JP2000505778A

JP2000505778A - 核酸に関する配列特異的結合性オリゴマーおよびアンチセンスストラテジーにおけるそれらの用途

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Publication number: JP2000505778A
Application number: JP08507032A
Authority: JP
Inventors: ヘルデベイン，ピート・アンドレ・モーリッツ; ファン・アエルスホット，アルツール・アルベルト・エドガルト
Original assignee: スティヒティング・レガ・ヴェー・ゼット・ウェー
Priority date: 1994-08-17
Filing date: 1995-08-14
Publication date: 2000-05-16
Also published as: CA2196306A1; HUT77509A; WO1996005213A1; AU3384595A; FI970598L; FI970598A0; FI970598A7; NO970716L; EP0777676A1; MX9701111A; NZ292140A; CN1158618A

Abstract

(57)【要約】この発明は、完全または部分的に、一般式（Ｉ）（ただし、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環、例えばシトシン、５−メチルシトシン、ウラシルおよびチミン、またはそれらのデアザ誘導体、またはアデニン、グアニン、２,６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンおよびキサンチン、またはそれらのデアザ誘導体である）により表される１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体から成るオリゴマーに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】核酸に関する配列特異的結合性オリゴマーおよびアンチセンスストラテジーにおけるそれらの用途この発明は、核酸結合特性を有するオリゴマーであって、モノマー単位として１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体により完全または部分的に構成されるオリゴマーに関するものである。さらにこの発明は、アンチセンス技術におけるオリゴマーの用途およびオリゴマーの製造方法に関するものである。アンチセンス技術は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のコーディングセンス鎖の機能が相補的アンチセンス鎖により遮断され得るという原理に基づいている。アンチセンス技術は、様々な適用性があり、例えば診断、治療、ＤＮＡ修飾および単離等で使用され得る。これらの技術では、アンチセンス鎖自体の安定性に加えて、センスおよびアンチセンス鎖により形成される二重らせんまたは三重らせんの安定性並びにセンス鎖に対するアンチセンス鎖の結合親和力が重要である。同様に、分解酵素、例えばヌクレアーゼに対するオリゴマー、二重らせんまたは三重らせんの感受性は、有効性に関連した因子である。オリゴヌクレオチドは、モノマーがヌクレオチドのオリゴマーである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの燐酸エステルであり、プリンまたはピリミジン塩基および糖により構成される。各ヌクレオチドのバックボーンは、交互になった糖および燐酸基により構成される。ヌクレオチドの安定性および結合親和力は、例えば塩基の修飾により影響され得る。その方向での研究では(１−５)、上記修飾の結果、二重らせんは安定性の劣るものにしかならないことが示された。バックボーンにおける改変またはそこへの新規構造の組み込みにより、ヌクレアーゼ安定性は高められたが、相補鎖に関する結合親和力については副作用がもたらされただけだった。糖を修飾することにより、標的分子に対する親和力は限定的に増加しただけであった(６−８)。この発明の目的は、既知オリゴマーと比べて安定性および結合親和力が改善された新規オリゴマーを提供することである。ヘキシトールがその２位のところでピリミジンまたはプリン塩基の複素環に結合している１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトールヌクレオシド類似体により完全または部分的に構成されるオリゴマーは、天然に存在するオリゴヌクレオチドに結合し得ることが見いだされた。少なくとも部分的にオリゴマーを構成しているモノマーは、式Ｉ：（式中、Ｂは、ピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環である）により示される。モノマーは燐酸ジエステル架橋により互いに連結されており、これらのオリゴマーの構造は式II：［式中、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環であり、ｌは０〜１５の整数、ｋおよびｍは各々１〜１５の整数であるが、ただしｋ＞１の場合ｍは０であり得、ｍ＞１の場合ｋは０であり得、Ｘは酸素または硫黄を示す］で示される。式IIで示される化合物の塩で可能なものは全てこの発明に包含される。式Ｉで示されるモノマーは、ヨーロッパ特許出願第９２２０１８０３.１号の対象である。式IIのオリゴマーは新規化合物である。それらは、天然２’−デオキシヌクレオシドから成るオリゴヌクレオチドとある種の類似性を示すが、メチレン基が環オキシドおよび炭素間に組み込まれ、塩基に結合されているため、モノマーの糖は拡大されている。この発明によると、式IIで示されるオリゴマーおよびそれらの塩類は、式III ［式中、ｋは整数であり、Ｂは式ＩおよびIIの場合と同じ意味を有する］で示される天然オリゴヌクレオチドに対する配列特異的結合性を呈することが見いだされた。従って、新規種類に属するハイブリドンまたは配列特異的結合性ポリマーが見いだされた。少なくとも部分的にピラノースヌクレオシドにより構成されるこの発明によるオリゴマーが高い結合親和力を有するという事実は、非常に驚くべきことである。モノマーのピラノースヌクレオチドから構築されるオリゴヌクレオチドの研究は、特にエシェンモーザー等のグループにより過去数年間にわたって手がけられてきた。エシェンモーザーは、核酸に関する糖ビルディングブロックとしてのフラノースの自然淘汰について調べた（９）。しかしながら、彼は、天然に存するフラノース−ＤＮＡとの良好な結合を達成するために適当なアンチセンス分子が満たすべき必要条件については示さなかった。しかしながら、本発明者らは、どのピラノース様オリゴヌクレオチドが天然フラノース−ＤＮＡとの安定した二重らせんを形成し得るかを調査した（１０、１１）。理論的には、ピラノースオリゴヌクレオチドは、二重らせん形成中におけるエントロピー変化が少ないため、フラノースオリゴマーを凌ぐ自由エネルギー利点を有する。しかしながら、以前に本発明者らにより試験されたピラノース様オリゴヌクレオチドは、天然フラノース−ＤＮＡの相補鎖に全く結合し得ないかまたは充分には結合し得なかった。これらのピラノース様オリゴヌクレオチドは、２,３−ジデオキシ−Ｂ−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（式Ｖ）、２,４ −ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（式VI）および／または３,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキサピラノシルヌクレオシド（式VII）により各々構成された。従って、配列特異的結合性が、糖ビルディングブロックとしてピラノースを含む式IIのオリゴマーについて見いだされるという事実は、よりいっそう驚くべきことである。フラノース化合物のフラン環をピラン環に拡大しても、天然オリゴヌクレオチドと結合し得るオリゴマーは得られなかった。すなわち、ペントーフラノシル環を１,５−アンヒドロヘキシトール環に拡大する効果は、予想され得なかった。従って、この発明による化合物は、１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ− Ｄ−ヘキシトールが、アラビノ−立体配置に従いその２位のところでピリミジンまたはプリン塩基の複素環に結合しているヌクレオシド類似体のオリゴマーである。オリゴマーは、燐酸ジエステルまたはチオ燐酸ジエステルとして互いに結合した上記ヌクレオシド類似体により構成される。オリゴマーは、式II（ただし、ｋ、ｌ、ｍ、ＢおよびＸは上記の意味を有する）により示され得る。オリゴマーは、専ら式Ｉで示されるヘキシトールヌクレオシド類似体により構成され得るか（ただし、式IIの１は０に等しい）、または天然２’−デオキシヌクレオシドを分子に散在した状態またはその一端に有し得る（ただし、式IIの１は０またはそれより大きい）。ヘキシトールは（Ｄ）−立体配置を有し、置換基の立体化学はアラビノ立体配置に従う。基Ｂがピリミジン塩基から誘導される場合、それはシトシン、５−メチルシトシン、ウラシルまたはチミンであり得る。Ｂがプリン塩基から誘導される場合、それはアデニン、グアニン、２,６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンもしくはキサンチン環またはこれらのうちの１つに関するデアザ誘導体であり得る。この発明のモノマー成分のヌクレオシド類似体は、様々な方法で製造され得、製造方法の１つはヨーロッパ特許出願第９２.２０１８０３.１号の対象である。これらの合成についてはフェルヘッゲン等（１２）にも同様に報告されている。モノマーからオリゴマーへの組立は、古典的計画に従っており、標準ホスホルアミダイト化学（参考文献１３参照）またはＨ−ホスホレート化学（参考文献１４参照）により行われ得る。手順は全て、好都合には標準的オリゴヌクレオチド合成の場合と同様にＤＮＡ自動合成装置で行われる。これらの標準条件については「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」（１５）を参照。好ましい方法は、「６’−方向」での組立用に入ってくるビルディングブロックとしてヘキシトールヌクレオシド類似体のホスホルアミダイトを利用するホスホルアミダイト方法である。ホスホルアミダイトは、式VIII（ただし、Ｂ*はオリゴヌクレオチド合成に適した保護塩基部分である（例、各々式IX、Ｘ、ＸＩおよびＸIIにより示されるチミン、Ｎ⁴−ベンゾイルシトシン、Ｎ⁶−ベンゾイルアデニンおよびＮ²−イソブチリルグアニン））により示される。式VIIIで示される生成物は、標準的方法に従って製造され得る。シトシン、アデニンまたはグアニンの塩基部分の保護は、式Ｉで示される化合物のヒドロキシル部分に関する一時的保護ストラテジーに従い達成される（１６）。しかしながら、好ましくは、塩基保護は、上記式Ｉのモノマーの合成における中間体である、４,６−ベンジリデン保護ヌクレオシド類似体１ａ−ｄのアシル化により行われる。環外アミノ官能基のアシル化後、ベンジリデン部分は８０％酢酸により除去され、３ａ−ｄが得られる。化合物３ｃを得るため、ｐ−ニトロ−フェニルエチル基はＤＢＵにより除去され得る。１,５−アンヒドロヘキシトール類似体３ａ−ｄの１次ヒドロキシル官能基は、ジメトキシトリチル基により保護され得、４ａ−ｄが得られる。オリゴヌクレオチド鎖への組み込みに適したホスホルアミダイトビルディングブロック５ａ− ｄへの変換は、２−シアノ−エチル・Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトにより達成され得る。１，５−アンヒドロヘキシトール類似体を含む支持体の製造は、化合物４ａ−ｄをスクシニル化して６ａ−ｄを得、これらはカルボジイミドを利用して長鎖アルキルアミノ多孔質ガラス固相担体（ＣＣＡＡ−ＣＰＧ）または適当なアミノ官能化ポリスチレン（例、テンタゲル（商標）−ＲＡＰＰポリメア）のアミノ官能基に結合され得、７ａ−ｄが得られる（支持体の官能性化、すなわち参考文献１７）。構築後、得られたオリゴヌクレオチドは、支持体から開裂され、１６時間５５ ℃でのアンモニア処理により脱保護される。上記式IIの得られたオリゴマーの精製は、幾つかの方法で達成され得る（１８）。好ましい精製方法では、１２という塩基性ｐＨでのアニオン交換ＦＰＬＣを行い、可能な２次構造を全て崩壊する（１０）。脱塩は、単純なゲル濾過技術、次いで凍結乾燥により行われ得る。許容し得る塩類は全て慣用的方法で製造され得る。上記で述べたところによると、これらのオリゴマーは、天然オリゴヌクレオチドへの配列特異的結合性を示す。それらは、相補的天然オリゴデオキシヌクレオチドに対して非修飾配列の場合よりも強い結合性を示し、かなり高い生化学的安定性があると考えられる。このように、それらは、診断、ハイブリダイゼーション、核酸の分離、部位特異的ＤＮＡ修飾および治療を含むアンチセンスストラテジー並びに現在天然オリゴデオキシヌクレオチドにより遂行されている全アンチセンスストラテジーに関して有利に使用され得る。実施例以下、実施例において、この発明による化合物並びにそれらの化学合成および出発物質の製造についてさらに説明するが、それらはこの発明の限定を意図したものではない。次の略語が使用されている。ＦＡＢＭＳ＝高速原子衝撃質量分析法Ｔｈｇｌｙ＝チオグリセリンＮＢＡ＝ニトロベンジルアルコール１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−２−置換−Ｄ−アラビノ−ヘキシトールヌクレオシド類似体およびそれらの４,６−Ｏ−ベンジリデン保護誘導体の合成については、フェルヘッゲン等（１２）により報告されている。実施例１塩基保護ヌクレオシド類似体１.１．１,５−アンヒドロ−２−（Ｎ⁶−ベンゾイルアデニン−９−イル）− ２，３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（３ｂ）２０ｍｌの乾燥ピリジン中２.３ｇ（６.５１ミリモル）の１,５−アンヒドロ −４,６−Ｏ−べンジリデン−２−（アデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ −Ｄ−アラビノ−ヘキシトールから成る溶液に、０．９ｍｌ（７.８ミリモル）のベンゾイルクロリドを０℃で加えた。室温で４時間撹拌後、混合物を氷浴で冷却し、２ｍｌのＨ₂Ｏを加えた。１.５ｍｌの濃縮ＮＨ₃溶液（３３％ｇ／ｖ）を加え、室温で４５分間さらに撹拌した後、混合物を濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ、９８：２）により精製すると、１. ９２ｇ（４.１９ミリモル、６４％収率）の１,５−アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベンジリデン−２−（Ｎ⁶−ベンゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ− Ｄ−アラビノヘキシトールが得られた。これをさらに６０℃で５時間１００ｍｌの８０％酢酸で処理することにより、ベンジリデン部分を除去した。濃縮し、トルエンと共濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ、９５：５〜９０：１０）により精製すると、この実施例の標記化合物１.１０ｇ（２.９８ミリモル、７１％収率）が得られた。１.２．１,５−アンヒドロ−２,３−ジデオキシ−２−（Ｎ²−イソブチリルグアニン−９−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトール（３ｃ）Ｎ²−イソブチリル−Ｏ⁶−［２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル］グアニン（１.８５ｇ、７.５ミリモル）を１,５−アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベンジリデン− ３−デオキシ−Ｄ−グルシトール（１.１８ｇ、５ミリモル）によりアルキル化し、１６時間無水ピリジン中１.５ｍｌ（１０ミリモル）のＤＢＵによりｐ−ニトロフェニル−エチル基を除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂ Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ、９９：１〜９７：３）により精製した後、１.３５ｇの粗１, ５ −アンヒドロ−４,６−Ｏ−ベンジリデン−２,３−ジデオキシ−２−（Ｎ²−イソブチリル−グアニン−９−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトールが得られた。１００ｍｌの８０％ＨＯＡｃによりベンジリデン部分を加水分解すると（６０℃で５時間）、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ、９０：１０）後に、所望の化合物３ｃ（６１０ｍｇ、１.７４ミリモル、３４％全体収率）が得られた。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_max２７３ｎｍ実施例２ヌクレオシド類似体のジメトキシトリチル化２.１．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（チミン−１ −イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（４ａ）１,５−アンヒドロ−２−（チミン−２−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘキシトール（３ａ）（３３０ｍｇ、１．２９ミリモル）を、２０ｍｌの無水ピリジンに溶かし、４８０ｍｇ（１．４２ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドを加えた。混合物を室温で一夜撹拌し、１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、トルエンと共濃縮した。生成した残留物をカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン含有ＣＨＣｌ₃中０〜３％ＭｅＯＨの勾配による）により精製すると、泡状物として３７３ｍｇ（０．６７ミリモル、５２％）の標記化合物が得られた。２.２．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ⁶−ベンゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（４ｂ）２５ｍｌの乾燥ピリジンに３７０ｍｇ（１ミリモル）のヌクレオシド３ｂおよび４００ｍｇ（１.２ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドを溶かした溶液を、室温で１６時間撹拌した。混合物を１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、トルエンと共濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（０.２％ピリジン含有ＣＨ₂Ｃｌ₂中０〜３％のＭｅＯＨ）により精製すると、泡状物として４００ｍｇ（０．６ミリモル、収率６３％）の化合物４ｂが得られた。ＦＡＢＭＳ（Ｔｈｇｌｙ、ＮａＯＡｃ）ｍ／ｃ：６９４（ｍ＋Ｎａ）⁺、２４０（Ｂ＋２Ｈ）⁺。２.３.１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ²−イソブチリルグアニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（４ｃ）２５ｍｌの乾燥ピリジンに５８０ｍｇ（１.６５ミリモル）のヌクレオシド３ｃおよび６７０ｍｇ（２０ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドを溶かした溶液を、室温で１６時間撹拌した。混合物を１００ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃溶液で２回洗浄した。有機層を乾燥し、濃縮し、トルエンと共濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（０.２％ピリジン含有ＣＨ₂Ｃｌ₂中０〜３％のＭｅＯＨの勾配）により精製すると、泡状物として７７０ｍｇ（１.１８ミリモル、収率７１％）の化合物４ｃが得られた。ＦＡＢＭＳ（ＮＢＡ）ｍ／ｅ：６５４（Ｍ＋Ｈ）⁺。２.４．アミダイトビルディングブロック（５ａ−ｃ）の製造２.５ｍｌの乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂中６’−Ｏ−保護ヌクレオシド（０.５ミリモル）、３当量の乾燥Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミンおよび１.５当量の２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルクロロ−ホスホルアミダイトから成る混合物を、室温で３時間撹拌した。０.５ｍｌのＥｔＯＨを加え、さらに２５分間撹拌した後、混合物を５％ＮａＨＣＯ₃−溶液（１５ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。Ｅｔ₃Ｎでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、白色泡状物としてアミダイトが得られ、これを少量の乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、１００ｍｌの冷（−５０℃）ｎ−ヘキサンに滴下した。沈澱物を分離し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥し、そのままＤＮＡ合成に使用した。下表は、種々のアミダイトに関する溶離溶媒および沈澱後の収率を示す。実施例３６−Ｏ−保護ヌクレオシド類似体のスクシニル化３.１．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｏ−スクシニル−２−（チミン−１−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（６ａ）５ｍｌの無水ピリジン中８０ｍｇ（０.１４ミリモル）の４ａ、９ｍｇ（０.０７ミリモル）のＤＭＡＰおよび４３ｍｇ（０.１４ミリモル）の琥珀酸無水物から成る混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応が不完全なので、追加量の４３ｍｇ（０.４３ミリモル）を加え、混合物をさらに２４時間撹拌した。溶液を濃縮し、トルエンと共濃縮した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、有機層を飽和ＮａＣｌ溶液および水で洗浄し、乾燥し、濃縮すると、白色泡状物として７８ｍｇ（０.１２ミリモル、８６％収率）の６ａが得られた。３.２．１,５−アンヒドロ−６−Ｏ−ジメトキシトリチル−４−Ｏ−スクシニル−２−（Ｎ⁶−ベンゾイルアデニン−９−イル）−２,３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノヘキシトール（６ｂ）６ａについて記載したのと同じ方法を用いて、６ｂを合成した。２６０ｍｇ（０.３９ミリモル）の量の４ｂから、泡状物として２５６ｍｇ（０.３３ミリモル、８５％収率）の標記化合物が得られた。実施例４オリゴヌクレオチドの生成４.１．固体支持体の製造４ｍｌの無水ピリジン中８０マイクロモルのスクシネート（６ａ、ｂ）、４００ｍｇの予備活性化ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（１７）、５ｍｇ（４０ミリモル）のＤＭＡＰ、３５μｌのＥｔ₃Ｎおよび１５３ｍｇ（８００マイクロモル）の１−（３ −ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド.ＨＣｌから成る混合物を、まず５分間音波処理し、次いで室温で１６時間撹拌した。撹拌後、ＣＰＧ固体支持体を濾過し、ピリジン、メタノールおよびＣＨ₂Ｃｌ₂により逐次洗浄し、次いで減圧下乾燥した。１.５ｍｌの１−メチルイミダゾール（ＴＨＦ中）（アプライド・バイオシステムズ）および１.５ｍｌの無水酢酸−ルチジン−ＴＨＦ１：１：８（アプライド・バイオシステムズ）を用いて、支持体の表面の未処理部位を覆った。室温で４時間撹拌後、固体支持体を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、減圧下乾燥した。比色定量ジメトキシトリチル分析により、７ａについては１８. ５マイクロモル／ｇおよび７ｂについては２１.５マイクロモル／ｇのローディングが示された。４.２．ＤＮＡ−合成オリゴヌクレオチド合成は、ホスホルアミダイト法（末端ジメトキシトリチル脱離）を用い、ＡＢＩ３８１ＡＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ）において行われた。得られた配列を脱保護し、濃縮アンモニア処理（５５ ℃、１６時間）により固体支持体から開裂した。緩衝液Ａ（下記参照）で溶離するＮＡＰ−１０（商標）カラム（セファデックスＧ２５−ＤＮＡ級、ファーマシア）により精製後、勾配系［Ａ＝１０ミリモルＮａＯＨ、ｐＨ１２.０、０.１モルＮａＣｌ、Ｂ＝１０ミリモルＮａＯＨ、ｐＨ１２.０、０.９モルＮａＣｌ、使用勾配はオリゴにより異なる、流速２ｍｌ／分］によるモノ−Ｑ（商標）ＨＲ１０／１０アニオン交換カラム（ファーマシア）において精製を行った。低圧液体クロマトグラフィーシステムは、メルク−日立Ｌ６２００Ａインテリジェント・ポンプ、モノＱ（商標）ＨＲ１０／１０カラム（ファーマシア）、ウビコードＳＪＩ２１３８ＵＶ検出装置（ファーマシア−ＬＫＢ）および記録装置により構成された。生成物含有分画をＮＡＰ−１０(商標)カラムで脱塩し、凍結乾燥した。実施例５融解温度オリゴマーを、緩衝液：０.１モルＮａＣｌ、０.０２モル燐酸カリウムｐＨ＝７.５、０.１ミリモルＥＤＴＡに溶かした。８０℃、２６０ｎｍで吸光度を測定し、１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体が変性状態で天然ヌクレオシドの場合と同じ吸収係数を有するものとして、濃度を決定した。アデニンモノマーの場合エプシロン＝１５０００チミンモノマーの場合エプシロン＝８５００グアニンモノマーの場合エプシロン＝１２５００シトシンモノマーの場合エプシロン＝７５００全実験における濃度は、各鎖約４マイクロモルであった。ウビコン９４０分光光度計により、融解曲線を決定した。キュベットホルダー全体を循環している水によるサーモスタットでキュベットを調温し、キュベットに直接浸したサーミスターで溶液温度を測定した。温度制御およびデータ獲得は、ＩＢＭ／ＰｃＡＴ互換性コンピューターにより自動的に行われた。試料を加熱し、０.２℃／分の速度で冷却すると、加熱および冷却融解曲線間に差異は全く観察され得なかった。吸光度対温度曲線の第１微分係数を調べることにより、融解曲線を評価した。合成されたオリゴヌクレオチドの例をそれらの融解点と一緒に表１〜４に示す。表１Ａ₁₃／Ｔ₁₃二重らせんの中央に単一アンヒドロヘキシトールヌクレオシド（Ａ *、Ｔ*）が組み込まれた（０.１モルＮａＣｌ濃度で測定された）オリゴヌクレオチドの融解点。表１から明らかなのは、１,５−アンヒドロ−２−（アデニン−９−イル）−２, ３−ジデオキシ−Ｄ−アラビノーヘキシトールをオリゴデオキシアデニレートに組み込むと、天然２’−デオキシアデノシンの挿入とほぼ同一のヘリックス−コイル転移が行われることである。しかしながら、オリゴデオキシアデニレート／オリゴチミジン二重らせんに１つの誤対合があると、二重らせんの安定性に多大な効果を及ぼすことは注意すべきである。これに反して、１,５−アンヒドロ− ２,３−ジデオキシ−２−（チミン−１−イル）−Ｄ−アラビノヘキシトールによりチミジンをオリゴチミジレートに置換すると、融解温度は実質的に下がる。２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキソピラノシルヌクレオシド（ただし、Ａ*．Ｇ［Ａ*：９−２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロヘキソピラノシル）アデニン］誤対合の方が、Ａ*．Ｔ［Ａ*：９−２,４−ジデオキシ−β−Ｄ −エリトロヘキソピラノシル）アデニン］塩基対合よりもハイブリダイゼーションの安定性を高くする）による我々の実験室の以前の観察結果とは反対に（１１）、モデルとしてオリゴデオキシアデニレート／オリゴチミジン二重らせんを用いたとき、１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシドとの塩基対合特異性における改変は無い。表２０．１モルＮａＣｌで測定された、完全修飾オリゴヌクレオチドおよび両端が修飾されたオリゴヌクレオチドの融解温度。（１）２８４ｎｍで測定１本鎖オリゴＡ*およびオリゴＴ*は両方とも規則正しい構造を示すが、高塩濃度での結果とは反対に（結果は示されていない）、ポリＴ*はホモ二本鎖形成の場合と同じ傾向は示さない。これは、オリゴＡ*およびオリゴＴ*の両場合とも、温度に従ったＵＶ吸収のある程度の直線的増加により立証される。オリゴＴ*およびオリゴデオキシアデニレートの当モル混合物は、２８４ｎｍで測定したとき４９％の淡色性で４５℃の融解点を示す。塩濃度を変えることにより、構造転移がＤＮＡで行われることが知られており、この場合も事実は明らかにこの通りである。オリゴＴ*：オリゴデオキシアデニレート会合は低塩濃度で有利であり、オリゴＴ*ホモ二本鎖の形成は高塩濃度で有利である。しかしながら、２６０ｎｍでの複合体の熱反応は、オリゴＴ*：オリゴデオキシーアデニレート会合が古典的ヘリックス−コイル転移ではないことを示している。２６０ｎｍでは、まず淡色性が減少し、４６℃で最小値を示し（融解点は４８４ｎｍで観察される）、次いで増加する。アデニン（Ａ*）およびグアニン（Ｇ*）ヌクレオシド類似体を含む完全修飾された混合配列（２つの６量体および１つの１２量体）も同様に評価された。表３完全修飾６量体の融解温度１モルＮａＣｌ、２０ミリモルＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７.５、ＥＤＴＡ０.１モルで測定。２本鎖は、相補的配列：１６および１７の場合、５’−ＴＣＴＣＣＴ（２０）、および１８および１９の場合、５’−ＴＣＴＣＴＣ（２１）により各々形成された。これらの配列のうちの幾つかの場合融解点は６量体について測定され得たが、１モルＮａＣｌ（２０ミリモルＫ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７.５および０１ミリモルＥＤＴＡ）中でこれらのオリゴヌクレオチドの熱変性を試験した。最も重要な現象は、ピラノース様オリゴヌクレオチドおよびそれらの天然対応物質間における２本鎖の明確な形成である。さらに、これらの修飾２本鎖は、全くワトソン−クリック塩基対のみで構成される対照２本鎖よりも安定している。しかしながら、注意を引くのは、逆平行相補的オリゴヌクレオチドを伴った配列１６（３１.２℃）および１７（Ｔｍ＝１４.７℃）に関する融解温度の差異が大きいことである。両修飾オリゴが３Ｇ*および３Ａ*を含み、それらの配列順序のみ異なる場合、１６に関する融解温度は１８の場合の２倍である。この配列依存的効果は、対照オリゴヌクレオチド１７および１９では僅かしか表されていない。表４Ａ*およびＧ*を含む完全修飾１２量体の融解温度０.１モルＮａＣｌで測定（２４）５’−ＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴ１２量体の場合を見ても、相補的逆平行配列２４を伴う両配列を評価した場合、やはり完全修飾オリゴヌクレオチドの安定性が、その対照配列２３と比べて高く、融解温度が１６℃高いことに気付く。参考文献１．ビューケージ、Ｓ.Ｌ.およびアイヤー、Ｒ.Ｐ.、「テトラヘドロン」４９、６１２３−６１９４（１９９３）２．サンフビ等、「ヌクレオサイズ・アンド・ヌクレオタイズ」１０、３４５ −３４６（１９９１）３．チョレット等、「ケミカ・スクリプタ」２６、３７−４０（１９８６）４．シーラ、Ｆ.およびケーネ、Ａ.、「バイオケミストリー」２４、７５５６ −７５６１（１９８５）５．ワグナー等、「サイエンス」２６０、１５１０−１５１３（１９９３）６．イノウエ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１５、６１３１−６１４８（１９８７）７．パーボスト等、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ」１６５、７４２−７４７（１９８９）８．ガグノア等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１５、１０４１９− １０４３６（１９８７）９．エシェンモーザー、Ａ.、「ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー」６５、１１７９−１１８８（１９９３）１０．アウグスティンズ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」２０、４７１１−４７１６（１９９２）１１．アウグスティンズ等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」２１、４６７０−４６７６（１９９３）１２．フェルヘッゲン等、「ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー」３６、２０３３−２０４０（１９９３）１３．マッテウッチ・エン・カルテルス、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー」１０３、３１８５−３１９１（１９８１）１４．フロエーラー等、「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」１４、５３９９−５４０７（１９８６）１５．「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、２０巻、『プロトコルズ・フォー・オリゴヌクレオタイズ・アンド・アナログズ』、Ｓ．アグラワル編、フマーナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、アメリカ合衆国１６．ティ等、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー」１０４、１３１６−１３１９（１９８２）１７．ポン等、「バイオテクニクス」６、７６８−７７５（１９８８）１８．「メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、２６巻、フーフズツック９、『アナリシス・アンド・ピュリフィケーション・オブ・シンセティック・オリゴヌクレオタイズ・バイ・ＨＰＬＣ』、Ｓ．アグラウェル編、フマーナ・プレス、トトワ、ニュージャージー、アメリカ合衆国

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・アエルスホット，アルツール・アルベルト・エドガルトベルギー、ベー−2220ヘイスト・オー／デー・ベルク、ヘイスト−ゴールストラート 29番

Claims

【特許請求の範囲】（１）完全または部分的に、一般式Ｉ（式中、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環である）により表される１,５−アンヒドロヘキシトールヌクレオシド類似体から成るオリゴマー。（２）一般式II （式中、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基から誘導される複素環であり、ｋ、ｌおよびｍは各々０〜１５の整数であって、ただしｋおよびｍは少なくとも１であるが、ｋ＞１の場合ｍは０であり得、ｍ＞１の場合ｋは０であり得、そしてＸは酸素または硫黄を表す）およびその塩類を特徴とする、請求項１記載のオリゴマー。（３）複素環が、シトシン、５−メチルシトシン、ウラシルおよびチミン、またはそのデアザ誘導体から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１または２記載のオリゴマー。（４）複素環が、アデニン、グアニン、２,６−ジアミノプリン、ヒポキサンチンおよびキサンチン、またはそのデアザ誘導体から成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１または２記載のオリゴマー。（５）式Ｉで示される化合物が（Ｄ）−立体配置を有し、置換基がアラビノ−立体配置で位置する、請求項１−４のいずれか１項記載のオリゴマー。（６）アンチセンス技術で使用される、請求項１−５のいずれか１項記載のオリゴマー。（７）アンチセンス技術に、診断、ハイブリダイゼーション、核酸の分離、部位特異的ＤＮＡ修飾および治療が含まれることを特徴とする、請求項６の記載に従い使用されるオリゴマー。（８）式１で示されるモノマーの適量をカップリングすることを含む、式IIで示されるオリゴマーの製造方法。（９）請求項１記載のオリゴマーの製造に使用される、一般式VIII （式中、Ｂ★は保護塩基である）で示されるホスホルアミダイト。