JP2000314839A

JP2000314839A - レーザ走査型顕微鏡

Info

Publication number: JP2000314839A
Application number: JP11124737A
Authority: JP
Inventors: Takehiro Yoshida; 剛洋吉田
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 2000-11-14

Abstract

(57)【要約】【課題】光学フィルタや高度な位置再現精度を要する
機械駆動部を必要とせず、励起波長や蛍光色素の各種組
み合わせに対しても装置構成の変更を必要としない、多
重染色された標本の多重励起蛍光像を一つの光検出装置
でも高いＳ／Ｎをもって得ることの出来る、簡易な構成
のレーザ走査型顕微鏡を提供する。【解決手段】標本８から異なる波長域の蛍光を発生さ
せ得るレーザ光源１４，１５と、標本８から発した蛍光
を検出し得る光検出装置２６と、標本８と光検出装置２
６との間に配置されていて標本８からの光をスペクトル
分解するプリズム２２と、プリズム２２と光検出装置２
６との間に配置されていてスペクトル分解された標本か
らの各種の光を夫々受けて蛍光のみを光検出装置２６へ
向けて反射し得る複数の微小ミラー素子２５から成るミ
ラーアレイ２４と、光検出装置２６からの出力をサンプ
リングする出力信号処理装置３１とを備えている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ走査型顕微
鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、蛍光検出装置は、医学及び生物
学を初めその他の分野において、生物組織や細胞上で蛍
光標識を施した蛋白質や遺伝子等を検出する目的で広く
用いられている。特に、近年では、複数の蛍光色素で染
色した標本を一度に観察する多種蛍光検出が、遺伝子の
解析や細胞内構造の解明に威力を発揮している。これら
蛍光検出の有効手段としてレーザ走査型顕微鏡が公知で
ある。

【０００３】図９は、これら蛍光検出用レーザ走査型顕
微鏡の代表例の光学系を示しているが、図中、互いに異
なる発振波長を有する三つのレーザ発振器１ａ，１ｂ，
１ｃから射出された三種類のレーザビームは、結合用ダ
イクロイックミラー２ａ，２ｂにより共通の光軸上に結
合された後、ビームエキスパンダー３を通り、適当なビ
ーム径に拡大されてダイクロイックミラー４で反射さ
れ、ガルバノメータミラー等のＸ−Ｙ走査光学系５で偏
向され、瞳リレーレンズ６及び対物レンズ７を介して集
光されて、標本８上に照射されることにより、標本８は
レーザスポットで走査される。レーザビームの照射によ
り励起された標本８からの蛍光は、対物レンズ７からダ
イクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイッ
クミラー４を透過し、分光用ダイクロイックミラー９ａ
で分光される。ダイクロイックミラー９ａで反射された
一方の蛍光は、結像レンズ１０ａで集光され、共焦点絞
り１１ａを通って、吸収フィルタ１２ａにより目的とす
る第一の蛍光以外の波長の蛍光が吸収または反射された
後、光検出器１３ａでその強度が検出される。

【０００４】共焦点絞り１１ａは、対物レンズ７の焦点
位置と光学的に共役な位置に配置されて、レーザスポッ
トで励起された蛍光以外の光を遮断するため、得られる
画像は非常にコントラストが高く、更に、標本８と対物
レンズ７との間の距離を相対的に光軸方向に変えること
によって三次元像を得ることが出来るようになる。他
方、ダイクロイックミラー９ａを透過した蛍光は、ダイ
クロイックミラー９ｂで更に分光され、ダイクロイック
ミラー９ｂで反射された蛍光は、結像レンズ１０ｂで集
光され、共焦点絞り１１ｂを通り、目的とする第二の蛍
光のみを透過させる吸収フィルタ１２ｂを経て、光検出
器１３ｂにより光強度が検出される。また、ダイクロイ
ックミラー９ｂを透過した蛍光は、結像レンズ１０ｃで
集光され、共焦点絞り１１ｃを通り、目的とする第三の
蛍光のみを透過させる吸収フィルタ１２ｃを経て、光検
出器１３ｃで検出される。

【０００５】この光学系では、各レーザ発振器１ａ，１
ｂ，１ｃから射出される三波長のレーザビームによる三
重励起蛍光の同時検出が可能であり、レーザ波長の変
更，蛍光色素の種類や励起レーザ波長の数等、多重励起
の状態が変わる毎にダイクロイックミラー２ａ，２ｂ，
４、分光用ダイクロイックミラー９ａ，９ｂ、吸収フィ
ルタ１２ａ，１２ｂ，１２ｃは最適な分光特性を有する
ものに変更される。

【０００６】しかしながら、光学フィルタを用いる上記
従来の蛍光用レーザ走査型顕微鏡は下記の如き問題点を
有する。即ち、１）光学フィルタは、製造上の制限から
自在にその分光特性を決定することができないので、蛍
光光量やＳ／Ｎに限界がある。特に、吸収フィルタでは
励起光を完全に遮断する必要があるが、励起波長近傍の
最も蛍光強度が強い波長領域の蛍光を光量損失なしに透
過させるように設計し製造することは不可能であるこ
と、２）励起波長、蛍光色素毎に専用の高価な光学フィ
ルタを用意せねばならず、様々な多重励起を想定した場
合はフィルタ枚数の膨大化、装置構成の複雑化及び大型
化が避けられないこと、３）図９から明らかなように、
蛍光用レーザ走査型顕微鏡では、多重蛍光の分光は複数
の光学フィルタを介して行われるため、蛍光が光検出器
に到達するまでに相当の光量損失があること、等であ
る。

【０００７】従来、これらの問題点を改善すべく光学フ
ィルタを用いずに複数の蛍光波長を選択、検知する手段
が提案されている。即ち、特表平９−５０２２６９号公
報に開示された技術は、プリズム等でスペクトル分解さ
れた光束を、スリット状のミラーで透過する第一の波長
領域と反射する第二の波長領域とに分光し、更にスリッ
ト状ミラー及び第二の波長領域を制限する第二のスリッ
ト位置とスリット幅を制御して、任意の二つの波長領域
を選択、検出することが出来る分光装置及び共焦点蛍光
顕微鏡に関するものである。また、特開平８−４３７３
９号公報に開示された技術は、共焦点絞り通過後の光束
をグレーティングにより分光し、少なくとも一つのスリ
ットによって波長領域及び波長幅の選択を行い、各波長
領域の光量を光検出器で検出するようにした走査型光学
顕微鏡に関するものである。これら二つの技術は、共に
多重励起蛍光検出において、光学フィルタを使用するこ
となく確実に励起波長を遮断し且つ十分な蛍光光量を確
保して、Ｓ／Ｎの良い蛍光検出が可能な走査型光学顕微
鏡を提供している。

【０００８】また、光学フィルタを用いずに任意の波長
選択が可能な分光装置として、特開平６−２０７８５３
号公報に開示されたものがある。これは、光分散素子に
よって被検出光束を空間的にスペクトル分解し、分散ス
ペクトルの少なくとも一部を変形可能なミラー装置によ
って代表される空間光変調器で受け、所望のスペクトル
領域のみを反射または透過させて、そのエネルギー強度
を検出するようにしたものである。一度、光分散素子と
空間光変調器及びエネルギー検出器の関係が固定される
と、空間光変調器以外の総ゆる機械的動きを必要としな
いため、そこで生じる誤差や高精度な機械制御部をなく
すことが出来る。ここで、変形可能なミラー装置とは詳
しくは米国特許第５０６１０４９号に記載されているも
ので、マイクロミラーの空間的なアレイから成り、各マ
イクロミラーは印加電圧の制御のみによって選択的に予
め選択された角度に偏向可能な素子である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記特
開平８−４３７３９号公報に開示された方法は、波長選
択を決定するスリットに機械的な動きが伴い、その稼働
部に非常に高度な制御構造が必要となるばかりか、機械
的駆動部の振動や摩耗は測定時の再現性を失わせ、校正
の問題を惹起する。特に、スリット状のミラーと第二の
スリットは、分光の際に夫々が連動した動きを必要とす
るため、その制御の高精度化は極めて困難である。更
に、同時検出すべき蛍光の種類が増えると、上記分光手
段は一つでは足りず、同様な波長分割手段を幾つも使用
することが必要となり、光量損失と装置の複雑化を惹起
すると云う問題点がある。

【００１０】また、前記特表平９−５０２２６９号公報
に開示された方法は、上記の場合と同様に機械駆動部の
精度や再現性を保証する校正の問題の他に、一つの光検
出器で検出できる波長帯域が、グレーティングなどのス
ペクトル分散手段と光検出器の初期配置で決定されてし
まうため、広波長帯域における波長選択の自由度が低
く、多重励起蛍光検出における蛍光色素やレーザ波長の
多様性に対応できないと云う問題がある。

【００１１】また、前記特開平６−２０７８５３号公報
に開示された分光装置は、任意の波長領域における光の
光量検出を行えることから、一つの励起波長に対して一
つの蛍光を得るのには、蛍光用レーザ走査型顕微鏡への
応用は可能であるが、励起波長や蛍光色素の総ゆる組み
合わせに対応して、多重化した蛍光強度を時間的に同時
検出する方法として、容易に蛍光用レーザ走査型顕微鏡
に組み込めるものではない。

【００１２】本発明は、従来の技術の有するこのような
問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とすると
ころは、光学フィルタや高度な位置再現精度を要する機
械駆動部を必要とせず、励起波長や蛍光色素の様々な組
み合わせに対しても装置構成の変更を必要としない、多
重染色された標本の多重励起蛍光像を蛍光の数だけ光検
出器を用いずに高いＳ／Ｎをもって得ることの出来る、
簡易な構成のレーザ走査型顕微鏡を提供しようとするも
のである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明によるレーザ走査型顕微鏡は、標本に照射さ
れるべきレーザ光を射出して該標本から異なる波長域の
蛍光を発生させるためのレーザ光源と、標本からの蛍光
を検出する光検出装置と、標本と前記光検出装置との間
に配置されていて標本からの光を空間的にスペクトル分
解するスペクトル分解部材と、該スペクトル分解部材と
前記光検出装置との間に配置されていて前記スペクトル
分解部材によりスペクトル分解された光を受ける夫々が
偏向角度を変え得る複数の微小光偏向素子で構成された
微小光偏向素子アレイと、前記光検出装置からの出力を
サンプリングし得る出力信号処理装置とを備え、前記微
小光偏向素子アレイの少なくとも二つの微小光偏向素子
により偏向された光を前記光検出装置に所定の時間差を
以て入射させ、前記光検出装置からの出力を前記出力信
号処理装置により前記時間差を以てサンプリングするよ
うにしたことを特徴としている。

【００１４】また、本発明によれば、標本には、波長の
異なる少なくとも二つのレーザ光が所定の時間差をもっ
て照射されるようになっている。

【００１５】また、本発明によれば、前記標本から発生
した蛍光の検出波長域の少なくとも一つは前記レーザ光
源から射出したレーザ光の波長を含み、前記複数の微小
光偏向素子のうち蛍光とレーザ光とで共通している波長
の光を受ける微小光偏向素子はレーザ光が標本に当たっ
ている時間中は該微小光偏向素子が受ける光を前記光検
出装置からずれる方向に偏向させ、前記レーザ光が標本
に当たっていない時間中は前記微小光偏向素子が受ける
光を前記光検出装置に入射させるようにしたことを特徴
としている。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明の実施の形態を説明するに
先立ち、本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の作用・効果
について説明する。先ず、請求項１に記載の本発明によ
るレーザ走査型顕微鏡によれば、標本から発生した蛍光
と標本面で反射したレーザ光源からのレーザ光を空間的
にスペクトル分解した後、蛍光のみを微小の波長幅毎に
時間差をもって光検出装置へ導き、多重染色された標本
の蛍光波長域に応じてサンプリングする時刻を少しずつ
変えることによって、検出したい蛍光毎の光検出装置を
必要とせず、多くの種類の多重励起蛍光を分光し検出す
ることが出来る。即ち、前記のスペクトル分解された光
は、標本で反射したレーザ光とは異なる波長域の蛍光か
ら成る。これらの蛍光は、空間的にスペクトル分解され
て、その方向に配列された微小光偏向素子から成る微小
光偏向素子アレイへ投影される。先ず、微小光偏向素子
は特定の波長域の第一の蛍光を光検出装置へ入射させ、
これとは異なる波長域の第二の蛍光と前記レーザ光は光
検出装置へ入射しない方向に偏向させ、次に、時間差を
おいて微小光偏向素子は前記第二の蛍光を光検出装置へ
入射させる状態にされる。微小光偏向素子は、このよう
な動きを繰り返して異なる波長域の蛍光を交互に光検出
装置へ入射させることにより、一つの光検出装置で異な
った波長域の蛍光像を作ることが出来る。この場合、微
小光偏向素子の光偏向角度をステップ状に変化させる以
外に機械的駆動部を必要とせず、検出したい蛍光波長が
変わっても装置の変更や部品の入れ替えは不要である。
また、微小光偏向素子の光偏向角度は電気的デジタル信
号で制御可能であるため、装置自体に高い精度も複雑な
構成も必要としない。また、使用するレーザ光源は連続
発振のものでもパルス発振のものでも構わない。

【００１７】請求項２に記載の本発明によるレーザ走査
型顕微鏡によれば、異なった波長のレーザ光が時間差を
もって標本に照射されるため、標本から発生する蛍光も
レーザ光出射の時間に同期して発生する。このため、検
出したい異なる波長域の蛍光がこの段階で既に時間分解
される。これらの標本から発生した蛍光と該標本面で反
射したレーザ光を空間的にスペクトル分解した後、微小
光偏向素子によって蛍光波長毎に夫々光検出装置へ導
き、レーザ光源の照射時間に同期するようにサンプリン
グすることによって、一つの光検出装置により異なった
波長域の蛍光を分光検出することが出来る。更に、前記
レーザ光の波長と蛍光の波長が一致していない場合は、
微小光偏向素子の光偏向角度は、検出したい複数の蛍光
波長に対応する微小光偏向素子から、若しくは異なった
蛍光波長域に対応する連続する微小光偏向素子群から光
検出装置へ偏向させる光を導くように、更に、レーザ光
源の波長に対応する微小光偏向素子のみを光検出装置と
は異なる方向へ導くように予めセットしておけば、それ
以降各微小光偏向素子を駆動させる必要はなくなる。別
の波長のレーザ光を出射するレーザ光源とその照射によ
って標本から発生する蛍光を検出する場合においても、
その蛍光の波長域とレーザ光の波長とに夫々対応する微
小光偏向素子を前述のようにセットしておけば、装置の
構成を変える必要はない。かくして、本発明によれば、
像のコントラスト低下の原因となる標本から反射するレ
ーザ光を完全に排除することが出来る。また、光検出装
置を複数用意することなく多重化された蛍光を分離し、
異なった波長域の蛍光を検出することが出来る。更に、
前記時間差を十分小さくすれば、各波長域の蛍光を殆ど
同時に検出することが出来る。

【００１８】請求項３に記載の本発明によれば、標本か
ら発生した蛍光の検出波長域の少なくとも一つは、レー
ザ光源から出射するレーザ光の波長を含むため、蛍光と
該レーザ光とで共通した波長の光を受ける微小光偏向素
子は、常に光検出装置へ光を入射させる状態にして置く
ことは出来ない。従って、レーザ光が標本に当たってい
る時間中は微小光偏向素子は光検出装置へ光を入射させ
ない方向へ偏向され、レーザ光が標本に当たっていない
時間中は光検出装置へ光を入射させる方向へ偏向させる
ように制御される必要がある。これに対し、レーザ光の
波長と蛍光の波長とが重ならない波長域に対応する微小
光偏向素子、即ち、蛍光は受けるがレーザ光は受けない
微小光偏向素子は受けた光を光検出装置へ入射させる状
態にして置き、また蛍光の波長と重なる波長のレーザ光
を受ける微小光偏向素子は受けた光を光検出装置へは入
射させない状態にして置けば、蛍光観察中は微小光偏向
素子の何れも駆動させる必要はなくなる。この場合、レ
ーザ光も蛍光も受けない微小光偏向素子はどのような状
態に置かれても構わないことは云うまでもない。

【００１９】以下、本発明の実施の形態を図示した各種
実施例を参照して詳細に説明する。図中、従来例で用い
たのと実質上同一の部材には同一符号が付され、それに
ついての詳細な説明は省略されている。実施例１図１は本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第１実施例を
示す図である。図中、１４は波長４８８nmと５６８nmと
６４７nmの光を同時発振するマルチラインＫｒ−Ａｒレ
ーザから成る光源、１５は波長３５１nmの光を発振する
Ａｒレーザから成る光源、１６はレーザラインフィル
タ、１７はファイバカップリングレンズ、１８はシング
ルモードファイバ、１９はビームコリメートレンズ、２
０はダイクロイックミラー、２１はコリメートレンズ、
２２はスペクトル分解部材であるプリズム、２３は集光
レンズ、２４は多数の微小ミラー２５で構成されるミラ
ーアレイ（微小光偏向素子アレイ）、２６は光検出装
置、２７は光トラップ、２８はコントローラー、２９は
メモリー部、３０は入力部、３１は出力信号処理装置で
ある。なお、標本８，レーザ１４及び１５，ファイバカ
ップリングレンズ１７，ファイバ１８，コントローラ２
８，メモリー部２９，入力部３０及び出力信号処理装置
３１を除く構成部材は、レーザ走査型顕微鏡本体内に収
納されている。

【００２０】上記第１実施例において、各レーザ１４，
１５から射出したレーザ光は、ファイバカップリングレ
ンズ１７を経てシングルモードファイバ１８を通り、レ
ーザ走査型顕微鏡本体内に導入される。この場合、レー
ザ１４から射出したレーザ光は、レーザラインフィルタ
１６により励起波長を選択される。レーザ走査型顕微鏡
本体内に導入されたレーザ光は、レンズ１９により適当
なビーム径を有する平行光束に変換され、ダイクロイッ
クミラー２０によって混合される。混合されたレーザ光
は、励起用ダイクロイックミラー４で反射されてガルバ
ノメータミラー等のＸ−Ｙ走査光学系５において偏向さ
れ、瞳リレーレンズ６と対物レンズ７を介して標本８上
に達し、レーザスポットによる走査が行われる。

【００２１】かくして、レーザ光の照射により励起され
た標本８からの蛍光は、対物レンズ７からダイクロイッ
クミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４
を透過して結像レンズ１０で集光され、共焦点絞り１１
を通過する。共焦点絞り１１を通りコリメートレンズ２
１で平行光にされた蛍光光束は、プリズム２２によって
その波長情報が出射角度の差異に変換され、更に集光レ
ンズ２３を経てミラーアレイ２４上に結像される。この
時、プリズム２２からの出射角度の差異に変換された波
長情報は、ミラーアレイ２４上の位置情報に置換され、
微小ミラー素子２５の位置がそのまま波長に対応せしめ
られるようになる。この場合、プリズム２２の代わり
に、グレーティング，音響光学素子，ホログラフィック
素子など他のスペクトル分解素子が用いられても良い。
また、集光レンズ２３は、シリンドリカルレンズ等スペ
クトル分解方向にパワーを有するどのような光学系によ
り置換されても良い。

【００２２】微小ミラー素子２５は、各々がそこに入射
した光束を検出装置２６へ向けて反射する偏向角と光ト
ラップ２７へ向けて反射する偏向角とを選択することが
でき、その角度選択は入力部３０から出力信号処理装置
３１を経てコントローラ２８からの電気信号で一素子単
位で行うことが出来る。また、入力部３０を介してレー
ザや蛍光色素に対する何らかの入力を行うと、コントロ
ーラ２８がメモリー部２９に記憶されている各微小ミラ
ー素子２５の角度状態を呼び出し、何時でも最適な測定
状態を再現することが出来るようになっている。反対
に、微小ミラー素子２５の角度状態をメモリー部２９へ
記憶させることも出来る。

【００２３】以下、多重化された蛍光の分光作用につい
て説明する。先ず、総ての波長に対応する微小ミラー素
子２５が、入力光を光トラップ２７へ向けて反射するよ
うにセットされる。そして、第一の蛍光波長に対応する
微小ミラー素子がその蛍光を検出装置２６へ向けて反射
するように制御される。これにより、光検出装置２６か
らの信号を出力信号処理装置３１がサンプリングし、第
一の蛍光の強度が検出され、検出された信号を受け、コ
ントローラ２８によりその微小ミラー素子は、入射光を
光トラップ２７へ向けて反射させるか、又はメモリー２
９に記録された一定時間だけその微小ミラー素子は入射
光を光検出装置２６へ向けて反射させ、その後再び入射
光を光トラップ２７へ向けて反射させる。その後、第二
の蛍光波長に対応する微小ミラー素子が同様の動作を行
い、第二の蛍光の強度がサンプリングされる。この繰り
返しにより、観察される総ての蛍光波長の強度が検出さ
れる。

【００２４】従って、観測される蛍光波長域が三つの場
合例えば三つの異なる波長域の蛍光を発する蛍光色素が
使われた場合、光検出装置２６から出力される信号は、
図２に示されたようになる。図２において、縦軸は検出
された蛍光の強度を、横軸は時間を表している。各蛍光
は光検出装置２６に、時間差をもって順に入射するた
め、時間軸上の異なる時刻において第一，第二，第三の
ピークが発生する。そして、夫々第一，第二及び第三の
蛍光を表わす信号に対応する。ｔ₁，ｔ₂及びｔ ₃を第
一、第二及び第三の蛍光のサンプリング時間とすること
により、各蛍光の強度が検出される。ｔ₁，ｔ₂及びｔ
₃を完全に含むようにＴ₂を決め、このＴ ₂が走査手段
が一画素を走査する時間よりも短ければ、各画素を走査
する時間中に三つの蛍光の信号のサンプリングを行うこ
とにより、出力される総ての画素において標本を一度走
査するだけで三つの波長域の蛍光像が得られる。この場
合、多重化される蛍光色素の数によらず微小光偏向素子
２５による一度の反射によって分光が行われるので、光
量損失は極めて少ない。

【００２５】ここで、励起波長と蛍光色素を変更する場
合を考える。今、３５１nm，４８８nm，５６８nm及び６
４７nmの四重励起波長に対して、各波長で励起される四
種類の蛍光色素で標本８が染色されているものとする。
そして、３５１nmの波長の励起光で励起される蛍光色素
は、４８８nmより長波長の蛍光を発することは無いもの
とする。同様に、４８８nmの波長の励起光で励起される
蛍光色素は５６８nmより長波長の蛍光を発することはな
く、５６８nmの波長の励起光で励起される蛍光色素は６
４７nmより長波長の蛍光を発することは無いものとす
る。

【００２６】図３はミラーアレイ２４における微小ミラ
ー素子２５の配置を示している。図３（ａ）において、
微小ミラー素子２５ｅ，２５ｆ，２５ｇ，２５ｈは夫々
３５１nm，４８８nm，５６８nm，６４７nmのレーザ波長
に対応していて、入射光を光トラップ２７へ偏向させる
向きに配置されている。微小ミラー素子２５ａ，２５
ｂ，２５ｃ，２５ｄは夫々波長３５１nm，４８８nm，５
６８nm，６４７nmで励起された蛍光波長域に対応し、入
射光を光検出装置２６へ入射させるように偏向させる向
きと、光検出装置２６から外れるように偏向させる向き
とに切り替えられるようになっている。標本８は、四種
類の波長の光で同時に励起されると、四つの異なった波
長域の蛍光を発する。今、ミラーアレイ２４は微小ミラ
ー素子２５ａの領域に入射する光のみを光検出装置２６
へ向かわせるような状態にあるものとすると、波長３５
１nmの励起光で励起される色素の蛍光のみが検出装置２
６により検出される。一定時間経過後ミラーアレイ２４
の微小ミラー素子の向きが変わって微小ミラー素子２５
ｂの領域に入射する光のみを光検出装置２６へ向かわせ
るようにすると、波長４８８nmの励起光で励起される色
素の蛍光のみが光検出装置２６により検出されるように
なる。同様にして、波長５６８nm及び６４７nmの励起光
で夫々励起される色素の蛍光が光検出装置２６により順
次検出される。従って、この一連の動作が一画素を走査
するのに要する時間内で完了するように設定しておけ
ば、標本８を複数波長のレーザビームで走査することに
より四重染色蛍光画像を得ることが出来る。

【００２７】次に、波長３５１nmと５６８nmの励起光で
励起される二種類の蛍光色素によって標本８が染色され
ている場合について説明する。この場合の蛍光色素は、
上述の如き四重励起の場合の色素とは異なり蛍光波長域
が広く、波長３５１nmの励起光で励起される蛍光色素は
５６８nmよりも短波長域の励起光で蛍光を発し、波長５
６８nmの励起光で励起される蛍光色素は７００nmを越え
る波長の励起光でも蛍光を発するものとする。二種類の
波長のレーザが標本８に照射されると、標本からは二種
類の異なった波長域の蛍光を発生するが、図３（ｂ）に
示されるように励起波長に対応する微小ミラー素子２５
ｅ，２５ｇは、そこに集光された蛍光を光トラップ２７
へ向けて偏向させ、波長３５１nmの励起光で励起された
蛍光は、その波長に対応する微小ミラー素子２５ａ，２
５ｆ，２５ｂにより光検出装置２６へ向けて反射され、
蛍光検出後光トラップ２７へ向けられる。この間に光検
出装置２６に向けられた蛍光の強度信号がサンプリング
される。また、この時微小ミラー素子２５ｃ，２５ｈ，
２５ｄは入射した蛍光を光トラップ２７へ向かわせるよ
うな状態にされている。次に、波長５６８nmの励起光で
励起された蛍光に対応する微小ミラー素子２５ｃ，２５
ｈ，２５ｄが向きを変えて入射した蛍光を光検出装置２
６へ向かうようにし、蛍光強度をサンプリングして検出
するこの一連の動作を一画素を走査する時間内に完了す
るように設定し、標本８を二種類の波長を含むレーザビ
ームで走査することにより二重染色蛍光画像を得ること
が出来る。

【００２８】同様に、レーザ光源自体が変更された場合
でも、入射した光束を光検出装置２６へ向けて反射させ
たり、光トラップ２７に向けて反射させたりする微小ミ
ラー素子を、どのミラー素子にするか適当に選択するこ
とにより対応することが出来る。このように、励起波長
と蛍光色素の様々な組み合わせに対し常に最適な分光が
行えるのは、各微小ミラー素子の向きを任意に制御し
て、各蛍光毎に光検出装置２６に入射している時に必ず
サンプリングがなされるからである。このように、本実
施例によれば、光学フィルタを使用することなく、また
高度な位置再現精度を要する機械駆動部を必要としない
簡易な構成で、更に、励起波長や蛍光色素の様々な組み
合わせに対しても、装置構成を変更することなしに多重
染色された標本の多重励起蛍光像を高いＳ／Ｎをもって
得ることが出来る。また、本実施例によれば、標本から
発生した蛍光と標本面で反射したレーザ光源からの光を
空間的にスペクトル分解した後、スペクトル分解された
光を微小の波長幅毎に時間差をもって光検出装置へ導
き、多重染色された標本の蛍光波長域に応じてサンプリ
ングする時刻を少しずつ変えることによって、検出した
い蛍光毎に光検出装置を設けることなく、単一の光検出
装置で多種類の多重励起蛍光を分光し検出することが出
来る。また、微小ミラー素子の光偏向角度をステップ状
に変化させること以外に機械的駆動部を必要とせず、検
出したい蛍光波長が変わっても装置の変更や部品の入れ
替えも不要である。また、微小ミラー素子の光偏向角度
は電気的デジタル信号で制御可能であるから、装置自体
に高い精度も複雑な構成も必要としない。また、レーザ
光源は連続発振でもパルス発振でも構わない。また、前
述の時間差を十分小さくすることにより夫々の蛍光を殆
ど同時に検出することができる。

【００２９】実施例２図４は本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第２実施例を
示す図である。図中、第１実施例と実質上同一の部材に
は同一符号が付され、詳細な説明は省略されている。こ
の実施例は、各レーザ１４，１５とダイクロイックミラ
ー２０との間の光路中に各レーザ１４，１５からのビー
ムを遮るシャッター３２が備えられている点で、第１実
施例とは異なる。

【００３０】以下、波長３５１nmと５６８nmの励起光を
用いる二重励起の場合を例にとり、異なる二つの波長域
の蛍光を検出する場合について説明する。先ず、総ての
波長に対応する微小ミラー素子２５は、入射光を光検出
装置２６へ向けて反射させる向きにして置く。図３
（ｂ）の微小ミラー素子を用いると、励起光のレーザ波
長に対応する微小ミラー素子２５ｅ，２５ｇは、入射光
を光トラップ２７へ向けて反射させる向きにされてお
り、以後、この微小ミラー素子２５を制御する必要はな
い。図５において、ｔ₁₁，ｔ₁₂は、シャッター３２の開
閉により時間差Ｔ₃をもって各レーザ１４，１５から標
本８上にレーザビームが照射されている時間を表してい
る。このレーザ照射によって標本８から発生する蛍光
は、各蛍光の波長に対応する微小ミラー素子２５ａ，２
５ｆ，２５ｂ及び２５ｃ，２５ｈ，２５ｄにより反射さ
れて光検出装置２６に向うが、各レーザビームはシャッ
ター３２の開閉により二者択一的に一方のみが交互に標
本８上に照射されるため、二種類の蛍光が同時に光検出
装置２６に入射することはない。標本８へのこのレーザ
光入射により、発生する蛍光の時間に対する強度の変化
は図４に示されたようになる。この場合、各蛍光のサン
プリング時間をｔｓ₁，ｔｓ₂とすることによって各蛍
光は分離することができ、その強度が検出され得る。

【００３１】この実施例において、シャッター３２は機
械式のシャッターに限らず、カーセルや微小ミラー素子
など光の透過と遮断を制御できるものであれば何でも良
い。更に、シャッターを用いずに何らかの方法でレーザ
１４，１５自身を交互に点滅させることが出来ればそれ
でも構わない。なお、走査手段が一画素を走査する時間
と時間Ｔ₂との関係は、第１実施例で述べたのと同様で
あるので説明を省略する。

【００３２】実施例３第３実施例としては、再び図４を参照して、波長３５１
nmと４８８nmの励起光を用いる二重励起の場合を取り上
げ、異なる二つの波長域の蛍光を検出する場合について
説明する。先ず、総ての波長に対応する微小ミラー素子
２５は、入射光を光検出装置２６へ向けて反射させる向
きにして置く。波長３５１nmの励起光に対応する微小ミ
ラー素子２５のうち２５ｅ（図３（ｃ）参照）は、入射
光を光トラップ２７へ向けて反射させる向きにあるとす
る。先ず、波長３５１nmのレーザビームが標本８に照射
されている時間ｔｌ₁（図５参照）中に標本８から発生
する蛍光は、その蛍光波長域に対応する微小ミラー素子
２５ａ，２５ｆ，２５ｂにより反射されて光検出装置２
６へ向う。次に、波長４８８nmのレーザビームが標本８
に照射されている時間ｔｌ₂（図５参照）中に標本８か
ら発生する蛍光は、その蛍光波長に対応する微小ミラー
素子２５ｂ，２５ｇ，２５ｃ（図３（ｃ）参照）により
反射されて光検出装置２６へ向う。この時、波長４８８
nmのレーザビームに対応する微小ミラー素子２５ｆへ入
射するレーザ光は光トラップ２７へ向けて反射されるよ
うに、微小ミラー素子２５ｆは制御される。シャッター
１６により二種類のレーザビームが同時に標本８に照射
されることはないから、二種類の蛍光が同時に光検出装
置２６へ入射することはない。この実施例において、発
生する二種類の蛍光の時間に対する強度の変化は図５に
示されている。各蛍光のサンプリング時間をｔｓ₁，ｔ
ｓ₂とすることにより、各蛍光は分離できその強度が検
出される。

【００３３】また、図６において、ｔａは第一の蛍光の
サンプリング終了時刻を、ｔｂは第二の蛍光の光検出装
置２６への入射開始時刻を夫々示している。この図に示
されているように、時刻ｔａがｔｂよりも早い場合に
は、このサンプリングによって得られる信号強度は第一
の蛍光によるもののみであり、第二の蛍光によるものが
混ざることはない。このようにすることにより、各蛍光
の強度が混ざることはなくサンプリング出来るので、得
られた画像のコントラストの低下は確実に防ぐことが出
来る。更に、図６において、Ｔ₄はレーザビームの照射
時間、Ｔ₅はレーザビームの照射により発生する蛍光の
ライフタイム、Ｔ₆は蛍光のサンプリング時間である。
この図から明らかなように、時間Ｔ₄とＴ₅の合計時間
は、時間Ｔ６よりも短く而もその時間帯に含まれるよう
に構成されているから、発生した蛍光を無駄なくサンプ
リングすることが出来る。また、図７に示すように、各
レーザビームの照射時間ｔｌ₁（ｔｌ₂）と各蛍光のラ
イフタイムｔｆ₁（ｔｆ₂）の和が各蛍光のサンプリン
グ時間ｔｓ₁（ｔｓ₂）と等しくなるようにし、更に照
射時間ｔｌ₁（ｔｌ₂）を短くすると総ての画素におい
て多色の蛍光像が得易くなる。

【００３４】実施例４図８は本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第４実施例を
示す図である。図中、第１実施例と実質上同一の部材に
は同一符号が付されており、詳細な説明は省略されてい
る。この実施例は、光検出装置が二つ備えられている点
で、第１実施例とは異なる。即ち、２６ａ，２６ｂは二
つの光検出装置であって、四重励起の場合を考えると、
第一と第二の蛍光を光検出装置２６ａで、第三と第四の
蛍光を光検出装置２６ｂで夫々検出するように構成され
る。また、三重励起の場合は、光検出装置２６ａで第一
と第二の蛍光を、光検出装置２６ｂで第三の蛍光を検出
するように構成される。この場合は、光検出装置２６ｂ
から出力される信号は一つの蛍光強度を表わすので時間
分解する必要がない。この実施例におけるその他の作用
効果は、第１実施例について述べたのと同様であるの
で、説明を省略する。なお、光検出装置の数は２つに限
定されない。

【００３５】以上説明したように、本発明のレーザ走査
型顕微鏡は、特許請求の範囲に記載した特徴の他に下記
の特徴を有している。（１）レーザ光源は異なる波長域の蛍光を同時に発生さ
せ得るように構成されていることを特徴とする請求項１
に記載のレーザ走査型顕微鏡。

【００３６】（２）前記所定の時間差をＴ₁、レーザ走
査型顕微鏡が備えている走査手段が一画素を走査する時
間をＴ₂としたとき、Ｔ₂＞Ｔ₁なる条件を満たすよう
に構成されていることを特徴とする請求項１又は上記
（１）に記載のレーザ走査型顕微鏡。これにより、走査
手段が一つの画素を走査する間に異なった波長域の蛍光
の強度を総てサンプリングすることが出来る。総ての画
素においてそれがなされれば、標本の検出範囲を一度走
査するだけで、出力画面において検出したい波長域それ
ぞれの蛍光像を得ることが出来る。

【００３７】（３）レーザ走査型顕微鏡が備えている走
査手段が一画素を走査する時間をＴ ₂、波長の異なる少
なくとも二つのレーザ光が標本に照射される所定の時間
差をＴ₃としたとき、Ｔ₂＞Ｔ₃なる条件を満たすよう
に構成されていることを特徴とする請求項２又は３に記
載のレーザ走査型顕微鏡。これにより、走査手段が一つ
の画素を走査する間に異なる波長域の蛍光の強度を総て
サンプリングすることができる。総ての画素においてそ
れがなされれば、標本の検出範囲を一度走査するだけ
で、出力画面の総ての画素において検出したい夫々の波
長の蛍光像を得ることが出来る。

【００３８】（４）光検出装置へ時間的に連続して入射
する二つの波長域の蛍光について、先に入射した蛍光の
強度のサンプリング終了時刻が、後に入射する蛍光の前
記光検出装置への入射時刻よりも早くなるように構成し
たことを特徴とする請求項２又は３又は上記（３）に記
載のレーザ走査型顕微鏡。これにより、光検出装置に入
射する蛍光は時間的に重なることがなくなる。光検出装
置に蛍光が入射しない時間に蛍光のサンプリングをリセ
ットすることによって、各蛍光の強度が混ざることなく
サンプリングできるので、蛍光像のコントラストの低下
を防ぐことが出来る。

【００３９】（５）レーザ光の照射時間をＴ₄、レーザ
光の照射により発生する蛍光のライフタイムをＴ₅、前
記蛍光のサンプリング時間をＴ₆としたとき、Ｔ₆≧Ｔ
₄＋Ｔ₅なる条件を満たすように構成したことを特徴と
する上記（４）に記載のレーザ走査型顕微鏡。これによ
り、発生した蛍光の全量がサンプリングできるので、単
位時間当たりの蛍光強度が小さい場合でも蛍光を測定す
ることが出来る。

【００４０】（６）前記時間Ｔ₆の開始は前記時間Ｔ₄
の開始より先であり、前記時間Ｔ₆の終了は前記時間Ｔ
₅の終了よりも後であるように構成したことを特徴とす
る上記（５）に記載のレーザ走査型顕微鏡。これによ
り、上記時間Ｔ₄を併せた時間が完全に上記時間Ｔ₆の
時間内に含まれるようになり一層好ましい。

【００４１】（７）レーザ光源としてパルスレーザが用
いられていることを特徴とする請求項１乃至３の何れか
又は上記（３）乃至（５）の何れかに記載のレーザ走査
型顕微鏡。これにより、レーザ光は時間差をもって標本
に照射され得る。

【００４２】（８）レーザ光源と標本の間に、レーザ光
を遮断し得るシャッターが配置されていることを特徴と
する請求項１乃至３の何れか又は上記（３）乃至（５）
の何れかに記載のレーザ走査型顕微鏡。これにより、シ
ャッターを開閉させて波長の異なるレーザ光を時間差を
もって標本に照射させることが可能となる。

【００４３】（９）シャッターとしてカーセルを用いた
ことを特徴とする上記（８）に記載のレーザ走査型顕微
鏡。これにより、透過状態と遮蔽状態の切り替えを高速
で行うことが容易となり、効率的にレーザ光を時間差を
もって標本面へ照射させることが出来る。

【００４４】（10）シャッターとして、レーザ光源と標
本との間に配置された微小光偏向素子を用いたことを特
徴とする上記（８）に記載のレーザ走査型顕微鏡。これ
により、レーザ光を特定の方向へ偏向させる状態と、特
定の方向とは別の方向へ偏向させる状態とを高速で切り
替えることができ、それによってレーザ光を時間差をも
って標本面に照射させることが出来る。

【００４５】

【発明の効果】上述の如く本発明によれば、干渉フィル
タや高度な位置再現精度を要する機械駆動部を必要とせ
ず、また、励起波長や蛍光色素の様々な組み合わせに対
する装置構成の変更を必要とせずに、異なる蛍光波長域
の蛍光を単一の光検出装置で検出することが出来る、高
い蛍光検出感度を持つレーザ走査型顕微鏡を提供するこ
とが出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第１実施例
を示す図である。

【図２】第１実施例における光検出装置の出力信号強度
を示すグラフである。

【図３】本発明に係るレーザ走査型顕微鏡に用いられる
微小ミラー素子の拡大図で、（ａ）は第１実施例におけ
る様子、（ｂ）は第１実施例の一変形例及び第２実施例
における様子、（ｃ）は後述の第３実施例における様子
を夫々示している。

【図４】本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第２及び第
３実施例を示す図である。

【図５】第２及び第３実施例における光検出装置の出力
信号強度を示すグラフである。

【図６】第３実施例の一変形例における光検出装置の出
力信号強度を示すグラフである。

【図７】第３実施例の他の変形例における光検出装置の
出力信号強度を示すグラフである。

【図８】本発明に係るレーザ走査型顕微鏡の第４実施例
を示す図である。

【図９】従来の蛍光用レーザ走査型顕微鏡を示す図であ
る。

【符号の説明】

１ａ，１ｂ，１ｃレーザ発振器２ａ，２ｂレーザ結合用ダイクロイックミ
ラー３ビームエクスパンダー４，２０ダイクロイックミラー５Ｘ−Ｙ走査光学系６瞳リレーレンズ７対物レンズ８標本９ａ，９ｂ分光用ダイクロイックミラー１０，１０ａ，１０ｂ，１０ｃ結像レンズ１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ共焦点絞り１２ａ，１２ｂ，１２ｃ吸収フィルタ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ光検出器１４マルチラインＫｒ−Ａｒレーザ１５Ａｒレーザ１６レーザラインフィルタ１７ファイバカップリングレンズ１８シングルモードファイバ１９ビームコリメートレンズ２１コリメートレンズ２２プリズム（スペクトル分解部
材）２３集光レンズ２４ミラーアレイ（微小光偏向素子
アレイ）２５，２５ａ〜２５ｈ微小ミラー素子（微
小光偏向素子）２６，２６ａ，２６ｂ光検出装置２７光トラップ２８コントローラ２９メモリー部３０入力部３１出力信号処理装置３２シャッターｔ₁，ｔ₂，ｔ₃ 蛍光のサンプリング時間ｔｌ₁，ｔｌ₂ レーザの照射時間ｔｓ₁，ｔｓ₂ 蛍光のサンプリング時間ｔｆ₁，ｔｆ₂ 蛍光のライフタイムｔａ第一の蛍光のサンプリング終了
時刻ｔｂ第二の蛍光の検出装置への入射
開始時刻Ｔ₂ 総ての蛍光をサンプリングする
のに必要な時間Ｔ₃ ２つのレーザ光が標本面に照射
される時間差Ｔ₄ レーザ光の照射時間Ｔ₅ レーザ光の照射により発生する
蛍光のライフタイムＴ₆ 蛍光のサンプリング時間

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G043 AA01 AA04 BA16 CA04 EA01 FA02 GA01 GB01 HA01 HA02 HA05 HA09 HA11 HA15 JA02 JA05 KA02 KA03 KA05 KA09 LA01 MA04 2H052 AA08 AA09 AB24 AB25 AC12 AC15 AC26 AC27 AC34 AF07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レーザ走査型顕微鏡において、標本に照
射されるべきレーザ光を射出して該標本から異なる波長
域の蛍光を発生させるためのレーザ光源と、標本からの
蛍光を検出する光検出装置と、標本と前記光検出装置と
の間に配置されていて標本からの光を空間的にスペクト
ル分解するスペクトル分解部材と、該スペクトル分解部
材と前記光検出装置との間に配置されていて前記スペク
トル分解部材によりスペクトル分解された光を受ける夫
々が偏向角度を変え得る複数の微小光偏向素子で構成さ
れた微小光偏向素子アレイと、前記光検出装置からの出
力をサンプリングし得る出力信号処理装置とを備え、前
記微小光偏向素子アレイの少なくとも二つの微小光偏向
素子により偏向された光を前記光検出装置に所定の時間
差を以て入射させ、前記光検出装置からの出力を前記出
力信号処理装置により前記時間差を以てサンプリングす
るようにしたことを特徴とするレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】標本には波長の異なる少なくとも二つの
レーザ光が所定の時間差を以て照射されるようにしたこ
とを特徴とする請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】前記標本から発生した蛍光の検出波長域
の少なくとも一つは前記レーザ光源から射出したレーザ
光の波長を含み、前記複数の微小光偏向素子のうち蛍光
とレーザ光とで共通している波長の光を受ける微小光偏
向素子はレーザ光が標本に当たっている時間中は該微小
光偏向素子が受ける光を前記光検出装置からずれる方向
に偏向させ、前記レーザ光が標本に当たっていない時間
中は前記微小光偏向素子が受ける光を前記光検出装置に
入射させるようにしたことを特徴とする請求項２に記載
のレーザ走査型顕微鏡。