JP2000325093A - 増幅捕捉アッセイ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】サンプル中の特定の核酸を測定するハイブリダ
イゼーションにおいて、増幅手順およびマルチプローブ
ハイブリダイゼーションアッセイの組合せを改良する。 【解決手段】試験に供するサンプル中の相補的一本鎖標
的核酸を測定する組成物を開示する。また、この組成物
を使用し、試験に供するサンプル中の一本鎖標的遺伝物
質を測定する方法を開示する。
イゼーションにおいて、増幅手順およびマルチプローブ
ハイブリダイゼーションアッセイの組合せを改良する。 【解決手段】試験に供するサンプル中の相補的一本鎖標
的核酸を測定する組成物を開示する。また、この組成物
を使用し、試験に供するサンプル中の一本鎖標的遺伝物
質を測定する方法を開示する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サンプル中の特定の核
酸を測定するハイブリダイゼーションの分野に関する。
更に詳しくは、これは増幅手順およびマルチプローブハ
イブリダイゼーションアッセイの組合せの改良に関す
る。
酸を測定するハイブリダイゼーションの分野に関する。
更に詳しくは、これは増幅手順およびマルチプローブハ
イブリダイゼーションアッセイの組合せの改良に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】特定の結合アッセイ技術の発展により、
極めて低濃度で種々の液体または固体（例えば組織）中
に現れる診断、医療、環境並びに工業的に重要な種々の
物質を測定する極めて有用な分析方法が提供された。特
異的結合アッセイは、測定下で結合し得る分析物とその
結合パートナー、すなわち分析物特異的部分との特異的
な相互作用に基く。分析物特異的部分の結合および必要
に応じていずれかの付加的な試薬との相互作用により、
結合および未結合ラベル分析物の機械的分離が行われ、
または検出し得るシグナルを調節するようラベル作用さ
れる。前者の状態は通常は異種的と呼ばれ、後者は分離
工程を必要としない点で、後者は同種的と呼ばれる。
極めて低濃度で種々の液体または固体（例えば組織）中
に現れる診断、医療、環境並びに工業的に重要な種々の
物質を測定する極めて有用な分析方法が提供された。特
異的結合アッセイは、測定下で結合し得る分析物とその
結合パートナー、すなわち分析物特異的部分との特異的
な相互作用に基く。分析物特異的部分の結合および必要
に応じていずれかの付加的な試薬との相互作用により、
結合および未結合ラベル分析物の機械的分離が行われ、
または検出し得るシグナルを調節するようラベル作用さ
れる。前者の状態は通常は異種的と呼ばれ、後者は分離
工程を必要としない点で、後者は同種的と呼ばれる。
【０００３】分析物またはその結合パートナーのいずれ
が標的核酸配列であり、他のものが相補的核酸配列であ
る場合であっても、このアッセイは、核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイとして知られている。一般には、フ
ァルコウら、米国特許第４，３５８，５３５号、コウリ
ルスキーら、米国特許第４，５８１，３３３号、アルバ
レラら、米国特許第４，５６３，４１７号、並びにパウ
ら、米国特許第４，５５６，６４３号を参照するとよ
い。
が標的核酸配列であり、他のものが相補的核酸配列であ
る場合であっても、このアッセイは、核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイとして知られている。一般には、フ
ァルコウら、米国特許第４，３５８，５３５号、コウリ
ルスキーら、米国特許第４，５８１，３３３号、アルバ
レラら、米国特許第４，５６３，４１７号、並びにパウ
ら、米国特許第４，５５６，６４３号を参照するとよ
い。
【０００４】従来のラベル共役特異的結合アッセイ技術
においては、アッセイに供する液体媒体からなるサンプ
ルと種々の試薬組成物とを組合せる。この種の組成物に
は、ラベルと混和された結合成分からなるラベル共役物
が包含される。他の構成成分と共に参画する共役物中の
結合成分がある場合、これは試薬組成物およびアッセイ
下における媒体中のリガンドのものであり、２つの分子
種を与える結合反応系を形成するものであるか、または
例えば結合分子種（共役複合体）および遊離分子種のよ
うな共役物の形態を形成するものである。結合分子種に
おいては、共役物の結合成分は結合パートナーに対応す
ることにより結合されるが、これに対して遊離分子種で
は、結合成分はこのように結合されない。遊離分子種に
比較して結果的に結合分子種を与える共役物の割合の量
は、試験サンプル中の検出されるべき分析物の存在（ま
たは量）の関数である。
においては、アッセイに供する液体媒体からなるサンプ
ルと種々の試薬組成物とを組合せる。この種の組成物に
は、ラベルと混和された結合成分からなるラベル共役物
が包含される。他の構成成分と共に参画する共役物中の
結合成分がある場合、これは試薬組成物およびアッセイ
下における媒体中のリガンドのものであり、２つの分子
種を与える結合反応系を形成するものであるか、または
例えば結合分子種（共役複合体）および遊離分子種のよ
うな共役物の形態を形成するものである。結合分子種に
おいては、共役物の結合成分は結合パートナーに対応す
ることにより結合されるが、これに対して遊離分子種で
は、結合成分はこのように結合されない。遊離分子種に
比較して結果的に結合分子種を与える共役物の割合の量
は、試験サンプル中の検出されるべき分析物の存在（ま
たは量）の関数である。
【０００５】特異的結合アッセイについての他の形態は
「サンドイッチ」アッセイ手順であるが、この場合は、
標的分析物は、第１特異的結合パートナー（これは直接
または結合基を介して固体マトリックスに固定される）
と第２特異的結合パートナー（これはシグナル生成また
はラベル系と会合する）との間に結合される。第１およ
び第２特異的結合パートナーの両者がオリゴまたはポリ
ヌクレオチドであり、標的が核酸である場合、このアッ
セイはサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイと
して知られている。一般には、ランキら、米国特許第
４，４８６，５３９号およびランキら、米国特許第４，
５６３，４１９号を参照することができる。また、ビル
タネンら、「ウイルス診断の新しい試験：核酸サンドイ
ッチハイブリダイゼーションによる鼻咽頭粘液呼吸疾患
のアデノウイルスの検出」、Ｌａｎｃｅｔ、１：３８１
−３８３（１９８３）およびランキら、「粗製サンプル
中の核酸を検出する便利な方法としてのサンドイッチハ
イブリダイゼーション」、Ｇｅｎｅ、２１：７７−８５
（１９８３）を参照することができる。
「サンドイッチ」アッセイ手順であるが、この場合は、
標的分析物は、第１特異的結合パートナー（これは直接
または結合基を介して固体マトリックスに固定される）
と第２特異的結合パートナー（これはシグナル生成また
はラベル系と会合する）との間に結合される。第１およ
び第２特異的結合パートナーの両者がオリゴまたはポリ
ヌクレオチドであり、標的が核酸である場合、このアッ
セイはサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイと
して知られている。一般には、ランキら、米国特許第
４，４８６，５３９号およびランキら、米国特許第４，
５６３，４１９号を参照することができる。また、ビル
タネンら、「ウイルス診断の新しい試験：核酸サンドイ
ッチハイブリダイゼーションによる鼻咽頭粘液呼吸疾患
のアデノウイルスの検出」、Ｌａｎｃｅｔ、１：３８１
−３８３（１９８３）およびランキら、「粗製サンプル
中の核酸を検出する便利な方法としてのサンドイッチハ
イブリダイゼーション」、Ｇｅｎｅ、２１：７７−８５
（１９８３）を参照することができる。
【０００６】ウルデアら、「ブロッティングまたは放射
能活性を用いることなく粗製生物サンプル中の特定の核
酸配列を迅速に検出する新規な方法：ヒト血清中の肝炎
Ｂウイルスの分析への応用」、Ｇｅｎｅ、６１：２５３
−２６４（１９８７）には溶液ハイブリダイゼーション
が記載されているが、これは、可溶性オリゴヌクレオチ
ドプローブの多重度を利用するものである。ここに開示
された方法では、溶液ハイブリダイゼーションにおい
て、４８の異なる肝炎ウイルス特異的配列からなる２つ
の組合せのプローブの使用が開示されている。１つの組
合せのプローブ（Ａプローブセット）は、標的特異的領
域と非単独重合捕捉特異的領域とからなる核酸配列を有
する。このプローブセットの非単独重合捕捉特異的領域
は、ビオチンによりラベルされアビジン修飾ビーズによ
り結合され得る捕捉ヌクレオチド配列に相補的である。
プローブの他の組合せ（Ｂプローブセット）は、標的特
異的領域と他の非単独重合非標的特異的領域とからなる
ヌクレオチド配列を有する。この非単独重合非標的特異
的領域は、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列に特
異的である。このラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配
列自体は、非単独重合非標的特異的領域に相補的な領
域、並びにシグナル剤、西洋ワサビペルオキシダーゼに
よりラベルされたシグナルオリゴヌクレオチドに相補的
な領域を有する。標的核酸とプローブセットＡおよびＢ
とのハイブリダイゼーションに続き、ハイブリダイズし
た複合体をその後ビオチンラベル捕捉プローブにハイブ
リダイズさせ、これをその後次にアビジン修飾ビーズに
結合させる。マトリックス結合複合体をラベル捕捉ヌク
レオチドマルチマー配列とハイブリダイズさせ、その後
シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。
結合ハイブリダイズ複合体の量は、西洋ワサビペルオキ
シダーゼの存在により測定される。この研究に開示され
た方法は、５１の異なるオリゴヌクレオチド、その付着
非単独重合領域と共に４８の異なる標的特異的プロー
ブ、捕捉プローブ、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマ
ー、並びにシグナルプローブの合成を必要とする。ま
た、これは、それぞれ架橋剤および西洋ワサビペルオキ
シダーゼを用いるビオチンによる後者の３つのプローブ
の修飾を必要とする。この著者は、異なるプローブの数
に比例した感受性を記載している。
能活性を用いることなく粗製生物サンプル中の特定の核
酸配列を迅速に検出する新規な方法：ヒト血清中の肝炎
Ｂウイルスの分析への応用」、Ｇｅｎｅ、６１：２５３
−２６４（１９８７）には溶液ハイブリダイゼーション
が記載されているが、これは、可溶性オリゴヌクレオチ
ドプローブの多重度を利用するものである。ここに開示
された方法では、溶液ハイブリダイゼーションにおい
て、４８の異なる肝炎ウイルス特異的配列からなる２つ
の組合せのプローブの使用が開示されている。１つの組
合せのプローブ（Ａプローブセット）は、標的特異的領
域と非単独重合捕捉特異的領域とからなる核酸配列を有
する。このプローブセットの非単独重合捕捉特異的領域
は、ビオチンによりラベルされアビジン修飾ビーズによ
り結合され得る捕捉ヌクレオチド配列に相補的である。
プローブの他の組合せ（Ｂプローブセット）は、標的特
異的領域と他の非単独重合非標的特異的領域とからなる
ヌクレオチド配列を有する。この非単独重合非標的特異
的領域は、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配列に特
異的である。このラベル捕捉ヌクレオチドマルチマー配
列自体は、非単独重合非標的特異的領域に相補的な領
域、並びにシグナル剤、西洋ワサビペルオキシダーゼに
よりラベルされたシグナルオリゴヌクレオチドに相補的
な領域を有する。標的核酸とプローブセットＡおよびＢ
とのハイブリダイゼーションに続き、ハイブリダイズし
た複合体をその後ビオチンラベル捕捉プローブにハイブ
リダイズさせ、これをその後次にアビジン修飾ビーズに
結合させる。マトリックス結合複合体をラベル捕捉ヌク
レオチドマルチマー配列とハイブリダイズさせ、その後
シグナルオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。
結合ハイブリダイズ複合体の量は、西洋ワサビペルオキ
シダーゼの存在により測定される。この研究に開示され
た方法は、５１の異なるオリゴヌクレオチド、その付着
非単独重合領域と共に４８の異なる標的特異的プロー
ブ、捕捉プローブ、ラベル捕捉ヌクレオチドマルチマ
ー、並びにシグナルプローブの合成を必要とする。ま
た、これは、それぞれ架橋剤および西洋ワサビペルオキ
シダーゼを用いるビオチンによる後者の３つのプローブ
の修飾を必要とする。この著者は、異なるプローブの数
に比例した感受性を記載している。
【０００７】１９８９年３月１日に公告されたジビンと
モナハン、ＥＰＯ公告第０３０５１４５号には溶液サン
ドイッチハイブリダイゼーション法が開示されている
が、これは２つの可溶性オリゴヌクレオチドプローブを
利用するものである。１つのプローブは、相補的ホモポ
リヌクレオチドにより被覆された固体支持体により捕捉
されるホモポリヌクレオチド尾部を有し、他のプローブ
は、標的の異なる領域に相補的な検出し得るプローブで
ある。標的核酸配列は、溶液中で２つのプローブとハイ
ブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーションが完了
して始めて、ハイブリダイズした複合体を含有するサン
プルを不溶性固体支持体と接触させ捕捉させる。共に譲
渡され１９８７年１月１５日に出願された同時係属中の
米国特許出願第００５，３７７，号にもサンドイッチハ
イブリダイゼーションが開示されているが、これを参考
としてここに取り入れる。
モナハン、ＥＰＯ公告第０３０５１４５号には溶液サン
ドイッチハイブリダイゼーション法が開示されている
が、これは２つの可溶性オリゴヌクレオチドプローブを
利用するものである。１つのプローブは、相補的ホモポ
リヌクレオチドにより被覆された固体支持体により捕捉
されるホモポリヌクレオチド尾部を有し、他のプローブ
は、標的の異なる領域に相補的な検出し得るプローブで
ある。標的核酸配列は、溶液中で２つのプローブとハイ
ブリダイズ可能である。ハイブリダイゼーションが完了
して始めて、ハイブリダイズした複合体を含有するサン
プルを不溶性固体支持体と接触させ捕捉させる。共に譲
渡され１９８７年１月１５日に出願された同時係属中の
米国特許出願第００５，３７７，号にもサンドイッチハ
イブリダイゼーションが開示されているが、これを参考
としてここに取り入れる。
【０００８】核酸の増幅についての幾つかの初期の方法
論が知られている。例えば、オルソンら、「化学合成Ｄ
ＮＡ断片の酵素的増幅」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４３−６０（１９７５）、パネッ
トとコーラナ、「ポリヌクレオチドの研究。デオキシリ
ボ核酸とセルロースとの結合およびその複製におけるそ
の使用」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２４９：５
２１３−５２２１（１９７４）、ゲフターら、「無細胞
抽出液におけるＤＮＡ合成、第３部：ＤＮＡポリメラー
ゼIIの触媒特性」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２
４７：３３２１−３３２６（１９７２）、並びにクレッ
ペら、「ポリヌクレオチドの研究、第９６部、ＤＮＡポ
リメラーゼにより触媒されたものとしての短い合成ＤＮ
Ａの修復複製」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５６：
３４１−３６１（１９７１）を参照することができる。
論が知られている。例えば、オルソンら、「化学合成Ｄ
ＮＡ断片の酵素的増幅」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４３−６０（１９７５）、パネッ
トとコーラナ、「ポリヌクレオチドの研究。デオキシリ
ボ核酸とセルロースとの結合およびその複製におけるそ
の使用」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２４９：５
２１３−５２２１（１９７４）、ゲフターら、「無細胞
抽出液におけるＤＮＡ合成、第３部：ＤＮＡポリメラー
ゼIIの触媒特性」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２
４７：３３２１−３３２６（１９７２）、並びにクレッ
ペら、「ポリヌクレオチドの研究、第９６部、ＤＮＡポ
リメラーゼにより触媒されたものとしての短い合成ＤＮ
Ａの修復複製」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５６：
３４１−３６１（１９７１）を参照することができる。
【０００９】更に最近の他の方法論は、ポリメラーゼ鎖
反応（ＰＣＲ）手順であり、これは天然に少量で存在す
る核酸の比較的大量のものを利用可能とする種々の技術
となった。端的には、ＰＣＲ手順は次の通りである。コ
ピーに供する標的の分離した（一本鎖）相補的ストラン
ドをそれぞれ２つのストランドの対抗末端（すなわち、
それぞれのプライマーは５′−プライマーである）に相
補的な過剰モルのオリゴヌクレオチドプライマーにより
処理する。元の標的が二本鎖の場合、これは最初に一本
鎖とする必要がある。個々のヌクレオチドおよび適当な
ポリメラーゼまたは逆転写酵素を加えることによりプラ
イマーを延長して相補的プライマー延長生成物を形成す
る。一旦プライマー延長生成物が形成されたならば、そ
れぞれの重複する二本鎖中間体生成物をメルト（変性）
させて一本鎖形態とする。その相補体から分離され他の
プライマーにハイブリダイズされた場合、１つのプライ
マーから合成された延長生成物は、他のプライマーの延
長生成物の合成のための鋳型となる。ムュリスら、米国
特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２
号を参照するとよい。
反応（ＰＣＲ）手順であり、これは天然に少量で存在す
る核酸の比較的大量のものを利用可能とする種々の技術
となった。端的には、ＰＣＲ手順は次の通りである。コ
ピーに供する標的の分離した（一本鎖）相補的ストラン
ドをそれぞれ２つのストランドの対抗末端（すなわち、
それぞれのプライマーは５′−プライマーである）に相
補的な過剰モルのオリゴヌクレオチドプライマーにより
処理する。元の標的が二本鎖の場合、これは最初に一本
鎖とする必要がある。個々のヌクレオチドおよび適当な
ポリメラーゼまたは逆転写酵素を加えることによりプラ
イマーを延長して相補的プライマー延長生成物を形成す
る。一旦プライマー延長生成物が形成されたならば、そ
れぞれの重複する二本鎖中間体生成物をメルト（変性）
させて一本鎖形態とする。その相補体から分離され他の
プライマーにハイブリダイズされた場合、１つのプライ
マーから合成された延長生成物は、他のプライマーの延
長生成物の合成のための鋳型となる。ムュリスら、米国
特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２
号を参照するとよい。
【００１０】ＰＣＲの大部分の応用において、増幅され
たＤＮＡはサザンまたはドットブロットハイブリダイゼ
ーションにより放射能ラベルまたはビオチンラベルされ
たプローブとして分析される。例えば、オウら、「末梢
血液単球細胞のＤＮＡ中のＨＩＶ−１の直接検出のため
のＤＮＡ増幅」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：２９２−２
９５（１９８５）、サイキら、「熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼによるプライマー指向酵素的増幅」、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２３９：４８７−４９１（１９８８）、ヒグチ
ら、「シングルヘアーからのＤＮＡタイピング」、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３２：５４３−５４６（１９８８）、並び
にブガワンら、「胎児診断および法医学ＨＬＡタイピン
グのための酵素的に増幅されたＤＮＡを分析する非放射
活性オリゴヌクレオチドプローブの使用」、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９４３−９４７（１９８８）を
参照することができる。この種の手順は完遂するのに２
〜３日かかるため、これらは一般に大量の応用、臨床試
験状況での使用には不適切であり、自動化された装置へ
の応用に特に不適切である。
たＤＮＡはサザンまたはドットブロットハイブリダイゼ
ーションにより放射能ラベルまたはビオチンラベルされ
たプローブとして分析される。例えば、オウら、「末梢
血液単球細胞のＤＮＡ中のＨＩＶ−１の直接検出のため
のＤＮＡ増幅」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：２９２−２
９５（１９８５）、サイキら、「熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼによるプライマー指向酵素的増幅」、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２３９：４８７−４９１（１９８８）、ヒグチ
ら、「シングルヘアーからのＤＮＡタイピング」、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３２：５４３−５４６（１９８８）、並び
にブガワンら、「胎児診断および法医学ＨＬＡタイピン
グのための酵素的に増幅されたＤＮＡを分析する非放射
活性オリゴヌクレオチドプローブの使用」、Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：９４３−９４７（１９８８）を
参照することができる。この種の手順は完遂するのに２
〜３日かかるため、これらは一般に大量の応用、臨床試
験状況での使用には不適切であり、自動化された装置へ
の応用に特に不適切である。
【００１１】他の増幅系を記載すれば、リザルジら、
「組換えＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの対数
的増幅」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７
−１２０２（１９８８）には、ハイブリダイゼーション
プローブおよびＱβレプリカーゼによる対数増幅のため
の鋳型の双方に機能する組換えＲＮＡ分子を合成したこ
とが報告されている。それぞれの組換え体は、ＭＤＶ−
１ＲＮＡの配列内に埋設されたプロトゾア寄生体に特異
的な配列よりなり、これはＱβレプリカーゼの天然の鋳
型である。プローブ配列は、ＭＤＶ−１ＲＮＡの外部に
存在するヘアピンループ内に挿入される。相補的ＤＮＡ
に特異的にハイブリダイズする組換えＲＮＡは、プロー
ブドメイン上のトポロジー的束縛にも拘らず、ＭＤＶ−
１ＲＮＡと同じ速度で複製され、その付加的な長さによ
らず、多数のＲＮＡコピーの合成のための鋳型として働
くことが可能である。この結果は、バイオアッセイにお
ける対数的複製可能なＲＮＡを用いることの実行可能性
と言われ、この場合これらは特異的プローブおよび増幅
レセプターの二元的な役割を果たし得る。これらのアッ
セイでは、非特異的にハイブリダイズした、またはトラ
ップされた二元的役割のプローブ／増幅可能プローブの
標的非特異的増幅の影響を被り得る。
「組換えＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの対数
的増幅」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１１９７
−１２０２（１９８８）には、ハイブリダイゼーション
プローブおよびＱβレプリカーゼによる対数増幅のため
の鋳型の双方に機能する組換えＲＮＡ分子を合成したこ
とが報告されている。それぞれの組換え体は、ＭＤＶ−
１ＲＮＡの配列内に埋設されたプロトゾア寄生体に特異
的な配列よりなり、これはＱβレプリカーゼの天然の鋳
型である。プローブ配列は、ＭＤＶ−１ＲＮＡの外部に
存在するヘアピンループ内に挿入される。相補的ＤＮＡ
に特異的にハイブリダイズする組換えＲＮＡは、プロー
ブドメイン上のトポロジー的束縛にも拘らず、ＭＤＶ−
１ＲＮＡと同じ速度で複製され、その付加的な長さによ
らず、多数のＲＮＡコピーの合成のための鋳型として働
くことが可能である。この結果は、バイオアッセイにお
ける対数的複製可能なＲＮＡを用いることの実行可能性
と言われ、この場合これらは特異的プローブおよび増幅
レセプターの二元的な役割を果たし得る。これらのアッ
セイでは、非特異的にハイブリダイズした、またはトラ
ップされた二元的役割のプローブ／増幅可能プローブの
標的非特異的増幅の影響を被り得る。
【００１２】ケンプら、「ポリメラーゼ鎖反応により増
幅された特異的ＤＮＡ断片の発色検出」、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２４２３−
２４２７（１９８９）には、増幅されたＤＮＡの発色検
出のためのアッセイが記載されている。標的ＤＮＡは最
初にＰＣＲによって増幅され、その後最初の２つの間に
介在する第２の組のオリゴヌクレオチドを、３以上のＰ
ＣＲサイクルにより組み込む。これらのオリゴヌクレオ
チドはリガンドを担持する。例えば、１つはビオチニル
化され得、他は二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質についての部位
を含有し得る。固定化アフィニティ試薬（例えばクロー
ン化ＤＮＡ結合蛋白質）への結合、および西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合した第２アフィニティ試薬（例え
ばアビジン）によりラベルの後、発色性物質を用いる反
応により増幅されたＤＮＡの検出を行う。
幅された特異的ＤＮＡ断片の発色検出」、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：２４２３−
２４２７（１９８９）には、増幅されたＤＮＡの発色検
出のためのアッセイが記載されている。標的ＤＮＡは最
初にＰＣＲによって増幅され、その後最初の２つの間に
介在する第２の組のオリゴヌクレオチドを、３以上のＰ
ＣＲサイクルにより組み込む。これらのオリゴヌクレオ
チドはリガンドを担持する。例えば、１つはビオチニル
化され得、他は二本鎖ＤＮＡ結合蛋白質についての部位
を含有し得る。固定化アフィニティ試薬（例えばクロー
ン化ＤＮＡ結合蛋白質）への結合、および西洋ワサビペ
ルオキシダーゼに結合した第２アフィニティ試薬（例え
ばアビジン）によりラベルの後、発色性物質を用いる反
応により増幅されたＤＮＡの検出を行う。
【００１３】ケーラーとカーン、「核酸プローブを使用
するＨＩＶ配列の同定」、Ａｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌ
ａｂｓ、（１９８８年１１月）では、ＨＩＶ−１ウイル
ス核酸の検出についての最近開発された方法が論じられ
ている。記載された１つの方法は、組み込まれた、また
はエピーゾームＤＮＡに存在するＨＩＶ−１プロウイル
ス上でポリメラーゼ鎖反応を使用することにより開始す
る。サイキら、前記文献を引用し、ウイルスＲＮＡも、
幾つかの付加的な工程により特異的に増幅され得ること
が記載されている。ＲＮＡ鋳型はウイルスｍＲＮＡまた
はパックされたウイルス粒子ＲＮＡである。ウイルスＲ
ＮＡのｃＤＮＡコピーは、ＰＣＲプライマーおよび逆転
写酵素を使用して合成される。この著者によれば、恐ら
く検出形式を改変して、より単純であるがより信頼性の
高い試験を提供すべきことが示されいてる。サンドイッ
チハイブリダイゼーションは、他のものとして言及さ
れ、従来のハイブリダイゼーションの図式が示されてい
るが、詳細は全く与えられていない。
するＨＩＶ配列の同定」、Ａｍ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌ
ａｂｓ、（１９８８年１１月）では、ＨＩＶ−１ウイル
ス核酸の検出についての最近開発された方法が論じられ
ている。記載された１つの方法は、組み込まれた、また
はエピーゾームＤＮＡに存在するＨＩＶ−１プロウイル
ス上でポリメラーゼ鎖反応を使用することにより開始す
る。サイキら、前記文献を引用し、ウイルスＲＮＡも、
幾つかの付加的な工程により特異的に増幅され得ること
が記載されている。ＲＮＡ鋳型はウイルスｍＲＮＡまた
はパックされたウイルス粒子ＲＮＡである。ウイルスＲ
ＮＡのｃＤＮＡコピーは、ＰＣＲプライマーおよび逆転
写酵素を使用して合成される。この著者によれば、恐ら
く検出形式を改変して、より単純であるがより信頼性の
高い試験を提供すべきことが示されいてる。サンドイッ
チハイブリダイゼーションは、他のものとして言及さ
れ、従来のハイブリダイゼーションの図式が示されてい
るが、詳細は全く与えられていない。
【００１４】クオーら、「ビーズ基材サンドイッチハイ
ブリダイゼーション形式を用いる転写に基く増幅系およ
び増幅されたヒト免疫疾患ウイルスタイプ１の検出」、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：１１７３−１１７７（１９８９）には、転写に基く
増幅系（ＴＡＳ）が開示されている。それぞれのサイク
ルは２つの工程からなる。第１はｃＤＮＡ合成工程であ
り、これはＲＮＡまたはＤＮＡ標的核酸のそれぞれのコ
ピーについての二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのコピーを与え
る。このｃＤＮＡ合成工程の過程で、ＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼによって認識される配列が、増幅される
標的のｃＤＮＡコピー中に挿入される。第２の工程は、
ｃＤＮＡ鋳型を多数のコピーのＲＮＡに転写することに
よる標的配列の増幅である。この手順は、ＨＩＶ−１の
検出に応用された。ＨＩＶ−１感染細胞に由来するＴＡ
Ｓ形成ＲＮＡの検出は、ビーズ基材サンドイッチハイブ
リダイゼーション手順によって達成することができる。
オリゴヌクレオチドを含有するセファクリルビーズは、
ゴッシュとムッソ、「固体支持体へのオリゴヌクレオチ
ドの共有付着」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、１５：５３５３−５３７２（１９８７）に記
載されているように調製された。このビーズ結合オリゴ
ヌクレオチドを使用し、これらの標的が３２Ｐラベル検
出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした後に、ＴＡ
Ｓ増幅ＨＩＶ−１配列が捕捉された。
ブリダイゼーション形式を用いる転写に基く増幅系およ
び増幅されたヒト免疫疾患ウイルスタイプ１の検出」、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：１１７３−１１７７（１９８９）には、転写に基く
増幅系（ＴＡＳ）が開示されている。それぞれのサイク
ルは２つの工程からなる。第１はｃＤＮＡ合成工程であ
り、これはＲＮＡまたはＤＮＡ標的核酸のそれぞれのコ
ピーについての二本鎖ＤＮＡ鋳型の１つのコピーを与え
る。このｃＤＮＡ合成工程の過程で、ＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼによって認識される配列が、増幅される
標的のｃＤＮＡコピー中に挿入される。第２の工程は、
ｃＤＮＡ鋳型を多数のコピーのＲＮＡに転写することに
よる標的配列の増幅である。この手順は、ＨＩＶ−１の
検出に応用された。ＨＩＶ−１感染細胞に由来するＴＡ
Ｓ形成ＲＮＡの検出は、ビーズ基材サンドイッチハイブ
リダイゼーション手順によって達成することができる。
オリゴヌクレオチドを含有するセファクリルビーズは、
ゴッシュとムッソ、「固体支持体へのオリゴヌクレオチ
ドの共有付着」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、１５：５３５３−５３７２（１９８７）に記
載されているように調製された。このビーズ結合オリゴ
ヌクレオチドを使用し、これらの標的が３２Ｐラベル検
出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした後に、ＴＡ
Ｓ増幅ＨＩＶ−１配列が捕捉された。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】これらの努力にも拘ら
ず、これらのある種の方法論には存在するが他には存在
しない望ましい特性の組合せを達成する点において、改
良の余地は大いに残されている。
ず、これらのある種の方法論には存在するが他には存在
しない望ましい特性の組合せを達成する点において、改
良の余地は大いに残されている。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、増幅さ
れた核酸を検出する単純化された組成物および方法が、
特異的なＤＮＡ配列の増幅の記載された有用性を十分に
活用するのに必要であることが認められた。本発明によ
れば、後記する評価基準が充足された。これは十分に感
度が高く、このため増幅の工程は最小限に維持された。
これは適切に特異的であり、このため全ゆる非特異的増
幅は誤りなく陽性でないと記録される。これは大量の臨
床試験への応用が可能であり、更に好ましくは自動化に
容易に適用することができる。
れた核酸を検出する単純化された組成物および方法が、
特異的なＤＮＡ配列の増幅の記載された有用性を十分に
活用するのに必要であることが認められた。本発明によ
れば、後記する評価基準が充足された。これは十分に感
度が高く、このため増幅の工程は最小限に維持された。
これは適切に特異的であり、このため全ゆる非特異的増
幅は誤りなく陽性でないと記録される。これは大量の臨
床試験への応用が可能であり、更に好ましくは自動化に
容易に適用することができる。
【００１７】所定の態様の更なる利点は、これらは増幅
の効率を見積る方法論を提供するため、意図する配列に
ついての陰性の結果は、増加した確実性をもって陰性で
あると記録される点である。またこの種の系により、１
つのサンプル内で単一のアッセイ操作により複数の標的
核酸配列を増幅および検出する単純化された方法も可能
となる。この種の方法の付加的な利点は、これらが増幅
サイクルの前に意図する標的核酸配列を部分精製する単
純で危険性のない方法論を提供することである。
の効率を見積る方法論を提供するため、意図する配列に
ついての陰性の結果は、増加した確実性をもって陰性で
あると記録される点である。またこの種の系により、１
つのサンプル内で単一のアッセイ操作により複数の標的
核酸配列を増幅および検出する単純化された方法も可能
となる。この種の方法の付加的な利点は、これらが増幅
サイクルの前に意図する標的核酸配列を部分精製する単
純で危険性のない方法論を提供することである。
【００１８】先に示したように、本発明によれば、サン
プル中の核酸分析物の存在または非存在を測定する組成
物および方法が提供される。
プル中の核酸分析物の存在または非存在を測定する組成
物および方法が提供される。
【００１９】試験を行うサンプル液体には、生物的、生
理的、工業的、環境的並びに他の種類の液体が包含され
る。特に意図するものは生物的液体であり、例えば血
清、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、ミルクブロスおよび他
の培養媒体並びに上澄、更にこれらのいずれかの混合物
または分画がある。意図する生理的液体には、注射溶
液、緩衝液、防腐または抗微生物溶液等が包含される。
工業的液体には、発酵培地および使用される他の加工液
体が包含され、例えば薬剤の製造におけるもの、乳製品
およびマルト飲料がある。従来の方法によって試験され
るサンプル液体の他の供給源は、使用するこの用語によ
って企図され、本発明に従ってアッセイすることができ
る。また、試験を企図するものには組織サンプルがあ
り、例えば、髪、バイオプシーまたは組織切片サンプル
が包含され、新鮮、凍結またはパラフィンに包埋された
ものであることを問わない。
理的、工業的、環境的並びに他の種類の液体が包含され
る。特に意図するものは生物的液体であり、例えば血
清、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、ミルクブロスおよび他
の培養媒体並びに上澄、更にこれらのいずれかの混合物
または分画がある。意図する生理的液体には、注射溶
液、緩衝液、防腐または抗微生物溶液等が包含される。
工業的液体には、発酵培地および使用される他の加工液
体が包含され、例えば薬剤の製造におけるもの、乳製品
およびマルト飲料がある。従来の方法によって試験され
るサンプル液体の他の供給源は、使用するこの用語によ
って企図され、本発明に従ってアッセイすることができ
る。また、試験を企図するものには組織サンプルがあ
り、例えば、髪、バイオプシーまたは組織切片サンプル
が包含され、新鮮、凍結またはパラフィンに包埋された
ものであることを問わない。
【００２０】用語「分析物」または「標的」は、その存
在がサンプル液体中で定性的または定量的に測定される
全ゆる核酸含有物質を意図する。分析物は、通常はオリ
ゴまたはポリヌクレオチドであり、これに対して相補的
な核酸配列が存在するか、またはこれを調製することが
できるものである。分析物または標的は通常はＲＮＡま
たはＤＮＡである。
在がサンプル液体中で定性的または定量的に測定される
全ゆる核酸含有物質を意図する。分析物は、通常はオリ
ゴまたはポリヌクレオチドであり、これに対して相補的
な核酸配列が存在するか、またはこれを調製することが
できるものである。分析物または標的は通常はＲＮＡま
たはＤＮＡである。
【００２１】用語「マトリックス」または「試験帯域」
は、キャリヤまたは支持体を意図し、例えば、顕微鏡ス
ライド、マイクロタイタ穴、粒子等であり、その試験で
使用する試験サンプル、水または生理的液体および試薬
に露呈された場合、これは不溶性でありその構造的一貫
性を維持する。適切な材料には、ガラスまたは有機プラ
スチック材料が包含され、例えばポリスチレン、ポリプ
ロピレン等がある。
は、キャリヤまたは支持体を意図し、例えば、顕微鏡ス
ライド、マイクロタイタ穴、粒子等であり、その試験で
使用する試験サンプル、水または生理的液体および試薬
に露呈された場合、これは不溶性でありその構造的一貫
性を維持する。適切な材料には、ガラスまたは有機プラ
スチック材料が包含され、例えばポリスチレン、ポリプ
ロピレン等がある。
【００２２】用語「普遍的検出」、「普遍的ラベル捕捉
部分」並びに「普遍的ラベル」は、「ポリヌクレオチド
配列を利用するアッセイ方法」と題し、米国出願番号第
９２２，７５７号を有し、１９８６年１０月２４日に出
願され共に譲渡されたペルゴリジらに対する同時係属中
の出願に記載されたラベル系を意図する。この出願の開
示を参考としてここに取り入れる。
部分」並びに「普遍的ラベル」は、「ポリヌクレオチド
配列を利用するアッセイ方法」と題し、米国出願番号第
９２２，７５７号を有し、１９８６年１０月２４日に出
願され共に譲渡されたペルゴリジらに対する同時係属中
の出願に記載されたラベル系を意図する。この出願の開
示を参考としてここに取り入れる。
【００２３】前記したコピー数の増幅は、例えばポリメ
ラーゼ鎖反応または核酸材料の遺伝型として特異的な蛋
白質を再生することにより行うことができる（例えば、
転写に基く増幅）。
ラーゼ鎖反応または核酸材料の遺伝型として特異的な蛋
白質を再生することにより行うことができる（例えば、
転写に基く増幅）。
【００２４】後記するように、第１および第２実体の例
には、１つの実体がリガンドであり他の実体がそのレセ
プターであるもの、第１および第２実体が相補的ポリヌ
クレオチド単独重合体であるもの、１つの実体が抗原ま
たはハプテンであり他の実体が抗原またはハプテンに対
するその抗体または特異的結合断片であるもの、１つの
実体がホルモンであり他の実体がそのレセプターである
もの、１つの実体が酵素であり他の実体がその阻害剤で
あるもの、１つの実体がアポ酵素であり他の実体がその
補欠因子であるもの、１つの実体が糖であり他の実体が
これと特異的に結合し得るレクチンであるもの、並びに
１つの実体がアビジンまたはストレプトアビジンであり
他の実体がビオチンまたはその結合アナログであるもの
が包含される。
には、１つの実体がリガンドであり他の実体がそのレセ
プターであるもの、第１および第２実体が相補的ポリヌ
クレオチド単独重合体であるもの、１つの実体が抗原ま
たはハプテンであり他の実体が抗原またはハプテンに対
するその抗体または特異的結合断片であるもの、１つの
実体がホルモンであり他の実体がそのレセプターである
もの、１つの実体が酵素であり他の実体がその阻害剤で
あるもの、１つの実体がアポ酵素であり他の実体がその
補欠因子であるもの、１つの実体が糖であり他の実体が
これと特異的に結合し得るレクチンであるもの、並びに
１つの実体がアビジンまたはストレプトアビジンであり
他の実体がビオチンまたはその結合アナログであるもの
が包含される。
【００２５】１つの観点では、この発明によれば、試験
に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物
が提供される。この組成物は、（ｉ）意図するそれぞれ
の一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライ
マー（このプライマーは、一本鎖の標的核酸の相補的部
分に選択的にアニールすることができる）、（ｉｉ）４
つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、（ｉｉ
ｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物
を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
して増幅された核酸配列を与える）、（ｉｖ）標的核酸
の第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片に付着した普遍的ラベル捕捉部分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｖ）標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、（ｖ
ｉ）第２ポリヌクレオチドプローブが固定されるマトリ
ックス、並びに（ｖｉｉ）第１ポリヌクレオチドプロー
ブがハイブリダイゼーションにより増幅した標的核酸配
列（これはハイブリダイゼーションによりマトリックス
固定第２ヌクレオチドプローブに捕捉される）に捕捉さ
れる場合、第１普遍的ラベル捕捉部分により捕捉され得
る普遍的ラベルからなる。
に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物
が提供される。この組成物は、（ｉ）意図するそれぞれ
の一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライ
マー（このプライマーは、一本鎖の標的核酸の相補的部
分に選択的にアニールすることができる）、（ｉｉ）４
つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、（ｉｉ
ｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物
を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
して増幅された核酸配列を与える）、（ｉｖ）標的核酸
の第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片に付着した普遍的ラベル捕捉部分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｖ）標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、（ｖ
ｉ）第２ポリヌクレオチドプローブが固定されるマトリ
ックス、並びに（ｖｉｉ）第１ポリヌクレオチドプロー
ブがハイブリダイゼーションにより増幅した標的核酸配
列（これはハイブリダイゼーションによりマトリックス
固定第２ヌクレオチドプローブに捕捉される）に捕捉さ
れる場合、第１普遍的ラベル捕捉部分により捕捉され得
る普遍的ラベルからなる。
【００２６】更にこの観点に関して、本発明によれば、
試験に供する一本鎖標的核酸を測定する方法が提供され
る。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、
（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１普遍的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブとを接触させ（この第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片は、標的核酸の第１部分とハイブリダイズ
し得てハイブリッドを形成する）、（ｃ）ハイブリダイ
ズし得る条件下で、かくして形成された全ゆるハイブリ
ッドと、標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるマトリックス固
定第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させて結合複
合体を形成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる
未結合核酸から分離し、（ｅ）普遍的ラベルの存在また
は非存在を捕捉して観察することにより増幅された標的
核酸の存在または非存在を測定することからなる。
試験に供する一本鎖標的核酸を測定する方法が提供され
る。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、
（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数の標的核酸と第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１普遍的ラベル捕捉部分からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブとを接触させ（この第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片は、標的核酸の第１部分とハイブリダイズ
し得てハイブリッドを形成する）、（ｃ）ハイブリダイ
ズし得る条件下で、かくして形成された全ゆるハイブリ
ッドと、標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるマトリックス固
定第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させて結合複
合体を形成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる
未結合核酸から分離し、（ｅ）普遍的ラベルの存在また
は非存在を捕捉して観察することにより増幅された標的
核酸の存在または非存在を測定することからなる。
【００２７】第２の観点では、この発明によれば、試験
に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物
が提供される。この組成物は、（ｉ）それぞれの一本鎖
標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（こ
のプライマーは、一本鎖の標的核酸の相補的部分に選択
的にアニールすることができる）、（ｉｉ）４つの核酸
塩基のそれぞれについてのモノヌクレオチド、（ｉｉ
ｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物
を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
する）、（ｉｖ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズ
し得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベ
ル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオ
チドプローブ、（ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、並び
に（ｖｉ）第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付
着したマトリックスからなる。
に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する組成物
が提供される。この組成物は、（ｉ）それぞれの一本鎖
標的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（こ
のプライマーは、一本鎖の標的核酸の相補的部分に選択
的にアニールすることができる）、（ｉｉ）４つの核酸
塩基のそれぞれについてのモノヌクレオチド、（ｉｉ
ｉ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物
を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
する）、（ｉｖ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズ
し得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベ
ル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオ
チドプローブ、（ｖ）標的核酸の第２部分とハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した
第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプローブ、並び
に（ｖｉ）第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付
着したマトリックスからなる。
【００２８】更にこの観点に関し、この発明によれば、
試験に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する方
法が提供される。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー
数を増幅し、（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増
幅したコピー数の標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分
にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第
２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオ
チド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオ
チドプローブ、並びに（ｉｉｉ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触さ
せ、（ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増
幅したコピー数の標的核酸とのハイブリダイゼーション
および第１実体と第２実体との結合を行って結合複合体
を生成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結
合核酸から分離し、（ｅ）増幅したコピー数の標的核酸
の存在または非存在を測定することからなる。
試験に供するサンプル中の一本鎖標的核酸を測定する方
法が提供される。この方法は、（ａ）標的核酸のコピー
数を増幅し、（ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で、増
幅したコピー数の標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分
にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第
２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオ
チド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオ
チドプローブ、並びに（ｉｉｉ）第１実体と特異的に結
合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触さ
せ、（ｃ）第１および第２プローブと存在する全ゆる増
幅したコピー数の標的核酸とのハイブリダイゼーション
および第１実体と第２実体との結合を行って結合複合体
を生成し、（ｄ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結
合核酸から分離し、（ｅ）増幅したコピー数の標的核酸
の存在または非存在を測定することからなる。
【００２９】この発明の他の観点によれば、一本鎖標的
核酸およびその試薬の増幅および検出の効率を改良する
予備増幅捕捉工程について提供される。１つの態様によ
れば組成物が提供され、これは、（ａ）意図するそれぞ
れの一本鎖標的核酸についてのマトリックス捕捉ポリヌ
クレオド（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の相
補的部分に選択的にアニールすることができると共にそ
の標的核酸のプライマーとして機能する）、（ｂ）４つ
の核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、（ｃ）プラ
イマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物を生成し
得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補
的であり、これにプライマーがアニールしてマトリック
ス結合増幅核酸配列を与える）、（ｄ）増幅、マトリッ
クス固定標的核酸の一部とハイブリダイズし得る一本鎖
ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも
１つの成分からなるポリヌクレオチドブローブからな
る。
核酸およびその試薬の増幅および検出の効率を改良する
予備増幅捕捉工程について提供される。１つの態様によ
れば組成物が提供され、これは、（ａ）意図するそれぞ
れの一本鎖標的核酸についてのマトリックス捕捉ポリヌ
クレオド（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の相
補的部分に選択的にアニールすることができると共にそ
の標的核酸のプライマーとして機能する）、（ｂ）４つ
の核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、（ｃ）プラ
イマーおよびモノヌクレオチドから延長生成物を生成し
得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的核酸に相補
的であり、これにプライマーがアニールしてマトリック
ス結合増幅核酸配列を与える）、（ｄ）増幅、マトリッ
クス固定標的核酸の一部とハイブリダイズし得る一本鎖
ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも
１つの成分からなるポリヌクレオチドブローブからな
る。
【００３０】この観点の他の態様によれば、（ａ）ハイ
ブリッドを形成すべく一本鎖標的核酸と意図するそれぞ
れの一本鎖標的核酸についてのマトリックス固定捕捉ポ
リヌクレオチドとを接触させ、（ｂ）ハイブリダイズし
た標的核酸をサンプルから分離し、（ｃ）標的核酸のコ
ピー数を増幅してマトリックス結合増幅コピー数の標的
核酸を生成し、（ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数と増幅した標的核酸の一部にハイブリ
ダイズし得る一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラ
ベル系の少なくとも１つの成分からなるポリヌクレオチ
ドプローブとを接触させ、（ｅ）ハイブリダイズさせて
増幅した標的核酸とプローブとの複合体を形成し、
（ｆ）必要に応じて結合プローブを全ゆる未結合核酸か
ら分離し、（ｇ）結合レベルを観察することにより結合
した増幅標的の存在または非存在を測定することからな
る方法が提供される。
ブリッドを形成すべく一本鎖標的核酸と意図するそれぞ
れの一本鎖標的核酸についてのマトリックス固定捕捉ポ
リヌクレオチドとを接触させ、（ｂ）ハイブリダイズし
た標的核酸をサンプルから分離し、（ｃ）標的核酸のコ
ピー数を増幅してマトリックス結合増幅コピー数の標的
核酸を生成し、（ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数と増幅した標的核酸の一部にハイブリ
ダイズし得る一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラ
ベル系の少なくとも１つの成分からなるポリヌクレオチ
ドプローブとを接触させ、（ｅ）ハイブリダイズさせて
増幅した標的核酸とプローブとの複合体を形成し、
（ｆ）必要に応じて結合プローブを全ゆる未結合核酸か
ら分離し、（ｇ）結合レベルを観察することにより結合
した増幅標的の存在または非存在を測定することからな
る方法が提供される。
【００３１】この観点の他の態様は組成物であり、これ
は、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について
のマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌ
クレオチドは、その標的核酸の相補的部分に選択的にア
ニールし得る）、（ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的
核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプ
ライマーは、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニ
ールし得る）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノ
ヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびオリゴヌクレオ
チドから延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（こ
れは一本鎖の標的核酸に相補的であり、これに対してプ
ライマーがアニールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分
にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｆ）標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、並びに（ｇ）第１実体に特異的に結合し得
る第２実体が付着したマトリックスからなる。
は、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について
のマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌ
クレオチドは、その標的核酸の相補的部分に選択的にア
ニールし得る）、（ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的
核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプ
ライマーは、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニ
ールし得る）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノ
ヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびオリゴヌクレオ
チドから延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（こ
れは一本鎖の標的核酸に相補的であり、これに対してプ
ライマーがアニールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分
にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる
第１ポリヌクレオチドプローブ、（ｆ）標的核酸の第２
部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、並びに（ｇ）第１実体に特異的に結合し得
る第２実体が付着したマトリックスからなる。
【００３２】この観点の他の態様は方法であり、これ
は、（ａ）ハイブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的
核酸と意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についての少
なくとも１つのマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチド
とを接触させ（このポリヌクレオチドは、その標的核酸
の相補的部分に選択的にアニールすることができる）、
（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸をサンプルから分離
し、（ｃ）捕捉配列と重複しないプライマーを添加する
ことにより標的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コ
ピー数の標的核酸を生成し、（ｄ）複合体を形成すべく
未結合増幅標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイ
ブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポ
リヌクレオチドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第２部分
とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブとを接触させ、（ｅ）複合体と第１実体に特異的
に結合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触
させ、（ｆ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核
酸から分離し、（ｇ）結合ラベルを観察することにより
結合増幅標的核酸の存在または非存在を測定することか
らなる。
は、（ａ）ハイブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的
核酸と意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についての少
なくとも１つのマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチド
とを接触させ（このポリヌクレオチドは、その標的核酸
の相補的部分に選択的にアニールすることができる）、
（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸をサンプルから分離
し、（ｃ）捕捉配列と重複しないプライマーを添加する
ことにより標的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コ
ピー数の標的核酸を生成し、（ｄ）複合体を形成すべく
未結合増幅標的核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイ
ブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付
着したラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポ
リヌクレオチドプローブ、（ｉｉ）標的核酸の第２部分
とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブとを接触させ、（ｅ）複合体と第１実体に特異的
に結合し得る第２実体が付着したマトリックスとを接触
させ、（ｆ）必要に応じて結合複合体を全ゆる未結合核
酸から分離し、（ｇ）結合ラベルを観察することにより
結合増幅標的核酸の存在または非存在を測定することか
らなる。
【００３３】他の観点では、本発明によれば、マーカー
核酸を含有し標的核酸を含有する可能性のあるサンプル
中で、一本鎖標的核酸を測定しその増幅の効率を確認す
る組成物が提供される。１つの態様では、この組成物
は、（ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本
鎖マーカー核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマ
ー（そのコピー数は既知である）（このプライマーは、
一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれの
モノヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレ
オチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポ
リメラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカ
ー核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニ
ールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイ
ズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラ
ベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレ
オチド標的プローブ、（ｆ）反応帯域から離間した第１
試験帯域に結合し、標的核酸の第２部分とハイブリダイ
ズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２
ポリヌクレオチド標的プローブ、（ｇ）マーカー核酸の
第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレ
オチド断片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの
成分からなる第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、
並びに（ｈ）反応帯域および第１試験帯域から離間した
第２試験帯域に結合し、マーカー核酸の第２部分にハイ
ブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片から
なる第２ポリヌクレオチドマーカープローブからなる。
核酸を含有し標的核酸を含有する可能性のあるサンプル
中で、一本鎖標的核酸を測定しその増幅の効率を確認す
る組成物が提供される。１つの態様では、この組成物
は、（ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本
鎖マーカー核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマ
ー（そのコピー数は既知である）（このプライマーは、
一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれの
モノヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌクレ
オチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポ
リメラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマーカ
ー核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニ
ールする）、（ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイ
ズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラ
ベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレ
オチド標的プローブ、（ｆ）反応帯域から離間した第１
試験帯域に結合し、標的核酸の第２部分とハイブリダイ
ズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第２
ポリヌクレオチド標的プローブ、（ｇ）マーカー核酸の
第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレ
オチド断片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの
成分からなる第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、
並びに（ｈ）反応帯域および第１試験帯域から離間した
第２試験帯域に結合し、マーカー核酸の第２部分にハイ
ブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片から
なる第２ポリヌクレオチドマーカープローブからなる。
【００３４】この観点の他の態様は方法であり、これ
は、（ａ）反応帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸の相
補的部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチド
プライマーとを接触させ、（ｂ）反応帯域中で既知のコ
ピー数のマーカー核酸を含有するサンプルと一本鎖マー
カー核酸の相補的部分に選択的にアニールし得るオリゴ
ヌクレオチドプライマーとを接触させ、（ｃ）核酸ポリ
メラーゼとの接触により反応帯域中で標的およびマーカ
ー核酸のコピー数を増幅し、（ｄ）反応帯域中で、ハイ
ブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー数の標的お
よびマーカー核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブ
リダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１
ポリヌクレオチド標的プローブおよび（ｉｉ）マーカー
核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片に付着した第２ラベル系の少なくとも
１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドマーカープロ
ーブとを接触させ、（ｅ）第１マーカーおよび標的プロ
ーブと増幅したコピー数のマーカー核酸および存在し得
る全ゆる標的核酸とをそれぞれハイブリダイズさせてマ
ーカーおよび標的ハイブリッドを形成し、（ｆ）反応帯
域から離間した第１試験帯域中でかくして処理したサン
プルの第１分画と第１試験帯域に結合した第２ポリヌク
レオチド標的プローブとを接触させて第２標的プローブ
と存在する全ゆる増幅したコピー数の標的核酸とをハイ
ブリダイズさせ、（ｇ）反応帯域および第１試験帯域か
ら離間した第２試験帯域中でかくして処理されたサンプ
ルの第２分画と第２試験帯域に結合した第２ポリヌクレ
オチドマーカープローブとを接触させて第２マーカープ
ローブと増幅したコピー数のマーカー核酸とをハイブリ
ダイズさせ、（ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未
結合核酸を分離し、（ｉ）第１試験帯域中に存在する全
ゆる標的核酸のコピー数および第２試験帯域中のマーカ
ー核酸のコピー数を測定することからなる。前記した態
様では、第１および第２ラベル系は同一または異なるも
のとすることができる。
は、（ａ）反応帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸の相
補的部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチド
プライマーとを接触させ、（ｂ）反応帯域中で既知のコ
ピー数のマーカー核酸を含有するサンプルと一本鎖マー
カー核酸の相補的部分に選択的にアニールし得るオリゴ
ヌクレオチドプライマーとを接触させ、（ｃ）核酸ポリ
メラーゼとの接触により反応帯域中で標的およびマーカ
ー核酸のコピー数を増幅し、（ｄ）反応帯域中で、ハイ
ブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー数の標的お
よびマーカー核酸と（ｉ）標的核酸の第１部分とハイブ
リダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第１ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１
ポリヌクレオチド標的プローブおよび（ｉｉ）マーカー
核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片に付着した第２ラベル系の少なくとも
１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドマーカープロ
ーブとを接触させ、（ｅ）第１マーカーおよび標的プロ
ーブと増幅したコピー数のマーカー核酸および存在し得
る全ゆる標的核酸とをそれぞれハイブリダイズさせてマ
ーカーおよび標的ハイブリッドを形成し、（ｆ）反応帯
域から離間した第１試験帯域中でかくして処理したサン
プルの第１分画と第１試験帯域に結合した第２ポリヌク
レオチド標的プローブとを接触させて第２標的プローブ
と存在する全ゆる増幅したコピー数の標的核酸とをハイ
ブリダイズさせ、（ｇ）反応帯域および第１試験帯域か
ら離間した第２試験帯域中でかくして処理されたサンプ
ルの第２分画と第２試験帯域に結合した第２ポリヌクレ
オチドマーカープローブとを接触させて第２マーカープ
ローブと増幅したコピー数のマーカー核酸とをハイブリ
ダイズさせ、（ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未
結合核酸を分離し、（ｉ）第１試験帯域中に存在する全
ゆる標的核酸のコピー数および第２試験帯域中のマーカ
ー核酸のコピー数を測定することからなる。前記した態
様では、第１および第２ラベル系は同一または異なるも
のとすることができる。
【００３５】この観点の他の態様は組成物であり、これ
は、（ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本
鎖核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（サン
プル中のそのコピー数は既知である）（このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞ
れのモノヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌ
クレオチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核
酸ポリメラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマ
ーカー核酸に相補的であり、これにプライマーがアニー
ルする）、（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズ
し得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１
ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌク
レオチド標的プローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハ
イブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に
付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プ
ローブ、（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体
が結合した標的試験帯域、（ｈ）マーカー核酸の第１部
分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド
断片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分か
らなる第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、（ｉ）
マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一
本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる
第２ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｊ）
第３実体と特異的に結合し得る第４実体が結合した標的
試験帯域からなる。
は、（ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本
鎖核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマー（サン
プル中のそのコピー数は既知である）（このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、（ｃ）４つの核酸塩基のそれぞ
れのモノヌクレオチド、（ｄ）プライマーおよびモノヌ
クレオチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核
酸ポリメラーゼ（これはそれぞれ一本鎖の標的およびマ
ーカー核酸に相補的であり、これにプライマーがアニー
ルする）、（ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズ
し得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１
ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌク
レオチド標的プローブ、（ｆ）標的核酸の第２部分にハ
イブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に
付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プ
ローブ、（ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体
が結合した標的試験帯域、（ｈ）マーカー核酸の第１部
分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド
断片に付着した第２ラベル系の少なくとも１つの成分か
らなる第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、（ｉ）
マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一
本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる
第２ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに（ｊ）
第３実体と特異的に結合し得る第４実体が結合した標的
試験帯域からなる。
【００３６】前記した態様では、第１および第２ラベル
系は同一とすることができ、この場合、第１および第２
結合実体対は第３および第４結合実体対と異なる。ま
た、第１および第２ラベル系が識別し得る程異なる場
合、第１および第２結合実体対は第２および第４結合実
体対と同一とすることができる。
系は同一とすることができ、この場合、第１および第２
結合実体対は第３および第４結合実体対と異なる。ま
た、第１および第２ラベル系が識別し得る程異なる場
合、第１および第２結合実体対は第２および第４結合実
体対と同一とすることができる。
【００３７】この観点の他の態様は方法であり、これ
は、（ａ）反応帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接
触させ（このプライマーは、一本鎖標的核酸の相補的部
分に選択的にアニールすることができる）、（ｂ）反応
帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（サ
ンプル中のそのコピー数は既知であり、このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、（ｃ）サンプルと核酸ポリメラ
ーゼとを接触させることにより、反応帯域中でサンプル
中の標的およびマーカー核酸のコピー数を増幅し、
（ｄ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数の標的核酸と（ｉ）ラベル部分および
ラベル部分に付着した標的核酸の第１部分とハイブリダ
イズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第
１ポリヌクレオチド標的プローブおよび（ｉｉ）標的核
酸の第２部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌ
クレオチド断片および第２ポリヌクレオチド断片に付着
した第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プロー
ブとを接触させ、（ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズ
し得る条件下で、増幅したコピー数のマーカー核酸と
（ｉ）ラベル部分およびラベルに付着したマーカー核酸
の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片からなる第１ポリヌクレオチドマーカープ
ローブおよび（ｉｉ）マーカー核酸の第２部分とハイブ
リダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および
第２ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる
第２ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触させ、
（ｆ）（ｉ）第１および第２標的プローブと存在する全
ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、および（ｉｉ）
第１および第２マーカープローブと存在する増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とのハイブリダイゼーションを行
い、（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの分
画と第１試験帯域（これは反応帯域から離間し、これに
第２実体が結合する）中の第１実体と特異的に結合し得
る第２実体とを接触させ、（ｈ）かくして工程（ａ）〜
（ｆ）で処理したサンプルの他の分画と第２試験帯域
（これは反応帯域および第１試験帯域から離間し、これ
に第４実体が結合する）中の第３実体と特異的に結合し
得る第４実体とを接触させ、（ｉ）試験帯域に結合した
核酸を全ゆる未結合核酸から分離し、（ｊ）増幅された
マーカー核酸のコピー数および全ゆる標的核酸の存在ま
たは非存在を測定することからなる。
は、（ａ）反応帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖標
的核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接
触させ（このプライマーは、一本鎖標的核酸の相補的部
分に選択的にアニールすることができる）、（ｂ）反応
帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（サ
ンプル中のそのコピー数は既知であり、このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、（ｃ）サンプルと核酸ポリメラ
ーゼとを接触させることにより、反応帯域中でサンプル
中の標的およびマーカー核酸のコピー数を増幅し、
（ｄ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数の標的核酸と（ｉ）ラベル部分および
ラベル部分に付着した標的核酸の第１部分とハイブリダ
イズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第
１ポリヌクレオチド標的プローブおよび（ｉｉ）標的核
酸の第２部分にハイブリダイズし得る第２一本鎖ポリヌ
クレオチド断片および第２ポリヌクレオチド断片に付着
した第１実体からなる第２ポリヌクレオチド標的プロー
ブとを接触させ、（ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズ
し得る条件下で、増幅したコピー数のマーカー核酸と
（ｉ）ラベル部分およびラベルに付着したマーカー核酸
の第１部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌク
レオチド断片からなる第１ポリヌクレオチドマーカープ
ローブおよび（ｉｉ）マーカー核酸の第２部分とハイブ
リダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および
第２ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体からなる
第２ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触させ、
（ｆ）（ｉ）第１および第２標的プローブと存在する全
ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、および（ｉｉ）
第１および第２マーカープローブと存在する増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とのハイブリダイゼーションを行
い、（ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの分
画と第１試験帯域（これは反応帯域から離間し、これに
第２実体が結合する）中の第１実体と特異的に結合し得
る第２実体とを接触させ、（ｈ）かくして工程（ａ）〜
（ｆ）で処理したサンプルの他の分画と第２試験帯域
（これは反応帯域および第１試験帯域から離間し、これ
に第４実体が結合する）中の第３実体と特異的に結合し
得る第４実体とを接触させ、（ｉ）試験帯域に結合した
核酸を全ゆる未結合核酸から分離し、（ｊ）増幅された
マーカー核酸のコピー数および全ゆる標的核酸の存在ま
たは非存在を測定することからなる。
【００３８】更に他の観点では、本発明によれば、試験
に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を増幅し検
出する組成物が提供される。多数の組合せのポリヌクレ
オチドプライマーにより、単一の増幅反応混合物内での
１以上の標的核酸配列の特異的な増幅が可能となり、第
１および第２ポリヌクレオチドプローブの多数の組合せ
の使用により、増幅された標的核酸配列の１以上の検出
が可能となる。これらの組成物は、陰性の結果の信頼性
を確立するために増幅反応の効率の測定を単純化するの
に有用である。またこれらは、試験に供する特定のサン
プル上で１以上の測定を同時に行うのに有用である。
に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を増幅し検
出する組成物が提供される。多数の組合せのポリヌクレ
オチドプライマーにより、単一の増幅反応混合物内での
１以上の標的核酸配列の特異的な増幅が可能となり、第
１および第２ポリヌクレオチドプローブの多数の組合せ
の使用により、増幅された標的核酸配列の１以上の検出
が可能となる。これらの組成物は、陰性の結果の信頼性
を確立するために増幅反応の効率の測定を単純化するの
に有用である。またこれらは、試験に供する特定のサン
プル上で１以上の測定を同時に行うのに有用である。
【００３９】１つの態様では、この発明によれば、試験
に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する
組成物が提供される。この組成物は、（ａ）意図するそ
れぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチド
プライマー（このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標
的核酸の１つの相補的部分に選択的にアニールすること
ができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌ
クレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチド
から反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラ
ーゼ（この延長生成物は、一本鎖の標的核酸に相補的で
あり、これに特定のプライマーがアニールする）、
（ｄ）ラベル部分およびラベル部分に付着した第１一本
鎖ポリヌクレオチド断片からなるそれぞれの核酸標的に
ついての第１ポリヌクレオチドプローブ（第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片のそれぞれは、そのそれぞれの標的
核酸の第１部分にハイブリダイズし得る）、（ｅ）その
標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得てそれぞれの
他の標的核酸試験帯域から離間した試験帯域に結合した
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるそれぞれの核
酸標的についての第２ポリヌクレオチドプローブからな
る。
に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を測定する
組成物が提供される。この組成物は、（ａ）意図するそ
れぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌクレオチド
プライマー（このプライマーのそれぞれは、一本鎖の標
的核酸の１つの相補的部分に選択的にアニールすること
ができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌ
クレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチド
から反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラ
ーゼ（この延長生成物は、一本鎖の標的核酸に相補的で
あり、これに特定のプライマーがアニールする）、
（ｄ）ラベル部分およびラベル部分に付着した第１一本
鎖ポリヌクレオチド断片からなるそれぞれの核酸標的に
ついての第１ポリヌクレオチドプローブ（第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片のそれぞれは、そのそれぞれの標的
核酸の第１部分にハイブリダイズし得る）、（ｅ）その
標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得てそれぞれの
他の標的核酸試験帯域から離間した試験帯域に結合した
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなるそれぞれの核
酸標的についての第２ポリヌクレオチドプローブからな
る。
【００４０】この観点の他の態様では、この発明によれ
ば、試験に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を
測定する組成物が提供される。この組成物は、（ａ）意
図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌク
レオチドプライマー（このプライマーのそれぞれは、一
本鎖の標的核酸の１つの相補的部分に選択的にアニール
することができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれ
のモノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌク
レオチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸
ポリメラーゼ（この延長生成物は、特定のプライマーが
アニールする一本鎖の標的核酸に相補的である）、
（ｄ）その標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベルから
なるそれぞれの核酸標的についての第１ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｅ）その標的核酸の第２部分にハイブリ
ダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第
２ポリヌクレオチド断片に付着した特異的結合実体から
なるそれぞれの核酸標的についての第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、並びに（ｆ）それぞれ反応帯域およびそれ
ぞれの他の試験帯域から離間し、結合パートナー（これ
は意図する標的核酸についての第２プローブに付着した
特異的結合実体とのみ結合し得る）がそれぞれ付着した
複数の試験帯域からなる。
ば、試験に供するサンプル中の複数の一本鎖標的核酸を
測定する組成物が提供される。この組成物は、（ａ）意
図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオリゴヌク
レオチドプライマー（このプライマーのそれぞれは、一
本鎖の標的核酸の１つの相補的部分に選択的にアニール
することができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれ
のモノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌク
レオチドから反応帯域中で延長生成物を生成し得る核酸
ポリメラーゼ（この延長生成物は、特定のプライマーが
アニールする一本鎖の標的核酸に相補的である）、
（ｄ）その標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベルから
なるそれぞれの核酸標的についての第１ポリヌクレオチ
ドプローブ、（ｅ）その標的核酸の第２部分にハイブリ
ダイズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第
２ポリヌクレオチド断片に付着した特異的結合実体から
なるそれぞれの核酸標的についての第２ポリヌクレオチ
ドプローブ、並びに（ｆ）それぞれ反応帯域およびそれ
ぞれの他の試験帯域から離間し、結合パートナー（これ
は意図する標的核酸についての第２プローブに付着した
特異的結合実体とのみ結合し得る）がそれぞれ付着した
複数の試験帯域からなる。
【００４１】他の観点では、この発明によれば、増幅の
特性とハイブリダイゼーション凝集のものとを組合せる
組成物および方法が提供される。ハイブリダイゼーショ
ン凝集は、１９８７年１月１５日に米国出願第００５，
３２７号として出願されたエンゲルハードとラバニの
「遺伝物質の検出のためのハイブリダイゼーション方
法」と題する共に譲渡され同時係属中の出願に詳述され
ている。この出願の開示を参考としてここに取り入れ
る。この出願は、米国出願番号第６５３，８１６号（１
９８４年９月２４日出願）から誘導され、これは米国出
願番号第６０５，０２２（１９８４年４月２７日出願）
から誘導される。
特性とハイブリダイゼーション凝集のものとを組合せる
組成物および方法が提供される。ハイブリダイゼーショ
ン凝集は、１９８７年１月１５日に米国出願第００５，
３２７号として出願されたエンゲルハードとラバニの
「遺伝物質の検出のためのハイブリダイゼーション方
法」と題する共に譲渡され同時係属中の出願に詳述され
ている。この出願の開示を参考としてここに取り入れ
る。この出願は、米国出願番号第６５３，８１６号（１
９８４年９月２４日出願）から誘導され、これは米国出
願番号第６０５，０２２（１９８４年４月２７日出願）
から誘導される。
【００４２】この観点の１つの態様は組成物であり、こ
れは、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸につい
てのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれの
モノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレ
オチドから延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ
（これは一本鎖の標的核酸に相補的であり、これにプラ
イマーがアニールして増幅した核酸配列を与える）、
（ｄ）標的核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖
ポリヌクレオチド断片が付着した第１粒子からなる第１
ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｅ）標的核酸の第
２部分に相補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片が付着した第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブからなる。
れは、（ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸につい
てのオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマー
は、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができる）、（ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれの
モノヌクレオチド、（ｃ）プライマーおよびモノヌクレ
オチドから延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ
（これは一本鎖の標的核酸に相補的であり、これにプラ
イマーがアニールして増幅した核酸配列を与える）、
（ｄ）標的核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖
ポリヌクレオチド断片が付着した第１粒子からなる第１
ポリヌクレオチドプローブ、並びに（ｅ）標的核酸の第
２部分に相補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片が付着した第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブからなる。
【００４３】この観点の他の態様によれば、その方法が
提供され、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、（ｂ）
ハイブリダイズし得る条件下で、標的核酸と（ｉ）標的
核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレ
オチド断片が付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブおよび（ｉｉ）標的核酸の第２部分に相
補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着し
た第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを
接触させ、（ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸
の第１部分および第２断片と標的核酸の第２部分とをハ
イブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションにより結果
的に凝集を与え、（ｄ）凝集を測定する工程からなる。
提供され、（ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、（ｂ）
ハイブリダイズし得る条件下で、標的核酸と（ｉ）標的
核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌクレ
オチド断片が付着した第１粒子からなる第１ポリヌクレ
オチドプローブおよび（ｉｉ）標的核酸の第２部分に相
補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断片が付着し
た第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプローブとを
接触させ、（ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸
の第１部分および第２断片と標的核酸の第２部分とをハ
イブリダイズさせ、ハイブリダイゼーションにより結果
的に凝集を与え、（ｄ）凝集を測定する工程からなる。
【００４４】
【実施例】実施例１ Ｅ−Ｂ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢ
Ｖ）（プラスミドＤＮＡの精製調製物並びにＥＢＶ感染
リンパ球細胞の組成細胞溶解物中に含有される）を、ポ
リメラーゼ鎖反応技術により酵素的に増幅し、ハイブリ
ッド捕捉により検出した。
Ｖ）（プラスミドＤＮＡの精製調製物並びにＥＢＶ感染
リンパ球細胞の組成細胞溶解物中に含有される）を、ポ
リメラーゼ鎖反応技術により酵素的に増幅し、ハイブリ
ッド捕捉により検出した。
【００４５】試薬 特に記載しない限り、化学試薬はアルドリッチ社から購
入した。デテク１−ｈｒｐ、デデク−１ａｌｋ、バイオ
ブリッジＡ、ターミナルデオキシヌクレオチドトランス
フェラーゼおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰは、エンゾ
ー・バイオケム社から、サーマス・アクアチカス（Ｔａ
ｑ）ポリメラーゼは、ペルキン−エルマー／シータスか
ら購入した。ｐＵＣ１８はインターナショナル・バイオ
テクノロジイス社から得た。デオキシヌクレオシドトリ
リン酸および硫酸デキストランは、ファルマシアから得
た。オルソフェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰ
Ｄ）、ポルシン皮膚ゼラチン、過酸化水素、セファデッ
クスＧ−２５並びにトリトンＸ−１００はシグマから得
た。イムロン２マイクロメータプレートは、ダイナテッ
クから購入した。ホルムアミドはフルカから得た。ＲＰ
ＭＩ１６４０培養培地および熱失活ウシ胎児血清はギブ
コから購入した。バイオジンＢ膜はパール・コーポレー
ションから購入した。ヌシーブアガロースおよびセアケ
ムアガロースはＦＭＣから購入した。
入した。デテク１−ｈｒｐ、デデク−１ａｌｋ、バイオ
ブリッジＡ、ターミナルデオキシヌクレオチドトランス
フェラーゼおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰは、エンゾ
ー・バイオケム社から、サーマス・アクアチカス（Ｔａ
ｑ）ポリメラーゼは、ペルキン−エルマー／シータスか
ら購入した。ｐＵＣ１８はインターナショナル・バイオ
テクノロジイス社から得た。デオキシヌクレオシドトリ
リン酸および硫酸デキストランは、ファルマシアから得
た。オルソフェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰ
Ｄ）、ポルシン皮膚ゼラチン、過酸化水素、セファデッ
クスＧ−２５並びにトリトンＸ−１００はシグマから得
た。イムロン２マイクロメータプレートは、ダイナテッ
クから購入した。ホルムアミドはフルカから得た。ＲＰ
ＭＩ１６４０培養培地および熱失活ウシ胎児血清はギブ
コから購入した。バイオジンＢ膜はパール・コーポレー
ションから購入した。ヌシーブアガロースおよびセアケ
ムアガロースはＦＭＣから購入した。
【００４６】ハイブリダイゼーションおよび検出アッセ
イで使用した緩衝液は、次の保存溶液から調製した：
１）２０ｘＳＳＣ含有３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸
ナトリウム、２）２０ｘＳＳＰＥ含有３．６ＭＮａＣ
ｌ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、並び
に０．０２Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、３）クエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．３（０．０５
Ｍクエン酸および０．１ＭＮａ ２ＨＰＯ４を含有して組
合せ５．３のｐＨを与える）、４）１０ｘＰＢＳ（１．
５ＭＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．２を含有する）、並びに５）デンハードの溶液（１
％フィコール、１％ポリビニルピロリドン並びに１％ウ
シ血清アルブミンを含有する）。
イで使用した緩衝液は、次の保存溶液から調製した：
１）２０ｘＳＳＣ含有３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸
ナトリウム、２）２０ｘＳＳＰＥ含有３．６ＭＮａＣ
ｌ、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、並び
に０．０２Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、３）クエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．３（０．０５
Ｍクエン酸および０．１ＭＮａ ２ＨＰＯ４を含有して組
合せ５．３のｐＨを与える）、４）１０ｘＰＢＳ（１．
５ＭＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
７．２を含有する）、並びに５）デンハードの溶液（１
％フィコール、１％ポリビニルピロリドン並びに１％ウ
シ血清アルブミンを含有する）。
【００４７】オリゴヌクレオチド合成、精製並びにラベ
ル ホスホルアミダイト法により、フプライド・バイオシス
テムス社装置、モデル３８０Ｂによりオリゴヌクレオチ
ドを合成した。０．２μｍｏｌおよび１μｍｏｌ合成サ
イクルの両者を用いた。シアノエチルホスホルアミダイ
トおよび試薬を、製造業者により推奨されたようにして
使用した。鎖延長の際のホスホルアミダイト添加は、ト
リチルカチオンの遊離により監視した。オリゴヌクレオ
チドを支持体から開裂させた後にジメトキシトリチルエ
ーテルとして保護された５′ヒドロキシルを残す手順を
使用した。合成および支持体からの開裂の後に、オリゴ
マーを、５５°Ｃで一夜アンモニアにより処理すること
により脱保護し、溶液を続いて蒸発させて乾燥した。
ル ホスホルアミダイト法により、フプライド・バイオシス
テムス社装置、モデル３８０Ｂによりオリゴヌクレオチ
ドを合成した。０．２μｍｏｌおよび１μｍｏｌ合成サ
イクルの両者を用いた。シアノエチルホスホルアミダイ
トおよび試薬を、製造業者により推奨されたようにして
使用した。鎖延長の際のホスホルアミダイト添加は、ト
リチルカチオンの遊離により監視した。オリゴヌクレオ
チドを支持体から開裂させた後にジメトキシトリチルエ
ーテルとして保護された５′ヒドロキシルを残す手順を
使用した。合成および支持体からの開裂の後に、オリゴ
マーを、５５°Ｃで一夜アンモニアにより処理すること
により脱保護し、溶液を続いて蒸発させて乾燥した。
【００４８】５′−Ｏ−ジメトキシトリチルオリゴヌク
レオチドを１ｍｌの１０ｍＭトリエチルアンモニウム・
ビカーボネート、ｐＨ７．５〜９．０に再溶解し、ワッ
トマン・パラチシルＭ−２０ＯＤＳ−３（Ｃ１８半調製
用）ＨＰＬＣカラムを使用して精製した。１：９９でア
セトニトリル：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、
ｐＨ７．０（ＴＥＡＡ）中でカラムを平衡化した。７５
吸収単位（２６０ｎｍ）までカラムに注入した。オリゴ
ヌクレオチドを、流速４ｍｌ／分にて、１：９９アセト
ニトリル：ＴＥＡＡを使用して１分間溶出させた後、２
０分間かけて１〜３０％アセトニトリル直線グラジエン
トを行った。トリチル化オリゴマーは、１９〜２３分の
範囲の保持時間にて単独ピークとして溶出された。溶媒
を留去した後、０．５ｍｌの８０％酢酸に２０分間溶解
することによりオリゴマーを脱トリチル化し、その後凍
結乾燥した。最終精製は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中
でセファデックスＧ−２５クロマトグラフィにより行っ
た。オリゴマーを含有する画分を凍結乾燥し、滅菌水に
再懸濁した。
レオチドを１ｍｌの１０ｍＭトリエチルアンモニウム・
ビカーボネート、ｐＨ７．５〜９．０に再溶解し、ワッ
トマン・パラチシルＭ−２０ＯＤＳ−３（Ｃ１８半調製
用）ＨＰＬＣカラムを使用して精製した。１：９９でア
セトニトリル：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、
ｐＨ７．０（ＴＥＡＡ）中でカラムを平衡化した。７５
吸収単位（２６０ｎｍ）までカラムに注入した。オリゴ
ヌクレオチドを、流速４ｍｌ／分にて、１：９９アセト
ニトリル：ＴＥＡＡを使用して１分間溶出させた後、２
０分間かけて１〜３０％アセトニトリル直線グラジエン
トを行った。トリチル化オリゴマーは、１９〜２３分の
範囲の保持時間にて単独ピークとして溶出された。溶媒
を留去した後、０．５ｍｌの８０％酢酸に２０分間溶解
することによりオリゴマーを脱トリチル化し、その後凍
結乾燥した。最終精製は、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中
でセファデックスＧ−２５クロマトグラフィにより行っ
た。オリゴマーを含有する画分を凍結乾燥し、滅菌水に
再懸濁した。
【００４９】クックら、「一連のビオチニル化オリゴヌ
クレオチドの合成およびハイブリダイゼーション」、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：４
０７７〜４０９５（１９８８）に先に記載されたように
して、モル当り約３〜４ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基
を用いてオリゴヌクレオチドを３′末端ラベルした。ハ
イブリッド捕捉アッセイについてのシグナルオリゴヌク
レオチドは、０．２Ｍカコジル酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、ターミナル
トランスフェラーゼ（２０〜５０単位／μｇオリゴマ
ー）、０．４ｍＭＴＴＰ並びに２０μｇ／ｍｌオリゴヌ
クレオチドを含有する反応混合物中で、ＴＭＰの重合体
により３′末端ラベルした。反応を完了まで行わせ（３
７°Ｃで９０分〜２時間）、最終濃度２５ｍＭでＥＤＴ
Ａを添加することにより終了させた。ビオチンラベルお
よびポリＴラベルしたオリゴヌクレオチドを、更に精製
することなく使用した。
クレオチドの合成およびハイブリダイゼーション」、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６：４
０７７〜４０９５（１９８８）に先に記載されたように
して、モル当り約３〜４ビオチン−１１−ｄＵＴＰ残基
を用いてオリゴヌクレオチドを３′末端ラベルした。ハ
イブリッド捕捉アッセイについてのシグナルオリゴヌク
レオチドは、０．２Ｍカコジル酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、ターミナル
トランスフェラーゼ（２０〜５０単位／μｇオリゴマ
ー）、０．４ｍＭＴＴＰ並びに２０μｇ／ｍｌオリゴヌ
クレオチドを含有する反応混合物中で、ＴＭＰの重合体
により３′末端ラベルした。反応を完了まで行わせ（３
７°Ｃで９０分〜２時間）、最終濃度２５ｍＭでＥＤＴ
Ａを添加することにより終了させた。ビオチンラベルお
よびポリＴラベルしたオリゴヌクレオチドを、更に精製
することなく使用した。
【００５０】細胞溶解物の調製 Ｂ９５−８、ラジ、ナマルワとラモス細胞を、１０％熱
失活ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で維
持した。低速遠心により細胞を補集し、培地を除去し、
細胞を１０μｌのＰＢＳに再懸濁した。滅菌水によりサ
ンプル容積を４５μｌに増加させ、酵素的増幅に供し
た。
失活ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で維
持した。低速遠心により細胞を補集し、培地を除去し、
細胞を１０μｌのＰＢＳに再懸濁した。滅菌水によりサ
ンプル容積を４５μｌに増加させ、酵素的増幅に供し
た。
【００５１】増幅反応 ４５μｌ容量の精製したプラスミドＤＮＡまたはリンパ
球細胞を９２°Ｃに１０分間加熱し、速やかに冷却し
た。煮沸したサンプルを５５μｌの１．８ｘ保存反応緩
衝液と混合し、最終反応混合物が、５０ｍＭＫＣｌ、１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇ
Ｃｌ２、０．０１％ゼラチン、２００μＭのそれぞれの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、並びに
１μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマーを含
有するものとした。２．５単位のＴａｑポリメラーゼを
添加することにより反応を開始した。９２°Ｃでの１分
間の変性工程、３７°Ｃでの２分間のアニール工程、並
びに７０°Ｃでの３分間の延長工程により、サンプルを
繰返し循環させた。最後のサイクルの後、サンプルを１
分間９２°Ｃに加熱し、速やかに冷却した。
球細胞を９２°Ｃに１０分間加熱し、速やかに冷却し
た。煮沸したサンプルを５５μｌの１．８ｘ保存反応緩
衝液と混合し、最終反応混合物が、５０ｍＭＫＣｌ、１
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇ
Ｃｌ２、０．０１％ゼラチン、２００μＭのそれぞれの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、並びに
１μＭのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマーを含
有するものとした。２．５単位のＴａｑポリメラーゼを
添加することにより反応を開始した。９２°Ｃでの１分
間の変性工程、３７°Ｃでの２分間のアニール工程、並
びに７０°Ｃでの３分間の延長工程により、サンプルを
繰返し循環させた。最後のサイクルの後、サンプルを１
分間９２°Ｃに加熱し、速やかに冷却した。
【００５２】ハイブリッド捕捉および検出 ９６穴の独立した穴のイムロン２プレートを１Ｍ酢酸ア
ンモニウムにより２回リンスした。５０ｎｇの捕捉オリ
ゴヌクレオチドを、１Ｍ酢酸アンモニウム中にてプレー
トの穴に添加した。プレートを３７°Ｃで一夜インキュ
ベートして乾燥し、その後直ちに使用するか、使用の前
に４°Ｃで保存した。結合した捕捉オリゴヌクレオチド
を有するプレートを、調製物中で０．５ｘＳＳＣ、０．
１％トリトンＸ−１００により予備洗浄し、ハイブリッ
ド捕捉アッセイにおける使用を図った。
ンモニウムにより２回リンスした。５０ｎｇの捕捉オリ
ゴヌクレオチドを、１Ｍ酢酸アンモニウム中にてプレー
トの穴に添加した。プレートを３７°Ｃで一夜インキュ
ベートして乾燥し、その後直ちに使用するか、使用の前
に４°Ｃで保存した。結合した捕捉オリゴヌクレオチド
を有するプレートを、調製物中で０．５ｘＳＳＣ、０．
１％トリトンＸ−１００により予備洗浄し、ハイブリッ
ド捕捉アッセイにおける使用を図った。
【００５３】分析に供するサンプルを９２°Ｃで１０分
間熱変性させ、速やかに冷却し、滅菌水中で希釈した。
希釈したサンプルを、終濃度で２０％ホルムアミド、１
ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−
１００並びに５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリゴヌクレオ
チド（３′−ポリＴ尾部を含有する）を含有するハイブ
リダイゼーション溶液に添加した。それぞれのサンプル
の１００μｌを三連でオリゴヌクレオチド被覆穴に添加
し、（振盪しつつ）１時間室温でハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーションの後、０．０５ｘＳＳＣ、
０．１％トリトンＸ−１００を用いて４回穴を洗浄し、
バイオブリッジＡ（２ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−
１００中でエンゾーの仕様書により希釈）をそれぞれの
穴に添加し、室温で２．５分間インキュベートした。
０．５ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−１００、並びに
デテク１ｈｒｐブランドのストレプトアビジン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体により穴を３回洗浄し、
０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．３％ゼラチ
ン、０．２５％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩
衝塩類溶液中で希釈し、０．０１％チメロゾルをそれぞ
れの穴に添加し、室温で１５分間（振盪しつつ）インキ
ュベートした。０．５ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−
１００により穴を３回洗浄し、その後５ｍＭＥＤＴＡを
含有するＰＢＳにより３回洗浄した。クエン酸リン酸緩
衝液（ｐＨ５．３）中に０．０１２５％過酸化水素およ
び１．６ｍｇ／ｍｌオルソフェニレンジアミンを含有す
る１５０μｌの反応混合物を添加することによりシグナ
ルを生成させた。５０μｌの４ＮＨ２ＳＯ４を添加する
ことにより発色の進行を停止させ、４９０ｎｍにおける
光学密度測定を、インタームド・イムノリーダー・モデ
ルＮＪ２０００により行った。３，３′，５，５′−テ
トラメチルベンジデンのような他の発色性指示薬も使用
することができる。
間熱変性させ、速やかに冷却し、滅菌水中で希釈した。
希釈したサンプルを、終濃度で２０％ホルムアミド、１
ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％トリトンＸ−
１００並びに５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリゴヌクレオ
チド（３′−ポリＴ尾部を含有する）を含有するハイブ
リダイゼーション溶液に添加した。それぞれのサンプル
の１００μｌを三連でオリゴヌクレオチド被覆穴に添加
し、（振盪しつつ）１時間室温でハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイゼーションの後、０．０５ｘＳＳＣ、
０．１％トリトンＸ−１００を用いて４回穴を洗浄し、
バイオブリッジＡ（２ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−
１００中でエンゾーの仕様書により希釈）をそれぞれの
穴に添加し、室温で２．５分間インキュベートした。
０．５ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−１００、並びに
デテク１ｈｒｐブランドのストレプトアビジン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ複合体により穴を３回洗浄し、
０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．３％ゼラチ
ン、０．２５％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩
衝塩類溶液中で希釈し、０．０１％チメロゾルをそれぞ
れの穴に添加し、室温で１５分間（振盪しつつ）インキ
ュベートした。０．５ｘＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−
１００により穴を３回洗浄し、その後５ｍＭＥＤＴＡを
含有するＰＢＳにより３回洗浄した。クエン酸リン酸緩
衝液（ｐＨ５．３）中に０．０１２５％過酸化水素およ
び１．６ｍｇ／ｍｌオルソフェニレンジアミンを含有す
る１５０μｌの反応混合物を添加することによりシグナ
ルを生成させた。５０μｌの４ＮＨ２ＳＯ４を添加する
ことにより発色の進行を停止させ、４９０ｎｍにおける
光学密度測定を、インタームド・イムノリーダー・モデ
ルＮＪ２０００により行った。３，３′，５，５′−テ
トラメチルベンジデンのような他の発色性指示薬も使用
することができる。
【００５４】アガロースゲル電気泳動およびサザンブロ
ットハイブリダイゼーション 増幅した生成物を、０．０４Ｍトリス−酢酸、０．００
２ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）並びに０．２μｇ／ｍｌ臭
化エチジウム中に３％ヌシーブアガロース、１％セアケ
ムアガロースを含有するアガロースゲル中で電気泳動に
供した。電気泳動の後、０．４ＮＮａＯＨ、０．６ＮＮ
ａＣｌ中でＤＮＡを変性させ、バイオジンＢ膜に対して
一夜移行させた。６ｘＳＳＣ、５ｘデンハードの溶液、
０．１％ＳＤＳ並びに１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子
ＤＮＡを含有する緩衝液中で、５５℃にて６０分間膜を
予備ハイブリダイズさせた。５５°Ｃで１０％硫酸デキ
ストランを用い、予備ハイブリダイゼーション緩衝液中
に３′−ビオチン−１１−ｄＵＭＰ尾部を含有するオリ
ゴヌクレオチドＥＢＶ５（１００ｎｇ／ｍｌ）（図１参
照）にＤＮＡをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼ
ーションの後、室温で３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによ
り１０分間膜を洗浄し、同じ緩衝液中で５５°Ｃにて３
回（洗浄当り１０分間）行った。膜を、１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、３ｍ
ＭＭｇＣｌ２並びに０．５％ツイーン２０（溶液Ａ）中
でリンスし、その後０．５％カゼインを含有するＰＢＳ
により１５分間予備ブロックした。デテク１−ａｌｋ中
で室温にて１５分間膜をインキュベートし、１００ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、
３ｍＭＭｇＣｌ２並びに０．０５％ツイーン２０中で希
釈した。溶液Ａにより洗浄した後、１００ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、７５ｍｇ／ｍｌニトロブルー・テトラゾリ
ウム並びに５０ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸を含有する検出緩衝液を添加した。
フィルタを検出緩衝液から除去し、これを水でリンスす
ることにより、約５分後に発色の進行を停止した。
ットハイブリダイゼーション 増幅した生成物を、０．０４Ｍトリス−酢酸、０．００
２ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）並びに０．２μｇ／ｍｌ臭
化エチジウム中に３％ヌシーブアガロース、１％セアケ
ムアガロースを含有するアガロースゲル中で電気泳動に
供した。電気泳動の後、０．４ＮＮａＯＨ、０．６ＮＮ
ａＣｌ中でＤＮＡを変性させ、バイオジンＢ膜に対して
一夜移行させた。６ｘＳＳＣ、５ｘデンハードの溶液、
０．１％ＳＤＳ並びに１００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子
ＤＮＡを含有する緩衝液中で、５５℃にて６０分間膜を
予備ハイブリダイズさせた。５５°Ｃで１０％硫酸デキ
ストランを用い、予備ハイブリダイゼーション緩衝液中
に３′−ビオチン−１１−ｄＵＭＰ尾部を含有するオリ
ゴヌクレオチドＥＢＶ５（１００ｎｇ／ｍｌ）（図１参
照）にＤＮＡをハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼ
ーションの後、室温で３ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによ
り１０分間膜を洗浄し、同じ緩衝液中で５５°Ｃにて３
回（洗浄当り１０分間）行った。膜を、１００ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭＮａＣｌ、３ｍ
ＭＭｇＣｌ２並びに０．５％ツイーン２０（溶液Ａ）中
でリンスし、その後０．５％カゼインを含有するＰＢＳ
により１５分間予備ブロックした。デテク１−ａｌｋ中
で室温にて１５分間膜をインキュベートし、１００ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、
３ｍＭＭｇＣｌ２並びに０．０５％ツイーン２０中で希
釈した。溶液Ａにより洗浄した後、１００ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍ
ＭＮａＣｌ、７５ｍｇ／ｍｌニトロブルー・テトラゾリ
ウム並びに５０ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸を含有する検出緩衝液を添加した。
フィルタを検出緩衝液から除去し、これを水でリンスす
ることにより、約５分後に発色の進行を停止した。
【００５５】ハイブリッド捕捉によるＥ−ＢウイルスＤ
ＮＡ配列の検出 精製プラスミドＤＮＡ調製物およびＥＢＶ感染リンパ球
細胞培養の粗製細胞溶解物中に含有されるＥ−Ｂウイル
ス（ＥＢＶ）を、増幅および検出のための標的として選
択した。ＥＢＶのＩＲ１リピートは、ＥＢＶゲノム当り
約１０回繰り返されている。これは、チェウングとキー
フ、「Ｅ−ＢウイルスＤＮＡ中の長い内部直接リピー
ト」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４４：２８６−２９４
（１９８２）に報告されている。ＩＲ１リピートの２４
６塩基対配列に延在する６のオリゴヌクレオチドを、共
役増幅／ハイブリッド捕捉アッセイでの使用のために選
択した。これらを図１の下部に示す。ＩＲ１標的配列の
ハイブリダイゼーションおよび検出を至適にするため、
幾つかのオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐＣＦ１
（これはｐＵＣ１８ベクタ中にＩＲ１リピートのＢａｍ
Ｈ１開裂断片を含有する）を捕捉しシグナルするその能
力について、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて
試験した。それぞれの場合、１（または２）のオリゴヌ
クレオチドがイムロン２プレートの穴に結合し、標的配
列を捕捉するよう作用した。第２のオリゴヌクレオチド
（または２つのオリゴヌクレオチド）（ポリＴによる
３′末端ラベル）は、標的配列およびビオチン修飾ポリ
ｄＡ（バイオブリッジＡブランド試薬）と協奏的にハイ
ブリダイズすることにより、シグナル反応において架橋
として作用した。過酸化水素およびＯＰＤの存在下で、
ストレプトアビジンおよびビオチニル化西洋ワサビペル
オキシダーゼの複合体を使用してビオチンを検出した。
ネガティブコントロールとして、ｐＵＣ１８中に１３ｋ
ｂサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡ挿入物を含有
するｐＡＫ８を、ＥＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアッセイした。図１に示す種々の組合せのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズした既知量のｐＣＦ１に
ついて標準曲線を作成した。
ＮＡ配列の検出 精製プラスミドＤＮＡ調製物およびＥＢＶ感染リンパ球
細胞培養の粗製細胞溶解物中に含有されるＥ−Ｂウイル
ス（ＥＢＶ）を、増幅および検出のための標的として選
択した。ＥＢＶのＩＲ１リピートは、ＥＢＶゲノム当り
約１０回繰り返されている。これは、チェウングとキー
フ、「Ｅ−ＢウイルスＤＮＡ中の長い内部直接リピー
ト」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４４：２８６−２９４
（１９８２）に報告されている。ＩＲ１リピートの２４
６塩基対配列に延在する６のオリゴヌクレオチドを、共
役増幅／ハイブリッド捕捉アッセイでの使用のために選
択した。これらを図１の下部に示す。ＩＲ１標的配列の
ハイブリダイゼーションおよび検出を至適にするため、
幾つかのオリゴヌクレオチド対を、プラスミドｐＣＦ１
（これはｐＵＣ１８ベクタ中にＩＲ１リピートのＢａｍ
Ｈ１開裂断片を含有する）を捕捉しシグナルするその能
力について、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて
試験した。それぞれの場合、１（または２）のオリゴヌ
クレオチドがイムロン２プレートの穴に結合し、標的配
列を捕捉するよう作用した。第２のオリゴヌクレオチド
（または２つのオリゴヌクレオチド）（ポリＴによる
３′末端ラベル）は、標的配列およびビオチン修飾ポリ
ｄＡ（バイオブリッジＡブランド試薬）と協奏的にハイ
ブリダイズすることにより、シグナル反応において架橋
として作用した。過酸化水素およびＯＰＤの存在下で、
ストレプトアビジンおよびビオチニル化西洋ワサビペル
オキシダーゼの複合体を使用してビオチンを検出した。
ネガティブコントロールとして、ｐＵＣ１８中に１３ｋ
ｂサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡ挿入物を含有
するｐＡＫ８を、ＥＢＶ特異的オリゴヌクレオチドを使
用してアッセイした。図１に示す種々の組合せのオリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズした既知量のｐＣＦ１に
ついて標準曲線を作成した。
【００５６】図２は、２つの異なる組合せのオリゴヌク
レオチド対を用いるハイブリダイゼーションの後に０．
７８ｎｇ〜５０ｎｇのｐＣＦ１を用いて作成した標準曲
線を示す。増幅されていないｐＣＦ１についてのハイブ
リダイゼーションの検出限界は、標的プラスミドＤＮＡ
約５×１０８であった。同程度の量のＣＭＶＤＮＡを含
有するプラスミド、ｐＡＫ８はシグナルを生成すること
ができず、したがってアッセイの特異性が示された。
レオチド対を用いるハイブリダイゼーションの後に０．
７８ｎｇ〜５０ｎｇのｐＣＦ１を用いて作成した標準曲
線を示す。増幅されていないｐＣＦ１についてのハイブ
リダイゼーションの検出限界は、標的プラスミドＤＮＡ
約５×１０８であった。同程度の量のＣＭＶＤＮＡを含
有するプラスミド、ｐＡＫ８はシグナルを生成すること
ができず、したがってアッセイの特異性が示された。
【００５７】精製プラスミドＤＮＡ中でのＥＢＶ配列の
増幅と検出 オリゴヌクレオチドＥＢＶ１およびＥＢＶ６を境界とす
る２４６ｂｐ配列（図１）を２５回のＰＣＲによる１ｐ
ｇのｐＣＦ１に供することにより酵素的に増幅した。増
幅の後、出発プラスミドＤＮＡの７８アトグラム〜２．
５フェムトグラムと等量の増幅反応混合物の一部を、Ｅ
ＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとして、ポリＴ尾部Ｅ
ＢＶ４をシグナルオリゴクレオチドとして使用してハイ
ブリッド捕捉によりアッセイした。図３に、既知量の増
幅していないｐＣＦ１により作成した標準曲線と比較
し、増幅した材料の４９０ｎｍの吸光度を示す。２５回
の増幅の後、共役ＰＣＲ／ハイブリッド捕捉アッセイで
は、１２．５〜４００モルの標的プラスミドＤＮＡを検
出することができた。標的ＤＮＡ配列の見積もられた増
幅は、３．３×１０７の理論的増幅限界と比較して、約
１．２×１０７であり、９２％の効率が示唆された（効
率は、ｎ＝増幅の回数、Ｘ＝それぞれのサイクルの平均
効率、並びにＹをｎサイクル後の収率として、Ｙ＝（１
＋Ｘ）ｎにより計算した。ムリスとファローナ、「ポリ
メラーゼ触媒鎖反応を介する試験管内でのＤＮＡの特異
的合成」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５５：
３３５−３５０（１９８７）を参照するとよい）。対照
として、１ｐｇのｐＡＫ８ＤＮＡを、ＥＢＶ１およびＥ
ＢＶ６の存在下でＰＣＲにより２５回増幅し、同様のハ
イブリッド補足手順によりアッセイした。元のサンプル
の５％（５０ｆｇ）に至るまでアッセイした場合でも、
シグナルは全く与えられなかった。同様の検討では、前
記同様増幅しハイブリダイズさせた１０ｎｇに及ぶ対照
プラスミドＤＮＡによってもシグナルを与えることはで
きなかった。更に、ｐＣＦ１またはｐＡＫ８をＴａｑポ
リメラーゼの非存在下にＰＣＲを介してサイクルさせた
場合、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてシグナ
ルは全く与えられなかった。
増幅と検出 オリゴヌクレオチドＥＢＶ１およびＥＢＶ６を境界とす
る２４６ｂｐ配列（図１）を２５回のＰＣＲによる１ｐ
ｇのｐＣＦ１に供することにより酵素的に増幅した。増
幅の後、出発プラスミドＤＮＡの７８アトグラム〜２．
５フェムトグラムと等量の増幅反応混合物の一部を、Ｅ
ＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドとして、ポリＴ尾部Ｅ
ＢＶ４をシグナルオリゴクレオチドとして使用してハイ
ブリッド捕捉によりアッセイした。図３に、既知量の増
幅していないｐＣＦ１により作成した標準曲線と比較
し、増幅した材料の４９０ｎｍの吸光度を示す。２５回
の増幅の後、共役ＰＣＲ／ハイブリッド捕捉アッセイで
は、１２．５〜４００モルの標的プラスミドＤＮＡを検
出することができた。標的ＤＮＡ配列の見積もられた増
幅は、３．３×１０７の理論的増幅限界と比較して、約
１．２×１０７であり、９２％の効率が示唆された（効
率は、ｎ＝増幅の回数、Ｘ＝それぞれのサイクルの平均
効率、並びにＹをｎサイクル後の収率として、Ｙ＝（１
＋Ｘ）ｎにより計算した。ムリスとファローナ、「ポリ
メラーゼ触媒鎖反応を介する試験管内でのＤＮＡの特異
的合成」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５５：
３３５−３５０（１９８７）を参照するとよい）。対照
として、１ｐｇのｐＡＫ８ＤＮＡを、ＥＢＶ１およびＥ
ＢＶ６の存在下でＰＣＲにより２５回増幅し、同様のハ
イブリッド補足手順によりアッセイした。元のサンプル
の５％（５０ｆｇ）に至るまでアッセイした場合でも、
シグナルは全く与えられなかった。同様の検討では、前
記同様増幅しハイブリダイズさせた１０ｎｇに及ぶ対照
プラスミドＤＮＡによってもシグナルを与えることはで
きなかった。更に、ｐＣＦ１またはｐＡＫ８をＴａｑポ
リメラーゼの非存在下にＰＣＲを介してサイクルさせた
場合、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてシグナ
ルは全く与えられなかった。
【００５８】更に図１に示した配列を参照し、それぞれ
のシグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対について良好に
機能する種々のプライマーの組合せは、シグナル／捕捉
オリゴヌクレオチド対４および５および／または２およ
び３についてプライマー１および６、シグナル／捕捉オ
リゴヌクレオチド対４および５についてプライマー２お
よび６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対４および
５についてプライマー３および６、シグナル／捕捉オリ
ゴヌクレオチド対２および３についてプライマー１およ
び５、並びにシグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対２お
よび３についてプライマー１および４であった。
のシグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対について良好に
機能する種々のプライマーの組合せは、シグナル／捕捉
オリゴヌクレオチド対４および５および／または２およ
び３についてプライマー１および６、シグナル／捕捉オ
リゴヌクレオチド対４および５についてプライマー２お
よび６、シグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対４および
５についてプライマー３および６、シグナル／捕捉オリ
ゴヌクレオチド対２および３についてプライマー１およ
び５、並びにシグナル／捕捉オリゴヌクレオチド対２お
よび３についてプライマー１および４であった。
【００５９】増幅手順に渡って標的ＤＮＡの量の相対的
増加を測定するため、プライマー、ＥＢＶ１およびＥＢ
Ｖ６の存在下に０〜３５回のＰＣＲを介して１０ｐｇの
ｐＣＦ１およびｐＡＫ８をサイクルさせた。５回の時点
で増幅反応を停止し、０．０３％の反応混合物をアッセ
イした。図４に示すように、２０回の増幅の後にシグナ
ルが最初に検出された。このシグナルは標的ＤＮＡの
１．７×１０５倍の増加に対応し、８０％の増幅の効率
を示唆する。一連の増幅の回で標的ＤＮＡの量が増加
し、３５回で僅か０．０３％の反応混合物により生成し
たシグナルがアッセイの直線的吸光度範囲および増幅の
絶対レベルを越え、増幅の絶対レベルは正確に測定され
得なかった。同様に処理したネガティブコントロール、
ｐＡＫ８ＤＮＡは、増幅工程の如何なる段階においても
ハイブリダイゼーションアッセイでシグナルを与えなか
った。
増加を測定するため、プライマー、ＥＢＶ１およびＥＢ
Ｖ６の存在下に０〜３５回のＰＣＲを介して１０ｐｇの
ｐＣＦ１およびｐＡＫ８をサイクルさせた。５回の時点
で増幅反応を停止し、０．０３％の反応混合物をアッセ
イした。図４に示すように、２０回の増幅の後にシグナ
ルが最初に検出された。このシグナルは標的ＤＮＡの
１．７×１０５倍の増加に対応し、８０％の増幅の効率
を示唆する。一連の増幅の回で標的ＤＮＡの量が増加
し、３５回で僅か０．０３％の反応混合物により生成し
たシグナルがアッセイの直線的吸光度範囲および増幅の
絶対レベルを越え、増幅の絶対レベルは正確に測定され
得なかった。同様に処理したネガティブコントロール、
ｐＡＫ８ＤＮＡは、増幅工程の如何なる段階においても
ハイブリダイゼーションアッセイでシグナルを与えなか
った。
【００６０】粗製細胞溶解物中のＥＢＶ配列の増幅と検
出 感染細胞の溶解物に含有される標的ＤＮＡの検出の例と
して、粗製細胞溶解物中のＥＢＶ特異的配列の増幅およ
び検出を検討した。これらの検討のため、４つのリンパ
セルラインを使用した。Ｂ９５−８はＥＢＶ感染セルラ
インであり、その９５％の細胞が約５０コピーのＥＢＶ
を含有し、５％の細胞が１０００コピーを越えるＥＢＶ
ＤＮＡを含有する。これを使用したが、更にはミラーと
リップマン、「形質転換キヌザル白血球による感染性Ｅ
ＢＶの放出」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、７０：１９０−１９４（１９７３）に記載
されている。ラジ（全ての細胞が約５０コピーのＥＢＶ
ＤＮＡを有するセルライン）を使用したが、更にはエプ
ステインら、「培養ブルキット腫瘍リンホブラスト（ラ
ジ種）による形態的およびウイルス的検討」、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．、３７：５４７−５５９（１９６６）
に記載されている。ナマルワ（全ての細胞が１〜２コピ
ーのＥＢＶＤＮＡを含有するセルライン）を使用した
が、更にはリードマンとクレイン、「処理および未処理
リンホブラストイドセルラインにおけるＥＢＶ関連相補
的固定抗原の細胞的局在性」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ、１１：４４９−５２０（１９７３）に記載されてい
る。また、ラモス（未感染リンパ球セルライン）も使用
したが、更にはクレインら、「アメリカン・ブルキット
リンパ球から確立されたＥＢＶゲノム陰性セルライン：
レセプター特性、ＥＢＶ感染性、並びに試験管内感染に
よるＥＢＶ陽性サブラインへの永久的変換」、Ｉｎｔｅ
ｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、５：３１９−３３４（１９７５）
に記載されている。それぞれの培養物の１０４〜１０６
細胞を煮沸により溶解し、その後ＥＢＶ１およびＥＢＶ
６の存在下で１５回の増幅に供した。それぞれの反応混
合物の一部をその後ハイブリッド捕捉によりアッセイし
た。標的ＤＮＡを用いることなくハイブリダイズ（およ
び検出）した捕捉穴を、吸光度の読みのゼロ（ブラン
ク）対照として使用した。結果を表１に示す。
出 感染細胞の溶解物に含有される標的ＤＮＡの検出の例と
して、粗製細胞溶解物中のＥＢＶ特異的配列の増幅およ
び検出を検討した。これらの検討のため、４つのリンパ
セルラインを使用した。Ｂ９５−８はＥＢＶ感染セルラ
インであり、その９５％の細胞が約５０コピーのＥＢＶ
を含有し、５％の細胞が１０００コピーを越えるＥＢＶ
ＤＮＡを含有する。これを使用したが、更にはミラーと
リップマン、「形質転換キヌザル白血球による感染性Ｅ
ＢＶの放出」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、７０：１９０−１９４（１９７３）に記載
されている。ラジ（全ての細胞が約５０コピーのＥＢＶ
ＤＮＡを有するセルライン）を使用したが、更にはエプ
ステインら、「培養ブルキット腫瘍リンホブラスト（ラ
ジ種）による形態的およびウイルス的検討」、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔ．、３７：５４７−５５９（１９６６）
に記載されている。ナマルワ（全ての細胞が１〜２コピ
ーのＥＢＶＤＮＡを含有するセルライン）を使用した
が、更にはリードマンとクレイン、「処理および未処理
リンホブラストイドセルラインにおけるＥＢＶ関連相補
的固定抗原の細胞的局在性」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ、１１：４４９−５２０（１９７３）に記載されてい
る。また、ラモス（未感染リンパ球セルライン）も使用
したが、更にはクレインら、「アメリカン・ブルキット
リンパ球から確立されたＥＢＶゲノム陰性セルライン：
レセプター特性、ＥＢＶ感染性、並びに試験管内感染に
よるＥＢＶ陽性サブラインへの永久的変換」、Ｉｎｔｅ
ｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、５：３１９−３３４（１９７５）
に記載されている。それぞれの培養物の１０４〜１０６
細胞を煮沸により溶解し、その後ＥＢＶ１およびＥＢＶ
６の存在下で１５回の増幅に供した。それぞれの反応混
合物の一部をその後ハイブリッド捕捉によりアッセイし
た。標的ＤＮＡを用いることなくハイブリダイズ（およ
び検出）した捕捉穴を、吸光度の読みのゼロ（ブラン
ク）対照として使用した。結果を表１に示す。
【００６１】
【表１】
【００６２】表１に示すように、Ｂ９５−８、ラジ並び
にナマルワ細胞によりシグナルが得られたが、ロマス細
胞では得られなかった。これらのデータは、共役した増
幅／ハイブリッド捕捉アッセイの特異性は、標的が精製
ＤＮＡでない場合であっても維持されることを示す。
にナマルワ細胞によりシグナルが得られたが、ロマス細
胞では得られなかった。これらのデータは、共役した増
幅／ハイブリッド捕捉アッセイの特異性は、標的が精製
ＤＮＡでない場合であっても維持されることを示す。
【００６３】ナマルワ細胞は１〜２コピーのＥＢＶＤＮ
Ａを含有するため、これらの細胞を選択して共役アッセ
イの感度を検討した。結果を表２に示す。
Ａを含有するため、これらの細胞を選択して共役アッセ
イの感度を検討した。結果を表２に示す。
【００６４】
【表２】
【００６５】表２に示すように、僅か１０ナマルワ細胞
の２４６ｂｐＩＲ１配列の増幅により、２０％（２つの
細胞に相当する）の反応混合物をアッセイした場合、弱
いシグナルが生成した。シグナルの強度は、初発増幅反
応に１００細胞を投入した場合に顕著に増加した。等量
数のロマス細胞の増幅によっては、バックグラウンドの
読みを越えるシグナルは生成しなかった。
の２４６ｂｐＩＲ１配列の増幅により、２０％（２つの
細胞に相当する）の反応混合物をアッセイした場合、弱
いシグナルが生成した。シグナルの強度は、初発増幅反
応に１００細胞を投入した場合に顕著に増加した。等量
数のロマス細胞の増幅によっては、バックグラウンドの
読みを越えるシグナルは生成しなかった。
【００６６】感染および未感染細胞の異種存在における
感染性試薬の核酸の検出の例として、ラモスおよびナマ
ルワ細胞を混合し、ＰＣＲにより増幅し、ハイブリッド
捕捉によりアッセイした。ナマルワ細胞（１０２）とラ
モス細胞（１０４）とを混合し、３５回のＰＣＲを介し
てサイクルした。反応混合物の一部（２０％）をその後
アッセイした。結果を表３に示す。
感染性試薬の核酸の検出の例として、ラモスおよびナマ
ルワ細胞を混合し、ＰＣＲにより増幅し、ハイブリッド
捕捉によりアッセイした。ナマルワ細胞（１０２）とラ
モス細胞（１０４）とを混合し、３５回のＰＣＲを介し
てサイクルした。反応混合物の一部（２０％）をその後
アッセイした。結果を表３に示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】表３に示すように、混合細胞溶解物の場合
でも、標的配列は増幅され検出された。細胞混合物中の
増幅のレベルは、純粋種の細胞存在と比較すると約４倍
低減された。ラモス細胞の増幅は単独ではイブリダイゼ
ーションアッセイにおいてシグナルを生成しないため、
混合した溶解物により生成されたシグナルは、ナマルワ
細胞における特異的標的配列の生成物であったと考える
ことができる。
でも、標的配列は増幅され検出された。細胞混合物中の
増幅のレベルは、純粋種の細胞存在と比較すると約４倍
低減された。ラモス細胞の増幅は単独ではイブリダイゼ
ーションアッセイにおいてシグナルを生成しないため、
混合した溶解物により生成されたシグナルは、ナマルワ
細胞における特異的標的配列の生成物であったと考える
ことができる。
【００６９】サザンブロットハイブリダイゼーションに
よるハイブリッド捕捉の結果の確認共役した増幅ハイブ
リッド捕捉検出アッセイの特異性を確認するため、増幅
反応生成物をアガロースゲル中で電気泳動により分析
し、その後サザンブロットハイブリダイゼーションを行
った。ＥＢＶ１およびＥＢＶ６をプライマーとして使用
してｐＣＦ１中のＩＲ１配列の一部を増幅した場合に得
られた生成物のエチジウムブロミド染色アガロースは、
約２５０ｂｐの断片を示した。この断片は、ｐＡＫ８Ｄ
ＮＡまたはラモス細胞溶解物からの増幅生成物中には認
められなかった。電気泳動的に分析したＤＮＡをバイオ
ジンＢナイロン膜に移し、ビオチン−１１−ｄＵＴＰの
３′末端添加によりラベルしたＥＢＶ５オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。ニトロブルーテトラゾリ
ウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸の存在下に、ストレプトアビジンおよびビオチニル
化したアルカリ性ホスファターゼの複合体を使用して発
色アッセイを行うことによりビオチン部分を検出した。
２５０ｂｐ断片がハイブリダイゼーションの主要なバン
ドであり、したがってハイブリッド捕捉アッセイで得ら
れた結果が確認された。
よるハイブリッド捕捉の結果の確認共役した増幅ハイブ
リッド捕捉検出アッセイの特異性を確認するため、増幅
反応生成物をアガロースゲル中で電気泳動により分析
し、その後サザンブロットハイブリダイゼーションを行
った。ＥＢＶ１およびＥＢＶ６をプライマーとして使用
してｐＣＦ１中のＩＲ１配列の一部を増幅した場合に得
られた生成物のエチジウムブロミド染色アガロースは、
約２５０ｂｐの断片を示した。この断片は、ｐＡＫ８Ｄ
ＮＡまたはラモス細胞溶解物からの増幅生成物中には認
められなかった。電気泳動的に分析したＤＮＡをバイオ
ジンＢナイロン膜に移し、ビオチン−１１−ｄＵＴＰの
３′末端添加によりラベルしたＥＢＶ５オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイズさせた。ニトロブルーテトラゾリ
ウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリ
ン酸の存在下に、ストレプトアビジンおよびビオチニル
化したアルカリ性ホスファターゼの複合体を使用して発
色アッセイを行うことによりビオチン部分を検出した。
２５０ｂｐ断片がハイブリダイゼーションの主要なバン
ドであり、したがってハイブリッド捕捉アッセイで得ら
れた結果が確認された。
【００７０】実施例２ サンプル中のヒト免疫疾患ウイルス（ＨＩＶ Ｉ）（ま
たはＨＴＬＶ ＩＩＩ）核酸配列の存在を測定する方法
論の有用性を検討するため、減少する量の精製ＨＩＶ
１ＤＮＡを用い、ヒト末梢血液細胞を接種した（または
接種しなかった）。更に処理または精製を行わないサン
プルをその後、表４に示すプライマーを使用するポリメ
ラーゼ鎖反応による２５回の増幅に供した。増幅反応の
後、表４に示すプローブを使用してハイブリッド捕捉に
つき主として前記したようにサンプルを試験した。結果
を表５に示す。
たはＨＴＬＶ ＩＩＩ）核酸配列の存在を測定する方法
論の有用性を検討するため、減少する量の精製ＨＩＶ
１ＤＮＡを用い、ヒト末梢血液細胞を接種した（または
接種しなかった）。更に処理または精製を行わないサン
プルをその後、表４に示すプライマーを使用するポリメ
ラーゼ鎖反応による２５回の増幅に供した。増幅反応の
後、表４に示すプローブを使用してハイブリッド捕捉に
つき主として前記したようにサンプルを試験した。結果
を表５に示す。
【００７１】
【表４】
【００７２】
【表５】
【００７３】表５に示すように、ＨＩＶ核酸の検出の限
界は、約１．５×１０５ヒト末梢血液細胞中の約２コピ
ーであった。同一のサンプルの一部を３２Ｐラベルした
オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼー
ションによる検出、電気泳動並びにオートラジオグラフ
ィに供した場合、検出の限界は実質的に同一だった。
界は、約１．５×１０５ヒト末梢血液細胞中の約２コピ
ーであった。同一のサンプルの一部を３２Ｐラベルした
オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼー
ションによる検出、電気泳動並びにオートラジオグラフ
ィに供した場合、検出の限界は実質的に同一だった。
【００７４】これらのデータは、組合せた増幅およびハ
イブリッド捕捉アッセイの特異性および感度を示す。僅
かに変動する長さおよび／または少しの配列の変動を有
するプライマーおよびプローブは、ここで使用した特定
の配列と互換性があると考えられる。
イブリッド捕捉アッセイの特異性および感度を示す。僅
かに変動する長さおよび／または少しの配列の変動を有
するプライマーおよびプローブは、ここで使用した特定
の配列と互換性があると考えられる。
【００７５】実施例３ 検出ハイブリダイゼーション反応の効率を増加させ、ハ
イブリダイゼーションを完了するのに必要な時間を減少
させるために、増幅した標的核酸配列の溶液ハイブリダ
イゼーションを行う。
イブリダイゼーションを完了するのに必要な時間を減少
させるために、増幅した標的核酸配列の溶液ハイブリダ
イゼーションを行う。
【００７６】オリゴヌクレオチドプローブのラベル クックら（１９８８）、前記文献に先に記載されたよう
にしてシグナルオリゴヌクレオチドを３′−末端ラベル
する。またこれらを、１００ｍＭＫＰＯ４緩衝液ｐＨ
７．２、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフ
ェラーゼ、ｄＡＴＰ並びにビオチン−１１−ｄＵＴＰ
（その量は、ｄＡＴＰおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰ
が、５：１〜９：１のモル比で最初に存在し、ｄＡＴＰ
濃度プラスビオチン−１１−ｄＵＴＰ濃度の和がオリゴ
ヌクレオチドの濃度の２００倍であるものとする）を含
有する溶液中でのインキュベーションによりラベルす
る。反応は、３７°Ｃで２〜２０分間、または全ての単
量体が組み込まれるまで行わせる。
にしてシグナルオリゴヌクレオチドを３′−末端ラベル
する。またこれらを、１００ｍＭＫＰＯ４緩衝液ｐＨ
７．２、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエ
タノール、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフ
ェラーゼ、ｄＡＴＰ並びにビオチン−１１−ｄＵＴＰ
（その量は、ｄＡＴＰおよびビオチン−１１−ｄＵＴＰ
が、５：１〜９：１のモル比で最初に存在し、ｄＡＴＰ
濃度プラスビオチン−１１−ｄＵＴＰ濃度の和がオリゴ
ヌクレオチドの濃度の２００倍であるものとする）を含
有する溶液中でのインキュベーションによりラベルす
る。反応は、３７°Ｃで２〜２０分間、または全ての単
量体が組み込まれるまで行わせる。
【００７７】前記したように、捕捉オリゴヌクレオチド
は、ポリｄＴの３′末端付加によりラベルする。連結技
術も使用することができるが、この種の方法論はそれ程
複雑ではない。また、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮ
Ｐ−ｄＵＴＰの形でジニトロフェニル残基を組み込むこ
とによりラベルすることができる。また、捕捉オリゴヌ
クレオチドは、化学的にラベルした後、アリルアミンｄ
ＵＭＰホスホロアミダイト（クックら（１９８８）、前
記文献参照）の存在下で自動的に合成することができ
る。合成および仕上げの後、アリルアミン残基を２，４
−ジニトロフルオロベンゼンとの反応によりラベルす
る。
は、ポリｄＴの３′末端付加によりラベルする。連結技
術も使用することができるが、この種の方法論はそれ程
複雑ではない。また、捕捉オリゴヌクレオチドは、ＤＮ
Ｐ−ｄＵＴＰの形でジニトロフェニル残基を組み込むこ
とによりラベルすることができる。また、捕捉オリゴヌ
クレオチドは、化学的にラベルした後、アリルアミンｄ
ＵＭＰホスホロアミダイト（クックら（１９８８）、前
記文献参照）の存在下で自動的に合成することができ
る。合成および仕上げの後、アリルアミン残基を２，４
−ジニトロフルオロベンゼンとの反応によりラベルす
る。
【００７８】捕捉マトリックスおよび検出 １Ｍ酢酸アンモニウムによりイムロン２マイクロタイタ
プレートの穴を２回リンスすることにより、ポリｄＡ捕
捉穴を調製する。２００ｎｇのポリｄＡ（ファルマシア
・ファイン・ケミカルス、ピスカタウェイ、ＮＪ）を、
５０μｌの容量の１Ｍ酢酸アンモニウム中にて穴に添加
する。穴が乾燥するまで（１２時間以上）ドライインキ
ュベータ中でプレートを３７°Ｃでインキュベートす
る。プレートを封止し、使用するまで２〜８°Ｃで保存
する。使用の直前に、固定ポリＡを含むプレートを２ｘ
ＳＳＣにより２回リンスし、その後０．１％トリトンＸ
−１００を含有する２ｘＳＳＣ中で５〜６０分間定置す
る。
プレートの穴を２回リンスすることにより、ポリｄＡ捕
捉穴を調製する。２００ｎｇのポリｄＡ（ファルマシア
・ファイン・ケミカルス、ピスカタウェイ、ＮＪ）を、
５０μｌの容量の１Ｍ酢酸アンモニウム中にて穴に添加
する。穴が乾燥するまで（１２時間以上）ドライインキ
ュベータ中でプレートを３７°Ｃでインキュベートす
る。プレートを封止し、使用するまで２〜８°Ｃで保存
する。使用の直前に、固定ポリＡを含むプレートを２ｘ
ＳＳＣにより２回リンスし、その後０．１％トリトンＸ
−１００を含有する２ｘＳＳＣ中で５〜６０分間定置す
る。
【００７９】ウサギ抗ＤＮＰＩｇＧのような抗体を含有
する捕捉穴を、３７°Ｃで２〜４時間イムロン２プレー
トの穴中で５０μｌの５０ｍＭ重炭酸緩衝液中で希釈さ
れた適当な量の抗体をインキュベートすることにより調
製する。使用するまで２〜８°Ｃでカバーしてプレート
を保存する。使用の直前に、固定抗体を含むプレート
を、０．１％トリトンＸ−１００を含有する０．５ｘＳ
ＳＣにより２回リンスする。
する捕捉穴を、３７°Ｃで２〜４時間イムロン２プレー
トの穴中で５０μｌの５０ｍＭ重炭酸緩衝液中で希釈さ
れた適当な量の抗体をインキュベートすることにより調
製する。使用するまで２〜８°Ｃでカバーしてプレート
を保存する。使用の直前に、固定抗体を含むプレート
を、０．１％トリトンＸ−１００を含有する０．５ｘＳ
ＳＣにより２回リンスする。
【００８０】分析に供する増幅したコピー数の標的核酸
を含有するサンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ、
速やかに冷却し、滅菌水により希釈する。２０％ホルム
アミド、１ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％ト
リトンＸ−１００並びに５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリ
ゴデオキシヌクレオチド並びに適当量の捕捉オリゴヌク
レオチドのようなハイブリダイゼーション溶液に希釈し
たサンプルを添加する。例えば、ｄＡＴＰ−、ビオチン
−１１−ｄＵＴＰ尾部シグナルプローブを、ポリｄＴ尾
部捕捉プローブと組合せて、またはＤＮＰラベル捕捉プ
ローブと組合せて使用する。捕捉プローブ量は、予め滴
定したものである。全ての捕捉プローブが、標的配列に
ハイブリダイズするか否かに拘らず、マイクロタイタプ
レートの単一捕捉穴中で捕捉試薬により結合され得るも
のとする。ハイブリダイゼーション反応（１００μｌ）
を室温で５〜３０分間行わせた後、０．１％トリトンＸ
−１００を含有する４００μｌの０．０５ｘ〜０．１ｘ
ＳＳＣによりサンプルを希釈する。希釈ハイブリダイゼ
ーション反応物の分画をマイクロタイタプレートの穴に
添加する。ポリｄＡ捕捉穴を使用し、ポリＴ尾部捕捉プ
ローブを使用する場合、サンプルを穴中で２〜５分間イ
ンキュベートした後、０．１％トリトンＸ−１００を含
有する０．０５ｘ〜０．１ｘＳＳＣにより洗浄する。Ｄ
ＮＰラベル捕捉プローブと共に抗ＤＮＰ抗体を使用する
場合、穴を１０〜６０分間インキュベートした後、０．
１％トリトンＸ−１００を含有する０．０５ｘ〜０．１
ｘＳＳＣにより洗浄する。前記したように、デテク１−
ｈｒｐを使用してハイブリッドの量を測定することがで
きる。
を含有するサンプルを９２°Ｃで１０分間熱変性させ、
速やかに冷却し、滅菌水により希釈する。２０％ホルム
アミド、１ｘＳＳＰＥ、２％硫酸デキストラン、１％ト
リトンＸ−１００並びに５０ｎｇ／ｍｌのシグナルオリ
ゴデオキシヌクレオチド並びに適当量の捕捉オリゴヌク
レオチドのようなハイブリダイゼーション溶液に希釈し
たサンプルを添加する。例えば、ｄＡＴＰ−、ビオチン
−１１−ｄＵＴＰ尾部シグナルプローブを、ポリｄＴ尾
部捕捉プローブと組合せて、またはＤＮＰラベル捕捉プ
ローブと組合せて使用する。捕捉プローブ量は、予め滴
定したものである。全ての捕捉プローブが、標的配列に
ハイブリダイズするか否かに拘らず、マイクロタイタプ
レートの単一捕捉穴中で捕捉試薬により結合され得るも
のとする。ハイブリダイゼーション反応（１００μｌ）
を室温で５〜３０分間行わせた後、０．１％トリトンＸ
−１００を含有する４００μｌの０．０５ｘ〜０．１ｘ
ＳＳＣによりサンプルを希釈する。希釈ハイブリダイゼ
ーション反応物の分画をマイクロタイタプレートの穴に
添加する。ポリｄＡ捕捉穴を使用し、ポリＴ尾部捕捉プ
ローブを使用する場合、サンプルを穴中で２〜５分間イ
ンキュベートした後、０．１％トリトンＸ−１００を含
有する０．０５ｘ〜０．１ｘＳＳＣにより洗浄する。Ｄ
ＮＰラベル捕捉プローブと共に抗ＤＮＰ抗体を使用する
場合、穴を１０〜６０分間インキュベートした後、０．
１％トリトンＸ−１００を含有する０．０５ｘ〜０．１
ｘＳＳＣにより洗浄する。前記したように、デテク１−
ｈｒｐを使用してハイブリッドの量を測定することがで
きる。
【００８１】抗体またはポリヌクレオチド修飾ラテック
スまたはポリスチレンビーズのようなマトリックスを、
同様の増幅／サンドイッチ捕捉アッセイの捕捉マトリッ
クスとして使用することができる。
スまたはポリスチレンビーズのようなマトリックスを、
同様の増幅／サンドイッチ捕捉アッセイの捕捉マトリッ
クスとして使用することができる。
【００８２】実施例４ ＡＩＤＳの蔓延および特定の種類のＨＩＶの蔓延に関す
る疫学的研究は、世界の人口に対するウイルスの範囲お
よび分布を確立するのに極めて重要である。この疾患の
蔓延を監視すると共に特定の患者における疾患の進行を
監視するため、そして恐らくより重要なことは、世界の
血液供給を保護するために、ＨＩＶ核酸配列の存在また
は非存在を測定することは非常に重要である。ＰＣＲの
ような増幅方法論はこの種の検討を行う能力を相当改良
されているが、これらのアッセイのネガティブな結果の
正確性を決定するのは困難である。
る疫学的研究は、世界の人口に対するウイルスの範囲お
よび分布を確立するのに極めて重要である。この疾患の
蔓延を監視すると共に特定の患者における疾患の進行を
監視するため、そして恐らくより重要なことは、世界の
血液供給を保護するために、ＨＩＶ核酸配列の存在また
は非存在を測定することは非常に重要である。ＰＣＲの
ような増幅方法論はこの種の検討を行う能力を相当改良
されているが、これらのアッセイのネガティブな結果の
正確性を決定するのは困難である。
【００８３】核酸増幅および検出の陰性結果の確認の推
定は、ＨＩＶに露呈された個々人の範囲においてＨＩＶ
ＤＮＡの量を正確に測定することによってのみ行うこと
ができる。最近の研究によれば、ＣＤ４（＋）細胞は、
潜伏ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの保存体として作用し、
プロウイルスＤＮＡを有するこれらの細胞の数は、無症
候性血清陽性個人で１／４０，０００〜１／１００、Ａ
ＩＤＳ患者で１／１００と見積もられている。プサリド
ポウロスら、「組み込まれたプロウイルスヒト免疫不全
ウイルスタイプＩは、健康な血清陽性個人のＣＤ４＋末
梢血液リンパ球中に存在する」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、６３：４６２６−４６３１（１９８９）、およびシ
ュニットマンら、「ヒト末梢血液のＨＩＶ−１の保存体
は、ＣＤ４の発現を維持するＴ細胞である」、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４５：３０５−３０８（１９８９）を参照す
ることができる。
定は、ＨＩＶに露呈された個々人の範囲においてＨＩＶ
ＤＮＡの量を正確に測定することによってのみ行うこと
ができる。最近の研究によれば、ＣＤ４（＋）細胞は、
潜伏ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの保存体として作用し、
プロウイルスＤＮＡを有するこれらの細胞の数は、無症
候性血清陽性個人で１／４０，０００〜１／１００、Ａ
ＩＤＳ患者で１／１００と見積もられている。プサリド
ポウロスら、「組み込まれたプロウイルスヒト免疫不全
ウイルスタイプＩは、健康な血清陽性個人のＣＤ４＋末
梢血液リンパ球中に存在する」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、６３：４６２６−４６３１（１９８９）、およびシ
ュニットマンら、「ヒト末梢血液のＨＩＶ−１の保存体
は、ＣＤ４の発現を維持するＴ細胞である」、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２４５：３０５−３０８（１９８９）を参照す
ることができる。
【００８４】これらの研究において、ＡＣＨ２細胞は、
１の組み込まれたコピーのＨＩＶ−１を細胞当り含有
し、増幅／検出手順の標準として使用された。したがっ
て、この標準体においては、反応毎の増幅効率の変動を
考慮に入れることができない。患者試料中細胞当りのＨ
ＩＶゲノムの範囲を正確に確立するためには、それぞれ
の反応における増幅の効率を測定する必要がある。意図
する配列と同一の反応混合物中のβ−グロビンまたはグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのような既知の
標準配列の同時増幅により、この種の情報が提供され
る。
１の組み込まれたコピーのＨＩＶ−１を細胞当り含有
し、増幅／検出手順の標準として使用された。したがっ
て、この標準体においては、反応毎の増幅効率の変動を
考慮に入れることができない。患者試料中細胞当りのＨ
ＩＶゲノムの範囲を正確に確立するためには、それぞれ
の反応における増幅の効率を測定する必要がある。意図
する配列と同一の反応混合物中のβ−グロビンまたはグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼのような既知の
標準配列の同時増幅により、この種の情報が提供され
る。
【００８５】実施例２では、増幅されたＨＩＶ核酸の検
出の限界は、１５０，０００ＰＢＬ中のＨＩＶＤＮＡの
２コピーであると認められ、これは検出が、ここに開示
した方法によるか、標準的な３２Ｐ方法論によるかを問
わなかった。この感度の限界のため、少なくとも７０〜
８０％の増幅の効率が必要である。臨床サンプルについ
て同様の試験を行うに際し、１〜３コピー／１５０，０
００ＰＢＬのバックグラウンドの範囲の読みは、結論を
出せないと判断しなければならない。低くかつ／または
陰性の読みは、ＨＩＶＤＮＡの非存在または存在するＨ
ＩＶＤＮＡの不充分な増幅の結果である。それぞれの増
幅反応の効率が既知の場合、低くかつ／または陰性の読
みは、結論を出し得るものとして解釈できる。例えば、
臨床サンプルについての増幅反応の効率が８５％である
と知られ、ＨＩＶ検出の結果、＜＜２コピーのＨＩＶＤ
ＮＡが示される場合（すなわち、バックグラウンドを越
えるには不充分である）、ＨＩＶＤＮＡの不存在（１５
０，０００ＰＢＬ中）の結論を出すことができる。一
方、増幅反応の効率が５０％であると知られ、ＨＩＶ配
列検出により０〜３コピーのＨＩＶが示された場合、結
果は結論を出し得ないものと考えられ、手順を繰り返す
ことにより必要な増幅効率か達成され得る。
出の限界は、１５０，０００ＰＢＬ中のＨＩＶＤＮＡの
２コピーであると認められ、これは検出が、ここに開示
した方法によるか、標準的な３２Ｐ方法論によるかを問
わなかった。この感度の限界のため、少なくとも７０〜
８０％の増幅の効率が必要である。臨床サンプルについ
て同様の試験を行うに際し、１〜３コピー／１５０，０
００ＰＢＬのバックグラウンドの範囲の読みは、結論を
出せないと判断しなければならない。低くかつ／または
陰性の読みは、ＨＩＶＤＮＡの非存在または存在するＨ
ＩＶＤＮＡの不充分な増幅の結果である。それぞれの増
幅反応の効率が既知の場合、低くかつ／または陰性の読
みは、結論を出し得るものとして解釈できる。例えば、
臨床サンプルについての増幅反応の効率が８５％である
と知られ、ＨＩＶ検出の結果、＜＜２コピーのＨＩＶＤ
ＮＡが示される場合（すなわち、バックグラウンドを越
えるには不充分である）、ＨＩＶＤＮＡの不存在（１５
０，０００ＰＢＬ中）の結論を出すことができる。一
方、増幅反応の効率が５０％であると知られ、ＨＩＶ配
列検出により０〜３コピーのＨＩＶが示された場合、結
果は結論を出し得ないものと考えられ、手順を繰り返す
ことにより必要な増幅効率か達成され得る。
【００８６】増幅反応に既知の標準を取り入れて使用
し、それぞれの増幅反応の効率を見積もることができる
のは自明であるが、これを達成するための簡単な手段は
全く記載されていない。ここに開示した方法は、この種
の手順に容易に受け入れられるものである。実施例２で
は、患者試料をサンプル材料として破壊した未精製末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）細胞を使用しポリメラーゼ鎖反
応により増幅に供する場合、２つの組合せのプライマー
（ＨＩＶ配列についての１つの組合せ、およびマーカー
配列についての第２の組合せ）をＰＣＲ反応に包めるこ
とができる。第２の組合せのプライマーは、細胞当り１
コピーでＰＢＬの正常なゲノム中に存在することが知ら
れた遺伝子配列から選択される。この種の遺伝子配列の
例はβ−グロビン遺伝子である。他の例は、中間代謝の
酵素の遺伝子であり、例えばグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子である。β−グロビンについての
遺伝子を使用する場合、サイキら、「カマ細胞貧血症の
診断のためのＢ−グロビンゲノム配列の酵素的増幅およ
び制限部位分析」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０
−１３５４（１９８５）に記載されたようなプライマー
の配列が適切である。重複しない一本鎖ポリヌクレオチ
ドプローブの対を、これらのプライマーの間に位置する
配列から選択する。これらは、１本のストランドまたは
他のものに相補的であるよう選択し、増幅したコピー数
のβ−グロビン配列を検出するのに使用する。検出は、
標的核酸の検出で使用した手順により行う。
し、それぞれの増幅反応の効率を見積もることができる
のは自明であるが、これを達成するための簡単な手段は
全く記載されていない。ここに開示した方法は、この種
の手順に容易に受け入れられるものである。実施例２で
は、患者試料をサンプル材料として破壊した未精製末梢
血液リンパ球（ＰＢＬ）細胞を使用しポリメラーゼ鎖反
応により増幅に供する場合、２つの組合せのプライマー
（ＨＩＶ配列についての１つの組合せ、およびマーカー
配列についての第２の組合せ）をＰＣＲ反応に包めるこ
とができる。第２の組合せのプライマーは、細胞当り１
コピーでＰＢＬの正常なゲノム中に存在することが知ら
れた遺伝子配列から選択される。この種の遺伝子配列の
例はβ−グロビン遺伝子である。他の例は、中間代謝の
酵素の遺伝子であり、例えばグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子である。β−グロビンについての
遺伝子を使用する場合、サイキら、「カマ細胞貧血症の
診断のためのＢ−グロビンゲノム配列の酵素的増幅およ
び制限部位分析」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３５０
−１３５４（１９８５）に記載されたようなプライマー
の配列が適切である。重複しない一本鎖ポリヌクレオチ
ドプローブの対を、これらのプライマーの間に位置する
配列から選択する。これらは、１本のストランドまたは
他のものに相補的であるよう選択し、増幅したコピー数
のβ−グロビン配列を検出するのに使用する。検出は、
標的核酸の検出で使用した手順により行う。
【００８７】ＨＩＶ１配列およびβ−グロビン配列の検
出のための増幅反応は、ＨＩＶ１について表４に示した
プライマーの存在下、サイキら、（１９８５）、前記文
献に示されたβ−グロビン配列についてのプライマーの
存在下で、ＰＢＬの懸濁物により行う。増幅の後、主と
して前記したようにしてプローブに対するハイブリダイ
ゼーションを行う。２つのポリＴ尾部プローブをハイブ
リダイゼーション溶液に添加する。表５のＨＩＶについ
てのＴ尾部プローブを、前記したように選択したβ−グ
ロビンについてのＴ尾部プローブと同様に使用する。ハ
イブリダイゼーション反応の一部をマイクロタイタプレ
ートの個々の穴に添加する。１つの組合せの穴は、表５
に示されるようにＨＩＶ１についてのプローブを含有
し、他の組合せの穴は前記したように選択されたβ−グ
ロビンについてのプローブを有する。増幅した核酸の特
異的な希釈物をハイブリダイゼーション混合物に添加
し、その後希釈物をマイクロタイタプレートの穴に添加
する。増幅した核酸配列を測定する。結果が現れる場合
に得られる吸光度の読みから、増幅反応の効率が確定さ
れ、意図する標的配列についての陰性の結果の確認が行
われる。
出のための増幅反応は、ＨＩＶ１について表４に示した
プライマーの存在下、サイキら、（１９８５）、前記文
献に示されたβ−グロビン配列についてのプライマーの
存在下で、ＰＢＬの懸濁物により行う。増幅の後、主と
して前記したようにしてプローブに対するハイブリダイ
ゼーションを行う。２つのポリＴ尾部プローブをハイブ
リダイゼーション溶液に添加する。表５のＨＩＶについ
てのＴ尾部プローブを、前記したように選択したβ−グ
ロビンについてのＴ尾部プローブと同様に使用する。ハ
イブリダイゼーション反応の一部をマイクロタイタプレ
ートの個々の穴に添加する。１つの組合せの穴は、表５
に示されるようにＨＩＶ１についてのプローブを含有
し、他の組合せの穴は前記したように選択されたβ−グ
ロビンについてのプローブを有する。増幅した核酸の特
異的な希釈物をハイブリダイゼーション混合物に添加
し、その後希釈物をマイクロタイタプレートの穴に添加
する。増幅した核酸配列を測定する。結果が現れる場合
に得られる吸光度の読みから、増幅反応の効率が確定さ
れ、意図する標的配列についての陰性の結果の確認が行
われる。
【００８８】またこれらの手順は、意図する第２標的核
酸配列の存在を検出するのに使用することができる。例
えば、ＥＢＶおよびＨＩＶについて前記したプライマー
を単一増幅反応で使用することができ、マイクロタイタ
プレートの穴は、ＥＢＶ特異的またはＨＩＶ特異的オリ
ゴヌクレオチドを含有することができ、更にＨＩＶまた
はＥＢＶまたは両者の存在は、単一の増幅反応および単
一の検出操作により確立することができる。
酸配列の存在を検出するのに使用することができる。例
えば、ＥＢＶおよびＨＩＶについて前記したプライマー
を単一増幅反応で使用することができ、マイクロタイタ
プレートの穴は、ＥＢＶ特異的またはＨＩＶ特異的オリ
ゴヌクレオチドを含有することができ、更にＨＩＶまた
はＥＢＶまたは両者の存在は、単一の増幅反応および単
一の検出操作により確立することができる。
【００８９】実施例５ 実施例４において、感染個体中のＨＩＶＤＮＡの量を測
定する検討により、感染の段階によって、１０，０００
〜１，０００，０００ＰＢＬ中の１ゲノムコピーの範囲
を確認することができる。単に増幅反応の効率を改良す
ることが可能ならば、それぞれの増幅反応で１０６以上
の細胞を一貫して使用してこの種の検討を行うことも可
能であろう。また、２５〜３５（以上）から増幅の回数
（ラウンド）を増加させてこの種の検討を行うことが可
能である。しかしながら、増幅の効率は、増幅反応に投
入される粗製材料の量が増加すると共に減少する傾向が
ある。更に増幅の回数が２５〜３５を越えて増加する
と、しばしば標的非特異的配列の生成が起こる。
定する検討により、感染の段階によって、１０，０００
〜１，０００，０００ＰＢＬ中の１ゲノムコピーの範囲
を確認することができる。単に増幅反応の効率を改良す
ることが可能ならば、それぞれの増幅反応で１０６以上
の細胞を一貫して使用してこの種の検討を行うことも可
能であろう。また、２５〜３５（以上）から増幅の回数
（ラウンド）を増加させてこの種の検討を行うことが可
能である。しかしながら、増幅の効率は、増幅反応に投
入される粗製材料の量が増加すると共に減少する傾向が
ある。更に増幅の回数が２５〜３５を越えて増加する
と、しばしば標的非特異的配列の生成が起こる。
【００９０】これらの困難を回避する方法は、サンプル
から核酸を精製することである。残念なことに、多くの
場合サンプルから核酸を精製することは困難で単調なも
のであり、サンプルが互いに夾雑するに至る場合もあ
る。更に、試験に供するサンプルからの核酸の精製は、
例えばフェノールのような危険性のある材料の使用を必
要とする。その他の場合、サンプルからの核酸の精製が
必要とされ得るが、これはサンプルの破壊および核酸の
放出に必要な条件および材料が、核酸の酵素的増幅に和
合しないためである。例えば、フェノール、界面活性剤
並びに還元剤を使用して、唾液サンプル中のマイコバク
テリウム・チューベルキュロシスまたはエム・アビウム
核酸の存在についての試験のためにサンプルが破壊され
る。このような場合、増幅反応を開始する前に、核酸が
これらの破壊剤を含有しないものとしなければならな
い。
から核酸を精製することである。残念なことに、多くの
場合サンプルから核酸を精製することは困難で単調なも
のであり、サンプルが互いに夾雑するに至る場合もあ
る。更に、試験に供するサンプルからの核酸の精製は、
例えばフェノールのような危険性のある材料の使用を必
要とする。その他の場合、サンプルからの核酸の精製が
必要とされ得るが、これはサンプルの破壊および核酸の
放出に必要な条件および材料が、核酸の酵素的増幅に和
合しないためである。例えば、フェノール、界面活性剤
並びに還元剤を使用して、唾液サンプル中のマイコバク
テリウム・チューベルキュロシスまたはエム・アビウム
核酸の存在についての試験のためにサンプルが破壊され
る。このような場合、増幅反応を開始する前に、核酸が
これらの破壊剤を含有しないものとしなければならな
い。
【００９１】これらの困難を回避する簡単な方法は、意
図する配列の予備捕捉または予備選択である。この種の
手順により、殆ど全ゆる量のサンプルを使用する可能
性、および通常は酵素的増幅反応に和合しないサンプル
を破壊する条件および材料を使用する可能性が与えられ
る。
図する配列の予備捕捉または予備選択である。この種の
手順により、殆ど全ゆる量のサンプルを使用する可能
性、および通常は酵素的増幅反応に和合しないサンプル
を破壊する条件および材料を使用する可能性が与えられ
る。
【００９２】破壊されたサンプルから予期された標的核
酸を予備捕捉することにより、増幅の効率をより一貫し
たものとし、幾つかのサンプルを破壊するのに使用する
材料を酵素的増幅反応を開始する前に容易に除去するこ
とができる。標的核酸が非常に低い濃度であるためハイ
ブリダイゼーション反応に非常に長い時間がかかること
は考えなくてもよい。増幅反応を行うに際し、最初の回
の増幅にはプライマーと標的核酸のハイブリダイゼーシ
ョン（アニール）を必要とする。現在使用されている手
順では、これには通常は５分未満が必要である。破壊さ
れたサンプル中の核酸とマトリックス結合または捕捉し
得る予備捕捉プローブとの最初のアニール反応を行うこ
とにより、標的核酸がサンプルの残余およびサンプル破
壊試薬を含有しないものとすることが可能である。
酸を予備捕捉することにより、増幅の効率をより一貫し
たものとし、幾つかのサンプルを破壊するのに使用する
材料を酵素的増幅反応を開始する前に容易に除去するこ
とができる。標的核酸が非常に低い濃度であるためハイ
ブリダイゼーション反応に非常に長い時間がかかること
は考えなくてもよい。増幅反応を行うに際し、最初の回
の増幅にはプライマーと標的核酸のハイブリダイゼーシ
ョン（アニール）を必要とする。現在使用されている手
順では、これには通常は５分未満が必要である。破壊さ
れたサンプル中の核酸とマトリックス結合または捕捉し
得る予備捕捉プローブとの最初のアニール反応を行うこ
とにより、標的核酸がサンプルの残余およびサンプル破
壊試薬を含有しないものとすることが可能である。
【００９３】実施例１におけるように、６〜８の異な
る、重複しないプローブ／プライマーオリゴヌクレオチ
ドが選択され、特定の標的核酸配列について合成が行わ
れる。これらは、図５のオリゴヌクレオチドＡ〜Ｈとし
て示される。標的がＤＮＡである場合に予備捕捉プロー
ブを形成するためには、ゴッシュとムッソ（１９８７）
前記文献に記載されたように、これらの２つのオリゴヌ
クレオチド（図５のオリゴヌクレオチドＡおよびＨ）
（標的が元来一本鎖の場合は１つのオリゴヌクレオチ
ド、すなわちＲＮＡ）を、その後５′末端を介してセフ
ァクリルまたは調節されたポアガラスまたは他の支持体
に架橋させる。１つの手順では、破壊したサンプルとビ
ーズ架橋オリゴヌクレオチド予備捕捉プローブとをハイ
ブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションに続い
て、沈降またはろ過によりビーズを集め、簡単な塩類溶
液で洗浄してサンプルの残部および破壊溶液の成分を除
去する。一旦ビーズがこれらの材料を含有しないものと
なったならば、ビーズを増幅反応混合物（緩衝液、ｄＮ
ＴＰ並びにポリメラーゼ）に懸濁する。その後通常と同
様に増幅を行う。図６に、３ラウンドの増幅を示す。こ
の系のそれぞれのラウンドの増幅により、ビーズに架橋
した意図する標的配列が生成する。増幅の後、ラベルし
たオリゴヌクレオチドＢ、ＣまたはＤおよび／または
Ｅ、ＦまたはＧを使用してビーズ架橋増幅核酸標的配列
を検出することができる。
る、重複しないプローブ／プライマーオリゴヌクレオチ
ドが選択され、特定の標的核酸配列について合成が行わ
れる。これらは、図５のオリゴヌクレオチドＡ〜Ｈとし
て示される。標的がＤＮＡである場合に予備捕捉プロー
ブを形成するためには、ゴッシュとムッソ（１９８７）
前記文献に記載されたように、これらの２つのオリゴヌ
クレオチド（図５のオリゴヌクレオチドＡおよびＨ）
（標的が元来一本鎖の場合は１つのオリゴヌクレオチ
ド、すなわちＲＮＡ）を、その後５′末端を介してセフ
ァクリルまたは調節されたポアガラスまたは他の支持体
に架橋させる。１つの手順では、破壊したサンプルとビ
ーズ架橋オリゴヌクレオチド予備捕捉プローブとをハイ
ブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションに続い
て、沈降またはろ過によりビーズを集め、簡単な塩類溶
液で洗浄してサンプルの残部および破壊溶液の成分を除
去する。一旦ビーズがこれらの材料を含有しないものと
なったならば、ビーズを増幅反応混合物（緩衝液、ｄＮ
ＴＰ並びにポリメラーゼ）に懸濁する。その後通常と同
様に増幅を行う。図６に、３ラウンドの増幅を示す。こ
の系のそれぞれのラウンドの増幅により、ビーズに架橋
した意図する標的配列が生成する。増幅の後、ラベルし
たオリゴヌクレオチドＢ、ＣまたはＤおよび／または
Ｅ、ＦまたはＧを使用してビーズ架橋増幅核酸標的配列
を検出することができる。
【００９４】他の方法では、予備捕捉オリゴヌクレオチ
ドを前記したようにマトリックスに架橋させるが、オリ
ゴヌクレオチドＡおよびＨの３′末端を修飾して、これ
らがポリメラーゼのプライマーとして機能できないよう
にする（オリゴヌクレオチドＡおよびＨ上の黒丸として
図７に示す）。例えば、ジデオキシヌクレオチドは３′
末端に位置し、または３′末端をメチル化またはグリコ
シル化により修飾する。この場合、核酸とのハイブリダ
イゼーションの後に、同様にビーズに結合したハイブリ
ッドを洗浄する。一旦ビーズおよびハイブリッドを洗浄
したならば、プライマー（オリゴヌクレオチドＢおよび
Ｃとして図７に示す）を、増幅反応の他の成分（緩衝
液、ｄＮＴＰ並びにポリメラーゼ）と共に添加する。そ
の後通常と同様に増幅を行う。図７に３ラウンドからな
る増幅を示すが、この場合、全ての増幅した核酸は溶液
中で遊離しており、増幅反応の際にビーズおよびその結
合オリゴヌクレオチドが存在するにも拘らず、ビーズに
架橋しない。増幅の後、プローブ対ＣおよびＤおよび／
またはＥおよびＦを前記した検出のために使用する。
ドを前記したようにマトリックスに架橋させるが、オリ
ゴヌクレオチドＡおよびＨの３′末端を修飾して、これ
らがポリメラーゼのプライマーとして機能できないよう
にする（オリゴヌクレオチドＡおよびＨ上の黒丸として
図７に示す）。例えば、ジデオキシヌクレオチドは３′
末端に位置し、または３′末端をメチル化またはグリコ
シル化により修飾する。この場合、核酸とのハイブリダ
イゼーションの後に、同様にビーズに結合したハイブリ
ッドを洗浄する。一旦ビーズおよびハイブリッドを洗浄
したならば、プライマー（オリゴヌクレオチドＢおよび
Ｃとして図７に示す）を、増幅反応の他の成分（緩衝
液、ｄＮＴＰ並びにポリメラーゼ）と共に添加する。そ
の後通常と同様に増幅を行う。図７に３ラウンドからな
る増幅を示すが、この場合、全ての増幅した核酸は溶液
中で遊離しており、増幅反応の際にビーズおよびその結
合オリゴヌクレオチドが存在するにも拘らず、ビーズに
架橋しない。増幅の後、プローブ対ＣおよびＤおよび／
またはＥおよびＦを前記した検出のために使用する。
【００９５】標的配列の予備捕捉は、溶液ハイブリダイ
ゼーション手順によっても行うことができる。この種の
予備捕捉プローブは、第１予備捕捉部分により修飾され
る。標的核酸とのアニールの後、ハイブリッド（並びに
未ハイブリダイズ予備捕捉プローブ）とマトリックス結
合第２予備捕捉部分（これは第１予備捕捉部分と特異的
に相互作用する）とを接触させる。例えば、図５の予備
捕捉オリゴヌクレオチドＡおよびＨを、前記したように
ポリＴによりその３′末端において、または合成の際に
５′末端においてラベルし得る。その後「尾部を有す
る」予備捕捉プローブの３′末端を前記したようにブロ
ックする。破壊サンプル中における核酸に対するアニー
ルの後、ハイブリッド（および全ての予備捕捉プローブ
ＡおよびＨ）とポリＡまたはセファクリル、ラテック
ス、ポリスチレン、ＣＰＧまたは他の固体マトリックス
に架橋したポリｄＡとを接触させる。前記したようにハ
イブリッドを洗浄し、これらがサンプルの残部およびサ
ンプル破壊剤を含有しないものとする。ハイブリッドを
含有するマトリックスをその後図７に示すようにプライ
マーＢおよびＧを含有する増幅反応混合物に懸濁する。
通常と同様に増幅を行い、図７の増幅された材料として
増幅された核酸を検出する。
ゼーション手順によっても行うことができる。この種の
予備捕捉プローブは、第１予備捕捉部分により修飾され
る。標的核酸とのアニールの後、ハイブリッド（並びに
未ハイブリダイズ予備捕捉プローブ）とマトリックス結
合第２予備捕捉部分（これは第１予備捕捉部分と特異的
に相互作用する）とを接触させる。例えば、図５の予備
捕捉オリゴヌクレオチドＡおよびＨを、前記したように
ポリＴによりその３′末端において、または合成の際に
５′末端においてラベルし得る。その後「尾部を有す
る」予備捕捉プローブの３′末端を前記したようにブロ
ックする。破壊サンプル中における核酸に対するアニー
ルの後、ハイブリッド（および全ての予備捕捉プローブ
ＡおよびＨ）とポリＡまたはセファクリル、ラテック
ス、ポリスチレン、ＣＰＧまたは他の固体マトリックス
に架橋したポリｄＡとを接触させる。前記したようにハ
イブリッドを洗浄し、これらがサンプルの残部およびサ
ンプル破壊剤を含有しないものとする。ハイブリッドを
含有するマトリックスをその後図７に示すようにプライ
マーＢおよびＧを含有する増幅反応混合物に懸濁する。
通常と同様に増幅を行い、図７の増幅された材料として
増幅された核酸を検出する。
【図１】Ｅ−ＢウイルスＤＮＡ構造および増幅／ハイブ
リッド捕捉アッセイに使用するオリゴヌクレオチド配列
を示す図。ＩＲ１リピートを拡大してオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびプローブの位置を示す。記載した図
の下部はオリゴヌクレオチド１〜６の配列である。
リッド捕捉アッセイに使用するオリゴヌクレオチド配列
を示す図。ＩＲ１リピートを拡大してオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびプローブの位置を示す。記載した図
の下部はオリゴヌクレオチド１〜６の配列である。
【図２】未増幅核酸標的配列を使用するハイブリッド捕
捉アッセイの感度および特異性を示すグラフ。０．７８
ｎｇ〜５０ｎｇの標的プラスミドＤＮＡから、ｐＣＦ１
を、オリゴヌクレオチド対、ＥＢＶ２およびポリＴ尾部
ＥＢＶ３（白四角）またはＥＢＶ４およびポリＴ尾部Ｅ
ＢＶ５（黒四角）を用いてハイブリッド捕捉によりアッ
セイした。等量のｐＡＫ８ＤＮＡといずれかのオリゴヌ
クレオチド対とのハイブリダイゼーションにより、バッ
クグラウンド吸光度の読み（白丸）が与えられた。
捉アッセイの感度および特異性を示すグラフ。０．７８
ｎｇ〜５０ｎｇの標的プラスミドＤＮＡから、ｐＣＦ１
を、オリゴヌクレオチド対、ＥＢＶ２およびポリＴ尾部
ＥＢＶ３（白四角）またはＥＢＶ４およびポリＴ尾部Ｅ
ＢＶ５（黒四角）を用いてハイブリッド捕捉によりアッ
セイした。等量のｐＡＫ８ＤＮＡといずれかのオリゴヌ
クレオチド対とのハイブリダイゼーションにより、バッ
クグラウンド吸光度の読み（白丸）が与えられた。
【図３】ハイブリッド捕捉による増幅ＥＢＶ配列の検出
を示すグラフ。１ｐｇのｐＣＦ１およびｐＡＫ８ＤＮＡ
を２５回の増幅に供した。出発プラスミドＤＮＡの７８
アトグラム〜２．５フェムトグラムに相当する増幅反応
混合物の一部を、ＥＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドと
して、ポリＴ尾部ＥＢＶ４をシグナルオリゴヌクレオチ
ドとして使用するハイブリッド捕捉によりアッセイし
た。増幅されたｐＣＦ１（０．６２５ｎｇ〜２０ｎｇ）
を同一のオリゴヌクレオチド対を使用してアッセイし標
準の作成を図った。
を示すグラフ。１ｐｇのｐＣＦ１およびｐＡＫ８ＤＮＡ
を２５回の増幅に供した。出発プラスミドＤＮＡの７８
アトグラム〜２．５フェムトグラムに相当する増幅反応
混合物の一部を、ＥＢＶ５を捕捉オリゴヌクレオチドと
して、ポリＴ尾部ＥＢＶ４をシグナルオリゴヌクレオチ
ドとして使用するハイブリッド捕捉によりアッセイし
た。増幅されたｐＣＦ１（０．６２５ｎｇ〜２０ｎｇ）
を同一のオリゴヌクレオチド対を使用してアッセイし標
準の作成を図った。
【図４】核酸配列の酵素的増幅の際の標的ＤＮＡの量の
相対的増加を示すグラフ。１０ｐｇのｐＤＦ１およびｐ
ＡＫ８ＤＮＡを０〜３５回の増幅に供した。５回の時点
で増幅反応を停止し、ＥＢＶ５およびポリＴ尾部ＥＢＶ
４を使用するハイブリッド捕捉によりアッセイした。
１．２５ｎｇ〜４０ｎｇの未増幅ｐＣＦ１もハイブリッ
ド捕捉によりアッセイして標準曲線（これにより増幅の
効率を見積もる）を作成した。
相対的増加を示すグラフ。１０ｐｇのｐＤＦ１およびｐ
ＡＫ８ＤＮＡを０〜３５回の増幅に供した。５回の時点
で増幅反応を停止し、ＥＢＶ５およびポリＴ尾部ＥＢＶ
４を使用するハイブリッド捕捉によりアッセイした。
１．２５ｎｇ〜４０ｎｇの未増幅ｐＣＦ１もハイブリッ
ド捕捉によりアッセイして標準曲線（これにより増幅の
効率を見積もる）を作成した。
【図５】標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。
これはＤＮＡ標的中の標的核酸の領域を示す。予備捕
捉、プライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドは、
ＤＮＡデュープレックスの上下の線により示す。Ａ〜Ｄ
は、実線により示されるＤＮＡのストランド中に含まれ
るものと同じ配列である代表的配列を含む。Ｅ〜Ｈは、
破線により示されるＤＮＡのストランド中に含まれるも
のと同じ配列である代表的配列を含む。
これはＤＮＡ標的中の標的核酸の領域を示す。予備捕
捉、プライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドは、
ＤＮＡデュープレックスの上下の線により示す。Ａ〜Ｄ
は、実線により示されるＤＮＡのストランド中に含まれ
るものと同じ配列である代表的配列を含む。Ｅ〜Ｈは、
破線により示されるＤＮＡのストランド中に含まれるも
のと同じ配列である代表的配列を含む。
【図６】標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。
この図では、予備捕捉プローブＡ〜Ｈは、明細書中に記
載したようにビーズに架橋して示されている。これらは
標的ＤＮＡストランドにハイブリダイズする。ビーズ結
合ハイブリッドの洗浄の後、予備捕捉プローブＡおよび
Ｈを使用し（３つのラウンドを示す）増幅を行い、結果
的にビーズ結合、予備捕捉配列ＡおよびＨに架橋した増
幅ＤＮＡ配列を与える。増幅した核酸配列の検出は、結
合シグナルビーズＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのハイブ
リダイゼーションおよび検出により行う。
この図では、予備捕捉プローブＡ〜Ｈは、明細書中に記
載したようにビーズに架橋して示されている。これらは
標的ＤＮＡストランドにハイブリダイズする。ビーズ結
合ハイブリッドの洗浄の後、予備捕捉プローブＡおよび
Ｈを使用し（３つのラウンドを示す）増幅を行い、結果
的にビーズ結合、予備捕捉配列ＡおよびＨに架橋した増
幅ＤＮＡ配列を与える。増幅した核酸配列の検出は、結
合シグナルビーズＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧのハイブ
リダイゼーションおよび検出により行う。
【図７】標的核酸配列の予備捕捉および増幅を示す図。
この図では、ビーズ結合予備捕捉プローブＡおよびＨを
３′末端で修飾する（オリゴヌクレオチドの末端の黒丸
により示す）。標的核酸のビーズ結合ハイブリッドおよ
び予備捕捉プローブを洗浄した後、プライマーＢおよび
Ｇの存在下に増幅を行う。増幅の後（３ラウンドが示さ
れている）、プローブ対ＣおよびＤおよび／またはＥお
よびＦを、ビーズに架橋していない増幅核酸配列の検出
に使用する。図６および図７では、増幅ラウンドの重合
工程の際に合成されたＤＮＡは濃い実線または破線で示
す。
この図では、ビーズ結合予備捕捉プローブＡおよびＨを
３′末端で修飾する（オリゴヌクレオチドの末端の黒丸
により示す）。標的核酸のビーズ結合ハイブリッドおよ
び予備捕捉プローブを洗浄した後、プライマーＢおよび
Ｇの存在下に増幅を行う。増幅の後（３ラウンドが示さ
れている）、プローブ対ＣおよびＤおよび／またはＥお
よびＦを、ビーズに架橋していない増幅核酸配列の検出
に使用する。図６および図７では、増幅ラウンドの重合
工程の際に合成されたＤＮＡは濃い実線または破線で示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリスティーン エル ブレイケル アメリカ合衆国、ニュー ヨーク州 11718、ブライトウォーターズ、アカース ン ブールバード 530番 (72)発明者 ジョアン ピー スパドロ アメリカ合衆国、ニュー ジャージー州 07070、ラザフォード、ネビンズ ストリ ート 66番
Claims (18)
- 【請求項１】 サンプル中の一本鎖標的核酸を測定する
組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのマ
トリックス付着捕捉ポリヌクレオチド（このヌクレオチ
ドは、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニールす
ることができ、その標的核酸のプライマーとして働くこ
とができる） （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｃ）捕捉ポリヌクレオチド／プライマーおよびモノヌ
クレオチドから延長生成物を生成し得る核酸ポリメラー
ゼ（これは一本鎖標的核酸に相補的であり、これに対し
て捕捉ポリヌクレオチド／プライマーがアニールしてマ
トリックス結合増幅核酸配列を与える）、並びに （ｄ）増幅、マトリックス結合標的核酸とハイブリダイ
ズし得る一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル
系の少なくとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプ
ローブからなる組成物。 - 【請求項２】 試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について一本
鎖標的核酸とマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチドと
の間のハイブリッド形成を行うべく接触させ、 （ｂ）ハイブリダイズした標的核酸をサンプルから分離
し、 （ｃ）標的核酸のコピー数を増幅してマトリックス結合
増幅コピー数の標的核酸を生成し、 （ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅したコピー
数と、増幅した標的核酸の一部とハイブリダイズし得る
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなるポリヌクレオチドプローブと
を接触させ、 （ｅ）ハイブリダイズさせて増幅標的核酸とプローブと
の複合体を形成し、 （ｆ）必要に応じて結合したプローブを全ゆる未結合核
酸から分離し、 （ｇ）結合ラベルを観察することにより結合した増幅標
的の存在または非存在を測定することからなる方法。 - 【請求項３】 試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのマ
トリックス付着捕捉ポリヌクレオチド（このポリヌクレ
オチドは、その標的核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルし得る）、 （ｂ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、その
標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得る）、 （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖標的核
酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニール
する）、 （ｅ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブ、 （ｆ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体からな
る第２ポリヌクレオチドプローブ、並びに （ｇ）第１実体と特異的に結合し得る第２実体が付着し
たマトリックスからなる組成物。 - 【請求項４】 試験に供するサンプル中の一本鎖標的核
酸を測定する方法であって、 （ａ）ハイブリダイズし得る条件下で、一本鎖標的核酸
と、意図するそれぞれの一本鎖標的核酸について少なく
とも１つのマトリックス付着捕捉ポリヌクレオチドとを
接触させ（このポリヌクレオチドは、その標的核酸の相
補的部分に選択的にアニールし得る）、 （ｂ）ハイブリダイズした標的核酸をサンプルから分離
し、 （ｃ）捕捉配列と重複しないプライマーを添加すること
により標的核酸のコピー数を増幅して未結合増幅コピー
数の標的核酸を生成し、 （ｄ）複合体を形成すべく未結合増幅標的核酸と （ｉ）標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の少な
くとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドプロー
ブ、 （ｉｉ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体から
なる第２ポリヌクレオチドプローブとを接触させ、 （ｅ）複合体と、第１実体に特異的に結合し得る第２実
体が付着したマトリックスとを接触させ、 （ｆ）必要に応じて結合プローブを全ゆる未結合核酸か
ら分離し、 （ｇ）結合ラベルの存在を観察することにより結合増幅
標的核酸の存在または非存在を測定することからなる方
法。 - 【請求項５】 試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する組成物であって、 （ａ）次の配列を有するマトリックス付着捕捉ポリヌク
レオチド、 【化１】 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖ＨＩＶ
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルする）、 （ｄ）次の群から選択される配列を有する一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの
成分からなる第１ポリヌクレオチドプローブ、 【化２】 （ｅ）この配列の他のものを有する第２ポリヌクレオチ
ドプローブからなる組成物。 - 【請求項６】 試験に供するサンプル中の一本鎖ＨＩＶ
核酸を測定する方法であって、 （ａ）ハイブリッドを形成すべく一本鎖ＨＩＶ核酸と次
の配列を有するマトリックス固定捕捉ポリヌクレオチド
／プライマーとを接触させ、 【化３】 （ｂ）かくしてハイブリダイズしたＨＩＶ核酸をサンプ
ルから分離し、 （ｃ）ＨＩＶ核酸のコピー数を増幅してマトリックス結
合増幅コピー数のＨＩＶ核酸を生成し、 （ｄ）ハイブリダイズし得る条件下で、増幅コピー数の
ＨＩＶ核酸と次よりなる群から選択される一本鎖ポリヌ
クレオチド断片に付着したラベル系の少なくとも１つの
成分からなるポリヌクレオチドプローブとを接触させ、 【化４】 （ｆ）プローブとマトリックス固定ＨＩＶ核酸とをハイ
ブリダイズさせ、 （ｇ）必要に応じて結合ハイブリッドを全ゆる未結合核
酸から分離し、 （ｈ）結合ラベルの存在または非存在を観察することに
より増幅されたＨＩＶ核酸の存在または非存在を測定す
ることからなる方法。 - 【請求項７】 マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する組成物であって、 （ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、
一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールし得
る）、 （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマー（サンプル中のそ
のコピー数は既知である）（このプライマーは、一本鎖
マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニールし得
る）、 （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは
それぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に対して相補
的であり、これにプライマーがアニールする）、 （ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標
的プローブ、 （ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域に結合し、標
的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第２一本鎖ポ
リヌクレオチド断片からなる第２ポリヌクレオチド標的
プローブ、 （ｇ）マーカー核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチドマ
ーカープローブ、並びに （ｈ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試
験帯域に結合し、マーカー核酸の第２部分とハイブリダ
イズし得る第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第
２ポリヌクレオチドマーカープローブからなる組成物。 - 【請求項８】 マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する方法であって、 （ａ）反応帯域中のサンプルと一本鎖標的核酸の相補的
部分に選択的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプラ
イマーとを接触させ、 （ｂ）既知のコピー数のマーカー核酸を含有する反応帯
域中のサンプルと一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選
択的にアニールし得るオリゴヌクレオチドプライマーと
を接触させ、 （ｃ）核酸ポリメラーゼとの接触により反応帯域中の標
的およびマーカー核酸のコピー数を増幅し、 （ｄ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅されたコピー数の標的およびマーカー核酸と（ｉ）
標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖
ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の少なく
とも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標的プロ
ーブ、および（ｉｉ）マーカー核酸の第１部分とハイブ
リダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着
した第２ラベル系の少なくとも１つの成分からなる第１
ポリヌクレオチドマーカープローブとを接触させ、 （ｅ）第１マーカーおよび標的プローブと増幅したコピ
ー数のマーカー核酸および存在し得る全ゆる標的核酸と
をそれぞれハイブリダイズさせてマーカーおよび標的ハ
イブリッドを形成し、 （ｆ）反応帯域から離間した第１試験帯域中でかくして
処理したサンプルの第１分画と第１試験帯域に結合した
第２ポリヌクレオチド標的プローブとを接触させ、第２
標的プローブと存在する全ゆる増幅したコピー数の標的
核酸とをハイブリダイズさせ、 （ｇ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試
験帯域中でかくして処理したサンプルの第２分画と第２
試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドマーカープロ
ーブとを接触させ、第２マーカープローブと増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせ、 （ｈ）必要に応じて試験帯域から全ゆる未結合核酸を分
離し、 （ｉ）第１試験帯域中に存在する全ゆる標的核酸のコピ
ー数および第２試験帯域中のマーカー核酸のコピー数を
測定することからなる方法。 - 【請求項９】 マーカー核酸を含有し標的核酸を含有す
る可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測定し
その増幅の効率を確認する組成物であって、 （ａ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、
一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニールするこ
とができる）、 （ｂ）反応帯域中のそれぞれの一本鎖核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（サンプル中のそのコピー
数は既知である）（このプライマーは、一本鎖マーカー
核酸の相補的部分に選択的にアニールすることができ
る）、 （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは
それぞれ一本鎖の標的およびマーカー核酸に相補的であ
り、これに対してプライマーがアニールする）、 （ｅ）標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得る第１
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１ラベル系の
少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチド標
的プローブ、 （ｆ）標的核酸の第２部分にハイブリダイズし得る第２
一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第１実体からな
る第２ポリヌクレオチド標的プローブ、 （ｇ）第１実体に特異的に結合し得る第２実体が結合し
た標的試験帯域、 （ｈ）マーカー核酸の第１部分にハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第２ラベル
系の少なくとも１つの成分からなる第１ポリヌクレオチ
ドマーカープローブ、 （ｉ）マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着した第３実体か
らなる第２ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに （ｊ）第３実体に特異的に結合し得る第４実体が結合し
た標的試験帯域からなる組成物。 - 【請求項１０】 第１および第２ラベル系が同一であ
り、第１および第２結合実体対が第３および第４結合実
体対と異なる請求項９記載の組成物。 - 【請求項１１】 第１および第２ラベル系が識別し得る
程異なり、第１および第２結合実体対が第３および第４
結合実体対と同一である請求項９記載の組成物。 - 【請求項１２】 マーカー核酸を含有し、標的核酸を含
有する可能性のあるサンプル中で、一本鎖標的核酸を測
定しその増幅の効率を確認する方法であって、 （ａ）反応帯域中でサンプルと一本鎖標的核酸について
のオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（このプ
ライマーは、一本鎖標的核酸の相補的部分と選択的にア
ニールすることができる）、 （ｂ）反応帯域中でサンプルと一本鎖マーカー核酸につ
いてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ（サ
ンプル中のそのコピー数は既知であり、このプライマー
は、一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、 （ｃ）サンプルと核酸ポリメラーゼとを接触させること
により、反応帯域中でサンプル中の標的およびマーカー
核酸のコピー数を増幅し、 （ｄ）反応帯域中でハイブリダイズし得る条件下で増幅
したコピー数の標的核酸と （ｉ）ラベル部分とラベル部分に付着した標的核酸の第
１部分とハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオ
チド断片とからなる第１ポリヌクレオチド標的プロー
ブ、 （ｉｉ）標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片および第２ポリヌクレオ
チド断片に付着した第１実体からなる第２ポリヌクレオ
チド標的プローブとを接触させ、 （ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅されたコピー数のマーカー核酸と（ｉ）ラベル部分
とラベルに付着したマーカー核酸の第１部分とハイブリ
ダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチド断片とからな
る第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、および（ｉ
ｉ）マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得る第
２一本鎖ポリヌクレオチド断片と第２ポリヌクレオチド
断片に付着した第３実体とからなる第２ポリヌクレオチ
ドマーカープローブとを接触させ、 （ｆ）（ｉ）第１および第２標的プローブと存在する全
ゆる増幅したコピー数の標的核酸との、および（ｉｉ）
第１および第２マーカープローブと存在する増幅したコ
ピー数のマーカー核酸とのハイブリダイゼーションを行
い、 （ｇ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの分画と
第１試験帯域（これは反応帯域から離間し、これに第２
実体が結合する）中の第１実体と特異的に結合し得る第
２実体とを接触させ、 （ｈ）工程（ａ）〜（ｆ）で処理したサンプルの他の分
画と第２試験帯域（これは反応帯域および第１試験帯域
から離間し、これに第４実体が結合する）中で第３実体
と特異的に結合し得る第４実体とを接触させ、 （ｉ）必要に応じて試験帯域に結合した核酸を全ゆる未
結合核酸から分離し、 （ｊ）増幅されたマーカー核酸のコピー数および全ゆる
標的核酸の存在または非存在を測定することからなる方
法。 - 【請求項１３】 マーカー核酸を含有するサンプル中で
一本鎖ＨＩＶ核酸を測定しその増幅の効率を確認する組
成物であって、 （ａ）次の配列を有する反応帯域中で有用なＨＩＶオリ
ゴヌクレオチドプライマー 【化５】 （ｂ）それぞれの一本鎖マーカー核酸についてのオリゴ
ヌクレオチドプライマ ー（そのコピー数は既知であり、このプライマーは、そ
の一本鎖マーカー核酸の相補的部分に選択的にアニール
することができる） （ｃ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド （ｄ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的
およびマーカー核酸にそれぞれ相補的であり、これにプ
ライマーがアニールする）、 （ｅ）ラベル部分とラベル部分に付着した第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片とからなる第１ポリヌクレオチドＨ
ＩＶプローブ（この第１一本鎖ポリヌクレオチド断片は
次よりなる群から選択される配列を有する） 【化６】 （ｆ）この配列の他のものを有し、反応帯域から離間し
た第１試験帯域に結合した第２ポリヌクレオチドＨＩＶ
プローブ （ｇ）標的ラベル部分から識別し得る第２ラベル部分
と、標的核酸の第１部分にハイブリダイズし得てラベル
部分に付着した第１一本鎖ポリヌクレオチド断片とから
なる第１ポリヌクレオチドマーカープローブ、並びに （ｈ）マーカー核酸の第２部分とハイブリダイズし得て
反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試験帯域
に結合した第２一本鎖ポリヌクレオチド断片からなる第
２ポリヌクレオチドマーカープローブからなる組成物。 - 【請求項１４】 マーカー核酸を含有しＨＩＶ核酸を含
有する可能性のあるサンプル中で一本鎖ＨＩＶ核酸を測
定しその増幅の効率を確認する方法であって、 （ａ）反応帯域中でサンプルと次の配列を有するＨＩＶ
オリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ、 【化７】 （ｂ）反応帯域中でサンプルとそれぞれの一本鎖マーカ
ー核酸についてのオリゴヌクレオチドプライマーとを接
触させ（サンプル中のそのコピー数は既知であり、この
プライマーは、一本鎖マーカー核酸の相補的部分と選択
的にアニールすることができる）、 （ｃ）反応帯域中でサンプルと４つの核酸塩基のそれぞ
れのモノヌクレオチドとを接触させ、 （ｄ）サンプル中のＨＩＶおよびマーカー核酸のコピー
数を増幅し、 （ｅ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数の核酸と次よりなる群から選択される
ＨＩＶ特異的配列を有する第１一本鎖ポリヌクレオチド
断片に付着したラベル部分からなる第１ＨＩＶポリヌク
レオチドプローブとを接触させ、 【化８】 （ｆ）第１ＨＩＶプローブと存在する全ゆる増幅したコ
ピー数の核酸とをハイブリダイズさせてＨＩＶハイブリ
ッドを形成し、 （ｇ）反応帯域中で、ハイブリダイズし得る条件下で、
増幅したコピー数のマーカー核酸とマーカー核酸の第１
部分にハイブリダイズし得る第１一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片に付着したラベル部分からなる第１ポリヌクレオ
チドマーカープローブとを接触させ、 （ｈ）第１マーカープローブと存在する全ゆる増幅した
コピー数のマーカー核酸とをハイブリダイズさせてマー
カーハイブリッドを形成し、 （ｉ）反応帯域から離間した第１試験帯域中で、ハイブ
リダイズし得る条件下で、工程（ａ）〜（ｆ）で処理し
たサンプルの分画とＨＩＶプローブ配列の他のものを有
する第１試験帯域に結合した第２一本鎖ポリヌクレオチ
ド断片からなる第２ポリヌクレオチドＨＩＶプローブと
を接触させ、 （ｊ）反応帯域および第１試験帯域から離間した第２試
験帯域中で、マーカー核酸の第２部分にハイブリダイズ
し得て第２試験帯域に結合した一本鎖核酸配列からなる
第２ポリヌクレオチドマーカープローブを接触させ、 （ｋ）ハイブリッドと試験帯域固定第２プローブとをハ
イブリダイズさせ、 （ｌ）必要に応じて試験帯域に結合した核酸を全ゆる未
結合核酸から分離し、 （ｍ）増幅されたマーカー核酸のコピー数および全ゆる
ＨＩＶ核酸の存在または非存在を測定することからなる
方法。 - 【請求項１５】 試験に供するサンプル中の複数の一本
鎖標的核酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このそれぞれのプライマ
ーは、標的核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニー
ルすることができる）、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成することのできる核酸ポリメラー
ゼ（この延長生成物は、特定のプライマーがアニールす
る一本鎖標的核酸に相補的である）、 （ｄ）ラベル部分とラベル部分に付着した第１一本鎖ポ
リヌクレオチド断片とからなる核酸標的のそれぞれにつ
いての第１ポリヌクレオチドプローブ（第１一本鎖ポリ
ヌクレオチド断片のそれぞれは、そのそれぞれの標的核
酸の第１部分とハイブリダイズし得る）、 （ｅ）その標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得て
それぞれの他の標的核酸についての試験帯域から離間し
た試験帯域に結合した第２一本鎖ポリヌクレオチド断片
からなるそれぞれの核酸標的についての第２ポリヌクレ
オチドプローブからなる組成物。 - 【請求項１６】 試験に供するサンプル中の複数の一本
鎖標的核酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーのそれぞ
れは、一本鎖標的核酸の相補的部分に選択的にアニール
することができる）、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから反応帯域
中で延長生成物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（この延
長生成物は、特定のプライマーがアニールする一本鎖の
標的核酸に相補的である）、 （ｄ）その標的核酸の第１部分とハイブリダイズし得る
第１一本鎖ポリヌクレオチド断片に付着したラベル系成
分からなるそれぞれの核酸標的についての第１ポリヌク
レオチドプローブ、 （ｅ）その標的核酸の第２部分とハイブリダイズし得る
第２一本鎖ポリヌクレオチド断片と第２ポリヌクレオチ
ド断片に付着した特異的結合実体とからなるそれぞれの
核酸標的についての第２ポリヌクレオチドプローブ、並
びに （ｆ）それぞれ反応帯域およびそれぞれの他の試験帯域
から離間し、それぞれ結合パートナー（これは意図する
標的核酸についての第２プローブに付着した特異的な結
合実体とのみ結合し得る）が付着した複数の試験帯域か
らなる組成物。 - 【請求項１７】 試験に供するサンプル中の一本鎖標的
核酸を測定する組成物であって、 （ａ）意図するそれぞれの一本鎖標的核酸についてのオ
リゴヌクレオチドプライマー（このプライマーは、標的
核酸の一本鎖の相補的部分に選択的にアニールし得
る）、 （ｂ）４つの核酸塩基のそれぞれのモノヌクレオチド、 （ｃ）プライマーおよびモノヌクレオチドから延長生成
物を生成し得る核酸ポリメラーゼ（これは一本鎖の標的
核酸に相補的であり、これに対してプライマーがアニー
ルして増幅された核酸配列を与える）、 （ｄ）標的核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖
ポリヌクレオチド断片が付着した第１粒子からなる第１
ポリヌクレオチドプローブ、並びに （ｅ）標的核酸の第２部分に相補的な複数の第２一本鎖
ポリヌクレオチド断片が付着した第２粒子からなる第２
ポリヌクレオチドプローブからなる組成物。 - 【請求項１８】 試験に供するサンプル中の一本鎖標的
核酸を測定する方法であって、 （ａ）標的核酸のコピー数を増幅し、 （ｂ）ハイブリダイズし得る条件下で標的核酸と（ｉ）
標的核酸の第１部分に相補的な複数の第１一本鎖ポリヌ
クレオチド断片が付着した第１粒子からなる第１ポリヌ
クレオチドプローブ、および（ｉｉ）標的遺伝物質の第
２部分に相補的な複数の第２一本鎖ポリヌクレオチド断
片が付着した第２粒子からなる第２ポリヌクレオチドプ
ローブとを接触させ、 （ｃ）第１ポリヌクレオチド断片と標的核酸の第１部分
とを、および第２断片と標的核酸の第２部分とをハイブ
リダイズさせ、ハイブリダイゼーションにより結果的に
凝集を与え、 （ｄ）凝集を測定することからなる方法。
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