JP2000516202A

JP2000516202A - セリン・プロテアーゼ阻害剤

Info

Publication number: JP2000516202A
Application number: JP10503897A
Authority: JP
Inventors: デッドマン，ジョン・ジョゼフ; エレジェンディ，セッド; グリーン，ドノバン; スコルダラケス，エマニュエル; スカリー，マイケル・フィンバー; グッドウィン，クリストファー・アンドリュー; カカー，ビジャイ・ビール
Original assignee: Trigen Ltd
Current assignee: Trigen Ltd
Priority date: 1996-06-29
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2000-12-05
Also published as: AU729393C; WO1998000442A1; CA2258634A1; NZ333390A; AU729393B2; KR20000022350A; CN1223664A; GB9613719D0; AU3042597A; EP0935611A1

Abstract

(57)【要約】二重機能性セリン・プロテアーゼおよびホウ素含有ペプチドの製法が提供される。セリン・プロテアーゼ阻害剤は、セリン・プロテアーゼの活性部位に結合し、それを阻害する触媒的部位指向部分、およびコネクター部分により連結した外部位関連部分を含む。触媒的部位指向部分と外部位関連部分とは、セリン・プロテアーゼ分子に同時に結合し得る。

Description

【発明の詳細な説明】セリン・プロテアーゼ阻害剤本発明は、セリン・プロテアーゼ阻害剤および基質に関すると共に、それら化合物の合成およびホウ素含有化合物合成のための方法および材料に関する。セリン・プロテアーゼ阻害剤の調節あるいは阻害は、とりわけ血栓症の防止に有用である。セリン・プロテアーゼ族酵素は、酵素の活性部位におけるAsp-His-Ser残基の三連が関与するメカニズムによってペプチド化学結合を開裂する。セリン・プロテアーゼ阻害剤は、三連と相互反応する官能基を使用し、それによって酵素基質の活性をブロックするように設計されている。一つの標的プロテアーゼに選択的な阻害剤をつくることが望ましい。ペプチド阻害剤に関する先行技術の論文は、本願と同日に出願された英国特許出願、標題「トロンビン阻害剤」およびPCT／GB9 ６／００３５２に記載されている。この標題「トロンビン阻害剤」の特許出願明細書のコピーを本願と共に提出する。この特許出願書の内容は、標題「トロンビン阻害剤」なる特許出願の主題を含み、技術者がこの明細書に関連する各種先行文献と共に参考にすることができよう。この「トロンビン阻害剤」の明細書は、本特許明細書の物理的な一部分をなすものではない。セリン・プロテアーゼのなかに、基質のアニオン部分と結合するための第２部位すなわち“外部位”を持つものがあることは知られている。この外部位は、しばしばアニオン結合外部位(“ＡＢＥ”)とよばれる。セリン・プロテアーゼ基質切断結合のカルボニル基を提供するアミノ酸残基を “P1”で表わす。P1残基のＮ−末端側に存在する連続アミノ酸残基をP2、P3、P4 等で表わし、P1残基のＣ−末端側に存在するアミノ酸残基をP1’、P2’、P3’等で表わす。フィブリノーゲンにおいて、Ｐ１’はグリシンであり、Ｐ２’はプロリンである。プロテアーゼはＰ１アミノ酸の側鎖を認識する“特異性ポケット” を含む。トリプシン様プロテアーゼは、通常はアルギニン様あるいはセリン様の側鎖を有するP1残基を認識する。本発明は新規の二重機能性セリン・プロテアーゼ阻害剤を提供する。その阻害剤は、 (ａ)セリン・プロテアーゼの活性部位に結合し、それを阻害する触媒的部位指向部分(ＣＳＤＭ)； (ｂ)外部位関連部分(ＥＡＭ)；および、場合によって、 (ｃ)ＥＡＭとＣＳＤＭを結合するコネクター部分を含む。ＣＳＤＭおよびＥＡＭはセリン・プロテアーゼの分子と同時に結合できる。阻害剤の一つの部類では、セリン・プロテアーゼはトロンビンではない。セリン・プロテアーゼはトリプシン様のプロテアーゼが好ましい。とにかく、この阻害剤は、コネクター部分がＣＳＤＭにそのC−末伸張として結合するトロンビン阻害剤を含有しない、すなわち米国特許第5196404およびこれに対応する国際特許出願第WO91／02750で開示されている化合物ではない。本発明の別の実施態様は、ホウ素含有ペプチドの新規製造法の提供である。本明細書で使用する“天然”アミノ酸はタンパク質に見出される20種の普通のすなわち“標準”α−アミノ酸の一つから選出されるL−アミノ酸(またはその残基)を意味する。 “非天然”アミノ酸は、20種の“標準”アミノ酸以外のすべてのα−アミノ酸 (またはその残基)を意味する。したがって、“非天然”アミノ酸は、天然アミノ酸のD−異性体および側鎖保護基を有するアミノ酸を含む。接頭語“D”および“L”は、それぞれDまたはL型配置の天然アミノ酸を普通に示すのに使用する。接頭語“D、L”はラセミ混合物を示し、それら接頭文字のない場合は、別記しない限り残基がL型配置である例を除き、アミノ酸がD型または L型配置のどちらでもあり得ることを示す。文中でD型配置かL型配置かどちらでもあり得る非特定の基の場合は、L型配置が好ましい。接頭語“ボロ(boro)”ではじまる略語および術語は、末端カルボキシ基−CO₂H がホウ素官能基で置換されたアミノ酸を表わす。図面の簡単な説明図1は、メリフィールド樹脂のフーリエ変換赤外線分光法(F．t.-I．R．)スぺクトルである。図2は、同樹脂のナトリウム2、2−ジメチル−1、3−ジオキソラン−4−メタノール酸との反応後のF．t.-I．R．スペクトルである。図3は、ジオキソランのヒドロキシ基脱保護をＨＣｌで処置した後の反応樹脂のF．t.-I．R．スペクトルである。図4は、フェニルホウ酸との反応後の脱保護樹脂のF．t.-I．R．スペクトルである。ここで発明性のある化合物および方法をより詳細に考察する。触媒的部位指向部分(ＣＳＤＭ) 触媒的部位指向部分(ＣＳＤＭ)は、セリン・プロテアーゼ酵素の触媒的部位に結合して、その部位を不活性化する。ＣＳＤＭの構造は本発明にとって重要ではない。それは、セリン・プロテアーゼ触媒的部位についての既知の阻害剤のいかなるアミノ酸配列をも含み得る。例えば、ＣＳＤＭの一つの部類は下記式Ｉに含まれる： X−(aa⁴)_m−(aa³)_n−(aa²)−(aa¹)−Z （Ｉ）式中、aa¹、aa²、aa³は天然または非天然酸残基を表わし、(ａａ⁴)_mはａａ³のアミノ基に連結した１以上の任意のアミノ酸残基を表わす。それと代って、１以上のaa基はアミノ酸残基の類似体で、その中でα−水素が置換基によって取って代わる。アミノ酸の配列および／またはアミノ酸類似体はセリン・プロテアーゼの活性部位に結合する。適切な配列を本明細書で後述する。XはHまたはN末アミノ基上の置換基を表わす。Zは例えば業界公知の−COOHまたはC末伸張基(カルボキシ置換基)である。好ましい化合物において、Zは、ヘテロ原子酸基であって、例えば、−B(OH)₂、−P(OH)₂、またはPO(OH)₂、またはその誘導体、例えばカルボキシル酸エステル、ジオキソ−ボロネート［−B(O置換基)₂］またはホスフェート［−PO(O置換基)₂］またはBF₂である。好ましいヘテロ原子類似体基は−B(O H)₂および−P(O)(OH)₂であり、あまり好ましくないヘテロ原子類似体基はS(O)₂O Hである。この他で考えられるZ基を挙げると、−CN、−COCH₂Cl、−COCH₂Fである。好ましい実施態様において、mは0から7であり、もっと通常の値は0から5で、例えば１または２、とくに0である。通常はn=1である。化合物の一つの部類において、(aa²)−(aa¹)天然ペプチド結合は他の結合(Ψ) によって置換される。それに加えて、あるいはそれに代わって、他の天然ペプチド結合はまた別の結合によって置換され得る。セリン・プロテアーゼの触媒的部位阻害剤は業界で公知である。セリン・プロテアーゼ阻害剤すなわち触媒的部位セリン・プロテアーゼ阻害剤に関する簡単な総説は、EP−B−145441に記載されており、この特許はC末ホウ素基を有するセリン・プロテアーゼの一つの類を開示している。その他に、セリン・プロテアーゼ阻害剤を記述する特許明細書は、EP 293881、EP 471651(US 5288707に相当)、EP 235692、US 4963655、WO 89／09612(特に、[TF：VII／VIIa]錯体におけるVII／ VIIａ因子の阻害剤に関する)などを含む。トリプシン様酵素の阻害剤について、ＣＳＤＭのP1残基の好ましい類は、(ｉ) Ａｒｇ、Ｌｙｓおよびそれらの類似体、(ii)疎水性残基であり、トロンビンおよびその他のトリプシン様酵素について好ましいＰ１基に関しては、更に標題「トロンビン阻害剤」の前記明細書およびPCT／GB96／00352に掲載されている。キモトリプシン様セリン・プロテアーゼは、フェニルアラニン類似体およびアラニン類似体の側鎖をP1残基上に有するＣＳＤＭに優先的に結合する。下記の表Aは、８つの特定のセリン・プロテアーゼについて最も好ましい(P4)P3P2残基を示す。それぞれの場合において、好ましいアミノ酸はその類似体で置換され得る。外部位関連部分(ＥＡＭ) 外部位関連部分(ＥＡＭ)は、セリン・プロテアーゼの外部位(ABE)と結合する部分である。トロンビンは明確に特定できる外部位を有し、それに対しトロンビン開裂部位のフィブリノゲン・アミノ酸配列c−末に加えて、ヒルジンのようなトロンビン非基質リガンドが結合する。Hir^53-64のようなヒルジン配列は“ヒルログ”という名の二重機能性ペプチドで使用される。ヒルログに関しては、US 5 196404に記載されており、更に、トロンビンＥＡＭの総説は前記の標題「トロンビン阻害剤」ＵＫ特許出願に述べられている。トロンビンについてのＥＡＭは、しばしば“アニオン結合外部位関連部分(ABEAM)”と呼ばれる。 FXa(Padmanabhan K et al，“Structure of Human Des(1-45)Factor Xa at2.2 Å Resolution”Ｊ Mol．Biol 1993，232，947-966)の結晶構造から推論できることは、8つの酸性残基を含む配列35〜41および70〜81がカオチン結合外部位を構成するということである。天然ボリペプチド阻害剤アンチスタシンおよびギランテンは、電気陽性カチオン外部位関連配列¹⁰⁸CRPKRKLIPR¹¹⁷および¹⁰⁸CKPKRKL VPR¹¹⁷をそれぞれ含む。 P'部位(開裂点でC端末)におけるセリン・プロテアーゼ相互作用は、P部位における相互作用と同様に特異性にとって重要であることは明らかである(例えば、D ing，L.；Coombs，G．S.；Strandberg，L.；Navre，M.；Coreyu，D.R．and Madi son，E.L．Origins of the Specificity of Tissue-type Plasminogen Activato r，Proc．Natl．Acad．Sci，1995，92，7627-7631)。ライブラリー・スクリーニングで迅速に用いられるように、より大きなリガンドで両部位のスパンを比較する必要がある。Lawsonが最近(1992年)に発表したところによると、P'およひP結合ユニットを十分に含むペプチド配列をスクリーニングすることにより、存在する基質が無感応すぎるFvlla／TF活性の検出を行うことができる。ペプチド・ライブラリーはさまざまな利用(例えば、Eichler,1994)において生物学的活性のスクリーニングに大きい効力を示し、本発明にとっても有用である。本発明では、以下のように他のセリン・プロテイナーゼ基質の開裂点へのＣ末端配列がＥＡＭを形成することを考察する。コネクター部分本発明の化合物はＣＳＤＭとＥＡＭとを相互連結するコネクター部分を含み、そのコネクター部分はＣＳＤＭおよびＥＡＭをそれぞれのセリン・プロテアーゼ阻害剤の分子に同時に結合させる。トロンビンの場合、コネクター部分はＣＳＤＭに、Ｎ末伸張として、あるいはその側鎖としてまたはそれを介して結合する。コネクター部分はＣＳＤＭに、C末伸張としてまたはN末伸張として、あるいはその側鎖としてまたはそれを介して、結合し得る。しかし、化合物がトロンビン阻害剤であると、コネクター部分はＣＳＤＭのC末伸張であり得ない。特に、もしコネクター部分がＣＳＤＭのＮ末伸張であるか、あるいはその側鎖に含まれると、好ましくはコネクター部分は少なくとも2個の隣接Gly残基を、例えばそのN末端において含有するアミノ酸配列を含む。化合物の1つの部類において、好ましくはコネクターはペプチド“スペーサー ”および非ペプチド“リンカー”を含む。代表的なコネクターの構造は次のとおりであり、 −λ−σ− 式中、λは非ペプチドリンカーを表わし、σはアミノ酸の配列を含むスペーサーを表わし、λおよびσは適切な状態でペプチド結合で連絡される。スペーサー σはＥＡＭに連結するのが好ましく、リンカーλはＣＳＤＭに連結するのが好ましい。ただし、化合物内でσがＣＳＤＭに、リンカーλがＣＳＤＭに連結する場合は、本発明に含まれる態様としてはあまり好ましくない。リンカーは典型的には、スペーサーのN末アミノ基と、例えばN末基のようなＣＳＤＭの官能基と反応する官能基を有する化合物の残基である。したがって、好ましいリンカーは２個のカルボキシル基、例えば、ＣＳＤＭおよびスペーサーのＮ末アミノ基とのアミド結合を形成できるジカルボキシル酸を有する。特に好ましいリンカーは、グルタル酸(HO₂C(CH₂)₃CO₂H)残基およびその同族体の式(HO₂C( CH₂)_hCO₂H)であり、式中のhは整数で２または４、５、６である。アルキレン残基[(CH₂)_2-6−]は、１以上の置換基で置換され、その置換基はリンカーに立体障害をあたえるものではなく、それによつてリンカーの望ましい柔軟性を維持できる。あまり好ましくはないが、リンカーは、例えばカルボキシル基の炭素原子が２個から６個の原子により分離されている２個のカルボキシル基を有する他の化合物の残基を含み得る。スペーサーのアミノ酸配列は、本発明では重要ではないが、その配列が少なくとも２個の隣接Ｇｌｙ残基を普通にその配列のＮ末端に含むことは好ましい。スペーサーの長さは、特にリンカーが接着しているＣＳＤＭ上の位置によって相違する。ペプチド・トロンビン阻害剤に適したコネクター部分に関して、前述の本願と同日の標題「トロンビン阻害剤」なるUK出願にさらに記述されている。コネクター部分は、他の結合で置換された１以上の天然アミド結合を有し得る。合成本発明の化合物は、例えばペプチド合成およびペプチドカップリングについて業界公知の方法によって製造できる。例示的な方法において新規化合物は、固相合成技法によって製造される。固相合成はペプチドを専門とする化学者にはよく知られた技法であるから、詳しい説明はここでは必要としない。この技法に関する概説は“The Chemical Syn thesis of Peptide”，John Jones，Clarendon Press，Oxford，England, 1991”に記載されている。固相合成の通常の原理は、固相にカップルしたアミノ酸またはペプチドが、それ自体との反応を保護されたアミノ酸と反応して、固相連結アミノ酸とのカップル後に、それ自体との反応を保護されたアミノ酸との反応のために脱保護されることである。これらの工程を必要に応じて何回も反復する。一つの固相合成技法にFmoc技法がある(Fmoc＝フルオレニルメチルカルボニル) 。Fmoc化学反応(‘Sheppard approach’としても一般的に知られている)において、ペプチドのカルボキシ末端(またはアミノ酸)が反応性機能によって末端部をなすリンカーを経て、樹脂ビードに結合する。樹脂ビードそれ自体は典型的にはポリスチレン(PS)であるが、溶媒中において適切な膨張特性を有する他の固体が使用される。その理由は、ペプチド鎖がビードの内部にある小孔中で成長することが現在判明しているからである。他の固体の例は、Kiesulguhrと呼ばれるポリアミドである。リンカーにはいろいろあるが、好ましいのはPEG(すなわち、ポリエチレングルコール・リンカー)であり、これはアルコール官能基を有する。リンカーの末端は、典型的に‘ハンドル(handle)’と呼ばれ、望む産物によって相違するが、Fmoc化学反応にとってその末端は最終的に酸によって開裂されることのできる部分である。最も普通の末端（使用しているもの）は、HMBAすなわちパラヒドロキシンメチル安息香酸リンカーである。HMBAをPEG上でエステル化し、次いでペプチドまたはアミノ酸(Ｎ末端上にFmocを有す)を反応せしめて、同じくHMBA上でエステル連結を生ぜしめる。このエステル連結を次に酸で開裂する。Fmoc保護基は塩基不安定性で、典型的には２次塩基(例えばピペリジン)で除去され、生成遊離アミノ基が選択されたFmoc保護アミノ酸と反応する。これらの工程を繰り返えして、アミノ酸配列を伸張する。もう一つの固相合成方法は、Boc技法である(Boc＝ｔ−ブチルオキシカルボニル)。Boc化学反応(より一般的にMerrifield methodで知られている)に使用する樹脂は、ジビニルベンジル塩基であることが多く、例えば‘Wang’樹脂は２％のジビニルベンゼンと共重合するクロロメチルベンゼンを有する。クロロメチルベンゼン基は、アミノ基がBocで保護されているアミノ酸またはペプチドと反応して、樹脂上に連結を生成する。この樹脂上の連結は典型的には乾HF液で開裂せしめる(非常に慎重に！)。これを‘活発な’酸分解と呼ぶ。Boc保護基は酸不安定性で、典型的には生成遊離アミノ基と選択したBoc保護アミノ基との反応に先立って、TFAで開裂される。Fmoc化学反応の場合と同じく、これらの工程を繰り返してアミノ酸配列を伸張する。固相ペプチド合成の２つの古典的な技法(SheppardおよびMerrifield)は、従ってアミノ酸をカルボキシ末端またはその誘導体を介して固相樹脂粒子にカップルすること、それに続いて新しいアミノ酸(それらの活性カルボキシ末端を介して) を生成されたＮ末端にカップルすることを含む。最近の報告によると、Ｎ末端を介する例えば、酸不安定性ベンジルオキシカルボニル結合を介する樹脂に対するカップルカルボキシ末端の遊離、その活性化、アミノ酸のそのＮ末端を介するカップル、アミノ酸のカルボキシ末端の一時的な保護について開示されている(Sharma,R.P.；Jones，D.A.；Broadbridge,R.J.；C orina，D.L.and Akhtar，M．A Novel Method of Solid Phase Synhesis Of Pept ide Analogues,in Inovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis，ed .，R．Epton．1994，Mayflower World wide Limited，Birmingham,page353-356 ；Letsinger，R．L．and Komet,M．J．Amer．Chem．Soc.，1963,85，3045.)。このようなＮ末端カップル方法を使って本発明の産物を製造する。一つの実施態様において、あらゆる直結アミノ酸を含むＣＳＤＭをＮ末端カップルによって合成する。この技法はＣＳＤＭがC末端ヘテロ原子基を有する場合に特別に有用である。この技法で、Ｎ末端カップルを使用して生成する樹脂結合ペプチド鎖は、そのカルボキシ末端を活性化するように誘導化し、次いで遊離α−アミノボロネートエステルまたは酸を樹脂結合配列とカップルする。最後に、ペプチドボロネート(ＣＳＤＭを含む)を、最終産物の残留物に連結するに先立って、強酸(例えば、ＨＦまたはＴＦＡ)によって樹脂から開裂する。合成化合物のＣＳＤＭがＰ１〜Ｐ２非天然アミド結合を含むとき、結合サブ部位親和性部分［式ＩのX-(aa⁴)_m-(aa³)_n−(aa²)]および接着C末端基［式Ｉの(aa¹ )-Z]を有する特異ポケット親和性部分を中間体としてあらかじめ製造しておくと便利である。これら２つの中間体は適切な官能基を含み、一緒に反応して標的非天然アミド結合[Ψ]を形成し、一緒に反応して化合物(あるいは、１以上の官能基変形をおこすその前駆体)を形成することをもたらし、または可能とする。非アミド結合Ψを含むペプチドを製造するために適切な合成技法はＰＣＴ／ＧＢ９６／００３５２に記載されている。我々は固相化学を使って、ペプチドボロネートエステルの合成に予期せざる成功をおさめた。例えば、セリン・プロテナーゼ阻害剤の模範的な合成工程において、コネクター部分およびその接着ＥＡＭはＣＳＤＭのN末伸張を形成し、そのＥＡＭは、例えばFmoc−ポリアミド連続フロー法を使用して、Fmoc固相ペプチド化学によって製造する。この目的のために適切な固相は、前誘導固体支持Fmoc-L eu-PEG-PSである。ペプチド共役樹脂を、次いで例えば無水グルタル酸で処理する。その１つのカルボキシル基はＥＡＭのＮ末アミノ基を反応するものである。前合成ペプチドボロネートＣＳＤＭをレジン／ペプチド／グルタル酸共役体と反応せしめ、最終化合物を形成する。この化合物は、例えば１００％ＴＦＡによる処置で樹脂から開裂する。固相化学法において、ペプチドボロネートエステルを使用するもう１つの方法は、全く新しい技法で、その技法の中でホウ酸[-B(OH)₂]を樹脂にカップルしたジオールと直接的にエステル化する。連鎖伸張をアミノ酸のアミノ基から例えば標準Fmoc化学結合によって続ける。ホウ酸エステルはペプチドボロネート[ペプチド−Ｂ(OH)₂]をつくる酸(例えば、ＴＦＡ)により、あるいはエステル交換反応により、例えばピナンジオールのような束縛ジオールの濃縮溶液によって、樹脂から開裂される。従って、本発明は本発明の化合物の生成法を含み、標的アミノ酸配列を生成するために次の工程を実施することを含む。 (ｉ)アミノ基または好ましくはカルボキシル基あるいはその活性誘導体と反応し得る官能基にカップルした固相を準備し； (ii)本発明化合物のアミノ酸配列の末端アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基(その活性誘導体の形であり得る)を選択的に該官能基に反応せしめ； (iii)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列中で配列的に続けるアミノ酸を該先行アミノ酸にカップルせしめ； (iv)必要に応じて工程(iii)を何回もくり返す。工程(ｉ)において、固相にカップルした官能基は、最終化合物に組みこまれている部分上にあり得、例えば固相に直接的または間接的にカップルしたアミノ酸のアミノ基(誘導化され得る)であり得る。本発明化合物を得るための方法において、しばしば、１以上の追加の工程が含まれる。好ましい方法には、望むときは、工程(iii)の該配列的に後続するアミノ酸を該先行アミノ酸に、アミノ基に反応し得る２官能基を有する化合物を介してカップルせしめる工程(ｖ)がある。２官能基を有する化合物によって、該官能基の１つは該先行アミノ酸のアミノ基に結合し、今１つは該後続アミノ酸のアミノ基に結合する。工程(iii)の配列的に後続するアミノ酸は、大きい部分の一部、例えば天然ペプチド結合についての置換を選択的に含有するアミノ酸配列の一部であり得る。この方法において、アミノ基と反応したいかなる１以上のカルボキシレート基も、その活性カルボニル含有誘導体、例えば活性カルボニル基および酸無水物の形態であり得る。使用する前に、固相合成の最終化合物は、例えば既知の方法で、固相から開裂される。開裂化合物は、最終化合物を得る前に１以上の追加の化学反応にかけ得る。好ましい実施態様において、固相に接着した官能基に反応する末端アミノ酸は、ＥＡＭのＣ末アミノ酸であり、工程(iii)は反復されて、ＥＡＭ配列の連続するアミノ酸と隣接コネクターペプチドの連続アミノ酸とをカップルして、非妨害アミノ酸配列を形成する。固相にカップルした非妨害アミノ酸配列の最終アミノ酸は、２個のカルボキシレート基またはその反応性誘導体を有する化合物、例えばジカルボン酸無水物と反応し、２個のうち１個のカルボキシレートを最終アミノ酸のアミノ基に結合する。未反応のカルボキシレートまたはその誘導体は１つのアミノ酸のアミノ基に典型的に反応し、このアミノ酸は普通はＣＳＤＭのＮ末アミノ酸である。後者の場合、アミノ酸はＣＳＤＭの残りにすでに結合し得て、すなわちＣＳＤＭは未反応のカルボキシレート(誘導体)に連結するために全体として(または部分的に)別個につくられる。２個のカルボキシレート基を有する化合物は好ましくは上記のリンカーである。いくつかの好ましい方法において、Ｃ末カルボキシ基の代りにヘテロ原子基を有するＣＳＤＭが用いられる。ヘテロ原子基は好ましくは上記のボロネートまたはボロネート誘導体である。固相材(固相および接着分子)と反応したアミノ酸また他の部分は、固相材と反応する基以外に合成妨害から保護された他の反応性官能基を望ましくは有する。すべての反応アミノ酸または部分の保護された官能基は、それ自体反応し得るものであって、反応に供せられる前に脱保護される。従って、第１の好ましい方法は次の工程を含む。 (ｉ)カルボキシル基またはその反応性誘導体と反応し得る官能基にカップルした固相を準備し； (ii)ＥＡＭのＣ末アミノ酸を固相に接触せしめ、アミノ酸は保護アミノ基および選択的に誘導カルボキシ基を有し、次いでアミノ酸分子のカルボキシ基を固相の官能基に反応せしめまたは反応を可能にし； (iii)反応したアミノ酸のアミノ基を脱保護し、それによって固相に遊離のアミノ基を提供し； (iv)ＥＡＭおよび選択的に隣接スペーサーペプチドの連続アミノ酸で工程(ii) および(iii)を反復して、固相上にＥＡＭのＣ末から配列の遊離末端におけるスペーサーのＮ末までのアミノ酸配列を形成せしめ； (ｖ)２個のカルボキシ基またはその反応性残基を有するリンカー化合物に固相を接触せしめ、リンカー・カルボキシ基また反応性カルボキシ残基をスペーサー配列のＮ末アミノ基に反応せしめるか、または反応を可能にし； (vi)リンカー化合物のカップルしている固相をＣＳＤＭ配列のＮ末アミノ酸に接触し、アミノ酸分子のアミノ基をリンカー化合物のカルボキシ基また反応性カルボキシ残基に反応せしめ、または反応を可能とし、選択的にＣＳＤＭ配列のＮ末アミノ酸は完全なＣＳＤＭの一部分であり； (vii)必要とあれば、ＣＳＤＭの連続アミノ酸について工程(ii)および(iii)を繰り返して、ＣＳＤＭ配列を完成し；そして (viii)固相の官能基から得た化合物を開裂する。第２の好ましい方法は次の工程を含む。 (ｉ)カルボキシル基またはその反応性誘導体と反応し得る官能基にカップルした固相を準備し； (ii)ＥＡＭのＣ末アミノ酸を固相に接触せしめ、アミノ酸は保護アミノ基および選択的に誘導カルボキシ基を有し、次いでアミノ酸分子のカルボキシ基を固相の官能基に反応せしめまたは反応を可能にし； (iii)反応したアミノ酸のアミノ基を脱保護し、それによって固相に遊離のアミノ基を提供し； (iv)ＥＡＭの連続アミノ酸について工程(ii)および(iii)を繰り返して、固相上にＥＡＭのＣ末から配列の遊離末端におけるＥＡＭのＮ末までのアミノ酸配列を形成せしめ； (ｖ)２個のカルボキシ基またはその反応性残基を有するリンカー化合物に固相を接触せしめ、リンカー・カルボキシ基また反応性カルボキシ残基をＥＡＭのＮ末アミノ基に反応せしめるか、または反応を可能にし； (vi)リンカー化合物のカップルしている固相をペプチドスペーサー配列のＮ末アミノ酸に選択的に接触し、アミノ酸分子のアミノ基をリンカー化合物のカルボキシ基また反応性カルボキシ残基に反応せしめ、または反応を可能とし； (vii)スペーサーの連続アミノ酸について工程(ii)および(iii)を選択的に繰り返し、ＣＳＤＭ配列のＮ末アミノ酸について工程(ii)を選択的に繰り返し、選択的にＣＳＤＭ配列のＮ末アミノ酸は完全なＣＳＤＭの一部分であり； (viii)必要とあれば、ＣＳＤＭの連続アミノ酸について工程(ii)および(iii) を繰り返して、ＣＳＤＭ配列を完成し；そして (ix)固相の官能基から得た化合物を開裂する。いずれの上記方法においても、合成化合物は固相から酸により好ましくは開裂される。上記方法は好ましくはＣＳＤＭアミノ酸またはＣ末ホウ素基を有するアミノ酸 (例えば完全ＣＳＤＭ)配列の使用を含む。第１および第２の好ましい方法において固相にカップルした官能基は、最終産物化合物に合体した部分の一部であり得、例えば固相に直接的または間接的にカップルしたアミノ酸のアミノ基(誘導され得る)である。本発明の一つの方法において、固相と結合した官能基は、最終産物である化合物に合体したアミノ酸ボロネートの一部分である。すなわち、固相がそこでアミノ酸ボロネートと結合したジオールを有している。本技法の他の部類において、その側鎖がアミノまたはカルボキシル基を有するアミノ酸が、側鎖に対するカルボキシル基またはアミノ基を通じて固相に結合する。連鎖伸張が、例えばアミノ基からのFmoc合成のごとく、アミノ酸の官能基の一つから起きる。別の官能基が次いで最終産物の他の構成部分、例えば、アミノ酸ホウ酸塩（ＣＳＤＭのＰ１残基を形成する)と反応する。しかしながら、ホウ素含有ペプチドの固相合成は、すべてのそのようなペプチドに適用可能であり、本発明のセリン・プロテアーゼ阻害剤にだけに適用できるものではない。ホウ素含有化合物の固相合成ペプチドボロネートは、溶液化学でつくられてきた化合物において十分に確定した部類に入る。かくして、ペプチド・プロテアーゼ阻害剤は、よく知られており、Ｃ末カルボキシ基がホウ酸基またはその誘導体によって置換されている。代表的な化合物はIIで表わされる： (aa)_k−B(R²)(R³)、（II）式中、(aa)_kはアミノ酸の配列(例えば、式Ｉにおけるごとく)を表わし、Ｒ²およびＲ³はそれぞれ独立してハロゲン、−OH、−OR⁴および−NR⁴R⁵から選択され、Ｒ⁴およびＲ⁵はそれぞれ独立して式Ｒ⁶(CO)_u−の１つの基であり、この中のuは０または１；Ｒ⁶はＨまたは場合によりハロゲン化されたアルキル、アリールまたはアリールアルキル基で、これらの基は(１０−u)までの炭素原子を含み、場合によっては、−OH、Ｒ⁷(CO)_vO−Ｒ⁷(CO)_v−から選択した１以上の基で置換され、式中vは０または１であり、Ｒ⁷はＣ₁−Ｃ_6-vアルキルであり、またはアリール、アルキルアリール、アリールアルキルまたはアルキルアリールアルキル基であり、これらの基は(１０−v)までの炭素原子を含む。またＲ²およびＲ³は一緒にジオールまたはジチオールの残基を表わす。そのようなペプチドホウ酸については、例えばWO 92／０７８６９(ＵＳＳＮ０８／３１７，３８７に相応する)、EP 0471651(US 5288707に相応する)およびUS SN 08／２４０，６０６に掲載されている(出典明示により参考として本明細書に組み入れる)。前述のとおり、我々はホウ素含有ペプチドを意外にも固相化学によって重大な分解などの欠陥なしに合成できることを発見した。したがって本発明の一つの様相は、固相化学反応、特にFmoc化学反応(“Sheppard approach”としても知られる)によるペプチド合成にホウ素含有アミノ酸類似体を使用することである。本発明のもう一つの様相は、標的アミノ酸配列を製造する下記の工程を実施することを含み、ペプチドまたはペプチド含有化合物を製造する方法を提供することである。 (ｉ)官能基とカップルした固相を準備し； (ii)それと官能基に反応性の化合物とを選択的に反応せしめ、その反応した化合物はアミノ基またはカルボキシル基あるいはその反応誘導体と反応できる官能基を有し； (iii)標的アミノ酸配列の末端アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基(その反応誘導体の形態でもあり得る)に、選択的に前記の反応化合物の官能基を反応せしめ； (iv)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列において配列的に後続するアミノ酸を前記の先行アミノ酸にカップルせしめ； (ｖ)工程(iv)を必要に応じて何回も繰り返えし； (vi)工程(ｉ)〜(iv)を使って製造した固相連結化合物を酸または塩基の作用で固相から開裂する。特徴的な点は、ホウ酸基[−B(OH)₂]またはその誘導体、特にエステルを含有する化合物を、その固相からの開裂に先立って、固相結合化合物に組み入れることである。ペプチドまたはペプチド含有化合物を製造するための本発明方法は、その前工程において、場合によっては、工程(iv)[すなわち、その工程(iv)において、配列的に後続するアミノ酸はペプチドの一部分である]において製造された固相結合化合物とペプチドを結合する工程を含む。ペプチドまたはペプチド含有化合物を製造するための本発明の方法は、工程の前段階において製造した固相連結化合物に、アミノ酸またはペプチド以外の化合物、例えば固相結合ペプチドのアミノ基とペプチド、ペプチド類似体またはアミノ酸とを液相中で連結するために使用する２つのカルボキシル基を有するような化合物を、カップルせしめる工程を含む。もちろん、アミノ基または場合によってカルボキシル基で反応させ得るその他のすべての液相化合物は、かくして固相結合ペプチドと結合できるはずである。ジアミンがカルボキシル基(例えば、それの反応誘導体の形で)を有する機能基の相互連結にとって有用である。ジカルボキシル酸、特にグルタル酸による固相結合ペプチドの伸張は、典型的には、そのＮ末を通じて、ペプチド・スペーサー部分およびジカルボキシル酸残基結合部分を含有するコネクター部分を介してＥＡＭと連結したＣＳＤＭを有する二重機能性セリン・プロテアーゼ誘導体の製造に有用である。遊離末端がジカルボキシル酸残基で終わる固相結合化合物は、遊離カルボシキシル残基(場合によってはその誘導体の形で)とアミノ酸のアミノ基との結合によって更に伸張し得る。例えば、固相結合ＥＡＭ−スペンサー部分とカップルしたジカルボキル酸残基は、ＣＳＤＭのアミノ酸、例えばＣＳＤＭのＮ末アミノ酸と反応し得る。本法の工程(ii)は、アミノ酸のアミノ基または選択的に誘導したカルボキシ基と、例えば在来の固相ペプチド合成の一部である固相に直接的にまたは間接的に結合した官能基との反応を含む。固相に結合したアミノまたはカルボキシ基はしばしば末端アミノまたはカルボキシ基であるが、ある態様においては、例えばグルタル酸の側鎖カルボキシ基のような側鎖の官能基である。側鎖を介して固相に接着したアミノ酸のＣ末カルボキシ基は、ホウ酸残基[-B(OH)₂]またはそれのエステルによって置換され得る。本発明方法は、ＳＰＰＳ中でのＮ末カップリングを含み樹脂結合ペプチドのカルボキシ末は、樹脂からの合成された生成物の酸開裂の前に、遊離α−アミノホウ酸またはエステルとカップルする。別の様態において、工程(ii)はアミノ酸またはペプチド・ホウ酸またはエステルの反応から成り、または、式中、E¹およびE²はホウ素エステル形成残基を表わし、あるいは一緒になって固相にカップルしたジオールによって単一の残基を形成し得る。ホウ素原子(例えば、アミノ酸またはペプチドホウ酸またはエステルの一部として)と固相との結合を、固相に(直接的または間接的に)カップルしたヒドロキシル基を通じて連結せしめる技法は、新規なものであって、本発明の特徴を形成する。もし、ホウ酸またはエステルを含む化合物が前述の態様のいずれかにおける工程(ii)で使用されるアミノ酸ボロネートであると、固相合成技法は、選択的に二重機能性セリン・プロテアーゼ阻害剤の合成においてセリン・プロテアーゼ触媒部位のペプチドボロネート阻害剤を製造するのに使用し得る。かくして、ホウ酸はジオール含有樹脂上で直接的にエステル化でき、次いでＮ末端から続いて連鎖伸張を例えば標準Fmoc化学反応によって行なえる。次いで、ホウ酸エステルを鉱酸により開裂して遊離ホウ酸[ペプチド−B(OH)₂]を得るか、またはエステル交換反応により、例えばジオール、ピナンジオールのような束縛ジオールの濃縮溶液により開裂できる。文献に、ジオール含有固相樹脂の製造方法が記載されており、その樹脂はアルデヒドによって誘導体化でき、またそれをホウ酸／エステルによって誘導化するのに適している(例えば、Xu，Z-H.，McArthur，C.R and Leznoff，C.C．‘The m onoblocking of symmetrical Diketones on Insoluble Polymer Supports，Can. J．Chem.，1993，61，1405-1409．and Leznoff，C.C．and Sywanyk，W．‘Use o f Polymer Supports in Organic Synthesis．9．Synthesis of Unsymmetrical Car etenoids on Solid Phase’，J．Org．Chem.，1997，42，3203-3205)。製造順序の概略は次のとおりである：ジオールは２以上のアルコール性ヒドロキシ基を有する化合物である。ＸおよびＹは保護基である。Ｒはアミノ酸ボロネート／ホウ酸の側鎖である。典型的には、樹脂を各工程の後に洗う。適当な実施態様において、ジオールは、樹脂と反応させる前は保護されていない。より特定的な順序は次の通り：従って、本発明は、例えば組み合わせ方法を使ってペプチドボロネートのライブラリーを製造する場合において、固相化学によるペプチドボロネート製造への道を開く。本発明は、ペプチドホウ酸またはペプチドボロネートエステルを含有する化合物の製法を含み、その方法は、 (ｉ)アルコール性ヒドロキシ基をカップルした固相を準備し； (ii)アミノ酸ホウ酸またはペプチドホウ酸をヒドロキシ基と反応せしめ、それによってホウ酸残基を固相にエステル化し； (iii)最終産物においてペプチドホウ酸またはボロネートエステルに配列的に後続するアミノ酸のカルボキシル基に、固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸のアミノ基を選択的に反応せしめ； (iv)工程(iii)を必要に応じて何回も繰り返えし； (ｖ)生成ペプチドボロネートを樹脂から開裂する；工程を含む。場合によっては、この方法は上記の化合物の製造工程に更に１以上の工程を含む。固相にカップルしたアルコール性ヒドロキシ基は、好ましくは基の対がホウ素原子と結合できるように配置されている。すなわち、ホウ素原子は下記のようにジエステル化されている：いくつかの態様において、ヒドロキシ基は１,２−配置(すなわち、隣接炭素上 )であり、別の態様においては、鎖上で離れている(例えば、NH(CH₂CH₂OH₂)の残基)。好ましくは、固相にカップルした各々のアミノ酸がアミノ保護基を有し、工程 (iii)はアミノ酸に配列的に先行するアミノ基を脱保護することを含む。また、工程(Ｖ)の開裂は酸またはエステル交換反応によって行われることが好ましい。更に一般的に、本発明は、ヒドロキシ基残基で固相に接着したホウ酸残基の固相合成法における使用を提供する。また、本発明はホウ素原子を含む化合物の製造法を提供し、その製造法は、 (ｉ)アルコール性ヒドロキシ基とカップルした固相を準備し； (ii)ホウ酸またはボロネートエステルをヒドロキシ基に反応せしめ、それによってホウ素残基を固相にエステル化し； (iii)上記化合物の製造のために更に１以上の工程を実行する；ことを含む。アルコール性ヒドロキシ基は上記のとおり配置するのが好ましい。本発明の別の実施様態は、ヒドロキシ基を介してホウ酸残基にカップルした固相材を提供する。それはまた下記式IVの部分にカップルした固相材でもある。式中、Ｒはホウ素原子に結合した残基であり、通常は有機部分である。残基Ｒはアルコール性ヒドロキシ基に反応性の官能基から遊離した材料の一部類である (ただし、その材料は官能基を保護形態で含み得る、例えば脱保護前)。別の部類の材料においては、前記の官能基は脱保護され、保護基は予め除去される。Ｒは典型的には、１以上の官能基を有する有機部分であり、Ｒの化学反応を可能とする。保護可能な官能基はすべて保護され得る。材料の一部類において、固相は下記式Ｖの部分とカップルする。 -CH₂-基の水素原子の１つまたは両方は、材料の使用に適合する他の基、例えば(メチルまたはブチルのような)アルキル基で置換し得る。更に別の部類の材料においては、式IVの左側の酸素はエステルの一部である。第一の固相合成法の部類は、下記の工程を実施することを含み標的アミノ酸配列製造方法を提供することである。 (ｉ)カルボキシル基と反応し得る官能基をカップルした固相を準備し； (ii)官能基に反応性で、塩基不安定性保護基により保護されているアミノ基を含有する化合物と官能基とを反応せしめて、酸不安定性結合を形成し； (iii)アミノ基を塩基で脱保護し； (iv)アミノ基が塩基不安定性保護基により保護されているアミノ酸のカルボキシル基と、工程(iii)から生成した脱保護アミノ基とを反応せしめ； (ｖ)保護アミノ酸を塩基で脱保護し； (vi)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列において配列的に後続するアミノ酸を、配列的に先行するアミノ酸の脱保護アミノ基と反応せしめ、この配列的に後続するアミノ酸は塩基不安定性保護基により保護されているアミノ基を有しており； (vii)保護アミノ酸基を塩基で脱保護し； (viii)工程(vi)および(vii)を必要に応じて何度も繰り返えし； (ix)酸不安定性結合を酸によるかまたはエステル交換反応によって開裂する。特徴的な点は、ホウ酸基[-B(OH)₂]を含有する化合物またはその誘導体、特にエステルを、その酸不安定性結合からの開裂に先立ち、固相連結化合物に組み入れることである。ペプチドまたはペプチド含有化合物製造法に関して上述したごとく、本法の工程(ii)は、アミノ酸のアミノ基または選択的に誘導したカルボキシ基と、例えばそれ自体が固相化学で公知の技法によって、固相に直接的にまたは間接的にカップルした官能基との反応を含む。このアミノ酸は、ホウ酸またはエステル基、すなわちアミノ酸ホウ酸を含む化合物である。他に代る方法として、工程(ii)は、アミノ酸またはペプチドホウ酸またはエステルの形態のホウ酸またはエステル基を含有する化合物と固相にカップルしたジオールとを反応せしめることを含む。どちらの場合も、アミノ酸(またはペプチド)ホウ酸またはエステルが使用され、この方法は、セリン・プロテアーゼ触媒的部位のペプチドボロネート阻害剤の製造に適し、場合によって二重機能性セリン・プロテアーゼ阻害剤の合成に適している。上述したその他さまざまなペプチドおよびペプチド含有化合物の製造方法は上記の固相合成法の第一部類に適用できる。固相合成法の第二部類は、標的アミノ酸配列を製造する下記の工程の実施を含む。 (ｉ)カルボキシル基と反応できる官能基をカップルした固相を準備し； (ii)官能基に反応性で、酸不安定性保護基により保護されているアミノ酸基を含有する化合物と官能基とを反応せしめて、塩基不安定性結合を形成；、 (iii)アミノ基を酸で脱保護し； (iv)アミノ基が酸不安定性保護基により保護されているアミノ酸のカルボキシル基を工程(iii)から生成した脱保護アミノ基と反応せしめ； (ｖ)保護アミノ酸を酸で脱保護し； (vi)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列において配列的に後続するアミノ酸を、配列的に先行するアミノ酸の脱保護アミノ基と反応せしめ、この配列的に後続するアミノ酸は塩基不安定性保護基により保護されているアミノ基を有しており； (vii)保護アミノ酸基を酸で脱保護し； (viii)工程(vi)および(viii)を必要に応じて何回も繰り返えし； (ix)塩基不安定性結合を塩基によるかまたはエステル交換反応によって開裂する。特徴的な点は、ホウ酸基[-B(OH)₂]を含有する化合物またはその誘導体、特にエステルを、その酸不安定性結合からの開裂に先立ち、固相リンク化合物に組み入れることである。上述した第一部類のさまざまな固相合成方法は、第二部類にも適用できる。ペプチドまたはペプチド含有化合物の製造法に関して、上記したように、第一および第二部類の固相合成方法は、それに先立つ工程で製造した固相連結化合物とアミノ酸またはペプタイド以外の化合物とをカップルせしめる工程を含み得る。合成の概要本発明の化合物には、たとえそれにホウ素を含み得るが、ホウ酸を含むべきでない。非ホウ素含有の化合物も固相合成によって製造することもできる。本発明の化合物には、別の連結基で置換された天然ペプチド結合を有するものがある。本発明のすべての化合物の合成に適した方法に関するこれ以上の情報は、前記の本日出願の標題「トロンビン阻害剤」なる特許出願に記載されている。用途本発明の新規化合物は、セリン・プロテアーゼ、例えばトロンビンの阻害剤または基質として有用であり、このような酵素の診断的、代謝的研究についてインビトロまたはインビボで用いられる。さらに一般的に新ペプチドは研究または合成目的に有用である。さらにその阻害作用からして、調節系、特に哺乳動物での系、例えば人体または動物体、例えば凝血系においてトロンビンまたは他のセリン・プロテアーゼの過剰により生じる疾患治療および予防に有用である。薬学的に有用な化合物は、Ｎ末置換体などの薬学的に許容される基を有する。本発明の抗血栓性化合物は、抗トロンボゲン剤を必要とするときに用いられる。一般的に本発明の化合物は経口または非経口的に有効量を対象体に投与可能であって抗トロンボゲン作用を得る。ヒトなどの大きい咄乳動物の場合、化合物は単独あるいは１以上の薬学的担体または希釈剤と併用して、０.０２−１００mg ／体重、好ましくは１−１００mg／体重で投与され、抗トロンボゲン作用を得る。この投与は１回量としてあるいは分割して、または徐放性剤としてなされる。体外血液ループが患者について確立すると、０.１−１０mg／kgを静注し得る。全血での利用について、１−１００mg/lが凝固を予防するために提供される。ヒトおよび動物での利用についての薬学的希釈剤および担体は、よく知られており、糖、でんぷんおよび水があり、１以上の対象ペプチドを必要な薬学的に適切かつ効果的な量または濃度で含有する医薬組成物(ヒト用または動物用)の適切な製剤がつくられる。この医薬製剤は単位用量形態をとり得る。それには、錠剤、カプセル、注射液などがある。本発明の抗凝固化合物は、血液を採取または分散する容器、血液と接触するチューブまたは挿入器具において血液の凝固を防止するために、血液に加えることができる。本発明の化合物によりもたらされる利点には、経口での効力、効果の迅速な発現および低い毒性がある。さらに本発明の化合物には、ヘパリン、トロンビンの他の既知阻害剤あるいは他のセリンプロテアーゼなどの化合物に過敏症である者についての処置で特別の利点がある。本発明の方法は、セリン・プロテアーゼ阻害剤および他の化合物の合成に有用である。また組み合わせた化学において有用である。本発明をさらに下記実施例によって記述、説明する。実施例実施例において、アミノ酸残基は別記しない限り、Ｌ−立体配置である。 GlyGlyGln(Tyr⁶³)Hir^51-64は、アミノ酸、式H-Gly-Gly-Gln-His-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Tyr-Leu-OHを有し、Fmoc-ポリアミド連続フロー法およびカラム・モニター・ソフトウェア上で９０５０Plusを用いるMilligen(商標) ９０５０ペプチド合成機における固相ペプチド化学によって製造した。あらかじめ誘導した固相支持体Fmoc-Leu-PEG-PS(1.6g、０.２２meq／g)を通して用いた。 Fmoc-Leu-PEG-PSは、HMBAリンカーを有するポリエチレングリコール誘導ポリスチレンを含有する。Fmoc基は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて除去した。 Fmoc-アミノ酸(４等量）は、そのペンタフルオロフェニルエステルとして、側鎖保護(例えばFmoc-L-Tyr(tBu)0Pfp、Fmoc-L-Glu(tBu)0Pfp、Fmoc-L-Asp(tBU)0Pfp 、Fmoc-L-Asn(Trt)OPfpおよびFmoc-His（boc）0Pfp)で配列的にカップルされていた。必要とするペプチド配列が完成すると、Ｎ末Fmoc基は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて除去した。ニンヒドリン試験が正であると、Fmoc基が除去されていることを示す。ペプチドコンジュゲート樹脂は、フィルター上に入れ、ジクロロメタン、メタノールおよびジクロロメタンで順次洗い、次いで減圧で数時間乾燥した。実施例１aで得たペプチドをDMF(5ｍｌ)に懸濁し、丸底フラスコ(２５ｍｌ)中でグルタル無水物(３００ｍｇ)および４−メチル−モルホリン(２００ｍｇ)で処理した。反応混合物を一夜攪拌した。樹脂をDMF、DCM、Me0Hで洗い一夜減圧で乾燥し、目的化合物を得た。隔壁を配置し窒素を流した丸底フラスコ(１００ml)中のCbz-D-Phe-Pro-BoroBp g0Pin(２g)に４０％HBr酢酸溶液(２０ml)を加えて、H-D-Phe-ProBoroBpgOPinを製造した。フラスコを回転させて攪拌し、保護したトリペプチドを完全に溶解した。約３０分後にガスの発生が止まったときに、無水エーテル(２００ml)を加え、反応混合物を冷蔵庫に４時間保存した。反応混合物を濾過し、残滓をEt0H(１ｍｌ)に溶解し、乾燥エーテルを加えると産物が沈澱して、白色固体(８００ｍｇ )(M-H)516:Tlc(C/M/A 95/5/3)，Rf=0.05が得られた。 [-D-PheProBoroBpgOPin]CO(CH₂)₃COGly₂Gln(Tyr^51-64)Hir^51-64を合成するために、乾燥樹脂HOCO(CH₂)₃COGly₂Gln(Tyr⁶³)Hir^51-64をＤＭＦ溶液(１０ｍｌ)に懸濁し、その後にTBTU(１２９ｍｇ，0.4mmol)およびH-D-Phe-ProBoroBpgOPin(２３０ｍｇ，0.4mmol)を反応混合物に加えた。５分間攪拌して、トリエチルアミン (４０mg，０．０４mmol)を加え、フラスコを攪拌しながら一夜放置した。完全に保護されたペプチド樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタンで洗浄し、減圧下で乾燥した。側鎖保護基の同時脱保護による樹脂からの開裂を、樹脂を１００％TFAで２時間処置して実行した。TFAを除去し、Ｃ末カルボキシル酸を有する遊離ペプチドを、冷乾燥エーテルで沈澱して生成した。粗ペプチドを濾過によって集め、更にエーテルの一部で洗浄した。粗ペプチドの精製は、Vydac(商標)C-18分取カラム(TPシリカ、１０μｍ、25mm ×300mm)を使用して、逆相HPLCによって実行した。カラムを直接勾配３０〜９０％A溶媒(０.１％TFA水溶液)およびB溶媒(０.１％TFAアセトニトリル液)で溶出した。カラム溶出物を２３０ｎＭでモニターし、フラクションを適宜集めた。産物の純度を分析RP-HPLCおよびマススペクトル計で測定した。クロロエタン−ピナネジオールボロネートエステル(０.３２１ｇ、１.２５× １０−３mol)を攪拌しながらCbz-D-Phe-Pro-OH(0.6g、1.52×１０^-3mol)に加えた。混合が完了するとDBUのCH₂Cl₂の溶液(0.23g、1.52mmol)を混合物に加え、室温で攪拌し、その後に検査までの間４℃で攪拌を続けた。不透明な液体をHCl( 0.1M、2×50ml)、NaHCO₃(1%、５０ml)で洗浄した。有機相をMgSO₄無水物中で激しく攪拌しながら乾燥し、それを濾過して乾燥剤を除去した。濾過物を回転蒸発器で減圧で濃縮し、濃厚な粘性残滓を得た。¹H N.M.Rによる予備検査により必要とする粗産物の生成が確認できた。粗製サンプルを少量のMeOHに溶解し、セファデックスLH20カラムにかけ、次いでそれを同じ溶媒を使ってポンプで溶出した。溶出物の内容を紫外線ランプ(２２６nM)およびレコーダーで追跡した。空隙量、フラクション1〜6、さらにバルク量が集められた。クロマトグラムに現われた形から、フラクション1〜6がトリペプチドが存在する可能性の最も高いフラクションであると推定した。フラクションをそれぞれ濃縮して明薄色の粘ちような残渣が得られた。強い減圧下で材料バルクを含む一つのフラクションからやや結晶状の産物(３５％収率０.２６９）が得られた。N.M.R.、FABMS(Fast Atom Bombardm ent Mass Spectrometry)、C.H.Nが化合物生成の非常に強力な(良好な)指標であった。 Cbz-D-Phe-Pro-Ψ(CO₂)-BoroEtgピナネジオール(実施例２aより)をMeOH溶液(3 0mg)中に溶解し、１０％Pd/Cで処理し、攪拌しながらアルゴンを通し、蒸留し、５時間攪拌しながらH₂をポンプで送り込んだ。ニンヒドリン着色により、TLC上に脱保護産物を確認した。その溶液にアルゴンを１０分間通し、濾過して減圧下で濃縮すると、濃い黒色の油状物が得られ、それをCHCl₂中に溶解し、濾過し、濃縮した。¹H N.M.R.で粗製物が保護産物でないことを確認した。上記産物からの残滓をセファデックスLH20クロマトグラフィカラム上で分離した。¹H(60MHz)N .M.R.に、単離化合物は、推定構造から考えられる特徴を示した。１２２ｍｇの遊離アミノホウ酸エステルを単離した。テトラキストリフェニルホスフィン・パラジウム(O)[PdP(Ph₃)₄](1g)をアルゴン気下、５％酢酸および２.５％N-メチルモルホリン含有のCH₃Cl溶液(３０ｍｌ) で溶解した。この混合物をアルゴン気下で、Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OA1(１.６ｇ)を含むフラスコに移した。樹脂をそのままにして２時間、時々しずかに振動させた。樹脂を焼結ガラス漏斗で濾過し、０.５％ジイソプロピルエチルアミンおよびジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム(０.５％w/w)のＤＭＦ溶液で洗って、触媒を除去した。乾燥樹脂Fmoc-L-Glu(PEG-PS)OH(１.５ｇ)をアルゴン気下、ＤＭＦ溶液(10ml)に懸濁した。TBTU(129mg、０.４mmol)およびNH₂BoroBpgPin(165mg、０.５mmol)wをその反応混合物に加えた。５分間攪拌した後に、トリエチルアミン（４０ｍｇ、０.４mmol)を加え、一夜フラスコを攪拌させながらそのまま放置した。樹脂をジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタンで洗い、減圧下で乾燥した。 Milligen9050ペプチド合成機上で固相化学によって、H-Phe-L-Glu(PEG-PS)NHB oroBpgOPinを製造した。固相支持体Fmoc-L-Glu(PEG-PS)NHBoroBpgOPinから２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を使用してFmoc基を除去した。Fmoc-Phe-OPfpを遊離Ｎ末にカップルした。保護したペプチド樹脂をジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタンで洗い、次いで真空下で乾燥した。樹脂からのペプチド開裂は、その樹脂をTFAによる２時間の処置で達成した。T FAを除去し、遊離ペプチドH-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPinを冷乾燥エーテルで沈澱して生成した。粗ペプチドを濾過して集め、更にエーテルの一部で洗った。粗ペプチドの精製は、VydacC-18分取カラム(TPシリカ：粒子サイズ１０ｍｍ、２５ｍｍ×３０ｍｍ)を使用して、逆相HPLCによって実行した。カラムを直線勾配３０％〜９０％A溶媒(０.１％TFA水溶液)およびB溶媒(０.１％TFAアセトニトリル液)で溶出した。カラム溶出物を２３０nMでモニターし、フラクションを適宜集めた。産物の純度を分析即−HPLCおよびマススペクトル計で測定した。産物 H-Phe-Glu-NH-BoroBpgOPinを、収率１７％、３４ｍｇを得た。ES-MS：６２６[M+ Na]；保持時間分析HPLC(４×２５０mm、Vydac、C-18 techsphere)、０.１％TFA を含む１０％〜６０％MeCN、０.１％TFAを含む水で２５分以上溶出し、Rt ２３. １分を得た。４．メリーフィールド樹脂へのホウ酸接着ａ．保護ジオール(２,２−ジメチル−1,3−ジオキソラン−４−メタノール)による樹脂の誘導体化アルゴンガス下でNa(固体、８ｇ、を２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン −４−メタノール(２４０ｍｌ)に加え、その混合物を透明な溶液になるまで攪拌した。それにメリフィールド樹脂(Sigma，１．１MeQ，Cl per gram，２０ｇ)を加え、その混合物を一夜攪拌し、次いで２４時間８０℃で加熱した。誘導体化した樹脂を濾過して集め、１，４−ジオキサン(１Ｌ)、水(３×５００ml)、MeOH:水(１：１、３×５００ｍｌ)、Me0H(３×５００ｍｌ)、乾燥エーテル(３×５００ml)で洗った。１.５〜２ｍｇの樹脂をKBr(乾燥、３００ｍｇ)の粉化によりスペクトルの赤外部を得て、ディスクに圧縮して、次いでPerki n(商標)１６００Fourier Transform I.R.で走査した。誘導樹脂(図２)はメリフィールド樹脂(図１)と比較して、五員環に特徴的であるエーテル伸縮頻度について明確な伸縮シグナル１０５０〜１１５０ｃｍ^-1(ｓ)を示し、アルキル−アルキル伸縮について１０６０〜１１５０ｃｍ^-1(ｓ)でジアルキルエーテル伸縮を示す。ｂ．脱保護誘導樹脂にHCl(１.５Ｍ、２５０ml)および１,４−ジオキサン(２５０ｍｌ)を混合し、懸濁液を攪拌して８０℃で加熱した。７２時間後に樹脂を水(５００ｍｌ)、Me0H(５００ｍｌ)、DCM(５００ｍｌ)、Et₂O(５００ｍｌ)で洗い、大気中で乾燥した。樹脂のF．t．-I．Rスペクトルは、明確なO-H伸縮頻度を３４００〜３５５０ｃｍ^-1(ｓ)で示し、主要ピークは３４１３.６(図３)で、このピークは２９１７.６ｃｍ^-1におけるシグナルより実質的に大きい。比較においてエーテル( 図２)およびメリフィールド樹脂は、背景湿気について弱い３４００ｃｍ^-1シグナルを示すにすぎない。ｃ．誘導体化樹脂とホウ酸との反応ジオール樹脂(５ｇ、５.５mmol／ジオール)をTHF溶液(乾燥５００ｍｌ)およびフェニルホウ酸(３.３５ｇ、２７.５mmol、５等量）および４Åふるい(１５０℃ で乾燥)中で懸濁した。アルゴン気下で一夜攪拌した後に、樹脂をアルゴン気下、閉鎖系中で濾過し、ＴＨＦ溶液(５００ｍｌ)で洗い、減圧下で乾燥した。F．t ．−L．R．(図４)は、フェニル環について１０２６ｃｍ^-1(アリル−アルキル伸縮頻度)で強シグナルおよび３４１７ｃｍ^-1で弱シグナル(出発ジオールについて、図３との比較)を示す。 Ref．Leznoff，C.C．and Wong，J.Y.，The use of Polymer Supports in Orga nic Synthesis III．Selective Chemical Reactions on One Aldehyde Group of Sylmmetrical Dialdeydes，Can．J．Chem.，1973．51．3756-3764．分析および活性データ下記の表１は本発明に関する活性データである。表中、“Ｚ”はベンゾイルオキシカルボニルを、“ＮＨｉｒ”は正常のピルジンを意味する。“NHir49-64(de s-S)”は正常ヒルジンのアミノ酸４９からアミノ酸６４のアミノ酸配列を意味し、そこでは野性のTyr(OSO₃H)⁶³がＴｒｙで置き換っている。表１の化合物は上記実施例１または２の化合物を製造する方法または類似方法によって製造し、中間体は適当な供給源から得た。下記は活性測定に用いた方法である。血漿トロンビン時間(ＴＴ) クエン酸処理の正常ヒト血１５０μｌおよび緩衝液または検体２０μｌを３７ ℃で１時間温めた。新たにつくった牛トロンビン１５０μｌ(５ＮＩＨｕ／ml塩水)を加えて凝固が始まり、凝固時間を記録した。０.１％牛血清アルブミンおよび０.０２％アジ化ナトリウム含有のリン酸緩衝液、ｐＨ７.８を使用した。検体をＤＭＳＯに溶解し、緩衝液で希釈した。阻害剤を用いないときは、緩衝液にＤＭＳＯを検体で使用したのと同じ濃度にまで加えた。阻害剤濃度を半対数用紙にトロンビン時間に対しプロットし、トロンビン時間を２倍(４０秒)にする阻害剤濃度を測定した。Ｋｉの測定ヒトα-トロンビンの阻害は、発色基質S-2238の３種の異なる濃度について酵素触媒加水分解によって測定した。検体または緩衝液の２００μｌおよびＳ２２３８の５０μｌを３７℃で１分間インキュベートし、ヒトα−トロンビン５０μｌ(０.２５ＮＩＨμ／ml)を加えた。阻害および非阻害の開始時間を４.５ｎｍで記録した。光学密度の増加をLin eweaver and Burke法によりプロットした。Ｋｍおよび見かけ上のＫｍを測定し、関係からＫｉを計算した。０.１リン酸ナトリウム、０.２ＭＮａＣｌ、０.５％ＰＥＧおよび０.０２％アジ化ナトリウム含有の緩衝液を用い、ｐＨ７.５にオルトリン酸で調整した。検体はＤＭＳＯに溶解した化合物からなる。Ｋｉ測定に関しては、Dixon，M．and Webb，E.C.，"Enzymes"，third edition ，1979，Academic Press(出典明示により本明細書の一部とする)をさらに参照し得る。n/e＝効果なし n/e11.7＝11.7μＭ濃度まで効果なし N.T.＝試験せず

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者グリーン，ドノバンイギリス、イー17・６エイイー、ロンドン、ウォルサムストー、グロスター・ロード50番 (72)発明者スコルダラケス，エマニュエルイギリス、エスイー14・５エルユー、ロンドン、テレグラフ・ヒル、ウォーラー・ロード166番 (72)発明者スカリー，マイケル・フィンバーイギリス、シーエム11・２エックスエヌ、エセックス、クレイズ・ヒル、ダグラス・ハウス (72)発明者グッドウィン，クリストファー・アンドリューイギリス、ビーエイ２・２エスピー、エイボン、バス、オッド・ダウン、オールド・フォッセ・ロード67番 (72)発明者カカー，ビジャイ・ビールイギリス、エスオー３・６エイチエヌ、ハンプシャー、ウォーサッシュ、ブルック・アベニュー、ハンブルズ・エッジ

Claims

【特許請求の範囲】１．標的アミノ酸配列をつくるための下記工程： (ｉ)官能基とカップルした固相を準備し； (ii)それと官能基に反応性の化合物とを選択的に反応せしめ、その反応した化合物はアミノ基またはカルボキシル基あるいはその反応誘導体と反応できる官能基を有し； (iii)標的アミノ酸配列の末端アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基(その反応誘導体の形態でもあり得る)に、選択的に前記の反応化合物の官能基を反応せしめ； (iv)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列において配列的に後続するアミノ酸を前記の先行アミノ酸にカップルせしめ； (ｖ)工程(iv)を必要に応じて何回も繰り返えし； (vi)工程(ｉ)〜(iv)を使って製造した固相連結化合物を酸または塩基の作用で固相から開裂する；を含み、ホウ酸基[−B(OH)₂]を含有する化合物またはそのエステルあるいは誘導体を、その固相からの開裂に先立ち、固相結合化合物に組み入れることを特徴とする、ペプチドまたはペプチド含有化合物を製造する方法。２．工程(ii)において、アミノ酸のアミノ基または選択的に誘導されたカルボキシ基を、例えば通常の固相ペプチド合成の部分としての固相に直接的または間接的にカップルした官能基に反応せしめることを含む、請求項１の方法。３．ホウ酸基を含有する化合物がアミノ酸ホウ酸、ペプチドホウ酸またはいずれかのボロネートエステルであり、工程(ii)がアミノ酸またはペプチドホウ酸またはエステルを固相にカップルしたジオールに反応せしめ、適当にリンカー、下記式の部分： (R'は天然または非天然のアミノ酸、またはその同族体であり、この同族体は選択的に天然ペプチド結合以外の結合を形成し得る他の官能基で置換されたアミノ基および／または置換されたα水素原子を有する)を介して、それにカップルした固相を形成せしめることを含む、請求項１の方法。４．方法が、 (ｉ)アルコール性ヒドロキシ基をカップルした固相を準備し； (ii)アミノ酸ホウ酸またはペプチドホウ酸をヒドロキシ基と反応せしめ、それによってホウ酸残基を固相にエステル化し； (iii)最終産物においてペプチドホウ酸またはボロネートエステルに配列的に後続するアミノ酸のカルボキシル基に、固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸のアミノ基を選択的に反応せしめ； (iv)工程(iii)を必要に応じて何回も繰り返えし； (ｖ)生成ペプチドボロネートを樹脂から開裂する；工程を含み、場合によっては、この方法は上記の化合物の製造工程に更に１以上の工程を含む、ペプチドホウ酸またはペプチドボロネートエステル含有の化合物を製造する方法。５．固相にカップルした各アミノ酸が保護されたアミノ基を有し、工程(iii)が配列的に先行するアミノ酸のアミノ基を脱保護することを含み、および／または工程(v)の開裂が酸またはエステル交換反応によりなされる、請求項４の方法。６．ペプチド含有化合物の固相合成におけるアミノ酸またはペプチドホウ酸またはボロネートエステルの使用。７．ヒドロキシ残基を介して固相に接着したホウ酸残基の、固相合成における使用８．方法が、 (ｉ)アルコール性ヒドロキシ基とカップルした固相を準備し； (ii)ホウ酸またはボロネートエステルをヒドロキシ基に反応せしめ、それによってホウ素残基を固相にエステル化し； (iii)上記化合物の製造のために更に１以上の工程を実行する；ことを含む、ホウ素原子含有の化合物を製造する方法。９．ヒドロキシ基を介してホウ酸残基にカップルした固相材。１０．下記式の部分： (式中、Ｒはホウ素に結合する残基であり、部分の固相との結合に介する酸素は、選択的に置換され得るアルキレン残基に直接的にまたはカルボニル基に選択的に結合する)にカップルした固相材。１１． (ａ)セリン・プロテアーゼの活性部位に結合し、それを阻害する触媒的部位指向部分(ＣＳＤＭ)、 (ｂ)外部位関連部分(ＥＡＭ)；および、場合によって、 (ｃ)ＥＡＭとＣＳＤＭを結合するコネクター部分を含み、ＣＳＤＭおよびＥＡＭはセリン・プロテアーゼの分子と同時に結合でき、ただし阻害剤はトロンビンではないことを含む、二重機能性セリン・プロテアーゼ。１２．ＣＳＤＭが、Arg、Lysまたはその同族体であるか、または疎水性であるP1 残基および下記から選択される(P4)P3P2残基を有する、請求項１１の阻害剤。１３．ＥＡＭが下記から選択されるアミノ酸配列である、請求項１１または１２の阻害剤。１４．コネクター部分が、 -λ-σ- (式中、λは式HO₂(CH₂)_hCO₂Hの非ペプチドリンカーの残基であり、hは2-6であり、σは少なくとも２個の隣接Gly残基を含有するペプチドスペーサーである)である、請求項１−３の阻害剤。１５．標的アミノ酸配列をつくるための下記工程： (ｉ)アミノ基または好ましくはカルボキシル基あるいはその活性誘導体と反応し得る官能基にカップルした固相を準備し； (ii)本発明化合物のアミノ酸配列の末端アミノ酸のアミノまたはカルボキシル基を選択的に該官能基に反応せしめ、カルボキシル基は選択的にその活性誘導体の形であり； (iii)固相にカップルした配列的に先行するアミノ酸に標的配列中で配列的に続けるアミノ酸を該先行アミノ酸にカップルせしめ； (iv)必要に応じて工程(iii)を何回もくり返す；を含む請求項１１−１４の阻害剤を製造する方法。１６．工程(iii)の配列的に後続する該アミノ酸をこの工程の先行する該アミノ酸に、アミノ基と反応し得る２個の官能基を有する化合物を介してカップルする工程(v)をさらに含む(これにより、該官能基のひとつが該先行アミノ酸のアミノ基に、他のひとつが該後続アミノ酸のアミノ基に結合することになる)、請求項１５の方法。１７．固相に接着した官能基に反応する端末アミノ酸がＥＡＭのＣ末アミノ酸であり、工程(iii)がＥＡＭ配列の継続アミノ酸と隣接コネクターペプチドの継続アミノ酸とをカップルするように繰り返される、請求項１４または１５の方法。１８．固相にカップルした非妨害アミノ酸配列の最終アミノ酸が２個のカルボキシレート基を有する化合物またはその反応性誘導体と反応し、非反応のカルボキシレートまたはカルボキシレート誘導体がＣＳＤＭのＮ末アミノ酸であるアミノ酸のアミノ基と典型的に反応する、請求項１５−１７の方法。１９．該Ｎ末アミノ酸がＣＳＤＭの残留物とすでに結合し、ＣＳＤＭがＣ末カルボキシ基の代わりにヘテロ原子を有する、請求項１８の方法。２０．ヒト用または動物用医薬としての使用のために製剤された請求項１−４の阻害剤を含む医薬製剤(製剤は選択的に薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体を含有する)。２１．請求項１−４の阻害剤の治療的または予防的な効果量を患者または動物に経口的または非経口的に投与することを含む、セリン・プロテアーゼの阻害による処置が可能な疾患または障害を治療的または予防的に処置する方法。