JP2014064586A - ペプチドの多種多様なファミリーのメンバーとしての、遺伝的パッケージの提示ライブラリーを構築する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを集合的に提示するライブラリーの構築において有用な方法、およびこの方法を使用して生成されるライブラリーを提供する。
【解決手段】ｉ）プライマーを用いて核酸を増幅する工程；（ｉｉ）該増幅した核酸を一本鎖にする工程；（ｉｉｉ）該増幅した一本鎖核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｉｖ）該核酸を該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で切断する工程；を包含する方法によって入手可能な複数の核酸によってコードされ、該接触工程および該切断工程は、ある温度で行われ、ここで、該該一本鎖核酸と該一本鎖オリゴヌクレオチドとが会合して、該一本鎖核酸の局部的に二本鎖の領域を形成し、ここで、該一本鎖核酸の残部は一本鎖であり、そしてここで、該制限エンドヌクレアーゼは、該温度で活性である、ライブラリー。
【選択図】なし

Description

本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築することに関する。好ましい実施形態では、提示されるポリペプチドはヒトＦａｂである。

より詳細には、本発明は、一本鎖核酸を選択された位置で切断する方法に関し、この切断された核酸は、本発明のライブラリーの遺伝的パッケージ上に提示されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を少なくとも部分的にコードする。好ましい実施形態では、この遺伝的パッケージは、糸状ファージまたはファージミドである。

本発明はさらに、有用なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提示する遺伝的パッケージのライブラリーをスクリーニングする方法、ならびにこのようなスクリーニングによって同定されたペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関する。

（発明の背景）
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺伝的パッケージのライブラリーを調製することは現在、当該分野において一般的な方法である。多くの通常のライブラリーでは、提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、抗体に関連する。しばしば、これらはＦａｂまたは単鎖抗体である。

一般に、提示されるべきファミリーのメンバーをコードするＤＮＡは、クローニングされて遺伝的パッケージの表面に所望のメンバーを提示するように使用される前に増幅されなければならない。このような増幅は代表的に、正方向プライマーおよび逆方向プライマーを利用する。

このようなプライマーは、増幅されるべきＤＮＡに対してネイティブな配列に対して相補的であり得るか、またはそのＤＮＡの５’末端もしくは３’末端に結合したオリゴヌクレオチドに対して相補的であり得る。増幅されるべきＤＮＡに対してネイティブである配列に相補的であるプライマーは、提示されるべきファミリーのメンバーを偏らせるという点で不利である。ネイティブなＤＮＡ中にこのプライマーに対して実質的に相補的である配列を含むメンバーのみが増幅される。そうでないメンバーはこのファミリーから存在しなくなる。増幅されるメンバーについては、プライマー領域内の何らかの多様性が抑制される。

例えば、特許文献１では、使用されるプライマーは、抗体遺伝子のＶ_Ｈ領域の５’末端に存在する。これは、ネイティブなＤＮＡ中の、単一種内で「充分によく保存された」と呼ばれる配列領域にアニーリングする。このようなプライマーは、増幅されるメンバーを、この「保存された」領域を有するメンバーに偏らせる。この領域内の何らかの多様性は失われる。

ヒトの抗体遺伝子が、ＶおよびＪ、またはＶ、ＤおよびＪの組合せ選択、続いて体細胞変異を含むプロセスを通して生じることが一般に受け入れられている。大部分の多様性は相補性決定領域（ＣＤＲ）に生じるが、多様性はまた、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）において生じ、そしてこの多様性の少なくともいくつかは、抗原（Ａｇ）に対する特異的結合を付与または増強する。その結果、ライブラリーは、可能な限り多くのＣＤＲおよびＦＲ多様性を含むべきである。

コードするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の遺伝的パッケージ上での提示のために、増幅されたＤＮＡをクローニングするために、ＤＮＡは、ベクターへの連結のために適切な末端を生じるように切断されなければならない。このような切断は一般に、プライマーに保有された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いてもたらされる。ＲＮＡの逆転写から生成されるＤＮＡの５’末端にプライマーが存在する場合、このような制限処理は、増幅されたＤＮＡ中に有害な５’非翻訳領域を残す。これらの領域は、クローニングされた遺伝子の発現を妨害し、従って、これらによってコードされるペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質の提示を妨害する。

欧州特許第３６８，６８４号明細書

（発明の要旨）
本発明の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーのメンバーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺伝的パッケージのライブラリーを構築するための新規方法を提供することである。これらの方法は、増幅のために用いられるプライマーに相補的であるネイティブな配列を含むＤＮＡには偏っていない。これらの方法はまた、発現に有害であり得る任意の配列が、クローニングおよび提示の前に、増幅されたＤＮＡから除去されることを可能にする。

本発明の別の目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法を提供することであり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、このオリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域においてこの核酸に機能的に相補的であり、そしてその核酸中の相補体とともに、制限処理の際に所望の位置での核酸の切断をもたらす制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドとの相補によって形成された認識部位で切断する工程；
接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域にわたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。

本発明のさらなる目的は、一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための代替的な方法を提供することであり、この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）この核酸を部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、このオリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域においてこの核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、その切断部位は、この認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）この核酸のみを、この核酸とこのオリゴヌクレオチドの一本鎖領域との相補によって形成された切断部位で切断する工程；接触工程および切断工程は、実質的に一本鎖形態の核酸を維持するに充分な温度で行われ、このオリゴヌクレオチドは、二本の鎖が会合し、その結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのを可能にするに充分に大きな領域にわたってこの核酸に対して機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを用いて行われる。

本発明の別の目的は、ＤＮＡの多様なファミリーのメンバーを含み、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に含む、ＤＮＡ分子を捕獲する方法を提供することである。一本鎖形態のこれらのＤＮＡ分子は、本発明の方法のうちの１つによって切断されている。この方法は、このファミリーの個々の一本鎖ＤＮＡメンバーを、部分的に二重鎖のＤＮＡ複合体に連結することを含む。この方法は以下の工程を包含する：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、このオリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断後に残る領域においてこの核酸に対して機能的に相補的であり、このオリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、切断後に残っている配列を、発現に適切なリーディングフレームに戻すために必要な任意の配列を含み、そしてこれらの配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、工程；および
（ｉｉ）この部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド配列のみを、この部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの二本鎖領域内に含まれる制限エンドヌクレアーゼ認識部位で切断する工程。

本発明の別の目的は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多様なファミリーを提示し、そしてこのファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、ライブラリーを、上記の方法およびＤＮＡを用いて調製することである。

本発明の目的は、これらのライブラリーをスクリーニングして、有用なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を同定し、そしてこれらの物質をヒトの治療において使用することである。たとえば、本発明は以下を提供する：
（項目１） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、そして制限の際に該核酸の該所望の位置での切断を生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、方法。
（項目２） 一本鎖核酸配列を所望の位置で切断するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される該領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、そして該オリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含し、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、方法。
（項目３） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の少なくとも一部が、
以下の工程：
（ｉ）核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって所望の位置で切断される該核酸によって、少なくとも一部がコードされることを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、方法。
（項目４） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、改善が、提示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
によって所望の位置で切断される核酸を含むＤＮＡ配列によってコードされることを特徴とし、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、方法。
（項目５） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、工程；ならびに
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくとも一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの該多様性の少なくとも一部を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目６） 遺伝的パッケージの表面上のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する方法であって、
該方法は、以下の工程：
（ｉ）該多種多様なファミリーのメンバーの少なくとも一部をコードする核酸の収集物を調製する工程；
（ｉｉ）該核酸を一本鎖にする工程；
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で該一本鎖核酸を切断する工程であって、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である切断エンドヌクレアーゼを使用して、該制限が行われる、工程；ならびに；
（ｉｖ）該遺伝的パッケージの該表面上の該切断された核酸によって少なくとも一部がコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する工程、
を包含する、方法。
（項目７） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示する遺伝的パッケージの収集物を含に、そして集合的に、該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示するライブラリーであって、該ライブラリーは、項目３、４、５または６に記載の方法を使用して作製される、ライブラリー。
（項目８） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該ファミリーの少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、そして制限の際に該核酸の所望の位置での切断を生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、その補体を用いて該核酸中に形成する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの相補性によって形成される該認識部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目９） ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして集合的に、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の該ファミリーの多様性の少なくとも一部を提示する遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
（ｉ）該核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該核酸に対して機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、該切断部位は、該核酸の該切断が所望される該認識部位から既知の距離に位置する、工程；および
（ｉｉ）該核酸および該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域の相補性によって形成されるＩＩ型−Ｓ切断部位で、該核酸を単独で切断する工程；
を包含する方法によって、所望の位置で一本鎖核酸配列を切断することによって生成される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡ配列によってコードされ、該接触工程および該切断工程は、該核酸を実質的に一本鎖形態で維持するために十分な温度で行われ、該オリゴヌクレオチドは、切断が選択された該温度および該所望の位置で起こり得るように、該二本の鎖の会合を可能にするために十分大きな領域にわたって該核酸と機能的に相補的であり、そして該選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して、該切断が行われる、ライブラリー。
（項目１０） 前記核酸が、免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１） 前記免疫グロブリンが、Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖを含む、請求項１０に記載の方法。
（項目１２） 前記免疫グロブリンが、重鎖の少なくとも部分を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１３） 前記重鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１２に記載の方法。
（項目１４） 前記免疫グロブリンが、ＦＲ１の少なくとも一部を含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１５） 前記ＦＲ１の少なくとも一部がヒトである、項目１４に記載の方法。
（項目１６） 前記免疫グロブリンが、軽鎖の少なくとも一部を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
（項目１７） 前記軽鎖の少なくとも一部がヒトである、項目１６に記載の方法。
（項目１８） 前記核酸配列の少なくとも一部が、少なくとも１つの自己免疫疾患および／または癌に罹患した患者由来である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９） 前記自己免疫疾患が、狼瘡、エリテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群、または脈管炎からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 前記核酸の少なくとも一部が、末梢血球、骨髄細胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞からなる群から単離される、項目１８に記載の方法。
（項目２１） さらに、核酸の増幅工程を、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間、工程（ｉｉ）と工程（ｉｉｉ）との間、または工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）との間に包含する、項目５または６に記載の方法。
（項目２２） 前記増幅工程が、ｇｅｎｅＲＡＣＥ^ＴＭを使用する、請求項２１に記載の方法。
（項目２３） 前記温度が、４５℃と７５℃との間である、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４） 前記温度が、５０℃と６０℃との間である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記温度が、５５℃と６０℃との間である、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１７塩基と３０塩基との間である、項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２７） 前記一本鎖オリゴヌクレオチドの長さが、１８塩基と２４塩基との間である、項目２６に記載の方法。
（項目２８） 前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭａｅＩＩＩ、Ｔｓｐ４５１、ＨｐｈＩ、ＢｓａＪＩ、ＡｌｕＩ、ＢｌｐＩ、ＤｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｌＩ、ＢｓｉＥＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ、ＭｎｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＢｓｍＡＩ、ＢｐｍＩ、ＸｍｎＩ、またはＳａｃＩからなる群から選択される、項目１、３、５または８に記載の方法。
（項目２９） 前記制限エンドヌクレアーゼが、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＴａａＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４ＶまたはＭｓｌＩを含む群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と２２塩基との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１４塩基と１７塩基との間である、項目３０に記載の方法。
（項目３２） 前記オリゴヌクレオチドの前記一本鎖領域の長さが、１８塩基と２０塩基との間である、項目３１に記載の方法。
（項目３３） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖領域の長さが、幹およびそのパリンドロームによって形成される１０塩基対と１４塩基対との間である、項目２、４、６または９に記載の方法。
（項目３４） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドが、前記幹と前記パリンドロームとの間に、３〜８塩基のループを含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｒＩＣＡＣ、ＡｃｅＩＩＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｃｅ８３１、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈｌ３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、またはＵｂａＰＩを含む群から選択される、請求項２、４、６または９に記載の方法。
（項目３６） 前記ＩＩ型−Ｓ制限エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、項目３５に記載の方法。
（項目３７） ベクターにクローニングするための一本鎖核酸を調製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼで切断された一本鎖核酸配列を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断の後に残る領域において該核酸と機能的に相補的であり、該オリゴヌクレオチドの該二本鎖領域は、発現のために切断後に残る配列を適切かつ本来のリーディングフレームに戻すのに必要とされる任意の配列を含み、そしてこれらの配列の制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’を含む、工程；および
（ｉｉ）該部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの該二本鎖領域内に含まれる該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で、単独で該部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド配列を切断する工程、
を包含する、方法。
（項目３８） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、２塩基と１５塩基との間である、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記一本鎖部分の長さが、７塩基と１０塩基との間である、項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、１２塩基対と１００塩基対との間である、項目３７に記載の方法。
（項目４１） 前記部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの前記二本鎖部分の長さが、２０塩基対と１００塩基対との間である、項目４０に記載の方法。

図１は、ＶＨ配列に特異的なプライマーを用いることなくＶＨ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。 図２は、ＶＬ配列を用いることなくＶＬ遺伝子を増幅するために用いられ得る種々の方法の模式図である。 図３は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。 図４は、実施例２からの切断されたκＤＮＡのゲル分析を示す。 図５は、実施例２からの増幅されたκＤＮＡのゲル分析を示す。 図６は、実施例２からの、ゲル精製された増幅されたκＤＮＡを示す。

（用語）
この出願では、以下の用語および略号を用いる：
センス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの上の鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄ）。センス鎖では、５’−ＡＴＧ−３’はＭｅｔをコードする。

アンチセンス鎖：通常記載されるように、ｄｓ ＤＮＡの下の鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）。アンチセンス鎖では、３’−ＴＡＣ−５’は、センス鎖におけるＭｅｔコドンに対応する。

正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー：「正方向」プライマーは、センス鎖の一部に対して相補的であり、そして新たなアンチセンス鎖分子の合成を開始する。「正方向プライマー」および「下の鎖のプライマー」は等価である。

逆方向（ｂａｃｋｗａｒｄ）プライマー：「逆方向」プライマーは、アンチセンス鎖の一部に対して相補的であり、そして新たなセンス鎖分子の合成を開始する。「逆方向プライマー」および「上の鎖のプライマー」は等価である。

塩基：塩基は、コドンおよび塩基による遺伝子内のそれらの位置として、ベクターまたは遺伝子のいずれかにおけるそれらの位置によって特定される。例えば、「８９．１」は、コドン８９の最初の塩基であり、８９．２は、コドン８９の二番目の塩基である。

Ｓｖ：ストレプトアビジン。

Ａｐ：アンピシリン。

ａｐ^Ｒ：アンピシリン耐性を付与する遺伝子。

ＲＥ：制限エンドヌクレアーゼ。

ＵＲＥ：一般的な制限エンドヌクレアーゼ。

機能的に相補的：２つの配列が、選択された条件下でアニールするように十分に相補的である。

ＲＥＲＳ：制限エンドヌクレアーゼ認識部位。

ＡＡ：アミノ酸。

ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。

ＧＬＧ：生殖系列遺伝子。

Ａｂ：抗体：免疫グロブリン。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質をカバーする。この定義内の抗体のいくつかの例は、特に、免疫グロブリンンアイソタイプならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ^１）_２、ｓｃｆｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄフラグメント。

Ｆａｂ：Ａｂの軽鎖および重鎖の部分を含む二鎖分子。

ｓｃＦｖ：ＶＨ：：リンカー：：ＶＬまたはＶＬ：：リンカーＶＨのいずれか
を含む単鎖Ａｂ。

ｗ．ｔ．：野生型。

ＨＣ：重鎖。

ＬＣ：軽鎖。

ＶＫ：κ軽鎖の可変領域。

ＶＨ：重鎖の可変領域。

ＶＬ：λ軽鎖の可変領域。

本願において、参照される全ての参考文献は、参考として詳細に援用される。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法において有用である核酸配列（すなわち、本発明の遺伝子パッケージに関して示される、少なくとも一部の個々のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質）は、天然に存在する配列、合成配列またはその組み合わせであり得る。これらは、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。好ましい実施形態において、核酸は抗体をコードする。最も好ましくは、これらはＦａｂをコードする。

本発明において有用な核酸は、天然に多様性であり、合成多様性は、これらの天然に多様性のメンバーに導入され得るか、またはこの多様性は、全体的に合成であり得る。例えば、合成多様性は、抗体遺伝子の１つ以上のＣＤＲに導入され得る。

合成多様性は、例えば、ＴＲＩＭ技術（米国特許第５，８６９，６４４号）の
使用を介して作製され得る。ＴＲＩＭ技術は、変化される位置で、どのアミノ酸型が可能で、そしてどんな割合でかを正確に制御することが可能である。ＴＲＩＭ技術において、多様化されるコドンは、三ヌクレオチドの混合物を使用して合成される。これは、任意の組のアミノ酸型が、任意の位置に含まれるのを可能にする。

多様化されたＤＮＡを作製するために使用され得る別の代替法は、混合オリゴヌクレオチド合成である。ＴＲＩＭ技術を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐが可能であり得る。混合オリゴヌクレオチド合成を用いて、ＡｌａおよびＴｒｐを含む混合物はまた、ＳｅｒおよびＧｌｙもまた必然的に含む。変性された位置において可能なアミノ酸型は、抗体の構造、または他のペプチド、ファミリーのポリペプチドまたはタンパク質、生殖系列遺伝子において観察された多様性、頻繁に観察される観察された体細胞変異、および変性の所望の領域および型を参照して選択される。

本発明の好ましい実施形態において、ファミリーのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１つのＣＤＲまたは他の領域の核酸配列は、ｍＲＮＡからの逆転写によって生成されたｃＤＮＡである。より好ましくは、ｍＲＮＡは、関連遺伝子の天然に多様性の組のメンバーを発現する末梢血液細胞、骨髄細胞、脾臓細胞またはリンパ節細胞（例えば、Ｂリンパ球細胞またはプラズマ細胞）から得られ得る。より好ましくは、ｍＲＮＡは、抗体の多様なファミリーをコードする。最も好ましくは、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの自己免疫障害または癌に罹患する患者から得られる。好ましくは、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、慢性関節リウマチ、抗リン脂質症候群および脈管炎）の高い多様性を含むｍＲＮＡが使用される。

本発明の好ましい実施形態において、ｃＤＮＡは、逆転写を使用してｍＲＮＡから生成される。この好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞から分離され、標準的な方法を使用して分解され、その結果、全長（すなわち、キャップされた）ｍＲＮＡのみが残る。次いで、キャップは除去され、そしてｃＤＮＡを生成するために逆転写が使用される。

第１（アンチセンス）鎖の逆転写は、任意の適切なプライマーを用いて任意の様式で行なわれ得る。例えば、ＨＪ ｄｅ Ｈａａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４（２６）：１８２１８−３０（１９９９）を参照のこと。ｍＲＮＡが抗体をコードする本発明の好ましい実施形態において、抗体遺伝子の定常領域に相補的なプライマーが使用され得る。これらのプライマーは有用である。なぜなら、これらは、抗体のサブクラスに対して偏りを生じないためである。別の実施例において、ポリｄＴプライマーが使用され得る（そして重鎖遺伝子に対して好ましくあり得る）。あるいは、プライマーに相補的な配列は、アンチセンス鎖の末端に付加され得る。

本発明の１つの好ましい実施形態において、逆転写プライマーは、ビオチン化プライマーであり得、従って、ｃＤＮＡ産物がストレプトアビジン（Ｓｖ）ビーズに固定されるのを可能にする。固定化はまた、ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオール、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既知のパートナーに対して強力な結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて見出されない別の基、のうちの１つを用いて５’末端において標識されたプライマーを使用して行なわれ得る。例えば、遊離アミン（好ましくは、主にアミン）が、ＤＮＡプライマーの５’末端において提供される場合、このアミンは、標準的なアミド形成化学を使用して、ポリマービーズ上のカルボン酸と反応され得る。このような好ましい固定が、逆転写の間に使用される場合、上方鎖ＲＮＡは、固定の前または後に、周知の酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＲＮＡｓｅＡの組み合わせ）を使用して分解される。

本発明において有用な核酸配列は、一般に、これらがコードするペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を表示するために使用される前に増幅される。増幅の前に、一本鎖ＤＮＡは、前に記載された方法のいずれかを使用して切断され得る。あるいは、一本鎖ＤＮＡは増幅され得、次いで、これらの方法のうちの１つを使用して切断される。

核酸配列を増幅するための周知の方法のいずれかが、このような増幅のために使用され得る。多様性を最大化し、偏らせない方法が好ましい。核酸配列が、抗体遺伝子に由来する本発明の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは、重鎖および軽鎖遺伝子の定常領域中のプライマーならびにセンス鎖の５’末端に付加された合成配列に対するプライマーを利用する。このような合成配列におけるプライミングは、抗体遺伝子の可変領域内の配列の使用を回避する。これらの可変領域プライミング部位は、まれなサブクラスのいずれかであるか、またはプライミング部位において変異されたＶ遺伝子に対する偏りを生じる。この偏りは、プライマー領域内の多様性の抑制に部分的に起因し、そして多数の変異がプライマーに相補的な領域中に存在する場合のプライミングの欠如に部分的に起因する。本発明において開示された方法は、特定のＶ遺伝子型についての増幅された抗体遺伝子の集団を偏らせない利点を有する。

合成配列は、ＤＮＡ配列を共に連結させるために周知の種々の方法によってＤＮＡ鎖の５’末端に付加され得る。ＲＴキャップ伸長ＣａｐＥｘｔｅｎｔｉｏｎは、１つの好ましい方法である。

ＲＴキャップ伸長（Ｓｍａｒｔ ＲＣＲ^（ＴＭ）に由来する）において、短い重複（上方鎖プライマー（ＵＳＰ−ＧＧＧ）における５’−．．．ＧＧＧ−３’は、下方鎖における３’−ＣＣＣ．．．．５’を補完する）および逆転写酵素を使用して、上方鎖プライマーの逆相補体が、下方鎖に付加される。

本発明の好ましい実施形態において、上方鎖および下方鎖プライマーはまた、ａ）遊離アミノ基、ｂ）チオール、ｃ）カルボン酸、またはｄ）不溶性媒体の既知のパートナーに対して強力な結合を形成するように反応し得るＤＮＡにおいて見出されない別の基、のうちの１つを用いて、５’末端においてビオチン化または標識され得る。次いで、これらは、増幅後の標識された鎖を固定するために使用され得る。固定されたＤＮＡは、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

図１は、ＶＨ遺伝子の増幅の概略図を示す。図１、パネルＡは、第１の下方鎖の３’ＵＴＲプライミング合成のポリｄＴ領域に特異的なプライマーを示す。定常領域において結合するプライマーもまた、適切である。パネルＢは、ｍＲＮＡに相補的でない３つのＣによって、その３’末端において伸長した下方鎖を示す。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダイズする３つのＧＧＧにおける合成上方鎖プライマーのアニーリング、および合成プライマー配列の逆相補体による下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す。パネルＤは、パネルＣの合成プライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化合成上方鎖プライマーおよび定常ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す。パネルＥは、５’ビオチン化上方鎖プライマーを使用することによって得られた固定二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを示す。

図２は、ＶＬ遺伝子の増幅のための同様の概略図を示す。図２、パネルＡは、第１の下方鎖の３’末端プライミング合成の領域またはその近くの定常領域に特異的なプライマーを示す。ポリｄＴ領域において結合するプライマーはまた、適切である。パネルＢは、ｍＲＮＡに相補的でない３つのＣによって、その３’末端において伸長した下方鎖を示す。パネルＣは、３’末端のＣＣＣにハイブリダイズする３つのＧＧＧにおける合成上方鎖プライマーのアニーリング、および合成プライマー配列の逆相補体による下方鎖を伸長する逆転写の伸長の結果を示す。パネルＤは、パネルＣの合成プライマーの５’末端を複製する５’ビオチン化合成上方鎖プライマーおよび定常ドメインの部分に相補的な下方鎖プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す。下方鎖プライマーはまた、有用な制限エンドヌクレアーゼ部位（例えば、ＡｓｃＩ）を含む。パネルＥは、５’ビオチン化上方鎖プライマーを使用することによって得られた固定ｄｓ ｃＤＮＡを示す。

図１および２において、各Ｖ遺伝子は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および分泌シグナル（これには可変領域が続き、これには定常領域が続き、これには３’非翻訳領域（これは、代表的にはポリＡで終わる）が続く）からなる。逆転写のための最初のプライマーは、定常領域または３’ＵＴＲのポリＡセグメントに対して相補的であり得る。ヒト重鎖遺伝子については、１５Ｔプライマーが好ましい。逆転写酵素は、新しく合成されたＤＮＡの３’末端にいくつかのＣ残基を付加する。ＲＴキャップ伸長は、この特徴を利用する。逆転写反応は、第１に、下方鎖プライマーのみと作動される。約１時間後、プライマーは、ＧＧＧ（ＵＳＰ−ＧＧＧ）で終了し、そして多くのＲＴａｓｅが添加される。これは、下方鎖ｃＤＮＡが、ＵＳＰ−ＧＧＧの逆相補体によって最終ＧＧＧまで伸長されることを引き起こす。付加された合成配列の部分に同一な１つのプライマーおよびセンス鎖の３’末端における既知の配列の領域に相補的な第２のプライマーを使用して、全てのＶ遺伝子は、それらのＶ遺伝子サブクラスに関わらず、増幅される。

増幅後、本発明のＤＮＡは、一本鎖とされる。例えば、この鎖は、ビオチン化プライマーを使用すること、ストレプトアビジン樹脂上のビオチン化産物を捕獲することによって、ＤＮＡを変成することによって、および相補的な鎖を洗い流すことによって、分離され得る。捕獲されたＤＮＡのどの末端が望まれているかに依存して、上方（センス）鎖または下方（アンチセンス）鎖のいずれかを固定することを選択する。

これらのＤＮＡによって（少なくとも部分的に）コードされるポリペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の表示を行なうために、遺伝子パッケージへのクローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを調製し、クローニングおよび発現のために適切な末端を提供するように操作されなければならない。詳細には、任意の５’非翻訳領域および最小のシグナル配列が除去され、そしてインフレームで、表示宿主において機能する適切なシグナル配列によって置換され得る。さらに、可変ドメイン（抗体遺伝子における）の部分は、除去され、そして合成多様性を含む合成セグメントによって置換される。他の遺伝子ファミリーの多様性は、同様に、合成多様性を用いて拡大され得る。

本発明の方法に従って、クローニングのための一本鎖増幅ＤＮＡを操作するための２つの方法が存在する。第１の方法は、以下の工程：
（ｉ）核酸と一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、切断が望ましい領域における核酸に機能的に相補的であり、そして制限が核酸の切断を所望の位置で生じる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成する核酸中にその相補体を有する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）核酸およびオリゴヌクレオチドの補完によって形成された認識部位のみで核酸を切断する工程；
を包含し、接触および切断工程は、実質的に一本鎖形態で核酸を維持するのに十分な温度で行なわれ、オリゴヌクレオチドは、切断が選択された温度および所望の位置で生じ得るように、２つの鎖が会合するのを可能にするのに十分に大きい領域にわたって核酸と機能的に相補的であり、そして切断は、選択された温度で活性である制限エンドヌクレアーゼを使用して行なわれる。

この第１の方法において、短いオリゴヌクレオチドを、１本鎖ＤＮＡにアニールさせ、現在の局部的なＤＮＡの２本鎖領域内に形成される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を切断し得る。特に、１本鎖ＤＮＡの実質的な画分の同じ位置に生じる認識部位は同一である。

抗体遺伝子に関して、これは、生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）配列のカタログを用いてなされ得る。例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌ．」を参照のこと。アップデータは、表題「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ」の下でこのサイトから獲得され得る。他のファミリーに関して、類似の比較が存在し、そして切断のための適切な領域を選択するために、および多様性を維持するために用いられ得る。

例えば、表１９５は、５１の公知のヒトＶＨ生殖系列遺伝子のＦＲ３領域のＤＮＡ配列を示す。この領域において、この遺伝子は、表２００に示される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。同じ部位で生殖系列遺伝子の大画分を切断する制限エンドヌクレアーゼは、種々の部位で切断するエンドヌクレアーゼ以上に好ましい。さらに、１本鎖ＤＮＡ上で短いオリゴヌクレオチドが結合する領域（例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のいずれかの側面の約１０塩基）内に制限エンドヌクレアーゼのための１つのみの部位が存在することが好ましい。

ＦＲ３における下流を切断する酵素もまた、より好ましい。なぜならば、それは、フレームワークにおける少数の変異を捕捉するからである。このことは、いくつかの場合、有利であり得る。しかし、フレームワークの変異が存在し、そして抗体結合を付与しそして増強することが周知である。本発明は、適切な制限部位の選択により、ＦＲ３の多様性の全てまたは一部を捕捉することを可能とする。従って、この方法はまた、広範囲の多様性を捕捉することを可能とする。

最後に、本発明の方法において、約４５℃と約７５℃との間で活性な制限エンドヌクレアーゼが用いられる。好ましくは、５０℃以上で活性な酵素、より好ましくは、約５５℃で活性な酵素が用いられる。このような温度は、核酸配列が、実質的に１本鎖形態で切断されることを維持する。

表２００に示される、単一の位置で重鎖ＦＲ３生殖系列遺伝子の多くを切断する酵素として、以下が挙げられる：ＭａｅＩＩＩ（２４＠４）、Ｔｓｐ４５Ｉ（２１＠４）、ＨｐｈＩ（４４＠５）、ＢｓａＪＩ（２３＠６５）、ＡｌｕＩ（２３＠４７）、ＢｌｐＩ（２１＠４８）、ＤｄｅＩ（２９＠５８）、ＢｇｌＩＩ（１０＠６１）、ＭｓｌＩ（４４＠７２）、ＢｓｉＥＩ（２３＠７４）、ＥａｅＩ（２３＠７４）、ＥａｇＩ（２３＠７４）、ＨａｅＩＩＩ（２５＠７５）、Ｂｓｔ４ＣＩ（５１＠８６）、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ（５１＠８６）、ＨｉｎｆＩ（３８＠２）、ＭｌｙＩ（１８＠２）、ＰｌｅＩ（１８＠２）、ＭｎｌＩ（３１＠６７）、ＨｐｙＣＨ４Ｖ（２１＠４４）、ＢｓｍＡＩ（１６＠１１）、ＢｐｍＩ（１９＠１２）、ＸｍｎＩ（１２＠３０）、およびＳａｃＩ（１１＠５１）（使用される表記は、例えば、ＢｓｍＡＩが、ＦＲ３の塩基１１で開始する制限エンドヌクレアーゼ認識部位で１６のＦＲ３生殖系列遺伝子を切断することを意味する）。

ＦＲ３におけるヒト重鎖の切断について、好ましい制限エンドヌクレアーゼは、以下のようなものである：Ｂｓｔ４ＣＩ（またはＴａａＩもしくはＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ）、ＢｌｐＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、およびＭｓｌＩ。ＡＣＮＧＴ（Ｂｓｔ４ＣＩ、ＴａａＩ、およびＨｐｙＣＨ４ＩＩＩのための制限エンドヌクレアーゼ認識部位）は、全てのヒトＦＲ３生殖系列遺伝子において一致する部位に見出されるため、これらの酵素の１つは、重鎖ＣＤＲ３の多様性の捕捉のために最も好ましい。ＢｌｐＩおよびＨｐｙＣＨ４Ｖは相補的である。ＢｌｐＩは、ＶＨ１およびＶＨ４ファミリーのほとんどのメンバーを切断し、ＨｐｙＣＨ４Ｖは、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＨ６、およびＶＨ７のファミリーのほとんどのメンバーを切断する。両方の酵素ともＶＨ２を切断しないが、これは非常に小さいファミリーであり、３つのメンバーを含むのみである。従って、これらの酵素はまた、本発明の方法の好ましい実施形態において用いられ得る。

制限エンドヌクレアーゼＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、およびＴａａＩは全て、５’―ＡＣｎＧＴ―３’を認識し、そしてｎの後の上方のストランドＤＮＡおよびｎに相補的な塩基の前の下方ストランドＤＮＡを切断する。これは、ヒト重鎖上でのこの方法のために最も好ましい制限エンドヌクレアーゼ認識部位である。なぜならば、それは、全ての生殖系列遺伝子において見出されるからである。さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識領域（ＡＣｎＧＴ）は、表２０６に示されるような、チロシンコドン（ｔａｙ）およびそれに続くシステインコドン（ｔｇｙ）の第２および第３の塩基に適合する。これらのコドン（特に、成熟抗体遺伝子におけるシステイン）は、高度に保存されている。

表２５０Ｅは、長さ２２塩基（長さ２０の最後の１つを除く）の別個のオリゴヌクレオチドを示す。表２５５Ｃは、１６１７の実際の重鎖抗体遺伝子の分析を示す。これらの中で、１５１１つはこの部位を有し、そして４つの不適合内で候補オリゴヌクレオチドの１つに適合する。８つのオリゴヌクレオチドが、ほとんどの適合の原因であり、表２５０Ｆ．１．に示す。８つのオリゴヌクレオチドは非常に類似しており、その結果、満足のいく切断が、温度、ｐＨ、塩分などを調整することにより、１つのみのオリゴヌクレオチド（例えば、Ｈ４３．７７．９７．１−０２＃１）を用いて達成されるようである。１つまたは２つのオリゴヌクレオチドは、生殖系列遺伝子配列がごくわずかしか異ならない場合であっても、そして特に切断される制限エンドヌクレアーゼ認識領域付近でごくわずかしか異ならない場合、同様に満足し得る。表２５５Ｄは、８つの選択されたオリゴヌクレオチドのみを用いた、１６１７つの実際の重鎖抗体遺伝子の反復分析を示す。これは、１４６３つの配列が、４つの不適合内で少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで適合すること、および期待するような部位を有することを示す。７つの配列のみが、この領域内に第２のＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ認識領域を有する。

適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒト重鎖のＦＲ１における切断に関する。ＦＲ１における切断は、重鎖のＣＤＲの多様性全体の捕捉を可能にする。

ヒト重鎖ＦＲ１についての生殖系列遺伝子を表２１７に示す。表２２０は、ヒト生殖系列遺伝子ＦＲ１において見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。好まし部位は、ＢｓｇＩ（ＧＴＧＣＡＧ；３９＠４）、ＢｓｏＦＩ（ＧＣｎｇｃ；４３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＴｓｅＩ（Ｇｃｗｇｃ；４３＠６、１１＠９、２＠３、１＠１２）、ＭｓｐＡｌＩ（ＣＭＧｃｋｇ；４６＠７、２＠１）、ＰｖｕＩＩ（ＣＡＧｃｔｇ；４６＠７、２＠１）、ＡｌｕＩ（ＡＧｃｔ；４８＠８２＠２）、ＤｄｅＩ（Ｃｔｎａｇ；２２＠５２、９＠４８）、ＨｐｈＩ（ｔｃａｃｃ；２２＠８０）、ＢｓｓＫＩ（Ｎｃｃｎｇｇ；３５＠３９、２＠４０）、ＢｓａＪＩ（Ｃｃｎｎｇｇ；３２＠４０、２＠４１）、ＢｓｔＮＩ（ＣＣｗｇｇ；３３＠４０）、ＳｃｒＦＩ（ＣＣｎｇｇ；３５＠４０、２＠４１）、Ｅｃｏ０１０９Ｉ（ＲＧｇｎｃｃｙ；２２＠４６、１１＠４３）、Ｓａｕ９６Ｉ（Ｇｇｎｃｃ；２３＠４７、１１＠４４）、ＡｖａＩＩ（Ｇｇｗｃｃ；２３＠４７、４＠４４）、ＰｐｕＭＩ（ＲＧｇｗｃｃｙ；２２＠４６、４＠４３）、ＢｓｍＦＩ（ｇｔｃｃｃ；２０＠４８）、ＨｉｎｆＩ（Ｇａｎｔｃ；３４＠１６、２１＠５６、２１＠７７）、ＴｆｉＩ（２１＠７７）、ＭｌｙＩ（ＧＡＧＴＣ；３４＠１６）、ＭｌｙＩ（ｇａｃｔｃ；２１＠５６）、およびＡｌｗＮＩ（ＣＡＧｎｎｎｃｔｇ；２２＠６８）である。より好ましい部位は、ＭｓｐＡＩおよびＰｖｕＩＩである。ＭｓｐＡＩおよびＰｖｕＩＩは、７〜１２での４６つの部位および１〜６での２つの部位を有する。両方の部位での切断を回避するために、１〜６での部位を完全に覆わないオリゴヌクレオチドが用いられる。従って、ＤＮＡは、その部位で切断されない。本発明者らは、ＰｖｕＩＩ部位を超えて３、４、または５塩基延びるＤＮＡが効果的に切断され得ることを示した。

適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の説明は、ヒトκ軽鎖のＦＲ１における切断に関する。表３００は、ヒトκＦＲ１生殖系列を示し、そして表３０２は、一致する部位で実質的に多くのヒトκＦＲ１生殖系列遺伝子において見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。列挙される制限エンドヌクレアーゼ認識部位の中で、ＢｓｍＡＩおよびＰｆｌＦＩが最も好ましい酵素である。ＢｓｍＡＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において塩基１８にて見出される。ＰｆｌＦＩ部位は、４０の生殖系列遺伝子の中の３５において塩基１２にて見出される。

適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を選択する別の例は、ヒトλ軽鎖のＦＲ１における切断に関する。表４００は、３１の公知のヒトλＦＲ１生殖系列遺伝子配列を示す。表４０５は、ヒトλＦＲ１生殖系列遺伝子において見出される制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。ＨｉｎｆＩおよびＤｄｅＩが、ＦＲ１におけるヒトλ鎖を切断するための最も好ましい制限エンドヌクレアーゼである。

切断のための１つかまたは複数の適切な部位が選択された後に、１つ以上の短いオリゴヌクレオチドが、１つかまたは組み合わせて、選択された認識部位を機能的に補うために調製される。このオリゴヌクレオチドはまた、増幅された遺伝子の大部分において認識部位に隣接する配列を含む。この隣接配列は、この配列が、選択された部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼにより切断されるのに十分に、１本鎖ＤＮＡにアニールすることを可能にする。

このオリゴヌクレオチドの実際の長さおよび配列は、認識部位ならびに接触および切断のために用いられる状態に依存する。この長さは、オリゴヌクレオチドが、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位置のみでの切断が生じるのに十分大きな領域にわたって、１本鎖ＤＮＡに機能的に相補性であるために十分でなければならない。

代表的に、本発明の好ましい方法のオリゴヌクレオチドは、約１７〜約３０ヌクレオチド長である。約１７塩基未満では、アニーリングが弱すぎ、そして３０塩基より上では、特異性の喪失が存在し得る。好ましい長さは、１８〜２４塩基である。

この長さのオリゴヌクレオチドは、生殖系列遺伝子の同一の相補体である必要はない。むしろ、生じる数個の不適合が寛容され得る。しかし、好ましくは、１〜３の不適合のみが許容される。このような不適合は、１本鎖ＤＮＡに対するこのオリゴヌクレオチドのアニーリングに逆に影響しない。従って、この２つのＤＮＡは、機能的に相補性であると呼ばれる。

クローニングのために本発明の増幅した１本鎖ＤＮＡを操作するための第２の方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）核酸と部分的に２本鎖のオリゴヌクレオチドを接触される工程であって、このオリゴヌクレオチドの１本鎖領域が、切断が所望される領域においてこの核酸に機能的に相補的であり、そしてこのオリゴヌクレオチドの２本鎖領域が、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、それらの切断部位が、認識部位から既知の距離で配置される、工程；および
（ｉｉ）核酸とオリゴヌクレオチドの１本鎖領域との補完により形成される切断部位のみでこの核酸を切断する工程。
接触工程および切断工程は、この核酸を実質的に１本鎖形態で維持するために十分な温度にて実施され、オリゴヌクレオチドは、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのに十分に大きな領域にわたってこの核酸に対して機能的に相補性であり、そして切断は、選択された温度で活性な制限エンドヌクレアーゼを用いて実施される。

この第２の方法は、ユニバーサル制限エンドヌクレアーゼ（「ＵＲＥ」）を用いる。ＵＲＥは、部分的に２本鎖オリゴヌクレオチドである。１本鎖部分またはＵＲＥの重複は、１本鎖ＤＮＡにおいて切断されるためにこの配列に対して機能的に相補性であるＤＮＡアダプターからなる。２本鎖部分は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位でからなる。

本発明のＵＲＥ方法は、特異的かつ正確であり、そして相補領域においていくつか（例えば、１〜３）の不適合を寛容し得る（すなわち、それはその領域に対して機能的に相補性である）。さらに、ＵＲＥが用いられる条件が調整され、その結果、増幅されるほとんどの遺伝子が切断され、それらの遺伝子から生成されるライブラリー中の偏りを減少させ得る。

１本鎖ＤＮＡアダプターの配列またはＵＲＥの重複部分は、代表的に、約１４〜２２塩基からなる。しかし、より長いかまたはより短いアダプターが用いられ得る。大きさは、アダプターが１本鎖ＤＮＡの機能的な相補体と結合する能力、ならびにＩＩ−Ｓ型酵素を用いてこのＤＮＡを切断するために用いられる温度にてＵＲＥと１本鎖ＤＮＡを接触させるために用いられる温度に依存する。アダプターは、２つのストランドが結合し、その結果、選択された温度および所望の位置で切断が生じ得るのに十分に大きな領域にわたって１本鎖ＤＮＡに対して機能的に相補性でなければならない。本発明者らは、１４〜１７塩基長、より好ましくは１８〜２０塩基長の１本鎖部分または重複部分を好む。

ＵＲＥを用いて切断のために選択される部位は、好ましくは、増幅されたＤＮＡのファミリーにおいて実質的に保存される部位である。本発明の第１の切断方法と比較する場合、これらの部位は、エンドヌクレアーゼ認識部位である必要がない。しかし、第１の方法のように、選択される部位は、ネイティブのＤＮＡに存在するというよりも合成性であり得る。このような部位は、公知の抗体または遺伝子の他のファミリーの配列に関する参照により選択され得る。例えば、多くの生殖系列遺伝子の配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ／ｏｋ．ｈｔｍｌにて報告されている。例えば、１つの好ましい部位は、ＦＲ３の末端付近（コドン８９〜コドン９３の第２の塩基）で生じる。ＣＤＲ３は、コドン９５で開始する。

７９のヒト重鎖遺伝子の配列もまた、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅ２／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌにて利用可能である。このサイトは、本発明の方法に従うＵＲＥ切断のための適切な配列を同定するために用いられ得る。例えば、表８Ｂを参照のこと。

最も好ましくは、１つ以上の配列が、これらのサイトまたは他の利用可能な配列情報を用いて同定される。これらの配列は、共に、増幅されたＤＮＡの実質的な画分に存在する。例えば、複数の配列が、生殖系列遺伝子における公知の多様性または頻度の高い体細胞変異を可能にするために用いられ得る。合成性の変性配列もまた、用いられ得る。好ましくは、２〜３の不適合のみを有する試験された遺伝子の少なくとも６５％において生じる配列が、選択される。

次いで、ＵＲＥ１本鎖アダプターまたは重複は、選択される領域に相補性であるように作製される。ＵＲＥを使用する条件は、経験的に決定される。これらの条件は、２〜３の不適合のみを有する機能的に相補性の配列を含むＤＮＡの切断を可能にするが、このような配列を欠くＤＮＡの切断を可能にしない。

上記のように、ＵＲＥの二本鎖部分として、ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼ認識部位が挙げられる。一本鎖ＤＮＡを実質的にその形態で保持し、そして一本鎖ＤＮＡが所望される部位で切断されるのを可能にするために、ＵＲＥの一本鎖ＤＮＡアダプター部分が十分な長さでアニーリングすることを可能にするのに必要な温度で活性な任意のＩＩ−Ｓ型酵素が使用され得る。

本発明のＵＲＥ方法での使用のための好ましいＩＩ−Ｓ型酵素は、一本鎖ＤＮＡの非対称的な切断を提供する。とりわけ、表８００にこれらの酵素を列挙する。もっとも好ましいＩＩ−Ｓ型酵素が、ＦｏｋＩである。

好ましいＦｏｋＩを含むＵＲＥが使用される場合、切断を起こすためのいくつかの条件を使用することが好ましい：
１）酵素を活性化するための標的ＤＮＡ全体のＵＲＥの発現が存在するべきである。標的ＤＮＡに対して等モル量しか存在しないＵＲＥは、ｓｓＤＮＡの少ない切断を生じる。なぜなら、利用可能な活性な酵素の量は限られているからである。

２）アクチベーターを使用してＦｏｋＩ酵素の一部を活性化し、切断を生じることなく二量体化させ得る。適切なアクチベーターの例を、表５１０に示す。

３）切断の制限は、４５℃〜７５℃の間の温度、好ましくは５０℃より高い温度、そして最も好ましくは５５℃より高い温度で実施される。

先行技術で使用されているＵＲＥは、１４の塩基の一本鎖セグメント、１０の塩基のステム（ＦｏｋＩ部位を含む）、それに続く１０塩基のステムのパリンドロームを含んだ。このようなＵＲＥを本発明の本方法で使用し得るが、本発明の好ましいＵＲＥはまた、セグメントを含むＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位の間の３〜８塩基（１つのループ）のセグメントも含む。好ましい実施形態において、ステム（ＦｏｋＩ部位を含む）およびそのパリンドロームはまた、１０塩基よりも長い。好ましくは、これらは、１０〜１４塩基長である。これらの「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」ＵＲＥアダプターの例を表５に示す。

ＵＲＥを使用して、一本鎖ＤＮＡを切断する１つの例としては、ヒト重鎖のＦＲ３領域が挙げられる。表５０８は、示されるＵＲＥ認識配列を有する８４０の全長成熟ヒト重鎖の分析を示す。大部分（７１８／８４０＝０．８５）は、５つのＵＲＥ（ＶＨＳ８８１−１．１、ＶＨＳ８８１−１．２、ＶＨＳ８８１−２．１、ＶＨＳ８８１−４．１、およびＶＨＳ８８１−９．１）を使用して、２以下のミスマッチを認識される。これらのそれぞれは、生殖系列の遺伝子に相補的な２０塩基のアダプター配列、ＦｏｋＩ部位を含む１０塩基のステムセグメント、５つの塩基ループ、および第一のステムセグメントの逆の相補体を有する。これらのアダプターを、単独でまたは組合せて一本鎖アンチセンス重鎖ＤＮＡにアニーリングし、そして例えば、アクチベーターＦＯＫＩａｃｔの存在下でＦｏｋＩを用いて処理することによって、指示された位置でアンチセンス鎖の切断を生じる。

ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトκ軽鎖のＦＲ１領域が挙げられる。表５１２は、４つの示された１９塩基のプローブ配列による一致についての１８２の全長ヒトκ鎖の分析を示す。９６％の配列は、２以下のミスマッチを有するプローブの１つと一致する。表５１２に示されるＵＲＥアダプターは、κ鎖のセンス鎖の切断のためである。従って、アダプター配列は、生殖系列の遺伝子配列の逆の相補体である。ＵＲＥは、１０塩基のステム、５塩基のループ、ステムの逆の相補体およびその相補配列から構成される。ループは、ここではＴＴＧＴＴを示すが、他の配列が使用され得る。その機能は、ロリポップ単量体の形成が二量体化よりも好まれるように、ステムのパリンドロームを妨げることである。表５１２はまた、センス鎖が切断される場所を示している。

ＵＲＥを使用して一本鎖ＤＮＡを切断する別の例としては、ヒトλ軽鎖が挙げられる。表５１５は、４つの示された１９塩基のプローブを一致させるための１２８のヒトλ軽鎖の分析を示している。３以下のミスマッチを有し、１２８のうちの８８（６９％）の鎖がプローブの１つと一致する。表５１５はまた、これらのプローブに対応するＵＲＥアダプターを示している。これらのアダプターを、λ鎖の上側の鎖ｓｓＤＮＡにアニーリングし、そしてＦＯＫＩａｃｔの存在下、４５℃またはそれより高い温度で、ＦｏｋＩで処理することによって、これらの鎖の特異的かつ正確な切断が生じる。

第一の方法の短いオリゴヌクレオチド配列および第二の方法のＵＲＥが、一本鎖ＤＮＡと接触する条件下で、経験的に決定され得る。この条件は、一本鎖ＤＮＡが、実質的に一本鎖の形態で保持されるようでなければならない。より詳細には、これらの条件は、一本鎖ＤＮＡが、ループを形成しないような条件でなければならず、このループは、それが関係するオリゴヌクレオチド配列もしくはＵＲＥを妨害し得るか、または選択的制限エンドヌクレアーゼによってループ自身が切断の部位を提供し得る。

短いオリゴヌクレオチド（第一の方法）およびＵＲＥ（第二の方法）の効率および特異性は、ＵＲＥアダプター／オリゴヌクレオチドならびに基質ＤＮＡの濃度、温度、ｐＨ、金属イオン濃度、イオン強度、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）（例えば、尿素およびホルムアミド）の濃度、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）の濃度、および消化の時間を制御することによって調整され得る。これらの条件は、以下を有する合成オリゴヌクレオチドを用いて最適化され得る：１）標的生殖系列遺伝子配列、２）成熟標的遺伝子配列、または３）幾分関連する非標的配列。目標は、標的配列のほとんどを切断しかつ非標的の最小量を切断することである。

本発明の好ましい実施形態において、一本鎖ＤＮＡは、４５℃〜７５℃の間の温度を使用して、実質的に一本鎖ＤＮＡの形態で維持される。より好ましくは、５０℃〜６０℃の間であり、最も好ましくは５５℃〜６０℃の間の温度が使用される。これらの温度は、ＤＮＡがオリゴヌクレオチドまたはＵＲＥと接触する場合、および本発明の方法を使用してＤＮＡを切断する場合の両方で使用される。

本発明の２つの切断方法は、いくつかの利点を有する。第一の方法は、一本鎖ＤＮＡのファミリーの個々のメンバーを、１つの実質的に保存されたエンドヌクレアーゼ認識部位で単独に切断することを可能にする。この方法はまた、逆転写または増幅プライマーに構築されるエンドヌクレアーゼ認識部位を必要としない。ファミリー中の任意のネイティブな部位または合成部位が使用され得る。

第二の方法は、これらの利点の両方を有する。さらに、ＵＲＥの方法は、一本鎖ＤＮＡが、天然に存在するか、または合成で構築されたエンドヌクレアーゼ認識部位を有さない位置で切断されることを可能にする。

最も重要なことは、両方の切断方法が、多様性を最大にするように５’および３’プライマーの使用を可能にし、次いでクローニングおよびディスプレイの前に所望でないか、または有害な配列を除去するような切断を可能にする。

増幅されたＤＮＡを、本発明の方法の１つを使用して切断した後、このＤＮＡはクローニングのために調製される。これは、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダプター（この末端配列は、特定の切断部位に基づいており、増幅されたＤＮＡは、この部位で切断される）を使用することによってなされる。

合成ＤＮＡは、切断された一本鎖ＤＮＡに連結される場合、ＤＮＡが、所望のペプチド、ポリペプチドまたは遺伝子パッケージの表面タンパク質をディスプレイするように正確なリーディングフレームに発現されることを可能にするように設計される。好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、ペプチド、ポリペプチドまたは切断部位までのタンパク質のファミリーのアミノ酸配列の特徴をコードするいくつかのコドン配列を含む。ヒト重鎖について、好ましくは、３〜２３のフレームワークのアミノ酸を使用して、切断されたＤＮＡの発現に必要な配列を提供する。

好ましくは、アダプターの二本鎖部分は、約１２〜１００塩基長である。より好ましくは、約２０〜１００塩基が使用される。アダプターの二本鎖領域はまた、好ましくは、ＤＮＡを適切なディスプレイベクター（または多様性を保存するために使用されるレシピエントベクター）にクローニングするために有用な少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識部位を含む。このエンドヌクレアーゼ制限部位は、ＤＮＡ配列を伸長するために使用される生殖系列遺伝子配列に対してネイティブであり得る。これはまた、ネイティブな生殖系列遺伝子配列に対して縮重した配列を使用して構築され得る。または、これは全合成であり得る。

アダプターの一本鎖部分は、一本鎖ＤＮＡにおける切断領域に相補的である。このオーバーラップは、約２塩基〜約１５塩基までであり得る。オーバーラップがより長くなるにつれて、連結がより効率的になるようである。オーバーラップについて好ましい長さは、７〜１０である。これは、領域における多様性が捕捉され得るようにこの領域のいくつかのミスマッチを可能にする。

一本鎖領域または部分的二重鎖のアダプターのオーバーラップが有利である。なぜなら、これは、ＤＮＡが選択された部位で切断されることを可能にするが、捕捉される他のフラグメントは切断されないからである。このようなフラグメントは、適切な抗体に折り畳まれず、そして非特異的粘着性であるらしい遺伝子コード配列を有するライブラリーを汚染する。

本発明の方法における部分的二重鎖のアダプターの使用の１つの例示としては、このようなアダプターを上記のように、５’−ＡＣｎＧＴ−３’において、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩまたはＴａａＩを使用して切断されるヒトＦＲ３領域に連結する工程を包含する。

表２５０Ｆ．２は、切断された下側の鎖であるＤＮＡに連結するためにアダプターの二本鎖部分の下側の鎖を示している。ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ部位は、右（表２０６に示されるような）に対して非常に遠いので、ＡｆｌＩＩ部位およびＸｂａＩ部位を含む配列が、付加され得る。部分的に二重鎖のアダプターのこの下側の鎖部分（Ｈ４３．ＸＡＥｘｔ）は、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位の両方を組込む。アダプターの二重鎖部分の上側の鎖は、いずれの部位も有さない（Ｈ４３．ＸＡＥｘｔのＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ部位に逆のセグメントにおける計画されたミスマッチのため）が、Ｈ４３．ＸＡＥｘｔに非常に強固アニーリングする。Ｈ４３ＡＥｘｔは、ＡｆｌＩＩ部位のみを含み、そして上側鎖Ｈ４３．ＡＢｒ１およびＨ４３．ＡＢｒ２（これは、ＡｆｌＩＩ部位を破壊するために意図的な変更を有する）とともに使用される。

連結後に、所望の捕獲されたＤＮＡは、さらにＰＣＲ増幅され得、所望である場合、好ましい実施形態において、抗体遺伝子の下流の定常領域に対するプライマー、およびアダプターの二本鎖領域の部分に対するプライマーを使用する。これらのプライマーはまた、増幅されたＤＮＡのクローニングに使用するための制限エンドヌクレアーゼ部位を保有する。

部分的な二本鎖アダプターの一本鎖増幅ＤＮＡへの連結、およびおそらく増幅の後、複合体ＤＮＡは、選択された５’側および３’側エンドヌクレアーゼ認識部位で切断される。

クローニングに有用な切断部位は、カセットが挿入されるファージまたはファージミドおよび抗体遺伝子におけるその利用可能な部位に依存する。表１は、７５のヒト軽鎖についての制限エンドヌクレアーゼのデータを提供する。表２は、７９のヒト重鎖についての対応するデータを示す。各表において、エンドヌクレアーゼは、切断の頻度が増す順番で並べられている。これらの表において、Ｎｃｈは、酵素によって切断される鎖の数であり、Ｎｓは、部位の数（いくつかの鎖は１より多い部位を有する）である。

この分析から、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩが非常に適切である。ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩは、好ましくは、重鎖ディスプレイセグメントを挿入するためのｐＣＥＳ１において使用される。ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩは、好ましくは、軽鎖ディスプレイセグメントを挿入するためにｐＣＥＳ１において使用される。

ＢｓｔＥＩＩ部位は、生殖系列ＪＨ遺伝子の９７％に生じる。再配列されたＶ遺伝子において、重鎖遺伝子の５４／７９（６８％）のみが、ＢｓｔＥＩＩ部位を含み、そしてこれらの７／６１が、２つの部位を含む。従って、４７／７９（５９％）が、１つのＢｓｔＥＩＩ部位を含む。ＢｓｔＥＩＩを使用することの代替策は、ＪＨ末端でのＵＲＥを介する切断、およびＣＨ１の部分をコードする合成オリゴヌクレオチドへの連結である。

本発明の方法を使用するＤＮＡ配列のファミリーを調製する１つの例として、ヒトＣＤＲ３多様性を捕捉することが挙げられる。上記のように、種々の自己免疫の患者からのｍＲＮＡは、ｃＤＮＡへ逆転写される。ｍＲＮＡが分解された後、ｃＤＮＡを固定化し、そして短いオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ上流のＣＤＲ３を切断する。次いで、部分的に二重鎖の合成ＤＮＡアダプターは、ＤＮＡにアニーリングされ、そしてこのＤＮＡは、アダプターに対するプライマーおよび定常領域（ＦＲ４の後）に対するプライマーを使用して増幅される。次いで、ＤＮＡはＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４中）および部分的二本鎖アダプター（例えば、ＸｂａＩおよびＡｆｌＩＩ（ＦＲ３中））に適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して切断される。次いで、ＤＮＡは合成ＶＨ骨格（例えば、３〜２３）に連結される。

ＵＲＥ方法を使用して切断された一本鎖ＤＮＡを調製する１つの例として、ヒトκ鎖が挙げられる。この鎖のセンス鎖の切断部位は、表５１２に示される。オリゴヌクレオチドｋａｐｅｘｔＵＲＥは、オリゴヌクレオチド（ｋａＢＲ０１ＵＲ、ｋａＢＲ０２ＵＲ、ｋａＢＲ０３ＵＲ、およびｋａＢＲ０４ＵＲ）にアニーリングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。次いで、このＤＮＡは、切断された可溶性のκ鎖に連結される。次いで、連結産物は、プライマーｋａｐｅｘｔＵＲＥＰＣＲおよびＣＫＦｏｒｅＡｓｃ（これは、Ｃκ末端後のＡｓｃＩ部位に挿入する）を使用して増幅される。次いで、この産物は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩを用いて切断され、そして同様にレシピエントベクターを切断するために連結される。

別の例としては、表５１５に示される切断が挙げられる。切断後、エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＯＮ＿ＬａｍＥｘ１３３）オリゴヌクレオチドおよび４つのブリッジ（ｂｒｉｄｇｅ）オリゴヌクレオチド（ＯＮ＿ＬａｍＢ１−１３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ２−１３３、ＯＮ＿ＬａｍＢ３−１３３およびＯＮ＿ＬａｍＢ４−１３３）は、アニーリングされて部分的二重鎖ＤＮＡを形成する。このＤＮＡは、切断されたλ鎖センス鎖に連結される。連結後、ＤＮＡは、ＯＮ＿Ｌａｍ１３３ＰＣＲおよびλ定常ドメインに特異的な前進プライマー（例えば、ＣＬ２ＦｏｒｅＡｓｃまたはＣＬ７ＦｏｒｅＡｓｃ（表１３０））を用いて増幅される。

ヒト重鎖において、ＦＲ４のほとんど全ての遺伝子は、ヒト重鎖Ｖ遺伝子の非常に大きな画分中の定常位置で生じるＢｓｔＥＩＩ部位で切断され得る（下流、すなわち、ＣＤＲ３のセンス鎖の３’末端へ向かって）。次いで、ＣＤＲ３の多様性のみが捕捉される場合、ＦＲ３中の部位が、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の多様性が所望される場合、ＦＲ２中の部位が、またはＣＤＲの多様性全てが所望される場合、ＦＲ１中の部位が必要である。これらの部位は、好ましくは、部分的二重鎖のアダプターの一部として挿入される。

本発明の好ましいプロセスは、軽鎖または重鎖のいずれかのクローニングを可能にする部位を有するレシピエントベクターを提供することである。このようなベクターは、周知であり、当該分野で広く使用される。本発明に従った好ましいファージ提示ベクターは、ファージＭＡＬＩＡ３である。これは、遺伝子ＩＩＩにおいて提示する。ファージＭＡＬＩＡ３の配列を、表１２０Ａ（注釈付）および表１２０Ｂ（要約）に示す。

軽鎖または重鎖の選択された領域をコードするＤＮＡを、軽鎖または重鎖のいずれかを非常に稀にしか切断しないエンドヌクレアーゼを使用してベクターに移入し得る。例えば、軽鎖は、ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩによって捕捉される。重鎖遺伝子は、好ましくは、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ部位を有するレシピエントベクターにクローニングされる。軽鎖は、好ましくは、ＡｐａＬＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてライブラリー中に移される。重鎖は、好ましくは、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩフラグメントとしてライブラリーに移される。

最も好ましくは、この提示は、Ｍ１３ファージの誘導体の表面上に有される。最も好ましいベクターは、Ｍ１３の全ての遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および提示カセットを含む。好ましいベクターは、遺伝子の多様なファミリーのメンバーの導入および切除を可能にする制限部位をカセットとして提供される。好ましいベクターは、ファージを増幅させるために使用される増殖条件下での再編成に対して安定である。

本発明の別の実施形態において、本発明の方法によって捕捉される多様性は、ＩＩＩタンパク質上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を提示するファスミドベクター（例えば、ｐＣＥＳ１）において提示され得る。このようなベクターはまた、他のベクターまたはファージを使用する引き続く提示のための多様性を保存するために使用され得る。

別の実施形態において、提示の様式は、３つの可能性のあるアンカードメインに対する短いリンカーを介し得る。Ｍ１３ ＩＩＩ（「ＩＩＩスタンプ」）の最終部分である１つのアンカードメイン、全長ＩＩＩ成熟タンパク質である第二のアンカー、およびＭ１３ ＶＩＩＩ成熟タンパク質である第三のアンカー。

ＩＩＩスタンプフラグメントは、ファージに構築するためのＭ１３ ＩＩＩを十分に含むが、感染性の媒介に関するドメインを含まない。野生型のＩＩＩおよびＶＩＩＩタンパク質が存在することから、このファージは、抗体遺伝子を除去しないようであるが、非常に低い増殖の利点のみを受けるこれらのセグメントを欠失する。各々のアンカードメインのために、このＤＮＡは野生型のＡＡ配列をコードするが、非常に高い程度で野生型のＤＮＡ配列とは異なる。これは、提示アンカーと野生型遺伝子（これもまた存在する）との間の相同組換えの可能性を非常に減少させる。

最も好ましくは、本発明は、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）および提示カセットを保有する完全なファージを使用する。野生型ｉｉｉおよびｖｉｉｉ遺伝子が存在することから、野生型タンパク質もまた存在する。この提示カセットは、調節可能なプロモーター（例えば、Ｐ_ＬａｃＺ）から転写される。調節可能なプロモーターの使用は、対応する野生型コートタンパク質に対する融合提示遺伝子の比を制御することを可能にする。この比は、ファージ（またはファスミド）粒子当たりの提示融合の平均コピー数を決定する。

本発明の別の局面は、糸状ファージ上にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（および特にＦａｂ）を提示する方法である。最も好ましい実施形態において、この方法は、ＦＡＢを提示し、以下を包含する：
ａ）以下のエレメントをコードするＤＮＡの断片の送達を捕捉するカセットを得る工程：
Ｐ_ｒｅｇ：：ＲＢＳ１：：ＳＳ１：：ＶＬ：：ＣＬ：：停止：：ＲＢＳ２：：ＳＳ２：：ＶＨ：：ＣＨ１：：リンカー：：アンカー：：停止：：、
ここで、Ｐ_ｒｅｇは、調節可能なプロモーターであり、ＰＢＳ１は、第一のリボソーム結合部位であり、ＳＳ１は、宿主株において作動可能なシグナル配列であり、ＶＬは、軽鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＬは、軽鎖定常領域であり、停止は、１以上の停止コドンであり、ＰＢＳ２は、第二のリボソーム結合部位であり、ＳＳ２は、宿主株において作動可能な第二のシグナル配列であり、ＶＨは、重鎖可変領域の種々のセットのメンバーであり、ＣＨ１は、抗体重鎖の第一の定常領域であり、リンカーは、１〜約５０残基のアミノ酸の配列であり、アンカーは、糸状ファージ粒子に構築されるタンパク質であり、そして停止は、１以上の停止コドンの第二の例である；ならびに
ｂ）ファージの生存性を最大化し、そしてこのカセットまたはその部分の欠失の可能性を最小化するためにファージゲノム内にカセットを配置する工程。

上記の好ましいカセット中のアンカータンパク質をコードするＤＮＡは、同じ（または密接に関連する）アミノ酸配列（ファージのコートタンパク質の１つに見出されるような）をコードするが、別個のＤＮＡ配列を有するように設計される。これは、野生型遺伝子との望まない相同組換えを防止する。さらに、このカセットは、遺伝子間領域に配置されるべきである。提示カセットの配置および方向は、ファージの挙動に影響し得る。

本発明の１つの実施形態において、転写ターミネーターは、上記の提示カセットの第二の停止（例えば、Ｔｒｐ）の後に配置され得る。これは、提示カセットとファージ抗体提示ベクター（ＰＡＤＶ）中の他の遺伝子との間の相互作用を減少させる。

本発明の方法の別の実施形態において、このファージまたはファージミドは、Ｆａｂ以外のタンパク質を、他のタンパク質遺伝子で置換することによって、上記のＦａｂ部分を提示し得る。

種々の宿主を、本発明の提示ファージまたはファージミドの増殖のために使用し得る。このような宿主は、当該分野で周知である。好ましい実施形態において、Ｆａｂが提示される場合、好ましい宿主は３０℃で増殖し、そしてＲｅｃＡ⁻（望まない遺伝子組み換えを減少させるため）およびＥｎｄＡ⁻（ＲＦ ＤＮＡの回収を容易化するため）であり得る。エレクトロポレーションによって容易に形質転換される宿主株もまた好ましい。

ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、これらの好ましさのほとんどを満足させるが、３０℃ではあまり増殖しない。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、３８℃でゆっくりと増殖し、従って、許容可能な宿主である。ＴＧ−１はまた、中間宿主としてより好ましいが、ＲｅｃＡ^＋およびＥｎｄＡ^＋である。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’は、ライブラリーの最終構築の前の多様性を蓄積するために使用される中間宿主としてより好ましい。

提示後、本発明のライブラリーを、周知かつ慣用的に使用される技術を使用してスクリーニングし得る。次いで、選択されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、疾患を処置するために使用し得る。一般に、治療または薬学的組成物における使用のためのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、選択されるライブラリーのメンバーから所望のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって生成する。次いで、このＤＮＡを、慣用的な方法において使用して、適切な宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）においてコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生成する。単離後、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、単独でか、または疾患を処置するための治療において薬学的に受容可能な組成物と共に使用する。

（実施例）
（実施例１：ＢｓｍＡＩを用いるκ鎖の捕捉）
ヒトκ鎖ｍＲＮＡのレパートリーを、種々の自己免疫疾患を有する患者の集団から単離した総ＲＮＡまたはポリ（Ａ＋）ＲＮＡを仔ウシ腸ホスファターゼで処理して、例えば、リボソームＲＮＡ、フラグメント化ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを有する全ての分子から５’−リン酸を除去することによって調製した。全長のｍＲＮＡ（保護的７−メチルキャップ構造を含む）は、影響されない。次いで、ＲＮＡを、タバコ酸ピロホスファターゼで処理して、５’−一リン酸基を残して全長のｍＲＮＡからキャップ構造を除去する。

全長のｍＲＮＡを、５’末端でアダプターによって改変し、次いで、逆転写し、そしてＧｅｎｅｒＲＡＣＥ^ＴＭ方法およびキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して増幅した。アダプターに相補的な５’ビオチン化プライマー、および構築物の領域の一部に相補的な３’プライマーを使用した。

上方の鎖の５’末端にビオチンを結合した約２マイクログラム（μｇ）のヒトκ鎖（Ｉｇκ）遺伝子ＲＡＣＥ材料を、２００マイクロリットル（μＬ）のＳｅｒａｄｙｎ磁気ビーズ上に固定した。下方の鎖を、２アリコートの２００μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１３）で、第一のアリコートについて３分間、次いで第二のアリコートについて３０秒間、ＤＮＡを洗浄することによって除去した。これらのビーズを、２００μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ ＮａＣｌで中和した。表５２５に示した短いオリゴヌクレオチドを、１００μＬのＮＥＢ緩衝液２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）中に４０倍モル過剰に、乾燥ビーズに添加した。この混合物を、９５℃で５分間インキュベートし、次いで、３０分かけて５５℃まで冷却した。過剰なオリゴヌクレオチドを、ＮＥＢ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオトレイトール ｐＨ７．９）で２回洗浄して除去した。１０単位のＢｓｍＡＩ（ＮＥＢ）を、ＮＥＢ緩衝液３に添加し、そして５５℃で１時間インキュベートした。切断された下流のＤＮＡを、収集し、そしてＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムで精製した（図３および図４）。

部分的に二本鎖のアダプターを、表５２５に示したオリゴヌクレオチドを使用して調製した。このアダプターを、１０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と共に１００倍モル過剰に一本鎖ＤＮＡに添加し、そして１６℃で一晩インキュベートした。過剰なオリゴヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムで除去した。この連結材料を、表５２５に示したプライマーｋａｐＰＣＲｔ１およびｋａｐｆｏｒを使用するＰＣＲによって、表５３０に示したプログラムで１０サイクル増幅した。

可溶性ＰＣＲ産物を、ゲルで泳動し、そして予測されるような約７００ｎのバンドを示した（図５および図６）。このＤＮＡを、酵素ＡｐａＬＩおよびＡｓｃＩで切断し、ゲル精製し、そして同様に切断したベクターｐＣＥＳ１に連結した。正確なサイズの挿入物の存在を、図１５に示したように、いくつかのクローンでＰＣＲによってチェックした。

表５００は、この手順によって捕捉されたκ軽鎖のＤＮＡ配列を示す。表５０１は、この手順によって捕捉された第二の配列を示す。最も近い架橋配列は、配列５’−ａｇｃｃａｃｃ−３’に相補的であったが、捕捉された配列は５’−Ｔｇｃｃａｃｃ−３’と読め、これは、重複領域中にいくつかのミスマッチを寛容したことを示す。

（実施例２：Ｖ−３−２３ ＶＨフレームワークにおける合成ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の多様性の構築）
合成相補性決定基領域（ＣＤＲ）１および２の多様性を、二段階のプロセスで３−２３ ＶＨフレームワークにおいて構築した：第一に、３−２３ ＶＨフレームワークを含むベクターを構築し、次いで、合成ＣＤＲ１および２を、構築してこのベクター中にクローニングした。

Ｖ３−２３フレームワークの構築のために、重複する８つのオリゴおよび２つのＰＣＲプライマー（表６００に示した長いオリゴヌクレオチド：ＴＯＰＦＲ１Ａ、ＢＯＴＦＲ１Ｂ、ＢＯＴＦＲ２、ＢＯＴＦＲ３、Ｆ０６、ＢＯＴＦＲ４、ＯＮ−ｖｇＣ１、およびＯＮ−ｖｇＣ２ならびにプライマー：ＳＦＰＲＥＭＴおよびＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を、Ｖ３２３ ＶＨのＧｅｎｂａｎｋの配列に基づいて設計した。この設計は、表６００に示されるような、各々のフレームワークにおける少なくとも１つの有用な制限部位を取り込んだ。表６００において、合成された断片を太字として示し、重複する領域に下線を付し、そして各末端でのＰＣＲプライマー領域に下線を付した。これら８つのオリゴの混合物を、２０μｌのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応中の２．５μＭの最終濃度で組み合わせた。このＰＣＲ混合物は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２Ｕ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ^ＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、および１×Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で３０秒の１０サイクルからなった。次いで、１００μｌ ＰＣＲ反応における最初のＰＣＲからの１０倍希釈の２．５μｌを使用して、構築されたＶ３−２３ ＤＮＡ配列を増幅した。このＰＣＲ反応は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２Ｕ Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ^ＴＭＤＮＡポリメラーゼ、１Ｕ Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、１×Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度での２つの外側のプライマー（ＳＦＰＲＭＥＴおよびＢＯＴＰＣＲＰＲＩＭ）を含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で６０秒の２３サイクルからなった。このＶ３−２３ ＶＨ ＤＮＡ配列を、設計し、そしてＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用してｐＣＥＳ１（ファスミドベクター）にクローニングした（本明細書中で記載した全ての制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡによって供給され、そして製造業者の指示通りに使用した）。

ＣＤＲ１／ＣＤＲ２多様性のクローニング前に、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列（表６１０および表６２０に示す）を、ｐＣＥＳ１に導入してＣＤＲ１／ＣＤＲ２配列（ＢｓｐＥＩ制限酵素部位とＸｂａＩ制限酵素部位との間の９００塩基）およびＣＤＲ３配列（ＡｆｌＩＩとＢｓｔＥＩＩとの間の３５８塩基）を置換した。新規のベクターは、ｐＣＥＳ５であり、そしてその配列を、表６２０に与える。ＣＤＲの代わりにスタッファーを有することは、親配列がライブラリーにおいて過剰に提示される危険性を回避する。このＣＤＲ１−２スタッファーは、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｃｌＩ、ＸｃｍＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨｐａＩおよびＨｉｎｃＩＩについての制限部位、ベクターｐＣＥＳ５内に独自である、強調された領域を含む。ＣＤＲ３を置換するこのスタッファーは、独自の制限エンドヌクレアーゼ部位、ＲｓｒＩＩを含む。このスタッファー配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのペニシリン遺伝子由来のフラグメントである。

ＣＤＲ１およびＣＤＲ２多様性の構築のために、ＣＤＲ１／２および隣接領域をコードする４つの重複オリゴヌクレオチド（表６００および表６３０に示したＯＮ−ｖｇＣ１、ＯＮ＿Ｂｒ１２、ＯＮ＿ＣＤ２Ｘｂａ、およびＯＮ−ｖｇＣ２）を設計した。これら４つのオリゴの混合物を、４０μｌ ＰＣＲ反応物中２．５μＭの最終濃度で組み合わせた。４つのオリゴのうち２つは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に位置する、変化させた配列を含んだ。このＰＣＲ混合物は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、および２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液を含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６０秒の１０サイクルからなった。これは、１００μｌ ＰＣＲ反応物中の２．５μｌの混合物を使用して、増幅されたＣＤＲ１／２ ＤＮＡ配列を構築した。このＰＣＲ反応物は、２００μＭ ｄＮＴＰ、２．５Ｕ Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む１×Ｐｗｏ ＰＣＲ緩衝液、および１μＭの濃度で２つの外側のプライマーを含んだ。このＰＣＲプログラムは、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で６０秒の１０サイクルからなった。これらの変化された配列を、消化し、そしてＣＤＲ１／２スタッファーの代わりにＶ３−２３フレームワーク中にクローニングした。

本発明者らは、約７×１０^７の独立形質転換体を得た。この多様性に、本発明者らは、ドナー集団または合成ＤＮＡのいずれかからＣＤＲ３多様性をクローニングし得る。

上記は、本発明の原理を例示するのみであり、そして本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者によって種々の改変がなされ得ることが理解される。

Claims (13)

1. ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして該ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
   （ｉ）プライマーを用いて核酸を増幅する工程であって、ここで、該プライマーのうちの１つは、該核酸に結合された合成配列の少なくとも一部に対して相補的である、工程；
   （ｉｉ）該増幅した核酸を一本鎖にする工程；
   （ｉｉｉ）該増幅した一本鎖核酸を、一本鎖オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、切断が所望される領域において該一本鎖核酸に対して相補的であり、ここで、該一本鎖核酸と該一本鎖オリゴヌクレオチドとが会合して、該一本鎖核酸の局部的に二本鎖の領域を形成し、そしてここで該局部的に二本鎖の領域は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む、工程；および
   （ｉｖ）該核酸を該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で切断する工程であって、ここで、該切断工程は、制限エンドヌクレアーゼを該局部的に二本鎖の領域に接触させる工程を含み、ここで、該制限エンドヌクレアーゼは、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位に特異的であり、そして該切断は、該核酸から全ての望ましくない５’ヌクレオチドを除去する、工程；
   を包含する方法によって入手可能な複数の核酸によってコードされ、
   該接触工程および該切断工程は、ある温度で行われ、ここで、該該一本鎖核酸と該一本鎖オリゴヌクレオチドとが会合して、該一本鎖核酸の局部的に二本鎖の領域を形成し、ここで、該一本鎖核酸の残部は一本鎖であり、そしてここで、該制限エンドヌクレアーゼは、該温度で活性である、ライブラリー。
2. ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の多種多様なファミリーのメンバーを提示し、そして該ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する、遺伝的パッケージの収集物を含むライブラリーであって、該提示されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、以下の工程：
   （ｉ）プライマーを用いて核酸を増幅する工程であって、ここで、該プライマーのうちの１つは、該核酸に結合された合成配列の少なくとも一部に対して相補的である、工程；
   （ｉｉ）該増幅した核酸を一本鎖にする工程；
   （ｉｉｉ）該増幅した一本鎖核酸を、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドの一本鎖領域は、切断が所望される領域において該一本鎖核酸に対して相補的であり、ここで、該オリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有し、ここで、該一本鎖核酸と該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域とが会合して、該一本鎖核酸の局部的に二本鎖の領域を形成し、そしてここで該局部的に二本鎖の領域は、ＩＩ−Ｓ型切断部位を含む、工程；ならびに
   （ｉｖ）該核酸を該ＩＩ−Ｓ型切断部位で切断する工程であって、該切断工程は、ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼを、該一本鎖核酸の該局部的に二本鎖の領域に接触させる工程を含み、ここで、該ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩ−Ｓ型エンドヌクレアーゼ認識部位に特異的である、工程；
   を包含する方法によって入手可能な複数の核酸によってコードされ、
   該接触工程および該切断工程は、ある温度で行われ、ここで、該一本鎖核酸と該オリゴヌクレオチドの該一本鎖領域とが会合して、該一本鎖核酸の局部的に二本鎖の領域を形成し、ここで、該一本鎖核酸の残部は一本鎖であり、そしてここで、該ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼは、該温度で活性である、ライブラリー。
3. 前記方法が、工程（ｉ）における増幅の前に、前記多種多様なファミリーのメンバーをコードする核酸の収集物を調製する工程をさらに含む、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
4. 前記方法が、工程（ｉｖ）における切断の後に、前記切断された核酸によって少なくとも部分的にコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のファミリーのメンバーを、前記遺伝的パッケージの表面上に提示し、そして該ファミリーの多様性の少なくとも一部を集合的に提示する工程をさらに含む、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
5. 前記核酸が、免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
6. 前記核酸が、Ｆａｂまたは単鎖Ｆｖをコードする、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
7. 前記核酸が、重鎖の少なくとも一部、または軽鎖の少なくとも一部を含む免疫グロブリンをコードする、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
8. 前記核酸配列の少なくとも一部が、少なくとも１つの自己免疫疾患および／またはがんを罹患した患者由来である、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
9. 前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭａｅＩＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐｈＩ、ＢｓａＪＩ、ＡｌｕＩ、ＢｌｐＩ、ＤｄｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｌＩ、ＢｓｉＥＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＨａｅＩＩＩ、Ｂｓｔ４ＣＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ、ＭｎｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＢｓｍＡＩ、ＢｐｍＩ、ＸｍｎＩ、およびＳａｃＩを含む群から選択される、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
10. 前記ＩＩ−Ｓ型制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｒＩＣＡＣ、ＡｃｅＩＩＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｉＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、Ｓｔｈ１３２Ｉ、ＳｔｓＩ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、またはＵｂａＰＩを含む群から選択される、請求項２に記載のライブラリー。
11. 前記核酸が、ＶＨ ３−２３のフレームワーク領域をコードする配列をさらに含む、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
12. 前記遺伝的パッケージがＭ１３ファージである、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。
13. 前記核酸が、ファージベクターまたはファージミドベクター中にある、請求項１または請求項２に記載のライブラリー。

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