JP2003199564A - 染色体−特異的染色の方法および組成物 - Google Patents

染色体−特異的染色の方法および組成物

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 染色体異常を検出するに当たり、複数の座の
遺伝子再配列を同時に検出する。 【解決手段】 各疑わしい遺伝子再配列を含む領域にお
ける標的染色体物質の座位に各々が相補的である標識さ
れた異種の核酸断片の混合物からなる高度コンプレッキ
シティ核酸プローブを使用して、インシトゥハイブリダ
イゼーションを行い、隣接する遺伝子症候群を検出す
る。核酸プローブは、隣接する遺伝子症候群の複数の成
分の特性を示す核酸配列に実質的に相同である配列から
なる。疑わしい遺伝学的異常としては、急性リンパ性白
血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、ダウン症候群が検
出される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的に細胞遺伝
学の分野、より詳細には分子細胞遺伝学に関する。本発
明は、染色体を同定し分類する方法に関する。なおより
詳細には、本発明は、以下に記載するプロセスによって
設計することができる核酸プローブに関し、これにより
１または複数の全染色体にわたり、および／または１ま
たは複数の染色体上の１または複数の領域にわたる染色
分布を作出し、かつこれには全ゲノムに及ぶ染色パター
ンも含まれる。染色パターンは、とりわけ出生前、腫瘍
および疾患に関連した細胞遺伝学の適用を含む所望のい
ずれの細胞遺伝学的適用に対しても適合させることがで
きる。本発明は、核酸プローブの組成物および染色体を
染色する方法を提供し、これによって中期スプレッド(s
pread)と間期核の正常染色体および染色体異常を同定す
る。本発明のプローブ作出-染色パターンは、正常染色
体、異常染色体の顕微鏡的および／またはフローサイト
メトリーによる同定ならびに特定の異常の遺伝学的性質
の解析を容易にする。
【０００２】ここに記載した例の多くはヒト染色体に関
し、またここに使用した言葉の多くはヒト関係に向けら
れているが、染色体を染色または着色するために核酸プ
ローブを用いるという概念は、植物と動物の両者を含む
いずれの源からの染色体にも適用できる。
【０００３】
【従来の技術】染色体異常は、遺伝性疾患、変性疾患、
および変性疾患を起こすことが知られている薬剤への暴
露、特に癌と関連がある。German,「Studying Human Ch
romosomes Today」,American Scientist,Vol.58,pp.182
ー201(1970)；Yunis,「The Chromosomal Basis of Human
Neoplasia」,Science,Vol.221,pp.227ー236(1983)；お
よび German,「Clinical Implication of Chromosome B
reakage」,in Genetic Damage in Man Caused by Envir
onmental Agents,Berg,Ed.,pp.65-86(Academic Press,N
ew York,1979)参照のこと。染色体異常には数タイプが
あり、なかでも個々に過剰または欠如のある染色体、１
個の染色体の部分的過剰または欠如（セグメント的重複
または欠失）、切断、環および染色体再配列を含む。染
色体または遺伝子再配列は、転座（１つの染色体から他
の染色体へのピースのトランスファー）、二動原体（２
個の動原体を有する染色体）、逆位（染色体セグメント
の極性の反転）、挿入、増幅、および欠失を含む。
【０００４】検出可能な染色体異常は、ヒトの出生数２
５０ごとに１回の頻度で起きる。染色体物質の欠失また
は付加を伴う異常は、生体の遺伝子の平衡を変え、普通
は胎内死または重大な精神的、肉体的欠陥をもたらす。
ダウン症候群は、正常の１対の染色体の代わりに３個の
第21染色体のコピーを有することによって起こることが
ある。この症候群は、異常染色体数または異数性によっ
て起こる状態の一例である。また、ダウン症候群は、第
21染色体のサブリージョンのセグメント的重複（例えば
21q22）によっても起こることがあり、これは第21また
は他の染色体上に存在することがある。エドワーズ症候
群(18+)、パトー症候群(13+)、ターナー症候群(XO)、お
よびクラインフェルター症候群(XXY)が、数の異常を来
す疾患のなかでよく見られるものである。[Epstein,The
Consequences ofChromosome Imbalance:Principles,Me
chanisms and Models(Cambridge Univ. Press 1986); J
acobs,Am.J.Epi-demiol,105:180(1977)；および Lubs e
t al.,Science,169:495(1970)]。
【０００５】網膜芽細胞腫(del 13q14)、プレーダ−ウ
イリ症候群(del 15qll- q13)、ウイルムス腫瘍(del 11p
13)およびクリ-デュ-シャ症候群(Cri-du-chat)(del 5p)
は、構造的異常と関連した重要な疾患の例である。[Nor
a and Fraser,Medical Genetics:Principles and Pract
ice,(Lea and Febiger 1989)]。
【０００６】構造的に異常な染色体、例えば二動原体で
あって染色体異常誘発物(clastogenic agent)、例えば
電離性放射線または突然変異誘発化学物質によってひき
起こされるものの頻度の測定は、このような物質によっ
て起こる遺伝子傷害の定量的指標として広く用いられ
る。Biochemical Indicators of Radiation Injury inM
an(International Atomic Energy Agency,Vienna,197
1)；および Berg Ed.Genetic Damage in Man Caused by
Environmental Agents(Academic Press,New York,197
9)参照のこと。潜在的に発癌性があり奇形腫を発生する
多くの化学製品が、工業、農業活動によって環境に広く
分布されている。これらの化学製品のなかには、殺虫剤
およびある範囲の産業廃棄物、同副産物、例えばハロゲ
ン化炭化水素、塩化ビニル、ベンゼン、ヒ素などがふく
まれる。Kraybill et al.,Eds.,Environmental Cancer
(Hemisphere Publishing Corporation,New York,1977)
参照のこと。染色体切断およびその他の異常の鋭敏な測
定は、このような職業的、環境的薬剤への暴露の影響を
評価するための改良された線量測定による危険評価方法
論の基礎を形成することができるであろう。
【０００７】遺伝子スクリーニングと生物学的線量測定
の現在の手法は、カリオタイプ解析を含む。カリオタイ
プは、各個または各個の関連グループに相補的な特有な
染色体であって、通常は有糸分裂中期における染色体の
数と形態の両方によって定められる。これには、全染色
体数、各染色体型のコピー数（例えばX染色体のコピー
数）および染色体の形態（例えば長さ、動原体インデッ
クス、連結性(connectedness)などによって測定され
る）のようなものが含まれる。染色体異常はカリオタイ
プの検査によって検出できる。カリオタイプは、従来は
生体の分裂中期を染色し、またはこれとは別に濃縮した
（例えば早期染色体濃縮によって）染色体によって決定
されている。濃縮染色体が用いられるのは、その分散状
態と核内において可視境界が無いために、中期染色体を
見えるようにすることが、最近まで可能でなかつたため
である。
【０００８】化学的染色に基づく多くの細胞学的技術が
開発されたが、これらは濃縮染色体に、普通はバンドと
呼ばれる縦方向のパターンを生じさせるものである。生
体内の各染色体のバンディングパターンは、普通は各染
色体型の不明瞭ではない同定を可能にする。Latt,「Opt
ical Studies of MetaphaseChromosome Organizatio
n」, Annual Review of Biophysics and Bioengineerin
g,Vol.5,pp.1-37 (1976)参照のこと。ある重要な染色体
異常、例えば転座および逆位の正確な検出には、このよ
うなバンド分析を必要とした。
【０００９】あいにく、このような慣用のバンド分析
は、細胞培養と高品質の中期スプレッドの調製を必要と
し、これには時間と労力を要し、しかもしばしば困難ま
たは不可能である。例えば、多くの型の腫瘍からの細胞
は培養が困難であり、かつ培養された細胞がもとの腫瘍
細胞集団を代表しているかどうかは明確ではない。培養
可能な胎児細胞は、侵襲的手段によって得ることが必要
であり、また分析に十分な中期細胞を得るには数週間培
養しなければならない。多くの場合、異常染色体上のバ
ンディングパターンは、これを構成している正常染色体
の部分の明瞭な同定を可能にするものではない。このよ
うな同定は、異常に含まれる重要な遺伝子の位置を示す
ために重要であろう。さらに、現在のカリオタイピング
法の感度と分解能とは、多数の染色体または染色体領域
は非常に類似した染色特性を有し、かつバンドの一部分
のみに含まれる異常（例えば欠失）は検出できないとい
う事実によって制限される。したがって、このような方
法は、実質的に隣接する(contiguous)遺伝子症候群、例
えば部分トリソミー、プレーダーウイリ症候群[Emanue
l,Am.J.Hum.Genet.,43:575(1988); Schmickel,J.Pediat
r.,109:231(1986)]および網膜芽細胞腫[Sparkes,Bioche
m.Biophys.Acta.,780:95(1985)]の診断および詳細分析
に限られる。
【００１０】次の参考文献は、以下の記載において表示
の番号によって示す。 1. A.de Klein et al.,Nature 300,765(1982) 2. J.Groffen et al.,Cell 36,93(1984) 3. N.Heisterkamp et al.,Nature 306,239(1983)4. E.S
htivelman et al.,Blood69,971(1987) 5. J.B.Konopka,S.M.Watanabe,O.N.Witte,Cell 37,1035
(1984) 6. Y.Ben-Neriah et al.,Science 233,212(1986) 7. P.C.Nowell and D.A.Hungerford,Science 132,1497
(1960) 8. J.D.Rowley,Nature 243,290(June 1973) 9. G.Grosveld et al.,Mol Cell Biol 6,607 (1986) 10. E.Canaani et al.,Lancet 1,593(1984) 11. R.P.Gale and E.Canaani,Proc Natl Acad Sci USA
81,5648(1984) 12. Konopka J.B. et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82:
1810(1985) 13. P.Benn et al.,Cancer Genet Cytogenet 29,1(198
7) 14. S.Abe et al.,Cancer Genet Cytogenet 38,61(198
9) 15. M.Shtalrid et al.,Blood 72,485(1988) 16. I.Dube et al.,Genes Chromosomes and Cancer 1,1
06(1989) 17. A.J.Fishleder,B.Shadrach and C.Tuttle, Leukemi
a 3:10,746(1989) 18. C.R.Bartram et al.,J Exp Med 164(5):1389 (198
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5698(1988) 22. M.S.Roth et al.,Blood 74,882(1989) 23. A.L.Hooberman et al.,Blood 74,1101(1989) 24. C.A.Westbrook et al.,Blood 71(3):697-702 (198
8) 25. B.Trask,D.Pinkel,and G.van den Engh, Genomics
5,710(1989) 26. S.J.Collins and M.T.Groudine,Proc Natl Acad Sc
i USA 80,4813(1983) 27. D.Pinkel et al.,Proc Natl Acad Sci USA 83,2934
(1986) 28. D.Pinkel,T.Straume and J.W.Gay.,Proc Natl Acad
Sci USA 85,9138(1988) 29. B.Trask and J.Hamlin,Genes and Development,3:1
913(1989) 30. J.B.Lawrence,C.A.Villnave and R.H.Singer, Cell
42,51(1988) 31. G.D.Johnson and J.G.Nogueria,J.Immunol. Method
s 43,349(1981) 32. Hegewisch-Becker et al.,J.Cell. Biochem. (Supp
l.) 13E,289(1989) 33. Kohler et al.,"Expression of BCR-ABL from Tran
scripts Following BoneMarrow Transplant for Philad
elphia Chromosome Positive Leukemias",(manuscript
submitted) 34. Heisterkamp et al.,Nature,315:758(1985) 35. Heisterkamp et al.,J.Molec. Appl. Genet.,2:57
(1983)。
【００１１】第９染色体の長い腕からのプロト-オンコ
ジーンc-ABLと第２２染色体のBCR遺伝子との融合は、CM
Lにおける一致した所見である(1-3)。この遺伝子変化
は、BCR-ABL転写の形成となり、これは翻訳されて実際
上全てのCML患者に存在する210kdタンパクを形成する(4
-6)。患者の90%において、融合遺伝子は、第9及び第22
染色体を含み、フィラデルフィア(Ph1)染色体と呼ばれ
る細胞遺伝学的に明瞭な小さな末端動原体型染色体を生
じる相互転座に由来している(7-12)（図８参照）。しか
しながら、標準的細胞遺伝学においては、間隔的に密接
した切断点、例えばCMLおよび急性リンパ性白血病(ALL)
の特徴である切断点を識別する解像力を有せず、またよ
り複雑な再配列によって生じた融合を見落とす。両方の
遺伝子における切断点領域のマッピングとクローニング
は、細胞遺伝学的にPh1染色体が検出できなかったCML患
者のBCR-ABL融合を立証することができる分子的技術を
生むこととなった(13-16)。BCR再配列に対するサザン分
析は、CMLの診断に対する標準となった。さらに最近に
なって、融合は、逆転写酵素を用いCML mRNAからコピー
されたcDNAのインビトロ増幅によって検出されるように
なった(17-23)。この技術は、低い頻度で現れるCML細胞
からのBCR-ABL転写の検出を可能にする。これら両技術
は、細胞集団から得られた核酸を利用するので、各個の
細胞に対する遺伝子型と表現型との相関はあり得ない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、慣用の
バンド分析には幾つかの重要な制限があり、そのなかに
は以下の事項が含まれる。１）労力と時間がかかり、か
つ高度に訓練された分析化学者を必要とする。２）濃縮
染色体にしか適用できない。３）異常の性質とバンディ
ング技術の分解能によって、3-15メガベース(Mb)以下を
含む構造的異常の検出には向けられない。[Landegren e
t al.,Science,242:229(1988)] 本発明は、慣用のバン
ド分析の上記制限を克服するためにプローブ組成物と方
法を提供する。
【００１３】従来技術による化学的染色手法は、よく分
からない理由でゲノム上にパターンを作るが、これは異
なった適用での使用に対する要求に応じて変えることが
できない。このような化学的染色パターンは、プローブ
の結合座位をマップ化するために用いられた。しかしな
がら、インシトゥハイブリダイゼーションは、時たま
に、しかも大きな努力を払って、例えば特定のDNA配列
から切断点までの距離といった、病変の部位に関するい
くらかの情報を得るために用いられたにすぎない。本発
明は、核酸配列に基づいてパターン内のゲノムを染色す
るので、プローブの核酸配列を変えることにより必要に
応じてパターンを変え得るということにおいて、化学的
染色の適応性の欠如を克服する。本発明のプローブ-作
出染色パターンは、細胞遺伝学分析において有用な信頼
できる基礎的指標を提供する。
【００１４】化学的染色バンドのイメージ分析による染
色体の構造的異常の自動化検出は、慣用技術によって中
期染色体上に作出されたバンディングパターンを検出し
これを解釈できるシステムの開発を必要とするであろ
う。化学的に染色された正常染色体を、自動化手段によ
って信頼性をもって同定することが非常に難しいことは
分かったし、構造的異常、例えば転座を有する異常染色
体を区別することはもっと難しい。慣用的にバンド化し
た染色体の転座の効果的な自動化検出は、１０年以上に
わたる精深な研究によっても完成しなかった。本発明の
プローブ-作出バンディングパターンは、このような自
動化検出、分析に対して適している。
【００１５】近年において、染色体構造とその遺伝子内
容およびDNA組成との関連に関する研究が急速に進歩し
た。一部には、この進歩は、遺伝子工学技術によって生
産されたプローブに対する大量の純化DNAおよびRNA断片
の利用に基づく遺伝子マッピングの改良された方法とい
う形で行われた。例えば、Kao,「Somatic Cell Genetic
s and Gene Mapping」,International Review of Cytol
ogy,Vol.85,pp.109-146(1983)、および D'Eustachio et
al.,「Somatic Cell Genetics in Gene Families」, S
cience,Vol.220,pp.9,19-924(1983)参照のこと。遺伝子
マッピングのためのプローブは、一重鎖もしくは二重鎖
DNAまたはRNAの標識された断片からなり、これらは染色
体DNA上の相補的座位にハイブリダイズされる。このよ
うなプローブにおいては、関心のある座位以外の位置に
おけるハイブリダイゼーシヨンを最小にするような純粋
な、または均一なプローブを作ることが決定的に重要で
あった。Henderson,「Cytological Hybridization to M
am-malian Chromosomes」,International Review of Cy
tolo-gy,Vol.76,pp.1-46(1982)参照のこと。
【００１６】ハイブリダイゼーションプロセスは、（プ
ローブと標的が一重鎖核酸でなければ）、加熱または他
の手段によってプローブと標的の二重鎖核酸を解くこと
(unravelling)または融解(melting)を含む。このステッ
プは核酸の変成と呼ばれることがある。プローブおよび
標的の核酸の混合物が冷却すると、相補的ベースを有す
るストランドは再結合またはアニールする。プローブが
標的の核酸と共にアニールすると、標的上のプローブの
位置は、プローブが持つ標識により、またはプローブも
しくはプローブ-標的デュプレックス(duplex)のある内
在的特徴によって検出できる。もし標的の核酸がその自
然的生物学的セッティング(setting)内に、例えばDNAが
染色体に、mRNAが細胞質、染色体または細胞核の部分に
残留すれば（調製技術によって固定されまたは変わる
が）、このハイブリダイゼーションプロセスはインシト
ゥハイブリダイゼーシヨンと呼ばれる。
【００１７】インシトゥハイブリダイゼーションプロー
ブは始めは、染色体もしくは細胞の遺伝子または他の明
かになった核酸配列の同定に限られていた。シングル-
コピー(single-copy)プローブの正常および異常染色体
へのマッピングの比較が、染色体異常の検査に用いられ
た。Cannizzaro et al.,Cytogenetics and Cell Geneti
cs,39:173-178 (1985)参照のこと。反復プローブの多数
の結合座位の分布も決定することができた。
【００１８】一倍体ゲノム中に１つの標的座位を有する
プローブ、シングル-コピーまたは単一配列プローブに
よるハイブリダイゼーションは、ゲノム中の特定の遺伝
子の位置をマップ化するために用いられてきた。[Harpe
r and Saunders,「Localization of the Human Insulin
Gene to the Distal End of the Short Arm of Chromo
some 11」,Proc. Natl. Aca.Sci., Vol.78,pp.4458-446
0(1981; Kao et al.,「Assignment of the Structural
Gene Coding for Alubumin to Chromosome 4」,Human G
enetics,Vol.62,pp.337-341 (1982)] しかし、このよ
うなハイブリダイゼーションは標的座位が小さいときに
は信頼性がない。低度コンプレキシティ(complexity)シ
ングル-コピープローブに対する標的配列の量は小さい
ので、細胞集団中の潜在的標的座位の一部分のみがプロ
ーブによってハイブリッドを形成する。したがって、プ
ローブの特異的結合座位の位置のマッピングは、プロー
ブの非特異的結合によって生じるバックグラウンドシグ
ナルにより、また検出システム（例えばオートラジオグ
ラフィーまたは免疫化学）のノイズによって複雑化され
た。このような従来技術によるシングル-コピープロー
ブに対するシグナルの不信頼性の故に、プローブの特異
的結合座位をマップ化するためには、多数の細胞中の見
かけのハイブリダイゼーションシグナルの位置の統計的
分析を必要とした。
【００１９】異なった反復配列は染色体上に異なった分
布を有するであろう。これらは、先に引用した文献に示
されたように、全染色体上に広がっており、ゲノムのコ
ンパクトな領域、例えば染色体の動原体上に濃縮してお
り、または他の分布を有するであろう。ある場合には、
このような反復配列は主に単一染色体上に位置してお
り、このためこれは染色体-特異的反復配列である。[Wi
llard et al.,「Isolation and Characterization of a
Major Tandem Repeat Family from the Human XChromo
some」,Nucleic Acids Research,Vol.11,pp.2017-2033
(1983)]。
【００２０】全染色体によって共有された反復配列に対
するプローブは、もしその配列が種の１つに対して特異
的であれば、異なった種の染色体の間を識別するために
用いることとができるであろう。このような反復配列に
富む１つの種からの全ゲノムDNAは、このように用いる
ことができる。[Pinkel etal. (III),PNAS USA,83:2934
(1986);Manuelidis,Hum.Genet.,71:288(1985) and Dur
nam et al.,Somatic Cell Molec. Genet.,11:571(198
5)]。
【００２１】近来になって、選択された染色体に対して
激しくかつ特異的にハイブリダイズする反復配列用のプ
ローブ（反復プローブ）の利用の可能性が増した。[Tra
sk et al.,Hum. Genet.,78:251(1988)およびこのなかに
引用された文献] 今やこのようなプローブはヒト染色
体の半分以上に利用できる。一般的に、これらは動原体
近傍の標的染色体のコンパクトな領域上の反復配列に結
合する。しかしながら、ヒト染色体1p36にハイブリダイ
ズする１つのプローブが報告されており、またヒト染色
体Yqにハイブリダイズする幾つかのプローブがある。こ
のようなプローブによるハイブリダイゼーションは、中
期スプレッドにおける染色体の迅速同定、間期核中の選
択された染色体のコピー数の決定 [Pinkel et al.(I),P
NAS USA,83:2934(1986); Pinkel et al.(II),Cold Spri
ng Harbor Symp. Quant. Biol.,51:151(1986) and Crem
er et al.,Hum. Genet.,74:346(1986)] および間期核中
の染色体の相対的位置の決定を可能にする。[Trask et
al.,前記;Pinkel et al.(I),前記;Pinkel et al.(II),
前記;Manuelidis,PNAS USA,81:3123(1984); Rappoldet
al.,Hum. Genet.,67:317(1984); Schardin et al.,Hum.
Genet.,71:282(1985); and Manuelidis,Hum. Genet.,7
1:288(1985)]。
【００２２】しかしながら、多くの適用は、適当なプロ
ーブの欠如によってなお制約されている。例えば、ここ
に記載する方法が発明されるまでは、出生前診断に対し
て十分な特異性を有するプローブが第13または第21染色
体に対して利用できなかった。さらに、反復性プローブ
は構造的異常の検出に対して非常に有用ではない。とい
うのは、プローブがハイブリダイズした領域を異常が含
む確率が低いからである。
【００２３】以下に記載するのは、遺伝子再配列、例え
ばBCR-ABL融合に対して例示した再配列を検出する染色
体-特異的試薬および方法であって、現有技術によって
は入手できない情報を提供する。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明は、標的染色体物
質に対して、前記標的染色体物質における各疑わしい遺
伝子再配列を含む領域の座位に各々が相補的である標識
された核酸断片の不均一混合物からなる核酸プローブを
使用し、核酸配列に基づき染色体物質を染色する方法に
関する。この方法は、特異的細胞遺伝学的分析に対して
適合できる染色パターンを生じる。さらに、細胞遺伝学
的分析に対して有用な核酸プローブを作ることも本発明
の目的であって、これは信頼性のあるシグナルによって
染色体物質を染色する。このプローブはインシトゥハイ
ブリダイゼーションに適している。本発明のある適用に
対して好ましい核酸プローブは、２またはそれ以上の各
標的座位を確実に染色するのに十分なコンプレキシティ
を有するものである。
【００２５】本発明は、染色体物質を染色するための方
法および組成物を提供する。ハイブリダイゼーション技
術の現状における本発明のプローブ組成物は、典型的に
高度のコンプレキシティを有し、通常は50kbより大きい
コンプレキシティであって、このコンプレキシティはプ
ローブが設計される適用に依存する。特に、染色体-特
異的染色試薬としては、核酸断片の不均一混合物からな
り、各断片は特異的染色が所望されている核酸--標的核
酸、好ましくは標的染色体物質の一部分に実質的に相補
的である配列の実質的断片を有するような試薬を提供す
る。一般的に、核酸断片は、ここに例示しかつ後に示す
ような手段によって標識される。しかしながら、核酸断
片はプローブ断片の被検出標的との結合のために順序正
しく直接に標識される必要はなく、例えばこのような核
酸結合は抗-RNA/DNAデュプレックス抗体およびチミジン
ダイマーに対する抗体によって検出できる。不均一混合
物の核酸断片には、二重鎖もしくは一重鎖RNAまたはDNA
を含む。
【００２６】本発明は、疑わしい遺伝子再配列の近傍に
ある標的染色体物質を染色する染色体-特異的試薬およ
び方法に関する。このような遺伝子再配列には、転座、
逆位、欠失、増幅および挿入が含まれるが、これらに限
定されない。このような遺伝子再配列が疾患と関連して
いるときには、この染色体特異的試薬は、疾患特異的試
薬またはプローブと呼ばれる。また、このような遺伝子
再配列が癌と関連しているときには、この試薬は腫瘍特
異的試薬またはプローブと呼ばれる。
【００２７】本発明は、１または複数の疑わしい遺伝子
再配列の近傍にある標的染色体物質を確実に染色する核
酸プローブを提供する。遺伝子再配列の検出に対して有
用なこのような核酸プローブは、典型的に高度のコンプ
レキシティを有する。このような核酸プローブは、好ま
しくは遺伝子再配列と関連する切断点間に部分的または
全体にわたって、わきに位置し(flank)および／または
延びる染色体領域における核酸配列と実質的に相同な核
酸配列からなる。
【００２８】さらに、本発明は、細胞遺伝学的には類似
であるが遺伝学的には異なる染色体再配列の間を識別す
る方法および試薬を提供する。
【００２９】ここに特に例示するのは、慢性骨髄性白血
病(CML)の診断に役立つBCR-ABL融合を生じる遺伝子再配
列、例えば転座、欠失、増幅および挿入を検出する染色
体-特異的試薬および方法である。CML診断用のこの染色
体-特異的試薬は、CMLと関連する染色体領域 9q34およ
び22q11の転座切断点領域の近傍における染色体配列と
実質的に相同な核酸配列を含む。
【００３０】これらの試薬は、CMLの特徴であるBCR-ABL
融合が起こると、独特に変わる染色パターンを生ずる。
図１１Ａ〜１１Ｆに図式的に種々の染色パターンを示す
が、これらは他の潜在的染色パターンと共に、遺伝子再
配列、例えばBCR-ABL融合の存在において変えられる。
これらの図には、構造的異常検出のための幾つかの典型
的なプローブ戦略を示す。プローブの結合パターン、色
などの設計は、中期および／または間期細胞における遺
伝子異常の検出のために、最適にすることができる。異
なったパターンが個々の適用に対して有利となるであろ
う。図は、幾つかの異常の検出に対して有用な幾つかの
パターンを示す。これらの例は、代表的なものであって
究極的なものではないので、異なったパターンを組み合
わせることができ、同一細胞内の多数の異常の検出を可
能にする。これらの各図面において、中期染色体は両染
色分体に結合したプローブを伴って示されている。間期
核が描かれているのは、プローブが結合する染色体の部
分の複製前における細胞サイクルの段階であるので、各
間期染色体に対してただ１つの染色分体があるにすぎな
い。プローブの結合が染色体のただ一部分のみに制限さ
れると、シグナルは、黒または白の円として示される。
このような表示は、異なった色または別の識別可能な染
色特性を示すために用いられる。２つ以上の識別可能な
特性（３色、色の異なった比など）を含むパターンは、
ここに図示されたものよりより複雑な染色パターンを可
能にする。DNA中の切断点の染色体上の位置は、異常染
色体に隣接する水平線によって示される。
【００３１】図１１Ａのセクションは、染色体全体を染
色するプローブの使用を示す。このようなプローブは、
その染色体に沿ってどこかで起きる転座を検出するため
に用いることができる。図１２の写真は、転座を検出す
るために第22染色体に対するこの染色の使用を示すが、
この患者においてはCMLに伴って起きているものであ
る。染色のこのようなアプローチは、染色される核の領
域が比較的に大きいので、間期核においては非常に有効
であるとはいえず、染色された領域における重複は多く
の核において解釈を難しくする。
【００３２】図１１Ｂのセクシヨンは、図１１Ａで示さ
れた染色体の染色領域の切断点近傍の領域への縮小を示
し、その領域における事象に焦点を合わせた情報を提供
する。染色パターンは、切断点を横切って連続または不
連続であり、このためある結合は切断点の両側にある。
このような染色パターンは、ただ１つの”色”のみを必
要とするが、他のどのようなゲノム領域が組み換え(exc
hange)に含まれるかについては何ら情報を与えない。
【００３３】図１１Ｃのセクションは、再配列の結果と
して共に生じた配列と結合して、中期、間期の細胞中の
検出を可能にするプローブの使用を示す。この場合に
は、異なった配列は異なった「色」で染色される。この
ような染色パターンは、この出願のセクションVIIIの例
において使用されるものである。
【００３４】図１１Ｄのセクションは、再配列に含まれ
る両切断点の両側の染色を含むことによって、図１１Ｃ
の延長を示す。示したように、異なった「色」が使用さ
れる。より複雑な染色パターンによって供給される追加
の情報は、核の解釈の助けとなる。また、そこでの議論
のように明白な挿入事象の認識も可能となる。
【００３５】図１１Ｅのセクションは、染色体の１つの
相同体における挿入の検出を示す。
【００３６】図１１Ｆのセクションは、欠失の検出に有
用な染色パターンを示す。欠失は、欠失領域のみを染色
するプローブによっても検出できるが、プローブ結合の
欠如は、標的配列の欠失以外の理由によるかもしれな
い。わきに位置する異なった「色」に染色された領域
は、ハイブリダイゼーションに対する対照としての役目
をする。
【００３７】遺伝子再配列の存在は、ここに記載した方
法に従って本発明の試薬を用い、かつ生じた染色パター
ンのシグナルの近接および／または他の特徴を観察する
ことによって決定できる。
【００３８】好ましくは、本発明のCML検出用染色体-特
異的試薬は、約50キロベース(kb)から約1メガベース(M
b)まで、より好ましくは約50kbから約750kbまで、さら
により好ましくは約200kbから約400kbまでのコンプレキ
シティを有する核酸配列からなる。
【００３９】さらに、本発明は、１つのゲノム内におい
て比較的に近接して生じる疑わしい遺伝子再配列の間の
識別方法を提供するが、この染色体-特異的試薬は前記
疑わしい遺伝子再配列の近傍における核酸配列と実質的
に相同な核酸配列からなる。２つの潜在的遺伝子再配列
の間のこのような鑑別の例としては、急性リンパ性白血
病(ALL)からのCMLの識別診断である。
【００４０】さらになお、本発明は、遺伝子再配列と関
連した疾患、例えばCMLにおけるBCR-ABL融合と関連した
疾患に苦しむ患者において染色パターンを作出する方法
および試薬を提供し、この染色パターンは種々の治療的
養生、例えば化学療法、照射、外科、移植、例えば骨髄
移植に対する患者の反応を予知しおよび／または表示す
る。このような染色パターンは、このような患者の状態
を、好ましくは個々の細胞を染色することによって監視
するのに有用であり、また軽快化にある患者に対しては
疾患の再発を予知することができる。コンピュータを利
用した検鏡分析は、本発明の染色パターンの解釈を助け
ることができ、また本発明は、コンピュータ利用の検鏡
分析が、個々の細胞を染色することによって患者の細胞
を試験する、例えば患者に残留する疾患を探索するのに
用いられる方法を提供する。
【００４１】さらになお、本発明は、遺伝子的疾患の分
子的ベーシスを決定し、また特異的に遺伝子に基づく疾
患を検出する方法および試薬を提供する。
【００４２】さらになお、本発明は、核酸プローブのイ
ンシトゥハイブリダイゼーションからなる隣接する遺伝
子症候群を検出する方法と試薬を提供するが、このプロ
ーブは、隣接する遺伝子症候群の１または複数の成分の
特徴である核酸配列に実質的に相同である配列を含む。
このような隣接する遺伝子症候群の代表はダウン症候群
である。
【００４３】また、１つのゲノム内の多数の座の遺伝子
再配列を同時に検出する方法を提供するが、これは高度
コンプレキシティ核酸プローブのインシトゥハイブリダ
イゼーションからなり、かつこのプローブは、ゲノム内
の多数の座における核酸配列に実質的に相同である核酸
配列を含む。
【００４４】さらになお、１つのゲノム内の遺伝子再配
列を探索する方法を提供する。例えば、慣用のバンド分
析は、検査されているゲノムの染色体領域における異常
を示すであろう。本発明の方法は、正常なゲノムのその
染色体領域の近傍から作出した核酸プローブをインシト
ゥハイブリダイゼーションにより異常を含む細胞に適用
することを含み、これによって、生じた染色パターンの
観察により前記異常の遺伝子再配列の正確な位置と種類
とを詳細に知ることができる。
【００４５】さらになお、本発明は、遺伝子再配列の迅
速、効率的、かつ自動化された検出に対して最適化され
た高度コンプレキシティ核酸プローブを提供する。
【００４６】高度コンプレキシティプローブを作出する
１つのやり方は、数個または多数のクローン、例えばと
りわけファージ、プラスミド、コスミドおよび／または
YACクローンをプールすることであり、各クローンはゲ
ノム内の標的のある部分にハイブリダイズすることがで
きるインサート(insert)を含む。このようなプローブを
作出するもう１つのやり方は、ポリメラーゼ鎖反応(PC
R)を用いることである。
【００４７】標識された核酸断片の混合物に関する不均
一とは、染色試薬は各断片が異なった配列および／また
はサイズを有する多くのコピー（例えばプローブを作る
ためにプールした異なったDNAクローン）からなるとい
うことを意味する。使用のための準備としては、これら
の断片をランダムに、または特異的に切断して、ハイブ
リダイゼーションに関与する核酸のピースのサイズ分布
を調整する。
【００４８】以下により十分に論議するように、好まし
くは不均一プローブ混合物は非標的核酸に対してハイブ
リダイゼーション能力を持った核酸配列から実質的にフ
リーである。このような配列の多くは、標的および非標
的核酸によって共有された反復配列、すなわち共有反復
配列に結合している。
【００４９】所望しない核酸配列を除去しおよび／また
はこのような配列のハイブリダイゼーション能力を役立
たなくするための方法については、後により十分に論議
する。［セクションII参照］このような方法は、共有反
復配列のプローブからの選択的除去またはスクリーニン
グ、プローブ中のインクルージョン(inclusion)に対す
る核酸配列の注意深い選択、標識されないゲノムDNAの
添加による共有反復配列のブロッキング、またはブロッ
キング混合物中のインクルージョンに対する核酸配列の
より注意深い選択、および高コピー反復配列の再結合の
ために十分な時間をかけたプローブ混合物のインキュベ
ーションなどを含むがこれに限定されない。
【００５０】好ましくは、本発明の染色試薬は、インシ
トゥハイブリダイゼーションによって間期または中期の
染色体DNAに施され、かつ染色体は、染色試薬を含む核
酸断片上における標識、例えばビオチンまたは3Hの存在
を検出することによって同定、または分類、すなわちカ
リオタイプされる。
【００５１】本発明は、染色体の全ゲノム補体に対する
染色体染色試薬、単一染色体に特異的な染色試薬、染色
体のサブセットに特異的な染色試薬、および単一または
多数の染色体中のサブリージョンに特異的な染色試薬を
含む。述語"染色体-特異的"は、本発明の染色試薬のこ
れら実施態様の全てを包含するものと解釈される。ま
た、この述語は、正常染色体、異常染色体型の両方から
作られ、またこの両方に向けられた染色試薬を包含する
ものと解釈される。
【００５２】本発明の染色体-特異的染色試薬を作る好
ましい方法に含まれるのは、１）ゲノム内の特定の染色
体型または１もしくは複数の標的領域からの染色体DNA
の分離、２）核酸断片の不均一混合物を形成するための
分離DNAの増幅、３）核酸断片中の共有反復配列のハイ
ブリダイゼーション能力を役立たなくすること、または
除去、および４）標識された核酸断片の不均一混合物を
形成するために核酸断片に標識することである。より十
分に後に記載するように、特定の実施態様に対するステ
ップの順序は、ステップを実施するために採用される特
定の手段に従って変わる。
【００５３】本発明は、染色体のカリオタイプに関連す
る問題、特に診断的および線量測定的適用に向けられて
いる。特に、本発明は、次のような染色の欠如に起因す
る問題を克服する。すなわち、それは、標的DNAおよび
／またはRNA、例えば標的染色体、染色体の標的サブセ
ット、または特定染色体の標的領域にハイブリダイズで
きる核酸断片の不均一混合物を含む試薬を提供すること
によって十分に染色体-特異的な染色である。本発明の
染色技術は、標準的臨床および実験室装置と自動化技術
を利用する改善された分析を用いることによって、中
期、間期の両方の細胞における染色体異常、特に遺伝子
再配列の迅速、高感度検出の可能性を切り開くものであ
る。これは遺伝子スクリーニング、癌診断、および生物
学的線量測定に直接に適用できる。
【００５４】さらに、本発明は特に、中期のように濃縮
していても、また間期のように分散していても、胎児染
色体物質を染色する方法および核酸プローブを提供す
る。さらになお、本発明は、胎児細胞の染色体物質のカ
リオタイピングの胎児非侵襲的方法を提供し、胎児細胞
は母性の血液から分離されたものである。好ましくは、
このような胎児細胞は、白血球および／または細胞栄養
層である。典型的な核酸プローブは、染色体型13、18お
よび／または21に対して染色体-特異的な高度コンプレ
キシティプローブである。代表的なプローブは、染色体
-特異的ブルースクライブ(Bluescribe)プラスミドライ
ブラリーを含み、これは標的胎児染色体とのハイフリダ
イゼーションの前および／または期間中に十分な数の共
有反復配列が除去され、またはそのハイブリダイゼーシ
ョン能力が役立たなくされたものである。
【００５５】さらになお、本発明は、腫瘍細胞遺伝学、
疾患関連の座の検出、構造的異常、他の遺伝子再配列の
なかでも例えば転座の分析に使用し、また生物学的線量
測定に対して適当な核酸プローブを含むテストキットを
提供する。
【００５６】さらに、本発明は、本発明の適当な核酸プ
ローブを含む出生前のスクリーニングキットを提供す
る。また、本発明は遺伝子再配列、特にCMLの特徴であ
るBCR-ABL融合を生じる再配列検出用の高度コンプレキ
シティプローブを含むテストキットを提供する。
【００５７】本発明の方法および組成物は、所望の適用
に対して適当したパターンを伴った染色体物質の染色を
可能にする。パターンは、１または複数の染色体の幾つ
かの領域、または１つのゲノムの幾つかもしくは全染色
体にわたって延び、かつ例えば多数の色によって識別可
能な多数の部分を含むことができる。また、その代わり
に、パターンは、１つのゲノムの特定の１または複数の
部分、例えば１または複数の腫瘍に対して診断的にもし
くは予後的に重要な欠失または切断点を潜在的に含む１
または複数の部分、または出生前の診断に重要な染色体
のそれらの部分に焦点を絞ることができる。
【００５８】染色パターンは、用いられる分析方法、例
えば人による観察または自動化装置、例えばフローサイ
トメータまたはコンピュータ利用の検鏡に対して調整で
きる。パターンは、濃縮染色体または分散染色体物質の
分析に対して適当するように選択することができる。
【００５９】さらに、本発明は、本発明に従って作られ
た染色パターンによって示される、染色体異常、特に遺
伝子再配列を検出、分析する自動化手段を提供する。
【００６０】本発明の他の目的は、非自己相補的一重鎖
DNAハイブリダイゼーションプローブを調製し適用する
ために現在利用できる技術に代わる方法を提供すること
である。
【００６１】本発明の他の目的は、プローブの非特定的
かつ誤った結合を減少することによって、インシトゥハ
イブリダイゼーションにおいて到達可能なシグナル対ノ
イズ比を改善することである。
【００６２】本発明の他の目的は、プローブの配列に対
して非相補的であり、ハイブリダイゼーションに対して
利用できる一重鎖領域を最小にする二重鎖標的DNAを、
ハイブリダイゼーションプローブの適用に対して変性す
る手段を提供することである。
【００６３】プローブは、DNAを制限エンドヌクレアー
ゼにより処理することによって染色体DNAから構成する
ことができるが、これは用いるエンドヌクレアーゼの特
徴をなす「付着」端("sticky" end)または付着切断端(s
taggered cut)を有する制限断片のコレクションを生じ
る。すなわち、カットによって導入された２つの断片末
端は、それぞれ突出したストランドと引っ込んだストラ
ンドとからなる。制限断片は、この型の制限断片を受け
入れるように加工されたベクターに挿入され、そしてベ
クターは、制限断片の数を増すべく成長した宿主生体内
にトランスフェクトされる。次に、ベクターは宿主生体
から分離され、制限断片は切り出されベクターから分離
される。制限断片の各末端において、引っ込んだストラ
ンドは適当なエキソヌクレアーゼによってダイジェスト
される。ダイジェスチョンは完結を許されない。エキソ
ヌクレアーゼ処理された制限断片は次いでDNAポリメラ
ーゼに対する鋳型／プライマーとして使用され、これは
標識された前駆体の存在においてダイジェストされたス
トランドに代わる。このプロセスに適した酵素の例は、
DNAポリメラーゼ Iの大きな断片によって処理されたエ
キソヌクレアーゼ III、またはT4 DNAポリメラーゼで
あって、これは反応条件の変化によって両方の機能を果
たすことができる。合成が完了した後、制限断片は、最
初の制限断片の標識した部分が実質的に元のままに残る
ように、より細かな断片に分割される。この細かな断片
は変性され、標識されたストランドは標識されないスト
ランドから分離されて、ハイブリダイゼーションプロー
ブを形成する。一重鎖プローブを用いるこの方法におい
ては、標的DNAにハイブリダイゼーションプローブを施
す前に、先ず標的DNAを、クローニングベクターからプ
ローブDNAを切り出すために用いたのと同じ制限エンド
ヌクレアーゼで処理する。この処理は、標的DNAを、各
末端に制限エンドヌクレアーゼの特徴である尾部を有す
る制限断片のコレクションに分割する。次に、標的DNA
は、引っ込んだストランドを除去するエキソヌクレアー
ゼで処理されるが、これによって制限エンドヌクレアー
ゼによって導入されたカットの近傍に一重鎖DNAを露出
させる。最後に、より十分に後に記載するように、例え
ば標準インシトゥハイブリダイゼーションプロトコル(p
rotocol)を用いて、ハイブリダイゼーションプローブを
標的DNAに適用する。
【００６４】一重鎖プローブ法の重要な特徴は、クロー
ンされたプローブDNAと標的DNAとを同一の制限エンドヌ
クレアーゼで処理することである。これは、標的の一重
鎖DNAがプローブの標識されたストランドと相補的であ
ることを確実にする。もちろん、多くの制限カットがあ
るので、正しい結合座位に加えて標的の多くのセグメン
トが一重鎖化されるであろうが、全一重鎖標的は無差別
変性によって作られるよりもずっと少ないであろう。加
えて、このやり方で一重鎖化された標的DNAは自身によ
って再アニールができず、このためプローブへのアクセ
スを妨げることができない。
【００６５】このような方法の他の重要な（しかし決定
的ではない）特徴は、標識したストランドを標識されな
いストランドから分離することを可能にする標識の選択
である。好ましくは、前駆体はビオチン化(biotinylati
on)によって標識され、また標識されたストランドはア
フィニティークロマトグラフィーによって標識されない
ストランドから分離される。
【００６６】
【発明の作用および効果】本発明は、プローブの使用上
従来技術の有する制約を克服し、細胞遺伝学的分析に対
するインシトゥハイブリダイゼーションの適用を劇的に
増すものである。前記のとおり、従来技術によるプロー
ブは、徹底的な細胞遺伝学的分析に対して有用ではなか
った。低度コンプレキシティシングル-コピープローブ
は、ハイブリダイゼーション技術のこの段階においては
信頼性のあるシグナルを発生しない。反復性プローブは
信頼できるシグナルを生ずるが、このようなシグナル
は、ゲノムにおける反復配列の固定した分布のために、
異なった適用に対して適合させることができない。本発
明のプローブは、反復性プローブのハイブリダイゼーシ
ョン信頼性を、プローブの結合パターンを所望の適用に
対して適合させることができる融通性と結合させる。
【００６７】本発明によるプローブの高められた能力
は、その増加したコンプレキシティに由来する。プロー
ブのコンプレキシティの増加は、標的領域へのハイブリ
ダイゼーションの確率、ひいては強度を増すが、またバ
ックグラウンドシグナルをもたらす非特異的ハイブリダ
イゼーションの確率も増加させる。しかしながら、本発
明の概念においては、このようなバックグラウンドシグ
ナルはゲノム上にほぼランダムに分布しているものと考
えた。したがって、最終的結果としては、標的領域は、
このようなバックグラウンドシグナルに対するコントラ
ストの増加によって可視化できるということである。
【００６８】ここには、概略のコンプレキシティ範囲で
約50,000ベース(50 kb)から数億ベースからなるプロー
ブが例示されている。このような代表的プローブは、コ
ンパクトな座とヒト染色体全体に対するものである。本
発明の前には、インシトゥハイブリダイゼーションに使
用されるプローブは、40 kb以下、さらに代表的には数k
bのオーダーのコンプレキシティを有していた。
【００６９】本発明のプローブを用いた染色体物質の染
色は、従来技術による化学的染色とは顕著に異なってい
る。本発明のプローブ作出染色の特異性は、全く新規な
源-ゲノム中の核酸配列から生じる。かくして、本発明
の染色パターンは、特定の適用に対して重要な基礎的遺
伝子情報を目だたせるように設計することができる。
【００７０】本発明により所望の特異性をもつプローブ
を作るための手法は、細胞遺伝学研究の広い範囲に顕著
な進歩をもたらす。分析は中期染色体と間期核について
行うことができる。本発明の技術は、慣用の方法による
高品質のバンディングが難しいか、偏った情報が得られ
るという懸念がある適用、例えば腫瘍細胞遺伝学に対し
て特に有益である。診断上または予後上重要であること
が知られている病変、他の腫瘍特異的遺伝子配列のなか
でも例えば腫瘍型-特異的転座および欠失の座位を標的
とした試薬は、このような異常の迅速な認識を可能にす
る。分析の速度が主な関心事である場合、例えば有毒環
境薬剤によって誘発される低頻度の染色体異常の検出に
は、本発明の組成物は、慣用の染色体バンディングに基
づく従来技術と比較して、検査効率において劇的な向上
を可能にする。
【００７１】さらに、疾患-関連の染色体異常（例えば
トリソミー21）に対する出生前スクリーニングは、本発
明による方法と組成物による異常の迅速検出によって強
められる。本発明による間期異数体分析は、出生前診断
に対して特に顕著であり、細胞培養法によるよりもより
迅速に結果が得られる。さらに、母性の血液から分離さ
れる胎児の細胞は、日常の手法によっては培養すること
ができず、このため慣用のカリオタイピング技術によっ
て分析することもできないが、本発明の方法と組成物に
よれば検査することができる。これに加えて、染色パタ
ーンの強度、コントラスト、色の組合せは、特定の適用
に対してパターンを適合させる能力と連携して、自動化
された細胞遺伝学的分析、例えばフローサイトメトリー
またはコンピュータ化した検鏡検査およびイメージ分析
に対する機会を増した。
【００７２】本出願は、特に遺伝子再配列の検出のため
の染色体-特異的試薬と、このような再配列を検出する
ためにこの試薬を使用する方法について特許を請求す
る。このようにして検出される代表的な遺伝子再配列
は、慢性骨髄性白血病(CML)の診断に役立つ融合遺伝子-
BCR-ABL-を生じる再配列である。
【００７３】慢性骨髄性白血病(CML)は、骨髄細胞の悪
性増殖であって、一般的に第9および第22染色体上にお
けるBCRおよびABLの融合によって特徴づけられる。この
融合は通常は相互転座 t(9;22)(q34;q11)を含み、細胞
遺伝学的に独特のフィラデルフィア染色体 (Ph1)を生ず
る。しかしながら、もっと複雑な再配列がBCR-ABL融合
の原因となることがある。分子的レベルにおいては、融
合はサザーン分析またはポリメラーゼ鎖反応(PCR)を用
いる融合遺伝子からmRNAのインビトロ増幅によって検出
できる。これらの技術は鋭敏ではあるが、単一細胞には
適用できない。
【００７４】明らかに、染色体異常、より特定的には遺
伝子再配列、例えばCMLと関連した腫瘍特異的配列検出
の鋭敏な方法は、遺伝学的スクリーニングに対して非常
に有用な道具であろう。本発明はこのような道具を提供
する。
【００７５】
【発明の実施の形態】本発明は、標的染色体物質を１ま
たは複数の全染色体に延びるパターンに染色し、および
／または１または複数の染色体における１または複数の
領域に延びるパターンに染色する核酸プローブの使用に
関するもので、当該パターンは全ゲノムにわたって延び
るパターンを包含する。本発明の染色試薬は正常な染色
体と異常な染色体の顕微鏡的同定、および／またはフロ
ーサイトメトリック同定を容易にし、かつ遺伝子配列の
ごとき特有の異常の遺伝子的性質の特性を提供する。本
明細書において、「染色体-特異的」なる文言は「標的
特異的」および「領域特異的」なる文言を包含するもの
と定義される。すなわち、染色組成物が１個の染色体に
導びかれる場合、それは染色体-特異的であるが、染色
体組成物が例えば、多数の染色体にける多数の領域に導
かれる場合、単に１個の染色体の１領域に導かれる場
合、または全ゲノムにわたる領域に導かれる場合にも、
これらは染色体-特異的である。染色体-特異的なる文言
は組換えDNAライブラリーを使用することに由来する。
当該DNAライブラリーは本発明の最初のプローブのため
の源物質のごとき、単一の正常染色体から得られるDNA
をクローニングすることにより作られる。１または複数
の染色体の領域からのDNAから作られたライブラリー
は、ゲノムのこれらの領域のプローブのためのDNAの源
である。かかる源物質から形成されたプローブは領域-
特異的プローブであり、これもまた"染色体-特異的"な
る幅広い文言に包含される。「標的-特異的」なる文言
は本明細書においては「染色体-特異的」なる文言と互
換的に使用される。
【００７６】当該技術において一般に使用される「特異
的」なる文言は、２つのやや異なる意味を持っている。
本明細書においては下記の慣習に従う。「特異的」とは
核酸配列の起源または同核酸配列が、染色試薬の一部と
してゲノムにハイブリダイズする様式に関係する。例え
ば、特定された染色体からのDNAの分離およびクローニ
ングは「染色体-特異的ライブラリー」をもたらす。［E
g.,Van Dilla et al.,「Human Chromosome-Specific DN
A Libraries: Construction and Availability」,Biote
chnology,4:537(1986).］。しかしながら、かかるライ
ブラリーは他の染色体と共有する配列を含んでいる。こ
れらの共有配列は同共有配列のハイブリダイゼーション
特性を誘導される染色体に対しては染色体−特異的では
なく、同共有配列は起源の染色体よりも多く結合する。
配列は、ゲノムの所望の部位にのみ結合する場合には"
染色体-特異的"である。かかる配列は標的または反復配
列（repetitive sequenses）に包含されるシングルコピ
ー配列を含み、これらの配列においてコピーは標的物質
に抜群に包含されている。
【００７７】「染色試薬」を変更することにおける「染
色体−特異的」とは、試薬を含む核酸配列の全体のハイ
ブリダイゼーションの様式に関係する。染色試薬は、標
的染色体物質と非標的染色体物質間に有効な顕著なコン
トラストが達成されるならば、染色体-特異的である
（すなわち、標的物質が十分に可視化できる）。
【００７８】本明細書においてプローブは、標的物質に
対するハイブリダイゼーションが検出できる核酸断片の
集合体であると定義される。プローブは後述するごとく
標識され、その結果標的物質への結合が可視化出来る。
プローブは核酸配列のある源、例えばクローンの集合体
またはポリメラーゼ鎖反応（PCR）の集合体から形成さ
れる。源核酸はその後ある手段例えば反復配列の除去、
または同反復配列を相補的配列とともに標識されない核
酸によりブロッキングすることにより処理され、その結
果得られるプローブによるハイブリダイゼーションは標
的物質に十分な差異ある染色物を作り出す。従って、本
明細書において、プローブなる単語は検出可能な核酸の
みならず、例えばブロッキング核酸等とともに標的物に
適用される形態において検出可能な核酸に関しても使用
される。ブロッキング核酸については別に言及する。
「プローブ」が特別に関係することがらは、文言が使用
される状況から明確である。
【００７９】本発明に係る２またはそれ以上の核酸プロ
ーブが混合される場合、これらの核酸プローブは新しい
１つのプローブを形成し、同プローブは本発明の方法に
従って標的物質にハイブリダイズされると、成分プロー
ブにより個々に形成される染色パターンの組合わせであ
る染色体パターンを形成する。従って、「プローブ」お
よび「プローブズ」（すなわち単数形および複数形）な
る文言は、形成される染色パターンの状況において互換
的に使用される。例えば、本発明に係るあるプローブが
第9染色体にドットを形成し、かつ本発明に係る他のプ
ローブが第11染色体にバンドを形成する場合、これら２
つのプローブズはドット／バンド染色パターンを形成す
る１つのプローブを構成する。
【００８０】本明細書において「標識される」なる文言
は、プローブが変更された構成物質を直接導くか否かに
かかわらず、結合プローブ（bound probe）を可視化す
る方法があることを示すために使用される。後述のセク
ションIIIはプローブを直接標識する種種の手段および
結合プローブが検出可能な他の標識手段を述べている。
【００８１】本明細書において「染色」(staining)また
は「着色」(painting)なる文言は、本発明に係るプロー
ブをゲノムまたはそのセグメントにハイブリダイズする
ことを意味するものと定義され、従ってプローブは標的
染色体物質に確実に結合し、結合プローブは可視化可能
になる。「染色」または「着色」なる文言は互換的に使
用される。「染色」または「着色」によりもたらされる
パターンは細胞遺伝学的分析、特に分子細胞遺伝学的分
析にとって有用である。染色パターンは正常および異常
染色体の顕微鏡的同定および／またはフローサイトメト
リック同定、および特殊な異常状態の遺伝学的性質の特
徴付けを容易にする。後述のセクションIIIは可視的な
プローブを分離する方法を示している。プローブを可視
化するのに多数の適合する方法が利用でき、プローブの
異なる構成物質の結合パターンが例えば色によって識別
し得る。従って、本発明は１または複数の色（多数色染
色パターン）および／または他の指標手段で、可視化さ
れた染色体上で所望の染色パターンを形成することがで
きる。本明細書で定義された「染色」なる文言は、慣用
的なカロタイピング法（karotyping methods）のごとき
化学試薬で染色体を染色する概念を包含しない。但し、
かかる慣用の染料は、プローブが結合しないゲノムの部
分の可視化を可能にするために、本発明に係るプローブ
とともに使用されてもよい。かかる目的のためDAPIおよ
びプロピジウム アイオダイドの使用が図面に示されて
いる。
【００８２】本明細書において「高度コンプレキシテ
ィ」（high complexity）なる文言は、プローブが同プ
ローブにおける非反復核酸配列をベースとして 50,000
(50kb)またはそれ以上、数1000万または数10億までのオ
ーダで含むことを意味するものと定義される。例えば、
本発明に係る典型的な高度コンプレキシティ核酸プロー
ブは50kb以上、100,000(100kb)以上、200,000(200kb)以
上、500,000(500kb)以上、100万(1Mb)以上、2Mb以上、1
00Mb以上、500Mb以上、10億以上、さらには数10億以上
のコンプレッキシテイを持つことができる。
【００８３】本明細書において「コンプレキシティ」な
る文言は、ブリテン等により確立された核酸コンプレキ
シティのための標準に従って定義される。［Brittens e
t al.,Methods of Engymol.,29:363(1974)］。核酸コン
プレキシティのさらに詳しい説明および具体例について
は、カンターおよびシンメルの下記の文献を参照せよ。
［Canter and Schlmmel,Biophsical Chemistry:PartII
I:The Behaviorof Biological Macromolecules,at 1228
-1230(Freeman and Co.1980)］。
【００８４】本発明に係るプローブ組成物にとっての好
ましいコンプレキシティは、設計される適用に依存する
る。通常、標的区域が大きいほど、プローブはより大き
なコンプレクスである。染色体上の目標の好ましいパタ
ーンを形成するために必要とするプローブのコンプレキ
シティは、同パターンの形成の進行がハイブリダイゼー
ション技術にて行われるために、ハイブリダイゼーショ
ン感受性が増大する程減少することが予想される。感受
度が増大すると、より小さな標的座位からのシグナルの
確実性は増大するであろう。それ故、現在約40kbから約
100kbの標的配列が確実で、容易に検出可能なシグナル
を形成するのに必要であるのに対して、将来にはより小
さな標的配列が確実なシグナルを提供するであろう。そ
れ故、ハイブリダイゼーション感受性が増加するほど、
あるコンプレキシティ例えば100kbのプローブは、現在
確実に検出されるよりも多くのゲノムの遺伝子座を相当
に検出することをユーザに可能とする。従って、より多
くの情報が同じコンプレキシティのプローブから得られ
るであろう。"コンプレキシティ"なる文言はそれ故、如
何に多くの可視化的に個別の遺伝子座が検出されようと
も、すなわちゲノムを越えた標的座位の分散にかかわら
ず、全プローブのコンプレキシティに関係する。
【００８５】上記したように、現在のハイブリダイゼー
ション技術では、ゲノムにおけるコンパクトポイントを
標的とした約40kbから100kbのプローブ（例えば１また
は小数のコスミッドのプローブインサート能力）で確実
で、容易に検出できるシグナルを得ることが可能であ
る。例えば、約100kbの範囲のコンプレキシティは腫瘍
の特異的転座の両側にハイブリダイゼーションを許容す
る。切断点のー方側を標的としたプローブの部分は切断
点の他側を標的とした部分とは異なって標識され、これ
により両側は例えば異なる色で識別できる。プローブの
コンプレキシティを比例的に増大することは、同時にゲ
ノムの多数の緻密な領域の分析を可能とする。化学的染
料によつて形成された通常のバンディングパターンは本
発明により、プローブを基礎とし、カラーコードされた
各染色体またはそれらの重要領域に沿った関連点のシリ
ーズに置き替えられる。
【００８６】ゲノムの延在した隣接領域、例えば全染色
体を均一に染色するには、標的領域のコンプレキシティ
に比例するプローブ コンプレキシティが必要である。
但し、実質はそれより少ない。要求されたコンプレキシ
ティは、標的物質上で確実で実質的に均一なシグナルを
提供するためにのみ必要である。後述するセクションV.
B, は、約50メガベース(Mb)のDNAを含むヒト第21染色体
の蛍光染色が約1Mbのプローブ コンプレキシティで十分
であることを証明している。図４Ｈは、約200MbのDNAを
含むヒト第4染色体に対する約400Kbのプローブのハイブ
リダイゼーションを示している。この場合、プローブの
個々の要素のハイブリダイゼーション間のギャプ(gaps)
が可視化される。図４Ｂおよび図４Ｆは、それぞれ第4
染色体および第21染色体のために全ライブラリーにより
作り出されたプローブで達成された結果を証明してい
る。染色体は図４Ｂおよび図４Ｆに示すように、図４Ｈ
のパターンを形成するために使用されたシングルコピー
核酸配列からなる、より低度のコンプレキシティプロー
ブによる場合に比較してより濃密に染色される。
【００８７】コンプレキシティを十分な染色を行うのに
要求される最小値を越えて増加することは、プローブの
全核酸濃度がハイブリダイゼーションの損なわれる点を
下回る程度残る限りにおいては有害ではない。プローブ
における配列の一部分の濃度の減少は、標的座位の数の
増加により補われる。実際に、二重鎖プローブを使用す
る場合、配列の各部分を比較的低濃度に維持することは
好ましく、これにより同配列の各部位が標的物質におけ
る結合座位を見つけることができるまで再結合を阻止す
る。
【００８８】本発明の染色パターンは１または複数のバ
ンドからなる。本明細書において"バンド"なる文言は、
プローブ成分に結合した標的核酸配列からなるゲノムに
おける関連点（reference point）として定義される。
同プローブ成分のデュプレックス（duplex）はある指示
手段により検出することができ、かつ最も狭いディメン
ジョン(dimension)において、ハイブリダイゼーション
おび機器使用等の条件および慣習（protocol）のもとで
確実なシグナルを提供する。バンドは確実なシグナルを
提供する配列の狭いディメンジョンから、多数の染色体
における多数の領域まで全染色体にまで延在することが
できる。
【００８９】本発明のプローブ-形成バンドは、上記し
た本発明の背景で示したごとき化学的染色により形成さ
れたバンドとは識別されることである。本発明のプロー
ブ-形成バンドは核酸配列に基づくものであり、これに
対して化学的染色により形成されたバンドは染色体の本
来の特性によるもので、実質の核酸配列によるものでは
ない。さらに、化学的染色により形成されたバンディン
グパターンは中期染色体に関して解明できるにすぎず、
これに対して本発明のプローブ-形成バンドは中期およ
び間期染色体の両者の解明に有効である。
【００９０】本発明に係るプローブを形成する一の方法
は、多くの異なる低度コンプレキシティプローブをプー
ルすることである。かかるプローブは、その後それぞれ
クローン化された配列の"不均一混合物"を構成する。要
求されるクローンの数は、標的区域の広がりおよびクロ
ーニングベクターの能力に依存する。標的物質が幾多の
個別のコンパクトな遺伝子座、すなわち顕微鏡的解像の
限界であるシングルスポット(single spots)で構成され
ている場合には、各スポットにとっては約40kb好ましく
は100kbが通常の技術で与えられる確実なシグナルを与
える。各スポットためのプローブの部分は、例えば酵母
人工染色体（YACS）からのシングル インサート、35-40
kbを含む幾多のコスミッドまたはプローブ配列、4kbの
配列を伴う約25プラスミドから構成される。
【００９１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃおよび図２Ａ、図
２Ｂは、インサートがラムダファージカロン21Aにクロ
ーンされた、第21染色体-特異的ライブラリーのヒト中
期スプレッドへのハイブリダイゼーションを示めす。ラ
イブラリーにおける高度コピー反復配列のハイブリダイ
ゼーション能力は、標識されないゲノムDNAのハイブリ
ダイゼーション混合物への添加によって減少させた。プ
ローブはビオチンによって標識され、これは緑色FITC-
アビジン(fluores-cein isothiocyanate avidin)によっ
て検出された。染色体中の全DNAは、青色蛍光染料DAPI
(4,6-diamidino-2-phenylindole)によって染色した。
【００９２】本明細書で例示されたクローンの典型的な
不均一混合物はフアージ（図１、図２および図３）、お
よびプラスミド（図４）を含む。酵母人工染色体（YAC
S）（図５）、および種間雑種細胞（図６）における単
一ヒト染色体は、シングル クローンとして増殖できる
単一遺伝子座および全染色体のための高度コンプレキシ
ティ プローブの例である。
【００９３】ゲノムのある点における塩基配列は、「シ
ングルコピー」または「反復」のいずれかに分類でき
る。実際の目的のためには、配列は十分長いものである
ことを必要とし、これにより相補的プローブ配列は、使
用されるハイブリダイゼーション条件のもとにおいて標
的配列とともに安定なハイブリッドを形成できる。かか
る長さは典型的には、ヌクレオチドの数10〜数100の範
囲にある。
【００９４】「シングル-コピー配列」は、その中にお
いて標的核酸配列の唯一のワンコピーが一倍体ゲノムと
して存在することである。「シングル-コピー配列」は
当該技術において「非反復配列」としても知られてい
る。「反復配列」は、ゲノムにおける同じ標的核酸配列
のワンコピーより大きいものが存在するということであ
る。反復配列の各コピーは、他のもの全てと同一である
必要はない。重要な特質は、配列が反復配列のファミリ
ーの他の構成メンバーに十分に類似していることであ
り、これにより使用されるハイブリダイゼーションの条
件のもとにおいて、プローブ核酸の同じ断片が各コピー
とともに安定なハイブリドを形成できる。「共有反復配
列」（shared repetitive sequence）はゲノムの標的
領域、およびその他の領域においていくつかのコピーを
伴う配列である。
【００９５】形容詞である「シングルコピー」、「反
復」、「共有反復」その他のこのような修飾語がプロー
ブにおける配列を記述するために使用される場合には、
これらの文言はプローブ配列が結合する標的物質におけ
る配列のタイプに関係する。従って、「反復プローブ」
は標的物質における反復配列に結合する例であり、かつ
「シングル-コピープローブ」はシングル-コピー標的配
列に結合する例である。
【００９６】反復配列は一倍体ゲノムにおけるマルチプ
ルコピーの状態で生じる。コピーの数は２〜数10万まで
配列でき、その中で反復DNAのAluフアミリー（Alu fami
ly）は後者の非常に多い変種の典型的なものである。反
復のコピーはクラスターされ(clustered)、またはゲノ
ムからインタスパーズされる(interspersed)。反復物は
ゲノム、例えば各染色体の動原体の近くに生じる反復配
列、および多数のタンデム反復（VNTRs）における１ま
たは複数の場所でクラスターされる。［Nakamura et a
l,Science,235:1616(1987)］；反復物はシングル染色体
から分散されてもよい。［例えば、反復物はBardoni
等，Cytogenet. Cell Genet., 46:575 (1987)により記
述されたごとくX染色体上でのみ発見された］。反復物
は全染色体、例えば反復配列のAluフアミリーから分散
されてもよい。
【００９７】本明細書において、反復配列（repetitive
sequences）、反復配列（repeatedsequences）および
反復物(repeats)なる文言は互換的に使用される。
【００９８】共有反復配列（Shared repetitive sequen
ces）はクラスターまたはインタスパーズされる。クラ
スターされた反復配列（Clustered repetitive sequenc
es）はタンデム反復物(tandem repeats)を含む。タンデ
ム配列は、それらが染色体のバックボーンを形成するDN
A分子上に近接する故にそう呼ばれる。クラスターされ
た反復物は１または複数の染色体の明確に定義された領
域、例えば動原体領域に関連付けられる。１または複数
のクラスターされた反復物は、染色体の相当大きなフラ
クションを形成するとともに、ゲノムの１または複数の
非標的領域を共有し、かつその結果本発明で偉容された
断片の不均一混合物から除去されるか、またはそれらの
ハイブリダイゼーションの能力が無能力化されるとして
も、標的領域の染色の完全な均一性は可能ではない。こ
の状況は、標識された核酸断片の不均一混合物を標的物
質に結合することに関連して「実質的均一」なる文言の
使用によって理解される。
【００９９】本発明に係る染色体−特異的染色は、標的
物質に対して配列特異的にハイブリダイズする核酸断片
を使用することにより達成される。これらの配列はシン
グルコピーまたは反復のいずれかであり、その中で反復
のコピーが標的区域において支配的に生じる。図４Ｈお
よび後述のセクションVで詳述した実験結果は、プロー
ブがシングルコピー配列でつくることができることを示
している。しかしながら、図４Ｂのプローブのごときプ
ローブにおいては、低度コピー染色体-特異的反復［Nak
amura et al.,and Bardoni et al.,supral］が同様にハ
イブリダイゼーションに寄与する。
【０１００】ゲノムの非標的領域に相補的な核酸断片、
例えば共有反復配列または非特異的配列がプローブ中に
含まれる場合には、それらのハイブリダイゼーションが
十分に無能力化されるかそれらの行き渡りが十分におさ
えられることを必要とし、これにより十分な染色コント
ラストが得られる。セクションVおよび図４Ｈには、ク
ローンのプールを含むプローブによるハイブリダイゼー
ションの例が示されており、同例においては各クローン
は個々に選択され、その結果シングルコピー配列または
極低度コピー反復配列にハイブリダイズする。残りの図
面には高度コピー反復配列にハイブリダイズした断片を
含むプローブの使用例が示されているが、かかる高度コ
ピー反復配列は無能力化されたそのような配列のハイブ
リダイゼーション能力を持っている。
【０１０１】本発明に係る核酸プローブは、ゲノムの標
的部分にとって十分に特異的である必要はない。同プロ
ーブは「染色コントラスト」を形成しようと意図する。
「コントラスト」はゲノムの標的部分の染色強度の、他
の部分の染色強度に対する比によって決定される。例え
ば、後記の［表１］に示すごとき特定の染色体をクロー
ニングすることにより形成されるDNAライブラリーは、
全染色体を染色し得るプローブとして使用できる。ライ
ブラリーはその染色体上でのみ発見される配列と、他の
染色体と共有する配列を含む。ヒトゲノムの単純化され
たモデル（生命にとってほぼ真実）においては、約半分
の染色体DNAは各クラスに分かれる。全ライブラリーに
よるハイブリダイゼーションが結合座位の全てを飽和す
ることができるならば、標的染色体は他の染色体の明度
の２倍である（コントラスト比２）。何故ならば、標的
染色体はプローブにおける特異的配列および共有配列か
らのシグナルを含み、これに対して他の染色体は共有配
列からのシグナルを有するにすぎないためである。従っ
て、プローブにおける共有配列のハイブリダイゼーショ
ンを適度に減少させることのみが、実質的にコントラス
トを高める。非標的配列にのみハイブリダイズする汚染
した配列例えばライブラリー中の不純物は、同配列が染
色コントラストを有効レベル以下には低下させない限度
において、プローブ中に許容できる。
【０１０２】実際には、標的座位の全てがハイブリダイ
ゼーションにより飽和されることはなく、多くの他のメ
カニズムが染色コントラストを形成することに関与す
る。しかしながら、このモデルはゲノムの大きな部分を
標的としたプローブの使用におけるある一般的な考察を
示している。
【０１０３】要求されるコントラストは、プローブが設
計される適用に依存する。染色体および核等を顕微鏡的
に可視化する場合、全染色体を同定するためにはコント
ラスト比が２またはそれ以上でたりる。図４Ｄ〜図４Ｆ
においては、コントラスト比は3-5である。標的領域の
個々のセグメントが小さいほど、非標的領域の染色にお
ける変動に関係する標的の確実な認識を可能にするため
に、大きなコントラストが必要となる。フロー サイト
メトリーまたは定量顕微鏡法を使用する蛍光強度測定に
より、細胞核中に存在する標的領域の量を定める場合、
要求されるコントラスト比はゲノムにとって平均1/Tま
たはそれ以上のオーダである。ここで、Tは標的領域に
含まれるゲノムのフラクションである。コントラスト比
が1/Tに等しい場合、全蛍光強度の半分は標的領域から
もたされ、他の半分はゲノムの残りからもたらされる。
例えば、約10％のゲノムからなる第1染色体のために高
度コンプレキシティプローブを使用する場合、要求され
るコントラスト比は10のオーダであり、それは第1染色
体にとつてゲノムの残りのコントラスト強度に等しい。
【０１０４】プローブによりゲノムの非標的領域に染色
する背景はー様ではない。図４Ｆは、第21染色体特異的
プローブが、他の末端動原体型ヒト染色体の動原体に隣
接するコンパクト領域に弱くハイブリダイズする、プロ
ーブ断片を含んでいることを示している。この程度の非
特異性は、例示された適用における上記プローブの使用
を妨げない。他の適用のためには、これらの配列に結合
するプローブ断片の除去、またはさらには同断片のハイ
ブリダイゼーション能力の無能力化が必要である。
【０１０５】他の適用にとっては、動原体に結合する反
復配列、例えばアルフアサテライト配列および／または
テロメアは染色体−特異的染色試薬の役目をすることが
できる。その中で、標的物質は幾らかのまたは多くの動
原体および／またはテロメアをゲノム中に、多分他の染
色体領域とともに包含している。かかる適用の典型は次
のようなものである。かかる適用において、染色試薬は
染色体異常誘発物に起因するランダムな構造的異常を検
出するために設計され、かかる誘発物は転座のごとき二
動原体および他の構造的異常性をもたらす。ゲノムにお
ける全動原体、例えば図４Ｄの染色パターンの形成のた
めに使用されるプローブに結合する配列の添加は、二動
原体と転座物質とをより確実に識別することを可能とす
る。
【０１０６】本発明に係る染色試薬のゲノムに対する適
用は、ゲノムの標的領域にハイブリダイズしたプローブ
の実質的に均一な分散をもたらす。結合プローブは、ゲ
ノムの標的領域が有効なコントラストに可視化できるな
らば、「実質的に均一」であるものとみなされる。例え
ば、もし遺伝子座の多くが細胞の多くの中で可視的であ
るならば、標的物質が可視的に分離された遺伝子座の系
統である場合、同標的物質は実質的に均一に染色体され
る。
【０１０７】染色体DNAに相補的である核酸断片の塩基
配列に関する「実質的部分」(substantial propotions)
とは、使用されるハイブリダイゼーション条件のもとで
核酸断片が染色体DNAと安定なハイブリッドを形成する
ほど相補性が十分に広い範囲であることを意味する。特
に、かかる文言は、不均一混合物の核酸断片が標的染色
体物質に完全には相補的ではない配列のある領域を有し
ている状況を包んでいる。厳格性(stringency)は、ハイ
ブリダイゼーションのために要求された相補性の精度を
制御することにより調整することができる。
【０１０８】本明細書において「中期染色体」(metapha
se chromosomes)なる文言は、有糸分裂の中期ステージ
で凝縮した染色体のみならず他の凝縮した染色体、例え
ば未成熟(premature)染色体凝縮により凝縮された染色
体をも意味するものと定義される。
【０１０９】核酸配列のハイブリダイゼーション能力を
無能力化することは、本明細書においてはときどき、
「核酸配列を無能力化すること」と略して書かれる。
【０１１０】本発明に係る方法および試薬は診断的細胞
遺伝学の分野、特に診断的間期細胞遺伝学の分野におい
て特に適した適用を見いだす。癌のごとき疾病に関連す
る遺伝子再配列を検出することは、本発明に係る染色体
特異的試薬および染色方法の特有の適用である。
【０１１１】隣接する遺伝子症候群は、本発明に係るプ
ローブおよび方法が同定できる遺伝子再配列の例であ
る。隣接する遺伝子症候群は多数のおよび／または減少
したコピー数の状態にある、密の間隔に保持された遺伝
子の幾多の存在により特徴付けられる。ダウン症候群は
隣接する遺伝子症候群の例であり、同症候群には幾多の
遺伝子を含む染色体領域の余分のコピーが存在する。
【０１１２】特に本明細書での記載内容は、CMLに関連す
るBCR-ABL融合物を形成する遺伝子再配列を検出するた
めの染色体特異的試薬および方法の適用である。かかる
試薬は疾病特異的、この場合は腫瘍特異的プローブの典
型であり、同プローブは直接的および／または間接的に
標識でき、これにより標的染色体物質に結合したとき可
視化される。同標的染色体物質はCMLの場合、CMLに関連
することで知られている染色体領域9q34と22q11の転座
切断点領域の隣接部位である。本明細書のセクションVI
IIに提供された例においては、プローブは標識されて、
二重色の蛍光がインシトゥ ハイブリダイゼーションに
おける前記プローブの染色パターンに形成される［蛍光
インシトゥ ハイブリダイゼーション(FISH)］。しかし
ながら、染色パターンは他のタイプのシグナルと同様に
多くの色で形成でき、その標的物質に結合したプローブ
を合図する可視化手段は本発明の方法に使用できる。
【０１１３】本明細書におけるセクションVIIIは、遺伝
子再配列を検出する本発明に係る典型的な方法および試
薬を記述している。セクションVIIIの例は、CMLの特性
を示すBCR-ABL融合体を形成する遺伝子再配列に関す
る。かかる例への手引は第9および第22染色体からのプ
ローブを伴うFISHを基礎とするもので、同染色体はCML
（図８）の全てのケースに必須である融合したBCRとABL
の側面に位置する。プローブは正常および異常の両細胞
の染色体物質にハイブリダイズした場合、図８−図１２
に示すごとく異なる染色パターンを形成する。かかる典
型的なプローブにて形成された染色パターンは、正常お
よび異常細胞で異なる。染色パターンの提供(staining
pattern present)は、遺伝子再配列が生じると、遺伝子
再配列を含まない染色体物質にプローブをハイブリダイ
ズすることにより示された染色パターンの提供とは明確
に変えられる。さらに、染色パターンは遺伝子再配列の
ーのタイプを他のタイプに対して明確に異ならせる。例
えば、本発明に係る核酸プローブのALLに接近した遺伝
子再配列を含む染色体物質へのハイブリダイゼーション
により形成された染色パターンは、同プローブのCMLの
特性を示すBCR-ABLを含む染色体物質へのハイブリダイ
ゼーションにより形成された染色パターンとは明確に異
なる。従って、本発明に係る方法および試薬は類似の疾
患の差別診断を提供する。
【０１１４】セクションVIIIの実施例は、染色パターン
における蛍光シグナルのプロキシミティに基づくCMLの
診断のために提供するもので、融合物の存在を決定する
ために１ミクロンの切断点(cutoff point)をたよりとす
る。シグナルのプロキシミティ距離は、遺伝子再配列の
存在を検出するために使用できるシグナルの、多くの特
性のうちの一特性にすぎない。さらに、プロキシミティ
距離は、採用される特定の細胞調製技術および核のサイ
ズに依存し、特定の細胞調製にとっては正常および異常
細胞におけるシグナル間の距離に比較的依存する。
【０１１５】セクションVIIIの実施例で例示された染色
パターンは、プローブ方法の典型的なータイプである。
多くの他のプローブ方法が採用できる。図１１Ａ〜図１
１Ｆは遺伝子再配列を検出するためのいくつかの他の典
型的なプローブ方法を示しており、それらのパターンは
特定の遺伝子再配列を検出するために変更でき、最適化
でき、かつ他の状態に変形できる。
【０１１６】本発明に係る他の疾病特異的試薬は、CML
としてセクションVIIIで詳述した方法に類似する。例え
ば、急性リンパ性白血病（ALL）の診断と研究は、セク
ションVIIIのBCRプローブ（PEM12）をBC遺伝子の５'末
端からのプローブと置き換えることにより遂行される。
ALLは、Rh'染色体がその診断において最も一般の細胞遺
伝的異常性である故特に興味があり、かかる染色体の存
在が非常に攻撃的新生物(aggressive neoplasm)の存在
を表示する。
【０１１７】本明細書、特にセクションVIIIにて例示さ
れた方法および試薬は、細胞遺伝学的には類似するが遺
伝学的には異なる疾病を識別する手段として提供され
る。特定の状況における"細胞遺伝的"とは、慣用のバン
ド分析により確定された類似性に関係する。CMLおよびA
LLはこのような状況のもとでは、それぞれを関連させる
切断点がヒト遺伝子においては互いに密接している故
に、慣用的バンド分析ではそれらを識別できず、細胞遺
伝学的に類似する。
【０１１８】さらに、本発明は遺伝子疾患の分子ベース
の研究のための細胞遺伝学的探査形式に使用できる方法
および試薬を提供する。例えば、人のカリオタイプにお
ける異常が慣用のバンド分析により示された場合、本発
明に係るプローブおよび試薬が同異常の隣接部分におけ
る遺伝子再配列を検出するために使用できる。異常の根
底をなす分子ベースは本発明に係る方法および試薬によ
り確定でき、遺伝子レベルでもたらされる差異は異なる
処置を示唆し、かつ予知的に重要である。根底をなす遺
伝子再配列は、人における表現型特性のセットに関連し
て矛盾なく発見される。
【０１１９】次のセクションは本発明に係る染色組成物
を調製するとともに使用する実施例を提供するが、それ
は単に例示の目的のためであって本発明を限定する意味
ではない。次の略語が使用される。
【０１２０】 略語 BN − NP-40を伴うビカーボネート緩衝液 DAPI − 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール DCS − フルオロセイン-アビディンDCS（フルオロセインAvidan D の 商業的に入手できるセルソータグレイド） AAF − N-アセトキシ-N-2-アセチル-アミノフルオレン EDTA − エチレンジアミンテトラアセテート FACS − フルオロセイン-アクチベイティド セル ソーティング FITC − フルオロセイン イソチオシアネート IB − 分離緩衝液 NP-40 − Sigma as Nonidet P-40（St.Louis, MO）から商業的に入手できる 非イオン界面活性剤 PBS − フォスフェード-ブァファード サリン PI − プロピジウム アイオダイド PMSF − フエニルメチルスルフォニル フルオライド PN緩 − 0.1M NaH2PO4と0.1MNa2HPO4の混合物 衝液 pH8；0.1%NP-40 PNM緩 − 非脂肪ドライミルク（遠心分離）を伴 衝液 うPn緩衝液；0.02%Naアジド SDS − ソジウム ドデシル サルフェート SSC − 0.15M NaCl/0.015M Naサイトレート，pH7 VNTR − 可変数タンデム反復(variable number tandem repeat)。
【０１２１】
【実施例】I. 染色体-特異的染色試薬を調製する方法 I.A 染色体-特異的DNAの分離とDNA断片ライブラリーの
形成 本発明に係る組成物を調製する好ましい第１ステップ
は、染色体-特異的DNAを分離することである。（この文
言は上記したごとく標的-特異的および／または領域-特
異的DNAを包含するもので、その特異性はDNAの起源に起
因する）。同ステップは第１に、染色組成物が導かれる
十分な量の特定の染色体タイプまたは染色体サブリジョ
ンを分離すること、その後分離された染色体または染色
体サブリジョンからDNAを抽出すること含む。ここで"十
分な量"とは本方法のその後のステップを遂行するに十
分な量のことを意味する。好ましくは、抽出されたDNA
は標準的な遺伝子工学技術を用いてクローニングするこ
とによりDNAインサートを形成するために使用される。
【０１２２】好ましいクローニングベクターは、限定は
されないけれども酵母人工染色体(YACS)、プラスミド、
バクテリオファージおよびコスミドを含む。好ましいプ
ラスミドはブルースクライブ プラスミドである。好ま
しいバクテリオ ファージはラムダ インサーション ベ
クターであり、より好ましくはカロン4A(Charon 4A)、
カロン21A(Charon 21A)、カロン35(Charon 35)、カロン
40(Charon 40)およびGEM11である。好ましいコスミドは
ロウリスト4(Lawrist4)、ロウリスト5(Lawrist5)および
sCos1を含む。
【０１２３】上記したごとく、DNAはいくつかの源から
分離できる。染色体-特異的染色試薬は本発明により植
物および動物両者のDNAから調製できる。動物DNAの重要
な源は哺乳動物特に霊長類またはゲッシ動物であり、そ
の中では霊長類の源は特にヒトおよびモンキーであり、
ゲッシ動物の源は特にラットまたはマウスであり、特に
マウスである。
【０１２４】１．全染色体（entire chromosome)からDN
A を分離すること 特定の全染色体(whole chromosome)（特異的染色体タイ
プ）を分離するための好ましい手段は、インタースペシ
フック ハイブリッドセル システムを使用するか否かに
かかわらず、中期染色体のダイレクト フロー ソーティ
ング（フルオロセンス-アクティベイティド セル ソー
ティング）による手段である。ある種にとって、全ての
染色体は慣用の有効なソーティング技術により分離でき
る。全てではないが、多くのヒト染色体は一般にフロー
ソーティングによりヒト細胞から分離できる。［Carra
no et al.,「Measurement and Purification of Human
Chromosomes by Flow Cytometry and Sorting」,Proc.N
atl Acad Sci.,Vol.76,pp.1382-1384(1979)］。従っ
て、ヒト染色体の分離にはヒト／ゲッシ動物 ハイブリ
ッド セル システムが必要である。［Kao,「Somatic Ce
ll Genetics and GeneMapping」,International Review
of Cytology.,Vol.85,pp.109-146(1983)、Gusella et
al.,「Isolation and Localization of DNA Segments f
rom SpecificHuman Chromosomes」,Proc. Natl.Acad. S
ci.,Vol.77,pp.2829-2833(1980)］を参照。染色体ソー
ティングは商業的に入手できるフルオルセン-アクティ
ベイティド ソーティングマシン、例えばベクトン ディ
キンソン FACS-II(Becton Dickinson FACS-II)、カウル
ター エピシス V ソータ(Coulter Epics V sorter)、ま
たは染色体ソーティングに活用できる特殊目的のソータ
ーまたはこれに類似する機器により行われる。
【０１２５】DNAは分離された染色体から、例えばマー
ムル等の標準技術により抽出される。［Marmur,「A Pro
cedure for the Isolation of Deoxyribonucleic Acid
fromMicro-Organisms」, J.Mol.Biol.,Vol.3,pp.208-21
8(1961);Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Labor
atory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory,1982)p
p.280-281］。これらの引用文献はDNA分離技術の叙述の
ために参考文献として取り入れられる。
【０１２６】分離された染色体-特異的DNAからのインサ
ート ライブラリーの世代は、例えば下記に文献に示す
標準的遺伝子工学技術を使用することにより遂行され
る。［Davies et al.,「Cloning of a representative
Genomic Library of the HumanX Chromosome After by
flow Cytometry」,Nature,Vol.293,pp.374-376(1981);K
rumlauf et al.,「Construction and Characterization
of Genomic librariesfrom Specific Human Chromosom
es」,Proc. Natl Acad.Sci.,Vol.79,pp.2971-2975(198
2);Lawn et al.,「The Isolation and Characterizatio
n of Linked Delta-and-Beta-Globin Genes from a Clo
ned Libraly of Human DNA.」,Cell,Vol.15,pp.1157-11
74(1974); and Maniatis et al.,「Molecular Cloning:
A Laboratriy Manual」,(Cold Sring Harbor Laborator
y ,1982),pp.256-308;Van Dilla et al.,id;Fuscoe,Gen
e,52:291(1987);and Fuscoe et al.,Cytogenet.Cell Ge
net.,43:79(1986)。これらの文献は参考文献として本明
細書に取り入れられる。
【０１２７】ヒト染色体のそれぞれのための組換えDNA
ライブラリーは、ナショナル ラボラトリー ジーン ライ
ブラリー プロジェクト(National Laboratory Gene Lib
raryProject )によって考案され、アメリカン タイプ
カルチャー コレクション(American Type Culture Coll
ection)から入手できる。［Van Dilla et al., Biotecn
ology,4:537(1986).］。小インサート-含有ライブラリ
ー(small insert-containig libraries)は、Hind IIIま
たはEcoRIを伴うフローソートされたヒト染色体ゲノムD
NAの完全なダイジェションにより構成され、ラムダ イ
ンサーション ベクター カロン21Aにてクローニングさ
れる。ベクターは9.1kbのサイズまでのヒトインサート
を受入れることができる。従って、9.1kb より大きいHi
nd III（またはEcoRI)制限断片は、これらのライブラリ
ーから取り戻すことができない。これらのラボラトリー
における観測された平均挿入サイズは約4kbである。Hin
d III染色体-特異的ライブラリーとそれらのATCC 登録
番号を伴う代表的リストが［表１］に示される。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】選別された染色体タイプから抽出されたDN
Aは、ベクター中で同DNAをクローニングするよりはむし
ろポリメラーゼ鎖反応（PCR）によるか、または同DNAを
細胞系で増殖することにより増幅できる。PCRの調整に
おいては、抽出されたDNAに適当なファージの尾部が添
加される。かかるPCRの手法に関連した事項が後述のセ
クションI.B.で述べられている。
【０１３０】ハイブリッドセルから所望の配列を分離す
る他の実行できる方法は、シュメックペーパ(Schmeckpe
per)等の下記の方法を含む。［Schmecpeper et al.,「P
artial Purification and Charcterizationof DNA from
Human X Chromosome」, Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.76,
pp.6525-6528(1979);Olsen et al.,supra(in Backgroun
d )。それ故、これらの文献は参考文献として取入れら
ている。
【０１３１】２．染色体の一部からDNAを分離すること 領域-特異的染色体DNAを分離するのに使用できる方法に
は、下記の方法が含まれる。前もってマップ化されたDN
A、例えばマップ化されたコスミドのライブラリーから
の適宜の染色体領域の選択：例えばFACSによる誘導染色
体のソーティング：選択された染色体の微視的解体：減
ハイブリダイゼーション：所望の染色体断片を含み、DN
Aを抽出するとともに増幅し、かつ所望の増幅されたDNA
を選択する適宜のハイブリッドセルの同定：放射線ハイ
ブリッドからの適宜の染色体物質の選択。サブセクショ
ンI.A.１で概略的に記載した標準的遺伝子工学技術は、
本技術分野の周知の手法で使用される。領域-特異的DNA
の増幅は、適宜のベクターでクローニングすることによ
り、適宜の細胞系で増殖することより、および／または
PCRの使用により遂行できる（後述のI.B.を参照）。
【０１３２】染色体領域-特異的DNAを分離する好ましい
方法は、長いDNA配列のライブラリーをプローブするマ
ップ化された短いDNA配列を使用することであり、長いD
NA配列のライブラリーは通常異なるベクターでクローン
化される。例えば、プラスミドでクローン化されたプロ
ーブは、コスミドまたは酵母人工染色体（YAC)ライブラ
リーをプローブするために使用できる。イニシヤル シ
ード プローブ(initialseed probe)を使用することによ
り、より長いインサートライブラリーにおける重複クロ
ーンを見いだすことができ（「ウオーキング」(walkin
g)とよばれる方法）、より高度なコンプレキシティ プ
ローブはシードプローブを取り巻く染色体領域の確実な
染色を形成できる。結局、種のための全ゲノムがマップ
化されると（例えばヒト種のためにヒューマン ゲノム
プロジェクトにより）、種の全ゲノムのために配列され
たクローンが有効である。その後、所望の特異性プロー
ブを形成するために、適宜クローンを容易に選択でき
る。
【０１３３】染色体の１または複数の領域（または全染
色体）からDNAを分離する他の方法は、適宜の細胞系
（例えば、ヒト／ハムスタ ハイブリッド セルのごとき
ハイブリッド細胞系）において、かかる染色体の１また
は複数の領域を増殖し、細胞系からDNAを抽出し、それ
を適宜のベクターでクローン化し、かつライブラリーを
形成するためにヒトDNAを含むクローンを選択すること
である。ハイブリッドセルが使用される場合、ヒト染色
体物質を含むハイブリッド中の染色体はクローニングす
る以前に、ライブラリー中でヒトクローンの頻度を増大
するためにフローソーティング（FACS）により分離され
る。なおさらに、図６に例示するごとく、ハイブリツド
からの全てのDNAは分離でき、さらにクローニングする
ことなく標識化でき、かつプローブとして使用できる。
【０１３４】３．一重鎖プローブ あるケースにおいては、不均一混合物の核酸断片はー重
鎖RNAまたはDNAからなることが好ましい。ある条件のも
とでは、一重鎖核酸プローブの結合効率(binding effic
iency)は例えばコックス等の下記の文献にしめされてい
るように、インシトゥ ハイブリダイゼーションの間に
より高くなることが発見された。［Cox etal.,「Detect
ion of mRNAs in Sea Urchin Embryos by In Situ Hybr
idizationUsing Asymmetric RNA Probes」, Developmen
tal Biolgy, Vol.101,pp.485-502(1984)］。
【０１３５】分離されたDNA断片からRNA断片を生み出す
ためには、標準的な方法が使用される。例えば文献［Ce
ll,Vol.32,pp.681-694(1983)］にて記述されているグリ
ーン等により発展された方法は、プロメガ バイオテッ
ク(Promega Biotec)［Madison,WI］から商品名「リボプ
ローブ」(Riboprobe)として商業的に入手できる。本発
明とともに使用する好ましい他の転写キットは、商品
名"ジェネスクライブ"(Genescribe)としてユナイティッ
ド ステイト バイオケミカル コーポレイション（クレ
ベランド，OH）(United States Biochemical Corporati
on)から入手できる。ー重鎖DNAプローブは一重鎖バクテ
リ オファージM13にて形成することができ、例えばベセ
スダ リサーチ ラボラトリー（ガイサーバーグ，MD）(B
ethesda Research Laboratories)(Gaitherburg,MD)等の
キットホームの状態で入手できる。図４に示すハイブリ
ダイゼーションは、ブルースクライブ プラスミド ベク
ター（ストラタジェン，ラ ジョラ，シーエー）(Strata
gene, La Jolla,CA )中でサブクローンされた［表１］
のライブラリーで遂行された。ブルースクライブ プラ
スミドはRNAプロモータを含み、同RNAは一重鎖プローブ
の形成を可能とする。
【０１３６】後述のセクションIX、は非自己相補的一重
鎖核酸プローブを調製し、かつ適用する方法を提供す
る。同プローブはプローブの非特異的および不適当な結
合を減すことにより、インシトゥ ハイブリダイゼーシ
ョンで達成し得るシグナル／ノイズ比を改良する。さら
に、かかるセクションは二重鎖標的核酸を変性する方法
を提供する。同二重鎖標的核酸はハイブリダイゼーショ
ンに有効なー重鎖領域を最小にし、プローブ配列に非相
補的である。簡単にいえば、プローブはDNAを、DNAポリ
メラーゼのための鋳型／プライマーを形成する制限酵素
とエキソヌクレアーゼとで処理することにより構成され
る。ダイジエストされた鎖は標識されたヌクレオシド
トリホスフェート前駆体の存在のもとでで再合成され、
標識された一重鎖断片はプローブを形成するために再合
成された断片から分離される。標的核酸は、プローブを
構成するために使用したものと同様の制限酵素で処理さ
れ、かつプローブの適用以前にエキソヌクレアーゼで処
理される。
【０１３７】I.B. PCR 本発明に係るプローブを形成する他の方法は、ポリメラ
ーゼ鎖反応［PCR］の使用を含む。［PCRのメカニックの
説明として、Saiki et al.,Sciense,230:1350(1985)、U
SP Nos.4,683,195、4,683,202(1987,7,24)、4,800,159
(1989,1,24)］。上記したごとく、分離された標的-特異
的核酸配列はPCRによって増幅でき、反復配列の少ない
または皆無である標的-特異的配列を形成する。かかる
手法に使用されたPCRプライマーは、反復配列の末端の
ためのものであり、反復物によりフランクされた配列の
増幅をもたらす。
【０１３８】図７はPCRを使用するかかる方法を示して
おり、かかる方法において典型的な反復配列はAluであ
る。ショート セグメントのみが増幅される場合には、
そのような配列は他の反復物を含まないものと思われ
、従って反復配列の減少されたDNAを提供する。
【０１３９】それはさらに、相補的配列の前記反復配列
に対する最初のハイブリダイジングにより、かかるPCR
手法における反復配列の形成を抑制でき、かかる手法に
おいて前記相補的配列は非相補的フランキング エンド
(flanking end)を拡張するか、またはポリメラーゼによ
って拡張を許さないヌクレオチドにターミネートされ
る。ブロッキング配列の非相補的末端は、PCRプロセス
の間ブロッキング配列をPCRプライマーとして機能する
ことから抑制する。
【０１４０】II. 反復配列の除去および／または反復配
列のハイブリダイゼーション能力の無能力化すること 本発明に係るプローブは典型的には、以下の幾多のステ
ップにより形成される。ゲノムの標的領域に相補的であ
る核酸配列源を得るステップ。同配列が標的物質に能率
的にハイブリダイズしかつそれらが結合した後検出し得
るように、同配列を標識しまたはその他の処理を行うス
テップ。ハイブリダイゼーション能力を無能力化しまた
は共有反復配列の十分な量を除去し、またはかかる配列
を無能力化しかつ除去すべく同配列を処理するステッ
プ。これらのステップの順序は、採用される特定の方法
に依存する。
【０１４１】共有反復配列の除去、および／またはかか
る反復配列のハイブリダイゼーション能力の無能力化を
おこなうには、次の方法が使用できる。これらの方法は
典型的なものであって、当業者の周知の手法で模式的に
説明されており、かつこれらの方法は当業者の周知のパ
ラメータおよび手法に応じて変更および拡張できる。
【０１４２】１．シングル-コピー プローブ シングル-コピー プローブは、ゲノムの標的領域に含ま
れるシングルコピー配列に相補的である核酸断片からな
りたっている。かかるプローブを構成するー方法は、標
的領域をクローニングにより形成されたDNAライブラリ
ーで始めることである。ライブラリーにおけるクローン
の中には、全配列がシングル-コピーであるDNAを含むで
あろうし、他のものは反復配列を含むであろうし、また
さらに他のものはシングル-コピー配列および反復配列
の部分を持つであろう。個々のクローンによる選択、お
よびシングル-コピー配列のみを含んでいるこれらのク
ローンのプーリングは、標的領域に特異的にハイブリダ
イズするプローブをもたらす。クローンのシングル-コ
ピーの性質は最終的には、標準技術を使用するサザン
ハイブリダイゼーションにより確認される。図４Ｈは、
第4染色体ライブラリーからこの方法で選択された120ク
ローンによるハイブリダイゼーションを示す。
【０１４３】サザン法分析は非常に時間を消費し、かつ
緊張する労働である。それ故、完全ではないにしても、
候補的(candidate)シングル-コピー クローンを得るた
めのより効率的なスクリーニング方法が有用である。セ
クションV.B.においては、改良された方法の実施例は反
復DNAの存在のために、個体ファージおよびプラスミド
クローンをスクリーニングするために提供され、それは
ゲノムDNAによるハイブリダイゼーションを使用するも
のである。プラスミド クローンのスクリーニングはよ
り効率的であり、選択されたクローンの約80％がシング
ル-コピー配列のみを含んでいる。残りは低度コピー反
復物である。しかしながら、かかる方法で調製されたプ
ローブは十分な染色コントラストを形成でき、低度コピ
ー反復配列がプローブ中に許容できることを示している
（当セクションのサブセクション３を参照）。
【０１４４】クローン手法によるクローンの不利益は、
クローンが含んでいる配列の一部がたとえ反復配列であ
るとはいえ、同クローンが捨てられるということであ
る。クローン化された核酸の長さが長いほど、同核酸が
反復配列を含む機会は多くなる。それ故、核酸が大きな
インサート例えばコスミド、YAC等を含むベクター中
で、またはハイブリッド セルのごとき細胞系で増殖さ
れる場合には、シングル-コピー選択が行われる以前に
同核酸を小さな断片にサブクローンすることが有利であ
る。上記した選択手法は共有反復配列と特異的反復配列
とを区別するものではない。いずれか一方のタイプの検
出可能な反復配列を伴うクローンは、プローブには使用
されない。
【０１４５】２．ハイブリダイゼーション特性の個体試
験 核酸のピース、例えばクローンのハイブリダイゼーショ
ン特異性は、インシトゥ ハイブリダイゼーションによ
り試験できる。適宜のハイブリダイゼーション条件のも
とで、上記ピースが所望の標的領域としての特異的なシ
ングル-コピーまたは反復配列に結合するならば、同ピ
ースはプローブに包含できる。染色体-特異的反復配列
［Trask et al.,supra,(1988) and references therei
n］，VNTRs,多数のマップ化されたシングルコピー配列
等のごとく、特異的ハイブリダイゼーション特性を持っ
ている多くの配列がすでに知られている。もっと多くの
ものが連続的にマップ化されている。かかる配列は本発
明のプローブに包含できる。
【０１４６】３. 集団固定法(Bulk Procedures) ヒトゲノムのごとく多くのゲノムにおいて、共有反復DN
Aの主要部分はAluのごとき高度に反復された配列の若干
のファミリーに含まれている。このような高度コピー反
復配列を実質的に含んでいないプローブは、多くの適用
において有効な染色コントラストを形成するであろう。
かかるプローブは核酸配列のある源、例えば第１表のラ
イブラリーから比較的簡単な集団固定法で形成できる。
それ故、かかる集団固定法はかかる適用にとって好まし
い方法である。
【０１４７】これらの方法は先づ第１に、相補的核酸鎖
の濃度が増加するほど同鎖のハイブリダイゼーション率
が増加するという事実を促進する。従って、核酸断片の
不均一混合物がハイブリダイゼーションを許容する条件
のもとで変性されかつインキュベイトされる場合には、
高濃度で存在する配列は他の場合に比較してより早く二
重鎖になるであろう。二重鎖核酸はその後除去され、残
りのものがプローブとして使用できる。部分的にハイブ
リダイズした混合物はプローブとして使用できるが、二
重鎖配列は標的物質に結合し得ない。次の方法は本発明
に係る標的-特異的染色を形成するのに有効な集団固定
法の典型的な方法である。
【０１４８】３a.プローブの自己再結合 ハイブリダイゼーション混合物における二重鎖プローブ
核酸は変性され、その後ハイブリダイゼーション条件の
もとで高度コピー配列のための十分な時間プローブ中で
インキュベイトされて、実質的に二重鎖配列となる。ハ
イブリダイゼーション混合物はその後サンプルに適用さ
れる。高度に反復された配列の残留している標識された
ー重鎖コピーは、サンプルのいたるところに結合し、弱
くかつ幅広く分散されたシグナルを形成する。ゲノムの
標的領域のための特異的な低度コピー配列の多様な結合
は、容易に識別し得る特異的シグナルを形成する。
【０１４９】かかる方法は、染色体のプローブとして第
4染色体および第21染色体（pBS4とpBS21）のための、染
色体-特異的ライブラリーを用いた後述のセクションVI.
Bに例示されている。［Pinkel et al.,PNAs（USA）85:9
138-9142（December 1988）］。1-10ng/μlの範囲のプ
ローブ濃度を含んでいるハイブリダイゼーション混合物
はサンプルに適用される以前に、プローブを変性するた
めに加熱されかつ37℃で24時間インキュベイトされた。
【０１５０】３b.ブロッキング核酸の使用 ハイブリダイゼーション混合物には、ハイブリダイゼー
ション能力を抑制することが望まれる配列と相補的であ
る標識されない核酸配列が添加される。必要によりプロ
ーブおよびブロッキング核酸は変性され、また適宜のハ
イブリダイゼーション条件もとでインキュベイトされ
る。ブロックされるべき配列は他のものより早く二重鎖
配列になるため、ハイブリダイゼーション混合物が標的
物質に適用される場合には同標的物質に結合することは
できない。あるケースにおいては、ブロッキング反応は
インキュベイト期間が極めて短縮できるほど早く生じ、
ハイブリダイゼーション混合物が変性後直ちに標的物質
に適用される場合には十分な結果が得られる。ブロッキ
ング方法は一般にシーリイ等により下記の文献に記述さ
れ、かかる文献は参考文献として取り入れられる。［Se
aly et al ,「Removalof Repeat Sequence form Hybrid
ization probes」, Nucleic Acid Research,13:1905(19
85)］。ブロッキング核酸の実施例はゲノムDNA、ゲノム
DNAの高度コピーフラクションおよび下記(i-iii)に概略
的に示したごとく特定の配列を含んでいる。
【０１５１】３b.i.ゲノムDNA ゲノムDNAは生物の核酸配列の全てを、それらのゲノム
におけるコピー数に比例して含む。従って、ゲノムDNA
をハイブリダイゼーション混合物に添加することは、高
度コピー反復配列の濃度を低度配列より増加し、それ故
前者をブロッキングするのにより効果的である。しかし
ながら、ゲノムDNAは標的物質に対して特異的である配
列のコピーを含み、同ゲノムDNAがあまりにも多く添加
される場合には所望の染色体-特異的結合を減少するで
あろう。添加すべきゲノムDNA量を決定するガイドライ
ン（後述の３.e.項のＱの概念を参照）、およびゲノム
ブロッキングDNAを使用する実施例は下記に提供され
る。ゲノムDNAのブロッキング効果性はある条件のもと
では、そのハイブリダイゼーション混合物への添加タイ
ミングの調整により高めることができる。かかるタイミ
ング調整の実施例は、後述の図４Ｂ〜図４Ｅ（プロトコ
ルI）および図４Ｆ（プロトコルII）に示されたプロト
コルIおよびプロトコルII ハイブリダイゼーションで提
供され、またセクションVIに詳述されている。
【０１５２】３b.ii.ゲノムDNAの高度コピー フラクシ
ョン ゲノムDNAの使用での難しさは、同ゲノムDNAもまた低度
コピー配列のハイブリダイゼーションをブロックするこ
とであり、かかるブロックは所望の標的染色を与える配
列に対して支配的である。従って、単に高度コピー配列
のみを得るためにゲノムDNAを分別すること、およびこ
れらをブロッキングに使用することはこの困難性を克服
する。かかる分別は例えば、後述（３c.i.)するごとく
ハイドロオキシアパタイトで行うことができる。
【０１５３】３b.iii.特異的配列 プローブにおける特定の配列のブロッキングは、同配列
の標識されないコピーを多く添加することにより成し遂
げられる。例えば、プローブにおけるAlu配列は、クロ
ーン化されたAluを添加することによりブロックでき
る。ヒトゲノムにおける最高度コピー配列を含んでいる
わずかなクローンの混合物から調製されたブロッキング
DNAは、染色体-特異的ライブラリー例えば［表１］のラ
イブラリーとともに効果的に使用できる。１または複数
の染色体-特異的ライブラリーからの標識されない核酸
配列は、１または複数の他の染色体-特異的ライブラリ
ーからの標識された配列を含んでいるプローブをブロッ
クするのに使用できる。共有配列はブロックされ、標的
染色体上にのみ存在する配列は影響されない。図４Ｆ
は、ゲノムDNAがヒト第21染色体および他の末端動原体
型染色体の動原体型領域により共有された配列、または
配列類のハイブリダイゼーションを完全にブロッキング
するには効果的ではないことを示している。これらの配
列または配列類を含んでいるクローンまたはクローンズ
が最終的に分離されると、これから形成された標識され
ないDNAは染色の特異性を改良するためにゲノムブロッ
キングDNAに添加される。
【０１５４】３c. 配列の除去 ３c.i. ハイドロオキシアパタイト 一重鎖核酸および二重鎖核酸は、ハイドロオキシアパタ
イトに対して異なる結合特性を持っている。かかる特性
は核酸を分別するのに一般的に使用される基礎を提供す
る。ハイドロオキシアパタイトは商業的に入手できる
（eg. Bio-Rad Labratories,Richmond,CA）。最高度コ
ピー数からシングルコピー数までの反復の特定の度合の
配列を含んでいるゲノムDNAのフラクションは、ゲノムD
NAを変性し、それを適宜の条件のもとでCotの特定の値
に再結合することを許容することにより得られ、それに
続いてハイドロオキシアパタイトを使用する分離に付さ
れる。一重鎖核酸および二重鎖核酸もまた、S1ヌクレア
ーゼの使用により識別できる。かかる技術およびCotの
概念はブリテン等により以下の文献に説明されており、
かかる文献は参考文献として本明細書に取り入れられて
いる（Britten et al.,「Analysis of repeating DNA S
equences by Reassociation」,in Method in Enzymolol
gy,Vol.29,pp.363-418(1974）。
【０１５５】上記した３a.または３b.にて形成された一
重鎖核酸フラクションは、ハイドロオキシアパタイトに
より分離でき、かつプローブとして使用できる。従っ
て、ブロックされた配列（二重鎖となる）は物理的に除
去される。その後、プローブは必要とするまで保存され
る。その後、プローブは添加ブロッキング核酸なしに使
用でき、またはその染色コントラストは多分添加ブロッ
キング核酸により改良できる。
【０１５６】３c.ii. 固定された核酸による反応 特定の配列の除去は、一重鎖「吸収」(absorbing)核酸
配列をソリッドサポート(solid support)に付着するこ
とによっても遂行できる。一重鎖源核酸は固定された核
酸にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション
後、未結合配列は収集されプローブとして使用される。
例えば、ヒトゲノムDNAはヒトプローブから反復配列を
吸収するために使用できる。かかる方法の一つの方法が
ブリソン等により以下の文献に記述されており、かかる
文献は参考文献として取り入れられている。［Brisonet
al.,「General Method for Cloning Amplified DNA by
Differential Screening with Genomic Probes」,Mole
cular and Cellular Biology,Vol.2,pp.578-587(198
2)］。簡単に言えば、わずかに奪い取られたヒトゲノム
DNAは、ジアゾニウムセルロースまたはその類似のサポ
ートに結合される。断片に適宜にカットされた源DNAは
固定されたDNAに対してハイブリダイズされ、約1〜100
のCot値になる。ハイブリダイゼーション条件の好まし
いストリンジェンシイは、DNAのベース組成により変化
する。かかる手法は染色体-特異的ライブラリー、例え
ば［表１］のライブラリーから反復配列を除去し、全ヒ
ト染色体を染色し得るプローブを形成する。
【０１５７】３d. 標的ゲノムにおける非標的配列をブ
ロックすること 標的ゲノムにおける非標的結合座位を、標識されない相
補的反復配列によるハイブリダイゼーションを行うこと
によりブロックすることは、結合する潜在力を持つプロ
ーブにおける標識された配列の結合を阻止する。例え
ば、標識されないゲノムDNAによるハイブリダイゼーシ
ョンは、標的ゲノム二重鎖に高度コピー反復配列を与え
る。プローブにおけるかかる配列の標識されたコピー
は、プローブがその後に適用される場合結合することが
できない。
【０１５８】実際に染色コントラストを形成するために
は、多くのメカニズムが組み合わさっている。例えば、
ブロッキングDNAが上記3bに示したごとくプローブに添
加されると、同DNAは一重鎖配列として留まり、プロー
ブが標的物質に適用される場合には標的配列に結合で
き、かつ同標的配列をブロックできる。ブロッキングDN
Aをともなうプローブのインキュベイトが最小限である
場合には、その後ゲノムDNAは同時にプローブをブロッ
クし、かつプローブと標的物質における結合座位を競
う。
【０１５９】３e. Ｑの概念 上記３b.i.セクションで示したごとく、プローブにおけ
る高度コピー反復のハイブリダイゼーション能力を抑制
することと、標的-特異的配列の結合を抑制することに
よる所望のシグナル強度を減すこととの間の最適な妥協
を図るためには、正確な量のゲノムDNAを添加すること
が必要である。次のディスカッションは、ゲノムの標的
領域からのDNAをクローニングすることにより形成され
た、または同DNAの広がり(streches)をクローニングと
は異なる他の複製により形成されたプローブをともなう
ゲノム ブロッキングDNAの使用に関するものである。従
って、プローブはシングルコピー、染色体-特異的反復
配列、および標的において発見される共有反復配列の典
型的なサンプリングを含んでいる。かかるプローブは、
コンプレキシティがゲノムの小さな領域、例えばいくつ
かの接近されたコスミド クローンから誘導された100kb
から、例えば［表１］からの多数のライブラリーのコン
ビネーションである数億ベースまでの範囲のものであ
る。下記のディスカッションは例示的であり、異なる核
酸が使用される他の状況にまで拡大できる。下記のＱの
ディスカッションは、本発明を如何に進行すべきかに関
する一般的なガイドラインを与えることのみを意図した
ものである。
【０１６０】標識されたプローブ配列を含んでいるハイ
ブリダイゼーション混合物への標識されないゲノムDNA
の添加は、全配列の濃度を増大するが、共有配列がゲノ
ムの他の場所で見つかるのに対して標的-特異的配列が
見つからないことから、標的-特異的配列の濃度よりも
大きなファクターにて共有配列の濃度を増大する。従っ
て、共有配列の再結合が優先的に増大され、これにより
標的物質に対する共有配列の標識されたコピーのハイブ
リダイゼーションは優先的に抑制される。
【０１６１】この概念を定量化するために、［表１］の
第ｉ染色体ライブラリーからのプローブDNAのマスmp(ma
ss mp)と、標識されないゲノムDNAのmb とを含んでいる
ハイブリダイゼーション混合物中の第ｉ染色体に特異的
にハイブリダイズする配列、反復またはシングル-コピ
ーについて最初に考慮する。配列の標識されたコピーの
数はmpに比例する。ー方、標識されないコピーはfimbに
比例する。但し、fiは第ｉ染色体上に含まれたDNAのフ
ラクションである。従って、標的染色体にとっての配列
特異的な各々の標識されたコピーに対する標識されない
コピーの比率はfimb/mpであり、これは本発明において
Ｑとして規定される。正常のヒト染色体においては、0.
016≦fi≦0.08である。［Mendelsohn et al.,Science,1
79:1126(1973)］。典型的な実施例として、セクションV
I.B.ではf4=0.066とf21=0.016が示されている。L塩基対
からなる領域に標的されたプローブとってはfi=L/Gであ
る。但し、Gはゲノム中の塩基対の数である（ヒトおよ
びその他の哺乳動物においては約3×109）。従って、Ｑ
=(L/G)(mb/mp)である。
【０１６２】ゲノム全体にわたって多かれ少なかれ均一
に分散される共有配列、例えばAluについて考慮する。
標識されたコピーの数はmpに比例するのに対して、標識
されないコピーの数はmbに比例する。従って標識された
コピーに対する標識されないコピーの比率はmb/mp=Q/fi
である。これは、コピー数にかかわらず全て均一に分散
された配列にとって正しい。従って、添加するゲノムDN
Aはファクター(1+Q)により各特異的配列の濃度を増大
し、これに対して各均一分散された配列はより大きなフ
ァクター(1+Q/fi)により増大する。従って、共有配列の
再結合比率は、ゲノムDNAの添加により特異的配列の再
結合比率よりより大きなファクターにより増大される。
【０１６３】相対的再結合比率におけるゲノムDNAの有
益な効果のおおよそ半分は、Q=1で達成され、Q=5となる
と、さらに増大することにより得られるべき利益はもは
や本質的にはないが示される。従って、後述のセクショ
ンVI.B のプロトコルIハイブリダイゼーションはQ≦5を
保持する。
【０１６４】ゲノム ブロッキングDNAの使用を例示する
には、ゲノムのモデルを考慮するのが便利であって、同
モデルにおいてはDNAの50％が特異的配列（反復および
シングル−コピーの両者）であり、DNAの他の50％はゲ
ノム全体にわたって均一に分散している共有反復配列で
ある。従って、モデルによると、標的物質がL塩基であ
る場合（すなわち、プローブがゲノムの標的区域のL塩
基である断片を含む）、L/2塩基を含んでいる配列は標
的物質に対して特異的であり、かつL/2は全ゲノムと共
有される。
【０１６５】III. 不均一混合物の核酸断片を標識する
こと 不均一混合物のー重鎖および二重鎖核酸断片を標識する
にはいくつもの技術がある。これらの方法は放射線的標
識の結合を含んでいる。例えば、ハーパー等［Harper e
t al.,Chromosoma,Vol.83,pp.431-439(1984)］;フルオ
ロクロムまたは酵素の直接付着(direct attachment)、
例えばスミス等［Smith et al., NucleicAcids Reserc
h,Vol.13,pp.2399-2412(1986),およびコノリイ等［Conn
olly et al., Nicleic Acids Research, Vol.13,pp.448
5-4502(1985)］；免疫化学的または他のアフィニティ
リアクションにより核酸断片を検出し得るようにする同
断片の種種の化学的変更、例えばテーン等［Tchen et a
l.,「Cemically ModifiedNucleic Acids as Immunodete
ctable Probes in Hybridization Experiments」,Proi
c.Natl. Acad. Sci.,Vol.81,pp.3466-3470(1984)］；リ
チャードソン等［Richardson et al.,「Biotin and Flu
orescent Labeling of RNA Using T4 RNA Ligase」,Nuc
leic Acids Reserch,Vol.11,pp.6167-6184(1983)］；ラ
ンガー等［Langer et al.,「Enzymatic Synthesis of B
iotin-Labeled Polynucleotides: Nucleic AcidAffinit
y Probes」,Proic.Natl.Acad.Sci.,Vol.78,pp.6633-663
7(1981)］；ブリガティ等［Brigati et al.,「Detectio
n of Viral Genomesin Cultured Cells and Paraffin-
Embedded Tissue Sections Using Biotin-Labeled Hybr
idization Probes」,Virology,Vol.126,pp.32-50(198
3)］；ブロカー等［Brokeret al.,「Electron Microsco
pic Visualization of tRNA Genes Ferrin-Avidin: Bio
tin Labels」,NucleicAcids Research Vol.5,pp.363-38
4(1978)］；ベヤー等［Bayer et al.,「The Use of the
Avidin Biotin Complex as a Tool in Molecular Biol
ogy」, Methods of Biochemical Analysis, Vol.26,pp.
1-45(1980)；クールマン［Kuhlmann,Immunoenzyme Tech
niques in Cytochemistry(Weinheim,Basel,1984)］、ラ
ンガー-サファー等［PNAS USA,79:4381(1982)］；ラン
デゲント等［Exp. Cell Res.,153:61(1984)］；ホップ
マン等［Hopman et al.,Exp.Cell Res.,169:357(198
7)］。 典型的な標識化手段はこれらを含み、これらの
手段においてプローブ断片はビオチニル化され、N-アセ
トキシ-N-2-アセチルアミノフルオレンで変更され、フ
ルオロセインで変更され、水銀／TNPリガントで変更さ
れ、スルホン化され、ジゴキシゲニン化され、またはT-
Tダイマを含む。
【０１６６】「プローブ標識化」(probe labeling)のキ
イとなる特徴は、標的物質に結合したプローブが検出で
きるということである。あるケースでは、付加された特
徴よりもプローブ核酸の固有の特徴がこの目的のために
利用できる。例えば、特異的にRNA/DNAデュプレックス
を見いだす抗体は、DNA標的物質に結合されるRNA から
作られたプローブを確認する能力を持つことを証明され
ている。［Rudkin and Stollar,Nature,265:472-473(19
77)]。かかるプローブのために使用されたRNAは変更さ
れない。プローブ核酸断片は、変更されたヌクレオチド
または特定の正常なヌクレオチドの尾部を付加すること
により拡張できる。正常ヌクレオチドの尾部が使用され
る場合には、数ある標識する手段の中で、尾部に相補的
でありかつフルオロクロム、酵素、放射能、変更塩基対
を含んでいる核酸による第２のハイブリダイゼーション
が結合プローブの検出を可能とする。かかるシステムは
商業的にはエンゾ バイオケムから入手できる。
【０１６７】プローブにおける核酸配列が変更構成物を
直接誘導することのない、結合プローブを可視化する手
段の他の実施例は、チミジンダイマーに対する抗体の使
用である。ナカネ等［20(2):229(1987)］は、その中で
チミジン−チミジンの二量化DNA（T-TDNA）がインシト
ゥ ハイブリダイゼーションのためのマーカとして使用
された方法を例示している。ハイブリダイズされたT-TD
NAはラビット抗-T-TDNA抗体を使用して免疫組織化学的
に検出された。
【０１６８】上記文献に記載された標識化技術の全て
は、特定の状況のもとで選択される。それ故、上記文献
は参考文献として取り入れられる。さらに、当業者にと
って周知の標識化技術は、本発明にかかる染色組成物を
標識するのに有用である。標識化手段の選択は、下記の
ファクターを含む幾多のファクターにより決定される。
ハイブリダイゼーションの効率における標識効果および
染色体DNAに対する核酸断片の結合効果、最初のハイブ
リダイゼーション後に適用されるラベリング モイエテ
ィ(labeling moieties) への結合プローブの隣接性、ラ
ベリング モイエティの相互の適合性、標識により引き
起こされたシグナルの性質と強度、標識が適用される費
用および容易性、これらに類似する事項。
【０１６９】異なる方法によりそれぞれ標識された幾多
の異なる高度コンプレキシティ プローブは、同時に使
用できる。それ故、異なるプローブの結合は例えば異な
る色により識別される。
【０１７０】IV. インシトゥ ハイブリダイゼーション 染色体に対する本発明に係る不均一混合物の適用は、標
準的なインシトゥ ハイブリダイゼーション技術により
遂行される。技術上の幾多の優れたガイドが役に立つ。
例えばガルおよびパードゥ［Gall and Pardue,「Nuclei
c Acid Hybridization in Cytological Preparation
s」,Methods inenzymology,Vol.21,pp.470-480(198
1)］、例えばヘンダーソン［Henderson,「Cytological
Hybridization to Mammalian Chromo-somes」,Internat
ional Review of Cytology,Vol.76,pp.1-46(1982)］；
例えばアンゲラー等［Angerer,et al.,「In Situ Hybri
dization to Cellular RNAs」,in Genetic Engineerng:
Principles and Methods, Setlowand Hollaender,Ed
s.,Vol.7,pp.43-65(Plenum Press,New York,1985)］。
したがって、これらの文献は参考文献として取り入れら
れる。
【０１７１】以下の３つのファクターがハイブリダイゼ
ーション プローブの染色感受性(staining sensitivit
y)に影響を及ぼす。：(１) ハイブリダイゼーションの
効率（プローブによりハイブリダイズできる標的DNAの
フラクション）、(２)検出効率（すなわち、ハイブリダ
イゼーション プローブの与えられた量から得られる可
視化シグナルの量）、(３)プローブの非特異的結合また
は検出システムの成分により形成されたノイズのレベ
ル。 一般に、インシトゥ ハイブリダイゼーションは
次の主ステップからなる。(１)試験されるべき組織また
は生物学的構造の固定、(２)標的DNAの隣接性を増加し
かつ非特異的結合を減少するために生物学的構造のプレ
ハイブリダイゼーション処理、(３)プローブの不均一混
合物の生物学的構造または組織におけるDNAに対するプ
ローブの不均一混合物のハイブリダイゼーション、(４)
特異的ハイブリッドにおける結合していないプローブを
除去するポストハイブリダイゼーション洗浄(posthybri
dization washes)、(５)不均一混合物のハイブリダズさ
れたプローブの検出。これらのステップの各々に使用さ
れた試薬および使用条件は、特定の状況により変わる。
【０１７２】次のコメントは、上記した一般的ステップ
を適用するためのガイドとして供するために意図されて
いる。ある実験は特定の適用のために最善の染色条件を
確立すべく要求される。
【０１７３】ハイブリダイゼーションに備えて、プロー
ブはその形成方法にかかわらず、適宜のサイズの断片に
切断してハイブリダイゼーションの最良の強度と特異性
を得るようにしてもよい。断片のサイズに関する一般的
なガイドラインとして、次の事項を認識することは必要
なことである。断片が余りにも長い場合には、同断片は
結合するための標的内に侵入し得ず、その代わりハイブ
リダイゼーションにバックグランド ノイズを与える集
団を形成する。しかしながら、断片が余りにも短いと、
シグナル強度が低減される。
【０１７４】セクションVI.B.で例示されたハイブリダ
イゼーションの条件のもとでは、ヒトゲノムDNAは高度
コピー共有反復配列のハイブリダイゼーションをブロッ
クする試薬として使用され、プローブ断片の好ましいサ
イズの範囲は約200ベース〜約2000ベース、より好まし
くは約1kbである。プローブ断片のサイズが約800〜約10
00ベースの範囲である場合には、好ましいハイブリダイ
ゼーション温度は約30℃〜45℃、より好ましくは約35℃
〜40℃、なお好ましくは約37℃である。また、好ましい
洗浄温度の範囲は約40℃〜50℃、より好ましくは約45℃
である。
【０１７５】プローブ断片のサイズは、標的物質に対す
るハイブリダイゼーションの以前にチェックされる。断
片のサイズは、好ましくは電気泳動によりモニターさ
れ、より好ましくは変性アガローズゲル電気泳動により
モニターされる。
【０１７６】固定液は酸アルコール溶液、酸アセトン溶
液、ペトランクウイッチ試薬(Petrunkewitsch's reagen
t)、およびホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒドまたはそれらの類似物等のごとき種
種のアルデヒドを含む。好ましくは、約３：１の比率の
エタノール-アセティクアシド溶液またはメタノール-ア
セティクアシド溶液がメタフェーズ スプレッドにおけ
る染色体を固定するのに使用される。サスペンジョン中
の細胞および染色体にとってはトラスク等［Trask,et a
l.,in Science,Vol.230,pp.1401-1402(1985)］により記
述された固定手法が使用できる。それ故、かかる文献は
参考文献として取り入れられる。簡単に言えば、K2CO3
とジメチルサブエリミデイト（DMS）（５倍に濃縮され
たストック溶液、使用前に十分に混合）が、約5×106nu
clei/mlを含むサスペンジョンに付与される。最終のK2C
O3とDMS 濃度はそれぞれ20mMと3mMである。25℃で15分
放置後100mM サイトリックアシド／ml サスペンジョン
の50μlを添加してpHが10.0〜8.0に調整される。細胞核
は遠心分離によりー度洗浄される（300g,10min.,50mM K
Cl,5mM pH9.0のヘペスバッハァーおよび10mM MgSO4中4
℃にて）。
【０１７７】サスペンションにおける細胞または細胞核
の好ましい固定手法はトラスク等により開示されており
［Trask et al.,Him. Genet.,78:251-259(1988) ］、同
文献は参考文献として取入れらる。簡単に言えば、細胞
核はPBS,50'mM MgSO4,pH7.6の1％パラホルムアルデヒド
中室温で約10分間で固定され、そして二度洗浄される。
細胞核は分離緩衝液（IB)中で再度懸濁される。かかる
緩衝液は（50mM KCl,5mM HEPES,10mM MgSO4,3mM ジチオ
エリスリトール,0.15mg/ml RNase,pH 8.0）／（0.05%
トリトンX-100,108/ml ）。
【０１７８】しばしば、インシトゥ ハイブリダイゼー
ションの前に、染色体は蛋白質を除去する試薬で処理さ
れる。かかる試薬は酵素または緩酸を含む。プロナー
ゼ、ペプシン、プロティナーゼK等がしばしば酵素とし
て使用される。典型的な酸処理は0.02-0.2N HClでなさ
れ、続いて高温（例えば70℃）で洗浄される。脱タンパ
ク質の効率は、ハイブリダイゼーションを最高にするプ
ロティーズ濃度とダイジェション時間との組合せを必要
とするが、形態学的詳細(morphological detail)の許容
し得ないロスの原因とはならない。最適の条件は組織型
および固定方法により異なる。プロティーズ処理後の付
加的固定は有用である。従って、特定の適用のために
は、ある実験がプロティーズ処理を効率的にするために
要求される。
【０１７９】あるケースでは、標的物質から残余のRNA
を除去するためにRNasによる前処理が望ましい。かかる
除去処理は、50-100μg/ ml(RNase in 2×SSC)中で室温
で1-2時間、固定された染色体のインキュベイションに
より遂行できる。（但し、SSCは0.15MNaClと0.015M ソ
ジウム サトレイトの溶液である）。
【０１８０】不均一プローブ混合物のプローブを染色体
DNAにハイブリダイズするステップは、以下のステップ
を含んでいる。(１)プローブが相補的ー重鎖領域への接
近を促進できるために標的DNAを変性すること、および
(２)プローブを標的物質における相補的座位にアニール
(anneal)することを可能にする条件のもとで不均一混合
物を適用すること。変性方法は高pH、低pH、高温、また
はホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム ハライ
ドのごとき有機溶剤、またはそれらの類似物の存在のも
と、濃度および温度の種種の組合せでのインキュベイシ
ョンを含む。標的物質中の一重鎖DNAはエキソヌクリア
ーゼIII［van Dekken et al.,Chromosoma(Berl)97:1-5
(1988)］のごとき酵素で形成できる。好ましい変性手法
は約35-95%in 2×SSCの濃度、約25-70℃の温度でのホル
ムアミドにおける1-10分のインキュベイションである。
これらの範囲内での効率的なインキュベイション時間、
濃度、および温度の決定は、固定方法およびプローブ核
酸（例えばDNAまたはRNA）の型を含む種種の変動要因に
依存する。
【０１８１】染色体DNAが変性された後、変性要因は典
型的には不均一プローブ混合物の適用以前に除去され
る。ここでホルムアミドと熱は主要な変性要因であり、
それらの除去は溶剤による幾度かの洗浄により都合良く
遂行される。かかる溶剤は例えば70％,85％,100％冷エ
タノール シリーズのごとく、しばしば冷却される。変
性物質の組成は他の構成物の付加または適宜の溶剤での
洗浄のいずれかにより、インシトゥ ハイブリダイゼー
ションのために適宜に調整できる。プローブおよび標的
核酸はハイブリダイゼーション混合物の適用、およびそ
の後の適宜の加熱により同時に変性される。
【０１８２】不均一混合物が適用される時間の間の、染
色体DNAおよびプローブの雰囲気の物理化学的条件はハ
イブリダイゼーション条件、またはアニーリング条件に
関係する。特定の適用における最上の条件は、幾多のフ
ァクターをコントロールすることにより調整でき、同フ
ァクターとしては以下のものが含まれる。成分の濃度、
不均一混合物中の染色体のインキュベイション時間、不
均一混合物を構成する核酸断片の濃度、コンプレキシテ
ィ、および長さ。概略的には、ハイブリダイゼーション
条件は、非特異的結合を最小限にするために溶融温度に
十分に近ずけなければならない。他方、かかる条件は、
相補的配列の正確なハイブリダイゼーションを検出レベ
ル以下に低減し、または長いインキュベイション時間を
過剰に要求すること程には厳格なものではない。
【０１８３】ハイブリダイゼーション混合物中の核酸の
濃度は重要な要因である。かかる濃度は十分に高くなけ
ればならず、これによりそれぞれの染色体結合座位の十
分なハイブリダイゼーションが適当な時間内（数時間〜
数日）に生じる。十分なシグナルを得るのに要する濃度
より高い濃度は避けるべきであり、これにより非特異的
結合が最小となる。不均一混合物のプローブにおける核
酸の濃度に関する、重要な実際の拘束は溶解度である。
断片濃度、例えば単位体積当りの核酸の単位長さに関し
ては上限が存在し、それは溶液中で保持できかつ効果的
にハイブリダイズする。
【０１８４】後述のセクションVI.B.で記述された典型
的な実施例において、ハイブリダイゼーション混合物に
おけるDNA濃度は1μg/μlのオーダの上限を持ってい
る。かかる全染色体染色のためには、1-20ng/μlのプロ
ーブ濃度が使用された。ゲノムブロッキングDNAの量
は、Qが5未満であるように調整された。プローブ濃度の
下限において、1時間のインキュベイションで十分なシ
グナルが得られた。すなわち、プローブおよびブロッキ
ングDNAは標的物質に適用する以前にいっしょに保持さ
れ、高度コピー配列をブロックし、16時間のハイブリダ
イゼーションに付される。シグナルはハイブリダイゼー
ションの2時間後可視化された。最良の結果（最高コン
トラストの光輝シグナル）は、100時間ハイブリダイゼ
ーション後に生じた。かかるハイブリダイゼーション
は、低度コピー標的配列に結合座位を発見するためのよ
り多くの機会を与えた。プローブ濃度の上限において、
光輝シグナルは16時間またはそれ未満の時間のハイブリ
ダイゼーション後に得られた。コントラストは、より多
くの標識された反復配列がプローブ中に含まれている故
に減少した。
【０１８５】固定された標的物質はプローブDNAの非特
異的結合を減らすために、ハイブリダイゼーションステ
ップの間またはその後に幾多の手段で処理される。これ
らの処理は下記の処理を含む。非プローブ、"キャリ
ア"、DNAを不均一混合物に添加すること、デンハルト溶
液(Denhardt's solution)（Biochem．Biophys.Res.Comm
un.,Vol.23,pp.641-645(1966)）のごときコーティング
溶液を不均一混合物とともに使用すること、数分〜数10
分例えば5-20分、変性溶剤中ハイブリダイゼーション温
度より上5-10℃の温度でインキュベイトすること、RNA
プローブのケースではー重鎖RNase in 2×SSC（例えば5
-10μg/ml RNase）による室温での1時間の緩処理。
【０１８６】V. 選択された単一コピーの配列からから
なる染色体染色試薬 V.A. ヒト第21染色体に特異的な染色試薬の製造および
使用 V.A.1. 第21染色体の分離および第21染色体-特異的ライ
ブラリーの構造 ヒト染色体-特異的ライブラリーからのDNA断片は、ナシ
ョナル ラボラトリージーン ライブラリー プロジェク
ト(National Laboratory Gene Library Project)から、
アメリカン タイプ カルチャー コレクション［America
n Type CultureCollection(ATCC),Rockville,MD.］を通
して入手可能である。第21染色体からのDNA断片は、フ
スコー等により記載された手法［Fuscoe et al.,in「Co
nstruction of Fifteen Human Chromosome-Specific DN
A Libraries from Flow-PurifiedChromosome」,Cytogen
et. Cell Genet.,Vol.43,pp.76-86(1986)］で造られ、
この文献は参考文献として取り入れられる。簡単に言え
ば、ヒト二倍体繊維芽細胞培養は新生児包皮組織から確
立された。細胞の染色体はファン デン エンフ等のMgSO
4法［van den Enph et al.,Cytometry, Vol.5,pp.108-1
23(1984)］により分離され、蛍光染料−ヘキスト33258
およびクロモマイシンA3−で染色された。第21染色体は
ピータース等［Peters et al.,Cytometry,Vol.6,pp290-
301(1985)］により述べられたローレンス リバーモア
ナショナル ラボラトリーの高速ソーターにより分離さ
れた。
【０１８７】ソーティングの後、染色体濃度は約4×105
/mlであった。それゆえ、DNAの抽出に先立って、染色体
(0.2-1.0×106)は4℃で30分間、40,000×gで遠心により
濃縮された。それからペレットは0.5%のSDSと100μg/ml
のプロテイナーゼKを含む100μlのDNA分離緩衝液(15mM
NaCl,10mM EDTA,10mMトリスHCl pH8.0)中に再浮遊され
た。37℃で一晩のインキュベーションの後に、タンパク
質はフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール
(25:24:1)で二度、そしてクロロホルム:イソアミルアル
コール(24:1)で一度、抽出された。DNAの量が少量であ
るので、各有機相は少量の10mMトリスpH0.8, 1mM EDTA
(TE)で再抽出された。水様層はシュライヒャーとシュエ
ルのミニコロジオン膜(Schileicher and Schuell mini-
collodion membrane)(#UHO20/25)に結合されて移され、
6-8時間室温でTEに対し透析された。それから精製され
たDNA溶液は、50mM NaCl,10mMトリスHCl pH7.5,10mM Mg
Cl2,1mMジチオトレイトール中で50ユニットのHind III
(Bethesda Research Laboratories, Inc.) でもってダ
イジェストされた。37℃で4時間後、反応は上述のごと
くフェノールおよびクロロホルムを用いた抽出により停
止された。水相はミニコロジオンバッグ中で一晩4℃で
水に対し透析され、それからHind IIIでクリーブ(cleav
e)されウシ-アルカリホスファターゼ(calf alkaline ph
osphatase) (Boehringer Mann-heim)で処理された2μg
のカロン21Aアームズ(Charon 21A arms)が加えられた。
溶液は真空の下で50-100μlの容積まで濃縮され、0.5ml
のマイクロフュージチューブ(microfuge tube)に移され
て、そこでDNAは10分の1容積の3MソジウムアセテートpH
5.0および2容積のエタノールと共に沈降された。沈降物
は遠心により集められ、冷たい70%エタノールで洗浄さ
れ、10μlのTEに溶解された。
【０１８８】DNAが数時間溶解するのを許容した後、1μ
lの10×リガーゼ緩衝液(0.5MトリスHCl pH7.4,0.1M MgC
l2,0.1Mジチオトレイトール,10mM ATP,1mg/mlウシ血清
アルブミン)および1ユニットのT4リガーゼ(Bethesda Re
search Laboratory, Inc.)が加えられた。連結反応は10
℃で16-20時間インキュベートされ、3μlのアリコート
(aliquotes)がホーンにより記載［Horh in Methods in
Enzymony,Vol.68,pp.299-309(1979)Molecular Cloning:
A Labora-tory Manual,(Cold Spring Harbor Laborator
y, New York,1982)］されたＥ.コリ細胞株BHB2688およ
びBHB2690から調製されたインビトロ抽出物を用いてフ
ァージパーチクルに組み込まれた。簡単に言えば、両抽
出物は音波処理により調製されてインビボパッケージン
グ(in vivopackaging)のときに組み合わされた。これら
の抽出物は野生型ラムダDNAを、マイクログラムあたり1
-5×108プラークフォーミングユニット(pfu)の効率でパ
ッケージした。結果として生じたファージは、プラーク
が一緒に成長するのを阻止しまた異なる組換え物の成長
率の差を最小にするために、約104pfu/150mmディッシュ
の密度で8時間、Ｅ.コリLE392上で増幅された。ファー
ジはプレートごとに10mlのSM緩衝液(50mMトリスHCl pH
7.5,10mM MgSO4,100mM NaCl, 0.01%ゼラチン)中で、4℃
で12時間穏やかに揺り動かすことにより溶離された。そ
れからプレートは余分の4mlのSMでリンスされた。細胞
の破片をペレット化した後、ファージ浮遊液はクロロホ
ルムによって4℃で貯えられた。
【０１８９】V.A.2. ヒトリンパ細胞の第21染色体を染
色するための第21染色体-特異的染色剤の構造および使
用 非反復配列インサートを有するクローンはベントンおよ
びデイビスの方法［Benton and Davis,Science,Vol.19
6,pp.180-182(1977)］により分離される。簡単に言え
ば、約1000の組換えファージが第21染色体-特異的ライ
ブラリーからランダムに分離される。これらはニトロセ
ルロースに移されてニックトランスレートされた全ゲノ
ムヒトDNAでプローブされる。
【０１９０】強いハイブリダイゼーションを示さないク
ローンのうち、明白な非反復配列DNAを含むおよそ300が
抽出される。選択されたクローンが増幅された後、各ク
ローン中の第21染色体インサートは32P標識されて、第2
1染色体ライブラリーを構成するのに使われたと同じ酵
素すなわちHind IIIでダイジェストされたヒトゲノムDN
Aのサザンブロット(Suothern blots)にハイブリダイズ
される。クローンを含む非反復配列はサザン分析の間に
単一のバンドを生じるものとして認識される。およそ10
0のこのようなクローンが不均一な混合物に対して選択
される。非反復配列クローンは増幅され、インサートは
Hind IIIダイジェスションにより除去されて、インサー
トはゲル電気泳動によりファージアームから分離され
る。プローブDNA断片（すなわち非反復配列インサー
ト）はゲルから除去されてニックトランスレーションに
より（例えば Bethesda Research Laboratories から入
手可能なキットにより）ビオチン化される。標識された
DNA断片は、pH7.5の50mMトリス,1mM EDTA,0.1% SDS中で
膨潤されたセファデックスG-50（媒体）で充填した0.5m
lエッペンドルフチューブ(Eppen-dorph tubes)中に造ら
れた小型のスピンカラム(spin columns)を用いて、ニッ
クトランスレーション反応から分離される。ヒトリンパ
細胞染色体はハーパー等［Harper et al.,Proc.Nat'l.A
cad.Sci.,Vol.78,pp.4458-4460(1981)］に従って調製さ
れる。中期および間期の細胞は燐酸緩衝溶液中で３回洗
浄され、メタノール-アセティックアシッド(3:1)中で固
定され、清潔にされた顕微鏡スライド上に落された。ス
ライドは-20℃で窒素雰囲気中に貯えられる。
【０１９１】間期の細胞および／または中期のスプレッ
ドを載せたスライドは窒素から取り出され、4時間かけ
て空気中で65℃まで加熱され、RNアーゼで処理(100μg/
ml,37℃で1時間)されて、エタノールシリーズ中で脱水
される。それからプロテイナーゼKで処理(60ng/ml,37℃
で7.5時間)されて脱水される。プロテイナーゼKの濃度
は、細胞の型と酵素のロットに基づいて、染色体の位相
顕微鏡による像が乾燥したスライド上に殆ど残らないよ
うに調整される。ハイブリダイゼーション混合物は（最
終濃度で）、50%のホルムアミド,2×SSC、10%のデキス
トランサルフェート、500μg/mlのキャリヤDNA（音波処
理されたニシン精子DNA）および2.0μg/mlのビオチン-
標識された第21染色体-特異的DNAからなっている。この
混合物はガラスのカバースリップの下に3μl/cm2の密度
でスライドに適用されてラバーセメントでシールされ
る。37℃で一晩のインキュベーションの後、スライドは
45℃で洗浄（50%ホルムアミド-2×SSC pH7,3回3分、続
いて2×SSC pH7,5回2分）されて、BN緩衝液(0.1Mソジウ
ムビカーボネート,0.05%NP-40,pH8)に浸される。この時
点以後、スライドは決して乾燥させてはならない。
【０１９２】スライドはBN緩衝液から取り出されて、室
温で5分間、5%の脱脂粉乳(Carnation)および0.02%のソ
ジウムアジド（プラスチック製カバースリップの下で5
μl/cm 2）でブロックされる。カバースリップは取り除
かれ、余分の液体は手早く排出されて、フルオレセイン
-アビジンDCS(5%の粉乳と0.02%のソジウムアジドを有す
るBN緩衝液中で3μg/ml)が加えられる(5μl/cm2)。同カ
バースリップは戻されてスライドは37℃で20分間インキ
ュベートされる。それからスライドは3回2分間、それぞ
れ45℃のBN緩衝液中で洗浄される。ビオチン-連結され
たフルオレセインの強さは、ビオチン化されたヤギ抗-
アビジン抗体(5%のヤギ血清と0.02%のソジウムアジドを
を有するBN緩衝液中で5μg/ml)の層を加え、続いて上記
と同様に洗浄した後、フルオレセイン-アビジンDCSの別
の層を加えることにより増幅される。フルオレセイン-
アビジンDCS、ヤギ抗アビジンおよびヤギ血清は全て商
業的に入手可能［例えばVector Laboratories(Burlinga
me,CA)］である。BN中での洗浄後、蛍光抗フェード液、
p-フェニレンジアミン(カバースリップに関し1.5μl/cm
2)が観察の前に加えられる。最適の顕微鏡像を得るには
この層を薄く保持することが重要である。この抗フェー
ド液はフルオレセインの減退を大幅に減少させて5分間
までの連続した顕微鏡観察を可能にする。この抗フェー
ド液には、DNA対比染色剤(DAPIまたはプロビジウム-ア
イオダイド)が0.25-0.5μg/mlで含まれている。
【０１９３】赤い蛍光を発するDNA-特異的染料プロピジ
ウムアイオダイド(PI)は、ハイブリダイズされたプロー
ブと全DNAを同時に観察することを可能にするために使
用される。フルオレセインおよびPIは450-490nm（Zeiss
filter combination 487709）で励起される。励起波長
を546nm（Zeiss filter combination 487715）に増大す
ればPIのみの観察を可能にする。DAPI、紫外線（Zeiss
filter combination 487701）で励起される青い蛍光のD
NA-特異的染色剤は、ビオチン-標識されたものと全DNA
が別々に観測される場合に対比染色剤として使用され
る。中期第21染色体は染色体の本体上に散らばるランダ
ムに位置する黄色いスポットにより検出される。
【０１９４】V.B. 第21染色体シングルコピー配列を効
率よく選択する改良された方法 フスコー等［Fuscoe et al.,Genomics,5:100-109(198
9)］は、多数のシングルコピー配列または非常に低いコ
ピー数の反復配列クローンを組換えファージライブラリ
ーから選択するための、すぐ上(V.A.2)で述べた方法よ
りもっと効率的な手法を提供して、第21染色体を染色す
るためのその使用につき実証している。前記記事はこれ
により参考として取り入れられる。簡単に言えば、クロ
ーンは２つの基本的手法を用いて（ヒト第21染色体のDN
Aから造られた）カロン21Aから選択された。第１に、フ
ァージライブラリーは、クローン内の反復配列の存在に
対しセクションV.A.2.の方法よりもっと敏感になるよう
に案出された方法を用いて２つのステージに区別され
た。それから選択されたクローンはプラスミドにサブク
ローンされた。このようにして選択された450のインサ
ートがライブラリーpBS-U21を形成する。第２は複数ス
テップの処理からなり、そこでは 1)LL21NS02からのイ
ンサートはブルースクライブプラスミドにサブクローン
され、2)プラスミドはニトロセルロースのフィルター上
のバクテリアコロニー中で高密度で増殖され、3)放射性
ヒトゲノムDNAがニトロセルロースのフィルター上のプ
ラスミドDNAに２ステップの低い厳格性でハイブリダイ
ズされ、4)ハイブリダイズされなかったインサートを有
するプラスミドがシングルコピー配列を備えている可能
性があるものとして選択された。このようにして５０３
０のコロニーが選び出されて、ライブラリーpBS-U21/15
30を形成した。
【０１９５】サザン分析は、反復配列を見分けるのに第
２の手法の方が第１のよりも効率的であることを示し
た。pBS-U21/1530からのDNAでの蛍光インシトゥハイブ
リダイゼーションは、ヒトリンパ細胞から造られた中期
スプレッド中の第21染色体の特異的で強い染色を可能に
した。pBS-U21でのハイブリダイゼーションは第21染色
体につきより少ない特異的染色を与える。フスコー等の
組換えライブラリーからシングルコピー配列または非常
に低い反復配列を選択する方法に関する詳細は、フスコ
ー等［Fuscoe et al.,id］に記載されている。
【０１９６】V.C. 第4染色体シングル-コピー配列のコ
レクションとのハイブリダイゼーション ピンケル等［Pinkel et al.,PNAS(USA),85:9138-9142(D
ecember 1988)］は、第4染色体シングルコピー配列を調
製する手法および、次いで前記シングルコピープローブ
をヒト中期スプレッドにハイブリダイズするためのプロ
トコル｛ピンケル等［Pinkel et al;PNAS(USA),83:2934
-2938(1986)］｝に記載された手法の変形を記載してい
る。図４Ｈは第4染色体からの120のシングルコピー-プ
ローブのプールでのヒト中期スプレッドに対するハイブ
リダイゼーションを示す。
【０１９７】VI. 共有反復配列の無能力化 VI.A. ブロッキングDNAを使用した第21染色体-特異的染
色 高濃度の標識されていないヒトゲノムDNAとラムダファ
ージDNAが標的染色体に対し反復およびベクターDNA配列
結合を抑制するのに使用された。重質プロテイナーゼの
ダイジェスションとこれに続く標的の固定は標的DNAに
対するプローブのアクセスを改良する。
【０１９８】ヒト中期スプレッドは標準的手法でもって
顕微鏡スライド上に調製されて-20℃で窒素雰囲気中に
貯えられた。
【０１９９】スライドはフリーザーから取り出されて染
色手法を始める前に窒素雰囲気中で室温まで温まるよう
にされた。暖められたスライドは先ずP緩衝液(20mMトリ
ス,2mM CaCl2 pH7.5)中で0.6μg/mlのプロテイナーゼK
で処理されてP緩衝液中で一度洗浄された。使用された
プロテイナーゼKの量はスライドの異なるバッチ毎に調
整する必要がある。変性後スライドは2×SSC中に貯えら
れた。50%のホルムアミド，10%のデキストランサルフェ
ート，1%のトゥィーン20，2×SSC，0.5mg/mlのヒトゲノ
ムDNA，0.03mg/mlのラムダDNA，および3μg/mlのビオチ
ン標識されたプローブDNAからなるハイブリダイゼーシ
ョン混合物が調製された。プローブDNAはセシウムクロ
ライドグラディエント(cesium chloride gradient)によ
り決定された、第21染色体Hind IIIフラグメントライブ
ラリー(ATCC登録番号57713)からのファージの最高密度
のフラクションから成っていた。（プローブのインサー
トおよびファージDNAは何れもニックトランスレーショ
ンにより標識された。）ゲル電気泳動により決定された
平均的インサートのサイズ（第21染色体DNAの量）は約
５キロベースであった。反復配列をインサートから除い
たりインサートをラムダファージベクターから分離する
試みはなされなかった。ハイブリダイゼーション混合物
は70℃で5分間加熱し続いて37℃で1時間インキュベーシ
ョンすることにより変性された。インキュベーションは
ハイブリダイゼーション混合物内のヒトゲノムDNAと標
識されていないラムダDNAが、プローブ内のヒト反復配
列およびベクター配列をブロックするのを可能にする。
【０２００】ヒト中期スプレッドを含むスライドは2×S
SCから取り出されてレンズペーパーで拭って乾かされ
た。ハイブリダイゼーション混合物は直ちにスライドに
適用され、ガラスのカバースリップがラバーセメント共
にスライド上に置かれて、スライドは37℃で一晩インキ
ュベートされた。その後スライドの調製はセクションV.
B.で述べた手法で進められた（ここでは第21染色体DNA
はフルオレセインで染色されて全染色体DNAはDAPIで対
比染色された）。図１Ａ-Ｃはその結果を示す。図１Ａ
はコンピュータ画像分析装置で得られたヒト中期スプレ
ッドのDAPI像である。これは全てのものをしきい値以上
は白でそれ以外は黒で示すバイナリーイメージである。
基本的データは256の強度レベルの灰色レベル像で記録
された。（小さい矢印は第21染色体の位置を示す。）図
１Ｂは図１Ａと同じスプレッドの、これもバイナリー形
式での、フルオレセイン像である。（ここでも小さい矢
印は第21染色体の位置を示す。）図１Ｃは、他のより淡
く染色されたものが標準的イメージ処理技法で除かれた
後の第21染色体の位置を示す。
【０２０１】VI.B. 第21トリソミーの検出およびブルー
スクライブプラスミドライブラリーを使用した第4染色
体の転座 セクションVI.A.で説明したごとく、共有反復配列を含
むヒト染色体-特異的ライブラリーは、標識しないヒト
ゲノムDNAでのインキュベーションにより共有反復配列
のハイブリダイゼーションキャパシイティが減少されて
いれば、その染色体を染色するのに使用することが出来
る。セクションVI.A.では、不均一な混合物の核酸配列
がファージベクターカロン21A中でクローンされ、そこ
ではベクターDNAのインサートの比は約0.1（40kbのベク
ターに対し平均4kbのインサート）である。このセクシ
ョンでは、より小さいクローニングベクター、約3キロ
ベースのブルースクライブプラスミド、に対して同じイ
ンサートの転移することが、ベクターDNAに対するイン
サートの比を0.5に増大させて、染色の特異性と強さを
改良したことを実証する。
【０２０２】前に論議したごとく、プローブのインキュ
ベーションはプローブ単独ででも、標識されていないゲ
ノムDNAと混合されたプローブででも、また全体で濃縮
された標識されていないDNAまたはある共有反復配列と
混合されたプローブででも行えることを論議した。もし
標識されていないゲノムDNAが加えられるならば、プロ
ーブ内の共有反復配列を充分に無能力化するに足るだけ
加えることが重要である。しかしながら、ゲノムDNAは
ハイブリダイゼーションが要望される配列の標識されて
いないコピーも含んでいる。上に述べたごとく、ここで
はハイブリダイゼーション混合物中の染色体-特異的配
列の標識されたコピーに対する標識されていないものの
比としてQが定義される。
【０２０３】ピンケル等［Pinkel et al.,PNAS(USA),8
5:9318-9142(December 1988)］は、他の染色体と共有し
ている染色体-特異的ライブラリー中の配列のハイブリ
ダイゼーションを競争して阻止するための標識されてい
ないゲノムDNAの使用を記載している。この論文はヒト
染色体-特異的ライブラリー［ブルースクライブプラス
ミド(pBS-4)にサブクローンされた第4染色体ライブラリ
ーLL04NS02;ブルースクライブプラスミド(pBS-21)にサ
ブクローンされた第21染色体ライブラリーLL21NS02］で
の蛍光インシトゥハイブリダイゼーションのための原料
および方法を記載している。これらのハイブリダイゼー
ションの結果は図４Ａ-Ｃおよび図４ＦおよびＧに示さ
れている。
【０２０４】VI.C. ヒト中期スプレッドに対する酵母人
工染色体(YACS)のハイブリダイゼーション YACS . ７つの酵母クローンHY1, HY19, HY29, HYA1.A2,
HYA3.A2, HYA3.A9およびHYA9.E6がＤ.バーク(Washingto
n University,St.Louis,MO)から得られた。クローン中
のヒトDNAの長さは約100kbから600kbの範囲であった。
ゲル電気泳動がこれらのインサートのサイズを確かめる
ために行われた。これらの各クローンは増殖されて全て
のDNAが分離された。分離されたDNAはチミジンの10-30%
がビオチン-11-dUTPで置換されるようにニックトランス
レーションによりビオチン化された。ニックトランスレ
ーション後の全ての標識されたDNAの濃度は10-20ng/μl
の範囲内だった。
【０２０５】ブロッキングDNA. ヒト胎盤DNA(Sigma)が
プロテイナーゼKで処理され、フェノールで抽出され
て、200-600bpのサイズ範囲にまで音波処理された。人
工染色体を含まない酵母から分離された全DNAが同様の
サイズ範囲まで音波処理された。これらのDNAは両方と
も1-10μg/μlの濃度に保持された。
【０２０６】蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(F
ISH). ハイブリダイゼーションは僅かの変更を加えて上
記ピンケル等(1988)に従って行われた。中期スプレッド
は、ハーパー等の手法［Harper et al., PNAS(USA)78:4
458-4460,(1981)］によるメトトレキセート同期培養に
より調製された。細胞はメタノール／アセティックアシ
ッド(3:1)中で固定され、スライド上に落とされ、空気
乾燥されて、使用されるまで-20℃で窒素中に貯えられ
た。それからスライドは標的DNA配列を変性するために7
0%ホルムアミド/2×SSC中に２分間浸され、70-85-100%
エタノール系中で脱水され、空気乾燥された。（SSCは
0.15M NaCl/0.015M Na Citrate,pH7である。）それから
10-100ngのビオチン化された酵母DNA、およびそれぞれ
約１μgの標識されていない酵母とヒトゲノムDNAがハイ
ブリダイゼーション混合物（最終容積10μl、最終組成5
0%ホルムアミド／2×SSC／10%デキストランサルフェー
ト）に加えられ、70℃で5分間加熱され、それから更に
高度に反復された配列の相補的ストランドが再結合する
のを許容するために70℃で1時間加熱される。
【０２０７】次いでハイブリダイゼーション混合物はス
ライド（面積およそ4cm2）に適用されてガラスのカバー
スリップのもとにラバーセメントでシールされた。37℃
で一晩のインキュベーションの後に、カバースリップは
除かれてスライドは3回3分それぞれ42-45℃の50%ホルム
アミド／2×SSC中で、また1回PN緩衝液［pH8の0.1M NaH
2PO4と0.1M Na2HPO4の混合物;0.1%Nonidet P-40(Sigm
a)］中で洗浄された。それから結合されたプローブは、
アビジン-FITCおよびヤギ-抗-アビジン抗体（何れもPNM
緩衝液（PN緩衝液プラス5%脱脂粉乳，固形分除去のため
遠心分離；0.02%ソジウムアジド）中に5μg/ml）中で交
互の20分のインキュベーション（室温）で検出された。
アビジンおよび抗-アビジンインキュベーションはそれ
ぞれPN緩衝液中での3回3分の洗浄で分離された。2また
は3層のアビジンが加えられた（アビジン、DCSグレード
およびビオチン化されたヤギ-抗-アビジンはVector Lab
o-ratories Inc.,Burlingame,CAから得られる）。
【０２０８】第５図はHYA3.A2（580kbのヒトDNA）の12q
21.1に対するハイブリダイゼーションを示している。ハ
イブリダイゼーションの位置は、DAPI/アクチノマイシ
ンD法［Schweizer,「Reverse fluorescent chromosome
banding with chromomycin and DAPI」,Chromosoma,58:
307-324(1976)］(DAPI/actinomycin D procedure)を採
用した通常の蛍光バンディング手法を用いて確定され
た。ハイブリダイゼーション信号は各第21染色体の幅を
横切るバンドを形成し、染色体のその領域におけるDNA
の充填の形態構造を示している。
【０２０９】YACクローンの位置は下記第２表に示すと
おりと考えられる。
【０２１０】
【表２】
【０２１１】VI.D. ヒト／ハムスター雑種細胞とのハイ
ブリダイゼーション 上記ピンケル等(1988)の手法で詳述され上記セクション
V.C.およびVI.B.で例示されたと本質的に同じハイブリ
ダイゼーションおよび染色条件が、この例では使用され
た。この例では、ヒト第19染色体の一つのコピーを含む
ハムスター-ヒト雑種細胞からの400ngのビオチン標識さ
れたDNAが、10ulのハイブリダイゼーション混合物中
で、1.9μgの標識されていないヒトゲノムDNAと混合さ
れた。ハイブリダイゼーションは37℃でおよそ60時間で
あった。結合プローブの蛍光染色と染色体の対比染色は
上述の他の例と同様であった。図６は、ハイブリダイゼ
ーションの結果を示す。
【０２１２】VII. 具体的適用例 この発明は、細胞上において細胞ベースで、顕微鏡的な
またある場合にはフローサイトメトリー的な遺伝的異常
の検出を可能にする。検鏡は全て人間の観察者によりな
されてもよいし、完全なオートメーションにいたるまで
の種々の程度の付加的器具の使用および算出方法の助成
手段を含んでもよい。このような分析のための器具の使
用やオートメーションは多くの利点を与える。その中に
は、人間の観察者には不可視な蛍光染料（例えばインフ
ェアードダイ(infared dyes)）の使用や、同時的には可
視でない多重標識法（例えば蛍光および吸収染色、オー
トラジオグラフィー等の組合せ）で得られた結果を判断
する機会がある。量的測定は人間の観察者では検出でき
ない染色の差を検出するのに使用できる。以下に述べる
ごとく、オートメーション化された分析は、細胞および
染色体が分析される速度を増大させることもできる。
【０２１３】本発明のプローブで検出できる細胞遺伝学
的異常のタイプはつぎのものを含む。重複：染色体タイ
プの全体または部分の重複が、その染色体タイプまたは
部位のためのプローブでのハイブリダイゼーションに続
く中期スプレッドまたは間期核中の識別できるハイブリ
ダイゼーションドメインの数またはサイズの増加とし
て、または結合されたプローブの量の増加により検出で
きる。もしプローブが蛍光により検出されるならば、結
合されたプローブの量はフローサイトメトリー的にまた
は定量的蛍光検鏡により確定される。欠失：全染色体ま
たは染色体部位の欠失が、その染色体タイプまたは部位
のためのプローブでのハイブリダイゼーションに続く中
期スプレッドまたは間期核中の識別できるハイブリダイ
ゼーションドメインの数またはサイズの減少として、ま
たは結合されたプローブの量の減少により検出できる。
もしプローブが蛍光により検出されるならば、結合され
た量はフローサイトメトリー的にまたは定量的蛍光検鏡
により確定される。転座、二動原体および逆位：転座、
二動原体および逆位が、普通は再配列の点にある染色体
の領域の側部に位置しまたは伸びるプローブでのハイブ
リダイゼーションに続いて分離されるハイブリダイゼー
ションドメインの異常な並置により中期スプレッドおよ
び間期核中において検出される。転座は少なくとも２つ
の異なる染色体タイプに影響を与えて、ただ一つの動原
体をそれぞれ有する派生的染色体という結果となる。二
動原体は少なくとも２つの異なる染色体タイプに影響を
与えて、動原体を欠く少なくとも一つの染色体断片と２
つの動原体を有するもう一つという結果となる。逆位は
染色体の一部の極性の逆転を伴う。
【０２１４】VII.A. バンド分析 中期スプレッドによる自動的な染色体の分類および異常
検出のためのオートメーション化されたシステム（特に
コンピューター制御顕微鏡）の開発に向けて、過去30年
間相当な努力がなされてきた。近年は、種々の染色体タ
イプ上にはっきり認識できるバンディングパターンを生
ずるように化学的に染色された染色体の自動分類に努力
が向けられてきた。これらの努力は、おおよそ同じサイ
ズの染色体タイプの間のバンディングパターンの微妙な
差のために、また異なる中期中の染色体の特質的な収縮
は各タイプの染色体上に見られるバンドの数および幅の
変化の原因となるので、ごく部分的にしか成功していな
い。本発明は、間隔、幅および標識の差異（例えば異な
る色）がオートメーション化された染色体の分類および
異常検出を容易にするように最適化される染色パターン
を生じる試薬の構成を可能にすることにより、これらの
問題を克服する。このことは、ハイブリダイゼーション
プローブが染色体の長さに沿って所望のように選択でき
るので可能である。このような試薬により生じるバンド
のサイズは、単一の小さいドットから一つまたはそれ以
上の染色体を本質的に一様に覆うものまでの範囲に及ぶ
であろう。従って本発明は、隣接したハイブリダイゼー
ションドメインが例えば色により見分けられるような、
ハイブリダイゼーションプローブの構成、および好まし
くは蛍光のような標識手段の使用を可能にし、これによ
り分解するには空間的に余りにも接近しているバンドも
スペクトル的に検出される（すなわち、もし赤と緑の蛍
光を発するバンドが合体していれば、この２つのバンド
の存在は結果として生じる黄色の蛍光により検出され
る）。
【０２１５】本発明はまたバンディングパターンの構成
を具体的な適用例に適応させるのを可能にする。従って
それらは、例えば全体的形状およびサイズが同様であり
従来の技法を用いたのでは同様のバンディングパターン
を有する染色体上において、空間的配置および色の混合
がきわめて異なるものになり得る。本発明のプローブに
より生じるハイブリダイゼーションバンドのサイズ、形
および標識（例えば色）は、機械評価(machine scorin
g)の誤りを除くように最適化でき、正確なオートメーシ
ョン化された異常検出が可能になる。この最適化された
バンディングパターンはまた視覚による染色体分類およ
び異常検出を大幅に改良する。
【０２１６】特異的転座切断点の認識の容易さは、切断
の領域に対しぴったりと標的化された試薬の使用により
改良される。例えば、染色体の切断の両側にハイブリダ
イズする配列からなる本発明による高コンプレキシティ
プローブが使用できる。切断の一側に結合されるプロー
ブの部分は他側に結合されるものとは、例えば異なる色
により異なって検出される。このようなパターンでは、
正常な染色体は互いに隣あった異なる色のハイブリダイ
ゼーション領域を有するであろうし、このようなバンド
は接近して現れるであろう。切断はプローブを異なる染
色体に分離するか結果的に染色体断片となるであろう
し、平均して更に離れて視覚化されるであろう。
【０２１７】VII.B. 生物学的線量法 生物学的線量法への一つの接近手段は、潜在的に有毒な
薬剤に暴露された個体により被った遺伝学的損傷の兆候
として、構造的に異常な染色体の頻度を測定することで
ある。多数の研究が、染色体異常誘発物と呼ばれる電離
性放射線およびその他の薬剤に対する暴露の増大と共に
構造的異常の頻度が増大することを示している。二動原
体染色体は、その特徴のある性質がバンド分析なしに速
やかに記録することを可能とするので、最も普通に記録
される。作業場で見いだされるレベルに暴露された個体
におけるこのような異常は低い頻度（〜2×10-3／細
胞）であるので、速やかな分析が重要である。遺憾なが
ら、二動原体は安定して維持されないので測定された二
動原体の頻度は暴露後の時間と共に減少する。従って、
長時間にわたる低レベルの暴露は、異常が連続的に除去
されるので結果的に高い二動原体頻度とはならない。転
座は多かれ少なかれいつまでも維持されるのでこのよう
な線量法的研究のための記録にはより適した異常であ
る。従って、遺伝子損傷の評価を暴露後長時間たったと
きに行うことが出来る。転座は、それを見分けることの
困難さが線量法のために充分な数の細胞を記録すること
を論理的に不可能にするので、生物学的線量法のために
は日常的に記録されない。
【０２１８】本発明はこの困難さを除くものである。特
にいくつかの染色体（例えば第１，第２，第３および第
４染色体）を本質的に一様に染色するプローブでのハイ
ブリダイゼーションは、これらの染色体を巻き込んだ構
造的異常の中期スプレッド中における即時の顕微鏡的同
定を可能にする。正常な染色体はプローブにより完全に
染色されまたは染色されないで現れる。標的および非標
的染色体の間の転座の結果派生した染色体は、部分的に
のみ染色されたものとして認識される（図４Ｄ）。この
ような部分的にハイブリダイズされた染色体は、顕微鏡
内で視覚的にまたはコンピューターにより助成された検
鏡を採用したオートメーション化されたやり方で即時的
に認識される。転座と二動原体の間の識別は、プローブ
に全ての染色体動原体で見出される配列を加えることに
より容易になる。プローブエレメントの残りを検出する
のに使用されたものとは異なる、標識手段例えば色を有
するプローブの動原体の成分の検出は染色体動原体の即
座の識別を可能にし、それは次いで二動原体と転座の間
の識別を容易にする。この技術はこれまでの技法では必
要であった記録のための努力を劇的に減少させて、低レ
ベルの生物学的線量法のために必要な一万もの中期スプ
レッドを検査することを可能にする。
【０２１９】VII.C. 出生前診断 出生前に発見される最も普通の異常は、第21染色体（ダ
ウン症候群）、第18染色体（エドワード症候群）および
第13染色体（パトー症候群）ならびにX0染色体（ターナ
ー症候群）、XXY染色体（クラインフェルター症候群）
およびXYY染色体の異常を伴う三染色体性である。構造
的異常も生じる。しかしながら、これらはまれであって
その臨床的重要性もしばしば不確実である。従って、こ
れらの異常を検出することの重要性は疑問である。羊水
穿刺や絨毛生検の様な伝統的な核型のために胎児細胞を
得る今の技法は、分析のための百から千の細胞をもたら
す。これらは通常細胞遺伝学的分析に充分な分裂細胞を
作り出すために、２から５週間培養基中で増殖される。
中期スプレッドが調製されれば、伝統的バンド分析で分
析される。このような処理は高度に熟練した分析家によ
ってのみ実行できまた時間を浪費するので、最大の細胞
遺伝学研究所によるものでも信頼性を持ってなされる分
析の数は年に数千だけである。結果的に、出生前の細胞
遺伝学的分析は通常、子供に遺伝病の高いリスクがある
婦人（例えば35才以上の婦人）に限られている。
【０２２０】本発明は、細胞培養不要または最小限の細
胞培養で、間期細胞中の普通の数字で表した細胞異常の
簡単な速やかな同定を可能にしてこれらの困難さを克服
するものである。特に、第21，第18，第13，XおよびY染
色体の異常の数が、これらの染色体（またはそれのダウ
ン症候群に対する21q22のごとき重要な領域）に対し特
異的なプローブでのハイブリダイゼーションに続いて、
ハイブリダイゼーションドメインの数を計数することに
より間期細胞において検出できる。ハイブリダイゼーシ
ョンドメインはハイブリダイゼーションの強さが高くな
っている密ではっきりした領域である。第21,第18およ
び第13染色体に対する３つのドメインを示す細胞の増大
した頻度（特に10%より大となる）は、それぞれダウ
ン、エドワードおよびパトー症候群の発生の兆候であ
る。X-特異的およびY-特異的プローブでのハイブリダイ
ゼーションに続く、シングルX-特異的ドメインを示しY-
特異的ドメインを示さない細胞の数の増加は、ターナー
症候群の発生の兆候である。２つのX-特異的ドメインお
よび１つのY-特異的ドメインを示す頻度の増加はクライ
ンフェルター症候群の兆候であり、１つのX-特異的ドメ
インおよび２つのy-特異的ドメインを示す細胞の頻度の
増加はXYY胎児の兆候である。ハイブリダイゼーション
の強さはそれに対しプローブが特異的である標的染色体
の数とおおよそ比例するので、間期細胞中でのドメイン
計数は、例えば量的蛍光検鏡またはフローサイトメトリ
ーを使用したハイブリダイゼーションの強さの計測によ
り補われ（またはときには置き換えられ）る。いくつか
の染色体を含む数字で表した異常は、異なる染色体のハ
イブリダイゼーションを異なる標識手段例えば異なる色
で検出することにより同時に記録できる。これらの異常
検出手法は、集団中の全ての細胞を記録できるので、手
法に必要な大規模な培養の必要性を克服する。これらは
数字的異常というハイブリダイゼーション標示の簡単で
明確な特質の故に高度に熟練した分析家の必要性を除
く。
【０２２１】数的異常が間期でも検出できるという事実
はまた、普通は有糸分裂へと刺激できない細胞の細胞遺
伝学的分析を可能にする。特に、母性抹消血液中に見い
だされる胎児細胞の分析を可能とする。このような特性
は、羊水穿刺または絨毛生検のような侵略的胎児細胞サ
ンプリングの必要性を除くので有益である。
【０２２２】背景でも示したごとく、このような胚-侵
入的方法が必要な理由は、これまでの核型およびバンド
分析は中期の染色体を必要とするということである。い
まのところ、中期の染色体を有する細胞の集団を調製す
るために母性血液から分離した胎児の細胞を培養するた
めの一般に認められた手法はない。本発明の染色試薬は
間期核に利用できるという点において、胎児細胞を核型
分析する非-胚-侵入的方法が本発明により提供される。
【０２２３】このような方法における最初のステップは
胎盤を通り抜けまたは胎盤から母性血液中に流れ出た胎
児細胞を分離することである。母性血液中の胎児細胞の
率は非常に低く、細胞数は10-4から10-6／mlのオーダー
であり、妊娠の時期により非常に変化しやすい。しかし
ながら、適切にマークされた胎児細胞は母性細胞から区
別でき、例えば高速細胞選別により濃縮できる。
【０２２４】男性胎児の細胞の存在はY染色体に対し染
色体-特異的染色試薬による標識、例えば蛍光タグによ
り同定できる。明らかに母性血液から分離されたリンパ
細胞または赤血球前駆体である細胞はY-染色質-陽性で
あることが示された。［Zillacus etal.,Scan.J.Haemat
ol,15:333(1975); Parks and Herzenberg,Methods in C
ell Biology,Vol.10, pp.277-295(Academic Press,N.
Y.,1982) および Siebers et al.,Humangenetik,28:273
(1975)］。
【０２２５】胎児細胞を母性血液から分離する好ましい
方法は母性血液には存在しないある成分に対し優先的に
親和性を有するモノクローナル抗体の使用である。胎児
細胞は父方HL4（ヒト白血球抗体)マーカーまたは胎児細
胞の表面上の抗体により検出することもできる。異なる
HLAタイプに基づき胎児と母性白血球を区別するための
好ましい免疫学的手法はHLA-A2,-A3および-B7遺伝子
座、更に好ましくは-A2遺伝子座における差を利用して
いる。更に、第１および第２の三ヶ月期の栄養芽層は、
母性白血球中には存在しない内部細胞を構成するサイト
ケラチンに対する抗体でマークしてもよい。代表的なモ
ノクローナル抗体は次の参考文献に述べられている。
【０２２６】ヘルツェンベルク等［Herzenberg et al.,
PNAS,76:1453(1979)］は、明らかにリンパ起源の胎児細
胞を、蛍光活性化された細胞選別(FACS)により母性血液
から分離することを報告しており、そこでは分離は母性
血液中のHLA-A2ネガティブ細胞と結合する標識された抗
体の検出に基づいていた。このようなやり方で分離され
た男性胎児細胞は更にY-染色質のキナクリン染色により
同定された。
【０２２７】コボーン等［Covone et al.,Lancet,Oct.1
3,1984:841］はH315と称するモノクローナル抗体を使用
したフローサイトメトリーによる母性血液からの胎児栄
養芽層の回収を報告した。報告によれば、前記モノクロ
ーナルは他の栄養芽層と同じくヒト合胞体栄養細胞の表
面に絞り出された糖タンパク質で、抹消血液細胞にはな
いものであることが同定された。
【０２２８】カワタ等［Kawata et al.,J.Exp.Med.,16
0:653(1980)］はヒト胎盤の懸濁液から胎盤細胞集団を
分離する方法を開示している。この方法は協調した二色
および光散乱FACS分析および選別を使用している。５つ
の異なる細胞集団が、サイズ、ならびにHLA-A,B,Cモノ
モルフィック決定基(MB40.5)およびヒト栄養芽層(anti-
Trop-1およびanti-Trop-2)に対するモノクローナル抗体
により検出された細胞表面抗原の協調表現における量的
差異に基づき分離された。
【０２２９】ロークおよびバターワース［Loke and But
ter-worth,J.Cell Sci.,76:189(1985)］は、２つのモノ
クローナル抗体、18B/A5および18A/C4、を述べており、
これらは第１の三ヶ月期の細胞栄養層および合胞体栄養
細胞を含む他の胎児上皮組織とよく反応する。
【０２３０】本発明による染色のために胎児細胞を母性
血液から分離するための好ましいモノクローナル抗体は
抗-サイトケラチン抗体Cam 5.2であり、これはベクトン
-ディキンソン(Becton-Dickinson)(Franklin Lakes,N.
J.,USA)から商業的に入手可能である。
【０２３１】胎児細胞を母性血液から分離するための他
の好ましいモノクローナル抗体は、1989年8月3日に出願
され、「胎児細胞栄養層細胞の分離方法」と題する同時
係属出願中で共有の米国特許出願番号第389,224号に開
示されたものである［次も参照：Fisher et al.,J.Cel
l.Biol.,109(2):891-902(1989)］。そこに開示されたモ
ノクローナル抗体は第１の三ヶ月期のヒト細胞栄養層細
胞上の抗原と特に反応するが、その胎児細胞は母性血行
に達する蓋然性が最も高い。前記出願および記事はここ
に特に参考に組み込まれる。簡単に言えば、開示された
モノクローナル抗体は、子宮吸引法により分離された胎
盤(placental bed)の切片から得られた細胞栄養層細胞
を用いた試験動物の注射により造られた。造られた抗体
は、第１の三ヶ月期の羊膜絨毛の細胞栄養層幹細胞層と
反応する抗体を選択するためにいくつかの細胞学的スク
リーンを受けた。
【０２３２】フィッシャー等により開示されたこのよう
な第１の三ヶ月期の細胞栄養層細胞に対する好ましいモ
ノクローナル抗体は、ブダペスト条約に基づきアメリカ
ンタイプ カルチャー コレクション［American Type Cu
lture Collection(ATTC;Rockville,MD,USA)］に寄託さ
れた次のハイブリドーマから造られたモノクローナル抗
体を含んでいる。
【０２３３】 ハイブリドーマ ATCC登録番号 J1D8 HB10096 P1B5 HB10097 両ハイブリドーマの培養は1989年4月4日にATTCにより受
け入れられて1989年4月14日に生育可能と報告された。
【０２３４】フィッシャー等は前記モノクローナル抗体
により母性血液から分離された胎児細胞が試験管内で複
製可能であると述べている。従って、フィッシャー等の
方法により分離された胎児細胞すなわち第１の三ヶ月期
の胎児細胞栄養層は、中期および間期における胎児の染
色体物質を提供できる。
【０２３５】胎児細胞、好ましくは白血球および細胞栄
養層、更に好ましくは細胞栄養層は、適切な抗体で一旦
マークされてから、直接または好ましくは前記胎児細胞
を細胞選別またはパンニング(panning)により分離し濃
縮することにより、母性血液から分離される。例えば、
FACSは蛍光標識された細胞を分離するのに使用され、ま
たはフローサイトメトリーも使用される。
【０２３６】母性血液から一旦分離された胎児細胞は、
本発明の適切な染色体-特異的染色試薬、好ましくは出
生前診断に特に重要なものでもって本発明の方法により
染色される。好ましい染色試薬は異数体、例えば染色体
タイプ21,18,13,XおよびYならびに第21染色体上のサブ
リジョン21q22のごときこれらの染色体上のサブリジョ
ンを含むいくつかの染色体の何れかの三染色体性、を検
出するように造られたものである。
【０２３７】好ましくは、本発明による染色分析のため
の胎児サンプルは少なくとも10個の細胞または核、更に
好ましくは約100個の細胞または核から成る。
【０２３８】VII.D. 腫瘍細胞遺伝学 近年の多数の研究は、特定の病気の表現型の診断に役立
ちまた病気それ自信の遺伝学的性質への手がかりを提供
する、構造的および数的染色体の異常の存在を明らかに
した。著名な例には、慢性骨髄性白血病と第9および第2
2染色体に伴う転座との密接な関連、13q14の部位の欠失
と網膜芽細胞腫との関連および第8および第14染色体に
伴う転座とバーキットリンパ腫との関連が含まれる。新
種の腫瘍の特異的異常を明らかにする今日の進歩は、細
胞遺伝学的分析のための代表的な高品質のバンデッド中
期スプレッドを造ることの困難性により制限されてい
る。これらの問題は、多くのヒト腫瘍は培養基中で増殖
させることが困難または不可能であるという事実に由来
する。従って、分裂細胞を得ることは普通は困難であ
る。たとえ細胞が培養基中で増殖できたとしても、増殖
する細胞が腫瘍集団を代表するものでないという少なか
らぬ危険がある。この困難性はまた存在する遺伝学的知
識を臨床的診断および予後に応用することを妨げる。
【０２３９】本発明はこれらの制限を、間期核内の特定
の構造的および数的異常の検出を可能にすることにより
克服する。これらの異常は上に述べたごとく検出され
る。全染色体プローブでのハイブリダイゼーションはこ
れまでは知られていなかった異常の同定を容易にし、こ
れにより異常と病気の表現型の間の新しい関連の速やか
な進展を可能にする。特定の悪性腫瘍の遺伝学的性質が
次第によく知られてきているので、遺伝学的障害を標的
とするハイブリダイゼーションプローブを選択すること
により、間期評価分析はますます具体的に行うことが出
来る。選択された染色体上の特定の転座は、ぴったりと
切断点を側面から攻撃するハイブリダイゼーションプロ
ーブの使用により検出できる。これらのプローブの使用
は特定の病気の表現型の診断を可能にする。これらは正
常では分離されているハイブリダイゼーションドメイン
を一緒にし、またはハイブリダイゼーションドメインを
２つのはっきり分離されたドメインに分離するので、転
座は間期において検出できる。これに加えて、これらは
治療の途中で悪性細胞の減少および再出現をフォローす
るために使用できる。このような応用では、存在するか
も知れない細胞が少数であり、またそれらは刺激して有
糸分裂させることが困難または不可能であるかも知れな
いので、間期分析が特に重要である。
【０２４０】重複および欠失、遺伝子増幅およびヘテロ
接合度がなくなることに伴うプロセスも、本発明の技法
を用いて中期および間期において検出できる。そのよう
なプロセスは異なる腫瘍の数の増大に関連している。
【０２４１】VIII. 慢性骨髄性白血病(CML)におけるBCR
-ABL融合の検出プローブ このセクションは、本質的に全てのCML患者において融
合BCR、ABL配列のわきに位置する第9及び第22染色体か
らのプローブを用いるFISHに基づくCML試験について詳
述する（図８）。このセクションの例において用いられ
たBCR、ABLプローブは、米国イリノイ州シカゴのユニバ
ーシティオブシカゴメディカルセンターの血液学／腫瘍
学セクション、デパートメントオブメディシンのカロル
エイ．ウエストブルックによって好意的に提供され
た。
【０２４２】第9染色体上のABLプローブ、c-hu-ABLは、
切断が起きるエキソンIBとIIの間のABLの200-kb領域に
テロメリックであるように選ばれた35-kbコスミド(pCV1
05)クローンである(24)。第22染色体上のBCRプローブ、
PEM12は、殆ど全てのCML切断点が起きるBCR遺伝子の5.8
-kb切断点クラスター領域の部分を含み、かつこれにセ
ントロメリックに延びる18-kbファージクローン(EMBL3
内)である。FISHはフルオロクロームテキサスレッドに
よって検出されるビオチン標識ABLプローブと、グリー
ンフルオロクロームFITCによって検出できるジゴキシゲ
ニン標識BCRプローブを用いて行われた。両プローブの
ハイブリダイゼーションは、二重バンド通過フィルター
セットの付いた蛍光顕微鏡（オメガオプティカル）を用
いて同時に観察することができた。
【０２４３】図８は、第22染色体上のBCR遺伝子、第9染
色体上のABL遺伝子、およびフィラデルフィア染色体上
のBCR-ABL融合遺伝子の略図であって、CML切断点の位置
とプローブに対する関係を示す。BCR遺伝子のエキソン
はソリッド枠で示す。ローマ数字IはBCR遺伝子の第1の
エクソンを示し、アラビア数字1-5は、破線で表した切
断点クラスター領域内のエクソンを示す。18kbファージ
PEM12プローブ(BCRプローブ)の概略の位置は、無地の水
平の棒によって示す。CMLにおける切断点の大部分はエ
キソン2と4との間で起きるので、PEM12に対する15kbま
たはそれ以上の標的がフィラデルフィア染色体上に残る
であろう。標準的相互転座においては、PEM12に対する
数kbの標的（検出できない蛍光シグナル）が派生染色体
上に見出されるであろう。マップとエクソンの番号付け
（尺度は別として）は、ハイスターカンプ等（前記文献
34）から改作した。
【０２４４】ABL遺伝子のエクソンは、無地の垂直の棒
で示す（尺度は別として）。ローマ数字Ia、Ibは択一的
に第1のエキソンを、IIは第2のエキソンを示す。エキソ
ンIIは28kbコスミドc-hu-abl(ABLプローブ)の末端の上
流約25kbにある。全てのCML切断点は、エキソンIIの上
流、通常はエキソンIbとIaの間で、長さ約200kbの領域
内で起きる。このため、c-hu-ablは、融合結合から常に
25から200kb離れているであろう。マップは（尺度は別
として）ハイスターカンプ等（前記文献35）から改作し
たBCR-ABL融合遺伝子が示されている。CMLにおいて、PE
M12は常に結合に位置するであろうが、c-hu-ablはPEM12
から25ないし225kb離れているであろう。
【０２４５】サンプル調製：CML-4：末梢血液を5分間遠
心分離した。界面の10滴をPBSで希釈し、攪拌し(spun d
own)、メタノール／アセティクアシッド(3:1)中で固定
し、スライド上に滴下した。CML-2,3,7：凝固を防ぐた
めにPBSで希釈した5ないし10滴の髄をメタノール／アセ
ティクアシッド中で固定し、スライド上に滴下した。CM
L-1,4,5,6：末梢血液および／または骨髄を、RPMI 1640
中で、10%のウシ胎児血清、抗生混合物(ゲンタマイシン
500mg/ml)および1%L-グルタミンを補って24時間培養し
た。培養は、J.J.ユニスおよび M.E.チャンドラー,Pro
g.in Clin.Path.,7:267(1977)に従ってシンクロナイズ
させ、これに続いてギビスおよびジャクソン,Karyogra
m,11:91(1985)に従って染色体調製を行った。
【０２４６】ハイブリダイゼーシヨンおよび検出プロト
コル．ハイブリダイゼーションは、D.ピンケル等(27),
トラスク等(25),および J.B.ローレンス等(30)によって
記載された手続きを修正して行った後に続いて実施し
た。BCRプローブは、平均して25%の組み込みを伴ったジ
ゴキシゲニン-11-dUTP(Boehringer Mannheim Biochemic
als)を用い、ニック-トランスレートされた(Bethesda R
esearch Laboratories Nick-Translation System)。ABL
プローブは、同様にビオチン-11-dUTP(Enzo Diagnostic
s)を用いてニック-トランスレートされた。
【０２４７】１．ハイブリダイゼーション．標的間期細
胞および／または中期スプレッドを、ガラススライド上
で72℃で70%ホルムアミド/2×SSC中にpH7で2分間変性す
る。エタノールシリーズ(70%,85%,100%各2分間)中で脱
水する。空気乾燥し、37℃(2×SSCは0.3M NaCl/30mMソ
ジゥムサイトレート)に置く。各プローブ2ng/ml,50%ホ
ルムアミド/2×SSC,10%デキストランサルフェート,およ
び1mg/mlヒトゲノムDNA(200-600 bpに音波処理)を含む
ハイブリダイゼーション混合物10 mlを70℃に5分間加熱
してDNAを変性する。30分間37℃でインキュベートす
る。温めたスライド上に置き、20mm×20mmのカバースリ
ップで覆い、ラバーセメントでシールし、湿潤室中で37
℃で一夜インキュベートする。カバースリップを取り除
き、3回20分間それぞれpH7,42℃の50%ホルムアミド/2×
SSCで、2回20分間それぞれ42℃の2×SSC で洗浄し、最
後に室温で4×SSCでリンスする。
【０２４８】２．結合したプローブの検出：全てのイン
キュベーションステップは、約100mlの溶液と共に室温
でカバースリツプの下で行う。ビオチン化されたABLプ
ローブが先ず検出され、次いでジゴキシゲニン-標識BCR
プローブが検出された。
【０２４９】ａ．ビオチン化ABLプローブ：4×SSC/1%ウ
シ血清アルブミン(BSA)により5分間プレブロックする。
テキサスレッド−アビジン(Vector LaboratoriesInc.,4
×SSC/1%BSA中2mg/ml)を45分間施す。4×SSCで一回、4
×SSC/1%トリトン-X100(Sigma)で、さらに再び4×SSCで
それぞれ5分間洗浄する。5分間PNM(脱脂ドライミルク5
%、ソジゥムアジド0.02%を含み、遠心分離により固形物
を除いたPN。PNは、0.1MNaH2PO4/0.1MNa2HPO4,0.05%NP4
0,pH8である)中でプレブロックする。ビオチン化された
ヤギ抗-アビジン(Vector Laboratories Inc.,PNM中5mg/
ml)を45分間施す。PNで2回5分間洗浄する。第2層目のテ
キサスレッド-アビジン(PNM中2mg/ml)を45分間施す。PN
で2回それぞれ5分間洗浄する。
【０２５０】ｂ．ジゴキシゲニン標識BCRプローブ：PNM
で5分間プレブロックする。ヒツジ抗-ジゴキシゲニン抗
体(D.Pepper,Boehringer Mannheim Biochemicals,India
napolis,INから入手;PNM中15.4mg/ml)を45分間施す。PN
で2回それぞれ5分間洗浄する。PNMで5分間プレブロック
する。FITCにより抱合されたウサギ-抗-ヒツジ抗体(Org
anon Teknika-Cappel,PNM中1:50)を45分間施す。2回そ
れぞれ5分間PNで洗浄する。必要により、シグナルは、5
分間PNMによりプレブロックし、かつFITCにより抱合さ
れたヒツジ抗-ウサギIgG抗体(Organon Teknika-Cappel,
PNM中1:50)を45分間施すことによって増幅される。PNで
リンスする。
【０２５１】３．可視化：スライドは、対比染色剤とし
て1mg/ml4',6-アミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を
含む蛍光アンチフェイド溶液[G.D.Johnson and J.G.Nog
ueria,J.Immunol.Methods,43:349(1981)(前記文献31)に
マウントされ、FITC/テキサス赤色二重バンド通過フィ
ルターセット(Omega Optical)を用い、ツァイスアキシ
オスコープにより検査される。
【０２５２】ここで試験したBCR-ABL PCRに対して用い
られた方法は、CML-3,4と7に対してはヘーゲウィッシュ
-ベッカー等によって記載され(前記文献32)、またCML-5
と6に対してはコーラー等によって記載された(前記文献
33)方法である。
【０２５３】結果．ABLおよびBCRハイブリダイゼーショ
ン座位は、たいていの中期スプレッド中の染色体の両染
色分体上に見られた。正常な個体からの中期スプレッド
と結合したABLプローブは、9qのテロメア近くにあるが
（図９Ａ）、BCRプローブは22q11において結合している
（図９Ｂ）。正常な間期核へのABLまたはBCRによるハイ
ブリダイゼーションは、典型的には両相同染色体上の標
的配列に対応した２つの小さな蛍光点を生じた。これら
の点は、二次元的核イメージ内に外見上ランダムに分布
しており、通常はよく分離していた。少数の細胞は、２
つのダブレットハイブリダイゼーションシグナルを示し
たが、これはたぶんDNAのこの領域を複製した細胞内の
両相同の両姉妹染色分体（すなわち細胞サイクルのS-ま
たはG2-フェイズにおけるそれら）へのハイブリダイゼ
ーションの結果であろう。正常なG1核へのABL(赤色)、B
CR(緑色)プローブの二重カラーFISHは、核の周囲にラン
ダムに分布した２つの赤色(ABL)および緑色(BCR)ハイブ
リダイゼーションシグナルを生じた。
【０２５４】CMLの遺伝子再配列は、図８に示すよう
に、異常染色体上、通常はPh1であるが、に共に、また
間期核内に共にプローブと相同なDNA配列を生じる。融
合遺伝子中のプローブ結合座位間のゲノム距離は、CML
患者間で変わるが、25ないし225kbの範囲であって、単
一の白血病クローンの全ての細胞において同一である。
間期CML細胞へのABL、BCRプローブによる二重カラーハ
イブリダイゼーションは、核内にランダムに位置する１
つの赤色と１つの緑色のハイブリダイゼーションシグナ
ルと、２色間の分離が１ミクロン以下である１つの赤色
-緑色ダブレットシグナル（または非常に近接したハイ
ブリダイゼーションに対する１つの黄色のハイブリダイ
ゼーションシグナル、図１０参照）を生じた。ランダム
に位置する赤色と緑色のシグナルは、正常染色体上のAB
L、BCR遺伝子へのハイブリダイゼーションに、また赤色
-緑色ダブレットシグナルはBCR-ABL融合遺伝子へのハイ
ブリダイゼーションに起因する。間期マッピングの研究
は、分離が250kb以下のDNA配列は間期核においては１ミ
クロン以下の分離でなければならないことを示唆する(2
5)。結果として、１ミクロン以上分離した赤色と緑色の
ハイブリダイゼーションシグナルを示す細胞は、正常で
あると評価された、というのはこのことはハイブリダイ
ゼーション座位が異なった染色体上にあることと合致す
るからである。しかしながら、統計的考察によれば、正
常細胞のなかには、異常と評価されるのに十分なほど互
いに近接した赤色と緑色の点を示すものがあるであろ
う。この二次元的核分析においては、750個の正常核中
の9個が互いに１ミクロン以下の分離の赤色と緑色のハ
イブリダイゼーションシグナルを示した。かくして、正
常細胞の約１％が異常として分類された。
【０２５５】［表３］は、６人のCML患者からの７個の
サンプルに対するハイブリダイゼーションの結果を、慣
用のカリオタイプおよびその他の診断結果（PCRおよび
サザンブロットデータ）と共に示す。６人の患者全て
が、そのなかには バンド分析によってPh1陰性であるこ
とが見いだされた３人（CML-5,-6および-7）が含まれる
が、検査された核の50%以上において分離が１ミクロン
以下の赤色-緑色のハイブリダイゼーションシグナルを
示した。多くは、融合事象が殆ど全ての細胞で見られ
た。１患者（CML-7）では、PCR分析は融合遺伝子の存在
の検出に失敗し、またバンド分析はフィラデルフィア染
色体を現出しなかったにもかかわず、殆ど全ての細胞に
融合シグナルを示した。
【０２５６】
【表３】
【０２５７】中期スプレッドへのハイブリダイゼーショ
ンは３人の患者（CML-1,-5および-6）について行った。
これら全ては、単一の末端動原体型染色体上にごく近接
した赤色と緑色のハイブリダイゼーションシグナルを示
した。２人の患者において、バンディングによってt(9:
22)(q34;q11)と定められたが、Ph1に対して予期された
ように、その赤色-緑色の対は小さな末端動原体型染色
体の長い腕のテロメアにごく近接していた（図９Ｃ）。
１人の患者（CML-6）は、古典的細胞遺伝学によって、2
2q11に染色体物質の挿入を有すると考えられた。この患
者からの中期スプレッドへの二重カラーハイブリダイゼ
ーションは、小さな染色体内に中心的に位置する赤色−
緑色の対を示した（図９Ｄ）。この結果は、挿入による
BCR-ABL融合遺伝子の形成と合致する。１人の患者（CML
-1）では、２対の赤色-緑色ダブレットシグナルが150個
中3個(2%)の間期核において見られた。これは、これら
の細胞中のダブルPh1（またはダブル融合遺伝子）を示
す。このような事象は、25の中期スプレッドの分析に限
定されていた標準的細胞遺伝学によっては検出されなか
った。付加的Ph1の取得は、芽球化に伴う最も頻度の高
い細胞遺伝学的事象であつて、その細胞遺伝学的検出に
よつて、疾患の加速を予告することができるであろう。
【０２５８】CML派生細胞系K-562の中期スプレッドへの
ABL、BCRプローブの同時ハイブリダイゼーションは、単
一の末端動原体型染色体の両腕に沿って多くの赤色-緑
色ハイブリダイゼーション座位を示した。間期核へのハ
イブリダイゼーションは、赤色と緑色のシグナルが核の
同一領域に局限されていることを示した。このことは、
そのらが単一の染色体上に局限されていることと合致す
る。12から15 のハイブリダイゼーション対が各核に見
られたが、これはBCR-ABL融合遺伝子の対応した増幅を
示す（第９Ｅ、９Ｆ図参照）。これらの発見は、この細
胞系における融合遺伝子の増幅を示す前のサザンブロッ
トデータと合致する(26)。
【０２５９】要約すれば、7例のCML、4例の正常細胞サ
ンプルに対してABL、BCR プローブを用い二重カラーFIS
H を使用する間期細胞の分析は、CMLの日常的診断とこ
の疾患の臨床的監視に対するこのアプローチの有用性を
示唆する。その非常に重要な利点の１つは、個々の間期
または中期細胞から24時間以内に遺伝子情報が得られる
という能力である。かくして、これは１つの集団の全細
胞に適用でき、偶然にまたは培養により、たまたま中期
にある細胞に限らない。さらに、遺伝子型分析は、形態
学または他のマーカーによつて判断されるように、細胞
表現型と関連させることができ、これによってCML遺伝
子型をもつ細胞の血統的特異性の研究と、異常をもつ細
胞の頻度の評価とを共に可能にする。 正常細胞の二次
元イメージにおける赤色と緑色のシグナルのランダムな
並置は、正常細胞のうち約0.01において起きるが、低頻
度の検出限界を示す。この検出限界は、コンピュータ化
したイメージ分析を用い、各核内のハイブリダイゼーシ
ョンシグナルの分離と強度のより完全な定量的測定をす
ることによって低めることができる。このような分析
は、細胞が低頻度にBCR-ABL融合をもつ（例えば軽快化
中、骨髄移植後、再発中またはモデルシステムにおい
て）患者集団の研究において特に重要であろう。
【０２６０】また、この試験は、少数の細胞しか必要と
しないので、分析のために利用できる細胞の数が少ない
場合、治療中にCML細胞の検出に対して有利であるべき
である。最後に、ハイブリダイゼーションスポットをた
だ数えるだけで、K562細胞系に対して示したように（図
９Ｅ）、BCR-ABL融合遺伝子の増幅の検出と定量を可能
にする。蛍光強度の定量的測定はこの分析の助けになる
であろう。
【０２６１】IX. 一重鎖核酸プローブを調製してこれを
二重鎖標的DNAに適用する方法 一般に一重鎖DNAハイブリダイゼーションプローブを調
製してこれを二重鎖標的DNAに適用する方法は、標的DNA
とプローブDNAの両方を同一の制限エンドヌクレアーゼ
で処理することとこれに続く制限切断端付近での一重鎖
のダイジェスションを含んでいる。プローブはダイジェ
ストされた一重鎖を標識されたヌクレオチドで再合成す
ることにより構成される。標識された鎖は標的DNAのダ
イジェストされていない一重鎖と本質的に相補的であ
る。標識された一重鎖を含む二重鎖DNA断片はより小さ
いピースに切断されて変性される。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは標識された一重鎖断片を標識されていな
い断片から分離することにより得られる。
【０２６２】プローブで使用すべきDNAは、制限エンド
ヌクレアーゼで処理されて「付着」端を有する制限断片
に構成される。すなわち、制限エンドヌクレアーゼが二
重鎖DNAを通して付着切断端を造ることは重要である。
適当な制限エンドヌクレアーゼはHind III,Bam H1,Eco
R1または類似物を含むがこれらに限定されるものではな
く、これらは全て商業的に入手可能［例えばPromega Bi
otec(Madison,WI)またはBoehringer Mannheim(Indianap
olis,IN)］である。制限エンドヌクレアーゼを選択する
際には、結果として生じる制限断片が利用できるクロー
ニングベクターに直接挿入できるサイズ範囲内となるよ
うにすることが好ましい。適当なクローニングベクター
は、pBR322のごときプラスミドおよびラムダファージの
ごときファージ、これら両方からの商業的に入手可能な
種々の派生物［例えばPromega Biotec(Madison,WI)およ
びBoehringer Manheim(Indianapolis,IN)］を含んでい
た。制限断片の増幅されたコピーは標準的技法［例えば
Maniatis et al.,Molecular Cloning: ALaboratory Man
ual(Cold Spring Harbor Laboratory,1982)］を使用し
て分離される。あるいはまた、ある応用では制限断片は
存在する研究所から得られる。例えば、アメリカン タ
イプ カルチャー コレクション(the AmericanType Cult
ure Collection,Rockville,MD)は、誰でも利用できる、
制限断片のヒト染色体-特異的ライブラリーのコレクシ
ョンを備えている。
【０２６３】標準的技法に続いて、エキソヌクレアーゼ
での制限断片の処理、および標識された前駆体の存在の
もとでダイジェストされた鎖を酵素的に再-合成するこ
とがなされる。特にジェームズおよびレファックにより
開示された技法［James andJeffak,Anal.Biochem.,Vol.
141,pp33-37(1984)］が続いてなされる。よって、この
文献は参考文献として取り入れられる。簡単に言えば、
制限断片に対しDNA 1マイクログラム当たり約3ユニット
のエキソヌクレアーゼIIIが、100mMのNaCl,50mMのトリ
ス-HCl(pH8.0),10mMのMgCl2および1mMのジチオトレイト
ールよりなる37℃の溶液中で加えられる。ダイジェスシ
ョンはサンプルを60℃で5-10分加熱することにより終了
される。ジェームズおよびレファックは、これらの条件
は毎分当たり約80-200のヌクレオチドのダイジェスショ
ンという結果になると報告している。実際のダイジェス
ションの率は、DNA基質の源と同様にエキソヌクレアー
ゼIIIの源およびバッチにより変化する（例えばGuo et
al.,Nucl.Acids Res.,Vol.10 pg.2065）。所望の長さの
標識された鎖を得るには多少の実験が必要かも知れな
い。エキソヌクレアーゼIIIは商業的に入手可能［例え
ば、Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)またはProm
ega Biotec(Madison,WI)］である。また、T4ポリメラー
ゼ(BRL,Bethesda,MD)もエキソヌクレアーゼおよび再合
成ステップの両方のために使用できる。
【０２６４】エキソヌクレアーゼで処理された制限断片
は、標識された前駆体の存在のもとでダイジェストされ
た鎖を再-合成するDNAポリメラーゼのためのプライマー
／鋳型として役にたつ。好ましい標識された前駆体は、
チミジンの代替物としてのビオチン化されたウラシルで
ある。再-合成はDNAポリメラーゼIまたはT4 DNA ポリメ
ラーゼを使用して、ランガー等の手法［Langer et al.,
Proc.Nat'l.Acad.Sci.,Vol.78,pp.6633-6637(1981)］に
従ってなされ、この手法はリグビー等［Rigbyet al.,J.
Mol.Biol.,Vol.113,pg.237(19779］により開示された基
本的ニックトランスレーション技法の改作物である［例
えばDNA 1マイクログラム当たり1ユニットのＥ.コリポ
リメラーゼIが、100mMのNaCl,50mMのトリス-HCl(pH8.
0),10mMのMgCl2,1mMのジチオトレイトールおよび50mMの
KClからなる溶液中で37℃でインキュベートされる］。
また溶液の中には適切な量のトリフォスフェート前駆体
（そのひとつまたはそれ以上は標識されている）も含ま
れている（例えば各50-100マイクロモル濃度のものを、
制限断片1ミリリットル当たり20-50マイクログラム）。
これらの条件のもとで、再合成は約40-60分で終わる。
【０２６５】標識された制限断片は、標識された制限断
片の各端の標識された領域が確実に分離されるようにす
るために、より小さい断片に切断される。（さもなけれ
ば、一端の標識された断片は、他端の標識された断片に
対する相補的領域を含んだ一重鎖DNAのより大きいピー
スの一部であるかも知れない。）このようなより小さい
断片への切断は標準的技法、例えば音波処理、酵素処理
または同様なものの一つ［Maniatis et al.,Molecular
Cloning: ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab
ora-tory,1982)］によりなされる。
【０２６６】標識された制限断片はより小さいピースに
適切に切断された後、変性されて一重鎖の標識された断
片は標識されない断片から分離される。分離はいくつか
の方法でできる。好ましい標識、ビオチンが使用される
ときは、好ましい分離方法は標準的なアビジンアフィニ
ティカラムによるものである［例えばBayer and Wilche
k,「The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool
in MolecularBiology」,Methods of Biochemical Anal
ysis,Vol.26,pp.1-45(1980)およびManning etal.,Bioch
emistry,Vol.16,pp.1364-1370(1977)］。アビジンは、
ガラス，セファロース，アガロースその他同種類のもの
のごとき多数の異なる基質に、上記文献に記載されたご
とき標準的技法で共有結合される。よって、マンニング
等およびバイヤーとウイルチェックの9-16頁は参考文献
として取り入れられる。アビジンアフィニティカラムも
商業的に入手可能［例えば、Zymed Laboratories,Inc.
(South San Francisco,CA)］である。ビオチン化された
プローブは、チョレットおよびカワシマ［Chollet and
Kawashima,Nucleic Acids Resources,Vol.5,pp.1529-15
41(1985)］の手法に従ってアビジンカラムから除去され
る。
【０２６７】前記標識手法の代替手段が可能である。例
えば、プローブに使用されるDNAが制限エンドヌクレア
ーゼで処理された後、結果として生じた制限断片は２つ
の部分に分離される。第１の部分は上に述べた処理を受
ける。すなわち、DNAの標識された鎖を再合成するため
の鋳型／プライマーを形成するためにエキソヌクレアー
ゼで処理される。結果として再合成された制限断片は、
それから上述のごとくより小さいピースに切断される。
この場合の標識は、ビオチンである必要はない。例えば
放射性の標識も使用できる。第２の部分もエキソヌクレ
アーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼIIIで処理され
る。しかしながら反応は、各制限断片が親の鎖の長さの
およそ半分の２つの非相補的一重鎖ピースに変えられる
ように完了まで進むようにされる。結果として生じるこ
れらの一重鎖は、それから標準的技法［例えばManiatis
et al;MolecularCloning: A Laboratory Manual(Cold
Spring Harbor Laboratory,1982)pp.335-339およびAlwi
ne et al.,Method in Enzymology,Vol.68,pp.220-242(A
cademic Press,New York,1979)］を使用してDBMペーパ
ー(DBM paper)に共有結合される。よって、これらの文
献の引用頁は参考文献として取り入れられる。第１の部
分の断片は変性されて、共有結合された第２の部分の断
片を含むDBMペーパーと結合される。条件は、DBMペーパ
ーに共有結合された相補的鎖に対し標識された鎖のハイ
ブリダイゼーションを可能にするように調整される。第
１の部分からの標識されない鎖はペーパーから洗浄され
る（それらがハイブリダイズすべき相補的鎖はない）。
洗浄の後標識された鎖は、例えば加熱により除去され、
使用できる状態になる。
【０２６８】標的DNAにプローブを適用する前に、標的D
NAはプローブを構成するのに使用されたと同じ制限エン
ドヌクレアーゼで処理される。制限エンドヌクレアーゼ
処理の後に、標的DNAはエキソヌクレアーゼ、好ましく
はエキソヌクレアーゼIIIまたはT4ポリメラーゼで処理
される。好ましくは、エキソヌクレアーゼ処理の条件
は、造られた一重鎖領域の長さがプローブDNAの長さと
本質的に同じになるように調整される。
【０２６９】標的DNAに対するプローブのハイブリダイ
ゼーションは、標準的手法［例えばGall and Pardue,Me
thods in Enzymology,Vol.21,pp.270-480(1981);Hender
son,International Review of Cytology,Vol.76,pp.1-4
6(1982)およびAngerer et al.,in Genetic Engineerin
g:Principles and Methods,Setlow and Hollaender,Ed
s.,Vol.7,pp.43-65(Plenum Press,New York,1985)］を
使用してなされる。よって、これらの文献は、インシト
ゥハイブリダイゼーションにおける本発明の実施の指針
として参考に取り入れられる。簡単に言えば、本発明に
従って調製されたプローブは、非特異的結合の減少、プ
ローブされる生物学的構造の無欠性の維持その他ため
に、いくつかの他の薬剤と組み合わされる。結果として
生じる混合物は、ここではハイブリダイゼーション混合
物と呼ぶ。以下に、この方法はヒト第21染色体の染色体
-特異的染色に適用される。
【０２７０】ヒト第21染色体のHind III制限断片は、ア
メリカン タイプ カルチャー コレクション(Rockville,
MD)を通じてナショナル ラボラトリー ジーン ライブラ
リー プロジェクトから入手可能［Van Dilla et al.,
「Human Chromosome-Specific DNA Libraries:Construc
tion and Availability」,Biotechnology,Vol.4,pp.537
-552(1986)］である。代わりに、そのような断片は上に
引用したファンディラ等、またはフスコー等［Fuscoe e
t al.,「Construction of Fifteen Human Chromosome-S
pecific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosom
es」, Cytogenet Cell Genet.,43:79-86(1986)］の開示
に従って造ることもできる。
【０２７１】非反復配列インサートを有するライブラリ
ーからのクローンはベントンおよびデービスの方法［Be
nton and Davis,Science,Vol.196,pp.180-182(1977)］
により分離される。簡単に言えば、約1000の組変えファ
ージが第21染色体-特異的ライブラリーからランダムに
分離される。これらはニトロセルロースに移されてニッ
クトランスレートされた全ゲノムヒトDNAでプローブさ
れる。
【０２７２】強いハイブリダイゼーションを示さないク
ローンのうち、明白な非反復配列DNAを含むおよそ300が
抽出される。選択されたクローンが増幅された後、各ク
ローン中の第21染色体インサートは32P標識されて、第2
1染色体ライブラリーを構成するのに使われたと同じ酵
素すなわちHind IIIでダイジェストされたヒトゲノムDN
Aのサザンブロット(Suothern blots)にハイブリダイズ
される。クローンを含む非反復配列はサザン分析の間に
単一のバンドを生じるものとして認識される。およそ10
0のこのようなクローンがプローブDNAの不均一な混合物
に対して選択される。非反復配列クローンは増幅され、
インサートはHind IIIダイジェスションにより除去され
て、インサートはゲル電気泳動によりファージアーム(p
hage arms)から分離される。プローブDNA断片（すなわ
ち非反復配列インサート）はゲルから除去されて上述の
ようにエキソヌクレアーゼIIIで処理され、続いてビオ
チン化されたUTP前駆体の存在のもとに再合成される。
結果として生じる二重鎖断片は各断片が平均して約1.5-
2.0の切断を受けるように音波処理される。結果として
生じたピースは変性され、ビオチン化された断片は上述
のようにアビジンアフィニティクロマトグラフィにより
分離される。
【０２７３】ヒトリンパ細胞染色体はハーパー等［Harp
er et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,Vol.78,pp.4458-4460
(1981)］に従って調製される。中期および間期の細胞は
燐酸緩衝溶液内で３回洗浄され、メタノール-アセティ
ックアシッド(3:1)中で固定され、清潔にされた顕微鏡
スライド上に落された。スライドは-20℃で窒素雰囲気
中に貯えられる。
【０２７４】間期の細胞および／または中期のスプレッ
ドを載せたスライドは窒素から取り出され、RNアーゼで
処理(100μg/ml,37℃で1時間)され、37℃のHind III(10
ユニットM 10mMトリス-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl2およ
び14mMジチオエリトリトール，Ph7.6)で約1-16時間処理
され、上述のようにエキソヌクレアーゼIIIで処理され
て、エタノールシリーズ中で脱水される。それからプロ
テイナーゼKで処理(60ng/ml,37℃で7.5時間)されて脱水
される。プロテイナーゼKの濃度は、細胞の型と酵素の
ロットに基づいて、染色体の位相顕微鏡による像が乾燥
したスライド上に殆ど残らないように調整される。ハイ
ブリダイゼーション混合物は（最終濃度で）、2×SSC
(0.15M NaClおよび0.015Mソジウムナイトレート)、10%
のデキストランサルフェート、500μg/mlのキャリヤDNA
（音波処理されたニシン精子DNA）および2.0μg/mlのビ
オチン-標識されたプローブDNAからなっている。この混
合物はガラスのカバースリップの下に3μl/cm2の密度で
スライドに適用されてラバーセメントでシールされる。
37℃で一晩のインキュベーションの後、スライドは45℃
で洗浄（50%ホルムアミド-2×SSC pH7,3回3分、続いて2
×SSC pH7,5回2分）されて、BN緩衝液(0.1Mソジウムビ
カーボネート,0.05%NP-40,pH8)に浸される。この時点以
後、スライドは決して乾燥させてはならない。
【０２７５】スライドはBN緩衝液から取り出されて、室
温で5分間、5%の脱脂粉乳(Carnation)および0.02%のソ
ジウムアジド（プラスチック製カバースリップの下で5
μl/cm 2）でブロックされる。カバースリップは取り除
かれ、余分の液体は手早く排出されて、フルオレセイン
-アビジンDCS(5%の粉乳と0.02%のソジウムアジドを有す
るBN緩衝液内で3μg/ml)が加えられる(5μl/cm2)。同カ
バースリップは戻されてスライドは37℃で20分間インキ
ュベートされる。それからスライドは3回2分間、それぞ
れ45℃のBN緩衝液内で洗浄される。ビオチン-結合され
たフルオレセインの強さは、ビオチン化されたヤギ抗-
アビジン抗体(5%のヤギ血清と0.02%のソジウムアジドを
を有するBN緩衝液内で5μg/ml)の層を加え、続いて上記
と同様に洗浄した後、フルオレセイン-アビジンDCSの別
の層を加えることにより増幅される。フルオレセイン-
アビジンDCS、ヤギ抗アビジンおよびヤギ血清は全て商
業的に入手可能［例えばVector Laboratories(Burlinga
me,CA)］である。BN内での洗浄後、蛍光抗フェード液、
p-フェニレンジアミン(カバースリップに関し1.5μl/cm
2)が観察の前に加えられる。最適の顕微鏡像を得るには
この層を薄く保持することが重要である。この抗フェー
ド液はフルオレセインの減退を大幅に減少させて5分間
までの連続した顕微鏡観察を可能にする。この抗フェー
ド液には、DNA対比染色剤(DAPIまたはプロピジウム ア
イオダイド)が0.25-0.5μg/mlで含まれている。
【０２７６】赤い蛍光を発するDNA-特異的染料プロピジ
ウムアイオダイド(PI)は、ハイブリダイズされたプロー
ブと全DNAを同時に観察することを可能にするために使
用される。フルオレセインおよびPIは450-490nm（Zeiss
filter combination 487709）で励起される。励起波長
を546nm（Zeiss filter combination 487715）に増大す
ればPIのみの観察を可能にする。DAPI、紫外線（Zeiss
filter combination 487701）で励起される青い蛍光のD
NA-特異的染色剤は、ビオチン-標識されたものと全DNA
が別々に観測される場合に対比染色剤として使用され
る。中期第21染色体は染色体の本体上に散らばるランダ
ムに位置する黄色のスポットにより検出される。
【０２７７】
【付言】本発明の以上の実施例の記述は例証および説明
の目的で提示された。それらは網羅的であるとか、また
は本発明を開示されたまさにその形態に限定することを
意図するものではなく、上記教示に照らして明らかに多
くの変更や変形が可能である。実施例は本発明の原理と
実際の適用を最もよく説明し、これによりこの技術に熟
練した他の者が本発明を種々の実施例でまた期待される
特定の用途適合した種々の変更と共に最もよく利用する
ことが可能となるようにするために、選ばれ記述され
た。ここに添付する特許請求の範囲により本発明の技術
的範を定義することが意図されている。
【０２７８】ここに引用された全ての文献は参考文献と
して取り入れられる。
【０２７９】アメリカ合衆国政府は、同国エネルギー省
とユニバーシティ オブ カリフォルニアとの間の、ロ
ーレンスリバーモアナショナルラボラトリーの運営のた
めの契約書第W-7405-ENG-48号に従って、本発明におけ
る権利を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 蛍光顕微鏡に取り付けたTVカメラを用いて
得られたヒト中期スプレッドにおけるDAPI染色のバイナ
リーイメージである。DAPI可視化のために適当なフィル
ターを用いた。イメージのコンピュータ処理により、選
ばれたしきい値強度以上の全ての部分は白く、残りは黒
く示された。
【図１Ｂ】 図１Ａと同一のヒト中期スプレッドのFITC
染色のバイナリーイメージである。このイメージは、図
１Ａと同様に処理されたが、顕微鏡のフィルターを変え
たので、プローブに付けたFITCがDAPIよりもよく見え
る。
【図１Ｃ】 第21染色体のみのバイナリーイメージであ
って、図１Ｂのバイナリーイメージ上の非特異的染色対
象物（これらはより小さい）は、標準イメージ処理技術
によって除いた。
【図２Ａ】 ヒト中期スプレッドにおけるDAPI染色のカ
ラー写真であって、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃのコンピュ
ータ処理により生じたバイナリーイメージに示されたス
プレッドと同時に準備されハイブリダイズされたもので
ある。
【図２Ｂ】 図２Ａに示すものと同一のヒト中期スプレ
ッドにおけるDNAプローブに付けたフルオレセインのカ
ラー写真である。これは、DAPIよりもフルオレセインを
エキサイトするために、蛍光顕微鏡のフィルターを変え
ることによって得らこれた。この写真は、図１Ｂのバイ
ナリーイメージと比較できる。
【図３】 図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃおよび図２Ａ、図２
Ｂに示すスプレッドと同時に準備しハイブリダイズした
ヒト中期スプレッドの写真である。用いられた手法は、
全染色体を染色するためにDAPIの代わりにPI（プロピジ
ゥムアイオダイド、propidium iodide）を用いる以外は
同一であつた。PIとフルオレセイン染色の両者は同一の
顕微鏡フィルターで見ることができる。カラーフィルム
を用いたのは、カラーフィルム上でプロピジゥムアイオ
ダイド対比染色剤は赤色で現れ、プローブのフルオレセ
インは黄色で現れるからである。
【図４Ａ】 ブルースクライブプラスミドにおける第4
染色体-特異的ライブラリー（ライブラリー pBS-4）の
ヒト中期スプレッドへのハイブリダイゼーションを示す
が、標識しないヒトゲノムDNAは用いず、かつハイブリ
ダイゼーション混合物は変性後すぐに施用した。第４染
色体の両方のコピーは、他の染色体より僅かによく輝い
て見える。小さな矢は、プローブによって非染色の領域
を示す。図３および以下の残りの図のように、PIは対比
染色剤であり、フルオレセインはプローブを標識するた
めに用いる。
【図４Ｂ】 ヒト中期スプレッドへのpBS-4のハイブリ
ダイゼーションを示すが、標識しないヒトゲノムDNAが
ハイブリダイゼーションの間に用いられた（ゲノムDNA
に関しQ=2、Qの意味は後に説明する）。定量的イメージ
分析は、第4染色体の単位長さ当りの強度が他の染色体
のそれの約20Xであることを示す。第4染色体は黄色であ
り、他の染色体はプロピジゥムアイオダイドのために赤
色である。２層のアビジン-フルオレセインイソチオサ
イアネートが、正確に測定するために、標的染色体を十
分に輝かせる目的で用いられた。しかし、第4染色体
は、単一の層を施した後に容易に認識できる。
【図４Ｃ】 図４Ｂと同一のスプレッドを示すが、フル
オレセインイソチオサイアネート蛍光のみを通過させる
フィルターを通したものである。
【図４Ｄ】 pBS-4特異的ライブラリーを用いたヒト中
期スプレッド中に第4染色体を含む放射-誘発転座（矢
印）の検出を示す。コントラスト比は約5Xである。
【図４Ｅ】 正常染色体と、第4および第11染色体の間
の（細胞系RS4;11において）転座の結果である２つの派
生染色体が、本発明の組成物と方法によって間期核中に
検出できることを示す。これらは、３つの別個のドメイ
ンのように見える。
【図４Ｆ】 ブルースクライブプラスミド中における第
21染色体-特異的ライブラリー（ライブラリー pBS-21）
の、トリソミー21細胞系の中期スプレッドへのハイブリ
ダイゼーションを示す。少量のハイブリダイゼーション
が、他の末端動原体型染色体の動原体の近くに見える。
【図４Ｇ】 図４Ｆと同様のハイブリダイゼーションで
あるが、間期核を用いるものを示す。３つの第21染色体
ドメインが明かに示されている。
【図４Ｈ】 第4染色体からの120のシングルコピープロ
ーブのプールを用いた、ヒト中期スプレッドへのハイブ
リダイゼーションを示す。第4染色体が矢印によって示
されている。
【図５】 ヒトDNAの580kbインサートを含む酵母人工染
色体(YAC)クローンの、ヒト中期スプレッドへのハイブ
リダイゼーションを示す。各染色体第12上(12q21.1にお
いて)の黄色のフルオレセインバンドが、プロピジゥム
アイオダイド対比染色剤に対比して見える。
【図６】 ヒト第19染色体の１つのコピーを含むヒト／
ハムスターハイブリッド細胞からのDNAの、ヒト中期ス
プレッドへのハイブリダイゼーションを示す。写真の中
心から少し右寄りに、スプレッド中の他の染色体より輝
いている２つの第19染色体がある。
【図７】 本発明のプローブを作るためにポリメラーゼ
鎖反応(PCR)を用いる代表的な方法を示し、このプロー
ブは反復配列が減少している。
【図８】 正常な、またCMLの中期および間期核の両方
におけるCML切断点および対応した染色パターンへのプ
ローブの位置付けを示す。左側は、第22染色体上のBCR
遺伝子、第9染色体のABL遺伝子、およびフィラデルフィ
ア染色体上のBCR-ABL融合遺伝子の図式的表示である。
また、CML切断点の位置とプローブに対するそれらの関
係も示されている(32)。右は、c-hu-ABLおよびPEM12プ
ローブに対して期待される、正常な、またCMLの中期ス
プレッドおよび間期核へのハイブリダイゼーションパタ
ーンを示す。
【図９Ａ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。正常な中
期スプレッドへのABLのハイブリダイゼーションを示
す。ABLシグナルは9qのテロメア部分に局限されてい
る。
【図９Ｂ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。正常な中
期スプレッドへのBCRのハイブリダイゼーションを示
す。BCRシグナルは22qの動原体近くに局限されている。
【図９Ｃ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。46XY,t
(9:22)(q34;q11)を伴ったCML患者において、abl染色が
フィラデルフィア染色体のテロメア領域に局限されてい
ることを示す。
【図９Ｄ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。46XYins
(22:9)(q11;q34)を伴ったCML患者において、挿入的事象
から生じた派生第22染色体上に、abl染色が間質的にあ
ることを示す。
【図９Ｅ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。K562細胞
系が間期核の領域に局限された多数のシグナルを示して
いることを表している。同一の染色パターンが、BCR-AB
L融合遺伝子増幅を示すBCR プローブに伴って見られ
た。
【図９Ｆ】 中期スプレッドと間期核における蛍光イン
シトゥハイブリダイゼーション(FISH)を示す。単一の染
色体へ局限された融合遺伝子増幅を示すK562細胞系から
の中期スプレッドを示す。
【図１０】 二重バンド通過フィルターを通して同時に
可視化されたABL（赤色）およびBCR（緑色）プローブに
よるCML間期核における蛍光インシトゥハイブリダイゼ
ーションを示す。CML患者からの細胞は、BCR-ABL融合遺
伝子へのハイブリダイゼーションに起因する赤色-緑色
（黄色）シグナルと、第22および第9染色体上の正常なB
CR、ABL 遺伝子への単一な赤色および緑色ハイブリダイ
ゼーションシグナルとを示している。
【図１１Ａ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クションは、染色体全体を染色するプローブの使用を示
す。このようなプローブは、その染色体に沿ってどこか
で起きる転座を検出するために用いることができる。図
１２の写真は、転座を検出するために第22染色体に対す
るこの染色の使用を示すが、この患者においてはCMLに
伴って起きているものである。染色のこのようなアプロ
ーチは、染色される核の領域が比較的に大きいので、間
期核においては非常に有効であるとはいえず、染色され
た領域における重複は多くの核において解釈を難しくす
る。
【図１１Ｂ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クシヨンは、図１１Ａで示された染色体の染色領域の切
断点近傍の領域への縮小を示し、その領域における事象
に焦点を合わせた情報を提供する。染色パターンは、切
断点間にわたって連続または不連続であり、このためあ
る結合は切断点の両側にある。このような染色パターン
は、ただ１つの「色」のみを必要とするが、他のどのよ
うなゲノム領域が組み換え(exchange)に含まれるかにつ
いては何ら情報を与えない。
【図１１Ｃ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クションは、再配列の結果として共に生じた配列と結合
して、中期、間期の細胞中の検出を可能にするプローブ
の使用を示す。この場合には、異なった配列は異なった
「色」で染色される。このような染色パターンは、この
出願のセクションVIIIの例において使用されるものであ
る。
【図１１Ｄ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クションは、再配列に含まれる両切断点の両側の染色を
含むことによって、図１１Ｃの延長を示す。示したよう
に、異なった「色」が使用される。より複雑な染色パタ
ーンによって供給される追加の情報は、核の解釈の助け
となる。また、そこでの議論のように明白な挿入事象の
認識も可能となる。
【図１１Ｅ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クションは、染色体の１つの相同体における挿入の検出
を示す。
【図１１Ｆ】 構造的異常検出のための典型的なプロー
ブ戦略における染色体の染色パターンを示す。図示のセ
クションは、欠失の検出に有用な染色パターンを示す。
欠失は、欠失領域のみを染色するプローブによっても検
出できるが、プローブ結合の欠如は、標的配列の欠失以
外の理由によるかもしれない。わきに位置する異なった
「色」に染色された領域は、ハイブリダイゼーションに
対する対照としての役目をする。
【図１２】 染色体全体を染色することによる再配列を
検出するための染色パターンを示すが、この場合にはCM
Lと関連した第22染色体の再配列である。この図の中期
スプレッドは、ずっと第22染色体に沿って結合したプロ
ーブによって染色されたCML細胞からのものである。プ
ローブ-染色された領域は黄色に見える。DNAの残りは赤
色-蛍光化学染色プロピジゥムアイオダイドによって染
色された。全く黄色の染色体は、第22染色体の正常なコ
ピーである。この正常第22染色体のちょうど下にフィラ
デルフィア染色体、小さな一部黄色で一部赤色の染色体
がある。このフィラデルフィア染色体の下右に、第22染
色体（黄色）の遠位部分の付いた異常第9染色体（赤
色）がある。この図の写真は、図１１Ａに示した染色パ
ターンを表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ジョー ダブリュ． グレイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94550 リバーモア ロミタス 1760 (72)発明者 ダニエル ピンケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94595 ウォルナット クリーク マンザ ニタコート 31 (72)発明者 ダグラス トカチュク アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94550 リバーモア シェリーストリート 540 Ｆターム(参考） 2G045 BA14 BB14 BB24 BB46 BB50 BB51 CB01 DA13 FA16 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 CA03 CA09 HA14 4B063 QA12 QA19 QQ04 QQ58 QR56 QS34

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】急性リンパ性白血病(ALL)に特徴的な遺伝
    子再配列を有すると疑わしい標的染色体物質における前
    記疑わしい遺伝子再配列を含む領域の座位に各々が相補
    的である標識された核酸断片の不均一混合物からなり、
    前記標的染色体物質にハイブリダイズさせることによ
    り、前記各遺伝子再配列をそれぞれ識別して検出するこ
    とを可能とする標的染色体物質の染色に使用する核酸プ
    ローブ。
  2. 【請求項２】高度コンプレキシティ核酸プローブでイン
    シトゥ ハイブリダイゼーションを行うことからなり、
    ゲノムにおける比較的近接するプロキシミイティ(close
    proximity)に生じる疑わしい遺伝子再配列を識別する
    方法であって、同プローブは疑わしい遺伝子再配列を含
    む領域における核酸配列に実質的に相同である配列を含
    む識別方法。
  3. 【請求項３】請求項２に記載の方法において、前記疑わ
    しい遺伝子再配列がCMLまたはALLに関連することを特徴
    とする識別方法。。
  4. 【請求項４】高度コンプレッキシティ核酸プローブのイ
    ンシトゥ ハイブリダイゼーションからなる隣接する遺
    伝子症候群を検出する方法であり、同プローブは隣接す
    る遺伝子症候群の１または複数の成分の特性を示す核酸
    配列に実質的に相同である配列からなる検出方法。
  5. 【請求項５】請求項４に記載の検出方法において、前記
    隣接遺伝子症候群はダウン症候群であることを特徴とす
    る検出方法。
  6. 【請求項６】細胞遺伝学的には類似するが遺伝学的には
    相違する疾病に関連する切断点間に部分的または全体に
    わたって側面に位置し、および／または延びる染色体領
    域における核酸配列に実質的に相同である核酸配列から
    なる請求項１に記載の核酸プローブ。
  7. 【請求項７】下記により調製された染色体-特異的染色
    試薬の前記ゲノムに対するインシトゥ ハイブリダイゼ
    ーションからなり、異常物を含む慣用のバンド分析によ
    り表示されるゲノムの染色体領域における１または複数
    の遺伝子再配列を検査する方法。 (a)前記染色体領域から染色体-特異的DNAを分離するこ
    と。 (b)分離された染色体-特異的DNAのピースを増幅するこ
    と。 (c)標的染色体領域に優先的にハイブリダイズする核酸
    断片の集合物を形成するために、分離されたDNAの増幅
    されたピースに含まれている共有反復配列のハイブリダ
    イゼーション能力を無能力化し、および／または同共有
    反復配列を除去すること、および標識された核酸断片の
    不均一混合物を形成するために核酸断片集合物を標識す
    ること。
  8. 【請求項８】核酸プローブを使用する核酸配列を基礎と
    した染色体物質を染色する方法であって、前記染色体物
    質は１または複数の中期および／または間期染色体、ま
    たはそれらの１または複数の領域であり、母性血液から
    分離された胎児細胞からなる染色体物質の染色方法。
  9. 【請求項９】標識された一重鎖核酸断片の不均一混合物
    からなる染色体-特異的染色試薬であり、当該染色体-特
    異的染色試薬において前記標識された核酸断片は標的染
    色体物質の座位に相補的であり、非標的染色体物質の座
    位に対するハイブリダイゼーション能力を有する核酸配
    列を実質的に含まないことを特徴とする染色体-特異的
    染色試薬。
  10. 【請求項１０】下記のステップからなる染色体中の細胞
    学的異常を検出する方法。 (a)２またはそれ以上の染色されたバンドのパターンを
    形成するために、遺伝学的異常を含んでいる疑わしいゲ
    ノムの２またはそれ以上の染色体領域に標的された高度
    コンプレキシティ標識化／可視化核酸プローブをハイブ
    リダイズすること。 (b)ステツプ(a)にて形成されたバンディング パターン
    を、異常を含む疑いのある同種の正常な染色体物質に前
    記プローブをハイブリダイズすることにより得られたバ
    ンディング パターンと比較すること。 (c)ステップ(a)にて形成されたバンディング パターン
    と正常なバンディングパターン間の差異を検出するこ
    と。
  11. 【請求項１１】請求項１０に記載の細胞学的異常を検出
    する方法において、バンディング パターンは２つの染
    色領域からなり、疑わしい遺伝学的異常は慢性骨髄性白
    血病(CML)に関連する遺伝子再配列であることを特徴と
    する方法。
JP2002337236A 1989-12-01 2002-11-20 染色体−特異的染色の方法および組成物 Withdrawn JP2003199564A (ja)

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