JPH0230665B2 - Shinkinakogenteiryoho - Google Patents
ShinkinakogenteiryohoInfo
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- JPH0230665B2 JPH0230665B2 JP9665183A JP9665183A JPH0230665B2 JP H0230665 B2 JPH0230665 B2 JP H0230665B2 JP 9665183 A JP9665183 A JP 9665183A JP 9665183 A JP9665183 A JP 9665183A JP H0230665 B2 JPH0230665 B2 JP H0230665B2
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- JP
- Japan
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- antibody
- antigen
- red blood
- complement
- blood cells
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
- G01N33/555—Red blood cell
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な抗原を定量する方法に関するも
のである。
のである。
近年医療分野においては病気の診断等のため抗
原等を高い信頼性をもつて簡便迅速に定量するこ
とが極めて重要な課題になつている。
原等を高い信頼性をもつて簡便迅速に定量するこ
とが極めて重要な課題になつている。
従来免疫化学的方法による抗原の定量法として
は、放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセイ）
(A)、酵素免疫測定法(B)、逆受身赤血球凝集反応法
(C)及び一元放射状免疫拡散法(D)等により行われて
いるが、これらの定量方法は夫々次の如き欠点を
有するものであつた。
は、放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセイ）
(A)、酵素免疫測定法(B)、逆受身赤血球凝集反応法
(C)及び一元放射状免疫拡散法(D)等により行われて
いるが、これらの定量方法は夫々次の如き欠点を
有するものであつた。
Ａ方法：洗浄の操作を必要とし、またラジオアイ
ソトープを使用するため特別の設備を必要とす
る等莫大な設備費と繁雑な手数を要する。
ソトープを使用するため特別の設備を必要とす
る等莫大な設備費と繁雑な手数を要する。
Ｂ方法：一般的に洗浄の操作を必要とし且つ判定
までに長時間を要する。
までに長時間を要する。
Ｃ方法：ダイリユーターにて試料を２倍に階段希
釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要す
る。又判定までに長時間を要すると共に抗原量
を２倍階段希釈の終末値で判定するため雑駁な
測定になるおそれがある。
釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要す
る。又判定までに長時間を要すると共に抗原量
を２倍階段希釈の終末値で判定するため雑駁な
測定になるおそれがある。
Ｄ方法：判定までに多大な時間を要すると共に感
度的に不十分である。
度的に不十分である。
本発明者等はかかる現状に鑑み鋭意研究を行つ
た結果、多くの種類の抗原定量に汎用性があり且
つ感度よくしかも簡便迅速に抗原を定量する方法
を開発したものである。即ち、本発明方法は第１
抗体と抗原抗体反応を起こす第２抗体を結合させ
た赤血球浮遊液に、定量すべき抗原と抗原抗体反
応を起こす第１抗体を添加して前記第２抗体と抗
原抗体反応を起こさせた後、抗原と補体を添加し
て反応せしめることにより赤血球を溶血させ、該
溶血現象から前記抗原を間接的に定量することを
特徴とするものである。
た結果、多くの種類の抗原定量に汎用性があり且
つ感度よくしかも簡便迅速に抗原を定量する方法
を開発したものである。即ち、本発明方法は第１
抗体と抗原抗体反応を起こす第２抗体を結合させ
た赤血球浮遊液に、定量すべき抗原と抗原抗体反
応を起こす第１抗体を添加して前記第２抗体と抗
原抗体反応を起こさせた後、抗原と補体を添加し
て反応せしめることにより赤血球を溶血させ、該
溶血現象から前記抗原を間接的に定量することを
特徴とするものである。
本発明方法における第２抗体を結合させた赤血
球浮遊液に第１抗体を添加する工程において、添
加した第１抗体は赤血球に結合している前記第２
抗体に対する抗原であり、この段階で抗原抗体反
応が起るため、補体の添加によつて補体結合反応
による溶血現象が生じるものと考えられるが、実
際には溶血現象は生じなかつた。これに対し、更
に抗原を反応せしめることにより、初めて補体結
合反応による赤血球の溶血現象が生じ、前記抗原
を定量できることを見い出したものである。
球浮遊液に第１抗体を添加する工程において、添
加した第１抗体は赤血球に結合している前記第２
抗体に対する抗原であり、この段階で抗原抗体反
応が起るため、補体の添加によつて補体結合反応
による溶血現象が生じるものと考えられるが、実
際には溶血現象は生じなかつた。これに対し、更
に抗原を反応せしめることにより、初めて補体結
合反応による赤血球の溶血現象が生じ、前記抗原
を定量できることを見い出したものである。
本発明方法において定量できる抗原の種類とし
ては、例えばα−フエトプロテイン、T3、T4、
HBs、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、
ミオグロビンなどをあげることができるが、しか
し、これらの抗原に限定されるものではなく抗原
抗体反応に補体が関与するすべての種類の抗原を
定量しうるものである。
ては、例えばα−フエトプロテイン、T3、T4、
HBs、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、
ミオグロビンなどをあげることができるが、しか
し、これらの抗原に限定されるものではなく抗原
抗体反応に補体が関与するすべての種類の抗原を
定量しうるものである。
又本発明方法において赤血球に結合させる抗体
としては、定量する抗原に対する抗体ではなく、
抗原に対する抗体と同種の動物の免疫グロブリン
蛋白に対する抗体であるため、感作赤血球は多く
の種類の抗原定量に汎用性があるものである。
としては、定量する抗原に対する抗体ではなく、
抗原に対する抗体と同種の動物の免疫グロブリン
蛋白に対する抗体であるため、感作赤血球は多く
の種類の抗原定量に汎用性があるものである。
本発明方法において赤血球に抗体を結合させる
場合、赤血球に化学的に吸着させるのが好まし
い。赤血球にかかる抗体を担持させる方法はすで
に多くの方法が提案されている。例えばタンニン
酸、塩化クロム、水溶性カルボジイミド等による
方法である。
場合、赤血球に化学的に吸着させるのが好まし
い。赤血球にかかる抗体を担持させる方法はすで
に多くの方法が提案されている。例えばタンニン
酸、塩化クロム、水溶性カルボジイミド等による
方法である。
本発明方法において使用する赤血球は特に限定
するものではなく、如何なる種類の赤血球でもよ
い。然し定量の感度を高めるためには補体結合反
応による溶血現象が生じやすい赤血球、例えば羊
赤血球等が好ましい。
するものではなく、如何なる種類の赤血球でもよ
い。然し定量の感度を高めるためには補体結合反
応による溶血現象が生じやすい赤血球、例えば羊
赤血球等が好ましい。
本発明方法において補体の種類は、特に限定さ
れるものではなく、補体活性の高い補体が望まし
く、例えばモルモツト補体等である。
れるものではなく、補体活性の高い補体が望まし
く、例えばモルモツト補体等である。
而して本発明方法と従来の補体結合反応試験と
はどのように異なるかについて説明する。補体結
合反応試験は抗原定量法或は抗体定量法として従
来から知られている方法である。即ち抗原に抗体
が結合すると抗体分子に分子変容がおこり抗体に
補体が結合し活性化、消費される。これを補体結
合反応という。この反応を利用して消費された補
体量から間接的に抗原抗体反応の強さを知ること
が出来る。例えば抗原量を一定にしておけば抗体
量を、抗体量を一定にしておけば抗原量を測定す
ることができる。抗原抗体反応による補体の消費
は、羊赤血球に対する抗体が結合した羊赤血球の
溶血を指標とする。従来の補体結合反応試験で
は、このような抗原抗体反応に消費された残りの
補体による羊赤血球に対する抗体が結合した羊赤
血球の溶血から抗原或は、抗体を定量するもので
ある。然し本発明方法は直接赤血球表面で定量せ
んとする抗原と抗体を反応させ、補体結合反応に
よる赤血球の溶血現象から間接的に抗原を定量す
るものである。
はどのように異なるかについて説明する。補体結
合反応試験は抗原定量法或は抗体定量法として従
来から知られている方法である。即ち抗原に抗体
が結合すると抗体分子に分子変容がおこり抗体に
補体が結合し活性化、消費される。これを補体結
合反応という。この反応を利用して消費された補
体量から間接的に抗原抗体反応の強さを知ること
が出来る。例えば抗原量を一定にしておけば抗体
量を、抗体量を一定にしておけば抗原量を測定す
ることができる。抗原抗体反応による補体の消費
は、羊赤血球に対する抗体が結合した羊赤血球の
溶血を指標とする。従来の補体結合反応試験で
は、このような抗原抗体反応に消費された残りの
補体による羊赤血球に対する抗体が結合した羊赤
血球の溶血から抗原或は、抗体を定量するもので
ある。然し本発明方法は直接赤血球表面で定量せ
んとする抗原と抗体を反応させ、補体結合反応に
よる赤血球の溶血現象から間接的に抗原を定量す
るものである。
従来の補体結合反応試験では、抗原抗体反応に
消費された残りの補体による羊赤血球に対する抗
体が結合した羊赤血球の溶血を指標とするため補
体量が一定でなければならず被検血清中の既存の
補体の影響をなくすために56℃、30分間非働化を
行わなければならない。そのため熱に不安定な抗
原の定量には使用できなかつた。然し、本発明方
法においては、補体は一定以上であればよく被検
血清中の既存の補体の影響がなく非動化を要せず
熱に不安定な抗原でも定量することができる。更
に、従来の補体結合反応試験では被検血清を２倍
階段希釈するなどの繁雑な操作を必要とし且つ判
定までに長時間を要するが、本発明方法において
は２倍階段希釈などの操作を必要とせず簡便迅速
に抗原を定量することができる。
消費された残りの補体による羊赤血球に対する抗
体が結合した羊赤血球の溶血を指標とするため補
体量が一定でなければならず被検血清中の既存の
補体の影響をなくすために56℃、30分間非働化を
行わなければならない。そのため熱に不安定な抗
原の定量には使用できなかつた。然し、本発明方
法においては、補体は一定以上であればよく被検
血清中の既存の補体の影響がなく非動化を要せず
熱に不安定な抗原でも定量することができる。更
に、従来の補体結合反応試験では被検血清を２倍
階段希釈するなどの繁雑な操作を必要とし且つ判
定までに長時間を要するが、本発明方法において
は２倍階段希釈などの操作を必要とせず簡便迅速
に抗原を定量することができる。
次に本発明の実施例について説明する。
実施例 １
ヒトα−フエトプロテインの定量において、生
理食塩液で洗浄した羊赤血球沈査１容に塩化クロ
ム（0.4mg／ml）２容と抗ウサギ免疫グロブリン
ヤギ抗体２容（タンパク量400μｇ／ml）を混合
し、室温で30分間反応させた後、生理食塩液で洗
浄し８％の浮遊液とした。この抗体感作羊赤血球
浮遊液50μに抗ヒトα−フエトプロテインウサ
ギ抗体50μを添加した後、種々の濃度のヒトα
−フエトプロテイン量を含む試料50μを添加
し、更にベロナール緩衝液にて100倍に希釈した
モルモツト補体3.0mlを添加し37℃、30分間反応
を行つた後、低速遠心操作によつて上澄のヘモグ
ロビンの吸光度（416nｍ）を測定した。
理食塩液で洗浄した羊赤血球沈査１容に塩化クロ
ム（0.4mg／ml）２容と抗ウサギ免疫グロブリン
ヤギ抗体２容（タンパク量400μｇ／ml）を混合
し、室温で30分間反応させた後、生理食塩液で洗
浄し８％の浮遊液とした。この抗体感作羊赤血球
浮遊液50μに抗ヒトα−フエトプロテインウサ
ギ抗体50μを添加した後、種々の濃度のヒトα
−フエトプロテイン量を含む試料50μを添加
し、更にベロナール緩衝液にて100倍に希釈した
モルモツト補体3.0mlを添加し37℃、30分間反応
を行つた後、低速遠心操作によつて上澄のヘモグ
ロビンの吸光度（416nｍ）を測定した。
その結果は第１図に示す通りであり、ヒトα−
フエトプロテインの濃度と吸光度との直線関係に
よつてヒトα−フエトプロテインを定量すること
ができる。
フエトプロテインの濃度と吸光度との直線関係に
よつてヒトα−フエトプロテインを定量すること
ができる。
実施例 ２
ヒト免疫グロブリンＧの定量において、実施例
(1)と同様に調製した抗体感作羊赤血球浮遊液50μ
に抗ヒト免疫グロブリンＧ（γ−鎖特異性）ウ
サギ抗体（200μｇ／ml）50μを添加した後、
種々の濃度のヒト免疫グロブリンＧを含む試料
50μを添加し、更にベロナール緩衝液にて100
倍に希釈したモルモツト補体3.0mlを添加し、37
℃で30分間反応させた後、低速遠心操作によつて
上澄のヘモグロビンの吸光度（416nｍ）を測定
した。
(1)と同様に調製した抗体感作羊赤血球浮遊液50μ
に抗ヒト免疫グロブリンＧ（γ−鎖特異性）ウ
サギ抗体（200μｇ／ml）50μを添加した後、
種々の濃度のヒト免疫グロブリンＧを含む試料
50μを添加し、更にベロナール緩衝液にて100
倍に希釈したモルモツト補体3.0mlを添加し、37
℃で30分間反応させた後、低速遠心操作によつて
上澄のヘモグロビンの吸光度（416nｍ）を測定
した。
その結果は第２図に示す通りであり、ヒト免疫
グロブリンＧの濃度と吸光度との直線関係によつ
てヒト免疫グロブリンＧを定量することができ
る。
グロブリンＧの濃度と吸光度との直線関係によつ
てヒト免疫グロブリンＧを定量することができ
る。
以上詳述した如く本発明方法によれば優れた感
度を有し且簡便迅速に抗原を定量することができ
うると共に多種類の抗原に適用しうる等顕著な効
果を有する。
度を有し且簡便迅速に抗原を定量することができ
うると共に多種類の抗原に適用しうる等顕著な効
果を有する。
第１図は本発明新規な抗原の定量法においてヒ
トα−フエトプロテインの濃度と吸光度との関係
説明図、第２図は本発明新規な抗原の定量法にお
いてヒト免疫グロブリンＧの濃度と吸光度との関
係説明図である。
トα−フエトプロテインの濃度と吸光度との関係
説明図、第２図は本発明新規な抗原の定量法にお
いてヒト免疫グロブリンＧの濃度と吸光度との関
係説明図である。
Claims (1)
- １ 第１抗体と抗原抗体反応を起こす第２抗体を
結合させた赤血球浮遊液に、定量すべき抗原と抗
原抗体反応を起こす第１抗体を添加して前記第２
抗体と抗原抗体反応を起こさせた後、抗原と補体
を添加して反応せしめることにより赤血球を溶血
させ、該溶血現象から前記抗原を間接的に定量す
ることを特徴とする新規な抗原定量法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9665183A JPH0230665B2 (ja) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Shinkinakogenteiryoho |
| EP84106070A EP0132537A1 (en) | 1983-05-31 | 1984-05-28 | Immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9665183A JPH0230665B2 (ja) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Shinkinakogenteiryoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60364A JPS60364A (ja) | 1985-01-05 |
| JPH0230665B2 true JPH0230665B2 (ja) | 1990-07-09 |
Family
ID=14170729
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9665183A Expired - Lifetime JPH0230665B2 (ja) | 1983-05-31 | 1983-05-31 | Shinkinakogenteiryoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0230665B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3630279A1 (de) * | 1986-09-05 | 1988-03-17 | Basf Ag | Verfahren zur uebertragung von farbstoffen |
| JPH0711522B2 (ja) * | 1989-09-13 | 1995-02-08 | 工業技術院長 | 化学増幅型化学発光免疫測定法 |
-
1983
- 1983-05-31 JP JP9665183A patent/JPH0230665B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60364A (ja) | 1985-01-05 |
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