JP2003012702A

JP2003012702A - 低分子キトサンの製造方法

Info

Publication number: JP2003012702A
Application number: JP2002120276A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Fukazawa; 徹也深沢
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2003-01-15

Abstract

(57)【要約】【課題】高分子キトサンから低分子キトサンを再現性
よく生産する方法の提供。【解決手段】アセチル化度が１０〜３０％で分子量が
１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキトサ
ン分解酵素で加水分解し、次いで分子量１万未満の画分
を除去することにより、分子量が１万以上１００万未満
の低分子キトサン又はその塩を製造する方法であって、
前記キトサン分解酵素は、ｐＨ７．０〜７．５、温度３
７℃で１０〜２０分間の反応条件下で、３０％アセチル
化キトサン（粘度100〜300 cps）に対する加水分解活性
を１００％とした場合に、グリコールキチンに対する加
水分解活性が１００％より小さく、アセチル化度が１％
以下のキトサン（粘度50〜200 cps）に対する加水分解
活性が１５％以下である前記の方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、低分子キトサンの
製造方法、低分子キトサンおよび低分子キトサンを含む
医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】キチンは天然に非常に多く存在する多糖
であり、主としてカニ・エビ等の甲殻類およびイカ軟甲
から工業的規模で抽出され生産されている。キトサン
は、キチンを濃アルカリ水で処理することにより得られ
る、アミノ基を有する高分子多糖であり、さまざまな生
理活性を有することが知られている（技報堂「キチン・
キトサンハンドブック」302-376頁参照）。なかでも、キ
トサンは天然物由来物質としては強力な抗菌作用を有
し、かつ安全性が合成抗菌剤と比較して非常に高い（例
えば「キチン・キトサンの活用法」財界特別増刊第46巻
28号106-111頁1998年参照）ことが知られている。特
に、メチシリンセフェム耐性黄色ブドウ球菌（methichi
lin resistants aureus）(以下、「MRSA」と記す)を含
むスタヒロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aur
eus）（例えば加工技術33巻512-515頁1998年、名城大学
農学部学術報告34巻25-34頁1998年、繊維科学35巻37-39
頁1993年、大阪府立公衆衛生研究所研究報告薬事指導
編No.29, 7-12頁1995年、加工技術32巻339-343頁1997
年、加工技術33巻530-532頁1998年、等参照）、エシェ
リキア・コリ（Escherichia coli）（例えばTokura S e
t al. Macromol. Symp. 120, 1-9, 1997等参照）、シュ
ードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）
（例えばLoke WK et al. J. Biomed. Mater. Res. 53,
8-17, 2000, Kim H. J.et al. J. Biomater. Sci. Pol
ym. Ed. 10, 543-56, 1999等参照）等の細菌に対して効
果があることが知られている。ところで、現在はこれら
の菌に効果がある合成抗菌剤に対する耐性菌の出現が大
きな問題となっている。キトサンが有している抗菌作用
は、定かではないが、合成抗菌剤とはメカニズムが異な
ることが期待される。したがって、合成抗菌剤に対する
耐性菌であってもキトサンに対しては感受性である可能
性がある。しかしながら、MRSA以外の薬剤耐性菌に対す
るキトサンの効果は、全く検討されていない。また、院
内感染等で問題となっているセラチア・マルセッセンス
（Serratia marcescens）に対する効果も検討されてい
ない。さらに口腔衛生に関与するストレプトコッカス・
ミュータンス（Streptococcus mutans）に関しては、キ
トサン誘導体（例えばKurita K. et al. Chem. Lett. 3
17-318, 1998等参照）あるいはイカ軟甲由来キトサン
（例えば特開平7-157434等参照）が有効であることが報
告されている。しかしながら、キトサンの安全性は確認
されているが、その誘導体に関しては不明であるので、
キトサンを誘導体化しないで用いたほうが望ましい。さ
らにエビ・カニ由来のキトサンには効果がなく、イカ軟
甲由来キトサンにのみS. mutansが感受性であると言わ
れているが、イカ軟甲由来キトサンは将来にわたり安定
に素材が供給されるかどうか不明である。エビ・カニ等
は養殖が可能であるから、素材の安定供給が見込める物
質から生産されるキトサンのほうが素材として望まし
い。

【０００３】キチンから製造されたキトサンは分子量１
００万以上の高分子多糖であり、酸性条件下でのみ水に
可溶性である。中性あるいはアルカリ性では水不溶性に
なり、生理活性が十分に発揮できない状態にある。そこ
で、水に対する溶解性を増すために、高分子キトサンの
誘導体化あるいは、高分子キトサンが有する生理活性を
損ねずに低分子化するといった試みがなされている。誘
導体化を行うと天然物ではなくなり、安全性を確保する
必要が生じるので、後者の方法が望ましい。

【０００４】たとえば、高分子キトサンが有する抗菌活
性は、分子量が1万以上の低分子キトサンでも発揮され
ることが知られている（例えば日本農芸化学会誌74巻大
会公演要旨集公演番号２E183α等参照）。さらに、分
子量１万以下のキトサンは、皮膚刺激性等の副作用があ
るとも報告されており（例えば特開2000−169327参
照）、分子量1万以上１００万未満の低分子キトサンの
製造法が検討されている。方法としては、化学的あるい
は酵素的手法による高分子キトサンの加水分解が検討さ
れてきた。化学的手法としては、酸化剤で処理する方法
（例えば特許第3076212号公報、特開平10-158305公報等
参照）、超音波処理する方法（例えばキチン・キトサン
研究5巻75-79頁1999年等参照）などが挙げられ、酵素的
手法としてはキトサナーゼを用いる方法（例えば特許第
2763112号公報、特開平11-322809公報等参照）、キチナ
ーゼを用いる方法（例えば日本農芸化学会誌74巻大会公
演要旨集公演番号２F313α等参照）などが挙げられ
る。しかしながら酸化剤で処理する方法では分子量分布
が不明であり、かつ常に同じ分子量の低分子キトサンが
得られるかどうか不明である。超音波処理する方法は大
量製造に不向きであると考えられる。さらにキトサナー
ゼを用いる方法は、常に同じ分子量の低分子キトサンを
得るための反応制御が煩雑であるという問題点があっ
た。キチナーゼを用いた高分子キトサンの加水分解で
は、分子量１万以上の低分子キトサンが得られるかどう
か不明である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】将来にわたり供給が確
保されているエビ・カニ由来の高分子キトサンを素材と
して用い、中性条件下でも水に可溶であり、なおかつ安
全性が確保されている非誘導体の低分子キトサンを、常
に同じ分子量分布を有する状態で供給できる方法が必要
である。また、得られた低分子キトサンが高分子キトサ
ンと同等以上の抗菌活性を有し、さらにS. aureus, E.
coli, P. aeruginosa等の合成抗菌剤耐性菌に対する抗
菌作用も標準菌株と同程度有しており、S. marcescens
およびS. mutansに対しても他の菌株同様の効果がある
ことが望ましい。

【０００６】本発明は、高分子キトサンから低分子キト
サンを再現性よく生産する方法を提供することを目的と
する。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、目的とす
る物性・抗菌作用を有する低分子キトサンを効率よく、
かつ再現性よく生産する方法について鋭意検討を行った
ところ、本発明者がすでに報告しているバシラス・エス
ピー(Bacillus sp.)SANK70699株(FERM BP-6666)由来の
キトサン分解酵素（特開2000-312583公報参照）を用い
た酵素反応により、カニ・エビ由来の高分子キトサンか
ら分子量１万以上１００万未満の低分子キトサンを作製
することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】本発明の要旨は以下の通りである。（１）アセチル化度が１０〜３０％で分子量が１００
万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキトサン分解
酵素で加水分解し、次いで分子量１万未満の画分を除去
することにより、分子量が１万以上１００万未満の低分
子キトサン又はその塩を製造する方法であって、前記キ
トサン分解酵素は、ｐＨ７．０〜７．５、温度３７℃で
１０〜２０分間の反応条件下で、３０％アセチル化キト
サン（粘度100〜300 cps）に対する加水分解活性を１０
０％とした場合に、グリコールキチンに対する加水分解
活性が１００％より小さく、アセチル化度が１％以下の
キトサン（粘度50〜200 cps）に対する加水分解活性が
１５％以下である前記の方法。（２）低分子キトサン又はその塩が、０〜１００℃の水
１００ｇに対して１０ｇ以上溶解するものである（１）
記載の方法。（３）低分子キトサン又はその塩が抗菌活性を有するも
のである（１）または（２）に記載の方法。（４）キトサン分解酵素がバシラス・エスピー(Bacillu
s sp.)SANK70699株(FERMBP-6666)又はバシラス・エスピ
ー(Bacillus sp.)SANK70799株(FERM BP-6667)由来のキ
トサン分解酵素である（１）〜（３）のいずれかに記載
の方法。（５）ｐＨ３〜１２および７０℃以下の条件下で、１０
分〜７日間、高分子部分アセチル化キトサンをキトサン
分解酵素で加水分解する（１）〜（４）のいずれかに記
載の方法。（６）高分子部分アセチル化キトサンを酸性条件下で水
に溶解した溶液にアルカリを加えて弱アルカリ性にした
後、キトサン分解酵素を加えて加水分解を行い、低分子
キトサン又はその塩を生成する（１）〜（５）のいずれ
かに記載の方法。（７）分子量が１万以上１００万未満で、０〜１００℃
の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解する低分子キトサ
ン又はその塩。（８）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を含む医
薬組成物。（９）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効成
分として含有する創傷及び／又は褥創の予防及び／又は
治療剤。（１０）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効
成分として含有する抗菌剤。（１１）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効
成分として含有する抗高脂血症剤。（１２）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効
成分として含有する抗動脈硬化症剤。（１３）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効
成分として含有する抗糖尿病剤。（１４）（７）記載の低分子キトサン又はその塩を有効
成分として含有する抗肥満剤。（１５）アセチル化度が１０〜３０％で分子量が１００
万以上の高分子部分アセチル化キトサンが甲殻類由来で
あることを特徴とする、（１）に記載の方法。（１６）ｐＨ３乃至１２、７０℃以下の条件下にて、１
０分乃至７日間、アセチル化度が１０〜３０％で分子量
が１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキト
サン分解酵素で加水分解することを特徴とする、（１
５）記載の方法。（１７）ｐH６．０乃至７．５、３７℃乃至４０℃の条
件下にて、２乃至３日間、８０乃至１７０ｒｐｍで振盪
しつつ、アセチル化度が１０〜３０％で分子量が１００
万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキトサン分解
酵素で加水分解することを特徴とする、（１６）に記載
の方法。（１８）アセチル化度が１０〜３０％で分子量が１００
万以上の高分子部分アセチル化キトサンを、予めｐH
２．５乃至３．５の条件下で水に溶解せしめた後アルカ
リを加えてｐH６．０乃至７．５へ調整することを特徴
とする、（１）又は（１５）乃至（１７）のいずれか一
つに記載の方法。（１９）キトサン分解酵素がバシラス・エスピー(Bacil
lus sp.)SANK70699株(FERM BP-6666)又はバシラス・エ
スピー(Bacillus sp.)SANK70799株(FERM BP-6667)由来
のキトサン分解酵素であることを特徴とする、（１５）
乃至（１８）のいずれか一つに記載の方法。（２０）（１）又は（１５）乃至（１９）のいずれか一
つに記載の方法により製造される、分子量１万以上百万
未満の低分子キトサン又はその塩。（２１）０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上
溶解することを特徴とする、（２０）記載の低分子キト
サン又はその塩。（２２）１質量％低分子キトサン塩水溶液のｐHがｐH
４．８乃至６．３であることを特徴とする、（２０）又
は（２１）に記載の低分子キトサン又はその塩。（２３）１質量％低分子キトサン塩水溶液にアルカリを
添加した場合に沈殿物が析出するｐHがｐH６．４乃至
８．２であることを特徴とする、（２０）又は（２１）
に記載の低分子キトサン又はその塩。（２４）下記［Ｉ］乃至［ＩＶ］の性質を有する低分子
キトサン又はその塩；［Ｉ］分子量が１万以上百万未満
であること：［ＩＩ］０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上
溶解すること：［ＩＩＩ］のｐHがｐH４．８乃至６．３であること：［ＩＶ］１質量％低分子キトサン塩水溶液にアルカリを
添加した場合に沈殿物が析出するｐHがｐH６．４乃至
８．２であること。（２５）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を含有する医薬組成物。（２６）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
抗菌剤。（２７）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
抗高脂血症剤。（２８）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
抗動脈硬化症剤。（２９）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
抗肥満剤。（３０）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
抗糖尿病剤。（３１）（２０）乃至（２４）のいずれか一つに記載の
低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含有する
創傷及び／又は褥創の治療及び／又は予防剤。本発明
は、アセチル化度が１０〜３０％で分子量が１００万以
上の高分子部分アセチル化キトサンをキトサン分解酵素
で加水分解し、次いで分子量１万未満の画分を除去する
ことにより、分子量が１万以上１００万未満の低分子キ
トサン又はその塩を製造する方法であって、前記キトサ
ン分解酵素は、ｐＨ７．０〜７．５、温度３７℃で１０
〜２０分間の反応条件下で、３０％アセチル化キトサン
（粘度100〜300 cps）に対する加水分解活性を１００％
とした場合に、グリコールキチンに対する加水分解活性
が１００％より小さく、アセチル化度が１％以下のキト
サン（粘度50〜200 cps）に対する加水分解活性が１５
％以下である前記の方法を提供する。低分子キトサンの
分子量は、好ましくは、１万〜５０万であり、より好ま
しくは、５万〜３０万である。低分子キトサン又はその
塩は、０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶
解するものであるとよい。水は、蒸留水、水道水、井戸
水であるとよい。さらに、低分子キトサン又はその塩
は、ｐＨ１．０〜１２．０の条件下、好適にはｐＨ１．
０〜７．０の条件下で、１００ｇの水に１０ｇ以上溶解
するものであるとよい。また、低分子キトサン又はその
塩は抗菌活性を有するものであるとよい。

【０００９】キトサン分解酵素の一例として、バシラス
・エスピー(Bacillus sp.)SANK70699株(FERM BP-6666)
及びバシラス・エスピー(Bacillus sp.)SANK70799株（F
ERM BP-6667：特開2000-312583参照）由来のキトサン分
解酵素を挙げることができる。

【００１０】上記の方法において、ｐＨ３〜１２および
７０℃以下の条件下で、１０分〜７日間、高分子部分ア
セチル化キトサンをキトサン分解酵素で加水分解すると
よい。高分子部分アセチル化キトサンを酸性条件下（例
えば、ｐＨ１〜６、好適にはｐＨ２〜４、より好適には
ｐＨ２．５〜３．５）で水に溶解した溶液にアルカリ
（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、苛性
ソーダなど）を加えて弱アルカリ性（通常ｐＨ５以上、
好適にはｐＨ６〜１１、より好適にはｐＨ６〜７．５）
にした後、キトサン分解酵素を加えて加水分解を行い、
低分子キトサン又はその塩を生成することができる。酸
性条件にするために使用する酸としては、塩酸、酢酸、
トリフルオロ酢酸、パラトルエンスルホン酸、アクリル
酸、乳酸、アミノ酸、クエン酸、サリチル酸、グルクロ
ン酸、グリコール酸等を挙げることができる。この酸と
低分子キトサンが反応して、低分子キトサン塩が生成す
る。加水分解の温度は、通常７０℃以下、好適には２５
乃至５０℃、より好適には３７乃至４０℃である。加水
分解の時間は、通常１時間以上、好適には１時間乃至５
日間、より好適には２乃至３日間である。

【００１１】また、本発明は、分子量が１万以上１００
万未満で、０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以
上溶解する低分子キトサン又はその塩を提供する。

【００１２】さらに、本発明は、本発明の低分子キトサ
ン又はその塩を含有する医薬組成物を提供する。本発明
の医薬組成物が含有する低分子キトサンの塩は、医薬的
に許容できるものであるとよい。

【００１３】本発明の医薬組成物は、抗菌剤として、創
傷及び／又は褥創の治療及び／又は治療のために用いる
ことができる。

【００１４】また、本発明は、本発明の低分子キトサン
を含有する抗糖尿病剤、抗高脂血症剤、抗動脈硬化症剤
および抗肥満剤を提供する。

【００１５】キトサンのアセチル化度は、¹H-NMRにより
得られるアセチル基の３Hとアセチル基以外の、水酸基
を除く７Hとの積分比から算出することができる。

【００１６】キトサン分解酵素の加水分解活性は、Rand
le-Morgan法(Randle C.J.M et al.Biochem. J. GL 586-
589, 1955)に記載の方法に従って、後述の実施例１に記
載のようにして測定することができる。

【００１７】グリコールキチンは、R. Senzyu and S. O
kimatsu, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 23, 432 (1950)
に記載のようにして製造することができる。

【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１９】なお、本明細書において、「〜」はその前
後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値とし
て含む範囲を示す。

【００２０】

【発明の実施の形態】キチンを工業的にアルカリで脱ア
セチル化してキトサンを製造する際、完全に脱アセチル
化しない部分アセチル化キトサンが生成することが知ら
れている（キチン・キトサンハンドブックｐ．７０７
−７０９，１９９５技報堂）。部分アセチル化キトサ
ンのアセチル化度はアルカリ濃度、反応時間等により制
御できることが知られており、エビ・カニ由来の30％、
20％、10％アセチル化キトサンが市販されている（商品
名キトサン７B、８B、９B。いずれも加ト吉（株）
製）。これらの部分アセチル化キトサンは分子量１００
万以上の高分子であり、これを酸性条件下で水に溶解し
た後、本発明者が以前見出したSANK70699株(FERM BP-66
66)が生産するキトサン分解酵素を用いて加水分解する
ことにより、分子量１万以上１００万未満の低分子キト
サンをさまざまな塩として効率よく得ることができる。

【００２１】基質となるは、0.1〜5質量％好適には0.25
〜2質量％、さらに好適には0.5〜1質量％濃度がよい。

【００２２】高分子部分アセチル化キトサンはエビ・カ
ニ等の甲殻類由来であるとよい。高分子部分アセチル化
キトサンの分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィ（ＧＰＣ）を用いる高速液体クロマトグラフィー
（プルランを標準物質とする）により、測定することが
できる（滝口ら、キチン・キトサン研究ｐ.75-79,199
9）。この方法で測定した分子量は、平均分子量及び分
子量分布である。

【００２３】高分子部分アセチル化キトサンのアセチル
化度は、指示薬としてトルイジンブルー溶液を用い、１
／４００Ｎポリビニル硫酸カリウム溶液でPVSKコロイド
滴定を行うことにより測定することができる（Toei K.
et al. Anal. Chem. Acta 83, 59, 1976）。この方法で
測定したアセチル化度は、アセチル化されているアミノ
基の％（例えば、アセチル化度が１％とは、１００個の
アミノ基のうち１個がアセチル化されていることを意味
する）を表す値である。

【００２４】本発明の方法において使用する酵素は、ｐ
Ｈ７．０〜７．５、温度３７℃で１０〜２０分間の反応
条件下で、３０％アセチル化キトサン（粘度100〜300 c
ps）に対する前記キトサン分解酵素の加水分解活性を１
００％とした場合に、グリコールキチンに対する前記キ
トサン分解酵素の加水分解活性が１００％より小さく、
アセチル化度が１％以下のキトサン（粘度50〜200 cp
s）に対する前記キトサン分解酵素の加水分解活性が１
５％以下であればよい。本発明の製造方法に使用するこ
とができるキトサン分解酵素としては、細菌、放線菌、
糸状菌、酵母等の生産する酵素を挙げることができる。

【００２５】細菌の生産する酵素としては、バチルス
（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Corynebacteriu
m）属（Veldkamp, H., Nature, 169, 500(1952)参
照）、サイトファーガ（Cytophaga）属、アクロモバク
ター・ヒテロプティカム(Acromobacter hyteropticum:
Campbell, Jr., L.L. et al., J. Gen. Microbiol., 5,
894(1951)参照)、フラボバクテリウム（Flavobacteriu
m）属及びミクロコッカス・コルポゲネス（Micrococcus
colpogenes）の生産するキトサン分解酵素（Campbell,
Jr., L. L., et al., J. Gen. Microbiol., 5, 894(19
51)参照）、並びに、アルテロモナス・エスピー（Alter
omonas sp.）の生産するキチナーゼＡ（GenBank Access
ion No.D13762）等を例示することができ、好適にはバ
チルス属の生産するキトサン分解酵素である。バチルス
（Bacillus）属の生産する酵素としては、バチルス・エ
スピー SANK70699(FERM BP-6666)株、バチルス・エスピ
ー SANK70799(FERM BP-6667)株、バチルス・アルヴェイ
（Bacillus alvei：Cody, R. M.,Cur. Microbiol., 19,
201(1989)参照）、バチルス・サーキュランス（Bacill
us circulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacill
us licheniformis：Cody,R. M., Cur. Microbiol., 19,
201(1989)参照）、バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis）、バチルス・チュリンジエンシス（Bacillus
thuringiensis）、バチルス・キチノスポルス（Bacillu
s chitinosporus：：Cody, R. M., Cur.Microbiol., 1
9, 201(1989)参照）、バチルス・プルヴィファシエンス
（Bacillus pulvifaciens：Cody, R. M., Cur. Microbi
ol., 19, 201(1989)参照）及びバチルス・メセランス
（Bacillus mecerans：Cody, R. M., Cur. Microbiol.,
19,201(1989)参照）の生産するキトサン分解酵素等を
例示することができ、より具体的には、バチルス・サー
キュランスの生産するキチナーゼＡ１（GenBank Access
ion No.Ｍ57601）、Ｃ１（GenBank Accession No.D8956
8）及びＤ（GenBank Accession No.D10594）、バチルス
・リケニフォルミスの生産するキチナーゼ（GenBank Ac
cession No.U71214）、バチルス・ズブチリスの生産す
る蛋白質（GenBank Accession No.D26185）、バチルス
・チュリンジエンシスの生産するキチナーゼ（GenBank
Accession No.U89796）、バチルス・サーキュランスWL-
12株の生産するキトサン分解酵素（Tanaka, H., et a
l., J. Gen. Appl. Mcrobiol., 16, 39(1970)参照）、
バチルス・リケニフォルミスX-7u株の生産するキトサン
分解酵素（Takiguchi, Y., et al., Agric. Biol. Che
m, 53, 1539(1989)参照）等を例示することができ、よ
り好適にはバチルス・エスピー SANK70699(FERM BP-666
6)株及びバチルス・エスピー SANK70799(FERM BP-6667)
株の生産するキトサン分解酵素である。サイトファーガ
属の生産するキトサン分解酵素としては、サイファーガ
・ジョンソネー（Cytophga johnsonae：Stainer, R.
Y., J. Bacteriol., 53, 297(1947)参照）及びサイトフ
ァーガ・ジョンソニイ（Cytophaga johnsonii：Saundar
raj, N., et al., Arch., Mcrobiol., 85, 159(1972)参
照）の生産するキトサン分解酵素等を例示することがで
きる。フラボバクテリウム属の生産するキトサン分解酵
素としては、フラボバクテリウム・インドルテチクム
（Flavobacterium indoltheticum）株の生産するキトサ
ン分解酵素（Campbell, Jr., L.L., et al., J. Gen. M
icrobiol., 5, 894(1951)参照）、フラボバクテリウム
・メニゴセプチクム（Flavobacterium menigosepticu
m）の生産するエンド−N−アセチルグルコサミニダーゼ
（endo-N-acetylglucosaminidase）Ｆ１（GenBank Acce
ssion No.Ｍ80793）、Ｆ２（GenBank Accession No.L06
331）及びＦ３（GenBank Accession No.L06332）等を例
示することができる。

【００２６】放線菌の生産する酵素としては、ストレプ
トミセス（Streptomyces）属、ノカルディオプシス（No
cardiopsis）属及びアクチノミセス（Actinomyces）属
の生産するキトサン分解酵素等を例示することができ
る。ストレプトミセス属の生産する酵素としては、スト
レプトミセス・アエロコロニゲネス（Streptomyces aer
ocolonigenes：中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 3
0, 19(1966)参照）、ストレプトミセス・アルヴィドフ
ラヴス（Streptomyces albidofravus）、ストレプトミ
セス・アルボフラヴス（Streptomyces alboflavus：中
神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19(1966)参
照）、ストレプロミセス・ボビリエ（Streptomyces bob
iliae：中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19(19
66)参照）、ストレプトミセス・シネレオルバー（Strep
tomyces cinereoruber：Tagawa, K., etal., J. Fermen
t. Bioeng., 71, 230(1991)参照）、ストレプトミセス
・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレ
プトミセス・エルスラエウス（Streptomyces erthraeu
s）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces gr
iseus：Reynolds, D. M., J. Gen. Microbiol., 11, 15
0(1954)参照）、ストレプトミセス・リビダンス（Strep
tomyces lividans：Neugebauer, E., et al., Arch.Mic
robiol, 156, 192(1991)参照）、ストレプトミセス・ル
テオヴェルチシラツス（Streptomyces luteoverticilla
tus：中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19(196
6)参照）、ストレプトミセス・オリヴァセウス（Strept
omyces olivaceus）、ストレプトミセス・オリエンタリ
ス（Streptomyces orientalis：Tominaga, Y., et al.,
Agric. Biol. Chem., 40, 2325(1976)参照）、ストレ
プトミセス・パーヴルス（Streptomyces parvullus：中
神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19(1966)参
照）、ストレプトミセス・リモスス（Streptomyces rim
ousus：中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19(19
66)参照）、ストレプトミセス・ロチェイ（Streptomyce
s rochei：中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告, 30, 19
(1966)参照）、ストレプトミセス・ルーバー（Streptom
yces ruber）、ストレプトミセス・ヴィナセウス（Stre
ptomyces vinacceus）、ストレプトミセス・ヴィリドク
ロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、スト
レプトミセス・エリタエウス（Streptomyces erythaeu
s）、ストレプトミセス・オリヴァセオヴィリディス（S
treptomyces olivaceoviridis）、ストレプトミセス・
プリカツス（Streptomyces plicatus）、ストレプトミ
セス・テルモヴィオラセウス（Streptomyces thermovio
laceus）、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces
sp.）Ａ１株（Jeniaux, C., Compt. rend. Soc. Bio
l., 149, 1307(1955)参照）、同Ａ７株（中神照太ら,
工技院醗酵研究所報告, 30, 19(1966)参照）、同Ｓ−８
４株（Ueno, H., et al., J. Gen. Appl. Mcrobiol., 3
6, 377(1990)参照）、及びストレプトミセスNo．73株の
生産するキトサン分解酵素等を例示することができ、よ
り具体的には、ストレプトミセス・アルヴィドフラヴス
HUT 6111株（大宝明, 広島女子大紀要, 2, 15(1967)参
照）、ストレプトミセス・コエリコロルHUT6004株（大
宝明, 広島女子大紀要, 2, 15(1967)参照）、ストレプ
トミセス・エルスラエウスATCC 11635株（Hara, S., et
al., J. Biochem., 105, 484(1989)参照）、ストレプ
トミセス・グリセウスHUT 6037株（大宝明, 広島女子大
紀要,2, 15(1967)参照）、同HUT 6038株（大宝明, 広島
女子大紀要, 2, 15(1967)参照）、ストレプトミセス・
グリセウス var（中神照太ら, 工技院醗酵研究所報告,3
0, 19(1966)参照）、ストレプトミセス・オリヴァセウ
スHUT 6023株（大宝明,広島女子大紀要, 2, 15(1967)参
照）、ストレプトミセス・ルーバーHUT 6014株（大宝
明, 広島女子大紀要, 2, 15(1967)参照）、ストレプト
ミセス・ヴィナセウスHUT 6073株（大宝明, 広島女子大
紀要, 2, 15(1967)参照）及びストレプトミセス・ヴィ
リドクロモゲネスHUT 6076株（大宝明, 広島女子大紀
要, 2, 15(1967)参照）の生産する酵素、ストレプトミ
セス・コエリコロの生産するキチナーゼ（GeneBank Acc
ession No. AL021411）、ストレプトミセス・エリタエ
ウスの生産するキチナーゼ（Swiss-Prot Accession No.
P14529）、ストレプトミセス・リビダンスの生産する
キチナーゼＡ（GeneBank Accession No.D13775）及びＣ
（GeneBank Accession No. D12647）、ストレプトミセ
ス・オリヴァセオヴィリディスの生産するエキソキチナ
ーゼ（GeneBank Accession No. X71080）、ストレプト
ミセス・プリカスツの生産するキチナーゼ−６３（Gene
Bank Accession No. M82804）及びエンド−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼＨ（GeneBank Accession No. K-2
182）、並びにストエエプトミセス・テルモヴィオラセ
ウスの生産するキチナーゼ（GeneBank Accession No. D
14536）等を例示することができる。ノカルディオプシ
ス属の生産する酵素としては、ノカルディオプシス・ア
ルブス（Nocerdiopsis albus）の生産するキトサン分解
酵素等を例示することができ、より具体的には、ノカル
ディオプシス・アルブスsubsp. Prasina OPC-131株（Ts
ujibo, H., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56,
1304(1992)参照）、ノカルディオプシス・エス・ピー S
ANK 60599株(FERM BP-6665)等を例示することができ
る。アクチノミセス属の生産する酵素としては、アクチ
ノミセス・ヴィオラセウス（Actinomyces violaceus：W
igert, H., Naturwiss., 49, 379(1962)参照）の生産す
るキトサン分解酵素等を例示することができる。

【００２７】糸状菌の生産する酵素としては、アスペル
ギルス（Aspergillus）属、リゾプス（Rhizopus）属、
タラロミセス（Talaromyces）属、トリコデルマ（Trich
oderma）属及びペニシリウム（Penicillium）属の生産
するキトサン分解酵素等を例示することができ、好適に
はアスペルギルス属、リゾプス属、タラロミセス属及び
トリコデルマ属の生産するキトサン分解酵素である。ア
スペルギルス属の生産する酵素としては、アスペルギル
ス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペル
ギルス・ニガー（Aspergillu niger）、アスペルギルス
・カンディドス（Aspergillus candidus：Sherif, A.
A., et al., Appl. Mcrobiol., Biotechnol., 35, 228
(1991)参照）及びアスペルギルス・フミガツス（Asperg
illus fumigatus）の生産するキトサン分解酵素等を例
示することができ、より具体的には、アスペルギルス・
ニジュランスの生産するキチナーゼ（GenBank Accessio
n No. D87063及びD87895）、アスペルギルス・ニガーK1
4株の生産する酵素（沖増哲ら, 日本農芸化学会誌, 34,
873(1960)参照）、アスペルギルス・フミガツスQM45h
の生産する酵素（Monreal, J., et al., Can. J. Mcrob
iol., 15., 689(1969)参照）等を例示することができ
る。リゾプス属の生産する酵素としては、リゾプス・ニ
ヴェウス（Rhizopus niveus）及びリゾプス・オリゴス
ポルス（Rhizopus oligosporus）の生産するキトサン分
解酵素等を例示することができ、より具体的には、リゾ
プス・ニヴェウスの生産するキチナーゼ（GenBank Acce
ssion No. D10154）、リゾプス・オリゴスポルスの生産
するキチナーゼI（GenBank Accession No. D10157）、I
I（GenBank Accession No. D10158）及びIII（GenBank
Accession No. D87894）等を例示することができる。タ
ラロミセス属の生産する酵素としてはタラロミセス・エ
メルソイイ(Talaromyces emersoii)の生産するキトサン
分解酵素等を例示することができ、より具体的には、タ
ラロミセス・エメルソイイCBS814.70株の生産するキト
サン分解酵素(McCormack, J., et al., Biotechnol. Le
tt., 13 667 (1991)参照)等を例示することができる。
トリコデルマ属の生産する酵素としては、トリコデルマ
・ハマツム（Trichoderma hamatum）、トリコデルマ・
ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）及びトリコデ
ルマ・ヴィリデ（Trichoderma viride）の生産するキト
サン分解酵素等を例示することができ、より具体的に
は、トリコデルマ・ハマツムの生産するキチナーゼ（Ge
nBank Accession No. Z71415及びU88560）、トリコデル
マ・ハルジアヌム（Trichoderma harzianum）の生産す
るキチナーゼ（GenBank Accession No. L14614及びX800
06）及びトリコデルマ・ヴィリデQM 6a株の生産する酵
素（Monreal, J., et al., Can. J. Mcrobiol., 15., 6
89(1969)参照）等を例示することができる。ペニシリウ
ム属の生産する酵素としては、ペニシリウム・リラシニ
ウム（Penicillium lilacinium）の生産するキトサン分
解酵素等を例示することができ、より具体的には、ペニ
シリウム・リラシニウムQM 4eの生産する酵素（Monrea
l, J., et al., Can. J. Mcrobiol., 15., 689(1969)参
照）等を例示することができる。

【００２８】酵母の生産する酵素としては、サッカロミ
セス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）の生
産するキトサン分解酵素等を例示することができ、好適
にはサッカロミセス・セレヴィシエの生産するキチナー
ゼ（GenBank Accession No.M74070）及びORF D9481.7
（GenBank Accession No.U28373）である。

【００２９】より好適には、SANK70699株(FERM BP-666
6)由来のキトサン分解酵素及びSANK70799株(FERM BP-66
67)由来のキトサン分解酵素である。このような酵素
は、SANK70699株又はSANK70799株自身が生産するキトサ
ン分解酵素でもよいし、その変異体または修飾体であっ
てもよく、あるいは、SANK70699株又はSANK70799株のキ
トサン分解酵素をコードする遺伝子を宿主に導入して得
られた形質転換体から生産される組換えタンパク質であ
ってもよい。

【００３０】SANK70699株は平成１１年２月２６日付け
で日本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番
号FERM BP-6666を付された。

【００３１】SANK70799株は平成１１年２月２６日付け
で日本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番
号FERM BP-6667を付された。

【００３２】SANK60599株は平成１１年２月２６日付け
で日本国茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に国際寄託され、受託番
号FERM BP-6665を付された。

【００３３】SANK70699株により生産されるキトサン分
解酵素は、以下の性質を有する。１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分子量５０，０００、６
０，０００及び７０，０００を示す、２）等電点電気泳動法にて等電点ｐＩ３．５を示す、３）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ４乃至ｐ
Ｈ１０．５にて加水分解する、４）８０℃以下で３）記載の加水分解活性を発揮する、５）３）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ７．５及
びｐＨ１０である、６）３）記載の加水分解活性の最適温度はｐＨ７．５で
は６５℃、ｐＨ１０では５０℃である、７）７０℃以下の温度で安定である、８）ｐＨ５乃至ｐＨ１０．５のｐＨ条件下で安定であ
る。９）キトサン７Ｂに対する酵素のｐＨ７．５、温度３７
℃における２０分間の加水分解活性を１００％としたと
きの、他の基質に対する酵素のｐＨ７．５、温度３７℃
における２０分間の加水分解活性を相対値として表１に
示す。表中、キトサン１０Ｂは１％アセチル化キチン、
キトサン９Ｂは１０％アセチル化キチン、キトサン８Ｂ
は２０％アセチル化キチン、キトサン７Ｂは３０％アセ
チル化キチンである（いずれも加ト吉（株）製）。ＣＭ
−セルロースは、カルボキシメチルセルロースナトリウ
ムである（和光純薬社製）。グリコールキチンは、前述
の方法により調製した。

【００３４】

【表１】

【００３５】表１から、この酵素は、グリコールキチン
よりもアセチル化度が１０〜３０％の部分アセチル化キ
トサン（キトサン９Ｂ、８Ｂ、７Ｂ）に対する加水分解
活性が高く、アセチル化度が１％以下のキトサン（キト
サン１０Ｂ）に対する加水分解活性がほとんどないこと
がわかる。カルボキシメチルセルロースナトリウムに対
する加水分解活性はない。１０）GlcNAc6（アセチルグ
ルコサミン６量体）（焼津水産（株）製）をGlcNAc4
（アセチルグルコサミン４量体）とGlcNAc2（アセチル
グルコサミン２量体）に加水分解するが、GlcN6（グル
コサミン６量体）は加水分解しない。

【００３６】SANK70699株、70799株、60599株を始めと
するキトサン分解酵素産生微生物を培地で培養すること
により、キトサン分解酵素を生産させることができる。
例えば、０．１〜５．０％ポリペプトン（和光純薬
（株）製）、０．１〜１．０％イーストエキストラクト
（Difco（株）製）、０．０１〜０．５％リン酸水素カ
リウム、０．００１〜０．０５％硫酸マグネシウム、
０．０５〜０．５％キトサン７Ｂの培地で、１６〜４５
℃で１〜１０日間、１００〜２５０ｒｍｐで振とう培養
する。

【００３７】SANK70799株由来の酵素とSANK70699株由来
の酵素とでは、次の各点が共通である。・ｐH安定性・アルカリ性で活性がある。・アルカリ領域において、相対活性の極大はｐH１０で
ある。・ｐH１０のときの温度依存性・中性ｐH条件下では、すくなくとも５０℃まで安定
（熱耐性）である。・GlcNAc６量体からGlcNAc２量体を生じる。・GlcN６量体は分解しない。・３０％アセチル化キトサンに対する、ｐＨ７．０〜
７．５、温度３７℃における１０〜２０分間の加水分解
活性を１００％とすると、１％アセチル化キトサンに対
する該活性は１５％以下である。

【００３８】キトサン分解酵素は、精製したものでも、
粗精製でもよく、さらには培養上清を精製することな
く、そのまま使用しても差し支えない。酵素使用量及び
使用濃度については、少量でも大量でもよく、特に限定
されない。

【００３９】以上のようにして得られた低分子キトサン
又はその各種塩溶液は、そのまま用いることもできる
が、硫安沈殿・有機溶媒沈殿・遠心分離・凍結乾燥・限
外濾過等により、濃縮することもできる。また、透析・
限外濾過・ゲル濾過・カラムクロマトグラフィー等によ
り精製と脱塩及び分子量分画をすることもできる。本発
明の製造方法により得られた低分子キトサンを透析膜を
用いた透析に供した後、透析膜内の画分を回収すること
により、分子量１万以上の低分子キトサンを得ることが
できる。作製した低分子キトサン塩酸又はその塩の分子
量分布は、デキストランをマーカーとする、ゲル濾過法
で決定することができる。後述の実施例２〜５に記載の
ように、キトサン９B（高分子キトサン９B）からは分子
量７〜２５万がほぼ同量混在した低分子キトサン９B塩
酸塩が、キトサン８B（高分子キトサン８B）からは分子
量７万を中心とした低分子キトサン８B塩酸塩が、キト
サン７B（高分子キトサン７B）からは分子量5.5万を中
心とした低分子キトサン７B塩酸塩が得られた。また、
実施例２〜５を繰り返し、分子量分布を測定したとこ
ろ、いずれの場合もほぼ同じ結果が得られたことから再
現性が確認された。なお、透析膜の排除限界（分子量分
画）の分子量が必ずしも厳密なものではないことは当業
者に周知の事実であり、排除限界より大きい分子及び小
さい分子からなる試料を当該排除限界を有する膜を用い
た透析に供した場合、排除限界より小さい分子が透析膜
内の画分に含有されることがある。本発明においては、
そのような透析後に透析膜内に残る画分に含有される成
分は、便宜上、すべて当該膜の排除限界以上の分子量を
有するものとみなす。例えば、排除限界（分子量分画）
１万の膜を用いた透析後に当該膜内に残る画分に含有さ
れる成分は、すべて分子量１万以上であるとみなす。

【００４０】このように作製した低分子キトサンは、い
ずれの塩であっても水に対する溶解性に優れ、塩酸塩の
場合最大約10質量％濃度の溶液とすることができた。ま
た、低分子キトサン各塩の１質量％水溶液は、pH4.8〜
6.3を示し、低分子キトサン各塩の１質量％水溶液にア
ルカリを添加した場合に沈殿物（コロイド）が析出する
pHはpH6.4〜8.2であった。

【００４１】ここで作製した低分子キトサン又はその各
種塩のうち、塩酸塩が有する生理活性を、抗菌活性を指
標として調べた。抗菌活性を有するための低分子キトサ
ン９B、８B、７B各塩酸塩の最小阻止濃度（Minimum Inh
ibitory Concentration; MIC）は、対象菌がグラム陽性
菌・陰性菌にかかわらず概ね100μg/ml以下であった。
従来知られていなかった、動物濃皮症原因菌スタヒロコ
ッカス・インターメディウス（Staphylococcus interme
dius）、レンサ球菌ストレプトコッカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes）、S. marcescens、気道感
染菌モラキセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhali
s）に優れた抗菌活性を示した。また、さまざまな薬剤
耐性菌、すなわちニューキノロン耐性S. aureus、βラ
クタマ−ゼ生産性E. coli、カルバペネマーゼ生産性P.
aeruginosaに対して、それぞれの標準菌株と同等の優れ
た抗菌活性を示した。さらに、エビ・カニ由来のキトサ
ンでは抗菌活性を示さないとされていた、S. intermedi
usに対しても低濃度で効果があった。また、腸内細菌全
般に対して抗菌活性を示した。特に病原菌となりうる、
エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faeca
lis）、エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcu
s faecium）、エンテロコッカス・ヒラエ（Enterococcu
s hirae）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobac
ter cloacae）、ビブリオ・パラハエモリティクス（Vib
rio parahaemolytics）、クロストレディウム・ヒスト
リティズム（Chrostridium hystolytisum）に優れた抗
菌活性を示した。これらの低分子キトサン塩酸塩の抗菌
活性をS. aureus, S. mutans, S.intermediusおよびバ
シラス・サチリス（Bacillus subtilis）を使用して、
高分子キトサン塩酸塩の抗菌活性と比較した。グラム陽
性菌・陰性菌にかかわらず、およそ2倍から10倍低分子
キトサン塩酸塩のほうが活性が強いことが示された。し
たがって、低分子キトサンは高分子キトサンと同等以上
の優れた生理活性を有していることが示された。このこ
とから高分子キトサンが有するとされている抗菌活性
は、本発明の低分子キトサンにおいても保持されている
ものと考えられる。

【００４２】また、本発明の方法により得られた低分子
キトサン塩酸塩については、欠損傷治癒促進効果、体重
増加抑制効果、血清および肝総コレステロール低下作
用、血清および肝トリグリセライド低下作用、血清中の
HDL-コレステロール上昇作用が認められた。

【００４３】このように優れた生理活性を有しているこ
とから、例えば、創傷・褥創治療及び／又は予防薬、被
覆剤、アトピー性皮膚炎治療及び／又は予防薬、ニキビ
治療及び／又は予防薬等の皮膚外用剤、虫歯治療及び／
又は予防薬等の口腔衛生剤、腸内細菌改善薬等の整腸
剤、院内感染予防薬等の医療分野、食品保存剤等の食品
添加物分野、動物・魚類用飼料等の分野、植物活性増強
剤などの農業分野等で本発明の低分子キトサンおよびそ
の塩を使用することができる。また、抗肥満剤として肥
満および肥満に起因する各種疾患（まとめて「肥満」と
呼ぶ。）の予防及び／又は治療に、抗糖尿病剤として２
型糖尿病およびその合併症（まとめて「糖尿病」と呼
ぶ。）の予防及び／又は治療に、あるいは抗動脈硬化症
剤として動脈硬化症、虚血性心疾患、脳血管障害等の疾
患（まとめて「動脈硬化症」と呼ぶ。）の予防及び／又
は治療に、本発明の低分子キトサンおよびその塩を使用
することができる。さらに、抗高脂血症剤などとして
も、高コレステロール血症、高中性脂肪血症（まとめて
「高脂血症剤」と呼ぶ。）の予防及び／又は治療に使用
しうる。以上、種々の用途を記載したが、本発明の低分
子キトサンおよびその塩の用途は特にこれらの例に限定
されるものではない。

【００４４】本発明の低分子キトサンの使用形態は、目
的に応じて変わるが、上述のような用途に使用するに
は、さまざまな形態をとりうる。以下に列挙するが、特
に限定されるわけではない。低分子キトサンおよびその
塩は、白色固体のまま用いることができる。また、10質
量％濃度の水溶液あるいは有機溶媒溶液、さらに適宜こ
れを希釈して任意の濃度で用いることができる。希釈剤
は水あるいは有機溶媒（アルコール類など）等を使用す
ることができる。最終的にpHが6.5より酸性であれば溶
液として、アルカリ性であればコロイド状化合物として
使用できるが、塩の種類によっては弱アルカリ性でも溶
液として使用できる。さらに、無機物あるいは有機物を
共存させることにより、任意のpHで溶液として用いるこ
とができる。また、低分子キトサン溶液（または低分子
キトサン塩の溶液）あるいは希釈溶液を10質量％以下又
はそれ以上の任意の濃度においてクリーム基材と混合す
ることにより、クリーム剤として使用することができ
る。基材の種類は製剤例に示すが、特にこれに限定され
るものではない。低分子キトサン溶液（または低分子キ
トサン塩の溶液）あるいは希釈溶液を、任意の厚さを有
するフィルムとして使用することができる。プラスチッ
ク様の硬さを有するフィルムは、低分子キトサン溶液
（または低分子キトサン塩の溶液）を、さまざまな厚さ
を有する枠の中で乾燥させることにより得られる。ま
た、柔軟性を有する軟質シートは、低分子キトサン溶液
（または低分子キトサン塩の溶液）に例えばグリセリン
等の溶剤を任意の割合で混合して、さまざまな厚さを有
する枠の中で乾燥させることにより得られる。柔軟性の
度合いは、例えばグリセリン等の溶剤を加える割合で調
節される。さらに、キトサンメチルセルロ−ス複合フィ
ルムは、低分子キトサン溶液（または低分子キトサン塩
の溶液）にメチルセルロースを混合し、さまざまな厚さ
を有する枠の中で乾燥させることにより得られる。スプ
レー製剤として使用する場合には、低分子キトサン（ま
たはその塩）あるいは低分子キトサン溶液（または低分
子キトサン塩の溶液）に、アルコール、噴射剤を加える
とよい。アルコールとしては、エタノールを例示するこ
とができ、噴射剤としては、フロンガス（例えば、トリ
クロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタン、ジク
ロロテトラフルオロエタン、それらの混合物など）、液
化石油ガス（例えば、プロパン、ブタンなど）を例示す
ることができる。

【００４５】本発明の低分子キトサンおよびその塩は、
他の薬剤との合剤として用いてもよい。また、本発明の
低分子キトサンおよびその塩は、医薬品として用いても
よいし、あるいは、特定保健栄養食品として使用しても
よい。医薬または食品として用いる場合には、本発明の
低分子キトサンの塩は、医薬または食品として許容でき
るものであるとよい。本発明の低分子キトサン又はその
塩を医薬品又は食品として用いる場合、上記以外の種々
の形態で投与される。その投与形態としては、例えば錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経
口投与、または注射剤（静脈内、筋肉内、皮下）、点滴
剤、坐剤等による非経口投与を挙げることができる。こ
れらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合
剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁
剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通
常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することがで
きる。錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこ
の分野で従来公知のものを広く使用でき、例えば乳糖、
白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸
カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦
形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グ
ルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチル
セルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリ
ウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、ア
ルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素
ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステ
アリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白
糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑
制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウ
ム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱
粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸
等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポ
リエチレングリコール等の潤沢剤等が例示できる。さら
に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖
衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティン
グ錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。丸剤
の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従
来公知のものを広く使用でき、例えばグルコース、乳
糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タル
ク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチ
ン、エタノール等の結合剤；ラミナラン寒天等の崩壊剤
等が例示できる。坐剤の形態に成形するに際しては、担
体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例
えばポリエチレングリコール、カカオバター、高級アル
コール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合
成グリセリド等を挙げることができる。注射剤として調
製される場合には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ
血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤およ
び懸濁剤の形態に成形するに際しては、希釈剤としてこ
の分野で慣用されているものをすべて使用でき、例え
ば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ
化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステア
リルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル類等を挙げることができる。なお、この場合、
等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコー
ス、あるいはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめても
よく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添
加してもよい。さらに必要に応じて着色剤、保存剤、香
料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有せしめてもよ
い。上記医薬製剤に含まれる有効成分化合物の量は、特
に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常全組成物
中１１００重量％、好ましくは１〜９０重量％含まれる
量とするのが適当である。上記医薬製剤の投与方法は特
に限定は無く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他
の条件、疾患の程度等に応じて決定される。例えば錠
剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル
剤の場合には経口投与される。また、注射剤の場合には
単独であるいはグルコース、アミノ酸等の通常の補液と
混合して静脈内投与され、さらに必要に応じて単独で筋
肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場
合には直腸投与される。その使用量は症状、年齢、体
重、投与方法および剤形等によって異なるが、通常は成
人に対して１日あたり、１０mg〜２０００mg、好適には
１０mg〜５00mg、より好適には１０mg〜１００mgを、症
状に応じて１回または数回に分けて投与することができ
る。また、本発明の低分子キトサンを食品、食品素材又
は食品添加物として使用する場合、上記製剤の形態に加
え、前記水溶液等の形態をとり得る。

【００４６】

【実施例】以下に、実施例、試験例及び製剤例を挙げる
が、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。

【００４７】＜実施例1＞ SANK70699株由来粗酵素液の
調製キトサン７B（加ト吉（株）製）5gを1.0Lの水に懸濁
し、濃塩酸を加えて粉末を完全に溶解してpH2.5とし
た。このキトサン溶液にポリペプトン（和光純薬（株）
製）20g、イースト抽出物（Difco(株)製）10g、燐酸水
素２カリウム2g、硫酸マグネシウム0.4gを加え、１N苛
性ソーダでpH6.8に調整し、全量を1.5Lとした。別に炭
酸ナトリウム50gを水500mlに溶解し、両溶液を別々に12
1℃で15分間滅菌した。室温まで冷却後両溶液を混合
し、好アルカリ性細菌SANK70699株を植菌し、37℃で3日
間、170rpmで振とう培養した。培養終了後、菌体を含む
不溶物は遠心除去し、氷冷下上清１容に対して3容のエ
タノールを加えて30分間放置した。10,000rpm5分間の遠
心分離で沈殿物を得、これを分子量分画1万の透析膜（V
ISKASE SALES CORP.）を用いて、pH7.5の10mMTris/HCl
緩衝液に対して透析を行った。透析終了後溶液を10,000
rpmで10分間遠心し、上清を濾過して粗酵素液500mlを得
た。酵素液の活性は、以下のようにして測定した。pH7.
5 400mM MOPS/Na₂CO ₃緩衝液100μl、キトサン７B酢酸溶
液160μl、酵素液140μlを混合し、37℃で20分間保温し
た後、アセチルアセトン10μlを0.5M炭酸ナトリウム水
溶液500μlに溶かした溶液400μlを酵素反応液に加えて
反応を停止させた後、100℃で20分間保温した。氷冷
後、N,N-ジメチルアミノベンズアルデヒド0.8gをエタノ
ール30ml及び濃塩酸30mlに溶かした混合溶液400μl、エ
タノール1.2mlを反応溶液に加え、75℃で10分間発色反
応させた。氷冷後沈殿物を遠心分離し、上清の530nmに
おける吸光度を測定した。1分間あたり1μmolのグルコ
サミンを生成する酵素活性を１単位として、1mlあたり
0.097単位であった。

【００４８】＜実施例2＞低分子キトサン９B塩酸塩の
調製および分子量分布の測定キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
濃塩酸を加えてpH2.5として粉末を完全に溶解した。飽
和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を
加えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラス
コに移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃
で3日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終
了後、全ての反応液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水
でpH12以上としたのち、10,000rpm10分の遠心分離で沈
殿物を得た。回収した沈殿物を200mlの水に懸濁し、氷
冷下濃塩酸を加えてpH2.5として溶解し、分子量分画1万
の透析膜をもちいて、水に対して透析をおこなった。透
析終了後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。3.4gの
白色綿状固体として低分子キトサン９B塩酸塩が得られ
た。得られた低分子キトサン９B塩酸塩の1％濃度水溶液
を作製し、分子量分布をゲル濾過法で測定した。すなわ
ち、あらかじめpH4.5の200mM酢酸緩衝液で膨潤させたゲ
ル濾過材（Toyopearl HW55 Fine、東ソー（株）製）を
つめたカラム（86×2cm）に、上記水溶液200μlを展開
し、1.75mlずつに分画した。各々の分画液160μlにpH6.
0の400ｍM酢酸緩衝液100μl、水120μl、キトサナーゼ
（和光純薬（株）製）溶液20μl（0.1単位）を加えて10
分間37℃で保温して酵素反応を行った。実施例１と同じ
方法で530nmにおける吸光度を測定した。結果を図１に
示す。この結果から、低分子キトサン９Ｂ塩酸塩は、分
子量７万〜２５万のものがほぼ同量混在していることが
わかった。

【００４９】＜実施例3＞低分子キトサン８B塩酸塩の
調製および分子量分布の測定キトサン８B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
濃塩酸を加えてpH2.5として粉末を完全に溶解した。飽
和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を
加えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラス
コに移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃
で3日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終
了後、全ての反応液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水
でpH12以上としたのち、10,000rpm10分の遠心分離で沈
殿物を得た。回収した沈殿物を200mlの水に懸濁し、氷
冷下濃塩酸を加えてpH2.5として溶解し、分子量分画1万
の透析膜をもちいて、水に対して透析をおこなった。透
析終了後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。4.0gの
白色綿状固体として低分子キトサン８B塩酸塩が得られ
た。得られた低分子キトサンの1％濃度水溶液を作製
し、実施例2と同じ方法で分子量分布を測定した。結果
を図２に示す。この結果から、低分子キトサン８Ｂ塩酸
塩は、分子量７万のものを中心としていることがわかっ
た。

【００５０】＜実施例4＞低分子キトサン７B塩酸塩の
調製および分子量分布の測定キトサン７B 5gを水800mlに懸濁し、濃塩酸を加えてpH
2.5として粉末を完全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリ
ウム水でpHを7.5にあわせた後、水を加えて全量を1000m
lとし、200mlずつを500ml三角フラスコに移し、実施例
１で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3日間80rpmで振
とうして酵素反応を行わせた。反応終了後、全ての反応
液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水でpH12以上とした
のち、10,000rpm10分の遠心分離で沈殿物を得た。回収
した沈殿物を200mlの水に懸濁し、氷冷下濃塩酸を加え
てpH2.5として溶解し、分子量分画1万の透析膜をもちい
て、水に対して透析をおこなった。透析終了後、溶液を
濾過し、濾液を凍結乾燥した。3.4gの白色綿状固体とし
て低分子キトサン７B塩酸塩が得られた。得られた低分
子キトサンの1％濃度水溶液を作製し、実施例2と同じ方
法で分子量分布を測定した。結果を図3に示す。この結
果から、低分子キトサン７Ｂ塩酸塩は、分子量５．５万
のものを中心としていることがわかった。

【００５１】＜実施例5＞ゲル濾過法での分子量分画
の決定デキストランT40、T70、T110、T250（ファルマシア
（株）製）の各1％溶液200μlを、あらかじめpH4.5の20
0mM酢酸緩衝液で膨潤させたゲル濾過材（ToyopearlHW55
Fine）をつめたカラム（86×2cm）に展開し、1.75mlず
つに分画した。水1容に濃硫酸８容を加えた硫酸液1.8m
l、カルバゾール0.25gをエタノール50mlに溶かした溶液
60μlを各々の分画液200μlに加え、100℃で10分間保温
した。氷冷後420nmにおける吸光度を測定した。結果を
図１〜３に示す。

【００５２】＜実施例6＞低分子キトサン９B酢酸塩の
調製キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
酢酸を加えてpH3.5として粉末を完全に溶解した。飽和
炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を加
えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラスコ
に移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3
日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終了
後、全ての反応液を回収し、酢酸を加えてpH3.5とした
のち、分子量分画1万の透析膜をもちいて、水に対して
透析をおこなった。透析終了後、溶液を濾過し、濾液を
凍結乾燥した。4.3gの白色綿状固体として低分子キトサ
ン９B酢酸塩が得られた。

【００５３】＜実施例7＞低分子キトサン８B酢酸塩の
調製キトサン８B 5gを水800mlに懸濁し、酢酸を加えてpH3.
5として粉末を完全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリウ
ム水でpHを7.5にあわせた後、水を加えて全量を1000ml
とし、200mlずつを500ml三角フラスコに移し、実施例１
で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3日間80rpmで振と
うして酵素反応を行わせた。反応終了後、全ての反応液
を回収し、酢酸を加えてpH3.5としたのち、分子量分画1
万の透析膜をもちいて、水に対して透析をおこなった。
透析終了後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。5.4g
の白色綿状固体として低分子キトサン８B酢酸塩が得ら
れた。

【００５４】＜実施例8＞低分子キトサン９Bトリフル
オロ酸塩の調製キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
トリフルオロ酢酸を加えてpH2.5として粉末を完全に溶
解した。飽和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせ
た後、水を加えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml
三角フラスコに移し、実施例１で調製した酵素液5mlを
加え、40℃で3日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせ
た。反応終了後、全ての反応液を回収し、トリフルオロ
酢酸を加えてpH2.5としたのち、分子量分画1万の透析膜
をもちいて、水に対して透析をおこなった。透析終了
後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。5.2gの白色綿
状固体として低分子キトサン９Bトリフルオロ酢酸塩が
得られた。

【００５５】＜実施例9＞低分子キトサン８Bトリフル
オロ酸塩の調製キトサン８B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
トリフルオロ酢酸を加えてpH2.5として粉末を完全に溶
解した。飽和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせ
た後、水を加えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml
三角フラスコに移し、実施例１で調製した酵素液5mlを
加え、40℃で3日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせ
た。反応終了後、全ての反応液を回収し、トリフルオロ
酢酸を加えてpH2.5としたのち、分子量分画1万の透析膜
をもちいて、水に対して透析をおこなった。透析終了
後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。4.8gの白色綿
状固体として低分子キトサン８Bトリフルオロ酢酸塩が
得られた。

【００５６】＜実施例10＞低分子キトサン９Bパラト
ルエンスルホン酸塩の調製キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
パラトルエンスルホン酸を加えてpH2.5として粉末を完
全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5に
あわせた後、水を加えて全量を1000mlとし、200mlずつ
を500ml三角フラスコに移し、実施例１で調製した酵素
液5mlを加え、40℃で3日間80rpmで振とうして酵素反応
を行わせた。反応終了後、全ての反応液を回収し、氷冷
下１％苛性ソーダ水でpH12以上としたのち、10,000rpm1
0分の遠心分離で沈殿物を得た。回収した沈殿物を200ml
の水に懸濁し、パラトルエンスルホン酸を加えてpH2.5
としたのち、分子量分画1万の透析膜をもちいて、水に
対して透析をおこなった。透析終了後、溶液を濾過し、
濾液を凍結乾燥した。6.3gの白色綿状固体として低分子
キトサン９Bパラトルエンスルホン酸塩が得られた。

【００５７】＜実施例11＞低分子キトサン８Bパラト
ルエンスルホン酸塩の調製キトサン８B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
パラトルエンスルホン酸を加えてpH2.5として粉末を完
全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5に
あわせた後、水を加えて全量を1000mlとし、200mlずつ
を500ml三角フラスコに移し、実施例１で調製した酵素
液5mlを加え、40℃で3日間80rpmで振とうして酵素反応
を行わせた。反応終了後、全ての反応液を回収し、パラ
トルエンスルホン酸を加えてpH2.5としたのち、分子量
分画1万の透析膜をもちいて、水に対して透析をおこな
った。透析終了後、溶液を濾過し、濾液を凍結乾燥し
た。5.6gの白色綿状固体として低分子キトサン８Bパラ
トルエンスルホン酸塩が得られた。

【００５８】＜実施例12＞低分子キトサン９Bアクリ
ル酸塩の調製キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
アクリル酸を加えてpH3.5として粉末を完全に溶解し
た。飽和炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた
後、水を加えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三
角フラスコに移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加
え、40℃で3日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせ
た。反応終了後、全ての反応液を回収し、アクリル酸を
加えてpH3.5としたのち、分子量分画1万の透析膜をもち
いて、水に対して透析をおこなった。透析終了後、溶液
を濾過し、濾液を凍結乾燥した。4.6gの白色綿状固体と
して低分子キトサン９Bアクリル酸塩が得られた。

【００５９】＜実施例13＞低分子キトサン９B乳酸塩
の調製キトサン９B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
乳酸を加えてpH3.5として粉末を完全に溶解した。飽和
炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を加
えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラスコ
に移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3
日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終了
後、全ての反応液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水で
pH12以上としたのち、10,000rpm10分の遠心分離で沈殿
物を得た。回収した沈殿物を200mlの水に懸濁し、乳酸
を加えてpH3.5としたのち、分子量分画1万の透析膜をも
ちいて、水に対して透析をおこなった。透析終了後、溶
液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。4.6gの白色綿状固体
として低分子キトサン９B乳酸塩が得られた。

【００６０】＜実施例14＞低分子キトサン８B乳酸塩
の調製キトサン８B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
乳酸を加えてpH3.5として粉末を完全に溶解した。飽和
炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を加
えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラスコ
に移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3
日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終了
後、全ての反応液を回収し、氷冷下１％苛性ソーダ水で
pH12以上としたのち、10,000rpm10分の遠心分離で沈殿
物を得た。回収した沈殿物を200mlの水に懸濁し、乳酸
を加えてpH3.5としたのち、分子量分画1万の透析膜をも
ちいて、水に対して透析をおこなった。透析終了後、溶
液を濾過し、濾液を凍結乾燥した。3.5gの白色綿状固体
として低分子キトサン８B乳酸塩が得られた。

【００６１】＜実施例15＞低分子キトサン７B乳酸塩
の調製キトサン７B（加ト吉（株）製）5gを水800mlに懸濁し、
乳酸を加えてpH3.5として粉末を完全に溶解した。飽和
炭酸水素ナトリウム水でpHを7.5にあわせた後、水を加
えて全量を1000mlとし、200mlずつを500ml三角フラスコ
に移し、実施例１で調製した酵素液5mlを加え、40℃で3
日間80rpmで振とうして酵素反応を行わせた。反応終了
後、全ての反応液を回収し、乳酸を加えてpH4.0とした
のち、分子量分画1万の透析膜をもちいて、水に対して
透析をおこなった。透析終了後、溶液を濾過し、濾液を
凍結乾燥した。2.6gの白色綿状固体として低分子キトサ
ン７B乳酸塩が得られた。

【００６２】＜実施例16＞低分子キトサン各塩の水に
対する溶解性実施例２〜４及び６〜１５にて調製した低分子キトサン
各塩100mgを水10mlに溶かし、pHを測定した。この溶液
に１N苛性ソーダ水を少しずつ加え、溶液が白濁してコ
ロイドが析出するpHを測定した。結果を表２に示す。

【００６３】

【表２】

【００６４】＜実施例17＞高分子キトサン塩酸塩の調
製キトサン９B（加ト吉（株）製）1gを200mlの水に懸濁
し、濃塩酸でpH2.5にあわせて、完全に溶解した。これ
を水に対して透析後、凍結乾燥を行い、537mgの白色綿
状固体として、高分子キトサン９B塩酸塩が得られた。
高分子キトサン10B、８B、７B塩酸塩も同じ方法で調製
した。

【００６５】＜実施例１８＞ SANK70799株由来粗酵素
液の調製キトサン７B 2.5gを1.0Lの水に懸濁し、ポリペプトン
（和光純薬（株）製）10g、イースト抽出物（Difco(株)
製）5g、燐酸水素２カリウム1g、硫酸マグネシウム0.2g
を加え、121℃で15分間滅菌した。本培地にSANK70799株
を植菌し、37℃で3日間、170rpmで振とう培養した。培
養終了後、菌体を含む不溶物は遠心除去し、氷冷下上清
１容に対して3容のエタノールを加えて30分間放置し
た。10,000rpm5分間の遠心分離で沈殿物を得、これを分
子量分画1万の透析膜を用いて、pH7.5の10mMTris/HCl緩
衝液に対して透析を行った。透析終了後溶液を10,000rp
mで10分間遠心し、上清を濾過して粗酵素液200mlを得
た。酵素液の活性は、実施例1記載の方法で測定し、1分
間あたり1μmolのグルコサミンを生成する酵素活性を１
単位として、1mlあたり0.143単位であった。

【００６６】得られた粗酵素液に含有されるキトサン分
解酵素は以下の諸性質を示した；１）キトサン７Ｂ（加ト吉（株）製）を、ｐＨ２．５〜
１１．５の条件下で加水分解する。２）１００℃以下で１）記載の加水分解活性を示す。３）１）記載の加水分解活性の最適ｐＨはｐＨ３〜７及
びｐＨ１０である。４）１）記載の加水分解活性の最適温度は、ｐＨ６．５
では８０℃、ｐＨ１０では５０℃である。５）１００℃以下の温度条件下で安定である。６）ｐＨ４〜１０のｐＨ条件下で安定である。７）ｐＨ７、３７℃、１０分間の条件下における各基質
に対する相対加水分解活性を表３に示す。

【００６７】

【表３】

【００６８】８）GlcNAc6をGlcNAc2に加水分解するが、
GlcN6は加水分解しない。＜実施例19＞ SANK70799株由来酵素を用いた低分子キ
トサン９B塩酸塩の調製キトサン９B 1gを水100mlに懸濁し、濃塩酸を加えてpH
2.5として粉末を完全に溶解した。飽和炭酸水素ナトリ
ウム水でpHを6.0にあわせた後、水を加えて全量を200ml
とし、500ml三角フラスコに移し、実施例１で調整した
酵素液5mlを加え、40℃で2日間80rpmで振とうして酵素
反応を行わせた。反応終了後、実施例2に記載の方法で
精製し、0.6gの白色綿状固体として低分子キトサン９B
塩酸塩が得られた。

【００６９】該低分子キトサン9B塩酸塩は以下の諸性質
を示した。１）水１００ｇに対し１０ｇ以上溶解した。２）１質量％に溶解させた水溶液はｐＨ６．１であっ
た。３）アルカリを添加した場合、沈殿物（コロイド）はｐ
Ｈ６．５にて析出した。

【００７０】＜実施例20＞ SANK70799株由来酵素を用
いた低分子キトサン8B塩酸塩の調製キトサン8B 1gを実施例19に記載の方法で加水分解し、
0.45gの白色綿状固体として低分子キトサン8B塩酸塩が
得られた。

【００７１】該低分子キトサン8B塩酸塩は以下の諸性質
を示した。１）水１００ｇに対し１０ｇ以上溶解した。２）１質量％に溶解させた水溶液はｐＨ６．１であっ
た。３）アルカリを添加した場合、沈殿物（コロイド）はｐ
Ｈ６．７にて析出した。

【００７２】＜実施例21＞ SANK70799株由来酵素を用
いた低分子キトサン7B塩酸塩の調製キトサン7B 1gを実
施例19に記載の方法で加水分解し、0.12gの白色綿状固
体として低分子キトサン7B塩酸塩が得られた。該低分子
キトサン７B塩酸塩は以下の諸性質を示した。１）水１００ｇに対し１０ｇ以上溶解した。２）１質量％に溶解させた水溶液はｐＨ６．２であっ
た。３）アルカリを添加した場合、沈殿物（コロイド）はｐ
Ｈ６．９にて析出した。

【００７３】＜実施例22＞低分子キトサン塩酸塩のア
セチル化度実施例２〜４及び実施例19〜21にて調製した低分子キト
サン塩酸塩１００mgを蒸留水１０ｍｌに溶解し、キトサ
ナーゼ10U（和光純薬（株）製）を加えて室温で3時間攪
拌した。反応溶液を凍結乾燥し、乾燥固体をD₂Oに溶か
して¹H-NMRを測定した。実施例17にて調製した高分子キ
トサン塩酸塩100mgを蒸留水50mlに溶かし、キトサナー
ゼ５０Uを使用した以外は同様に行った。アセチル基の
３Hとアセチル基以外の、水酸基を除く７Hとの積分比か
ら、アセチル化度を算出した。結果は表４に示す。

【００７４】

【表４】

【００７５】＜試験例１＞試験菌種 SANK番号が付与されているものは、出願人の保存菌株、
ATCCおよびIAMは分譲株、それ以外は出願人による臨床
分離株である。１．Staphylococcus aureus 209P JC-1(SANK 70668) ２．Staphylococcus aureus SANK 71283（MRSA株）３．Staphylococcus aureus NR1SR2SR3-b1（ニューキノ
ロン耐性株）４．Staphylococcus intermedius SANK 71191 ５．Streptococcus pneumoniae 2132 ６．Streptococcus pyogenes 12255 ７．Streptococcus mutans SANK 72288 ８．Bacillus subtilus ATCC 6633 ９．Escherichia coli NIHJ JC-2 SANK 70569 10. Escherichia coli 609（βラクタマ−ゼ高生産株） 11. Serratia marcescens IAM 1184 12. Peudomonas aeruginosa PAO1 13. Peudomonas aeruginosa 10728（カルバペネマ−ゼ
高生産株） 14. Moraxella catarrhalis 11045 使用培地１〜３、４、８、９〜１０、１１及び１２〜１３はMuel
ler Hinton Broth（Difco（株）製）、５、６及び１４
はMueller Hinton Broth（Difco（株）製）に5％馬血清
（Gibco社製）添加で、いずれもpH6.5に調整した。７は
Todd Hewitt Broth（Difco（株）製）で、pHは調整しな
かった。試料菌液の調製試験に使用する菌を上記培地で培養し、菌数が2×10⁶に
なるように同培地で希釈した。検体の調製実施例２〜４にて調製した低分子キトサン９B、８B、７
B各塩酸塩各々を25mg蒸留滅菌水に溶かし、10mlとし
た。試験方法あらかじめ蒸留滅菌水を希釈液とし、検体溶液の倍数希
釈系列を作製しておき、これに上記培地50μl及び試験
菌液50μlを加え、37℃で18時間静置培養し、MICを判定
した。結果は表５に示した。

【００７６】

【表５】

【００７７】＜試験例2＞試験菌種 SANK番号が付与されているものは、出願人の保存菌株、
ATCCは分譲株である。１．S. aureus 209P JC-1(SANK 70668)（標準菌株）２．S. intermedius SANK 71191 ３．S. mutans SANK 72288 ４．B. subtilus ATCC 6633 使用培地１、２及び４はMueller Hinton Broth（Difco（株）
製）、３はTodd Hewitt Broth（Difco（株）製）で、い
ずれもpH6.5に調整した。試料菌液の調製試験に使用する菌を上記培地で一晩培養し、菌数が2×1
0⁶になるように同培地で希釈した。検体の調製実施例２〜４にて調製した低分子キトサン９B、８B、７
B各塩酸塩および実施例17にて調製した高分子キトサン
９B、８B、７B各塩酸塩各々を20mg蒸留滅菌水に溶か
し、10mlとした。試験方法あらかじめ蒸留滅菌水を希釈液とし、検体溶液の倍数希
釈系列を作製しておき、これに上記培地50μl及び試験
菌液50μlを加え、37℃で18時間培養し、MICを判定し
た。結果は表６に示した。

【００７８】

【表６】

【００７９】＜試験例３＞被検菌としてS. aureus 209P
JC-1株(SANK 70668)及びP. aeruginosa PAO1株を被検
菌とし、試験例２と同様に、実施例19〜21にて調製した
低分子キトサン７B、８B及び９BのMICを測定した。結果
は表７に示した。

【００８０】

【表７】

【００８１】＜試験例４＞試験菌種 SANK番号が付与されているものは、出願人の保存菌株、
ATCCは分譲株である。１．Staphylococcus aureus 209P ２．Enterococcus faecalis 681 ３．Enterococcus faecalis SANK71989 ４．Enterococcus faecium 4288 ５．Enterococcus faecium SANK70588 ６．Enterococcus hirae SANK74194 ７．Escherich coli NIHJ ８．Enterobacter cloacae 846 ９．Enterobacter cloacae 963 １０．Vibrio parahaemolyticus SANK73093 １１．Clostridium histolytisum SANK71784 １２．Clostridium histolytisum SANK71684 １３．Lactobatillus plantarum SANK72388 １４．Lactobatillus acidophilus SANK76175 １５．Lactobacillus brevis SANK72079 １６．Lactobacillus fermentum SANK76375 使用培地１〜１０はMueller Hinton Broth(Difco)、１１及び１
２はGAMブイヨン培地（ニッスイ）、１３〜１６はTodd
Hewit培地（Difco）を使用した。

【００８２】その他の条件は試験例１と同じである。検
体として実施例２〜４にて調製した低分子キトサン9B、
8B、7Bの各塩酸塩を用いた。結果は表８に示した。

【００８３】

【表８】

【００８４】＜試験例５＞マウス急性毒性試験実施例２〜４にて調製した低分子キトサン９B、８B、７
B各塩酸塩を2,000 mg/kg体重の用量でマウスに経口投与
したが、いずれも全く影響がなかった。

【００８５】＜製剤例1＞プロピレングリコール3.0g、
パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃
に加温し、実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩
酸塩5.0gを加えて溶解した。ステアリン酸3.0g、セター
ル1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフ
ィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリ
ン酸ポリオキシル40 2.5gを70℃にて加温溶解後、同温
度で実施例２にて調製した低分子キトサン９B溶液を加
え、精製水をくわえて全量を100gとし、混合乳化した。
乳化後攪拌しながら室温まで冷却し、白色5質量％低分
子キトサン９B塩酸塩クリームを100g得た。

【００８６】＜製剤例2＞プロピレングリコール3.0g、
パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃
に加温し、実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩
酸塩1.0gを加えて溶解した。ステアリン酸3.0g、セター
ル1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフ
ィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリ
ン酸ポリオキシル40 2.5gを70℃にて加温溶解後、同温
度で実施例２にて調製した低分子キトサン９B溶液を加
え、精製水をくわえて全量を100gとし、混合乳化した。
乳化後攪拌しながら室温まで冷却し、白色1質量％低分
子キトサン９B塩酸塩クリームを100g得た。

【００８７】＜製剤例3＞プロピレングリコール3.0g、
パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃
に加温し、実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩
酸塩0.5gを加えて溶解した。ステアリン酸3.0g、セター
ル1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフ
ィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリ
ン酸ポリオキシル40 2.5gを70℃にて加温溶解後、同温
度で実施例２にて調製した低分子キトサン９B溶液を加
え、精製水をくわえて全量を100gとし、混合乳化した。
乳化後攪拌しながら室温まで冷却し、白色0.5質量％低
分子キトサン９B塩酸塩クリームを100g得た。

【００８８】＜製剤例4＞プロピレングリコール3.0g、
パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃
に加温し、実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩
酸塩0.1gを加えて溶解した。ステアリン酸3.0g、セター
ル1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフ
ィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリ
ン酸ポリオキシル40 2.5gを70℃にて加温溶解後、先に
調製した低分子キトサン９B溶液を加え、精製水をくわ
えて全量を100gとし、混合乳化した。乳化後攪拌しなが
ら室温まで冷却し、白色0.1質量％低分子キトサン９B塩
酸塩クリームを100g得た。

【００８９】＜製剤例5＞実施例２にて調製した低分子
キトサン９B塩酸塩100mgを蒸留水1mlに溶解し、その溶
液を水平に保ったガラス板上に均一に塗布し、室温で風
乾して、0.1mmの厚さの透明なフィルムを得た。

【００９０】＜製剤例6＞実施例２にて調製した低分子
キトサン９B塩酸塩100mgを蒸留水1mlに溶解し、さらに
グリセリン0.1mlを攪拌混合した。脱泡した後、水平に
保ったガラス板上に均一に塗布し、50℃で3時間乾燥し
て、ゴム状の軟質シートを得た。

【００９１】＜製剤例７＞実施例２にて調製した低分子
キトサン９B塩酸塩50mgを蒸留水2mlに溶解し、さらに、
メチルセルロース50mgを加えて溶解した。脱泡した後、
水平に保ったガラス板上に均一に塗布し、室温で風乾し
て、0.05mmの厚さの透明なキトサンメチルセルロース複
合フィルムを得た。

【００９２】＜製剤例８＞プロピレングリコール3.0g、
パラオキシ安息香酸メチル0.1gの精製水80ml溶液を70℃
に加温し、実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩
酸塩1.0gを加えて溶解した。ステアリン酸3.0g、セター
ル1.0g、モノステアリン酸グリセリン6.0g、流動パラフ
ィン5.0g、パラオキシ安息香酸プロピル0.1g、ステアリ
ン酸ポリオキシル40 2.5gを70℃にて加温溶解後、先に
調製した低分子キトサン９B溶液を加え、精製水をくわ
えて全量を100gとし、混合乳化した。乳化後攪拌しなが
ら室温まで冷却し、白色1.0質量％低分子キトサン９B塩
酸塩クリーム（以下、「1%キトサン軟膏」という）を得
た(Lot No.27)。実施例２にて調製した低分子キトサン
９B塩酸塩の添加量をそれぞれ2.0gおよび5.0gに代えた
他は、上記の方法を繰り返して、白色1.0質量％低分子
キトサン９B塩酸塩クリーム（以下、それぞれ、「2%キ
トサン軟膏」および「5%キトサン軟膏」という）を得た
(Lot No.28およびLot No.29)。また、プラセボとして、
上記と同じ処方で、低分子キトサン９B塩酸塩を添加し
ないクリーム（以下、「基剤」という）も用意した(Lot
No.26)。

【００９３】＜試験例８＞１緒言実験的欠損傷モデルでのキトサン外用剤の有効性を予知
する目的で治癒試験を行なった。

【００９４】２試験材料２−１被験物質および対照薬製剤例８で調製した1％キトサン軟膏（Lot No. 27）、
2％キトサン軟膏（LotNo. 28）、5％キトサン軟膏（Lo
t No. 29）、基剤（Lot No. 26）を用いた。対照薬に
はアラントロックス（登録商標）軟膏（1ｇ中にアルミ
ニウム・クロルヒドロキシアラントイネート20mg（2
％）を含有、添加物としてポリオキシエチレン硬化ヒマ
シ油およびマクロゴール400）大洋薬品工業株式会社を
使用した。２−２投与方法および投与量欠損傷部位（1匹あたり2個所）にキトサン含有軟膏、基
剤および対照薬を（約0.1g/site、約0.2g/body）1日2回
塗布した。２−３使用動物６週齢のSprague-Dawley（SD）系雄性ラット（日本エス
エルシー株式会社）を購入して使用した。動物は平均温
度21.6-22.0℃、平均湿度59-72％の環境制御飼育装置
（日本クレア株式会社）で固形飼料（マウスラット飼
育用F-2、株式会社船橋農場）および水道水を与え、照
明時間7:00-19:00の条件下で6日間馴化飼育管理を行い
実験に用いた。

【００９５】３実験方法３−１ラット皮膚欠損傷モデル７週齢のSD系雄性ラット（体重157.6-235.9g）を1群5匹
で6群用いた。ラットの背部被毛を電気バリカンで除毛
した後、EBAエバクレーム（東京田辺製薬株式会社）を
塗布し15分後に洗浄して脱毛した。背部脱毛部位を70％
エタノールで消毒後、ペントバルビタールナトリウム
（40mg/kg，i.p.）麻酔下に円形ポンチ（内径15mm）を
用いて背部正中線で対称の打ち抜き創を2個所作製し
た。欠損傷作製24時間後に無処置群、基剤群、キトサン
含有軟膏群および対照薬群に群分けし、その後被験物質
を傷部位に10日間塗布した。ラットは実験期間中、個別
ケージで飼育した。効果の判定はノギスを用いて欠損傷
部の長径と短径を測定した。治療過程における面積変化
は、（測定日の長径×短径／欠損傷作製後の長径×短
径）×100の式で面積比（％）を求め、面積比から治療
面積（5-15日目）を、完治率は面積比が5％以下を完治
例とし治療日数を算出した。

【００９６】４統計学的処理実験結果は平均値±標準偏差で表し、結果の決定にはDu
nnettの多重比較片側検定（統計ライブラリーStar Ligh
t 1997、Yukms株式会社）を用いた。危険率は5％（P＜
0.05）を有意水準として示した。

【００９７】５実験結果 1群5匹の動物背部に2個所欠損傷を作製して試験を行っ
たが、試験期間中に掻いたり、ケージに擦りつけたりし
て傷口を悪化させた例数をデータから削除し、5％キト
サン軟膏群9例、1％キトサン軟膏群9例、アラントロッ
クス軟膏群7例、他群は10例でまとめた。図４に完治率
を示した。無処理（非塗布）群：非塗布群は欠損傷作製
後11日目より完治例が見られ、観察15日目には80％の完
治率が認められた。1％キトサン軟膏群：欠損傷作製後1
0日より完治例が見られ、観察15日目には90％の完治率
を示した。2％キトサン軟膏群：欠損傷作製後10日目よ
り完治例が見られ、観察13日目に完治率100％が認めら
れた。5％キトサン軟膏群：欠損傷作製後10日目より完
治例が見られ、観察12日目に完治率100％が認められ
た。基剤群：欠損傷作成後10日目より完治例が見られ、
観察15日目で80％の完治率が認められた。アラントロッ
クス軟膏群：欠損傷作製後11日目より完治例が見られ、
観察14日目に完治率100％を示した。表９に治療日数を
示した。無処理群の13.7±1.3日に対して、1％キトサン
軟膏群は12.2±1.3日、2％キトサン軟膏群は12.5±1.0
日、5％キトサン軟膏群は11.8±0.8日と有意に治療日数
を短縮した。基剤群およびアラントロックス軟膏群も1
2.7±1.2日、12.6±1.0日と治療日数を短縮したが無処
置群に対しての有意差はみられなかった。

【００９８】

【表９】

【００９９】６考察ラット皮膚欠損傷モデルを用いてキトサン外用剤の治癒
試験を行った。キトサン外用剤（1％、2％、5％キトサ
ン含有軟膏）は対照薬のアラントロックス軟膏（効能：
外傷・熱傷によるびらん・潰瘍等、薬効薬理：肉芽形成
作用・壊死組織除去作用）よりも優れた欠損傷治癒促進
作用が認められた。

【０１００】＜試験例９＞１目的コレステロール負荷をしたハムスターを用い、キトサン
が脂質低下作用を持つかどうかを検討した。

【０１０１】２．試験材料２−１基礎飼料および実験飼料（混餌） 0.3 % コレステロールおよび10 % ココナッツ油を添加
したマウス・ラット用FR-2標準粉餌飼料（株式会社船橋
農場）を基礎飼料とし、基礎飼料９８ｇに２％キトサン
水溶液（実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩酸
塩２ｇを精製水９８ｇに溶解して調製したもの）１００
ｇを懸濁させ、凍結乾燥機で乾燥させて作製した混餌を
実験飼料として用いた。２−２投与方法基礎飼料および実験飼料（混餌）を動物に自由摂取させ
た。２−３使用動物 14週齢のsyrian golden hamster（日本エスエルシー株
式会社）の雄１２匹を購入して使用した。動物は、アル
ミニウム製ケージに６匹ずつ入れ、平均温度２３±２
℃、平均湿度５５±１０％で、マウス・ラット用FR-2標
準粉餌飼料（株式会社船橋農場）および水道水を与え、
明暗１２時間交替に制御した飼育室で７日間馴化飼育管
理を行い実験に用いた。

【０１０２】３．実験方法 15週齢のsyrian golden hamsterを１群６匹で２群用い
た。動物をコントロール群とキトサン群に分け(day0)、
翌日からコントロール群には基礎飼料、キトサン群には
実験飼料（混餌）を与えて７日間飼育を行い、群分け後
８日目(day8)には、午前9時から絶食させ、午後１時に
腹大動脈より採血し、肝臓を摘出した。次いで、血清TG
（トリグリセライド）、血清TC（総コレステロール）、
肝TG、肝TCおよび肝重量を測定した。体重の測定は、群
分けの当日（day0）、その３日後（day3）、５日後（da
y5）、８日後（day8）に行った。血清TG、血清TCの測定
は、それぞれトリグリセライドE-テストワコー、コレス
テロールCII−テストワコー（和光純薬工業株式会社）
を用いて、酵素法により測定した。肝TG、肝TCの測定
は、Folchらの方法（J. Biol. Chem., 226, 494-509(19
57)に従い肝臓脂質を抽出し、抽出物のTG量・TC量を血
清と同じ方法で測定した。

【０１０３】４．実験結果４−１体重変化の測定各群の個体の体重の変化を表１０および図５に示す。図
７の縦軸の値は、各群の６匹の平均値(average)±標準
誤差(SEM)である。

【０１０４】

【表１０】

【０１０５】コントロール群では経時的な体重の増加が
観察された。これに対してキトサン投与群では体重の増
加が抑制された。また、コントロール群と比較してキト
サン投与群では体重増加率の有意な低下が認められた。
（ｐ＜０．０１、Student'stest）なお、各群の飼料の
摂取量を表１１に示す。

【０１０６】

【表１１】

【０１０７】摂餌量は両群ともほぼ同等であった。従っ
てキトサンによる体重増加の抑制効果は摂餌量の減少に
よるものではない事が示された。４−２肝重量の測定表１２は、各群のday8における肝重量を示す。各群の６
匹の平均値±標準誤差を図６に示す。

【０１０８】

【表１２】

【０１０９】両群とも肝重量に有意な差は認められず、
低分子キトサンは肝肥大を生じせしめなかった。４−３血清ＴＣの測定各群の血清ＴＣ値（ｍｇ/ｄｌ）を表１３に示す。各群
の６匹の平均値±標準誤差を図７に示す。

【０１１０】

【表１３】

【０１１１】コントロール群と比較して、キトサン投与
群ではTC値が低かった。４−４血清ＴＧの測定各群の血清ＴＧ値（ｍｇ/ｄｌ）を表１４に示す。各群
の６匹の平均値±標準誤差を図８に示す。

【０１１２】

【表１４】

【０１１３】コントロール群と比較して、キトサン投与
群ではTG値が低かった。４−５血清ＨＤＬ−コレステロール（ＨＤＬ−ＣＨ）
の測定各群の血清ＨＤＬ−ＣＨ値（ｍｇ/ｄｌ）を表１５に示
す。各群の６匹の平均値±標準誤差を図９に示す。

【０１１４】

【表１５】

【０１１５】コントロール群と比較して、キトサン投与
群ではHDL-CH値が高かった。４−６肝ＴＣの測定各群のＮｏ．と肝臓１ｇあたりのＴＣ量（ｍｇ／ｇ）を
表１６に示す。各群の６匹の肝臓１ｇあたりのＴＣ量の
平均値±標準誤差を図１０に示す。

【０１１６】

【表１６】

【０１１７】キトサンの投与群では、肝臓の総コレステ
ロール含量が低下していた。４−７肝ＴＧの測定各群のＮｏ．と肝臓１ｇあたりのＴＧ量（ｍｇ／ｇ）を
表１７に示す。各群の６匹の肝臓１ｇあたりのＴＧ量の
平均値±標準誤差を図１１に示す。

【０１１８】

【表１７】

【０１１９】キトサンの投与群では、肝臓のトリグリセ
ライド含量が低下していた。

【０１２０】

【発明の効果】本発明により、高分子キトサンから低分
子キトサンを再現性よく生産することができるようにな
った。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２にて調製した低分子キトサン９B塩酸
塩の分子量分布を示す。最大還元糖量を示すフラクショ
ンを100％として、相対比で表示した。白丸：デキスト
ランT40（分子量4万）、白三角：デキストランT70（分
子量7万）、白四角：デキストランT110（分子量11
万）、白菱形：デキストランT250（分子量25万）、黒
丸：低分子キトサン９B塩酸塩をあらわす。

【図２】実施例３にて調製した低分子キトサン８B塩酸
塩の分子量分布を示す。最大還元糖量を示すフラクショ
ンを100％として、相対比で表示した。白丸：デキスト
ランT40（分子量4万）、白三角：デキストランT70（分
子量7万）、白四角：デキストランT110（分子量11
万）、白菱形：デキストランT250（分子量25万）、黒
丸：低分子キトサン８B塩酸塩をあらわす。

【図３】実施例４にて調製した低分子キトサン７B塩酸
塩の分子量分布を示す。最大還元糖量を示すフラクショ
ンを100％として、相対比で表示した。白丸：デキスト
ランT40（分子量4万）、白三角：デキストランT70（分
子量7万）、白四角：デキストランT110（分子量11
万）、白菱形：デキストランT250（分子量25万）、黒
丸：低分子キトサン７B塩酸塩をあらわす。

【図４】図４は、ラット皮膚欠損傷モデルにおける完治
率を示す。

【図５】図５は、コントロール群とキトサン群の体重変
化を示す。

【図６】図６は、コントロール群とキトサン群の平均肝
重量（ｇ）を示す。

【図７】図７は、コントロール群とキトサン群の平均血
清ＴＣ値を示す。

【図８】図８は、コントロール群とキトサン群の平均血
清ＴＧ値を示す。

【図９】図９は、コントロール群とキトサン群の平均血
清ＨＤＬ−ＣＨ値を示す。

【図１０】図１０は、コントロール群とキトサン群の肝
臓１ｇあたりのＴＣ量の平均値を示す。

【図１１】図１１は、コントロール群とキトサン群の肝
臓１ｇあたりのＴＧ量の平均値を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 １０１Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 17/02 17/02 31/04 31/04 Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｆターム(参考） 4B064 AF21 CA21 CB07 CC06 CC07 DA01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA23 MA01 MA04 ZA45 ZA70 ZA89 ZB35 ZC33 ZC35 4C090 AA04 BA47 BC27 BD37 CA43 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アセチル化度が１０〜３０％で分子量が
１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキトサ
ン分解酵素で加水分解し、次いで分子量１万未満の画分
を除去することにより、分子量が１万以上１００万未満
の低分子キトサン又はその塩を製造する方法であって、
前記キトサン分解酵素は、ｐＨ７．０〜７．５、温度３
７℃で１０〜２０分間の反応条件下で、３０％アセチル
化キトサン（粘度100〜300 cps）に対する加水分解活性
を１００％とした場合に、グリコールキチンに対する加
水分解活性が１００％より小さく、アセチル化度が１％
以下のキトサン（粘度50〜200 cps）に対する加水分解
活性が１５％以下である前記の方法。
【請求項２】低分子キトサン又はその塩が、０〜１０
０℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解するものであ
る請求項１記載の方法。
【請求項３】低分子キトサン又はその塩が抗菌活性を
有するものである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】キトサン分解酵素がバシラス・エスピー
(Bacillus sp.)SANK70699株(FERM BP-6666)又はバシラ
ス・エスピー(Bacillus sp.)SANK70799株(FERM BP-666
7)由来のキトサン分解酵素である請求項１〜３のいずれ
かに記載の方法。
【請求項５】ｐＨ３〜１２および７０℃以下の条件下
で、１０分〜７日間、高分子部分アセチル化キトサンを
キトサン分解酵素で加水分解する請求項１〜４のいずれ
かに記載の方法。
【請求項６】高分子部分アセチル化キトサンを酸性条
件下で水に溶解した溶液にアルカリを加えて弱アルカリ
性にした後、キトサン分解酵素を加えて加水分解を行
い、低分子キトサン又はその塩を生成する請求項１〜５
のいずれかに記載の方法。
【請求項７】分子量が１万以上１００万未満で、０〜
１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上溶解する低分
子キトサン又はその塩。
【請求項８】請求項７記載の低分子キトサン又はその
塩を含む医薬組成物。
【請求項９】請求項７記載の低分子キトサン又はその
塩を有効成分として含有する創傷及び／又は褥創の予防
及び／又は治療剤。
【請求項１０】請求項７記載の低分子キトサン又はそ
の塩を有効成分として含有する抗菌剤。
【請求項１１】請求項７記載の低分子キトサン又はそ
の塩を有効成分として含有する抗高脂血症剤。
【請求項１２】請求項７記載の低分子キトサン又はそ
の塩を有効成分として含有する抗動脈硬化症剤。
【請求項１３】請求項７記載の低分子キトサン又はそ
の塩を有効成分として含有する抗糖尿病剤。
【請求項１４】請求項７記載の低分子キトサン又はそ
の塩を有効成分として含有する抗肥満剤。
【請求項１５】アセチル化度が１０〜３０％で分子量
が１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンが甲殻
類由来であることを特徴とする、請求項１に記載の方
法。
【請求項１６】ｐＨ３乃至１２、７０℃以下の条件下
にて、１０分乃至７日間、アセチル化度が１０〜３０％
で分子量が１００万以上の高分子部分アセチル化キトサ
ンをキトサン分解酵素で加水分解することを特徴とす
る、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】ｐH６．０乃至７．５、３７℃乃至４
０℃の条件下にて、２乃至３日間、８０乃至１７０ｒｐ
ｍで振盪しつつ、アセチル化度が１０〜３０％で分子量
が１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンをキト
サン分解酵素で加水分解することを特徴とする、請求項
１６に記載の方法。
【請求項１８】アセチル化度が１０〜３０％で分子量
が１００万以上の高分子部分アセチル化キトサンを、予
めｐH２．５乃至３．５の条件下で水に溶解せしめた後
アルカリを加えてｐH６．０乃至７．５へ調整すること
を特徴とする、請求項１又は請求項１５乃至１７のいず
れか一つに記載の方法。
【請求項１９】キトサン分解酵素がバシラス・エスピ
ー(Bacillus sp.)SANK70699株(FERM BP-6666)又はバシ
ラス・エスピー(Bacillus sp.)SANK70799株(FERM BP-66
67)由来のキトサン分解酵素であることを特徴とする、
請求項１５乃至１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２０】請求項１又は請求項１５乃至１９のい
ずれか一つに記載の方法により製造される、分子量１万
以上百万未満の低分子キトサン又はその塩。
【請求項２１】０〜１００℃の水１００ｇに対して１
０ｇ以上溶解することを特徴とする、請求項２０記載の
低分子キトサン又はその塩。
【請求項２２】１質量％低分子キトサン塩水溶液のｐ
HがｐH４．８乃至６．３であることを特徴とする、請求
項２０又は２１に記載の低分子キトサン又はその塩。
【請求項２３】１質量％低分子キトサン塩水溶液にア
ルカリを添加した場合に沈殿物が析出するｐHがｐH６．
４乃至８．２であることを特徴とする、請求項２０又は
２１に記載の低分子キトサン又はその塩。
【請求項２４】下記［Ｉ］乃至［ＩＶ］の性質を有す
る低分子キトサン又はその塩；［Ｉ］分子量が１万以上百万未満であること：［ＩＩ］０〜１００℃の水１００ｇに対して１０ｇ以上
溶解すること：［ＩＩＩ］のｐHがｐH４．８乃至６．３であること：［ＩＶ］１質量％低分子キトサン塩水溶液にアルカリを
添加した場合に沈殿物が析出するｐHがｐH６．４乃至
８．２であること。
【請求項２５】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を含有する医薬組成
物。
【請求項２６】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する抗菌剤。
【請求項２７】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する抗高脂血症剤。
【請求項２８】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する抗動脈硬化症剤。
【請求項２９】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する抗肥満剤。
【請求項３０】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する抗糖尿病剤。
【請求項３１】請求項２０乃至２４のいずれか一つに
記載の低分子キトサンまたはその塩を有効成分として含
有する創傷及び／又は褥創の治療及び／又は予防剤。