JP2000346841A - Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法 - Google Patents
Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法Info
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- JP2000346841A JP2000346841A JP11162126A JP16212699A JP2000346841A JP 2000346841 A JP2000346841 A JP 2000346841A JP 11162126 A JP11162126 A JP 11162126A JP 16212699 A JP16212699 A JP 16212699A JP 2000346841 A JP2000346841 A JP 2000346841A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 生物学的試料中のPIVKA-IIの二抗体サン
ドイッチ法を利用する免疫学的測定法において、緩衝液
として乳蛋白を含有する緩衝液を用いることを特徴とす
るPIVKA-IIの測定法。 【効果】 検体中の異常プロトロンビン（PIVKA-II）濃
度の測定に際し、検体中の干渉成分の影響を受けること
なく、異常プロトロンビン（PIVKA-II）濃度を正しく測
定できる。
ドイッチ法を利用する免疫学的測定法において、緩衝液
として乳蛋白を含有する緩衝液を用いることを特徴とす
るPIVKA-IIの測定法。 【効果】 検体中の異常プロトロンビン（PIVKA-II）濃
度の測定に際し、検体中の干渉成分の影響を受けること
なく、異常プロトロンビン（PIVKA-II）濃度を正しく測
定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異常プロトロンビ
ン（PIVKA-II）の測定法に関し、更に詳細には生物学的
試料中のPIVKA-II濃度を、当該試料中に存在する干渉物
質の影響を受けることなく正確に測定する方法に関す
る。
ン（PIVKA-II）の測定法に関し、更に詳細には生物学的
試料中のPIVKA-II濃度を、当該試料中に存在する干渉物
質の影響を受けることなく正確に測定する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】血液凝固因子であるプロトロンビンは正
常な肝細胞にて生成されるが、ビタミンＫが欠乏した貧
血状態では正常なプロトロンビンが産生されずに、その
分子中に含まれる一部のグルタミン酸残基のカルボキシ
ル化が不完全な構造異常をもつ異常プロトロンビン（PI
VKA-II）が産生されることが知られていた。このPIVKA-
IIは正常なプロトロンビンの一部に異常を来した蛋白で
あり、正常プロトロンビンと極めて類似した構造を持っ
ている。このため、抗体の持つ特異性を利用してPIVKA-
IIを認識する抗体を用いることに依って測定が可能にな
った。
常な肝細胞にて生成されるが、ビタミンＫが欠乏した貧
血状態では正常なプロトロンビンが産生されずに、その
分子中に含まれる一部のグルタミン酸残基のカルボキシ
ル化が不完全な構造異常をもつ異常プロトロンビン（PI
VKA-II）が産生されることが知られていた。このPIVKA-
IIは正常なプロトロンビンの一部に異常を来した蛋白で
あり、正常プロトロンビンと極めて類似した構造を持っ
ている。このため、抗体の持つ特異性を利用してPIVKA-
IIを認識する抗体を用いることに依って測定が可能にな
った。
【０００３】１９８４年にＬｉｅｂｍａｎらは、肝細胞
癌の罹患患者の血中に放出されたPIVKA-II濃度を、抗体
を用いる放射免疫測定法によって測定した結果、正常者
より高いことを報告し、肝細胞癌を診断できる可能性を
見出した。
癌の罹患患者の血中に放出されたPIVKA-II濃度を、抗体
を用いる放射免疫測定法によって測定した結果、正常者
より高いことを報告し、肝細胞癌を診断できる可能性を
見出した。
【０００４】更に、当時広く応用されていた二種類の抗
体を用いて測定物を挟み込むサンドイッチ測定法の原理
を利用して、PIVKA-IIのサンドイッチ測定法が開発され
た（特開昭６０−６０５５７号）。この方法は、PIVKA-
IIに特異的な抗体（一次抗体又は第一抗体と称する）を
反応容器に固相化し、これにPIVKA-IIを結合させ、更に
酵素等で標識した別の抗体（二次抗体又は第二抗体と称
する）を結合させるもので、PIVKA-II量に応じて標識さ
れた二次抗体の量が増加し、そのシグナルを検出するこ
とでPIVKA-IIの濃度を測定できる方法である。PIVKA-II
はプロトロンビンのN端部の一部の構造が変化（特異構
造）したものであるが、サンドイッチ法ではこのPIVKA-
IIのみを認識する同士の抗体サンドイッチ法では、両抗
体が狭い特異構造で反応しようとするためうまく測定で
きないという特殊な事情があった。このため、PIVKA-II
の特異構造を認識する抗体を一次抗体として固相化し、
もう一方の二次抗体はPIVKA-IIと正常のプロトロンビン
の共通領域を認識する抗体を用いていた。この際、標識
された二次抗体はPIVKA-IIのみならず正常のプロトロン
ビンやその分解物であるトロンビンやフラグメントとも
結合する性質をもっており、測定時にこれら、正常のプ
ロトロンビンやその分解物であるトロンビンやフラグメ
ントが予期せずに反応容器に非特異的に吸着することが
あり、その場合にこれらの物質にも標識された二次抗体
が結合することにより正しくPIVKA-IIのみを測定できな
かった。すなわち、反応容器に正常のプロトロンビンや
その分解物であるトロンビンやフラグメントが非特異的
に吸着し、標識された二次抗体がこれらの物質と結合し
た場合には、PIVKA-IIと反応した標識された二次抗体と
区別することなくシグナルを検出するため、恰もPIVKA-
IIを測定している様な誤った結果を示すのである。
体を用いて測定物を挟み込むサンドイッチ測定法の原理
を利用して、PIVKA-IIのサンドイッチ測定法が開発され
た（特開昭６０−６０５５７号）。この方法は、PIVKA-
IIに特異的な抗体（一次抗体又は第一抗体と称する）を
反応容器に固相化し、これにPIVKA-IIを結合させ、更に
酵素等で標識した別の抗体（二次抗体又は第二抗体と称
する）を結合させるもので、PIVKA-II量に応じて標識さ
れた二次抗体の量が増加し、そのシグナルを検出するこ
とでPIVKA-IIの濃度を測定できる方法である。PIVKA-II
はプロトロンビンのN端部の一部の構造が変化（特異構
造）したものであるが、サンドイッチ法ではこのPIVKA-
IIのみを認識する同士の抗体サンドイッチ法では、両抗
体が狭い特異構造で反応しようとするためうまく測定で
きないという特殊な事情があった。このため、PIVKA-II
の特異構造を認識する抗体を一次抗体として固相化し、
もう一方の二次抗体はPIVKA-IIと正常のプロトロンビン
の共通領域を認識する抗体を用いていた。この際、標識
された二次抗体はPIVKA-IIのみならず正常のプロトロン
ビンやその分解物であるトロンビンやフラグメントとも
結合する性質をもっており、測定時にこれら、正常のプ
ロトロンビンやその分解物であるトロンビンやフラグメ
ントが予期せずに反応容器に非特異的に吸着することが
あり、その場合にこれらの物質にも標識された二次抗体
が結合することにより正しくPIVKA-IIのみを測定できな
かった。すなわち、反応容器に正常のプロトロンビンや
その分解物であるトロンビンやフラグメントが非特異的
に吸着し、標識された二次抗体がこれらの物質と結合し
た場合には、PIVKA-IIと反応した標識された二次抗体と
区別することなくシグナルを検出するため、恰もPIVKA-
IIを測定している様な誤った結果を示すのである。
【０００５】これに対し、特許第２７０２６１６号に
は、二次抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含
まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用するPIVKA-IIの
測定方法が記載されている。この方法は、前記のような
多種の干渉物質のうちトロンビンのみに着目し、検体中
のトロンビンが反応容器に結合しても標識二次抗体にこ
れと反応する抗体が全くなければ、トロンビン吸着の影
響を受けずに正しく検体中のPIVKA-IIが測定できるとい
うものである。
は、二次抗体としてヒトトロンビンと反応する抗体を含
まない抗ヒトプロトロンビン抗体を使用するPIVKA-IIの
測定方法が記載されている。この方法は、前記のような
多種の干渉物質のうちトロンビンのみに着目し、検体中
のトロンビンが反応容器に結合しても標識二次抗体にこ
れと反応する抗体が全くなければ、トロンビン吸着の影
響を受けずに正しく検体中のPIVKA-IIが測定できるとい
うものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法では
二次抗体からトロンビンと反応する抗体を除去するため
トロンビンアフィニティーゲルを用いた吸収操作が必要
になるという問題があった。しかし、何よりもこの方法
ではトロンビンの影響については回避できると推定され
るが、トロンビン以外の正常のプロトロンビンやその分
解物のフラグメント等の干渉物質の吸着に対しては影響
を全く回避できない。特に、干渉物質はトロンビンのみ
ならず多種類の関連物質が存在し、しかもこれらの検体
中での濃度は何れもPIVKA-IIの濃度より遼に高く、これ
ら干渉物質の影響、とりわけ吸着に関する影響を如何に
回避するか課題があった。すなわち、本発明者の研究に
おいても、PIVKA-IIの測定において反応容器にトロンビ
ンのみならずプロトロンビンやそのフラグメントが予期
せずに吸着した場合には、トロンビンが吸着した際の影
響より大きな影響をうけ、PIVKA-IIを正しく測定できな
かった。この際、特許第２７０２６１６号のように、吸
着した物質と反応しない二次抗体を用いる方法、すなわ
ち、吸着したトロンビンに反応しない標識した二次抗体
を用いる様な方法ではプロトロンビン等の吸着の課題は
解決されない。つまり、標識された二次抗体はPIVKA-II
とプロトロンビンに対して同様に反応する性質の抗体
（共通の抗体）であり、プロトロンビンの反応容器への
吸着に対しプロトロンビンと反応する抗体を除去する方
法を採用すれば、同時に測定しようとするPIVKA-IIにも
反応できないという矛盾があるためである。
二次抗体からトロンビンと反応する抗体を除去するため
トロンビンアフィニティーゲルを用いた吸収操作が必要
になるという問題があった。しかし、何よりもこの方法
ではトロンビンの影響については回避できると推定され
るが、トロンビン以外の正常のプロトロンビンやその分
解物のフラグメント等の干渉物質の吸着に対しては影響
を全く回避できない。特に、干渉物質はトロンビンのみ
ならず多種類の関連物質が存在し、しかもこれらの検体
中での濃度は何れもPIVKA-IIの濃度より遼に高く、これ
ら干渉物質の影響、とりわけ吸着に関する影響を如何に
回避するか課題があった。すなわち、本発明者の研究に
おいても、PIVKA-IIの測定において反応容器にトロンビ
ンのみならずプロトロンビンやそのフラグメントが予期
せずに吸着した場合には、トロンビンが吸着した際の影
響より大きな影響をうけ、PIVKA-IIを正しく測定できな
かった。この際、特許第２７０２６１６号のように、吸
着した物質と反応しない二次抗体を用いる方法、すなわ
ち、吸着したトロンビンに反応しない標識した二次抗体
を用いる様な方法ではプロトロンビン等の吸着の課題は
解決されない。つまり、標識された二次抗体はPIVKA-II
とプロトロンビンに対して同様に反応する性質の抗体
（共通の抗体）であり、プロトロンビンの反応容器への
吸着に対しプロトロンビンと反応する抗体を除去する方
法を採用すれば、同時に測定しようとするPIVKA-IIにも
反応できないという矛盾があるためである。
【０００７】従って、本発明の目的は、検体中に存在す
る多様な干渉物質の影響を排除したPIVKA-IIの正確な測
定法を提供することにある。
る多様な干渉物質の影響を排除したPIVKA-IIの正確な測
定法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記干渉物質に対する抗体を除去するのでなく、干渉物質
の反応容器への吸着そのものを防止すべく種々検討した
結果、従来用いられている界面活性剤、血清由来タンパ
クや無機塩類では十分な効果が得られず、乳蛋白を緩衝
液に添加することが干渉物質の吸着防止に効果的である
ことを見出し、本発明を完成した。
記干渉物質に対する抗体を除去するのでなく、干渉物質
の反応容器への吸着そのものを防止すべく種々検討した
結果、従来用いられている界面活性剤、血清由来タンパ
クや無機塩類では十分な効果が得られず、乳蛋白を緩衝
液に添加することが干渉物質の吸着防止に効果的である
ことを見出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は生物学的試料中のPIVK
A-IIの二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法
において、緩衝液として乳蛋白を含有する緩衝液を用い
ることを特徴とするPIVKA-IIの測定法を提供するもので
ある。
A-IIの二抗体サンドイッチ法を利用する免疫学的測定法
において、緩衝液として乳蛋白を含有する緩衝液を用い
ることを特徴とするPIVKA-IIの測定法を提供するもので
ある。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明測定法は二抗体サンドイッ
チ法であるが、一次抗体が固相であり、二次抗体が標識
された抗体である測定法が好ましい。従って、本発明に
おける緩衝液は、検体と一次抗体固相との反応に用いる
緩衝液及び／又は標識二次抗体の反応に用いる緩衝液で
あるが、検体と一次抗体固相との反応に用いる緩衝液に
乳蛋白を含有せしめるのが好ましい。乳蛋白のうち、ス
キムミルクが入手が容易であることから特に好ましい。
当該乳蛋白は、干渉物質の吸着防止効果の点から緩衝液
中に０．１重量％以上、特に０．１〜１０重量％、更に
１〜５重量％となるように添加するのが好ましい。
チ法であるが、一次抗体が固相であり、二次抗体が標識
された抗体である測定法が好ましい。従って、本発明に
おける緩衝液は、検体と一次抗体固相との反応に用いる
緩衝液及び／又は標識二次抗体の反応に用いる緩衝液で
あるが、検体と一次抗体固相との反応に用いる緩衝液に
乳蛋白を含有せしめるのが好ましい。乳蛋白のうち、ス
キムミルクが入手が容易であることから特に好ましい。
当該乳蛋白は、干渉物質の吸着防止効果の点から緩衝液
中に０．１重量％以上、特に０．１〜１０重量％、更に
１〜５重量％となるように添加するのが好ましい。
【００１１】更に当該緩衝液には、塩化ナトリウム等の
無機塩類、ウシ血清アルブミン、マウスγグロブリン等
の動物血清蛋白を添加するのが好ましい。無機塩類の濃
度は０．１〜０．５Ｍ、特に０．２〜０．５Ｍが好まし
い。動物血清蛋白の濃度は１〜１０重量％、特に３〜７
重量％が好ましい。
無機塩類、ウシ血清アルブミン、マウスγグロブリン等
の動物血清蛋白を添加するのが好ましい。無機塩類の濃
度は０．１〜０．５Ｍ、特に０．２〜０．５Ｍが好まし
い。動物血清蛋白の濃度は１〜１０重量％、特に３〜７
重量％が好ましい。
【００１２】緩衝液の基本組成としては、トリス塩酸緩
衝液等が好ましい。
衝液等が好ましい。
【００１３】特に好ましい緩衝液の組成は、５．０％ウ
シ血清アルブミン、５０mg／Ｌ正常マウスγグロブリ
ン、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム
及び１．０％スキムミルクを含む０．０５Ｍ トリス塩
酸緩衝液（pH８．０）である。
シ血清アルブミン、５０mg／Ｌ正常マウスγグロブリ
ン、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍエチレンジア
ミン四酢酸二ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム
及び１．０％スキムミルクを含む０．０５Ｍ トリス塩
酸緩衝液（pH８．０）である。
【００１４】本発明の測定法は、上記の緩衝液を用いる
以外は、通常の二抗体サンドイッチ法に従えばよい。一
次抗体としては、抗PIVKA-II抗体、特にPIVKA-IIの構造
異常部位を認識する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を用
いるのが好ましい。二次抗体としては、抗プロトロンビ
ン抗体、抗PIVKA-II抗体のいずれでもよく、これらはト
ロンビンと反応する抗体を含むものであってもよい。ま
た、二次抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル
抗体でもよい。
以外は、通常の二抗体サンドイッチ法に従えばよい。一
次抗体としては、抗PIVKA-II抗体、特にPIVKA-IIの構造
異常部位を認識する抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を用
いるのが好ましい。二次抗体としては、抗プロトロンビ
ン抗体、抗PIVKA-II抗体のいずれでもよく、これらはト
ロンビンと反応する抗体を含むものであってもよい。ま
た、二次抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル
抗体でもよい。
【００１５】一次抗体の固相化は、プレートでもビーズ
でもよいが、ビーズが好ましい。また、二次抗体の標識
は、125I などのラジオアイソトープ、発光物質、蛍光
物質、酵素のいずれでもよいが、ラジオアイソトープ、
発光物質又は蛍光物質が、二次抗体の量を少なくできる
点で特に好ましい。
でもよいが、ビーズが好ましい。また、二次抗体の標識
は、125I などのラジオアイソトープ、発光物質、蛍光
物質、酵素のいずれでもよいが、ラジオアイソトープ、
発光物質又は蛍光物質が、二次抗体の量を少なくできる
点で特に好ましい。
【００１６】測定は、一次抗体固相としてビーズを用い
た場合を例にして示せば、まず、一次抗体固相化ビーズ
と検体に前記乳蛋白含有緩衝液を加えて反応させ、次に
標識二次抗体との反応を行い、一次抗体固相ビーズと結
合した標識二次抗体のシグナルを測定することにより行
われる。このシグナル測定の際、被測定対象免疫反応生
成物、すなわち一次抗体固相（ビーズ）を反応容器から
取り出して測定すれば、より正確な測定が可能となる。
すなわち、反応容器から一次抗体固相を移動することに
より反応容器に干渉物質がたとえ吸着していても測定時
には一次抗体固相のみを測定するため、この影響は完全
に回避できる。
た場合を例にして示せば、まず、一次抗体固相化ビーズ
と検体に前記乳蛋白含有緩衝液を加えて反応させ、次に
標識二次抗体との反応を行い、一次抗体固相ビーズと結
合した標識二次抗体のシグナルを測定することにより行
われる。このシグナル測定の際、被測定対象免疫反応生
成物、すなわち一次抗体固相（ビーズ）を反応容器から
取り出して測定すれば、より正確な測定が可能となる。
すなわち、反応容器から一次抗体固相を移動することに
より反応容器に干渉物質がたとえ吸着していても測定時
には一次抗体固相のみを測定するため、この影響は完全
に回避できる。
【００１７】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
が、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１８】製造例１（一次抗体固相の作製） 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体溶液（５μｇ／ビーズ）
にプラスチック製ビーズ（６．４mm±０．２mm）を一晩
浸漬させてビーズ表面上にモノクローナル抗体を結合さ
せる。精製水にて洗浄後、ビーズを０．３％Ｔｗｅｅｎ
２０溶液中に３０分間浸す。再度、精製水にて洗浄後、
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中にビーズ
を３時間以上浸した後、ビーズを乾燥させてモノクロー
ナル抗体固相化ビーズを作製した。
にプラスチック製ビーズ（６．４mm±０．２mm）を一晩
浸漬させてビーズ表面上にモノクローナル抗体を結合さ
せる。精製水にて洗浄後、ビーズを０．３％Ｔｗｅｅｎ
２０溶液中に３０分間浸す。再度、精製水にて洗浄後、
０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中にビーズ
を３時間以上浸した後、ビーズを乾燥させてモノクロー
ナル抗体固相化ビーズを作製した。
【００１９】製造例２（標識された二次抗体の作製） 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体（トロンビンと反応する
抗体を３％含有する）８４μｇに約３７ＭＢｑのＮａ
125I（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）及び
１０μｇのクロラミンＴ（キシダ化学）を加え６０秒間
反応させ、１０μｇのメタ重亜硫酸ナトリウム（純正化
学）を添加して反応を停止した。この反応溶液をイオン
交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−４００Ｔ）にて精製
し、二次抗体用の緩衝液で約１９ｋＢｑ／ｍＬとなるよ
うに希釈しヨウ化PIVKA-IIモノクローナル抗体（125I）
（トロンビンと反応する抗体を３％含有する）溶液を作
製した。
抗体を３％含有する）８４μｇに約３７ＭＢｑのＮａ
125I（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）及び
１０μｇのクロラミンＴ（キシダ化学）を加え６０秒間
反応させ、１０μｇのメタ重亜硫酸ナトリウム（純正化
学）を添加して反応を停止した。この反応溶液をイオン
交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−４００Ｔ）にて精製
し、二次抗体用の緩衝液で約１９ｋＢｑ／ｍＬとなるよ
うに希釈しヨウ化PIVKA-IIモノクローナル抗体（125I）
（トロンビンと反応する抗体を３％含有する）溶液を作
製した。
【００２０】製造例３ 抗ヒトプロトロンビン抗体（ＤＡＫＯ社）から、ヒトプ
ロトロンビンアフィニティーカラム及びヒトトロンビン
アフィニティーカラムにてヒトトロンビンと反応する抗
体を精製し、製造例２の方法と同様に125I にて標識し
ヨウ化ヒトトロンビン抗体（125I）溶液を作製した。
ロトロンビンアフィニティーカラム及びヒトトロンビン
アフィニティーカラムにてヒトトロンビンと反応する抗
体を精製し、製造例２の方法と同様に125I にて標識し
ヨウ化ヒトトロンビン抗体（125I）溶液を作製した。
【００２１】比較例１ ヒト正常プロトロンビンを真空下で加熱し、脱カルボキ
シル化プロトロンビン（異常プロトロンビン、PIVKA-I
I）を作製し、これを正常ウマ血清にて適当な濃度に希
釈し、標準PIVKA-II溶液を調製した。標準PIVKA-II溶液
（脱炭酸）又は検体１００μＬをポリスチレンチューブ
に分注し、次に、緩衝試薬としてリン酸バッファー（１
０ｍＭ、pH７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０５％アジ化
ナトリウム含有）１００μＬ及びPIVKA-II抗体ビーズ１
個ずつを各々のチューブに加え、室温にて２時間振盪す
る。この反応液を吸引除去した後、２ｍＬの生理食塩水
で２回洗浄する。次に、上記リン酸バッファーにて希釈
されたヨウ化PIVKA-IIモノクローナル抗体（125I）２０
０μＬをチューブに加え、再度、室温にて２時間振盪す
る。反応液を吸引除去した後、ビーズを２ｍＬの生理食
塩水で２回洗浄し、ビーズが入ったチューブの放射能量
をガンマカウンターにて測定する。各標準PIVKA-II濃度
のカウントより描かれた標準曲線から検体中のPIVKA-II
濃度を求める。
シル化プロトロンビン（異常プロトロンビン、PIVKA-I
I）を作製し、これを正常ウマ血清にて適当な濃度に希
釈し、標準PIVKA-II溶液を調製した。標準PIVKA-II溶液
（脱炭酸）又は検体１００μＬをポリスチレンチューブ
に分注し、次に、緩衝試薬としてリン酸バッファー（１
０ｍＭ、pH７．４、０．２％ＢＳＡ、０．０５％アジ化
ナトリウム含有）１００μＬ及びPIVKA-II抗体ビーズ１
個ずつを各々のチューブに加え、室温にて２時間振盪す
る。この反応液を吸引除去した後、２ｍＬの生理食塩水
で２回洗浄する。次に、上記リン酸バッファーにて希釈
されたヨウ化PIVKA-IIモノクローナル抗体（125I）２０
０μＬをチューブに加え、再度、室温にて２時間振盪す
る。反応液を吸引除去した後、ビーズを２ｍＬの生理食
塩水で２回洗浄し、ビーズが入ったチューブの放射能量
をガンマカウンターにて測定する。各標準PIVKA-II濃度
のカウントより描かれた標準曲線から検体中のPIVKA-II
濃度を求める。
【００２２】実施例１ 緩衝試薬として、比較例１におけるリン酸バッファーの
代わりに、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．０、５％
ＢＳＡ、５０mg／Ｌ正常マウスγグロブリン、０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有）を用
い、更に、この中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活
性剤）、０．０５％ＮＰ−４０（界面活性剤）、あるい
は１％スキムミルクを添加した。また、ヨウ化PIVKA-II
モノクローナル抗体（125I）用の緩衝剤には、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（pH６．４、１％ ＢＳＡ、１％ウマ血
清、０．９％塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０．０５％アジ化ナトリウム含有）を用い、比較例
１と同様な方法で測定を行った。健常成人の血清を用い
て上記の如くして測定した結果を表１及び図１に示す。
健常者のPIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ未満である
ため、検体中の干渉物質の影響を受けずに正しい測定が
出来る場合にはPIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ未満
となる。この際、検体中の干渉物質の影響を受ける場合
には、PIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ以上の異常高
値となる。
代わりに、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．０、５％
ＢＳＡ、５０mg／Ｌ正常マウスγグロブリン、０．３Ｍ
塩化ナトリウム、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸二
ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム含有）を用
い、更に、この中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（界面活
性剤）、０．０５％ＮＰ−４０（界面活性剤）、あるい
は１％スキムミルクを添加した。また、ヨウ化PIVKA-II
モノクローナル抗体（125I）用の緩衝剤には、１０ｍＭ
リン酸緩衝液（pH６．４、１％ ＢＳＡ、１％ウマ血
清、０．９％塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０．０５％アジ化ナトリウム含有）を用い、比較例
１と同様な方法で測定を行った。健常成人の血清を用い
て上記の如くして測定した結果を表１及び図１に示す。
健常者のPIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ未満である
ため、検体中の干渉物質の影響を受けずに正しい測定が
出来る場合にはPIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ未満
となる。この際、検体中の干渉物質の影響を受ける場合
には、PIVKA-II測定値は４０ｍＡＵ／ｍＬ以上の異常高
値となる。
【００２３】
【表１】
【００２４】表１から明らかなように、吸着防止剤を添
加しない場合（比較例１）では健常者であるにもかかわ
らず異常高値となる例が多い。これに対しＴｗｅｅｎ２
０やＮＰ−４０を添加した場合、ある程度は改善される
が、その添加効果は十分ではない。これに対し、スキム
ミルクを添加した場合は健常者の全例のPIVKA-II測定値
が４０ｍＡＵ／ｍＬ未満であり、正しく測定できること
がわかる。
加しない場合（比較例１）では健常者であるにもかかわ
らず異常高値となる例が多い。これに対しＴｗｅｅｎ２
０やＮＰ−４０を添加した場合、ある程度は改善される
が、その添加効果は十分ではない。これに対し、スキム
ミルクを添加した場合は健常者の全例のPIVKA-II測定値
が４０ｍＡＵ／ｍＬ未満であり、正しく測定できること
がわかる。
【００２５】実施例２ 標準PIVKA-II溶液（脱炭酸）又は検体１００μＬを反応
トレイの各穴に分注し、次に、実施例１の緩衝液１００
μＬ及びPIVKA-II抗体ビーズ１個ずつを各穴に加え、室
温にて２時間振盪する。この反応液を吸引除去した後、
２ｍＬの生理食塩水で２回洗浄する。次に、ヨウ化PIVK
A-IIモノクローナル抗体（125I）２００μＬを各穴に加
え、再度、室温にて２時間振盪する。反応液を吸引除去
した後、ビーズを２ｍＬの生理食塩水で２回洗浄し、反
応トレイからビーズをカウント用チューブに移し替え
る。このビーズが入ったチューブの放射能量をガンマカ
ウンターにて測定し、各標準PIVKA-II濃度のカウントよ
り描かれた標準曲線から検体中のPIVKA-II濃度を求め
る。健常者の血清及び血漿を用いて上記の如くして測定
した結果を図２に示す。図２により、標識二次抗体のカ
ウント時に抗体ビーズを反応容器から別のチューブに移
し替えた場合には、更に正しいPIVKA-II濃度測定ができ
ることがわかる。
トレイの各穴に分注し、次に、実施例１の緩衝液１００
μＬ及びPIVKA-II抗体ビーズ１個ずつを各穴に加え、室
温にて２時間振盪する。この反応液を吸引除去した後、
２ｍＬの生理食塩水で２回洗浄する。次に、ヨウ化PIVK
A-IIモノクローナル抗体（125I）２００μＬを各穴に加
え、再度、室温にて２時間振盪する。反応液を吸引除去
した後、ビーズを２ｍＬの生理食塩水で２回洗浄し、反
応トレイからビーズをカウント用チューブに移し替え
る。このビーズが入ったチューブの放射能量をガンマカ
ウンターにて測定し、各標準PIVKA-II濃度のカウントよ
り描かれた標準曲線から検体中のPIVKA-II濃度を求め
る。健常者の血清及び血漿を用いて上記の如くして測定
した結果を図２に示す。図２により、標識二次抗体のカ
ウント時に抗体ビーズを反応容器から別のチューブに移
し替えた場合には、更に正しいPIVKA-II濃度測定ができ
ることがわかる。
【００２６】実施例３ 実施例１及び２で二次抗体として用いた抗PIVKA-IIモノ
クローナル抗体は、トロンビンと反応する抗体を３％含
むものであったが、これに更に製造例３で得たヒトトロ
ンビン抗体を添加（１０％又は３０％）したものを二次
抗体とした。これらの二次抗体を用いる以外は、実施例
２と同様にして健常者血清中PIVKA-II濃度を測定した。
その結果、表２に示す如く、緩衝液に蛋白質を添加した
ことにより、二次抗体中にトロンビンと反応する抗体が
多量含まれていても正確に血清中PIVKA-II濃度が測定で
きることが判明した。
クローナル抗体は、トロンビンと反応する抗体を３％含
むものであったが、これに更に製造例３で得たヒトトロ
ンビン抗体を添加（１０％又は３０％）したものを二次
抗体とした。これらの二次抗体を用いる以外は、実施例
２と同様にして健常者血清中PIVKA-II濃度を測定した。
その結果、表２に示す如く、緩衝液に蛋白質を添加した
ことにより、二次抗体中にトロンビンと反応する抗体が
多量含まれていても正確に血清中PIVKA-II濃度が測定で
きることが判明した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、検体中に含まれるPIVK
A-II測定値に影響を及ぼす干渉物質の反応容器等への吸
着もほとんど防止できるため正確にPIVKA-IIの測定が可
能となった。また、本発明方法によれば、二次抗体とし
てトロンビンと反応する抗体を含む抗体を用いた場合で
も血清中のPIVKA-IIが正確に測定できる。
A-II測定値に影響を及ぼす干渉物質の反応容器等への吸
着もほとんど防止できるため正確にPIVKA-IIの測定が可
能となった。また、本発明方法によれば、二次抗体とし
てトロンビンと反応する抗体を含む抗体を用いた場合で
も血清中のPIVKA-IIが正確に測定できる。
【図１】血清中PIVKA-II濃度測定値に及ぼす緩衝液への
乳蛋白の添加効果を示す図である。
乳蛋白の添加効果を示す図である。
【図２】抗体固相移動方式によるPIVKA-II濃度測定にお
ける乳蛋白の添加効果を示す図である。
ける乳蛋白の添加効果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 16/36 Ｃ０７Ｋ 16/36 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ36 QR48 QR51 QR56 QR83 QS03 QS20 QS33 QS35 QS36 QX07 4H045 DA65 DA76 DA89 FA82
Claims (3)
- 【請求項１】 生物学的試料中のPIVKA-IIの二抗体サン
ドイッチ法を利用する免疫学的測定法において、緩衝液
として乳蛋白を含有する緩衝液を用いることを特徴とす
るPIVKA-IIの測定法。 - 【請求項２】 生物学的試料中のPIVKA-IIの二抗体サン
ドイッチ法を利用する免疫学的測定法が、被測定対象免
疫反応生成物を反応容器から取り出して測定する方法で
ある請求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 乳蛋白が、スキムミルクである請求項１
又は２記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11162126A JP2000346841A (ja) | 1999-06-09 | 1999-06-09 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11162126A JP2000346841A (ja) | 1999-06-09 | 1999-06-09 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000346841A true JP2000346841A (ja) | 2000-12-15 |
Family
ID=15748546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11162126A Withdrawn JP2000346841A (ja) | 1999-06-09 | 1999-06-09 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000346841A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| JP2013152247A (ja) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| KR20150041620A (ko) * | 2012-08-09 | 2015-04-16 | 후지레비오 가부시키가이샤 | Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트 |
| JP2017151120A (ja) * | 2011-05-20 | 2017-08-31 | アボットジャパン株式会社 | 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬 |
| CN116496401A (zh) * | 2022-01-26 | 2023-07-28 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗异常凝血酶原的抗体、检测异常凝血酶原的试剂和试剂盒 |
-
1999
- 1999-06-09 JP JP11162126A patent/JP2000346841A/ja not_active Withdrawn
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010127827A (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-10 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| JP2017151120A (ja) * | 2011-05-20 | 2017-08-31 | アボットジャパン株式会社 | 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬 |
| KR20150041620A (ko) * | 2012-08-09 | 2015-04-16 | 후지레비오 가부시키가이샤 | Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트 |
| KR102100152B1 (ko) | 2012-08-09 | 2020-04-13 | 후지레비오 가부시키가이샤 | Pivka-ⅱ 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트 |
| JP2013152247A (ja) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| CN116496401A (zh) * | 2022-01-26 | 2023-07-28 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗异常凝血酶原的抗体、检测异常凝血酶原的试剂和试剂盒 |
| CN116496401B (zh) * | 2022-01-26 | 2024-02-13 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 抗异常凝血酶原的抗体、检测异常凝血酶原的试剂和试剂盒 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060905 |