JPH03294281A - オキサゾピロロキノリン類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、オキサゾピロロキノリン類の製造方法に関し
、さらに詳細には、細菌を使用して得られたピロロキノ
リンキノンからオキサゾピロロキノリン類を製造する方
法に係わる。

オキサゾピロロキノリン類は、別名５位置換２．８．１
０−トリカルボキシ−ＩＨ−オキサゾ［５，４−ｈ］−
ピロロ［２，３−ｆｌキノリン（以下総称してＯＰＱ類
と記す）であり、化学構造式は、下記の一数式Ｉのごと
くである。

［Ｒは、ＨあるいはＲ’−ＣＨ（Ｎｌ２）−ＣＯＯｆｌ
で示されるα−アミノ酸のＲ′と同じ。］ ＯＰＱ類は、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱと記す
）の誘導体であり、今後、医薬品として開発しうる重要
な物質である。なお、ＰＱＱは。

１９７９年にメタノール資化性細菌のメタノール脱水素
酵素の補酵素として見い出された。

［従来技術、発明が解決しようとする問題点コＰＱＱは
、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母、さらには、噌
乳動物にも存在し、補酵素として重要な働きを担ってい
る。また、さらに、近年までに細胞の増殖促進作用（特
開昭６１−５８５８４号公報、同６３−２３３７８３号
公報）、抗白内障作用（特開昭６３−４１４２１号公報
、同８３−４８２１５号公報、同６４−２９３１３号公
報）、肝臓疾患予防治療作用（特開昭６３−１９２７１
７号公報）、創傷治癒作用（特開昭６３−１５２３０９
号公Ｉｆり　、抗アレルギー作眉（特開昭６３−１７４
９３号公報）、逆転写酵素阻害作用（特開昭６３−１５
８７２４号公報、特開平１−２９３１３号公報）および
グリオキサラーゼエ阻害作用−制癌作用（特開昭６３−
２１５６２８号公報、特開平１−２９３１３号公報）な
ど多くの生理活性が明らかにされている。

しかしながら、ＰＱＱは、腎毒性を有することが近年明
らかにされ（渡辺ら、Ｈ４ｒｏｓｈｉｍａ　Ｊ、Ｍｅｄ
。

Ｓｃｉ、、第３８巻、１号、第４９〜５１頁（１９８９
年））、毒性および腎毒性が低く安全なＰＱＱ誘導体の
開発が望まれている。

本発明者らは、種々のＰＱＱ誘導体について、腎毒性お
よび急性毒性試験を行なったところ、オキサゾピロロキ
ノリンＭ　（ＯＰＱ類）がこれらの毒性を大幅に軽減し
ていることを見い出した。

しかして、ＯＰＱ　（前記の一般式ＩにおいてＲ：Ｈの
場合に相当）は、ＰＱＱとグリシンを反応させて得られ
ることが知られている（平成元年度日本化学会講演要旨
集２１１［Ｂ５４）。しかしながら、この方法において
は、不純物を含まない高純度のＰＱＱが使用されている
。ＰＱＱは１通常細菌を使用して生産されるが、このと
きに得られる培養液にはＰＱＱの他に細菌菌体、蛋白質
および糖類などの細菌内物質、培地成分ならびに副生成
物などの夾雑物が多種多量に含まれており、これらの夾
雑物が反応に悪影響を及ぼすことが危惧され、かつ、Ｐ
ＱＱの醗酵生産が終了した後には、ＰＱＱは蛋白質など
と急速に反応して、損耗されるので。

このＰＱＱの損耗を防ぐために、この培養液から速やか
にＰＱＱを分離・回収し、さらに必要に応じて精製され
たＰＱＱがＯＰＱの生産に使用されていた。

しかしながら、培養液からのＰＱＱの分離・回収および
精製には煩雑な工程が必要であり、また、培養液中のＰ
ＱＱの蓄積量が極めて低いことから、これを効率よく分
離・精製するには、さらに複雑な工程が必要である。こ
のように、手数をかけて得られる高純度のＰＱＱを使用
することは、ＯＰＱの工業的生産に際して、重大な隘路
となっていた。

［問題を解決するための手段、作用コ 本発明者らは、細菌を用いるＯＰＱ類の培養生産方法を
種々検討した結果、ＰＱＱを生産する能力を有する細菌
を、メタノールを炭素源とする培地中に培養し、培養液
中にＰＱＱを蓄積させ、引き続いてこの培養液に、各種
アミノ酸およびモノメチルアミンのうち少なくとも一種
を添加し、酸素の存在下でＰＱＱとこれらの化合物とを
反応させることにより、培養液中に蓄積されたＰＱＱが
効率よ＜ＯＰＱ類に転換されることを見出し、本発明に
到達した。

すなわち１本発明は、メタノールを炭素源とする培地中
でピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を
培養してピロロキノリンキノンを含有する培養液を得、
該培養液に各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選
ばれたψなくとも一種を添加し、該培養液中のピロロキ
ノリンキノンをオキサゾピロロキノリン類に変化させる
ことを特徴とするオキサゾピロロキノリン類の製造法で
ある 本発明において使用される細菌としては、メタノールの
資化性を有し、かつ＋　ＰＱＱを菌体外に生産する能力
を有する細菌であれば、いずれでもよいが、これらの菌
の代表的な菌株としては。

１、メチロバチルス属に属する メチロバチルス　グリコゲネス　ＡＴＣＣ２９４７５（
＝ＪＣＭ　２８５０＝ＮＣＩＢ　１１３７５）、同ＡＴ
ＣＣ２１２７５（＝ＪＣＭＺ８４１）、同ＡＴＣＣ２１
４５２（＝ＪＣＭ　２８４２）、同ＡＴＣＣ２１９６１
（＝ＪＣＭ　２８４３）、同ＡＴＣＣ２１８５２（＝Ｊ
ＣＭ　２８４０　＝ＮＣＩＢ　１１３７６）、同ＡＴＣ
Ｃ２１３６９（＝ＪＣＭ　２８４４Ｌ同ＡＴＣＣ２１９
５８（＝ＪＣＭ　２８４７）、同ＡＴＣＣ２１９６３（
＝ＪＣＭ２８４ｇ）、同訂ＣＣ２１３７０（＝ＪＣＭ　
２８４９）、同＾ＴＣＣ２１３７２（＝ＪＣに２８５２
）、同＾ＴＣＣ２１９５９、同ＡＴＣＣ２１３７１（＝
ＪＣＭ　２８５３）、同＾ＴＣＣ２１９５７、同＾ＴＣ
Ｃ２１２７６（＝ＪＣＭ　２８５４）、同ＡＴＣＣ２１
４５３Ｃ＝ＪＣＭ　２８５５）、同＾ＴＣＣ２１９８２
（＝ＪＣ１Ｚ８５６）、同ＡＴＣＣ２１７０４（＝ＪＣ
Ｍ２８５７）、同ＡＴＣＣ２１９６０（＝ＪＣＭ　２８
５８）、同ＡＴＣＣ２１４３９、同ＮＣＩＢ　１１０５
０８（＝ＪＣ２８５９）、同ＮＣｌＢ１０５０９、同Ｎ
（ＪＢ　１１０５１０（＝ＪＣＺ８６０）、同ＮＣｌＢ
１０５１１、同ＮＣＩＢ　１０５１２　（＝ＪＣＭ　２
８６１）、同ＮＣｌＢ１０５１３、同ＮＣＩＢ　１０５
１４．同ＮＣＩＢ　１０５９２（１０５９２（＝ＪＣ、
同ＮＣＩＢ　１０５９３、同ＮＣＩＢ　１０５９４（１
０５９４（＝ＪＣ、同ＮＣＩＢ　１０５９５、同ＮＣＩ
Ｂ　１０５９６（＝ＪＣＨ２８６４）、同ＪＣＭ　２８
５１（＝ＮＲＲＬ　Ｂ−５４５８）、同ＪＣＭ２８６６
、同ＦＥＲＮ　Ｐ−１６９２、同ＦＥＲＮ　Ｐ−１６９
３，同ＦＥＲＭ　Ｐ−１６９４、同ＰＥＲＭ　Ｐ−２１
８２、同ＦＥＲＮ　Ｐ−２１８４、同ＦＥＲＮ　Ｐ−２
２４７、同ＦＥＲＮ　Ｐ−２６６１，同ＦＥＲＭ　Ｐ−
２６６２、同ＦＥＲＮ　Ｐ−２６６３、同ＰＥＲＭ　Ｐ
−４０３６、同ＦＥＲ１’Ｉ　Ｐ−４０３７、同ＦＥＲ
Ｎ　Ｐ−４０３８、同ＦＥＲＮ　Ｐ−４０３９、同ＦＥ
ＲＮＰ−４０４０、同ＦＥＲＮ　Ｐ−４０４１、同ＦＥ
ＲＮ　Ｐ−４０４２および同ＦＥＲＮ　Ｐ−４０４３゜ （菌種名は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｗｔａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、　！！３６巻、　９Ｊｉ５０２−５１１
頁（１９８６）に準拠した）。

２、メチロフィルス属に属する メチロフイルスメチロトロファス　ＮＣＩＢ　１０５１
５および同＾ＴＣＣ３１２２Ｂ（＝ＮＣＩＢ　１１８０
９）。

（菌種名は、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｍａｔｆｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ、第３７巻、　＠４４６−４４８頁（１９
８７）に準拠した）。

３、メチロバクテリウム属に属する メチロバクテリウム　エクストロクエンス　ＤＳＭ１３
３７（＝ＪＣＭ　２８０２＝ＮＣＩＢ　９３９９）、同
ＪＣＮ　２８０３（＝ＮＣＩＢ１０４０９）、　同　Ａ
ＴＣＣ８４５７（＝ＤＳＭ　　１３４０＝ＩＡＮ　　１
０８１＝ＪＣＭ２８１０８１＝ＪＣ２８７９）、同＾Ｔ
ＣＣ１４７１８（＝ＤＳＮ　１３３８＝ＪＣＭ２８０５
＝ＮＣＩＢ　９１３３）、同ＤＳＭ　１３３９（＝ＪＣ
Ｍ　２８０６：＝ＮＣＩＢ９６８８）および同ＮＣＩＢ
　１０４０９、メチロバクテリウム　ロデイナム　ＡＴ
ＣＣ１４８２１（＝ＪＣＭ　２８１１＝ＮＣＩＢ　９４
２１）、メチロバクテリウム　ロデシアナムＮＣＩＢ　
１２２４９、同＾ＴＣＣ２１６１１（＝ＪＣＭ　２８０
７）、同ＡＴＣＣ２１６１２（＝ＪＣＭ２８０ｇ）、同
ＡＴＣＣ２１６１３（＝ＪＣＭ　２８０９）、同ＡＴＣ
Ｃ２１６１４（＝ＪＣＭ　２８１０）、同ＮＣＩＢ　１
０５９７．同ＮＣＩＢ　１１０５９８（＝ＪＣ２８１２
）、同Ｎ（ＪＢ　１１０５９９（＝ＪＣ２８１３Ｌ同Ｎ
ＣＩＢ　１１０６００（＝ＪＣ２８１４）、同ＮＣＩＢ
　１０６０１（＝ＪＣ阿２８１７）、同ＭＣＩＢ　１０
６０２（＝ＪＣ８２８１５）および同ＮＮＣｌＢ１０６
１１（＝ＪＣ２８１８）。

メチロバクテリウム　ザットマニー　ＮＣＩＢ　１２２
４３゜同ＮＣＩＢ　１０６０３（＝ＪＣ？Ｉ　２８１８
）、同ＮＣＩＢ　１０６０４（＝ＪＣ’１２８２５）、
同ＭＣＩＢ　１１０６０６（＝ＪＣ２８１９）、同ＮＮ
ＣｌＢ１０６０７（＝ＪＣ２８２０）、同ＭＣｌ８１１
０６０８（＝ＪＣ２８２１）、同〜ＣＩＢ　１１０６０
９（＝ＪＣＺ８２２）、同ＭＣＩＢ　１１０６１０（＝
ＪＣ２８２３）および同ＮＣｒＢ　１１０６１２（＝Ｊ
Ｃ２８２４）、メチロバクテリウム　オルガノフイラム
　ＡＴＣＣ２７８８８（＝ＪＣＮ　２８３３）、 メチロバクテリウム　メソフイリカス　ＡＴＣＣ２９９
８３（＝ＪＣＭ　２８２９．ＮＣＩＢ　１１５６１）−
メチロバクテリウム　フジサワエンシス　ＮＣｌＢ１２
４１７および同ＮＣＩＢ　１１２７２、メチロバクテリ
ウム　ラジオトレランス　ＩＡＭ１２０９９（＝ＡＴＣ
Ｃ２７３２９＝ＪＣ？ｌ　２８３０＝ＮＣＩＢ　１０８
１５）、同ＦＡＮ　１２０９８（＝ＪＣＮ　２８３１）
、同ＮＣＩＢ　９１４２および同ＮＣＩＢ　９１４３、
ならびに メチロバクテリウム　エスピーＡＴＣＣ２１４３ｇ（＝
ＪＣに２８２７）、同ＩＡＭ　１２６２３（＝Ｊ（Ｊ　
２８３４）、同ＪＣ１１２８３２、同ＮＣＩＢ　９１４
１．同ＮＣＩＢ　９１４５、同ＮＲＲＬ　Ｂ−３４４９
、同ＦＥＲＭ　Ｐ−４８９３、同ＦＥＲＭ　Ｐ−４８９
４，同ＦＥＲ？ｌ　Ｐ−４８９５、同ＦＥＲＭ　Ｐ−４
８９６、同ＦＥＲＭ　Ｐ−４８９７および同ＦＥＲＮ　
Ｐ−９４６６゜ （菌種名は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙｓ第３３巻、第８７５−８７７頁（１９８３
）およびｊＩ３８巻、　ｊ１１２４−１２７頁（１９８
８）に準拠した）。

４、アンシロバクター属に属する アンシロバクター　アキュアティクス　ＡＴＣＣ２５３
９Ｂ（＝ＣＣＭ　１７８６＝ＤＳＮ　１０１＝ＮＣＩＢ
　９２７１）、同＾ＴＣＣ２７０６ｇ（＝ＤＳＭ　３３
４）、同ＡＴＣＣ２７０６９、同＾丁ＣＣ２１３７３（
＝ＤＳ？Ｉ　１１０６）、同ＮＣＩＢ　１１０５１６（
＝ＤＳ　２４５７）。

同ＤＳＭ　２８８８（＝ＦＥＲＭ　Ｐ−４４１６）、同
ＤＳ８２６６７（＝ＦＥＲＭＰ−４４１７）、同ＤＳＭ
　２６６８（＝ＰＥＲＭ　Ｐ−４４１８）および同ＤＳ
Ｍ　２ｆ３８９（＝ＦＥｌ？ｌｆ　Ｐ−４４１９）、な
らびにアンシロバクター　エスピー　ＤＳＭ　１１０７
、同ＤＳＮ　１１０ｇ、同ＤＳＮ　１２７７、同ＤＳＭ
　２４５５８よび同ＤＳＭ　２４５８゜ （菌種者は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇＹｐ　！！３８巻、　１４１５−４２１頁（ｘ
９ａｓ；に準拠した）。

５、ハイホミクロビウム属に属する ハイホミクロビウム　プルガレ　ＮＣＩＢ　９８９８、
同ＮＣＩＢ　９７７５、同ＤＳＮ　１５８４、同ＮＣＩ
Ｂ　１１０５２、同ＮＣ：ＩＢ　９６９Ｂ、同ＤＳＭ　
１５８８、同ＮＣＩＢ　９８９７．同ＮＣＩＢ　９６９
９、同ＮＣＩＢ　１００９９、同ＮＣＩＢ　１０３４２
（１０３４２（＝ＤＳおよび同ＮＣｒＢ　１１０５３、
ならびにハイホミクロビウム　メチロボラム　ＩＦＯ１
４１８０、同ＮＣＩＢ　１０５１７　オヨびＭ　ＤＳＮ
　１８６９（＝ＮＣｒＢ　１１７０６）（菌種者は、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙｐＷ１３３巻、　ｊ１５２１−５４２頁（１
９８７）に準拠した）。

６、キサントバクタ−属に属する キサントバクタ−オートトロフィヵス　ＤＳＭ４３２、
同ＤＳＭ　４３１、同０５？４６８５、同ＤＳＨ１３９
３、同ＤＳＭ１６１８−同ＤＳＭ　２００９および同Ｄ
ＳＭ　２２６７、　Ｊ３ヨび キサントバクタ−フラバス　ＤＳＭ　３３８（＝ＮＣＩ
Ｂ１００７１）。

（菌種者は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｉｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ、第２８巻、第５７３−５８１頁（１９８１
）に準拠した）。

７、アシドモナス属に属する アシドモナス　メタノリカ　ＪＣＭ　６８９１（＝Ｉｌ
ＩＥＴ１０９４５）およびＭ　ＪＣＭ３７１２（＝ＦＥ
ＢＮ　Ｐ−２６８４）。

（菌種者は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙｙ　第３９巻、第５０−５５頁（１９８９）
に準拠した）。

８、パラコツカス属に属する バラコツカス　デニトリフィカンス　ＡＴＣＣ１７４４
１（＝Ｏ３？Ｉ　６５＝ＩＡＭ　１２４７９＝ＮＣＩＢ
　１１８２７）、同＾ＴＣＣ１３５４３（＝ＣＣＮ　９
８２＝ＮＲＲＬ　Ｂ−３７８４）、　同ＡＴＣＣ１９３
６７（＝ＤＳＭ４１３＝ＩＦＯ１３３０１＝ＮＣＩＢ　
８９４４＝ＮＲＲＬ　Ｂ−３７８５）、同ＣＣＭ　１３
９６（＝ＤＳＭ　４１５＝ＮＣＩＢ　９７２２）　オヨ
び同ＩＦＯ１，２４４２、ならびに バラコツカス　アルカリフィルス　ＪＣＭ　７３６４（
＝ＦＥＲＭ　Ｐ−９２８２）、同ＦＥＢＮ　Ｐ−９２８
０および同ＦＥＢＮＰ−９２８１゜ （菌種者は、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ−麿ａむｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙｒ　Ｉ！３９巻、第１１６−１２１頁（１
９８９）に準拠した）。

９、チオバチルス属に属する チオバチルス　ノベルス　ＡＴＣＣ８０９３（＝ＣＣＮ
　１１０７７＝Ｏ５５０Ｂ＝ＩＦ０１２４４３＝ＮｃＩ
Ｂ　９１１３）および同Ｎ（ＪＢ１０４５６゜ （菌種者は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ−ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ、　１１３０巻、第２２５−４２０頁（１９
８０）に準拠した）。

１０、メチロファーガ属に属する メチロファーガ　マリーナ　ＡＴＣＣ３５８４２（＝Ｎ
ＣＭＢ２２４４）、 メチロファーガ　サラシカ　ＡＴＣＣ３３１４６（＝Ｉ
ＡＭ　　１２４５８＝ＮＣＭＢ　２１６３）、同ＮＣＭ
Ｂ　２１６２（＝ＦＥＲＭ　Ｐ−３６２２）および同Ａ
ＴＣＣ３３１４５、ならびにメチロファーガ　エスピー
　ＦＥＲＭ　Ｐ−３６１９、同ＦＥＲＭ　Ｐ−３６２０
、同ＦＥＢＮ　Ｐ−３６２３および同ＦＥＲＮ　Ｐ３６
２４゜ （菌種者は＋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　５ｙｓｔｅ−−ａむｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ、第３７巻、第４０２−４０６頁（１９８２
）に準拠した）。

１１、ミコバクテリウム属に属する ミコバクテリウム　メタノリカ　ＦＥＲＭ　Ｐ−８８２
３、同ＦＥＲＭ　Ｐ−８８２４、同ＦＥＲＮ　Ｐ−８８
２５、同ＦＥＢＮ　Ｐ−８８２６、同ＰＥＲＭ　Ｐ〜８
８２７、同ＦＥＲＭ　Ｐ−９４６４、同ＦＥＲ阿Ｐ−９
４６５および同ＦＥＲＭ　Ｐ−９４９７゜（ミコバクテ
リウム属に属するこれらの菌株の菌学的性質は、特開昭
６３−２８３８５号公報、同６４−５１０７７号公報お
よび同６４−６０３７１号公報に記載されている。）な
どがある。

なお、前記のこれらの菌株はすべて公知である。

また、これらの菌株より得られた変異株も使用すること
が出来る。

これらのＰＱＱ生産菌を培養するにあたって用いられる
栄養培地は、主炭素源として、メタノ−ルを含有するこ
とが必要である。さらに培地成分として、通常の窒素源
、無機物の適量が使用される。

窒素源としては、通常は、たとえば、硫酸アンモニウム
、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が用
いられ、無機塩類としては、通常は、たとえばリンＷｌ
塩、マグネシウム塩、鉄塩。

その他必要に応じて微量金属塩が用いられる。また、使
用菌株が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質を
培地に添加する必要がある。

また、メチロファーガ属細菌は、生育にＮａＣ１が必要
なので、培地中に、ＮａＣ１を２〜４重量％となるよう
に添加するか、あるいは、培地作成に用いる水として海
水を使用する必要がある。

培養温度は１通常２５〜４５℃の範囲で各菌株にとって
生育、増殖に適した温度を選択すればよい。

培養ｐＨは１通常６〜８の範囲で各菌株にとって生育、
増殖に適したＰＨを選択する。しかし、アシドモナス属
細菌の生育ｐＨは、２．０〜５．５であり、バラコツカ
ス　アルカリフィルスの菌株の生育ｐＨは、７．０〜１
０，０であるので、これらの菌株を用いる場合は、これ
らの範囲内のｐＨを選択する必要がある。

窒素源として、アンモニウム塩を使用した場合は、菌体
が増殖するに伴って培養液中のｐＨが低下するので、培
養期間中の培溶液のｐ）ｌを所定のｐ）Ｉを保つために
、アンモニア、苛性カリもしくは苛性ソーダ等を添加し
て、培養液のｐＨを調節する必要がある。これらの中で
アンモニアが特に好ましい。

このような条件下で通気撹拌などの方法で好気培養を行
うことにより、培養液中にＰＱＱが生成される。

次に、この培養液にα−アミノ酸およびモノメチルアミ
ンの少なくとも一種を添加してこれらと培養液中に含有
されているＰＱＱとを酸素の存在下で反応させて、使用
されたα−アミノ酸またはモノメチルアミンに対応する
ＯＰＱ類を得る。ここで用いられるα−アミノ酸の代表
例としてはグリシン、スレオニン、プロリン、トリプト
ファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、
メチオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシ
ン、グルタミン、セリン、アスパラギン酸。

リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、シス
ティンなどがある。

これらの化合物のうち、光学活性体のあるものは、Ｄ体
、５体、あるいは混合物のいずれでもよい。

また、モノメチルアミンとしては、塩酸塩などのモノメ
チルアミン塩類を用いることも可能である。

これらの化合物の添加時期は通常培養液中のＰ’ＱＱ濃
度が１０μｇ〜１０ｇ／ｌ、好ましくは１００μｇ〜ｌ
ｏｔ／　Ｑとなった時である。添加量は、培養液中のＰ
ＱＱに対して１モル倍以上、好ましくは５モル倍以上、
更に好ましくは大過剰とすることがよく、実際にはＯ，
Ｌｇ／Ｑ以上となるよう添加する事が好ましい。本発明
では通常はこのような培養液をそのまま使用するが、必
要に応じて濃縮により培養液の水分の一部を除去してか
ら使用することも妨げない。

添加の方法としては一度に全量を添加する方法、逐次添
加する方法どちらでも可能であるが、上記濃度とするこ
とが必要である。

反応液のＰＨは、通常は、一般に２〜１０の範囲が好ま
しく、その最適ｐＨはＯＰＱ類の種類により異なるが、
更に詳しくは後で述べる。

反応温度は、実用上、２０〜１００℃程度が好ましく、
特に２５〜８０℃が好ましい。

反応時間は４８時間以内、好ましくは１〜３０時間であ
る。

また、反応液中の溶存酸素濃度には特にｔｌ限はないが
、反応を短時間で終了させるためには。

０．５〜ｌｐｐｍ以上が好ましい。そのために空気ある
いは酸素またはその混合ガスなどを通気し、攪拌したり
、さらに、反応槽の圧力を高めるなどの手段が使用され
る。

このような条件で反応させることによりＰＱＱはＯＰＱ
類に変化せしめられる。

ＰＱＱの醗酵生産が終了した後、培養液に各種アミノ酸
あるいはモノメチルアミンを添加するまでの時間は、短
いほど好ましく、通常は、１０時間以内、好ましくは、
２時間以内とされる。

ＯＰＱ　（Ｒ＝８）はグリシン、トリプトファン、プロ
リン、スレオニン、チロシン、セリンおよびモノメチル
アミンのうち少なくとも一種を培養液番こ添加すること
により得られ、反応ｐｔｔとして番よｐＨ６〜９が特に
好ましい、また、１−メチルエチル０ＰＱ（Ｒ＝ＣＨ（
Ｃ）Ｉ、）２）はバリンを、　１−メチルプロピルＯＰ
　Ｑ　（Ｒ”ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）はインロイ
シンを、２−メチルプロピル シンを，メチル○ＰＱ（Ｒ＝ＣＨ３）はアラニンを、２
−カルボキシエチル○Ｐ　Ｑ　（Ｒ＝ＣＨ２Ｃ１２ＣＯ
□Ｈ）番よグルタミン酸を、２−カルボモイルエチル○
ＰＱ（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＩｈ）はグルタミンを、
２−メチルエチルエｆ　／Ｌ／　Ｏ　Ｐ　Ｑ　（　Ｒ＝
ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３）　Ｇ！　ｙ’　＋　オニ−　ン
，　ヘ：／ジルＯ　Ｐ　Ｑ　（Ｒ＝ＣＨ２−０）はフェ
ニルアラニンを、２）はアスパラギンを、４−イミダゾ
リルメチルＯＰ　Ｑ　（Ｒ”ＣＨ（Ｊ）はヒスチジンを
、４−アミツブｆ　ルＯ　Ｐ　Ｑ　（Ｒ”（ＣＨ２）４
Ｎ）１２）　＆！　！Ｊ　シンヲ．　３−グアニジノプ
ロビルＯ　Ｐ　Ｑ　（Ｒ＝（ＣＨ２）３ＮＨ！！Ｎｌ（
２）はアルギニンを、メルカプトメチルＯ　Ｐ　Ｑ　（
Ｒ＝ＣＨ２Ｓｔ（）はシスティンをそれぞれ培養液に添
加することにより得られ、反応ＰＨとしてはＰＨ６〜９
が特に好ましい。

一方、ヒドロキシメチルＯ　Ｐ　Ｑ　（Ｒ＝Ｃ［（２０
Ｈ）は。

培養液にセリンを添加し，反応ｐＨを２〜６とすること
により得られ、最適なＰＨは４〜６である。反応ｐＨが
６を越えることにより、ＯＰＱ　（Ｒ＝Ｈ）が得られる
。

４−ヒドロキシベンジルＯＰＱ　（Ｒ＝Ｃ）！２ーΩー
ＯＨ）は、培養液にチロシンを添加し、反応ＰＨを４〜
８とすることにより得られ、最適なＰＨは６〜８である
。

反応ｐＨが８を越えることによりＯＰＱ　（Ｒ．Ｈ）が
得られる。

このようにして得られた反応生成液から、たとえば、濾
過もしくは遠心分離などの通常の固液分離手段によって
、菌体などの固形分を除去し，上澄液を得る。

ＰＨ２〜５などの低ＰＨでＯＰＱ類を生成させた場合、
生成されたＯＰＱ類が反応生成液中で沈澱物として存在
している場合もあるので、反応液および反応生成液のそ
れぞれのＰＨを中性乃至アルカリ性以上にし，生成され
たＯＰＱ類を一旦溶解させた後、上澄液を得る必要があ
る。得られた上澄液からＯＰＱ類が分離・回数される。

」上澄液からのＯＰＱ類の分離、精製には種々の方法が
用いられる。例えば沈澱法、洗浄法、限外濾過法，抽出
法およびＯＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いる方法等が
挙げられる。

これらの方法を単独あるいは組み合わせてＯＰＱ類を分
離、精製することができる。

ＯＰＱ類を分離精製する方法についてさらに具体的に説
明する。

沈澱法としては、たとえば、塩酸、硫酸および硝酸など
の無機酸ならびにトリクロロ酢酸、トリプルオロ＃酸お
よびトリフルオロメタンスルホン酸などの有機酸などに
より反応生成液を酸性として，ヒドロキシメチルＯＰＱ
類を沈澱させる酸性沈澱法、反応生成液に、塩化ナトリ
ウムおよび塩化カリウムなどのアルカリ金属塩，塩化カ
ルシウムおよび塩化マグネシウムなどのアルカリ土類金
属塩を添加してＯＰＱ類を沈澱させる塩析法または反応
生成液と、たとえば、アセトンなどのＯＰＱ類の溶解度
の低い溶媒とを混合し沈澱させる溶媒沈澱法などがある
。

これらの沈澱法においては、液温を低くする程、ＯＰＱ
類の回収率は向上する。

前記の沈澱法によって得られたＯＰＱ類の粉体、または
、ＯＰＱ類を含む沈澱物を，たとえば、アセトン、ジエ
チルエーテルおよび酸性の水のようなヒドロキシメチル
ＯＰＱ類を溶かしにくい溶剤で洗浄する洗浄法を適用す
ることにより、ヒドロキシメチルＯＰＱ類の純度をさら
に向上させることができる。

発酵法によるヒドロキシメチルＯＰＱ類の生産において
，培養液中の高分子の夾雑物を除く場合には、限外濾過
法を利用することができる。

限外濾過法として、セファデツクスＧ−１０　（商品名
、ファルマシア社製）およびトヨパールＨｖシリーズ（
商品名、東ソー製）などのゲル濾適用樹脂担体を用いる
方法あるいは各種限外渡過膜や限外減退中空糸を用いる
方法などを適用することができる。

抽出法に用いる抽出剤として、水および有機溶媒等が使
用される。有機溶剤としては、水との相溶性が小さい有
機溶剤が好ましく、たとえば、ｎ−ブタノールのような
炭素数４ａ１以上の脂肪族アルコールが好適に使用され
る。ＯＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いた方法では、Ｏ
ＰＱ類を吸着・脱離することのできる樹脂担体であれば
特に制限なく利泪できる。この樹脂担体の代表例として
、陰イオン交換樹脂担体では、多糖系担体のＤＥＡＥ−
セファデックス＾−２５（商品名、ファルマシア社製）
。

親水性ポリマー系樹脂のＤＥＡＥ−トヨパール６５０（
商品名、東ソー製）およびアンバーリスト＾−２１（商
品名、ローム・アンド・ハース社Ｗ）などがある。

また、吸着・分離型樹脂担体では、疎水性ポリマー系樹
脂のダイヤイオンＨＰシリーズ（商品名、三菱化成ＷＪ
）およびアンバーライトＸＡＤシリーズ（商品名、ロー
ム・アンド・ナース社製）などの他にシリカ、オクタデ
シルシリカおよびアルミナなどがある。＊水性クロマト
グラフィ用樹脂担体では。

ブチル−トヨパール６５０およびフェニル−トヨパール
６５０（東ソー製）などがある。

ＯＰＱ類の同定には、元素分析、核磁気共鳴スペクトル
、赤外吸取スペクトルおよび質量分析などの手段が用い
られる。

また、ＯＰＱ類の定量には、高速液体クロマトグラフィ
ーにより行うことが出来る。

［ＰＱＱおよびＯＰＱ類の急性毒性および腎毒性試験］ （１）急性毒性試験 ■５ＰＦ−ＩＣＲマウス　雄、５週＠（チャールズ　リ
バーＷりに、ＰＱＱ４ＮａおよびＯＰＱ類をマウスｌｋ
、当り２０．４０．８０．１６０および２００鮎のそれ
ぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。

ＯＰＱ類としては、ＯＰＱ、１−メチルプロピルＯＰＱ
、２−メチルチオエチルＯＰＱおよびベンジルＯＰＱを
用いた。なお、−群は８匹とした。その結果、Ｐ　Ｑ　
Ｑ　・２Ｎ　ａ　　２０Ｈ／ｋｇ投与および４０ｍｇ／
ｋｇ投与ではマウスは死亡しなかったが、８０吋投与で
５匹、１６０ｍｇ投与および２００＋ｏｇ投与で８匹全
部死亡した。

ＰＱＱ・２ＮａのＬＤ５゜は約７０＋ａｇ／ｋｇ？ウス
であった。

一方、ＯＰＱ類では全てのマウスが死亡しなかった。

■５ＰＦ−ＩＣＲ７ウス　雄、５週＠（チャールズ　リ
バー製）に、ＯＰＱをマウス１ｋｇ当り０．１ｇ、０．
２ｇ、０．４ｇ、０．８ｇあるいは１．２ｇのそれぞれ
を腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。なお、−
群は８匹とした。○ＰＱ０．１〜０．４ｇ投与ではすべ
てのマウスが死亡せず、０．８ｇでは２匹、１．２ｇで
は６匹が死亡した。ＬＤ、ｏは約１．０ｇ／ｋｇマウス
であった。

■５ＰＦ−ＩＣＲマウス　雄、５週１ｌｌ（チャールズ
　リバー製）に、ＯＰＱをマウス１ｋｇ当り１．０．．
１．５ｇあるいは２．０ｇをそれぞれ経口投与し、１４
日間、２５℃で飼育した。−群は８匹とした。

すべてのマウスは死亡しなかった。

■〜■の結果より、ＯＰＱ類はＰＱＱに比べて毒性が著
しく低下していた。

（２）腎毒性 ■尿検査による腎毒性 急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・２ＮａおよびＯＰ
Ｑ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。毎日、マウスの
尿を採取し、臨床検査試薬（商品名：ウリステックス■
、マイルス・三共Ｗ）を用いてグルコース濃度を調べた
。第１表に示すように、ＰＱＱ・２Ｎａを投与したマウ
スの尿からは糖が検出されたが、ＯＰＱ類を投与したマ
ウスの尿からは糖が検出されなかった。　すなわち、Ｐ
ＱＱは腎毒性が認められたが、ＯＰＱ類では腎毒性が認
められなかった。

（以下余白） ！！！１表（その１） ＩＩＩ表（その２） ■血液検査による腎毒性 （イ）急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・２Ｎａおよ
びＯＰＱ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。

投与１日後に絶食（水は与える）し、さらに１８時間後
に採血して血清を得た。血清中のグルコース、尿素態窒
素およびクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）を臨床
検査試薬（商品名二富士ドライケムスライド、富士写真
フィルム製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の
平均値で示した。

結果をＩ！２表に示す。

ＰＱＱ・２Ｎａ投与では、グルコースの大幅な減少、尿
素態窒素およびクレアチニンの大幅な増加がみられ、腎
毒性が認められた。これに対してＯＰＱ類投与では、グ
ルコース、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの
含有量は「無投与」の場合と大差なかった。

（以下余白） 第２表 （その１） ＩＩ２表 （その２） （ＩＩ）急性毒性試験と同様にして、ＯＰＱを１５０■
、３００■ｇ、４００膳ｇあるいはｅｏｏ吐八ｇへ腔投
与し、マウスを１日飼育した。

その後、絶食（水は与える）し、さらに１８時間後に採
血して血清を得た。血清中のグルコース、尿素態窒素お
よびクレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）を臨床検査
試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィ
ルム製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均
値で示した。

結果を第３表に示す。

ＯＰＱのいずれの投与量でも、グルコース、尿素態窒素
およびクレアチニンのそれぞれの蓄積量は「無投与」の
場合と大差はなかった。

第３表 ■■の結果より、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＯＰ
Ｑ類は腎毒性が認められなかった。

［実施例］ 以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ 純水ＩＱあたりに、（Ｎｌ（４）２３０４３ｇ、　Ｋ）
１２ＰＯ４１−４ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４２，１ｇ、　Ｍ
ｇＳＯ４・７１（２００，２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０
３０ｍｇ−Ｆｅ２Ｈ２Ｏ３０°ＸＨ２Ｏ３０Ｂ、　Ｍｎ
Ｃｌ２・４）１２０５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０５ｍ
ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，５１１ｇ、チアミン塩酸
塩４町、パントテン酸カルシウム４ｍｇ、ビオチン２０
μｇおよびメタノール１２ｍＱを溶解し、ｐＨが７．１
に調整された液２００赫を１２容三角フラスコに入れ、
１２０℃で２０分間滅菌し、これを培地とした。

これに前記と同様な培地を用いて３０℃で２日間前培養
された各種菌株（第４表に示す）の培養液をそれぞれ１
容量％接種し、３０℃で回転振盪培養を行なって、培養
開始３日後に培養液を得た。

これらの培養液をそれぞれ２等分し、一方にはグリシン
を０．３ｇ／　Ｑとなるよう添加し、ＰＨ８，５にＩＷ
し、２４時間、３０℃で回転振盪してＯＰＱ生成液を得
た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４ｒ：／　Ｑとな
るよう添加し、ｐＨ４，０に調整し、３０℃で２４時間
、回転振盪して反応を行い、ヒドロキシメチル○？Ｑ生
成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液
を得、その中に含まれているＯＰＱ類量を測定した。

結果を第４表に示す。

なお、ＯＰＱ！ｉｊｌは、高速液体クロマトグラフで求
めた（以下の実施例でも同様）。

機器：島津製作所製高速液体クロマトグラフカラム：　
ＹＭＣＯＤＳ　　Ａ−３０２（４，６ｍｍφＸ　１５０
ｍｍ） 展開液：　０．ＩＭ　Ｋ１２ＰＯ４，０，１Ｍ　）Ｉｃ
ＩＯ，／ＣＨ，ＣＮ　：　Ｈ２０＝　１：９　　（ｐＨ
２，５） 流速：１．５ｄ／謹ｉｎ 検出器：島津５ＰＤ−６ＡＶ ［ＩＶ−ＶＩＳ検出器（２５９ｎｉおよび４２０ｎｍ）
１１４表（その１） 第４ａ（その２） １１４表（その３） 実施例２ 純水１ｇあたり、（ＮＨ４）２５０４３ｇ、　Ｋｆ（２
Ｐ０４４ｇ、　Ｍｇ５０４・７Ｈ２００−２Ｋ、ＣａＣ
ｌ２４Ｈ２０３０１３；、　ＦｅＣ６ｆ（５０ｆＸ８２
０３０ｍｇ、ＭｎＣｌ２−４Ｈ２０５＋＊ｇ；、　Ｚｎ
ＳＯ４・７）１２０５１Ｋ、ＣｕＳＯ２・５Ｈ２００，
５＋ｇｇ、パントテン酸カルシウム４１Ｋ、およびメタ
ノール１２ａ＋Ｑを溶解し、ｐｉ（が４．５に調整され
た培地を使用した以外は実施例１と同様にして、アシド
モナスメタノリカ　ＪＣＭ　ｅ８９１を３日間培養し、
培養液を得た。

この培養液を三等分し、一方には、モノメチルアミン塩
酸塩を０．３ｉ／　Ｑとなるよう添加し、　ｐｉ（８゜
５に調整し、２４時間３０℃で攪拌してＯＰＱ反応生成
液を得た。

残り一方には、Ｌ−セリンを０．４ｇｉとなるよう添加
し、Ｐ）１４．０に調整し、　３０℃で２４時間、回転
振盪して反応を行い、ヒドロキシメチルＯＰＱ生成液を
得た。

これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中
に含まれるＯＰＱ類量を測定した。結果を１１５表に示
す。

実施例３ 純水１１２あたりに、　（ＮＨ４）２Ｓ０４３ｇ、　Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１，４ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４２，１ｚ、Ｍｇ
ＳＯ４・７８２００．２ｇ、　ＣａＣｌ２・２２Ｈ２Ｏ
３（ｈ、　ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ□・ＸＨ２Ｏ３０ｍｇ、　Ｍ
ｎＣｌ２−４８２０５ｍｇ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０５
Ｈ，ＣｕＳＯ４・５）１２０　０．５ｍｇ、ビオチン２
０μｇおよびメタノール１２−を溶解し、１２０℃で２
０分間殺菌し、その後に、Ｎａ２ＣＯ３ｉｏ重量％水溶
液を無菌的に加え、Ｐ）Ｉが９．０に調整された培地を
使用した以外は、実施例１と同様にしてバラコツカスア
ルカリフィルスＪＣＭ７３６４を３日間培養し、培養液
を得た。この培養液を三等分し、一方には、Ｌ−セリン
を０．４ｇ／９となるよう添加し、ＰＦ１８．５に調整
し、３０℃で２４時間攪拌して、　ＯＰＱ反応生成液を
得た。

残り一方には、Ｌ−セリンを０．４ｇ／　Ｒとなるよう
添加し、ｐＨ４，０に調整し、３０℃で２４時間攪拌し
てヒドロキシメチルＯＰＱ生成液を得た。

これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中
に含まれるＱＰＱ類を測定した。結果を第５表に示す。

実施例４ 海水ＩＱあたりに、　（ＮＨ４）２５０４３．０ｇ、　
Ｋ１２ＰＯ４Ｌ４ｇ、Ｎａ２ＨＰ０４２．１ｇ、　８ｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ、　ＣａＣｌ２−２８２０　
３０Ｈ，ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ，４８２０３（ｈｇ、　　Ｎｎ
Ｃ１２・４Ｈ２０５ｍｇ、　ＺｎＳＯ４４Ｈ２０５ｍ（
、Ｃｕ５Ｏ（５Ｂ２００．５ｍｇ、メタノール１２−を
溶解し、　ｐＨが７．１に調整された培地を使用した以
外は、実施例１と同様にして、メチロファーガ属細菌を
３日間培養し、培養液を得た。

この培養液を三等分し、一方には、Ｌ−スレオニンを０
．５ｇ／　＄１となるよう添加し、ＰＨ８，５に調整し
、３０℃で２４時間攪拌して○ＰＱ反応生成液を得た。

残り一方には、Ｄ−セリンを０．４ｇＩＱとなるよう添
加し、ＰＨ４，０に調整し、３０℃で２４時間攪拌して
ヒドロキシメチルＯＰＱ生成液を得た。

これらの反応生成液を遠心分離して、上澄液を得、その
中に含まれるＯＰＱ類を測定した。

結果を第５表に示す。

（以下余白） １ｇ５表 実施例５ 純水ＩＱあたりに、（ＮＨ４）２５０４３．０ｇ−ＫＨ
２ＰＯ４１，４ｇ、　Ｎａ２ＨＰＯ４２，１ｇ、　Ｎｇ
ＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ、　ＣａＣｌ２・２Ｈ２０３
０ｍｇ、ＦｅＣ６Ｈ５０７４Ｈ２０３０ｍｇ、　ＭｎＣ
ｌ２１Ｈ２０５ｍｇ、　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０Ｓｔａｇ
、　ＣｕＳＯ４−５）１２００−５ｍｇおよびメタノー
ル８−を溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２０〇−
を１９容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌
し、これを培地とした。

これに　ハイホミクロビウム　プルガレ　ＮＣＩＢ９７
７５を接種し、３０℃でロータリーシェーカーで回転数
２２０回／分の回転振盪培養して得られた。この培養液
を種母液とした。

純水１２あたりに、（ＮＨ４）２５０４１．０ｇ、　Ｎ
ｇＳＯ＜・７Ｈ２０１、Ｏｇ、　Ｋ１２ＰＯ４１，４ｇ
を溶解した培地１５Ｑを３０２容培養槽に入れ、滅菌し
た。

純水１０−あたりに、ＦｅＳＯ４−７Ｂ２０１５ｍｇｇ
、　ＺｎＳＯ４−７Ｈ２０１５０ｍｇ、ＣａＣｌ２・２
Ｈ２０１５０Ｈ，ＮａＣ１１５０ｍｇ、ＨｎＳＯ４・４
〜５Ｈ２０４５ｍｇ、　Ｈ２ＢＯ３３Ｂ、Ｃｕ５Ｏ（５
８２０ｉ。

５　ｍｇ、ＣｏＣ１□・２８２０１．５ｍｇ、　ＫＩ　
１．５ｍｇ、　（ＮＨ４）６ＭＯ７０２、・４８２０１
．５Ｂを溶解したミネラル溶液を殺菌した。

３０Ｑ容培養槽の温度が３０℃に低下した後、槽内の培
地に、このミネラル溶液ＩＯ−を無菌的に加え。

さらにアンモニア水を無菌的に添加して、培養液のＰＨ
を６．８に調整した。

この培養槽内に、メタノールを１５０−および前記の種
母液２００−を無菌的に加え、通気量１０１ｉｔ／ｓｉ
ｎ、回転数３００回／分で攪拌しつつ温度３０℃、培養
液ＰＨを６．８になるようにアンモニア水を添加しなが
ら培養した。

細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノール濃度が
低下したが、排気ガス中のメタノールをガスクロマトグ
ラフィーで分析することにより検出し、培養液中のメタ
ノール濃度が０．１〜０．５重量％になるようにメタノ
ールを補充した。

このような方法により、７基の３０Ｑ容培養槽で１０日
間培養し、各々の培養槽内の培養液に（１）グ’）シン
９０ｇ、　　（２）　Ｌ−セ’）ン１２０ｇ、（３）Ｄ
−セ’）　：／　　１２０ｇ、（４）　Ｌ−スレｔ：−
ン１５０ｇ、（５）Ｄ−スレオニン　１５０ｇ、　　（
６）Ｌ−プロリン　１５０ｇ、　　（７）　Ｄ−プＯ’
）ン１５０ｇ、（８）　Ｌ−チロシン　２１０ｇ、　　
（９）　Ｄ−チロシン　２１０ｇ、（１０）Ｌ−トリプ
トファン　２４０ｇ、　　（１１）　Ｄ−トリプトファ
ン　２４０ｇ８よび（１２）モノメチルアミン塩酸塩７
５ｇをそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．５になるよ
うに調節しながらさらに２４時間反応を行って反応生成
液を得た。

反応生成液中のＯＰＱの蓄積量を第６表に示す。

第６表 実施例６ 菌株として、ハイホミクロビウム　メチロボラム　ＤＳ
Ｍ　　１８６９　　を使用した以外は、実施例５と同様
にして、７基の３０Ｑ容培養槽でＩＯ日間培養した培養
液に、グリシンを（１）　４．５ｇ、　　（２）　９．
０ｇ、（３）　１５．０ｇ、　　（４）　４５ｇ、　（
５）　７５ｇ、　（６）　１５０．および（７）　２２
５ｇをそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．０になるよ
うに調節しながらさらに５時間培養を行って反応生成液
を得た。

反応生成液中ＯＰＱ蓄積量を第７表に示す。

１Ｊ７表 実施例７ 実施例６と同様にして、ハイホミクロビウムメチロボラ
ム　ＤＳＭ　　１８６９の培養を８基の３０２容培養槽
で１０日間行なった。

その後、各々の培養槽の培養液のｐＨを（１）　ｐ）Ｉ
３．０、（２）　ｐ）１４．０、（３）　ｐＨ５，０、
（４）　ｐＨ６，０、（５）ｐＨ７，０、（６）　ｐＨ
８，０、（７）　ｐＨ９，０および（８）ｐ）１１０．
０とし、グリシン３０ｇを各々の培養槽中の培養液に添
加し、さらに３時間反応を行フて反応生成液を得た。

各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた
上澄液中の０ＰＱｊｉおよび前記（１）〜（５）につい
て、反応生成液のｐＨを８．５に調整した後に遠心分離
して得られた上澄液中のＯＰＱ量をそれぞれ第８表に示
す。

第８表 実施例８ 実施例６と同様にして、ハイホミクロビウムメチロボラ
ム　ＤＳＭ　　１８６９の培養を８基の３０２容培養槽
でｌＯ日間行なった。

その後、各々の培養槽の反応液のｐＨを（１）　ｐＦｆ
２゜０、（２）　ｐｌ（３，０、（３）　ｐＨ４，０、
（４）ＰＨ５，０、（５）ｐＨ６，０、（６）　ｐＨ７
，０、（７）　ＰＨ８，０、（８）　ｐＨ９，０（９）
　ｐｉ（１０，０とし、Ｌ−セリン　４２ｇを各々の培
養槽中の培養液に添加し、５時間反応を行って反応生成
液を得た。

各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた
分離液中のＯＰＱおよびヒドロキシメチル０ＰＱｔなら
びに反応生成液のＰＨを８．５に調整した後、遠心分離
した場合の分離液中のＯＰＱおよびヒドロキシメチルＯ
ＰＱ量を第９表（１）　　（２）に示す。

（以下余白） 第９表（１） 第９表（２） 実施例９ 実施例６と同様にして、ハイホミクロビウムメチロボラ
ム　ＤＳＭ　　１８８９の培養を４基の３０ｆｌ容培養
槽で１０日間行なった。

その後、各々の培養槽内の培養液の温度を（１）２０℃
、　（２）　３０℃、　（３）　４０’Ｃ１（４）　５
０’Ｃ１（５）７０℃とし、Ｌ−スレオニン　４８．を
各々の培養槽内の培養液に添加し、培養液のＰＨを８．
０に調整しながら５時間反応を行って反応生成液を得た
。

反応生成液の０ＰＱＩＦ積量を！１０表に示す。

Ｉ［１０表 実施例１０ 実施例６と同様にして、メチロバチルス　グリコゲネス
　ＦＥＲＮ　Ｐ−２２４７を培養した。培養開始４日目
の培養液に、モノメチルアミン塩ｆｌｌ＠　　２７ｇを
添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながらさらに６
時間培養を続けて反応生成液を得た。

反応生成液のＯＰＱの蓄積量は、　２２０ｍｇ／　Ｑで
あった。

実施例１１ 実施例６と同様にして、パラコツカス　デニトリフィカ
ンス　＾ＴＣＣ１９３６７を培養した。

培養開始１００日目培養液に、Ｄ−セリン　４２ｇを添
加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら反応を６時
間行って反応生成液を得た。

反応生成液のＯＰＱの蓄積量は、１４０ａ＋ｇ／　Ｑで
あった。

実施例１２ 培地に使用する水として、海水を用いた他は、実施例６
と同様にして、メチロファーガ　サラシカ　＾ＴＣＣ３
３１４６を培養した。培養開始１００日目培養液に、Ｄ
−スレオニン　４８ｇを添加し、培養液のＰＨを８．０
に調整しながら反応を６時間行って反応生成液を得た。

反応生成液のＯＰＱの蓄積量は１６３　　ｍに／Ｑであ
った。

実施例１３ 純水ＩＱあたりに、（Ｎ）Ｉ４）　２Ｓｏ４３ｇ、　Ｋ
Ｈ２ＰＯ４１，４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ｚ、ｉｇ、８１５
０４’７Ｈ２００，２ｚ−ＣａＣｌ２−２８２０３０ｍ
ｇｇ、　ＦｅＣ６Ｈ５０７・）１２０３０ｍｇｇ、Ｍｎ
Ｃｌ２・４）１２０　Ｓｔａｇ、Ｚｎ５Ｏ４−ｌＨ２Ｏ
５ｍｇ、　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，５Ｂおよびメタノ
ール１２−を溶解し、　ＰＨが７．１に調整された液２
００−を１２容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分
間殺菌し、これを培地とした。

これにハイホミクロビウム　プルガレ　ＮＣＩＢ９７７
５を接種し、３０℃でロータリーシェーカーで回転数２
２０回／分の回転振盪培養によって得られた培養液を種
母液とした。

純水ＩＱあたりに、（ＮＨ４）２５０４１ｇ、　ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２０Ｉｇ、　ＫＨ２Ｐ０．１．４．を添加し
た培地１５２を３０１２容培養槽に入れ、滅菌した。

純水ｌＯ−あたりに、Ｐｅ５０４・ｌＨ２Ｏ１５ｇｇ、
ＺｎＳＯ４−７ｆ（２０Ｉ５０ｍｚ、　ＣａＣｌ２・２
Ｈ２０１５０町、ＮａＣ１１５０ｍｇ、　Ｍｎ５０４１
〜５Ｈ２０４５ｍｇ、　Ｈ２ＢＯ３３Ｂ、　ＣｕＳＯ４
・５Ｈ２０１，５ｍｇ、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２０１，５ｍ
（、ＫＩ　　１．５Ｂ、　（Ｎ）１４）６Ｍｏ７０２４
・４８２０１．５ｍｇを溶解したミネラル溶液を滅菌し
た。

３０Ｑ容培養槽の温度が３０℃に低下した後、前記の槽
内の培地にこのミネラル溶液１０ｄを無菌的に加え、さ
らにアンモニア水を無菌的に添加して。

培養液のＰＨを６．８に調整した。

この培養槽内に、メタノールを１５０−および前記の種
母液２００−を無菌的に加え１通気量１０９／分、回転
数３００回／分で攪拌しつつ、温度３０℃、アンモニア
水を添加しながら培養液のＰＩ（を６．８に維持しなが
ら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタ
ノール濃度が低下したが、それを排気ガス中のメタノー
ルをガスクロマトグラフィーで分析することにより検出
し、この低下分に相当する量のメタノールを補充して培
養液中のメタノール濃度を０．１〜０．５重量％に維持
した。

このような方法により、２台の３０Ｑ容培養槽で１０日
間培養し、各々の培養槽内の培養液のＰＨを塩酸で４．
０に調整したのち、　（１）　Ｌ−セリン　１２０ｇ／
１５１ｔおよび（２）Ｄ−セリン　１２０ｇ／１５Ｑと
なるよう、それぞれ添加し、空気で通気攪拌しつつ。

培養液のｐ）Ｉを４．０になるように調節しながら、３
０℃で２４時間反応を行なって反応生成液を得た。

反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、
上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒドロキシメチル○
ＰＱの蓄積量を第１１表に示す。

第１１表 実施例１４ 菌株として、ハイホミクロビウム　メチロボラム　ＤＳ
Ｍ　１８６９を使用した以外は、実施例１３と同様にし
て、３０１２容培養槽で１０日間培養し、その後。

培養液のｐＨを４．０に調整し、Ｌ−セリンを４２ｇ添
加し、反応を行なった。

Ｌ−セリンを添加した後、各時間毎に反応生成液を採取
し、ｐＨ７に調整した後遠心分離し、その反応生成液に
含まれるヒドロキシメチルＯＰＱ量を測定した。

その結果をＩ！１２表に示す。

１！１２表 実施例１５ 菌株を変更した以外は、実施例１３と同様にして、メチ
ロバチルス　グリコゲネス　ＦＥＢ？Ｉ　Ｐ−２２４７
の培養を３０９容培養槽で４日間行なった。

その後、培養槽中の培養液のＰＲを４．５に調整し。

Ｌ−セリン４２ｇを添加し、６時間反応を行ない、反応
生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後
、遠心分離し、上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒド
ロキシメチルＯＰＱの蓄積量は、ＩＱあたり２００ｍｇ
であった。

実施例１６ 菌株を変更した以外は実施例１３と同様にして、パラコ
ンカス　デニトリフィカンス　ＡＴＣＣ１９３６７の培
養を３０９容培養槽で１０日間培養した。

その後、培養槽中の培養液のＰＨを６．０に調整し、Ｄ
−セリン４２ｇを添加し、６時間反応を行ない、反応生
成液を得た。ヒドロキシメチル○ＰＱの蓄積量は、反応
生成液１９あたり１１０ｍｇであった。

実施例１７ 菌株を変更し、培地に使用する水として海水を用いた他
は、実施例１３と同様にして、メチロファーガ　サラシ
カ　ＡＴＣＣ３３１４８を３０１２容培養槽で１０日間
培養した。

その後、培養槽中の反応液のＰＨを４．０に調整し、Ｄ
Ｌ−セリン４２ｇを添加して、空気で通気攪拌しながら
３０℃で６時間反応を行なって、反応生成液を得た。反
応生成液のＰＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上
澄液を得た。その上澄液中に含まれるヒドロキシメチル
ＯＰＱの蓄積量はＩＱ当たり１４２礼であった。

実施例１８ 実施例１４と同様にして、ハイホミクロビウムメチロボ
ラム　ＤＳＭ　１８６９の培養を３０Ｑ容培養槽を用い
て行い、培養液１５Ｑを得た。この培養液を各々２００
−づつを１２容三角フラスコに入れ、各種アミノ酸を０
．６ｇづつ添加し、ＮａＯＨあるいはＨＣＩを用いてｐ
Ｈ４，７あるいは９とし、３０℃で振盪させながら２４
時間反応を行って反応生成液を得た。

各フラスコの反応生成液のｐＨを７．０に調整した後に
遠心分離して得られた上澄液中の０ＰＱＩ［ＩＦ積量を
それぞれＷ＃１３表に示す。

（以下余白） 第１３表 Ｘ−０ＰＱ　：それぞれの添加アミノ酸に対応するＯＰ
Ｑ類を示し、 具体的な対応は次の表の通りで ある。

添加アミノ酸と対応するＸ−０ＰＱ 実施例１９ 実施例１８で用いたＰＱＱ含有培養液と同じ培養液を各
々２０Ｍづつ１２個のＩＱ容三角フラスコに入れた。

各々のフラスコに、し−スレオニン、し−チロシン、Ｌ
−セゾンあるいはＬ−システィンを各々０．６ｇづつ添
加し、ＮａＯＨあるいはＨＣＩを用いてｐＨを４．７あ
るいは９とし、３０℃で振盪させながら２４時間反応を
行って反応生成液を得た。

各フラスコの反応生成液のｐｌ（を７．０に調整した後
に、遠心分離して得られた上澄液中のＯＰ　ＱＩ［ＩＦ
積量をそれぞれ第１４表に示す。

各々の反応液中には、各々のアミノ酸に対応する。ＰＱ
類の他に、ＯＰＱも存在した。

（以下余白） 第１４表 Ｘ−０ＰＱ　： それぞれの添加アミノ酸に対応するＯＰＱ類を示し、具
体的な対応は次の表の通りである。

添加アミノ酸と対応するＸ−ＯＰＱ 実施例２０ 実施例９のうち培養槽内の培養液の温度を３０℃として
得たＯＰＱ含有反応液を１２，０ＯＯＸＪ：で２０分間
遠心分離した上澄液を用いてＯＰＱの回収実験を行った
。

各々５０ｄづつをＨＣＩを用いて、ｐ）ｌ　７．２．６
．５．５．７．５．０．４．７．４．２．３．７．３．
１．２．６．２．１．１．５および１．０に調整し、室
温で４時間放置後、１２．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分
離し、ＯＰＱを沈澱として回収した。

上澄液中に残存するＯＰＱを高速液体クロマトで分析し
た結果を第１５表に示す。ＯＰＱはｐＨ４以下で沈澱と
して回収できることがわかる。

（以下余白） 第１５表 ［発明の効果コ 本発明により、細菌を使用して得られたＰＱＱを含有す
る培養液からＰＱＱを分離・回収・精製することなくオ
キサゾピロロキノリン類を容易にかつ安定的に得ること
が可能である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. メタノールを炭素源とする培地中でピロロキノリンキノ
   ンを生産する能力を有する細菌を培養してピロロキノリ
   ンキノンを含有する培養液を得、該培養液に各種アミノ
   酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも１種
   を添加し、該培養液中のピロロキノリンキノンを酸素の
   存在下でオキサゾピロロキノリン類に変化させることを
   特徴とするオキサゾピロロキノリン類の製造法。