JP2000502894A

JP2000502894A - 均質ｄｎａプローブ滴定検定

Info

Publication number: JP2000502894A
Application number: JP9522770A
Authority: JP
Inventors: エフヤン、チェン; エスイェイン、フレデリック
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1995-12-19
Filing date: 1996-10-16
Publication date: 2000-03-14
Also published as: AU706205B2; WO1997022718A1; EP0868528A1; US5747256A; AU7595896A; CA2238961A1

Abstract

(57)【要約】テスト試料中の関心とする標的ポリヌクレオチド配列の存在又は量を検出するための検定が開示されている。この検定は、検定媒体中で（ｉ）第１試薬と（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含むと思われるテスト試料のアリコートとを合わせることによって反応混合物を形成する工程を含んでなる。この反応混合物は、変性条件におかれ、それから第１試薬と、存在する任意の標的ポリヌクレオチドとをハイブリッド化させるハイブリッド形成条件にさらされる。第２試薬がそれから添加され、この反応混合物はハイブリッド形成状態におかれ、そして試料中の標的ポリヌクレオチドの存在と関連する、反応混合物の濁りの変化が検出される。

Description

【発明の詳細な説明】均質ＤＮＡプローブ滴定検定チェンエフヤン及びフレッドシューチェンイェイン背景診断検定は疾病の検知や診断に重要な役割をなす。遺伝学上の特質、異常の検知、および臨床医学における疾病の診断のための方法として、遺伝学的分析を用いることは、非常な衝撃を与えている。組換え核酸技術は、特定のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片の検出、単離、及び特徴づけを可能にすることで、分子生物学や遺伝学に大変革を起している。遺伝学的分析の発達によって、血清、血漿、大脳髄液（ｃｅｒｅｂｒａｌｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄ）、羊水、及び尿の試料中の関心とする特定のポリヌクレオチドを精確に測定できるようになった。特に、遺伝学的分析は、細菌やウイルスのような病源学上の作用物（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌａｇｅｎｔｓ）を検知し同定するために、また抗生物質抵抗性の細菌をスクリーニングするために、またダウン症候群、鎌状赤血球貧血、及び嚢胞性線維症のような遺伝学上の病気の診断を手助けするために、更にはがん細胞のような細胞性の病気を検知するために用いることができる。このように、遺伝学的分析の重要性故に、この技術が医学の診断学、人間の遺伝学、胎児期の診断学、法科学、及び生物科学の他の学科といった広く様々の適用に受け入れやすくしている。しかしながら、検定としての遺伝学的分析の使用については、予想外に困難な事情がある。これらの検定の感度、正確さ、速さ、そして多用性がその検定条件によってしばしば制限される。そのような制限は関心ある特定のポリヌクレオチド配列の検出と測定を信頼できないものにし、そしてこのことは誤診と潜在的には不適切な処置へと導く不正確な結果を引き起こしうる。試料中の特定のポリヌクレオチド配列を見つけ出すいろいろな公知の方法がある。遺伝学的分析の慣用方法は、技術水準のハイブリッド形成検定技術を使用している。核酸ハイブリッド形成は試料中の核酸を検出し同定することに対して非常に敏感で明確な手がかりを提供してくれる。サンプル核酸中の、関心とする特定の塩基配列もしくは遺伝子間のハイブリッド形成は一般に、固体支持体上でのサンプル核酸の不動化と標識プローブを加えること、又はプローブの不動化とサンプル核酸をその場で標識化すること、又はプローブの１つが不動化され、また他の１つが標識化された２つのプローブを要求する二重ハイブリッド形成技術を使用することを必然的に伴っている。不動化を達成するために要求される手続は一般に時間の浪費であり、且つ臨床実験室での定期的な使用にとって望ましくない追加の工程を一般に要求するために、これらの方法に関連した不利がある。その上、これらの方法はしばしば酵素や核酸プローブを標識した放射性トレーサーを必要とする。放射性標識ヌクレオチド配列は広く使用されているが、その使用者に危険をもたらしうる。更にこれらの放射性物質は半減期が短く、そのために貯蔵寿命が制限されている。他の方法はＤＮＡ溶液の吸光度の変化を測定すること、クロマトグラフィー又はヒドロキシアパタイドを用いてハイブリッド化したＤＮＡをハイブリッド化していないＤＮＡから物理的に単離すること、そしてこのハイブリッド化したＤＮＡを定量することを包含している。これらの方法も一般に放射性標識を必要とする。特に診断上の適用に関しては、関心とする標的ポリヌクレオチド配列は、問題のＤＮＡや（リボ核酸）ＲＮＡのような核酸のほんの小さな部分でありうるので、同位体元素を用いずに標識化した、もしくは末端を標識化したヌクレオチドプローブを使ってこれらの存在を検出することは困難でありうる。プローブ検出システムの感度を増大させることに多くの努力が費やされている。そのため、関心とする特定のポリヌクレチド配列を検出するためのこれらの遺伝学的分析手順は有用であるけれども、これらはしばしば不都合に時間を浪費し、またこれらは有害でありうるし、更にこれらの制限のために検定の潜在的な感度や正確さが猛烈に低下しうる。現在、試料中の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する検定であって、前述の問題が解消され、もしくは大きく減少した検定が必要とされている。核酸ハイブリッド形成技術の感度と特異性をもち、それでもなお放射性物質の不動化もしくはその使用を要求せず、また時間を浪費せず、更に効率的で安全で且つ有効な検定が必要とされている。更に非常に低濃度で核酸配列を検出できる検定があれば好都合であろう。発明の要約本発明はこれらの必要性に合う検定に向けられている。この検定はテスト試料中の関心とする標的ポリヌクレオチド配列の存在または量を決定するために使用される。この検定は（ｉ）固体粒子に結合した第１のプローブを含んでなる第１の試薬と、（ii）標的ポリヌクレオチド配列を含むと思われるテスト試料のアリコートを検定媒体中で合わせて反応混合物を形成する工程を含んでなる。第１のプローブは、標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの２つの切り離された鎖のうち第１のものに対して相補的な第１の一本鎖核酸断片を含んでなる。テスト試料の標的ポリヌクレオチド配列の濃度は、第１のプローブのそれよりも過剰である。この反応混合物は、それから試料中の標的ヌクレオチド配列を一本鎖にするような、変性条件の下におかれる。反応混合物はそれから第１のプローブと、標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの第１の鎖の間にハイブリッド形成を起こさせるようなハイブリッド形成条件の下にさらされる。標的ポリヌクレオチドの存在下で、第１のプローブの実質的に全てが、ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの第１の鎖にハイブリット化されうる。次に、第２の試薬が反応混合物に加えられる。第２の試薬は固体粒子に結合した第２のプローブを含んでなる。第２プローブは標的ポリヌクレオチドの選ばれたセグメントの第２の鎖と同じヌクレオチド配列をもった第２の一本鎖核酸断片を含んでなる。第２のプローブは第１のプローブに対して相補的である。第１と第２のプローブは、標的ポリヌクレオチド配列の互いに相いれない部分に対して相補的である。反応混合物はハイブリッド形成条件の下で十分な時間、保温される。そして、この中で標的ポリヌクレオチオがない場合には、第１と第２のプローブが互いにハイブリッド化することができ、そしてこの反応混合物は十分に濁った状態になる。標的ポリヌクレオチドの存在下では、第２のプローブは標的ポリヌクレオチドの選ばれたセグメントの第２の一本鎖とハイブリッド化しうる。第１のプローブと、標的ヌクレオチドの選ばれたセグメントの第１の鎖とのハイブリッド形成は、反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさない。第２のプローブと、標的ヌクレオチドの選ばれたセグメントの第２の鎖とを合わせても、反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさない。反応混合物の濁度の変化は検出することができ、また標的ポリヌクレオチドの存在又は量を決定することができる。標的ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡのセグメントでありうる。第１と第２のプローブはＤＮＡの断片又はＲＮＡの断片でありうる。標的ポリヌクレオチドは少なくとも８個のヌクレオチドをもちうる。標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントは、少なくとも４個のヌクレオチドをもちうる。第１と第２のプローブは少なくとも４個のヌクレオチドをもちうる。これらプローブは、固体粒子に共有結合でもって、或るいは吸着によって結合しうる。これらは固体粒子に直接に、又はスペーサー分子を介して結合しうる。これらの固体粒子は、好ましくはポリスチレン、木炭、コロイド金、ベントナイト、ガラス、シリカゲル、赤血球、リポリーム、及びラテックスからなる群から選ばれうる。固体粒子はより好ましくはラテックスである。検定は、血清、血漿、唾液、大脳髄液、羊水、尿、ふん便、粘液、細胞抽出物、組織抽出物、及び膿のようなテスト試料を用いて行うことができる。標的ポリヌクレオチド配列は、ダウン症候群、ハンチントン病、鎌状赤血球貧血、ルーゲーリック病、嚢胞性線維症、テー・サックス病、多発性硬化症、成人多嚢胞性腎臓病（ａｄｕｌｔｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅ）、神経線維腫症、ベータ−地中海貧血、網膜芽腫、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）、単純庖疹ウイルス１、単純庖疹ウイルスII、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シュードモナスシュードマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及び髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からなる群から選ばれうる。標的ポリヌクレオチドは合わせる工程に先立って増幅されうる。図面の説明本発明のこれからの及び他の特徴、局面、および優位性が以下の説明、付随した請求の範囲、及び添付した図面を参照にして、より良く理解できるようになるであろう。ここで、図１は第１と第２の試薬を調製する工程を概説する模式図であり、そして図２は関心とするポリヌクレオチド配列を検出する均質ＤＮＡプローブ滴定検定の工程を概説する模式図である。説明本発明によると、テスト試料中の関心とする標的ポリヌクレオチド配列の存在や量を検出するための簡易な検定を提供できる。このような検定は、反応混合物を形成する工程、この反応混合物を変性条件下におく工程、この反応混合物をハイブリッド形成条件にさらす工程、第２の試薬をこの反応混合物に添加する工程、この反応混合物をハイブリッド形成条件の下で保温する工程、及び試料中の標的ポリヌクレオチドの存在及び量を決定する工程を含んでなる。分析の道具として核酸ハイブリッド形成を利用することは、ＤＮＡの二本鎖二重らせん構造に基づいている。二本鎖ＤＮＡ中のそれぞれの鎖のプリン塩基とピリミジン塩基間における水素結合は可逆的に開裂しうる。ＤＮＡのこの融解又は変性から生じる２つの相補的ＤＮＡ鎖が連合（リアニーリング又はハイブリッド形成としても言及される）して二重らせん構造を編成しなおすであろう。第２の一本鎖核酸と十分に相補的な塩基配列を含んでなる第１の一本鎖核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか、の適当な条件の下での接触は、それぞれの場合に応じて、核酸ハイブリッドの形成という結果をもたらすであろう。Ｉ．反応混合物の形成この反応混合物は、検定媒体中で第１の試薬と、関心とする標的ポリヌクレオチド配列を含むと思われるテスト試料のアリコートとを結合させることによって形成される。Ａ．第１の試薬第１の試薬は固体粒子に結合した第１のプローブを含んでなる。１．第１のプローブ第１のプローブは標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの二つの切り離された鎖のうちの第１の方と相補的な第１の一本鎖核酸断片を含んでなる。核酸断片はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列からの断片でありうる。核酸断片は一本鎖であることが好ましい。核酸断片は当業者に知られた方法、例えば合成による製造法、又は酸素を使った製造法でｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏで製造でき、或いは入手できる。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブは、一般にいわゆる遺伝子合成装置によって合成された、或いは組み換えＤＮＡ法を使ってつくられた一本鎖核酸分子である。第１のプローブは、そのプローブのヌクレオチド塩基配列が標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの二つの切り離された鎖のうちの第１の方の相補的なヌクレオチド配列とつり合うようにして（そしてこのものとのハイブリッド形成に役立つように）構成される。第１のプローブは、検出される標的ポリヌクレオチド配列に対して実質的に相補的な少なくとも一つの、一本鎖塩基配列からなるであろう。第１のプローブは典型的には関心とする標的ポリヌクレオチド配列と１以上のポイントに於いて検出可能なハイブリッド形成を発揮するであろう。第１のプローブは、核酸断片であり、且つ典型的には一本鎖配列の形の、化学的に合成された、又は生物学的に調製されたＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドからなることが好ましい。合成される場合には、一本鎖ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブは、その核酸塩基配列が標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントに対して相補的であるように製造される。典型的には、プローブ断片はそれがハイブリッド化する相手である選ばれた配列に対して完全な相補性を有する必要がない。ハイブリッド形成は緩衝液組成やハイブリッド形成温度のようなハイブリッド形成条件を適当に変えることによって、やはり検出できる。プローブ核酸断片は標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントに対してできるだけ相補的であることが好ましい。固体粒子に付着結合した核酸断片は、この断片が標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントと安定なハイブリッドを形成するに十分長ければ、殆ど任意の長さでありうる。第１のプローブ核酸断片は典型的には最低４つの塩基配列をもち、アミノ酸コドンよりも１塩基分長いことであろう。典型的には５つの塩基が安定なハイブリッド二重らせんを形成しうる。第１のプローブ核酸断片は長さにおいて、約４〜約２０個のヌクレオチドであることが好ましい。ヌクレオチドが長いほど特異性が大きくなるが、核酸断片が固体粒子にくっついている場合には、それだけより大きな立体障害を引き起しうる。短い核酸断片がＤＮＡｓｅＩでの制御された消化によって好ましく製造されうる。或いはこれとは別に音波処理または他の適当な核酸分解酸素での消化が利用されうる。プローブは１０，０００以上の塩基をもちうるけれども、５，０００が通常最大である。プローブ配列は、好ましくは通常、関心とする標的ポリヌクレオチドの配列特性に対して実質的に相補的である。ＲＮＡプローブ又はＤＮＡプローブは、いろいろの慣用の方法で得られうる。典型的には、ＲＮＡはバクテリア又は細胞の転移ＲＮＡから５ｓ、１６ｓ及び２３ｓリボソームＲＮＡのような細胞の天然物として単離されうる。ｉｎｖｉｔｒｏでは、ＲＮＡプローブの合成は、技術水準にある技術を用いて達成されうる。２．固体粒子どんな固体粒子を選べばよいかは、以下の事柄を含む幾つかの因子に依存している：（１）使用されるハイブリッド形成条件、特に温度、（２）一本鎖核酸断片に共有カップリングするために使われる方法、及び（３）一本鎖核酸断片のサイズ。このような固体粒子の選択は、ハイブリッド形成やプローブが標的ＤＮＡに結合する率の効果によって支配されうる。この固体粒子は好ましくはハイブリッド形成に有効な標的ヌクレオチド配列の量を検出するために十分な感度を提供すべきである。その他に考慮すべきことは、プローブの合成のしやすさ、器械（器具）の入手の可能性、自動化する能力、そして便利さであろう。１９９４年５月２３日に出願され、その発明の名称が「薬学的剤の迅速且つ定量的な検定のための試薬と方法」であるチェン・ヤン、チャン・Ｓ・オー、及びアンソニー・チェンの米国特許出願番号２４８，４７９、ここに参照してその記載を明細書の一部となす、の方法に従って使用される粒子は、肉眼で見える粒子であり、好ましくはラテックスからつくられる。このような肉眼で見える粒子を用いると光散乱又は反射における見分けられる変化を得るに必要な錯体形成の範囲を減少させる。このように、肉眼で見える粒子の存在のために、そうでなければ小さすぎて検出できないような標的ポリヌクレオチド配列が容易に測定できる。この粒子の存在することがネフェロ分析的（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）又は比濁分析的（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）手法を使う特定のポリヌクレオチド配列の検出に影響を与えうる。ラテックス粒子の大きさは、プローブの核酸セグメントの長さに依存しうる。典型的には、ラテックス粒子の大きさは約４０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲で変化しうる。約８０ｎｍ〜約２００ｎｍ間の粒子の使用が、ネフェロ分析的又は比濁分析的手段によって標的ポリヌクレオチド配列を測定するＤＮＡプローブにとって好ましい。そのような粒子はセラディン・インコーポレーテッド（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，Ｕ．Ｓ．）から得られうる。各６０ｎｍ粒子が平均で約１０，０００のカルボキシル基を含みうる。そして各１００ｎｍ粒子は共有カップリングに有用な約２５，０００の基を荷っている。固体粒子はＤＮＡ又はＲＮＡに共有結合で、又は吸着でくっ付くことができる任意の不溶性粒子でありうる。固体粒子はラテックス、木炭、コロイダル金、ベントナイト、ガラス、シリカゲル、赤血球、又はリポソームでありうる。固体粒子はラテックスであることが好ましい。速い反応速度をつくり出すためには、０．１μｍ未満の粒子が使用されうる。濁度の大きな変化をつくり出すためには、適切、且つ有用な屈折率をもったコアポリマーが選択される。３．第１プローブの固体粒子への結合ヌクレオチド配列は固体粒子表面に直接に結合されうるか、又は固体粒子表面に共有結合されうるか、又は吸着されうるスペーサー分子を介して付着結合されうる。典型的には、核酸は糖骨格に末端リン酸基及び反応性水酸基のみならず反応性アミノ官能基をもつ。核酸上のこれらの反応性基は、ラテックス上、または他の粒子上の反応性基と反応させられて、ＤＮＡもしくはＲＮＡを固体粒子に結合させることができる。ガラス、或いは他の粒子は反応性のある官能基を形成するように誘導される。核酸はまたポリスチレンに直接に結合させられうる。固体粒子は典型的には球状である。この固体粒子は懸濁液中にとどまるに十分なほど小さくなければならない。しかしながらそれでも固体粒子は一般にはＤＮＡ又はＲＮＡプローブの分子量に対して相対的に大きな粒子サイズをもつであろう（即ち５００ミクロン未満）。固体粒子へのプローブの結合は、共有付着であってもよいし、また吸着であってもよい。ヌクレオチド配列は、直接に、且つ共有に結合されうる。そして、この結合はＤＮＡ又はＲＮＡの長さにそって、その５′末端またはその３′末端のところでランダムに生じる。この配列はまた蛋白質又は他のスペーサー連結体を介して固体粒子に結合されうる。固体粒子への核酸の直接付着に関して、このことはドーマンの米国特許４，０４５，３８４（ここに参照してその記載を明細書の一部となす）の方法によって達成されうる。この方法はラテックスと蛋白質との間にアミド結合を形成することに基づいている。この方法は三つの工程からなっている。その第１は、カルボキシル基を結合されたラテックス粒子がそのラテックス表面に、水溶性Ｎ−ヒドロキシ化合物（即ち、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシサクシンイミド）及び水溶性カルボジイミド（即ち、１−シクロヘキシル−３−［２−モルフォリノエチル１］−カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＣ）との反応を通してエステルを形成させることによって活性化される。これらの材料は合わされ、攪拌され、そして冷却される。その結果、無水物リンクがラテックス粒子のカルボキシル基と、ヒドロキシベンゾトリアゾールのヒドロキシ窒素（ＮＯＨ₂）基との間に形成される。次に付着結合したヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体を含む反応混合物は未反応試薬を取り除くために透析によってきれいにされる。一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡは、ラテックス−ヒドロキシベンゾトリアゾール錯体と一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとを結合させ、そして室温でこの組合わせ物を攪拌することで、活性化されたラテックス粒子上に共有結合されうる。この方法による生成物は、ＤＮＡの長さ方向にそってラテックス粒子の勝手な位置に共有結合した一本鎖ＤＮＡであることを示されている。同様に、この方法はＲＮＡを共有結合させるためにも使用されうる。更に、核酸は、ラテックスに吸着又は共有結合されうるリンカー分子によって固体粒子に結合されうる。核酸は多糖類に幾つかの異った方法で共有結合されうる。多糖類は部分的に酸化されて反応性アルデヒド基を生成し、このものは次にアミノ基のような適切に反応性の基を有する粒子（即ち、アミノ官能性ラテックス）と反応しうる。更に、ラテックス粒子はヤン・Ｃらの特許出願番号第２４８，４７９に記載されたようにアビジンとカップリングしうる。この方法では、ヌクレオチド配列はビオチン（チューら、ＤＮＡ、第４巻、３２７〜３３１頁、参照してその記載を明細書の一部となす）とカップリングしうる。アビジンとビオチンは強いカップリング定数をもっているから、ラテックス粒子はアビジンと結合することができ、そのアビジンはプローブのヌクレオチド配列に取り付けられたビオチンに結合しうる。典型的には、ビオチニル化されたオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成は、次のような反応の順序である。標的ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡプローブ配列は５′−ホスフェート誘導体に変換され、その次に５′ホスホリミジゾリド中間体経由で５′エチレンジアミン付加物に変換されうる。Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドビオチンが添加されうる、そしてこのビオチニル化されたデオキシリボヌクレオチド誘導体が単離され、そして精製されうる。共有結合に関しては、ＤＮＡをアガロースのような固体支持体に共有結合で連結させる目的で、カルボジイミドカップリング反応が当業者によって使用されている。粒子サイズや検出波長とともに、粒子が凝集するときの濁度変化率を最大にする高い屈析率のために、ラテックス固体粒子が選択されうる。これらのケースでは、シェルポリマーには複数のエポキシを含みうる、そしてそれらは蛋白質と共有結合する能力のため、或いはシンセティックリンカーとして選択される。蛋白質リンカーが好まれる方法では、ポリヌクレオチド配列が、カルボジイミド又はグルタルアルデヒドのどちらかとともに、標準的なカップリング方法によって固体粒子と共有結合させられうる。Ｂ．テスト試料テスト試料は好ましくは、関心とする標的ポリヌクレオチド配列を有する核酸を含んでいる。検定されるテスト試料は、関心とする任意の媒体でありうる、そしてそれは通常、医学上、獣医学上、環境上、栄養上、又は産業上の意味のある液体試料であろう。血清、血漿、唾液、大脳髄液、羊水、尿、ふん便、粘液、細胞抽出物、組織抽出物、及び膿を含む、人間および動物の標本及び体液が特に本発明の方法によって検定されうる。更なるテスト試料としては、乳、排泄物、肺アスピレート（ｌｕｎｇａｓｐｉｒａｔｅｓ）、のどスワッブ（ｓｗａｂｓ）、生殖器のスワッブ及び滲出物、直腸のスワッブ、及びナソファリンガルアスピレート（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇａｌａｓｐｉｒａｔｅｓ）がある。１．標的ポリヌクレオチド関心とする標的ヌクレオチド配列は試料中に自然に存在する任意のポリヌクレオチド配列でありうる。それは細胞組織中の物質、又はそこから誘導される物質の中に存在しうる。それはウイルス、又はウイロイド、又はウイルス様の粒子のような細胞下成分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）でありうる。それはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列又はリボ核酸（ＲＮＡ）配列でありうる。それは一本鎖、又は二本鎖でありうる。それは病原体から誘導されうる。それは、原核生物、人間のような真核生物、又はウイルス又は染色体外遺伝因子の配列でありうる。関心とする標的ポリヌクレオチド配列はゲノムの全部又は任意の部分から誘導されうる。このポリヌクレオチド配列は関心とする任意の遺伝子又はポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）でありうる。精製された、または精製されてない形であれ、どのような核酸ソースであっても、それが望まれる特定の核酸配列を含むであろうと思われるものであれば、出発核酸又は核酸群として利用されうる。このように、この方法は例えばＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用することができ、このＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖、又は二本ストランド（ｓｔａｎｄａｒｄ）でありうる。更に、各々の一つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用されうる。配列中の十分な数の塩基が十分に知られていることだけが必要である。その配列の塩基についての知識が多いほど、標的ヌクレオチド配列の特異性がそれだけ大きくなる。そして、このようにしてこの方法の効率がそれだけ大きくなる。標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントは、塩基配列の知られている標的ポリヌクレオチド配列の全体の一部でありうる。典型的には、標的ポリヌクレオチドの選ばれたセグメントは少なくとも４つのヌクレオチドをもつ。標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントは少なくとも８つのポリヌクレオチドであることが好ましい。標的ポリヌクレオチド配列は、好ましくはダウン症候群、ハンチントン病、鎌状赤血球貧血、ルーゲーリック病、嚢胞性線維症、テー・サックス病、多発性硬化症、成人多嚢胞性腎臓病、神経線維腫症、ベーター地中海貧血、網膜芽腫、淋菌、単純庖疹ウイルス１、単純庖疹ウイルスII，ウシ流産菌、百日咳菌、赤痢菌、チフス菌、ネズミチフス菌、髄膜炎菌からなる群から選ばれる。細菌の又はウイルスのＤＮＡは、関心あるＤＮＡ断片の片側の選択された位置で開裂しうる。このＤＮＡ断片は他の断片から単離され、更に電気泳動によって精製されうる。それから、この単離されたＤＮＡ断片は、プラスミド又は細菌ウイルス（バクテリオファージ）に挿入し、次に適当な宿主細胞に挿入することによって増幅されうる。プラスミドを含む細胞が増殖するにつれて、プラスミドも又複製し、プローブとして使われるＤＮＡ断片の多くのコピーをつくる。同様にポリメラーゼ連鎖反応法がＤＮＡ断片を増幅するために使われうる。細胞を増殖させておいてから、ハイブリッドプラスミドが単離・精製され、その結果、ＤＮＡ断片の多くのコピーがつくられる。２．試料中の標的ポリヌクレオチド配列の増幅結合の工程の前、及びハイブリッド形成の前に、標的ポリヌクレオチドが増幅用の任意の技術水準の技術を使って増幅されうる。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（当業者によく知られたＰＣＲ技術）法が使用される。標的ポリヌクレオチドの増幅が検定の感度を増大させうる。例えば胎児の細胞からのＤＮＡを使用する鎌状赤血球貧血の出生前診断におけるように、分析のために入手できる標的ポリヌクレオチドの量が非常に少ないときに、増幅が有用である。このような分析が少量の試料において、しかも本来的に感受性がないかもしれない非放射性の検出技術を使ってなされるならば、増幅は特に有用である。比較的少数の病原性生物が感染患者からの臨床試料に存在する場合には、これらの患者の試料から抽出されたＤＮＡは、試料中の全ＤＮＡの非常に小さいフラクションだけを構成する。ＤＮＡ試料のハイブリッド形成検出に先立って、標的配列であると思われるものを特異的に増幅することが、これらの方法の感度と特効性を改良しうるであろう。標的ポリヌクレオチドの量は、増幅条件を通して決定されうる。またテスト試料の濃度は、ハイブリッド形成中の最大効率を確実なものとするために、第１の試薬の濃度より過剰であることが好ましい。Ｃ．検定媒体検定媒体は第１の試薬とテスト試料のアリコートを含み、そして更に緩衝剤を含みうる。検定媒体は更に、約６．５〜約８の間のｐＨを有する緩衝剤を含みうる。反応混合物のｐＨ緩衝剤は、相補的な鎖の塩基ペア間における最大限の水素結合を可能にする、核酸のアミノ基（ａｍｉｎｅｇｒｏｕｐ）がプロトン付加されるのを受け入れる約７〜約７．５の間にあることが好ましい。この緩衝剤は更に追加的成分を含みうる。粒子が自己会合するのを防ぐために、緩衝剤中に洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）が含有されるのが好ましい。典型的には、この洗浄剤の濃度は約２％よりも大きい。洗浄剤は、アルキルポリオキシエチレン、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（特にＴｒｉｔｏｎ− Ｘ^TM）及びアシルポリオキシエチレンソルビタミンエステル（特にＴｗｅｅｎ− ２０^TM）のような任意のノニオン系洗浄剤でありうる。更には、最大限のハイブリッド形成条件のため、固体粒子を浮遊し続けさせる水密度を変えるために、ポリマー類が緩衝剤に含有されうる。このポリマーとしては、ポリエチレングリコールが好ましい。Ｄ．第１の試薬とテスト試料の量反応混合物中で使用される試料の量は、固体粒子の性質やハイブリッド形成の緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）に依存して、広く変化する。プローブの量に比例して、ハイブリッド形成される公知の標的ポリヌクレオチドの化学量論的な量よりも実質的に過剰な量が、ハイブリッド形成率を高めるために、且つ存在する標的ポリヌクレオチド配列の量の定量を可能にするために使用されることが好ましい。例えばプローブに対して選択された標的ポリヌクレオチド配列の１００倍過剰量によって、全プローブの迅速なハイブリッド形成がなされるであろう。 II．反応混合物を変性条件下におくことテストされる患者または他のソースから得られるテスト試料が、細胞に含まれるような二本鎖核酸を主として含む場合には、このテスト試料は核酸を変性するための処置がなされ、関心とする標的ポリヌクレオチド配列を一本鎖にしうる。関心とする標的ポリヌクレオチド配列の変性は、アルカリ処置（例えば０．１Ｎ水酸化ナトリウム）によって達成できる。変性条件は加熱によって達成されるのが好ましい。試料の遺伝物質の少なくとも一部分が一本鎖型であるが、試料中のポリヌクレオチドの好ましくはすべてが一本鎖型である。典型的には、ポリヌクレオチド配列の遺伝物質の少なくとも一部分が一本鎖型にされる。しかしながら、二重らせん型のポリヌクレオチド配列は一般にハイブリッド形成に関与しないので、標的ポリヌクレオチド配列が実質的に一本鎖型であることが、たいへん好ましい。もし必要ならば、変性工程に先立って、テスト試料は細胞から核酸を開放する条件の下におかれる。核酸の開放は、機械的分裂（凍いう商標の下で市販されているポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、Ｔｗｅｅｎとして知られるポリオキシエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ）界面活性剤、及びドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、アルカリ処理、浸透圧ショック又は加熱）、又は酵素による破壊によって達成されうる。その結果生じた反応混合物は、一本鎖型の核酸を含み、そしてこのものはそれから本発明のハイブリッド形成方法に従って、分析（検定）されうる。核酸が２つの鎖を含むならば、核酸がプローブとハイブリッド化する鋳型として用いられうる前に、別個の工程として、又は同時に核酸のその２つの鎖を分離することが必要である。この鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素による手段を含む適当な変性方法によって達成されうる。核酸の鎖を分離する物理的方法の１つは核酸が完全に（＞９９％）変性されるまで核酸を加熱することを伴う。典型的な加熱変性は約８０℃〜１０５℃にわたる温度で、約１〜１０分にわたる時間の加熱を伴いうる。鎖の分離はヘリカーゼとして知られる酵素のクラスに属する酵素、又はヘリカーゼ活性をもち、かつリボＡＴＰの存在においてＤＮＡを変性するとして知られている、酵素ＲｅｃＡによっても引き起こされうる。 III．反応混合物をハイブリッド形成条件にさらすこと反応混合物が、第１のプローブと、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１の鎖との間でハイブリッド形成を引き起こすために、ハイブリッド形成条件の下にさらされ、それによって標的ポリヌクレオチドの存在下で実質的に全ての第１のプローブが標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１の鎖にハイブリッド化されるであろう。ここに使用されるような、”ハイブリッド形成条件”という用語は、第１のプローブが安定なプローブ−標的間ハイブリッドを形成することができる条件を意味している。様々なハイブリッド形成条件が検定において使用されうる。適当なハイブリッド形成条件は、プローブの長さ、およびプローブ又は標的ポリヌクレオチドのグアノシンプラスシトシン含量によって決定されうる。ハイブリッド形成中、テスト試料から導かれた一本鎖標的ポリヌクレオチド配列が第１のプローブと、第１のプローブと標的ヌクレオチドとのハイブリッド形成が生じうる条件の下で反応する。使用される特定のハイブリッド形成技術は、本発明の臨界的な要素ではない。約２０〜６０、好ましくは４０〜５０体積％の不活性極性有機溶媒を含んでなる様々のハイブリッド形成溶液が使用されうる。一般のハイブリッド形成溶液は約５０％のホルムアルデヒド、約０．０５〜０．５Ｍのリン酸ナトリウム、および少量のＥＤＴＡを使用しうる。或いは、これらの塩を含むが、ホルムアルデヒドのような有機溶媒を含まない水溶液を使用することができる。適用されるハイブリッド形成時間は、所望により、半時間以下、または数時間までもしくはそれ以上でありうる。ハイブリッド形成の範囲（程度）は、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間等を含む様々の因子によって影響される。実例として、ハイブリッド形成の範囲は、約０〜５０％の範囲でホルムアルデヒドの濃度を操作して反応溶液の極性を変えることによって変えることができる。或いは、温度が約２０℃〜８５℃、通常３０℃〜７５℃の範囲で変更されうる。特異的でない結合を避ける方向のハイブリッド形成条件が好ましい。典型的には、ハイブリッド形成は約３５℃と９０℃の間の温度からわずかに高い温度で始まるであろう。好ましくは、その温度は約９０℃である。関心とする標的ポリヌクレオチド配列と、ハイブリッド形成が生じることが要求される第１の試薬プローブ鎖との間の相補性の程度は、ハイブリッド形成の条件の厳しさに依存する。ハイブリッド形成の程度と特異性は、以下のような主たる条件によって影響されうる。（１）核酸調製の純度（２）プローブ−Ｇ−Ｃ塩基対の塩基構成が、Ａ−Ｔ又はＡ−Ｕ塩基対よりも大きな熱安定性を発揮するであろう。したがって、より高いＧ−Ｃ含量を伴うハイブリッド形成は、より高い温度でも安定であるであろう。（３）相同な塩基配列の長さ−塩基の任意の短い配列（例えば４未満の塩基）は多くの核酸中に存在することについて高い蓋然性を有する。従って、短い配列の関わるハイブリッド形成においては、殆ど、又は全く特異性が得られない。本件の相同なプローブ配列は、典型的には少なくとも４つのヌクレオチド、通常２０以上の塩基、好ましくは２０〜３０の塩基である。相同なプローブ配列はしばしば３００〜１０００の間のヌクレオチドでありうる。（４）イオン強度−リアニーリング率は、反応混合物のイオン強度が増大するにつれて、増大する。ハイブリッドの熱安定性も増大する。（５）核酸濃度と保温時間−好ましくは本発明に従って、テスト試料中の標的ポリヌクレオチドは第１の及び第２のプローブに対して過剰である。（６）変性試薬−ホルムアルデヒドや尿素のような、水素結合分裂試薬が存在することで、ハイブリッド形成の厳しさが増大する。 IV．反応混合物に第２の試薬を加えること。反応混合物が第１の試薬とともにハイブリッド形成条件の下にさらされたあと、第２試薬がこの反応混合物中に添加される。第２の試薬は固体粒子に結合した第２のプローブを含んでなる。第２のプローブは、標的ポリヌクレオチド配列の選ばれたセグメントの第２の鎖と同じヌクレオチド配列をもった第２の一本鎖核酸断片を含んでなる。そして、これによって第２のプローブは第１のプローブに対して相補的であり、そして第１と第２のプローブは標的ポリヌクレオチド配列の互いに相いれない部分に対して相補的である。第２のプローブは、ハイブリッド化されていない第１の試薬プローブとハイブリッド化されていない標的ポリヌクレオチドを滴定することによって、反応混合物を誘発する。ここで使われている”互いに相いれない（ｍｕｔｕａｌｌｙｅｘｃｌｕｓｉｖｅ）”という用語は、第１と第２のプローブ断片とが各標的ポリヌクレオチド配列とによるハイブリッド形成中において、この２つのプローブが標的ポリヌクレオチド上の同じヌクレオチド塩基配列に関して、ハイブリッド形成が妨げられる程度に競争してはならない、ことを意味している。第２のプローブ核酸セグメントは、第１のプローブの項目で詳しく述べられている。ただ異なる点は第２のプローブは第１のプローブに対して相補的であるということである。固体粒子は、前述の固体粒子と同一である。Ｖ．反応混合物をハイブリッド形成条件の下で保温すること第２試薬の添加後、反応混合物はハイブリッド形成の条件の下で十分な時間保温される。ハイブリッド形成条件は以前に詳細に記載されている。標的ポリヌクレオチドのない状態では、第１のプローブと第２のプローブは、各プローブに付着結合した固体粒子の凝集によって反応混合物が十分に濁った状態にさせることで、お互いにハイブリッド化されうる。標的ポリヌクレオチドのある状態では、第１のプローブは標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１の一本鎖と既にハイブリッド化しているので、第２のプローブは、標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の一本鎖とハイブリッド化しうる。第１のプローブと、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１の鎖とのハイブリッド形成は、反応混合物の濁度に実質的に変化を生じさせえない。第２のプローブと、標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の鎖とを合わせても反応混合物の濁度に実質的な変化を生じさせえない。固体粒子の凝集が最大であるときには光散乱が最大となるような濁りを生ずる。標的ポリヌクレオチド配列が反応混合物中にあるときは、粒子の凝集が阻止されうる。粒子の凝集に対する妨害の程度は、試料中の相補的な核酸の量に直接関係している。試料中に少数の相補的な配列がある場合は、試料がラテックス粒子上の配列に対して相補的な多数の配列を含む場合に比べて、粒子の凝集に対する妨害はより少なくなるあろう。反応混合物が、固体粒子に付着結合された配列に対して相補的である標的ポリヌクレオチド配列を含むならば、ハイブリッド形成は起こるであろうし、かつ粒子の凝集はないであろう。プローブに対して相補的な鎖がないならば、プローブのハイブリッド形成は起こるであろうし、粒子の凝集の存在が検出されうる。これは、反応混合物中の第１のプローブが関心とする標的ポリヌクレオチド配列の１つの鎖に既にハイブリッド化しており、かつ第２のプローブが、標的ポリヌクレオチド配列のハイブリッド化されていない区画の相補的な一本鎖部分とハイブリッド化しうるだけだという理由による。 VI．反応混合物の変化を検出すること典型的には、ハイブリッド形成条件の後、検出工程には更に、検査されている試料にハイブリッド化している組成物の当該部分を、ハイブリッド化していない当該部分から分離する分離工程が必要である。このような分離は、水洗工程によって実施されうる。本発明によると、ハイブリッド形成工程が完了した後では、分離工程は検出プロセスにおいて必要ではない。第１と第２の試薬として使用される固体粒子はラテックスであることが好ましい。ラテックスの凝集は光散乱もしくは光吸収を検出可能なほどに増大させ、鋭敏な検出を可能ならしめる。核酸の相補的な鎖を含むラテックス粒子は凝集するであろうし、また検定媒体中にない相補的な核酸は、相補的な核酸断片でおおったラテックス粒子の凝集を阻害するであろう。粒子の凝集が阻害され、又は妨げられ、凝集がないことが関心とする標的ポリヌクレオチド配列がテスト試料中にあることのしるしであろう。そのため、標的ポリヌクレオチドの存在は反応混合物中の濁度の量に（比例して、又は相互に関連して）関係している。現行の臨床用のアナライザーのための、これらの比濁分析検定を自動化するために、凝集に際して濁度の高い変化を生じしめ、且つ長い保存期間にわたって、再生的に速い反応速度を生ぜしめる粒子が必要である。検出工程において、凝集の検出は肉眼で見て行なわれる。好ましくは、凝集の程度が比濁分析的、又はネフェロ分析的方法で測定され、そして、この値は標的ヌクレオチド配列のハイブリッド形成の程度を示している。そして、これはテスト試料中のヌクレオチド配列の存在に比例しうる。凝集を検出するために、粒子の計数技術も使用されうる。テスト試料中の関心とするヌクレオチド配列を検出することが可能である。重要な特徴は、反応体が不動化されないということである。反応体は、ハイブリッド形成が生じるようにするために、溶液、または懸濁の状態におかれる。このことは、関心とするヌクレオチド配列を検出するための、より効率的且つ迅速なハイブリッド形成を可能にする。更には、これは均質の（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）検定である。つまり、関心とするヌクレオチド配列を検出するために、結合した相と結合していない相を分離する必要はない。プローブは、そのプローブに対して相補的なヌクレオチド配列とハイブリッド化するだけであろうから、この方法は非常に特異的である。応答曲線は、標的ポリヌクレオチド量を増大させた試料群を用いてつくり出される。阻害の程度が、テスト試料中の標的ポリヌクレオチドの存在と濃度を表示しうる。記載の明瞭性のために、以下の例が本発明を説明することを意図して挙げられるが、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。例（予見的）第１及び第２の試薬の調製図１を参照すると、第１と第２の試薬を調製する工程を概説する模式図が説明されている。１．固体粒子ａ．カルボキシル化されたラテックスの活性化ＤＮＡ又はＲＮＡとの共有結合において固体の支持体として使用されるカルボキシ化されたラテックス（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、米国特許４，０４５，３８４号（ここに参照してその記載を明細書の一部となす。）においてドーマンによって述べられた方法に従って調製される。カルボキシル基の活性化は、１−シクロヘキシル−３−［２−モルホリノエチル１］−カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）の存在下に、カルボキシル化されたラテックスとＮ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとの反応の結果として生じる。１．７ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と２．６ｍｌの水に１００ｍｇのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を溶解して調製される０．２ｍｌのＮ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール溶液が１ｍｌのカルボキシル化されたラテックス（直径０．１ミクロン、固形分２．５％）に添加される。その結果得られた溶液は冷蔵室（４℃）に置かれ、０．１ｍｌのＣＭＣ（０℃の水に５０ｍｇ／ｍｌ）がこの溶液に滴下添加される。この混合物を冷蔵室中で４時間、混合する。その結果得られた混合物を０．１Ｍ塩化ナトリウムに対して透析して、副生成物や未反応物質を取り除く。２．修飾されたラテックス固体粒子へのＤＮＡの共有結合修飾されたラテックスを冷蔵室で攪拌している間に第１のプローブである、ポリ（ｄＡ）₉ 又は第２のプローブであるポリ（ｄＴ）₉ を添加する。この混合物のｐＨ（６．８）を０．５Ｍ二塩基性リン酸ナトリウムの添加によって７．２に高める。この混合物を冷蔵室で５日間攪拌したままにしておく。ラテックス粒子を次に遠心により沈降させ、そして０．１％のＳＤＳ溶液で洗浄する。この遠心沈降と洗浄の手続を更に２回繰り返す。第１の試薬：ミクロ粒子（大きさ１００ミクロン）上に付着結合した一本鎖ポリ（ｄＡ）₉ は０．１５ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０^TM、０．１％ポリビニルピロリドン、及び０．０１５酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）の溶液中に再懸濁される。この第１の試薬溶液は約０．０２５ｕｇプローブ／５ｍｌを含むように調製される。第２の試薬：ミクロ粒子（大きさ１００ミクロン）上に付着結合した一本鎖ポリ（ｄＴ）₉ は０．１５ＮａＣｌ、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０^TM、０．１％ポリビニルピロリドン、及び０．０１５酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）の溶液中に再懸濁される。この第２の試薬溶液は約０．０２５ｕｇプローブ／５ｍｌを含むように調製される。検定フォーマット図２を参照すると、関心とするポリヌクレオチド配列を検出する、均質ＤＮＡプローブ滴定検定の工程を概説する模式図が説明されている。（１）関心とする標的ＤＮＡ配列の溶液は、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）１０ｍｌ中に二本鎖ポリ（ｄＡ：ｄＴ）０．５ｍｇを溶解することで調製される。この溶液は２６０ｎｍのところに約１．０の吸光度をもつ必要がある。この標的ＤＮＡ溶液を０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０）で連続的に希釈して、それぞれ濃度が０．５ｕｇ／ｍｌ及び１．０ｕｇ／ｍｌの２つの標的ＤＮＡ試料をつくる。（２）テスト試料の各標的ＤＮＡの０．５ｍｌのアリコートをピペットで測って試験管に入れる。二組の試料が作られ、各々の組が、各々の濃度での１つのレプリカ（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）試料を含む。（３）一組の試験管が８０℃で３０分間保温されて、ハイブリッド形成のために二本鎖標的ＤＮＡ配列を変性させられ、他方の組が二本鎖ＤＮＡの対照試料として３０℃で保温される。０．０１５Ｍのクエン酸緩衝剤を含む第三組の試験管をネガティブ対照試料として供給するために８０℃で３０分間保温される。（４）第１プローブハイブリッド形成：保温期間の終りに、第１の試薬溶液４．５ｍｌが各試験管に添加される。直ちに試験管が３０℃に冷却され、２０分間保温される。（５）第１のプローブのハイブリッド形成の後、第２の試薬溶液０．１ｍｌが各試験管に添加され、ハイブリッド形成されていない第１の試薬プローブを滴定するために３０℃で更に２０分間保温される。（６）各試験管中の反応混合物の６００ｎｍにおける吸光度が分光光度計においてクエン酸ナトリウム緩衝剤のブランクに対して測定される。３．結果：標的ＤＮＡのない状態では、第１のプローブと第２のプローブが互いにハイブリッド化することができ、その結果、反応混合物が十分濁った状態になる。変性した標的ＤＮＡが存在すれば、第１のプローブは標的ＤＮＡの第１の鎖とハイブリッド化することができ、また第２のプローブは標的ポリヌクレオチドの第２の一本鎖とハイブリッド化することができ、濁度に変化を生ずる。（１）ネガティブ対照：Ａ_600nm ＝０．３５８。第１のプローブの全てが、この溶液（ネガティブ対照試料）にない標的ＤＮＡ配列とハイブリッド化することができず、そしてそれ故にこの第１のプローブは第２のプローブと滴定され、又はハイブリッド化されるのに利用される。第１と第２のプローブの間でのハイブリッド形成は、大きさが２００ミクロンよりも大きなハイブリッド化された粒子をその結果として生じさせ、このことは６００ｎｍにおける吸光度の増加によって証明される。（２）標的ＤＮＡ試料：０．５ｕｇ／ｍｌＤＮＡ試料に関してＡ_600nm ＝０．０２９、そして１．０ｕｇ／ｍｌＤＮＡ試料に関してＡ_600nm ＝０．００１。第１のプローブが０．５ｕｇ／ｍｌ試料におけるように変性された標的ＤＮＡと部分的にハイブリッド化するときは、ハイブリッド化されてない少しの部分だけが、第２プローブによって滴定されるべく取り残され、その結果、０．０２９という吸光度の急激な低下となる。１ｕｇ／ｍｌにおける高濃度ＤＮＡ試料の場合のように、第１のプローブの全てが標的ＤＮＡとハイブリッド化することができると、反応混合物中には第１のプローブは全く残らず、第２のプローブによって滴定されない。このことは、吸光度の読みが零という結果となる。（２）二本鎖ＤＮＡ対照試料：０．５ｕｇ／ｍｌＤＮＡ試料に関してはＡ_600n _m ＝０．３５５、そして１．０ｕｇ／ｍｌに関しては０．３６２。二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性された後だけプローブとハイブリッド化しうる。高い温度で加熱しない限り、これらの試験管中のＤＮＡは二本鎖のままであり、第１、第２のプローブのいずれともハイブリッド化できない。そのため、これらの２つの試料の吸光度はネガティブ対照試料のものと同程度に高い。ここまで述べてきた本発明は多くの利点がある。その利点としては、核酸ハイブリッド形成技術の特異性を有するテスト試料中の関心とする標的ポリヌクレオチド配列を検出することができ、また少量のポリヌクレオチドを検出することができ、また更に、現在用いられている自動化された器械・弱具とともに使うことによって消費時間を短縮しかつ効率をより大きくできるといった検定を有することが挙げられる。使用される試薬が安定であることや、比較的に安全であることがこの検定を、基礎研究のみならず、日常的な医学診断において特に価値あるものにすると思われる。本発明は、幾つかの好ましい態様を参照して、かなり詳しく述べられているが、他の態様も可能である。それ故に、添付された請求の範囲の精神と範囲は、ここに記載した好ましい態様の記載に決して限定すべきものではない。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）検定媒体中で（ｉ）固体粒子に結合した第１のプローブであって、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの二つの切り離された鎖のうちの第１のものに対して相補的な第１の一本鎖核酸断片を含んでなる第１のプローブを含んでなる第１の試薬、及び（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含むと思われるテスト試料のアリコートを上記テスト試料の濃度を第１のプローブの濃度に対して過剰として、合わせることによって反応混合物を形成する工程；ｂ）試料中の標的ポリヌクレオチド配列を一本鎖にする変性条件の下に前記の反応混合物をおく工程；ｃ）この反応混合物をハイブリッド形成条件の下にさらして、第１プローブと、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１鎖との間でハイブリッド形成を引き起こし、それによって、標的ポリヌクレオチドの存在下、実質的に全ての第１プローブが標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１鎖にハイブリッド化する工程；ｄ）標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第２の鎖と同じヌクレオチド配列をもった第２の一本鎖核酸断片を含んでなる第２のプローブであって、固体粒子に結合した第２のプローブを含んでなる第２の試薬を前記反応混合物に添加し、それにより第２のプローブは第１のプローブに対し相補的であり、かつそれにより、第１と第２のプローブは標的ポリヌクレオチド配列の互いに相いれない部分に対して相補的であるようにする工程；ｅ）標的ポリヌクレオチドがない場合には、第１のプローブと第２のプローブが互いにハイブリッド化することができ、それによって反応混合物が十分濁った状態になり；標的ポリヌクレオチドが存在する場合には、第２のプローブが標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の一本鎖とハイブリッド化することができ；それによって第１プローブと、標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第１の鎖とのハイブリッド形成では反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさず、また第２プローブと標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の鎖とを合わせても反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさない；ように前記反応混合物をハイブリッド形成条件の下で十分な時間保温する工程；及びｆ）試料中の標的ポリヌクレオチドの存在と関連がある反応混合物の濁度の変化を検出する工程を含んでなるテスト試料中の関心とする標的ポリヌクレオチド配列の存在又は量を検出するための方法。２．標的ポリヌクレオチドがＤＮＡのセグメントである請求項１の方法。３．標的ポリヌクレオチドがＲＮＡのセグメントである請求項１の方法。４．第１のプローブがＤＮＡの断片又はＲＮＡの断片である請求項１の方法。５．第２のプローブがＤＮＡの断片又はＲＮＡの断片である請求項１の方法。６．標的ポリヌクレオチドが少なくとも８つのポリヌクレオチドをもつ請求項１の方法。７．標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントが少なくとも４つのヌクレオチドをもつ請求項１の方法。８．第１のプローブが少なくとも４つのヌクレオチドをもつ請求項１の方法。９．第２のプローブが少なくとも４つのヌクレオチドをもつ請求項１の方法。１０．第１と第２のプローブが固体粒子に共有結合で、又は吸着によって結合している請求項１の方法。１１．第１と第２のプローブが固体粒子に直接、又はスペーサー分子を介して結合している請求項１の方法。１２．固体粒子がポリスチレン、木炭、コロイド金、ベントナイト、ガラス、シリカゲル、赤血球、リポソーム及びラテックスからなる群から選ばれうる請求項１の方法。１３．固体粒子がラテックスである請求項１２記載の方法。１４．テスト試料が、血清、血漿、唾液、大脳髄液、羊水、尿、ふん便、粘液、細胞抽出物、組織抽出物、及び膿からなる群から選ばれる請求項１の方法。１５．標的ポリヌクレオチド配列が、ダウン症候群、ハンチントン病、鎌状赤血球貧血、ルーゲーリック病、嚢胞性線維症、テー・サックス病、多発性硬化症、成人多嚢胞性腎臓病、神経線維腫症、ベーター地中海貧血、網膜芽腫、淋菌、単純庖疹ウイルス１、単純庖疹ウイルスＩＩ、ウシ流産菌、百日咳菌、赤痢菌、インフルエンザ菌、結核菌、シュードモナスシュードマレイ、チフス菌、ネズミチフス菌、及び髄膜炎菌からなる群から選ばれる請求項１の方法。１６．標的ポリヌクレオチドが前記合わせられる工程前に増幅される請求項１の方法。１７．濁度を検出する工程が、肉眼、比濁分析、光散乱法、及びネフェロ分析からなる群から選ばれる方法によって測定されうる、請求項１の方法。１８．検定媒体が更に緩衝剤を含む請求項１の方法。１９．緩衝剤が約６．５〜約８のｐＨを有する請求項１８の方法。２０．緩衝剤がＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＴｗｅｅｎ−２０^TMからなる群から選ばれる洗浄剤を含む請求項１８の方法。２１．緩衝剤が更にポリエチレングリコールを含む請求項１８の方法。２２．ａ）検定媒体中で（ｉ）ラテックス粒子に結合した第１のプローブであって、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントであって少なくとも４つのヌクレオチドを有するセグメントの二つの切り離された鎖のうちの第１のものに対して相補的な、少なくとも４つのヌクレオチドを有する第１の一本鎖核酸断片を含んでなる第１のプローブを含んでなる第１の試薬、及び（ｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列を含むと思われるテスト試料のアリコートを上記テスト試料の濃度を第１のプローブの濃度に対して過剰として、合わせることによって反応混合物を形成する工程；ｂ）試料中の標的ポリヌクレオチド配列を一本鎖にする変性条件の下に前記の反応混合物をおく工程；ｃ）この反応混合物をハイブリッド形成条件の下にさらして、標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１鎖との間でハイブリッド形成を引き起こし、それによって、標的ポリヌクレオチドの存在下、実質的に全ての第１プローブが標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第１鎖にハイブリッド化する工程；ｄ）標的ポリヌクレオチド配列の選択されたセグメントの第２の鎖と同じヌクレオチド配列を有しかつ少なくとも４つのヌクレオチドを有する第２の一本鎖核酸断片を含んでなる第２のプローブであって、ラテックス粒子に結合した第２のプローブを含んでなる第２の試薬を前記反応混合物に添加し、それにより第２のプローブは第１のプローブに対し相補的であり、かつそれにより、第１と第２のプローブは標的ポリヌクレオチド配列の互いに相いれない部分に対して相補的であるようにする工程；ｅ）標的ポリヌクレオチドがない場合には、第１のプローブと第２のプローブが互いにハイブリッド化することができ、それによって反応混合物が十分濁った状態になり；標的ポリヌクレオチドが存在する場合には、第２のプローブが標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の一本鎖とハイブリッド化することができ；それによって第１プローブと、標的ポリヌクレオチドの選択された部位の第１の鎖とのハイブリッド形成では反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさず、また第２プローブと標的ポリヌクレオチドの選択されたセグメントの第２の鎖とを合わせても反応混合物の濁度に実質的に全く変化をもたらさない；ように前記反応混合物をハイブリッド形成条件の下で十分な時間保温する工程；及びｆ）試料中の標的ポリヌクレオチドの存在と関連がある反応混合物の濁度の変化を検出する工程を含んでなる、テスト試料中の関心とする、少なくとも８つのポリヌクレオチドを有する標的ポリヌクレオチド配列の存在又は量を検出するための方法。