JP2017113028A - 向上した薬物動態を有する抗ｃ５抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】本開示は、とりわけ終末補体（例えば、Ｃ５ｂ−９ ＴＣＣのアセンブリ及び／または活性）及びＣ５ａアナフィラトキシン媒介炎症を阻害するため、ひいては補体関連障害を治療するために有用な抗体を提供する。【解決手段】該抗体は、エクリズマブと比べていくつかの向上した特性を有し、これは例えば、ヒトにおける血清半減期の増加を含む。この開示は、本明細書に記載の新たな抗体が、標的媒介クリアランスに対する感受性を低減し、ひいては既知の抗Ｃ５抗体と比較して、血中のより長い血清排出半減期（半減期）を有することも示す。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６１／９４９，９３２号（２０１４年３月７日出願）に対する優先権及び利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は、医学、免疫学、分子生物学、及びタンパク質化学である。
補体系は、身体の他の免疫系と併せて作用して、細胞及びウイルス病原体の侵入から防御する。少なくとも２５の補体タンパク質があり、それらは血漿タンパク質及び膜共因子の複合の集合体として見出される。血漿タンパク質は、脊椎動物血清中のグロブリンの約１０％を構成する。補体成分は、一連の複雑だが精密な酵素的切断及び膜結合事象において相互作用することによって、それらの免疫防御機能を達成する。結果として生じる補体カスケードは、オプソニン、免疫調節、及び溶解機能を有する生成物の生成につながる。補体活性に関連した生物活性の簡潔な概要は、例えば、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎにおいて提供される。
補体カスケードは、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路、または代替経路（ＡＰ）を介して進行することができる。レクチン経路は、典型的に、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）の、高マンノース基質への結合で開始される。ＡＰは、抗体非依存性であり得、病原体表面上の特定分子によって開始され得る。ＣＰは、典型的に、標的細胞上の抗原部位の抗体認識、及びその部位への結合によって開始される。これらの経路は、補体成分Ｃ３が、活性プロテアーゼによって切断され、Ｃ３ａ及びＣ３ｂを産出する点である、Ｃ３転換酵素において合流する。
ＡＰ Ｃ３転換酵素は、血液の血漿画分中に豊富にある補体成分Ｃ３の自然加水分解によって開始される。「チックオーバー」としても知られるこのプロセスは、Ｃ３中のチオエステル結合の自然切断を通じて起こり、Ｃ３ｉまたはＣ３（Ｈ２Ｏ）を形成する。チックオーバーは、活性化されたＣ３の結合を支持する、及び／または中性もしくは陽性電荷特性を有する表面（例えば、細菌細胞表面）の存在によって促進される。このＣ３（Ｈ２Ｏ）の形成は、血漿タンパク質Ｂ因子の結合を可能にし、これが今度は、Ｄ因子がＢ因子をＢａ及びＢｂに切断するのを可能にする。Ｂｂ断片は、Ｃ３に結合されたままでＣ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂを含有する複合体、すなわち「流体相」または「開始」Ｃ３転換酵素を形成する。少量で生成されるに過ぎないが、流体相Ｃ３転換酵素は、複数のＣ３タンパク質をＣ３ａ及びＣ３ｂに切断することができ、Ｃ３ｂの生成、及び表面（例えば、細菌表面）へのＣ３ｂの後続の共有結合をもたらす。表面結合したＣ３ｂに結合したＢ因子は、Ｄ因子によって切断され、ひいてはＣ３ｂ，Ｂｂを含有する表面結合したＡＰ Ｃ３転換酵素複合体を形成する。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５７：３２１−３４７を参照されたい。）
ＡＰ Ｃ５転換酵素、すなわち（Ｃ３ｂ）２，Ｂｂは、第２のＣ３ｂモノマーの、ＡＰ Ｃ３転換酵素への付加時に形成される。（例えば、Ｍｅｄｉｃｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １４４：１０７６−１０９３、及びＦｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １４２：８５６−８６３を参照されたい。）第２のＣ３ｂ分子の役割は、Ｃ５に結合して、Ｂｂによる切断のためにそれを提示することである。（例えば、Ｉｓｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４：３２６−３３１を参照されたい。）ＡＰ Ｃ３及びＣ５転換酵素は、例えば、上記Ｍｅｄｉｃｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９７６）に記載されるように、三量体タンパク質プロパージンの付加によって安定化される。しかしながら、プロパージン結合は、機能する代替経路Ｃ３またはＣ５転換酵素を形成するために必要とされない。（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７５：３９４８−３９５２、及びＳｉｓｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：５５９−５６２を参照されたい）。
ＣＰ Ｃ３転換酵素は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、及びＣ１ｓの複合体である補体成分Ｃ１の、標的抗原（例えば、微生物抗原）に結合される抗体との相互作用時に形成される。Ｃ１のＣ１ｑ部分の、抗体−抗原複合体への結合は、Ｃｌｒを活性化するＣ１中の配座変化を引き起こす。次に、活性Ｃ１ｒは、Ｃ１関連Ｃ１ｓを切断し、それにより活性セリンプロテアーゼを生成する。活性Ｃ１ｓは、補体成分Ｃ４をＣ４ｂ及びＣ４ａに切断する。Ｃ３ｂと同様に、新たに生成されたＣ４ｂ断片は、標的表面（例えば、微生物細胞表面）上の好適な分子とのアミドまたはエステル結合を容易に形成する、高反応性チオールを含有する。Ｃ１ｓはまた、補体成分Ｃ２をＣ２ｂ及びＣ２ａに切断する。Ｃ４ｂ及びＣ２ａによって形成された複合体は、ＣＰ Ｃ３転換酵素であり、Ｃ３をＣ３ａ及びＣ３ｂにプロセスすることができる。ＣＰ Ｃ５転換酵素、すなわちＣ４ｂ、Ｃ２ａ、Ｃ３ｂは、Ｃ３ｂモノマーの、ＣＰ Ｃ３転換酵素への付加時に形成される。（例えば、Ｍuｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）、上記及びＣｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：７７５−７９３を参照されたい。）
Ｃ３及びＣ５転換酵素におけるその役割に加えて、Ｃ３ｂは、マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上に存在する補体受容体とのその相互作用を通じて、オプソニンとしても機能する。Ｃ３ｂのオプソニン機能は、一般に、補体系の最も重要な抗感染機能のうちの１つであると考えられている。Ｃ３ｂ機能を遮断する遺伝子病変を有する患者は、幅広い病原体により感染しやすいが、補体カスケード配列のより後に病変を有する患者、すなわち、Ｃ５機能を遮断する病変を有する患者は、ナイセリア感染症にのみ感染しやすく、そして幾分より感染しやすいのみであることが見出される。
ＡＰ及びＣＰ Ｃ５転換酵素は、Ｃ５をＣ５ａ及びＣ５ｂに切断する。Ｃ５の切断は、強力なアナフィラトキシン及び走化性因子であるＣ５ａ、及び溶解終末補体複合体Ｃ５ｂ−９の形成を可能にするＣ５ｂを放出する。Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、及びＣ８と組み合わさって、標的細胞の表面にＣ５ｂ−８複合体を形成する。いくつかのＣ９分子の結合時に、膜攻撃複合体（ＭＡＣ、Ｃ５ｂ−９、終末補体複合体、すなわちＴＣＣ）が形成される。十分な数のＭＡＣが標的細胞膜に挿入されるとき、それらが作り出す開口部（ＭＡＣ細孔）は、標的細胞の急速な浸透圧溶解を媒介する。
適切に機能している補体系は、感染する微生物に対して頑強な防御を提供するが、補体経路の不適切な調節または活性化は、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、ループス腎炎、喘息、虚血再灌流傷害、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ））、溶血、高肝酵素及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、少数免疫性血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、外傷性脳損傷、ならびに心筋梗塞、心肺バイパス、及び血液透析から生じる損傷を含む、様々な障害の発病に関係があるとされてきた。（例えば、Ｈｏｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２３：３００−３１６を参照されたい。）補体活性化の下方調節は、様々な動物モデルにおいていくつかの疾患適応を治療する際に有効であることが実証された。例えば、Ｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５（１１）：１２５６−１２６４、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：８５６３−８５６８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：８９５５−８９５９、Ｒｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９６：１５６４−１５７２、Ｋｒｏｓｈｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６０：１１９４−１２０２、Ｈｏｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：１０５５−１０６４、Ｗｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１４６−１５１、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６８：Ｈ４４８−Ｈ４５７、及びＲａｂｉｎｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：１７４４ １７５０を参照されたい。
Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５７：３２１−３４７
本開示は、例えば、治療目的で使用される既知の抗Ｃ５抗体と比べて、より向上した特性のうちの１つを有する抗Ｃ５抗体に関する。例えば、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、エクリズマブの血清排出半減期と比べて増加した血清寿命を呈する。それらの向上した薬物動態特性のために、本明細書に記載の抗体は、多くの利点、例えば、完全長または成熟Ｃ５に結合し、その切断を阻害する他の抗Ｃ５抗体を超える利点を特徴とする。かかる抗Ｃ５抗体と同様に、本明細書に記載の抗体は、Ｃ５ａ媒介炎症反応、及びＣ５の切断から生じるＣ５ｂ（ＭＡＣ）依存性細胞溶解を阻害することができる。しかしながら、ヒト血漿中のＣ５の濃度は、約０．３７μＭであるため（Ｒａｗａｌ ａｎｄ Ｐａｎｇｂｕｒｎ（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６（４）：２６３５−２６４２）、エクリズマブなどの抗Ｃ５抗体の高濃度使用及び／または頻繁な投与が、ヒトにおいてＣ５を有効に阻害するためにしばしば必要である。本開示は、実施例において、抗Ｃ５抗体が、インビトロ及びインビボで補体を阻害することにおいて非常に有効であるが（例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２を参照されたい）、抗体が、血中の高濃度のＣ５のために、標的媒介クリアランスに対して特に感受性であることを証明する、実験データを記載する。この開示は、本明細書に記載の新たな抗体が、標的媒介クリアランスに対する感受性を低減し、ひいては既知の抗Ｃ５抗体と比較して、血中のより長い血清排出半減期（半減期）を有することも示す。
それらの長い半減期を考慮して、本明細書に記載の抗体は、既知の抗Ｃ５抗体（例えば、エクリズマブ）よりもはるかに低い用量、及び／または少ない頻度でヒトに投与することができ、ヒトにおいて同じもしくはより高いＣ５の阻害を有効にもたらす。例えば、エクリズマブの用量と比較して、より少ない用量の抗体を投与する能力は、例えば、皮下投与、筋内投与、肺内送達、及び生物学的に分解可能な微小体の使用を介した投与などの追加の送達経路も可能にする。
したがって、一態様において、本開示は、エクリズマブと比べて１つ以上の向上した特性（例えば、向上した薬物動態特性）を有する抗Ｃ５抗体を特徴とする。抗体またはそのＣ５結合断片は、（ａ）補体成分Ｃ５に結合する、（ｂ）Ｃ５の、断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害する、ならびに（ｃ）（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むものであり、（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つ）のアミノ酸（複数可）が、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ２の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号４に対して８位のグリシンは、異なるアミノ酸（例えば、ヒスチジン）で置換される。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、置換は、配列番号１に対して１位のグリシン、配列番号１に対して２位のチロシン、配列番号１に対して３位のイソロイシン、配列番号１に対して４位のフェニルアラニン、配列番号１に対して５位のセリン、配列番号１に対して６位のアスパラギン、配列番号１に対して７位のチロシン、配列番号１に対して８位のトリプトファン、配列番号１に対して９位のイソロイシン、配列番号１に対して１０位のグルタミン、配列番号２に対して１位のグルタミン酸、配列番号２に対して２位のイソロイシン、配列番号２に対して３位のロイシン、配列番号２に対して４位のプロリン、配列番号２に対して５位のグリシン、配列番号２に対して６位のセリン、配列番号２に対して７位のグリシン、配列番号２に対して８位のセリン、配列番号２に対して９位のトレオニン、配列番号２に対して１０位のグルタミン酸、配列番号２に対して１１位のチロシン、配列番号２に対して１２位のトレオニン、配列番号２に対して１３位のグルタミン酸、配列番号２に対して１４位のアスパラギン、配列番号２に対して１５位のフェニルアラニン、配列番号２に対して１６位のリジン、配列番号２に対して１７位のアスパラギン酸、配列番号３に対して１位のチロシン、配列番号３に対して２位のフェニルアラニン、配列番号３に対して３位のフェニルアラニン、配列番号３に対して４位のグリシン、配列番号３に対して５位のセリン、配列番号３に対して６位のセリン、配列番号３に対して７位のプロリン、配列番号３に対して８位のアスパラギン、配列番号３に対して９位のトリプトファン、配列番号３に対して１０位のチロシン、配列番号３に対して１１位のフェニルアラニン、配列番号３に対して１２位のアスパラギン酸、及び配列番号３に対して１３位のバリンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、置換は、配列番号４に対して８位のグリシン、配列番号４に対して１０位のロイシン、配列番号６に対して３位のバリン、及び配列番号６に対して６位のトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、置換は、配列番号１に対して２位のチロシン、配列番号１に対して９位のイソロイシン、配列番号２に対して３位のロイシン、及び配列番号２に対して８位のセリンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号１に対して２位のチロシン及び配列番号２に対して３位のロイシンの両方は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号１に対して９位のイソロイシン及び配列番号２に対して８位のセリンの両方は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号１に対して９位のイソロイシン及び配列番号２に対して３位のロイシンの両方は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号１に対して２位のチロシン及び配列番号２に対して８位のセリンの両方は、異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、表１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、アミノ酸置換の組み合わせは、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ポリペプチド中の配列番号４に対して８位のグリシンに対する異なるアミノ酸の置換、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチド中の配列番号１に対して２位のグリシンに対する異なるアミノ酸の置換、及び（ｉｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチド中の配列番号２に対して８位のセリンに対する異なるアミノ酸の置換を含む。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、配列番号１に対して２位のチロシン及び配列番号２に対して８位のセリンは、ヒスチジンで置換される。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかは、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内である親和性解離定数（ＫＤ）をもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかは、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．２ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内であるＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかは、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．５ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内であるＫＤをもってＣ５に結合する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかは、ｐＨ６．０及び２５℃で、≧１ｎＭ（例えば、≧５０ｎＭ、≧１００ｎＭ、または≧１μＭ）であるＫＤをもってＣ５に結合する。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、［（ｐＨ６．０及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］は、２５を超える。本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、［（ｐＨ６．０及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］は、１００を超える（例えば、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１５００、１６００、１８００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、または８５００を超える）。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、ｐＨ７．４及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤは、１ｎＭ未満（例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｎＭ未満）である。
実施例に記載されるいくつかの変異エクリズマブ分子の特徴に基づいて、発明者らは、エクリズマブと比較して向上した薬物動態特性を有する抗体の新たな属を発見した。この属内の抗体は、ｐＨ７．４でのＣ５に対するエクリズマブの親和性よりも弱い、Ｃ５に対する親和性を有する。それでも、これらの抗体は、ｐＨ７．４で、１ｎＭ以下のＣ５に対する親和性解離定数（ＫＤ）を有する。本開示は、任意の特定の理論または作用機序に拘束されないが、発明者らは、ｐＨ７．４でのＣ５に対するエクリズマブの親和性をわずかに低減すること、及びｐＨ６．０でのＣ５に対する抗体の親和性に対するその後次の影響が、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で同じ／同様の親和性の比率を維持しながら、患者において結果として生じる抗体の補体阻害機能に実質的に影響を及ぼすことなく、抗体のＣ５媒介クリアランスを実質的に低減すると考える。故に、発明者らは、各々エクリズマブと比べて、必要な薬物動態特性を保持しながら向上した薬物動態特性をもたらす、抗Ｃ５抗体についての最適親和性範囲を定義した。したがって、別の態様において、本開示は、（ａ）ｐＨ７．４及び２５℃で、≦１ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）をもって補体成分Ｃ５に結合し、（ｂ）ｐＨ６．０及び２５℃で、１０ｎＭ以上のＫＤをもってＣ５に結合し、（ｃ）Ｃ５の、断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害する、単離抗体またはその抗原結合断片を特徴とし、［（ｐＨ６．０及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］は、２５以上である。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内の親和性解離定数（ＫＤ）をもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．２ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内のＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．５ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内のＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０及び２５℃で、≧１ｎＭのＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０及び２５℃で、≧５０ｎＭのＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０及び２５℃で、≧１００ｎＭのＫＤをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ６．０及び２５℃で、≧１μＭのＫＤをもってＣ５に結合する。
いくつかの実施形態において、［（ｐＨ６．０及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのＣ５に対する抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］は、５０を超える（例えば、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、または８５００を超える）。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、ＫＤ＜１ｎＭをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、ＫＤ＜０．８ｎＭをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、ＫＤ＜０．５ｎＭをもってＣ５に結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ｐＨ７．４及び２５℃で、ＫＤ＜０．２ｎＭをもってＣ５に結合する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの少なくとも１つのアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。異なるアミノ酸は、任意のアミノ酸（例えば、ヒスチジン）であり得る。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ１のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つのアミノ酸は、異なるアミノ酸で置換される。
いくつかの実施形態において、置換は、配列番号４に対して８位のグリシン、配列番号４に対して１０位のロイシン、配列番号６に対して３位のバリン、及び配列番号６に対して６位のトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。いくつかの実施形態において、置換は、配列番号１に対して２位のチロシン、配列番号１に対して９位のイソロイシン、配列番号２に対して３位のロイシン、及び配列番号２に対して８位のセリンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、表１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤＲに導入されたアミノ酸置換の組み合わせは、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片の軽鎖ポリペプチド中の配列番号４に対して８位のグリシンに対する異なるアミノ酸の置換、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチドの配列番号１に対して２位のグリシンに対する異なるアミノ酸の置換、及び（ｉｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチドの配列番号２に対して８位のセリンに対する異なるアミノ酸の置換を含む。
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換の組み合わせは、（ｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチドの配列番号１に対して２位のグリシンに対する異なるアミノ酸の置換、及び（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片の重鎖ポリペプチドの配列番号２に対して８位のセリンに対する異なるアミノ酸の置換を含む。
いくつかの実施形態において、配列番号１に対して２位のチロシン及び配列番号２に対して８位のセリンが（例えば、ヒスチジンで）置換される。
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片のうちのいずれかは、変異ヒトＦｃ定常領域が誘導された天然ヒトＦｃ定常領域の親和性よりも高い親和性をもって、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異ヒトＦｃ定常領域（例えば、変異ヒトＩｇＧ
Ｆｃ定常領域）を含む。変異Ｆｃ定常領域は、該変異ヒトＦｃ定常領域が誘導された天然ヒトＦｃ定常領域に対して、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つ以上）のアミノ酸置換を含むことができる。この置換は、例えば、天然ヒトＦｃ定常領域に対して２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、または４３６（ＥＵ付番）アミノ酸位置においてであり得る。この置換は、全てＥＵ付番で、２３７位のグリシンに対するメチオニン、２３８位のプロリンに対するアラニン、２３９位のセリンに対するリジン、２４８位のリジンに対するイソロイシン、２５０位のトレオニンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、２５２位のメチオニンに対するフェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン、２５４位のセリンに対するトレオニン、２５５位のアルギニンに対するグルタミン酸、２５６位のトレオニンに対するアスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミン、２５７位のプロリンに対するアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはバリン、２５８位のグルタミン酸に対するヒスチジン、２６５位のアスパラギン酸に対するアラニン、２７０位のアスパラギン酸に対するフェニルアラニン、２８６位のアスパラギンに対するアラニンまたはグルタミン酸、２８９位のトレオニンに対するヒスチジン、２９７位のアスパラギンに対するアラニン、２９８位のセリンに対するグリシン、３０３位のバリンに対するアラニン、３０５位のバリンに対するアラニン、３０７位のトレオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、３０８位のバリンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、またはトレオニン、３０９位のロイシンまたはバリンに対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、またはアルギニン、３１１位のグルタミンに対するアラニン、ヒスチジン、またはイソロイシン、３１２位のアスパラギン酸に対するアラニンまたはヒスチジン、３１４位のロイシンに対するリジンまたはアルギニン、３１５位のアスパラギンに対するアラニンまたはヒスチジン、３１７位のリジンに対するアラニン、３２５位のアスパラギンに対するグリシン、３３２位のイソロイシンに対するバリン、３３４位のリジンに対するロイシン、３６０位のリジンに対するヒスチジン、３７６位のアスパラギン酸に対するアラニン、３８０位のグルタミン酸に対するアラニン、３８２位のグルタミン酸に対するアラニン、３８４位のアスパラギンまたはセリンに対するアラニン、３８５位のグリシンに対するアスパラギン酸またはヒスチジン、３８６位のグルタミンに対するプロリン、３８７位のプロリンに対するグルタミン酸、３８９位のアスパラギンに対するアラニンまたはセリン、４２４位のセリンに対するアラニン、４２８位のメチオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、４３３位のヒスチジンに対するリジン、４３４位のアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン、及び４３６位のチロシンまたはフェニルアラニンに対するヒスチジンからなる群から選択されるものであり得る。
本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、変異ヒトＦｃ定常領域は、各々ＥＵ付番で、４２８位にメチオニン及び４３４位にアスパラギンを含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかは、配列番号１２もしくは１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、及び配列番号８もしくは１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。
本開示は、エクリズマブの重鎖可変領域（配列番号７）またはエクリズマブの重鎖領域のＣＤＲ（配列番号１〜３）を含む抗体も特徴とし、本明細書に記載の変異ヒトＦｃ定常領域のうちのいずれか、例えば、変異ヒトＦｃ定常領域は、各々ＥＵ付番で、４２８位にメチオニン及び４３４位にアスパラギンを含む。
一実施形態において、抗体または抗原結合断片は、エクリズマブの血清半減期と比べて、ヒトにおいて増加した半減期を有する。本明細書で使用される半減期は、体内の抗体薬物の血漿濃度が２分の１または５０％低減されるのにかかる時間として定義される。この血清濃度の５０％低減は、循環しており、自然な抗体クリアランスの方法によって除去されない薬物の量を反映する。エクリズマブの半減期は、ＰＮＨ患者では２７２＋８２時間または１１．３日であり、ａＨＵＳ患者では１２．１日であると決定された（Ｓｏｌｉｒｉｓ処方情報を参照されたい）。本明細書に記載の抗体または断片のヒトにおける半減期は、エクリズマブのヒトにおける半減期と比べて増加し得る。エクリズマブと比べた半減期の増加は、エクリズマブの半減期の少なくとも１．５倍、エクリズマブの半減期の少なくとも２倍、エクリズマブの半減期の少なくとも２．５倍、またはエクリズマブの半減期の少なくとも３倍であり得る。
本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、抗体は、ヒトにおいて少なくとも１０日以上（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日以上）の血清半減期を有する。この半減期（またはエクリズマブと比べた半減期の延長）は、いくつかの実施形態において、天然に存在するヒトＦｃ定常領域を含む本明細書に記載の抗体によって達成され得る。いくつかの実施形態において、この半減期は、本明細書に記載の変異ヒトＦｃ定常領域を含む抗体と比べて測定される。本明細書に記載の抗体または断片のヒトにおける半減期は、エクリズマブのヒトにおける半減期と比べて増加し得る。本明細書に記載の抗体のヒトにおける半減期は、少なくとも２５日、少なくとも２６日、少なくとも２７日、少なくとも２８日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも３１日、少なくとも３２日、少なくとも３３日、少なくとも３４日、または少なくとも３５日である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体または断片のうちのいずれかは、ヒト化、完全ヒト、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）、またはキメラである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその断片は、例えば、組換え抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、細胞内抗体、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ’）２断片であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその断片のうちのいずれかは、異種部分、例えば糖を含むことができる。例えば、抗体またはその断片は、グリコシル化され得る。この異種部分は、検出可能な標識、例えば、蛍光標識、発光標識、重金属標識、放射性標識、または酵素標識でもあり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかは、ＣＨＯ細胞内で作製され得る。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能なシアル酸残基を含有しない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかは、（ａ）循環中の抗体またはその抗原結合断片の安定化、及び（ｂ）循環中の抗体またはその抗原結合断片の保持、のうちの一方または両方を向上させる部分で修飾され得る。かかる部分は、ＰＥＧ（ＰＥＧ化）であり得る。
なおも別の態様において、本開示は、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のうちのいずれかの重鎖及び軽鎖ポリペプチドのうちの一方または両方をコードする核酸を特徴とする。核酸及び細胞（例えば、昆虫細胞、細菌細胞、真菌細胞、または哺乳類細胞）を含むベクター（例えば、クローニングまたは発現ベクター）も特徴とする。本開示は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを生成するための方法を更に提供する。これらの方法は、任意選択で、発現ベクター（組み込みまたは染色体外）を含有する上記細胞（または細胞の培養物）を提供することを含み、このベクターは、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片のうちのいずれかの重鎖及び軽鎖ポリペプチドのうちの一方または両方をコードする核酸を含有する。細胞もしくは細胞の培養物は、核酸によってコードされる抗体またはその抗原結合断片の細胞（もしくは細胞の培養物）による発現を可能にするために十分な条件下、及び時間にわたって培養される。この方法は、抗体またはその抗原結合断片を、細胞（もしくは培養物の細胞）から、または細胞（単数または複数）が培養された培地から単離することを含むこともできる。
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体、及び１つ以上の、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを含む、薬学的組成物を特徴とする。
別の態様において、本開示は、（ｉ）１つ以上の、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれか、及び（ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片のヒトへの送達のための手段を含む、治療キットを特徴とする。これらの手段は、例えば、シリンジまたはポンプであり得る。
なおも別の態様において、本開示は、ラベルを含む容器、及び１つ以上の、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを含む、製品を特徴とし、このラベルは、補体関連病態を有するか、有することが疑われるか、または発症する危険性のあるヒトに組成物が投与されるべきことを示す。この製品は、補体関連病態を有するか、有することが疑われるか、または発症する危険性のあるヒトを治療する際に使用するための、１つ以上の追加の活性治療薬を更に含むことができる。
別の態様において、本開示は、補体関連病態に罹患した患者を治療するための方法を特徴とし、この方法は、補体関連病態を治療するために有効な量の、１つ以上の、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかを対象に投与することを含む。補体関連病態は、例えば、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群、ループス腎炎、虚血再灌流傷害、非定型溶血性尿毒症症候群、定型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間血色素尿症、デンスデポジット病、視神経脊髄炎、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、黄斑変性、ＨＥＬＬＰ症候群、自然流産、血栓性血小板減少性紫斑病、少数免疫性血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、外傷性脳損傷、心筋炎、脳血管障害、末梢血管障害、腎血管障害、腸間膜／腸血管障害、血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチに関連した血管炎、免疫複合体血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、川崎病、静脈ガス塞栓症、ステント留置に続く再狭窄、回転式粥腫切除術、経皮的冠動脈形成術、重症筋無力症、寒冷凝集素病、皮膚筋炎、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、抗リン脂質症候群、グレーブス病、粥状動脈硬化、アルツハイマー病、全身性炎症反応敗血症、敗血症性ショック、脊髄損傷、糸球体腎炎、移植拒絶反応（例えば、腎移植）、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、デゴス病、及び劇症型抗リン脂質症候群からなる群から選択されるものであり得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２つの軽鎖ポリペプチド及び２つの重鎖ポリペプチドを含む全抗体を指す。全抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含む異なる抗体アイソタイプを含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化またはキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、及び完全ヒト抗体を含む。抗体は、様々な種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、及びマウスなどの哺乳動物のうちのいずれかにおいて作製され得るか、またはそれから誘導され得る。抗体は、精製抗体または組換え抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」、「抗原結合断片」という用語、または類似語は、標的抗原（例えば、ヒトＣ５）に結合し、その標的抗原の活性を阻害する能力を保持する抗体の断片を指す。かかる断片としては、例えば、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。ｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖが誘導される抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の両方を含む、単一ポリペプチド鎖である。加えて、細胞内抗体、ミニボディ、トリアボディ、及びダイアボディも抗体の定義に含まれ、本明細書に記載の方法での使用に適合可能である。例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１）：４７−６６、Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｋｏｒｔｔ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１）：１７７−１８９、Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２（１２）：１１２１−１１２３、Ｒｏｎｄｏｎ ａｎｄ Ｍａｒａｓｃｏ（１９９７）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５１：２５７−２８３を参照されたい（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、例えば、ラクダ化単一ドメイン抗体などの単一ドメイン抗体も含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２６：２３０−２３５、Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ １：２５３−２６３、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２３１：２５−３８、ＰＣＴ出願公開第９４／０４６７８号、及び同第９４／２５５９１号、ならびに米国特許第６，００５，０７９号を参照されたい（これらの全ては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、この開示は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を有する、２つのＶＨドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、重鎖ポリペプチドの可変領域及び軽鎖ポリペプチドの可変領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合断片は、抗体の軽鎖及び重鎖ポリペプチドのＣＤＲを含む。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）補体成分ヒトＣ５に結合し、
（ｂ）Ｃ５の、断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害し、
（ｃ）（ｉ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目２）
配列番号１２に示される重鎖可変領域、及び配列番号８に示される軽鎖可変領域を含む、項目１に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目３）
変異ヒトＦｃ定常領域であって、前記変異ヒトＦｃ定常領域が誘導された天然ヒトＦｃ定常領域の親和性よりも優れた親和性をもって、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する、変異ヒトＦｃ定常領域を更に含む、項目１または２に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目４）
前記変異ヒトＦｃ定常領域が、各々ＥＵ付番で、４２８位にメチオニン及び４３４位にアスパラギンを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目５）
配列番号１３に示される重鎖定常領域を更に含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目６）
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目７）
前記抗体が、ヒトにおいて少なくとも２５日の血清半減期を有する、項目１〜６のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目８）
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｐＨ７．４及び２５℃で、０．１ｎＭ≦ＫＤ≦１ｎＭの範囲内である親和性解離定数（ＫＤ）をもってヒトＣ５に結合する、項目１〜７のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目９）
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｐＨ６．０及び２５℃で、ＫＤ≧１０ｎＭをもってヒトＣ５に結合する、項目１〜８のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
［（ｐＨ６．０及び２５℃でのヒトＣ５に対する前記抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのヒトＣ５に対する前記抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］が、２５を超える、項目１〜９のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
単離抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）補体成分ヒトＣ５に結合し、
（ｂ）ヒトＣ５の、断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害し、
（ｃ）（ｉ）配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、
［（ｐＨ６．０及び２５℃でのヒトＣ５に対する前記抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）／（ｐＨ７．４及び２５℃でのヒトＣ５に対する前記抗体またはその抗原結合断片のＫＤ）］が、２５を超え、
前記変異ヒトＦｃ定常領域が、各々ＥＵ付番で、４２８位にメチオニン及び４３４位にアスパラギンを含み、
前記抗体が、ヒトにおいて少なくとも２５日の血清半減期を有する、前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ポリペプチド、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１１に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
配列番号１３に示される重鎖定常領域を更に含む、項目１１に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む、単離抗体。
（項目１５）
前記抗体が、ＣＨＯ細胞内で作製される、項目１４に記載の前記単離抗体。
（項目１６）
前記抗体が、検出可能なシアル酸残基を含有しない、項目１５に記載の前記単離抗体。（項目１７）
項目１４に記載の前記抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖ポリペプチドをコードする、核酸。
（項目１８）
項目１４に記載の前記抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方をコードする、核酸。
（項目１９）
項目１７または１８に記載の前記核酸を含む、ベクター。
（項目２０）
項目１７または１８に記載の前記核酸を含む、発現ベクター。
（項目２１）
項目２０に記載の前記発現ベクターを含む、細胞。
（項目２２）
抗体またはその抗原結合断片を生成するための方法であって、前記核酸によってコードされた前記抗体または抗原結合断片の項目２１に記載の細胞による発現を可能にするために十分な条件下、及び時間にわたって前記細胞を培養することを含む、前記方法。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片を単離することを更に含む、項目２２に記載の前記方法。
（項目２４）
薬学的に許容される担体、及び項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記抗体またはその抗原結合断片を含む、薬学的組成物。
（項目２５）
（ｉ）項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片、及び（ｉｉ）前記抗体またはその抗原結合断片の、ヒトへの送達のための手段を含む、治療キット。
（項目２６）
前記手段が、シリンジである、項目１９に記載の前記治療キット。
（項目２７）
製品であって、
ラベルを含む容器と、
（ｉ）項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、を含み、前記ラベルが、補体関連病態を有するか、有することが疑われるか、または発症する危険性のあるヒトに前記組成物が投与されるべきことを示す、前記製品。
（項目２８）
補体関連病態に罹患した患者を治療するための方法であって、前記補体関連病態を治療するために有効な量の項目１〜１６のいずれか一項に記載の前記単離抗体またはその抗原結合断片を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目２９）
補体関連病態に罹患した患者を治療するための方法であって、前記補体関連病態を治療するために有効な量の項目２４に記載の前記薬学的組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
（項目３０）
前記補体関連病態が、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群、ループス腎炎、虚血再灌流傷害、非定型溶血性尿毒症症候群、定型溶血性尿毒症症候群、発作性夜間血色素尿症、デンスデポジット病、視神経脊髄炎、多巣性運動ニューロパシー、多発性硬化症、黄斑変性、ＨＥＬＬＰ症候群、自然流産、血栓性血小板減少性紫斑病、少数免疫性血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、外傷性脳損傷、心筋炎、脳血管障害、末梢血管障害、腎血管障害、腸間膜／腸血管障害、血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチに関連した血管炎、免疫複合体血管炎、高安病、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、川崎病、静脈ガス塞栓症、ステント留置に続く再狭窄、回転式粥腫切除術、経皮的冠動脈形成術、重症筋無力症、寒冷凝集素病、皮膚筋炎、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、抗リン脂質症候群、グレーブス病、粥状動脈硬化、アルツハイマー病、全身性炎症反応敗血症、敗血症性ショック、脊髄損傷、糸球体腎炎、移植拒絶反応、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、デゴス病、及び劇症型抗リン脂質症候群からなる群から選択される、項目２８に記載の前記方法。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法及び材料は、下に記載されているが、本明細書に記載のものに類似するか、または相当する方法及び材料を、本開示の方法及び組成物の実施または試験において使用することもできる。本明細書で述べられる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、参照によりそれら全体が組み込まれる。
本開示の他の特徴及び利点、例えば、補体関連病態を治療または予防するための方法は、以下の説明、実施例、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
配列の簡単な説明
配列番号１は、エクリズマブの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す（混合型Ｋａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ定義の下で定義される）。
配列番号２は、エクリズマブの重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す（Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号３は、エクリズマブの重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す（混合型Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号４は、エクリズマブの軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す（Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号５は、エクリズマブの軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す（Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号６は、エクリズマブの軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す（Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号７は、エクリズマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、エクリズマブ及びＢＮＪ４４１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、エクリズマブの重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、エクリズマブの重鎖全体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、エクリズマブ及びＢＮＪ４４１抗体の軽鎖全体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＢＮＪ４４１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＢＮＪ４４１抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＢＮＪ４４１抗体の重鎖全体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＹＴＥ置換を含むＩｇＧ２重鎖定常領域変異型のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５（上記）に示される重鎖定常領域を含むエクリズマブ変異型の重鎖全体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、配列番号４に対して８位にグリシンからヒスチジンへの置換を有する、エクリズマブの軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す（Ｋａｂａｔ定義の下で定義される）。
配列番号１８は、ＥＨＧ３０３抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、配列番号２に対して８位のセリンが、ヒスチジンで置換される、エクリズマブの重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、いわゆる「ＦＬＡＧ」タグのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、抗原タグとして一般に使用されるポリヒスチジン配列を示す。
配列番号２２は、いわゆるヘマグルチニンタグのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、（配列番号１に対して）２位のチロシンが、ヒスチジンで置換される、エクリズマブの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＥＨＧ３０３抗体の重鎖ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＥＨＧ３０３抗体の軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＥＨＬ０４９抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＥＨＬ０４９抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＥＨＬ０００重鎖ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＥＨＬ０００抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＢＨＬ００６の軽鎖ポリペプチドアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＢＨＬ００６抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＢＨＬ００９抗体の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＢＨＬ００９抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＢＨＬ００１１抗体の軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＢＨＬ０１１抗体の重鎖のアミノ酸配列を示す。
外因性ヒトＣ５の存在または非存在下の、ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスの血清からのエクリズマブのクリアランスを示す線グラフである。Ｙ軸は、血清中に残留する抗体のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 マウスの血清からの、ＩｇＧ２定常領域（Ｅｃｕ−ＩｇＧ２）、及びＹＴＥ置換を含むＥｃｕ−ＩｇＧ２抗体（Ｅｃｕ−ＩｇＧ２（ＹＴＥ））を有するエクリズマブ変異型のクリアランスを示す線グラフである。Ｙ軸は、血清中に残留する抗体のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 マウスの血清からの、ＩｇＧ２定常領域（Ｅｃｕ−ＩｇＧ２）、及びＹＴＥ置換を含むＥｃｕ−ＩｇＧ２抗体（Ｅｃｕ−ＩｇＧ２（ＹＴＥ））のエクリズマブ変異型のクリアランスを示す線グラフである。実験は、外因性ヒトＣ５の存在または非存在下で行った。Ｙ軸は、血清中に残留する抗体のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ３つの抗Ｃ５抗体、すなわち、ＥＨＬ０００、ＥＨＧ３０３、及びＥＨＬ０４９に対する（ｐＨ７．４での）会合ならびに（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０での）解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、任意単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。 ＥＨＧ３０３（Ｙ２７Ｈ−Ｓ５７Ｈ二重置換）抗体、エクリズマブのＹ２７Ｈ単一置換変異型、及びエクリズマブ（ｅｃｕ、Ｅｃ２９３Ｆ）に対するｐＨ７．４及びｐＨ６．０での解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、ナノメートル（ｎｍ）単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。 ＥＨＧ３０４（Ｉ３４Ｈ−Ｌ５２Ｈ二重置換）抗体、エクリズマブのＩ３４Ｈ単一置換変異型、及びエクリズマブ（ｅｃｕ、Ｅｃ２９３Ｆ）に対するｐＨ７．４及びｐＨ６．０での解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、ナノメートル（ｎｍ）単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。ＥＨＧ３０４抗体は、選択のための第２の閾値を満たさなかった、つまり、ｐＨ７．４での解離に対する（エクリズマブからの）最大許容変動を超えた。 ＥＨＧ３０３（Ｙ２７Ｈ−Ｓ５７Ｈ二重置換）抗体及びエクリズマブ（ｅｃｕ、Ｅｃ２９３Ｆ）に対するｐＨ７．４及びｐＨ６．０での解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、ナノメートル（ｎｍ）単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。 ＥＨＬ０４９［Ｇ３１Ｈ（軽鎖）／Ｙ２７Ｈ−Ｓ５７Ｈ二重置換（重鎖）］抗体、エクリズマブのＹ２７Ｈ−Ｓ５７Ｈ（ＥＨＧ３０３）二重置換変異型、及びエクリズマブ（ｅｃｕ）に対するｐＨ７．４及びｐＨ６．０での解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、ナノメートル（ｎｍ）単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。 ＥＨＬ０５８［Ｇ３１Ｈ（軽鎖）／Ｌ５２Ｈ−Ｓ５７Ｈ二重置換（重鎖）］抗体、エクリズマブのＬ５２Ｈ−Ｓ５７Ｈ二重置換（重鎖）変異型、及びエクリズマブ（ｅｃｕ）に対するｐＨ７．４及びｐＨ６．０での解離の動態を示すセンサーグラムプロットである。Ｙ軸は、ナノメートル（ｎｍ）単位である一方で、Ｘ軸は、時間（秒単位）を表す。ＥＨＬ０５８抗体は、選択のための第２の閾値を満たさなかった、つまり、ｐＨ７．４での解離に対する（エクリズマブからの）最大許容変動を超えた。 ＥＨＬ０００、ＢＮＪ４２１、及びＢＮＪ４２３の、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／Ｃ５欠乏マウスの血清からのクリアランスを示す線グラフである。Ｙ軸は、血清中に残留する抗体のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ヒトＣ５の存在または非存在下でのＥＨＬ０００、ＢＮＪ４２１、及びＢＮＪ４２３の、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／Ｃ５欠乏マウスの血清からのクリアランスを示す線グラフである。Ｙ軸は、血清中に残留する抗体のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 体外溶血アッセイにおけるＥＨＬ０００、ＢＮＪ４２３、及びＢＮＪ４２１抗体の活性を示す線グラフである。Ｙ軸は、溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ０１１抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ０１１抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、各時点で、血清中に残留する１日目の抗体の濃度の％を表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ００６抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ００６抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、各時点で、血清中に残留する１日目の抗体の濃度の％を表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ００９抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ００９抗体の薬物動態を示す線グラフである。各線は、異なる動物を表す。Ｙ軸は、各時点で、血清中に残留する１日目の抗体の濃度の％を表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００６、及びＢＨＬ００９抗体の平均薬物動態の対数プロットを示す線グラフである。各線は、指示されるように異なる抗体を表す。Ｙ軸は、各時点で、血清中に残留する１日目の抗体の濃度の％を表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００６、及びＢＨＬ００９抗体の平均薬物動態の線形プロットを示す線グラフである。各線は、指示されるように異なる抗体を表す。Ｙ軸は、各時点で、血清中に残留する１日目の抗体の濃度の％を表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 単回投与後の体外血清溶血アッセイにおけるＢＨＬ０１１抗体の遮断能力を示す線グラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 単回投与後の体外血清溶血アッセイにおけるＢＨＬ００６抗体の遮断能力を示す線グラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 単回投与後の体外血清溶血アッセイにおけるＢＨＬ００９抗体の遮断能力を示す線グラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ＢＨＬ０１１血清濃度と、単回投与後の体外血清溶血アッセイとの相関を示すグラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、抗体濃度をμｇ／ｍＬで表す。 ＢＨＬ００６血清濃度と、単回投与後の体外血清溶血活性との相関を示すグラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、抗体濃度をμｇ／ｍＬで表す。 ＢＨＬ００９血清濃度と、単回投与後の体外血清溶血活性との相関を示すグラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、抗体濃度をμｇ／ｍＬで表す。 ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおけるＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００９、またはＢＨＬ００６の単回投与後の平均体外溶血活性を示す線グラフである。各線は、指示されるように異なる抗体を表す。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ｐＨの関数として、ＢＮＪ４４１及びエクリズマブの親和性の片対数（図２１Ａ）及び線形（図２１Ｂ）プロットを示す線グラフの対である。Ｙ軸は、解離％を表し、Ｘ軸は、ｐＨである。 ｐＨの関数として、ＢＮＪ４４１及びエクリズマブの親和性の片対数（図２１Ａ）及び線形（図２１Ｂ）プロットを示す線グラフの対である。Ｙ軸は、解離％を表し、Ｘ軸は、ｐＨである。 ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける、ヒトＣ５の非存在下でのＢＮＪ４４１及びエクリズマブの薬物動態を示す線グラフである。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおける、ヒトＣ５の存在下でのＢＮＪ４４１及びエクリズマブの薬物動態を示す線グラフである。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 時間の関数として、ヒトＣ５の存在下でＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの血清中に残留するＢＮＪ４４１及びエクリズマブのパーセンテージを示す線グラフである。Ｙ軸は、抗体の濃度をμｇ／ｍＬで表す。Ｘ軸は、時間を日数で表す。 時間の関数として、単回投与後のＢＮＪ４４１抗体及びエクリズマブの対外血清溶血遮断活性を示す線グラフである。Ｙ軸は、（投与前レベルと比べた）溶血のパーセンテージを表し、Ｘ軸は、時間を日数で表す。 ２００ｍｇまたは４００ｍｇ用量の、健康なボランティアへの静脈内投与に続く平均血清ＢＮＪ４４１濃度−時間プロファイルを示す（上パネル−線形目盛、下パネル−対数線形目盛）。 プラセボ、２００ｍｇのＢＮＪ４４１、または４００ｍｇのＢＮＪ４４１の、健康なボランティアへの静脈内投与に続く平均ニワトリ赤血球細胞溶血−時間プロファイルを示す。 ＢＮＪ４４１の、健康なヒトボランティアへの静脈内投与に続くＢＮＪ４４１濃度とニワトリ赤血球細胞溶血率との間の関係を示す。 終末補体活性アッセイにおけるエクリズマブと比較したＢＮＪ４４１の能力を示す。 ＢＮＪ４４１の構造を示す。 ＢＮＪ４４１の鎖間ジスルフィド結合を示す。
本開示は、とりわけ、終末補体（例えば、Ｃ５ｂ−９ ＴＣＣのアセンブリ及び／または活性）ならびにＣ５ａアナフィラトキシン媒介炎症を阻害するため、ひいては補体関連障害を治療するために有用な抗体を提供する。抗体は、エクリズマブと比べて、例えば、ヒトにおける血清半減期の増加を含む、いくつかの向上した特性を有する。決して限定することを意図しないが、例示的な抗体、複合体、薬学的組成物、及び製剤、ならびに上記のうちのいずれかを使用するための方法は、以下で詳しく説明され、実施例において例示される。
抗体
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、補体成分Ｃ５（例えば、ヒトＣ５）に結合し、Ｃ５の断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害する。上記のとおり、かかる抗体は、例えば、治療目的で使用される他の抗Ｃ５抗体（例えば、エクリズマブ）と比べて向上した薬物動態特性も有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、（ｉｉｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、（ｉｖ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、（ｖ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び（ｖｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、（ｉ）〜（ｖｉ）の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上）のアミノ酸（複数可）が、異なるアミノ酸で置換される。
ＣＤＲの正確な境界は、異なる方法に従って別様に定義された。いくつかの実施形態において、軽鎖または重鎖可変ドメイン内のＣＤＲまたはフレームワーク領域の位置は、Ｋａｂａｔら［（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ］によって定義されるとおりであり得る。かかる場合において、ＣＤＲは、「Ｋａｂａｔ ＣＤＲ」（例えば、「Ｋａｂａｔ ＬＣＤＲ２」または「Ｋａｂａｔ ＨＣＤＲ１」）と称され得る。いくつかの実施形態において、軽鎖または重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７−８８３によって定義されるとおりであり得る。したがって、これらの領域は、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」（例えば、「Ｃｈｏｔｈｉａ ＬＣＤＲ２」または「Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＣＤＲ３」）と称され得る。いくつかの実施形態において、軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ混合定義によって定義されるとおりであり得る。かかる実施形態において、これらの領域は、「混合型Ｋａｂａｔ−Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ」と称され得る。Ｔｈｏｍａｓら［（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７／１８）：１３８９−１４０１］は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ定義によるＣＤＲ境界の特定を例示する。
任意のアミノ酸が、任意の他のアミノ酸で置換され得る。いくつかの実施形態において、この置換は、保存的置換である。保存的置換は、典型的に、以下の群、すなわちグリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、及びトレオニン；リジン、ヒスチジン、及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシン内の置換を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸がヒスチジンで置換される。
いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ１の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ２の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。
いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ１の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ２の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、軽鎖ＣＤＲ３の少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸が、異なるアミノ酸で置換される。
いくつかの実施形態において、置換は、配列番号１に対して１位のグリシン、配列番号１に対して２位のチロシン、配列番号１に対して３位のイソロイシン、配列番号１に対して４位のフェニルアラニン、配列番号１に対して５位のセリン、配列番号１に対して６位のアスパラギン、配列番号１に対して７位のチロシン、配列番号１に対して８位のトリプトファン、配列番号１に対して９位のイソロイシン、配列番号１に対して１０位のグルタミン、配列番号２に対して１位のグルタミン酸、配列番号２に対して２位のイソロイシン、配列番号２に対して３位のロイシン、配列番号２に対して４位のプロリン、配列番号２に対して５位のグリシン、配列番号２に対して６位のセリン、配列番号２に対して７位のグリシン、配列番号２に対して８位のセリン、配列番号２に対して９位のトレオニン、配列番号２に対して１０位のグルタミン酸、配列番号２に対して１１位のチロシン、配列番号２に対して１２位のトレオニン、配列番号２に対して１３位のグルタミン酸、配列番号２に対して１４位のアスパラギン、配列番号２に対して１５位のフェニルアラニン、配列番号２に対して１６位のリジン、配列番号２に対して１７位のアスパラギン酸、配列番号３に対して１位のチロシン、配列番号３に対して２位のフェニルアラニン、配列番号３に対して３位のフェニルアラニン、配列番号３に対して４位のグリシン、配列番号３に対して５位のセリン、配列番号３に対して６位のセリン、配列番号３に対して７位のプロリン、配列番号３に対して８位のアスパラギン、配列番号３に対して９位のトリプトファン、配列番号３に対して１０位のチロシン、配列番号３に対して１１位のフェニルアラニン、配列番号３に対して１２位のアスパラギン酸、及び配列番号３に対して１３位のバリンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる。
いくつかの実施形態において、配列番号８に対して３１位のグリシンは、異なるアミノ酸で置換される。例えば、エクリズマブの軽鎖のＣＤＲ１における下線のグリシン、すなわち、
Figure 2017113028
 は、異なるアミノ酸で置換され得る。この置換は、グリシンの代わりのヒスチジン、すなわち、
Figure 2017113028
 であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、配列番号７に対して２６位のグリシン、配列番号７に対して２７位のチロシン、配列番号７に対して２８位のイソロイシン、配列番号７に対して２９位のフェニルアラニン、配列番号７に対して３０位のセリン、配列番号７に対して３１位のアスパラギン、配列番号７に対して３２位のチロシン、配列番号７に対して３３位のトリプトファン、配列番号７に対して３４位のイソロイシン、配列番号７に対して３５位のグルタミン、配列番号７に対して５０位のグルタミン酸、配列番号７に対して５１位のイソロイシン、配列番号７に対して５２位のロイシン、配列番号７に対して５３位のプロリン、配列番号７に対して５４位のグリシン、配列番号７に対して５５位のセリン、配列番号７に対して５６位のグリシン、配列番号７に対して５７位のセリン、配列番号７に対して５８位のトレオニン、配列番号７に対して５９位のグルタミン酸、配列番号７に対して６０位のチロシン、配列番号７に対して６１位のトレオニン、配列番号７に対して６２位のグルタミン酸、配列番号７に対して６３位のアスパラギン、配列番号７に対して６４位のフェニルアラニン、配列番号７に対して６５位のリジン、配列番号７に対して６６位のアスパラギン酸、配列番号７に対して９９位のチロシン、配列番号７に対して１００位のフェニルアラニン、配列番号７に対して１０１位のフェニルアラニン、配列番号７に対して１０２位のグリシン、配列番号７に対して１０３位のセリン、配列番号７に対して１０４位のセリン、配列番号７に対して１０５位のプロリン、配列番号７に対して１０６位のアスパラギン、配列番号７に対して１０７位のトリプトファン、配列番号７に対して１０８位のチロシン、配列番号７に対して１０９位のフェニルアラニン、配列番号７に対して１１０位のアスパラギン酸、及び配列番号７に対して１１１位のバリンからなる群から選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、上記の置換のうちのいずれかの２つ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上）、及び任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、エクリズマブに関して以下の基準を満たす少なくとも１つの置換を含む。
（１）ｐＨ７．４での会合動態の最大変動が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒で３３％小さいピーク相シフト、
（２）ｐＨ７．４での解離動態の最大変動が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒超で３倍以下のピーク相シフトの低減、及び
（３）ｐＨ６．０での解離動態の最小変化が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒超で少なくとも３倍低減したピーク相シフト。
例えば、上記の基準（１）に関して、エクリズマブとの会合の８００秒後の平均化ピーク相シフトが、約０．７５ｎＭである場合、０．５ｎＭ未満の相シフトを有する（例えば、２回以上再現した）試験抗体は、上記基準を満たさない。対照的に、８００秒で０．５ｎＭを超えるピーク相シフトを有する抗Ｃ５抗体は、第１の基準を満たす。かかる置換は、ｐＨ７．４でのエクリズマブのｋａ及びｋｄからわずかに逸脱する抗Ｃ５抗体を生じるが、ｐＨ６．０でのエクリズマブのｋｄからより著しく逸脱する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、配列番号８に対して３１位のグリシン、配列番号８に対して３３位のロイシン、配列番号８に対して９１位のバリン、及び配列番号８に対して９４位のトレオニンからなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、または４つ）のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、配列番号７に対して２７位のチロシン、配列番号７に対して３４位のイソロイシン、配列番号７に対して５２位のロイシン、及び配列番号７に対して５７位のセリンからなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）のアミノ酸置換（複数可）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、その軽鎖可変領域内に、以下から選択される少なくとも１つの置換、すなわち、配列番号８に対して３１位のグリシン、配列番号８に対して３３位のロイシン、配列番号８に対して９１位のバリン、及び配列番号８に対して９４位のトレオニンを含む。下の表１を参照されたい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、その重鎖可変領域内に、以下から選択される少なくとも１つの置換、すなわち、配列番号７に対して２７位のチロシン、配列番号７に対して３４位のイソロイシン、配列番号７に対して５２位のロイシン、及び配列番号７に対して５７位のセリンを含む。下の表１を参照されたい。
いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１〜６によって定義されるＣＤＲセットに対して、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸置換を含む。故に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、表１に記載される組み合わせ、及びアミノ酸位置に２つ以上の置換を含む。
Figure 2017113028
Figure 2017113028
Figure 2017113028
表１に記載される置換は、指示されたアミノ酸残基とは異なる任意のアミノ酸に対してであり得る。いくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、配列番号７に対して２７位のチロシン、配列番号７に対して３４位のイソロイシン、配列番号７に対して５２位のロイシン、及び配列番号７に対して５７位のセリンからなる群から選択されるアミノ酸位置で行われる置換を含む。いくつかの実施形態において、配列番号７に対して２７位のチロシン及び配列番号７に対して５２位のロイシンの両方は、各々異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、配列番号７に対して３４位のイソロイシン及び配列番号７に対して５７位のセリンの両方は、各々異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、配列番号７に対して３４位のイソロイシン及び配列番号７に対して５２位のロイシンは、各々異なるアミノ酸で置換される。いくつかの実施形態において、配列番号７に対して２７位のチロシン及び配列番号７に対して５７位のセリンの両方は、各々異なるアミノ酸で置換される。本明細書に記載の抗Ｃ５抗体のうちのいずれかのいくつかの実施形態において、異なるアミノ酸は、ヒスチジンである。例えば、２７位のチロシン及び５７位のセリンは、各々ヒスチジンで置換され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列、すなわち、
Figure 2017113028
 を含むか、またはそれからなる重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列、すなわち、
Figure 2017113028
 を含むか、またはそれからなる重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列、すなわち、
Figure 2017113028
 を含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、以下のアミノ酸配列、すなわち、
Figure 2017113028
 を含む軽鎖可変領域を含む。
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ｐＨ７．４及び２５℃で（ならびに、そうでなければ生理的条件下で）、少なくとも０．１（例えば、少なくとも０．１５、０．１７５、０．２、０．２５、０．２７５、０．３、０．３２５、０．３５、０．３７５、０．４、０．４２５、０．４５、０．４７５、０．５、０．５２５、０．５５、０．５７５、０．６、０．６２５、０．６５、０．６７５、０．７、０．７２５、０．７５、０．７７５、０．８、０．８２５、０．８５、０．８７５、０．９、０．９２５、０．９５、または０．９７５）ｎＭの親和性解離定数（ＫＤ）をもってＣ５に結合することができる。いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体のＫＤは、１ｎＭ以下（例えば、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、または０．２ｎＭ以下）である。
本明細書に記載の任意の抗Ｃ５抗体のいくつかの実施形態では、［ｐＨ６．０、ＣでのＣ５に対する抗体のＫＤ／（ｐＨ７．４、２５℃でのＣ５に対する抗体のＫＤ）］は、２１（例えば、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、または８０００）を超える。
抗体がタンパク質抗原に結合するかどうか、及び／または抗体のタンパク質抗原に対する親和性を決定するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、抗体のタンパク質抗原に対する結合は、限定されないが、ウェスタンブロット、ドットブロット、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの様々な技法を使用して検出及び／または定量され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（２００４）″Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，″Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：１５８８２９０９２１）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９２）″Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，″Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９５）″Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，″２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｏｘｆｏｒｄ、Ｊｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ １６０：１９１−１９８、Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ Ｂｉｏｌ Ｃｌｉｎ ５１：１９−２６、及びＪｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０−６２７を参照されたい。加えて、親和性（例えば、解離定数及び会合定数）を測定するための方法は、実施例に記載される。
本明細書で使用される場合、「ｋａ」という用語は、抗原に対する抗体の会合の速度定数を指す。「ｋｄ」という用語は、抗原／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指す。そして「ＫＤ」という用語は、抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。平衡解離定数は、動態速度定数の比から推測されるＫＤ＝ｋａ／ｋｄ。かかる決定は、好ましくは２５℃または３７℃で測定される（実施例を参照されたい）。例えば、ヒトＣ５に結合する抗体の動態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介して、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００器具上で、抗体を固定するための抗Ｆｃ捕捉方法を使用してｐＨ８．０、７．４、７．０、６．５、及び６．０で決定され得る。
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、Ｃ５タンパク質（例えば、ヒトＣ５タンパク質）のＣ５ａ及び／またはＣ５ｂ活性断片の生成または活性を遮断することにおいて活性を有し得る。この遮断効果を通じて、抗体は、Ｃ５ａの炎症促進効果、及び細胞の表面でのＣ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の生成を阻害する。
本明細書に記載の特定の抗体が、Ｃ５切断を阻害するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野において既知である。ヒト補体成分Ｃ５の阻害は、対象の体液中の補体の細胞溶解能力を低減し得る。体液（複数可）中に存在する補体の細胞溶解能力のかかる低減は、当該技術分野において周知の方法によって、例えば、Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｍａｙｅｒ（ｅｄｓ．），″Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，″１３５−２４０，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＣＣ Ｔｈｏｍａｓ（１９６１），ｐａｇｅｓ １３５−１３９によって記載される溶血アッセイなどの従来の溶血アッセイ、または例えば、Ｈｉｌｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０（６）：５５２に記載されるニワトリ赤血球溶血方法などの従来のアッセイの変化型などによって測定され得る。候補化合物が、ヒトＣ５のＣ５ａ及びＣ５ｂ形態への切断を阻害するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６２：３９７、Ｍｏｏｎｇｋａｒｎｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ １６５：３２３、Ｉｓｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２４（１）：３２６−３１、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３（１７−１８）：１３８９−４０１、及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２（１６）：１１８３−９５に記載されている。例えば、体液中のＣ５ａ及びＣ５ｂの濃度及び／または生理活性は、当該技術分野において周知の方法によって測定され得る。Ｃ５ａ濃度または活性を測定するための方法としては、例えば、走化性アッセイ、ＲＩＡ、またはＥＬＩＳＡが挙げられる（例えば、Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｚｖａｉｆｌｅｒ（１９７１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５０（３）：６０６−１６及びＷｕｒｚｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｉｎｆｌａｍｍ ８：３２８−３４０を参照されたい）。Ｃ５ｂの場合、本明細書で考察される溶血アッセイまたは可溶性Ｃ５ｂ−９に対するアッセイを使用することができる。当該技術分野において既知の他のアッセイを使用することもできる。これらまたは他の好適な種類のアッセイを使用して、ヒト補体成分Ｃ５を阻害することができる候補薬をスクリーニングすることができる。
限定されないが、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的技法を使用して、Ｃ５及び／またはその分割生成物のタンパク質濃度を測定し、Ｃ５の生物学的に活性な生成物への変換を阻害する、抗Ｃ５抗体の能力を決定することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ５ａの生成が測定される。いくつかの実施形態において、Ｃ５ｂ−９新エピトープ特異的抗体を使用して、終末補体の形成を検出する。
溶血アッセイを使用して、補体活性化に対する抗Ｃ５抗体の阻害活性を決定することができる。インビトロでの血清試験溶液中の古典補体経路媒介溶血に対する抗Ｃ５抗体の効果を決定するために、例えば、ヘモリシンで被覆されたヒツジ赤血球、または抗ニワトリ赤血球抗体で感作されたニワトリ赤血球を、標的細胞として使用する。溶血のパーセンテージは、阻害剤の非存在下で起こる溶血に等しい１００％溶血を考慮することによって正規化される。いくつかの実施形態において、古典補体経路は、例えば、Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）古典経路補体キット（Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）ＣＯＭＰＬ ＣＰ３１０、Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において用いられる、ヒトＩｇＭ抗体によって活性化される。簡単に言うと、試験血清を、ヒトＩｇＭ抗体の存在下、抗Ｃ５抗体でインキュベートする。生成されるＣ５ｂ−９の量は、混合物を酵素複合抗Ｃ５ｂ−９抗体及び蛍光発生基質と接触させること、ならびに適切な波長での吸光度を測定することによって測定される。対照として、試験血清を、抗Ｃ５抗体の非存在下でインキュベートする。いくつかの実施形態において、試験血清は、Ｃ５ポリペプチドで再構成されたＣ５欠乏血清である。
代替経路媒介溶血に対する抗Ｃ５抗体の影響を決定するために、未感作のウサギまたはモルモット赤血球を標的細胞として使用する。いくつかの実施形態において、血清試験溶液は、Ｃ５ポリペプチドで再構成されたＣ５欠乏血清である。溶血のパーセンテージは、阻害剤の非存在下で起こる溶血に等しい１００％溶血を考慮することによって正規化される。いくつかの実施形態において、代替補体経路は、例えば、Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）代替経路補体キット（Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）ＣＯＭＰＬ ＡＰ３３０、Ｅｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において用いられる、リポ多糖分子によって活性化される。簡単に言うと、試験血清を、リポ多糖の存在下、抗Ｃ５抗体でインキュベートする。生成されるＣ５ｂ−９の量は、混合物を酵素複合抗Ｃ５ｂ−９抗体及び蛍光発生基質と接触させること、ならびに適切な波長での蛍光を測定することによって測定される。対照として、試験血清を、抗Ｃ５抗体の非存在下でインキュベートする。
いくつかの実施形態において、Ｃ５活性、またはその阻害は、ＣＨ５０ｅｑアッセイを使用して定量される。ＣＨ５０ｅｑアッセイは、血清中の総古典補体活性を測定するための方法である。この試験は、抗体感作赤血球を古典補体経路の活性剤として、及び試験血清の様々な希釈液を使用して、５０％溶解（ＣＨ５０）をもたらすために必要な量を決定する溶解アッセイである。溶血パーセントは、例えば、分光光度計を使用して決定され得る。ＣＨ５０ｅｑアッセイは、終末補体複合体（ＴＣＣ）自体が測定される溶血に直接関与するため、ＴＣＣ形成の間接的尺度を提供する。
このアッセイは周知であり、当業者によって一般的に実施されている。簡単に言うと、古典補体経路を活性化するために、未希釈の血清試料（例えば、再構成ヒト血清試料）を、抗体感作の赤血球を含有するマイクロアッセイウェルに添加し、それによりＴＣＣを生成する。次に、活性化した血清を、捕捉試薬（例えば、ＴＣＣの１つ以上の成分に結合する抗体）で被覆されたマイクロアッセイウェル内で希釈する。活性化試料中に存在するＴＣＣは、マイクロアッセイウェルの表面を被覆するモノクローナル抗体に結合する。ウェルを洗浄し、各ウェルに、検出可能に標識され、結合したＴＣＣを認識する検出試薬を添加する。検出可能な標識は、例えば、蛍光標識または酵素標識であり得る。このアッセイ結果は、１ミリリットル当たりのＣＨ５０単位当量（ＣＨ５０Ｕ Ｅｑ／ｍＬ）で表される。
阻害は、例えば、それが終末補体活性に関する場合、類似条件下、及び等モル濃度での対照抗体（またはその抗原結合断片）の影響と比較して、例えば、溶血アッセイまたはＣＨ５０ｅｑアッセイにおいて、終末補体の活性の少なくとも５％（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０％）の減少を含む。本明細書で使用される場合、実質的な阻害は、少なくとも４０％（例えば、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％以上）の所与の活性（例えば、終末補体活性）の阻害を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、エクリズマブのＣＤＲ（すなわち、配列番号１〜６）に対して１つ以上のアミノ酸置換を含むが、溶血アッセイまたはＣＨ５０ｅｑアッセイにおいて、エクリズマブの補体阻害活性の少なくとも３０％（例えば、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％）を保持する。
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、ヒトにおいて、少なくとも２０日（例えば、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６日）の血清半減期を有する。抗体の血清半減期を測定するための方法は、当該技術分野において既知であり、実施例において例示される。例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４−２３５２４、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３−６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６−３５６、及びＰｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１２）：１７５９−６９を参照されたい（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、例えば、実施例に記載のマウスモデル系のうちの１つ（例えば、Ｃ５欠乏／ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスまたはｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスモデル系）において測定されるように、エクリズマブの血清半減期よりも少なくとも２０％（例えば、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００％）長い血清半減期を有する。
Ｆｃ領域に対する修飾
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、いくつかの実施形態において、変異ヒトＦｃ定常領域が誘導された天然ヒトＦｃ定常領域の親和性よりも優れた親和性をもって、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する変異ヒトＦｃ定常領域を含むことができる。例えば、Ｆｃ定常領域は、変異ヒトＦｃ定常領域が誘導された天然ヒトＦｃ定常領域と比べて、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、または８以上）のアミノ酸置換を含むことができる。この置換は、相互作用のｐＨ依存を維持しながら、ｐＨ６．０において、変異Ｆｃ定常領域を含むＩｇＧ抗体の、ＦｃＲｎへの結合親和性を増加させることができる。例えば、Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３−６２１６、及びＤａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３５：１−９を参照されたい。抗体のＦｃ定常領域内の１つ以上の置換が（相互作用のｐＨ依存を維持しながら）ｐＨ６．０において、ＦｃＲｎについてのＦｃ定常領域の親和性を増加させるかどうかを試験するための方法は、当該技術分野において既知であり、実施例において例示される。例えば、Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（３）：１７０９−１７１７、国際公開第９８／２３２８９号、国際公開第９７／３４６３１号、及び米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
ＦｃＲｎについての抗体Ｆｃ定常領域の結合親和性を強化する置換は、当該技術分野において既知であり、例えば、（１）Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４−２３５２４に記載のＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ三重置換、（２）Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６２１３−６２１６及びＨｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６−３５６に記載のＭ４２８ＬまたはＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ置換、ならびに（３）Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１２）：１７５９−６９に記載のＮ４３４ＡまたはＴ３０７／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ置換が挙げられる。追加の置換対合：Ｐ２５７Ｉ／Ｑ３１１Ｉ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、及びＤ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈは、例えば、Ｄａｔｔａ−Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（３）：１７０９−１７１７に記載されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、変異定常領域は、バリンに対してＥＵアミノ酸残基２５５に置換を有する。いくつかの実施形態において、変異定常領域は、アスパラギンに対してＥＵアミノ酸残基３０９に置換を有する。いくつかの実施形態において、変異定常領域は、イソロイシンに対してＥＵアミノ酸残基３１２に置換を有する。いくつかの実施形態において、変異定常領域は、ＥＵアミノ酸残基３８６に置換を有する。
いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ定常領域は、それが誘導された天然定常領域と比べて、３０以下（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２以下）のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、及びＶ３０８Ｆからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、変異ヒトＦｃ定常領域は、各々ＥＵ付番で、４２８位にメチオニン、及び４３４位にアスパラギンを含む。いくつかの実施形態において、変異Ｆｃ定常領域は、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に記載のように、４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。
いくつかの実施形態において、変異定常領域は、天然ヒトＦｃ定常領域と比べて、アミノ酸位置２３７、２３８、２３９、２４８、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２６５、２７０、２８６、２８９、２９７、２９８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１４、３１５、３１７、３２５、３３２、３３４、３６０、３７６、３８０、３８２、３８４、３８５、３８６、３８７、３８９、４２４、４２８、４３３、４３４、または４３６（ＥＵ付番）に置換を含む。いくつかの実施形態において、この置換は、全てＥＵ付番で、２３７位のグリシンに対するメチオニン、２３８位のプロリンに対するアラニン、２３９位のセリンに対するリジン、２４８位のリジンに対するイソロイシン、２５０位のトレオニンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、２５２位のメチオニンに対するフェニルアラニン、トリプトファン、またはチロシン、２５４位のセリンに対するトレオニン、２５５位のアルギニンに対するグルタミン酸、２５６位のトレオニンに対するアスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミン、２５７位のプロリンに対するアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、トレオニン、またはバリン、２５８位のグルタミン酸に対するヒスチジン、２６５位のアスパラギン酸に対するアラニン、２７０位のアスパラギン酸に対するフェニルアラニン、２８６位のアスパラギンに対するアラニンまたはグルタミン酸、２８９位のトレオニンに対するヒスチジン、２９７位に対するアスパラギンに対するアラニン、２９８位のセリンに対するグリシン、３０３位のバリンに対するアラニン、３０５位のバリンに対するアラニン、３０７位のトレオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、３０８位のバリンに対するアラニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、またはトレオニン、３０９位のロイシンまたはバリンに対するアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、またはアルギニン、３１１位のグルタミンに対するアラニン、ヒスチジン、またはイソロイシン、３１２位のアスパラギン酸に対するアラニンまたはヒスチジン、３１４位のロイシンに対するリジンまたはアルギニン、３１５位のアスパラギンに対するアラニンまたはヒスチジン、３１７位のリジンに対するアラニン、３２５位のアスパラギンに対するグリシン、３３２位のイソロイシンに対するバリン、３３４位のリジンに対するロイシン、３６０位のリジンに対するヒスチジン、３７６位のアスパラギン酸に対するアラニン、３８０位のグルタミン酸に対するアラニン、３８２位のグルタミン酸に対するアラニン、３８４位のアスパラギンまたはセリンに対するアラニン、 ３８５位のグリシンに対するアスパラギン酸またはヒスチジン、３８６位のグルタミンに対するプロリン、３８７位のプロリンに対するグルタミン酸、３８９位のアスパラギンに対するアラニンまたはセリン、４２４位のセリンに対するアラニン、４２８位のメチオニンに対するアラニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシン、４３３位のヒスチジンに対するリジン、４３４位のアスパラギンに対するアラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、セリン、トリプトファン、またはチロシン、及び４３６位のチロシンまたはフェニルアラニに対するヒスチジンからなる群から選択される。
本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、いくつかの実施形態において、配列番号１２もしくは１４に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチド、及び／または配列番号８もしくは１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含むことができる。
抗Ｃ５抗体及びその抗原結合断片を生成するための方法
本開示は、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体及びその抗原結合断片のうちのいずれかを生成するための方法も特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体を調製するための方法は、対象（例えば、非ヒト哺乳類）に適切な免疫原で免疫付与することを含み得る。本明細書に記載の抗体のうちのいずれかを生成するための好適な免疫原は、本明細書に記載される。例えば、Ｃ５に結合する抗体を生成するために、熟練者は、好適な対象（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長類などの非ヒト哺乳類）に、完全長ヒトＣ５ポリペプチドなどの完全長Ｃ５にポリペプチドで免疫付与することができる。いくつかの実施形態において、非ヒト哺乳類は、Ｃ５欠乏であり、例えば、Ｌｅｖｙ ａｎｄ Ｌａｄｄａ（１９７１）Ｎａｔ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ ２２９（２）：５１−５２、Ｃｒｏｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２７（２）：１２２−１２４、Ｗｅｔｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：２４３５−２４４０、及びＪｕｎｇｉ ａｎｄ Ｐｅｐｙｓ（１９８１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４３（２）：２７１−２７９に記載のＣ５欠乏マウスである。
好適な対象（例えば、非ヒト哺乳動物）は、哺乳動物による抗体の生成を誘発するために十分な回数の後次追加免疫とともに、適切な抗原で免疫付与され得る。免疫原は、補助剤とともに対象（例えば、非ヒト哺乳動物）に投与することができる。対象において抗体を生成する際に有用な補助剤には、タンパク質補助剤、細菌補助剤、例えば、全細菌（ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルバム、またはサルモネラ・ミネソタ）、ならびに結核菌の細胞壁骨格、トレハロースジミコレート、モノホスホリル脂質Ａ、メタノール抽出可能な残基（ＭＥＲ）を含む細菌成分、完全または不完全フロイント補助剤、ウイルス補助剤、化学補助剤、例えば、水酸化アルミニウム、及びヨード酢酸塩及びコレステリルヘミスクシナートが挙げられるが、これらに限定されない。免疫反応を引き起こすための方法において使用され得る他の補助剤としては、例えば、コレラ毒素及びパラポックスウイルスタンパク質が挙げられる。Ｂｉｅｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ３１（１）：１５−２４も参照されたい。また例えば、Ｌｏｄｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１０５９−１０６６、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４２：４６４０−４６４９、Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ １９：１０３−１０７、及びＧｕｐｔａ
ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３（１４）：１２６３−１２７６も参照されたい。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製することを含む。例えば、実験用マウスなどの好適な哺乳動物に、上記のようなＣ５ポリペプチドで免疫付与する。免疫付与した哺乳動物の抗体生成細胞（例えば、脾臓のＢ細胞）は、免疫原の少なくとも１回の追加免疫の２〜４日後に単離することができ、次に、好適な骨髄腫細胞株の細胞との融合前に、培地中で短期間成長させられ得る。これらの細胞は、例えば、ワクチニアウイルスまたはポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存在下で融合され得る。融合において得られたハイブリッド細胞はクローン化され、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、好適な免疫原で免疫付与したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞は、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合され得る。融合後、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を過剰増殖させるのを防ぐために、一定間隔で選択培地、例えばＨＡＴ培地を補充した好適な培養培地中で細胞を増殖させる。次に、得られたハイブリッド細胞を、所望の抗体、例えば、Ｃ５に結合し、Ｃ５の断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を阻害する抗体の分泌についてスクリーニングする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれかは、ＣＨＯ細胞中で作製され得る。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能なシアル酸残基を含有しない。
いくつかの実施形態において、熟練者は、例えば、米国特許第６，３００，０６４号（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧ）及びＳｃｈｏｏｎｂｒｏｏｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３（９）：ｅ８１に記載されるように、非免疫優位ライブラリから抗Ｃ５抗体を特定することができる．
上記方法を使用してスクリーニングされる抗体の亜集団は、当該技術分野において既知の任意の免疫学または生化学に基づく方法を使用して、特定の免疫原（例えば、Ｃ５）に対するそれらの特異性及び結合親和性について特徴付けられ得る。例えば、天然の完全長Ｃ５への抗体の特異的結合は、Ｃ５ａと比較して、例えば、限定されないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＰＲアッセイ、免疫沈降アッセイ、親和性クロマトグラフィー、及び上記の平衡透析などの免疫学または生化学に基づく方法を使用して決定されてもよい。抗体の免疫特異的結合及び交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイとしては、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの技法を使用する競合及び非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイは、当該技術分野において日常的であり、周知である。
抗体は、抗体のＣ５との相互作用の動態パラメータを特徴付けるために、当該技術分野において既知の任意のＳＰＲに基づくアッセイを使用してアッセイすることもできる。ＢＩＡｃｏｒｅ器具（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｌＡｓｙｓ器具（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＩＢＩＳシステム（Ｗｉｎｄｓｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｅｒｋｓ，ＵＫ）、ＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌａｂ、Ｈｏｋｋａｉｄｏ，Ｊａｐａｎ）、及びＳＰＲ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｐｒｅｅｔａ（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）を含むがこれらに限定されない市販の任意のＳＰＲ器具を、本明細書に記載の方法において使用することができる。例えば、Ｍｕｌｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２：７７−９１、Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ８２：３０３−３２３、Ｆｉｖａｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：９７−１０１、及びＲｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １１：５４−６１を参照されたい。
上記方法を使用して、例えば、抗Ｃ５抗体が、完全長の天然Ｃ３及び／またはＣ４タンパク質に結合しないかどうかを決定することもできることが理解される。
上記参照文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、それを使用して、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の所望の断片を生成して、例えば、下で詳述されるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより生成するための技法は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ＰＣＴ公開第９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９、及びＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６−３４、ならびにＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３に開示されるものなどを使用して用いることもできる。単鎖Ｆｖ及び抗体を生成するために使用することができる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８、Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：７９９５−７９９９、及びＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０に記載されるものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、エピトープマッピングを使用して、例えば、抗体と相互作用するＣ５の領域を特定することができる。特定の抗体が結合するエピトープを特定するための方法も当該技術分野において既知であり、上に記載される。
本明細書で特定される抗体及びその断片は、「キメラ」であり得るか、または「キメラ」にされ得る。キメラ抗体及びその抗原結合断片は、２つ以上の異なる種（例えば、マウス及びヒト）からの部分を含む。キメラ抗体は、ヒト定常ドメインに融合した所望の特異性のマウス可変領域を用いて生成され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）。この方法で、非ヒト抗体を修飾して、それらがヒト臨床適用に対してより好適になるようにすることができる（例えば、対象における補体媒介障害を治療または予防するための方法）。
本開示のモノクローナル抗体は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態を含む。ヒト化またはＣＤＲ移植ｍＡｂは、それらがマウス抗体のように急速に循環から一掃されず、典型的に逆免疫反応を引き起こさないため、ヒトに対する治療薬として特に有用である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒト アミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、これらは典型的に、「移入」可変ドメインから取られる。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に当該技術分野において周知である。例えば、ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び同僚の方法に従い（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照されたい）、齧歯類フレームワークまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって行うことができる。例えば、Ｓｔａｅｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：１２４３−１２５７も参照されたい。いくつかの実施形態において、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、ヒト抗体（レシピエント抗体）であり、所望の特異性、親和性、及び結合能力を有する非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類抗体）のＣＤＲ領域アミノ酸残基が、ヒト抗体のフレームワーク足場の上に移植される。
いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの１つ以上のフレームワーク領域アミノ酸残基は、非ヒト抗体の対応するアミノ酸残基によっても置換される（いわゆる「逆突然変異」）。加えて、ファージ提示ライブラリを使用して、抗体配列内の選択した位置のアミノ酸を変えることができる。ヒト化抗体の特性は、ヒトフレームワークの選択によっても影響される。更に、ヒト化及びキメラ化抗体は、例えば、親和性またはエフェクタ機能などの抗体特性を更に向上させるために、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含むように修飾され得る。
完全ヒト抗体もまた、本開示において提供される。「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列、好ましくはヒト生殖系配列から誘導される可変及び定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって誘導される突然変異）。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種から誘導されたＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含まない。完全ヒトまたはヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子を担持する（可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）、及び定常（Ｃ）エクソンを担持する）トランスジェニックマウスから、またはヒト細胞から誘導されてもよい。
ヒト配列は、ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の両方をコードすることができ、マウスにおいて正しく機能して、ヒトにおけるものと類似した広い抗体レパートリーを提供するように再配置を受ける。トランスジェニックマウスは、標的タンパク質免疫原で免疫付与され、特定の抗体及びそれらのコードするＲＮＡの多様なアレイを作り出すことができる。次に、かかる抗体の抗体鎖成分をコードする核酸は、動物から提示ベクターにクローン化されてもよい。典型的に、重鎖及び軽鎖配列をコードする核酸の別個の集団がクローン化され、次にこの別個の集団は、ベクターへの挿入時に組み換えられて、ベクターの任意の所与の複製が重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせを受け取るようになる。このベクターは、抗体鎖が組み立てられ、ベクターを含有する提示パッケージの外面に提示され得るように、抗体鎖を発現するよう設計される。例えば、抗体鎖は、ファージの外面からファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。その後、提示パッケージを、標的に結合する抗体の提示のために選択し、スクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、その対応する未改変の定常領域と比べて、低減したエフェクタ機能を有する（または有しない）改変重鎖定常領域を含む。抗Ｃ５抗体の定常領域を必要とするエフェクタ機能は、定常領域またはＦｃ領域の特性を改変することによって調節され得る。改変されたエフェクタ機能は、例えば、以下の活性、すなわち抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、アポトーシス、１つ以上のＦｃ受容体への結合、及び炎症促進反応のうちの１つ以上の調節を含む。調節は、未改変形態の定常領域の活性と比較して、改変定常領域を含む対象抗体によって呈されるエフェクタ機能活性の増加、減少、または排除を指す。特定の実施形態において、調節は、活性が廃止されるか、または完全に存在しない状況を含む。
改変ＦｃＲ結合親和性及び／またはＡＤＣＣ活性及び／または改変ＣＤＣ活性を有する改変定常領域は、未改変形態の定常領域と比較して、強化もしくは低減されたＦｃＲ結合活性及び／またはＡＤＣＣ活性及び／またはＣＤＣ活性を有するポリペプチドである。ＦｃＲへの結合の増加を提示する改変定常領域は、未改変ポリペプチドよりも優れた親和性をもって少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの結合の減少を提示する改変定常領域は、未改変形態の定常領域よりも低い親和性をもって少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ＦｃＲへの結合の減少を提示するかかる変異型は、ＦｃＲへの好ましい結合をほとんどまたは全く有しないことがあり、例えば、ＦｃＲへの天然配列免疫グロブリン定常領域またはＦｃ領域の結合レベルと比較して、ＦｃＲへの結合の０〜５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）である。同様に、調節されたＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性を提示する改変定常領域は、未改変定常領域と比較して、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性の増加または低減のいずれかを呈することができる。例えば、いくつかの実施形態において、改変定常領域を含む抗Ｃ５抗体は、未改変形態の定常領域のＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性の約０〜５０％（例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％未満）を呈し得る。低減したＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを提示する改変定常領域を含む本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、低減したＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣ活性を呈するか、または全く呈しないことがある。
ある特定の実施形態において、改変定常領域は、天然配列定常領域または未改変定常領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失、例えば、天然配列定常領域または親ポリペプチドの定常領域内に、約１〜約１００のアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失を有する。いくつかの実施形態において、本明細書における改変定常領域は、少なくとも約７０％の未改変定常領域との相同性（類似性）または同一性、及びいくつかの例では、少なくとも約７５％、及び他の例では、少なくとも約８０％のそれとの相同性または同一性、及び他の実施形態では、少なくとも約８５％、９０％、または９５％のそれとの相同性または同一性を有する。改変定常領域は、１つ以上のアミノ酸欠失または挿入を含んでもよい。追加として、改変定常領域は、例えば、改変グリコシル化パターンを含む改変翻訳後修飾をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入（例えば、１つ以上の糖成分の付加、１つ以上の糖成分の喪失、または未改変定常領域と比べて１つ以上の糖成分の組成物の変化）を含んでもよい。
改変エフェクタ機能を有するか、または有しない抗体は、異種定常、Ｆｃ、または重鎖領域を有する抗体を操作または生成することによって生成することができ、組換えＤＮＡ技術及び／または細胞培養及び発現条件を使用して、改変機能及び／または活性を有する抗体を生成することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して、エフェクタ機能を含む抗体機能に影響する領域（例えば、Ｆｃまたは定常領域など）内の１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を操作することができる。代替として、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化パターンなどの変化は、細胞培養物、及び抗体が生成される発現条件を操作することによって達成することができる。１つ以上の置換、付加、または欠失を抗体のＦｃ領域に導入するための好適な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，″Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８），上記、Ｂｏｒｒｅｂａｅｋ（１９９２），上記、Ｊｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３），上記、ＰＣＴ公開第０６／５３３０１号、及び米国特許第７，７０４，４９７号に記載される、例えば、標準ＤＮＡ突然変異誘発技法を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、低減したエフェクタ機能を呈するか、または全く呈しない。いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、ハイブリッド定常領域、またはＧ２／Ｇ４ハイブリッド定常領域などのその部分を含む（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎ ５１：１−１８、Ｃａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１４８３−１４９１、及びＭｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４（６）：４４１−４５２を参照されたい）。上記を参照されたい。
上記のＧ２／Ｇ４構成体を使用することに加えて、低減したエフェクタ機能を有する本明細書に記載の抗Ｃ５抗体は、抗体のある特定の領域のアミノ酸配列に他の型の変化を導入することによって生成することができる。かかるアミノ酸配列の変化は、例えば、ＰＣＴ公開第９４／２８０２７号及び同第９８／４７５３１号、ならびにＸｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６−２６に記載されるＡｌａ−Ａｌａ突然変異を含むが、これに限定されない。したがって、いくつかの実施形態において、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異を含む定常領域内に１つ以上の突然変異を有する抗Ｃ５抗体は、低減したエフェクタ機能を有するか、または全く有しない。これらの実施形態に従って、抗体の定常領域は、２３４位のアラニンに対する置換、または２３５位のアラニンに対する突然変異を含み得る。追加として、改変定常領域は、二重突然変異、すなわち、２３４位のアラニンに対する突然変異、及び２３５位のアラニンに対する第２の突然変異を含んでもよい。一実施形態において、抗Ｃ５抗体は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位のフェニルアラニンからアラニンへの突然変異（複数可）、及び／または２３５位のロイシンからアラインへの突然変異を説明する。別の実施形態において、抗Ｃ５抗体は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ突然変異は、２３４位のロイシンからアラニンへの突然変異（複数可）、及び／または２３５位のロイシンからアラニンへの突然変異を説明する。抗Ｃ５抗体は、代替または追加として、ＣＨ２ドメイン内に点突然変異Ｋ３２２Ａを含む、他の突然変異を担持することがある（Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１２１６１−１２１６８）。定常領域内に前述の突然変異（複数可）を有する抗体は、更に遮断または非遮断抗体であってもよい。
重鎖定常領域に導入されるとき、追加の置換は、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（９）：６５９１−６６０４に記載されるエフェクタ機能の減少をもたらす。特にＳｈｉｅｌｄｓらの表１を参照されたい（ヒトＦｃＲｎ及びＦｃγＲへのヒトＩｇＧ１変異体の結合（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗ＩｇＥ抗体のライブラリ（ライブラリの各抗体は、重鎖定常領域内の１つ以上の置換が異なる）を、Ｆｃ受容体の集団（ＦｃＲｎ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＡを含む）への結合についてスクリーニングすることによって、著者らは、特定のＦｃ−Ｆｃ受容体相互作用を調節するいくつかの置換を特定した。例えば、ＣＨ２ドメインがＤ２６５Ａ置換を含む（Ｋａｂａｔら（上記）による重鎖アミノ酸付番）変異ＩｇＧ２ａ重鎖定常領域は、変異定常領域と、ＩｇＧ Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃγＲＩ、及びＦｃγＲＩＶとの間の相互作用の完全な喪失をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）６５９５頁の表１。Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８１：６６６４−６６６９（上記）も参照されたい。
ヒンジ領域内の変化もまた、エフェクタ機能に影響を及ぼす。例えば、ヒンジ領域の欠失は、Ｆｃ受容体に対する親和性を低減させることがあり、補体の活性化を低減することがある（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ ７８：５２４−５２８）。したがって、本開示は、ヒンジ領域内の改変を有する抗体にも関する。
いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、強化または低減された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を呈する改変定常領域を含むことができる。調節されたＣＤＣ活性は、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を抗体のＦｃ領域内に導入することによって達成することができる。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい。代替または追加として、システイン残基（複数可）は、Ｆｃ領域内に導入されてもよく、それによりこの領域内の鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。故に、生成されたホモ二量体抗体は、向上した、もしくは低減した内部化能力、及び／または増加もしくは減少した補体媒介細胞殺滅を有することができる。例えば、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７６：１１９１−１１９５及びＳｈｏｐｅｓ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２９１８−２９２２、ＰＣＴ公開第９９／５１６４２号、及び同第９４／２９３５１号、Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８−４０、ならびに米国特許第５，６４８，２６０号及び同第５，６２４，８２１号を参照されたい。
抗体のエフェクタ機能を調節する別の潜在的手段としては、グリコシル化の変化が挙げられ、例えば、Ｒａｊｕ（２００３）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １（４）：４４−５３に要約されている。Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎにより、ヒトＩｇＧオリゴ糖の微小不均一性は、ＣＤＣ及びＡＤＣＣなどの生体機能、様々なＦｃ受容体への結合、及びＣｌｑタンパク質への結合に影響を及ぼし得る。（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２。抗体のグリコシル化パターンは、生産性細胞及び細胞培養条件（Ｒａｊｕ、上記）に応じて異なり得る。かかる差異は、エフェクタ機能及び薬物動態の両方の変化につながり得る。例えば、Ｉｓｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８９（４）：５７３−５７８、及びＮｅｗｋｉｒｋ ｅｔ
ａｌ．（１９９６）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０６（２）：２５９−２６４を参照されたい。エフェクタ機能の差異は、エフェクタ細胞上のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合するＩｇＧの能力に関連することがある。Ｓｈｉｅｌｄｓらは、ＦｃγＲへの結合を向上させたアミノ酸配列内の改変を有するＩｇＧが、ヒトエフェクタ細胞を使用して、最大１００％強化されたＡＤＣＣを呈し得ることを示した。（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６（９）：６５９１−６６０４。これらの改変は、結合界面において見出されないアミノ酸の変化を含むが、糖成分の性質ならびにその構造パターンの両方が、観察される差異に寄与することもある。加えて、ＩｇＧのオリゴ糖成分中のフコースの存在または非存在は、結合及びＡＤＣＣを向上させることができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３０）：２６７３３−２６７４０を参照されたい。Ａｓｎ２９７に結合したフコシル化炭水化物を欠失したＩｇＧは、ＦｃγＲＩ受容体への正常な受容体結合を呈した。対照的に、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への結合は、特により低い抗体濃度で５０倍向上し、強化されたＡＤＣＣを伴っていた。
抗体のエフェクタ機能を改変するために、更に他の手法が存在する。例えば、抗体生産性細胞は、高突然変異誘発性であり得、それにより抗体分子全体にわたってランダムに改変されたポリペプチド残基を有する抗体を生成する。例えば、ＰＣＴ公開第０５／０１１７３５号を参照されたい。高突然変異誘発性宿主細胞としては、ＤＮＡミスマッチ修復において欠乏している細胞が挙げられる。この方法で生成された抗体は、抗原性が低く、及び／または有益な薬物動態特性を有することがある。追加として、かかる抗体は、強化または減少したエフェクタ機能（複数可）などの特性について選択されてもよい。本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を調製するために有用な分子生物学技法の追加の詳細は、下に記載される。
組換え抗体の発現及び精製
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、分子生物学及びタンパク質化学の技術分野において既知の様々な技法を使用して生成され得る。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸は、例えば、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、転写ターミネータシグナル、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサまたはアクチベータ配列を含む、転写及び翻訳制御配列を含む発現ベクターに挿入され得る。制御配列は、プロモータ、ならびに転写開始及び停止配列を含む。加えて、発現ベクターは、それが２つの異なる生物において、例えば、発現のために哺乳類または昆虫細胞において、及びクローニング及び増幅のために原核宿主において維持され得るように、複数の複製系を含み得る。
様々な修飾、例えば置換は、当業者に既知の標準方法を使用して、本明細書に記載の重鎖及び／または軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に導入され得る。例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ位置におけるヒスチジン置換の導入は、ＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準方法を使用して実行することができ、ＰＣＲ生成物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含むように、突然変異ヌクレオチドがＰＣＲプライマーに組み込まれる。置換は、ＣＤＲ領域のうちの１つ以上に導入され、例えば、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で抗原に対する抗体のＫＤを増加または減少させることができる。部位特異的突然変異誘発における技法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）を参照されたい。
いくつかの可能なベクター系は、哺乳類細胞中の核酸からのクローン化重鎖及び軽鎖ポリペプチドの発現に使用可能である。１つのベクター群は、所望の遺伝子配列の、宿主細胞ゲノムへの統合に依存する。安定して統合されたＤＮＡを有する細胞は、大腸菌ｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２０７２）またはＴｎ５ ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｍｏｌ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １：３２７）などの薬物耐性遺伝子を同時に導入することによって選択され得る。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に結合され得るか、または同時形質移入によって同じ細胞に導入され得るかのいずれかである（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：７７）。第２のベクター群は、自家複製能力を染色体外プラスミドに付与するＤＮＡ要素を利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７９：７１４７）、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス（Ｄｅａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：１２９２）、またはＳＶ４０ウイルス（Ｌｕｓｋｙ ａｎｄ Ｂｏｔｃｈａｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９３：７９）などの動物ウイルスから誘導され得る。
発現ベクターは、核酸の後次発現に好適な方法で細胞に導入され得る。導入の方法は、下で考察される標的細胞型によって主に規定される。例示的な方法としては、ＣａＰＯ４沈降、リポソーム融合、カチオンリポソーム、電気穿孔、ウイルス感染、デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融合、及び直接微量注入が挙げられる。
抗体またはその抗原結合断片の発現に適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物、及び哺乳類細胞が挙げられる。特に、大腸菌などの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ及びピキア・パストリスなどの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳類細胞株（例えば、ヒト細胞株）、ならびに霊長類細胞株が関心対象である。
いくつかの実施形態において、抗体またはその断片は、トランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）において発現され、それから精製され得る。例えば、抗体は、例えば、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３（６）：６２５−６２９、ｖａｎ Ｋｕｉｋ−Ｒｏｍｅｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ９（２）：１５５−１５９、及びＰｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１−２）：１４７−１５７に記載されるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物（例えば、齧歯動物）において生成され、乳汁から単離され得る。
抗体及びその断片は、タンパク質の発現を可能にするために十分な条件下、及び時間にわたって、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターで変換された宿主細胞を培養することによって細胞から生成され得る。タンパク質発現のためのかかる条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選択によって異なり、ルーチン実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、大腸菌中で発現された抗体は、封入体から再び折り畳まれ得る（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １０：３１９−３０を参照されたい）。細菌発現系及びそれらの使用のための方法は、当該技術分野において周知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ−−３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい）。コドン、好適な発現ベクター、及び好適な宿主細胞の選択は、いくつかの因子に応じて異なり、必要に応じて容易に最適化され得る。本明細書に記載の抗体（またはその断片）は、哺乳類細胞において、または酵母、バキュロウイルス、及びインビトロ発現系を含むが、これらに限定されない他の発現系において発現され得る（例えば、Ｋａｓｚｕｂｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：２１３−２２０を参照されたい）。
発現に続いて、抗体及びその断片が単離され得る。本明細書に記載のタンパク質（抗体または断片）のうちのいずれかに適用される「精製された」または「単離された」という用語は、成分（例えば、タンパク質または他の天然に存在する生体分子または有機分子）から分離または精製されたポリペプチドを指し、これらはタンパク質を発現する原核生物において、例えば、他のタンパク質、脂質、及び核酸を天然に伴う。典型的に、ポリペプチドは、それが試料中の総タンパク質の少なくとも６０重量％（例えば、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、または９９重量％）を構成するときに精製される。
抗体またはその断片は、どの他の成分が試料中に存在するかに応じて、当業者に既知の様々な方法で単離または精製され得る。標準精製方法としては、電気泳動、分子、免疫学的、及びクロマトグラフィー技法が挙げられ、イオン交換、疎水性、親和性、及び逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む。例えば、抗体は、標準抗抗体カラム（例えば、タンパク質−Ａまたはタンパク質−Ｇカラム）を使用して精製され得る。タンパク質濃度と併せて、超ろ過及び透析ろ過も有用である。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）″Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，″Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。必要な精製の程度は、所望の用途に応じて異なる。いくつかの例において、発現された抗体またはその断片の精製は必須でない。
精製された抗体またはその断片の収率または純度を決定するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ブラッドフォードアッセイ、紫外分光、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、及びゲル電気泳動法（例えば、クマシーブルーまたはコロイド銀染色などのタンパク質染色を使用する）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、内毒素は、抗体または断片から除去され得る。タンパク質試料から内毒素を除去するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、内毒素は、様々な市販の試薬を使用してタンパク質試料から除去することができ、無制限に、ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ（商標）内毒素除去キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ内毒素除去ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）内毒素除去キット（Ｍｉｒｕｓ）、またはＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）−Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ膜（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。
試料中に存在する内毒素を検出する、及び／またはその量を測定するための方法は（精製前及び精製後の両方）、当該技術分野において既知であり、市販のキットが入手可能である。例えば、タンパク質試料中の内毒素の濃度は、ＱＣＬ−１０００発色性キット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはリムルス変形細胞ライセート（ＬＡＬ）系キット、例えば、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能なＰｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬ、及びＣＳＥキットを使用して決定され得る。
抗体またはその抗原結合断片の修飾
抗体またはその抗原結合断片は、それらの発現及び精製後に修飾され得る。修飾は、共有結合的または非共有結合的修飾であり得る。かかる修飾は、例えば、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応させることができる有機誘導剤と反応させることによって、抗体または断片に導入され得る。修飾に好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造分析またはアミノ酸配列分析を含む様々な基準のうちのいずれかを使用して選択され得る。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、異種部分に複合され得る。この異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療薬（例えば、毒素もしくは薬物）、または限定されないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどの親和性タグなどの検出可能な標識であり得る。好適な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体または断片を精製する際に使用するための、抗原タグ
Figure 2017113028
 ポリヒスチジン
Figure 2017113028
 ヘマグルチニン
Figure 2017113028
 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））が挙げられる。異種ポリペプチドは、診断または検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド（例えば、酵素）、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も含む。好適な放射性標識としては、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、及び３Ｈが挙げられる。好適な蛍光標識としては、無制限に、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８、フィコエリスリン（ＰＥ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＰｅｒＣＰ、ＰＥ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、及びＣｙ７が挙げられる。蛍光標識は、例えば、様々な発光ランタニド（例えば、ユーロピウムまたはテルビウム）キレートのうちのいずれかを含む。例えば、好適なユーロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミ五酢酸（ＤＴＰＡ）またはテトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）のユーロピウムイキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、ルシフェラーゼ、及びホースラディッシュペルオキシダーゼが挙げられる。
２つのタンパク質（例えば、抗体及び異種部分）は、いくつかの既知の化学架橋剤のうちのいずれかを使用して架橋され得る。かかる架橋剤の例は、「ヒンダード」ジスルフィド結合を含む結合を介して２つのアミノ酸残基を結合するものである。これらの結合において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元グルタチオンまたは酵素ジスルフィド還元酵素の作用による還元から（ジスルフィド結合のいずれかの側の基を妨げることによって）保護される。１つの好適な試薬、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）は、タンパク質のうちの一方の末端リジン及び他方の末端システインを利用して、２つのタンパク質間にかかる結合を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分によって架橋するヘテロ二官能性試薬を使用することもできる。他の有用な架橋剤としては、無制限に、２つのアミノ基（例えば、Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、２つのスルフヒドリル基（例えば、１，４−ビス−マレイミドブタン）、アミノ基及びスルフヒドリル基（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ基及びカルボキシル基（例えば、４−［ｐ−アジドサリチルアミド］ブチルアミン）、ならびにアミノ基及びアルギニンの側鎖内に存在するグアニジニウム基（例えば、ｐ−アジドフェニルグリオキサール一水和物）を結合する試薬が挙げられる。
いくつかの実施形態において、放射性標識は、抗体のアミノ酸骨格に直接複合され得る。代替として、放射性標識は、より大きな分子（例えば、遊離アミノ基に結合して関連タンパク質のメタ−ヨードフェニル（ｍＩＰ）誘導体を形成する、メタ−［１２５Ｉ］ヨードフェニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド中の１２５Ｉ（［１２５Ｉ］ｍＩＰＮＨＳ）（例えば、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３８：１２２１−１２２９を参照されたい）またはタンパク質骨格に順次結合されるキレート（例えば、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡ）の一部として含まれ得る。放射性標識、またはそれらを含むより大きな分子／キレートを本明細書に記載の抗体または抗原結合断片に複合する方法は、当該技術分野において既知である。かかる方法は、放射性標識またはキレートの、タンパク質への結合を促進する条件下（例えば、ｐＨ、塩濃度、及び／または温度）、放射性標識を有するタンパク質をインキュベートすることを必要とする（例えば、米国特許第６，００１，３２９号を参照されたい）。
蛍光標識（時として「フルオロフォア」と称される）をタンパク質（例えば、抗体）に複合するための方法は、タンパク質化学の技術分野において既知である。例えば、フルオロフォアは、そのフルオロフォアに付着したスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルまたはテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分を使用して、タンパク質の遊離アミノ基（例えば、リジンの）またはスルフヒドリル基（例えば、システイン）に複合され得る。いくつかの実施形態において、フルオロフォアは、スルホ−ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤部分に複合され得る。好適な複合方法は、抗体タンパク質またはその断片を、タンパク質へのフルオロフォアの結合を促進する条件下、フルオロフォアでインキュベートすることを必要とする。例えば、Ｗｅｌｃｈ ａｎｄ Ｒｅｄｖａｎｌｙ（２００３）″Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，″Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ＩＳＢＮ ０４７１４９５６０３）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、抗体または断片は、例えば、循環中、例えば血液、血清、他の組織中の抗体の安定化及び／または保持を向上させる部分で修飾され得る。例えば、抗体または断片は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０（６）：９７３−８、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｅｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４７７−４８５、及びＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５４：４５９−４７６に記載のようにＰＥＧ化またはＨＥＳ化され得る（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ，Ｇｅｒｍａｎｙ、例えば、Ｐａｖｉｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ３８７（１−２）：１１０−１１９を参照されたい）。 安定化部分は、抗体（もしくは断片）の安定性または保持を、少なくとも１．５倍（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、もしくは５０倍以上）向上させることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、グリコシル化され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片は、酵素治療もしくは化学治療に供され得るか、または細胞から生成され得、抗体または断片がグリコシル化を低減または不在にするようになる。低減したグリコシル化を有する抗体を生成するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，９３３，３６８号、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ １０（１０）：２７１７−２７２３、及びＣｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１３６１に記載されている。
薬学的組成物及び製剤
本明細書に記載の組成物は、例えば、補体関連障害の治療または予防のために対象に投与するための、薬学的溶液として配合され得る。薬学的組成物は、一般に、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合性の同様物を指し、それらを含む。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１−１９を参照されたい）。
組成物は、標準方法に従って配合され得る。薬学的配合は、十分に確立された技術分野であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，″２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）″Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，″７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、及びＫｉｂｂｅ（２０００）″Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，″３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）において更に記載されている。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、好適な濃度で、２〜８℃（例えば、４℃）での保管に適した緩衝溶液として配合され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、０℃より低い温度（例えば、−２０℃または−８０℃）での保管のために配合され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、２〜８℃（例えば、４℃）で最長２年（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１年半、または２年）にわたる保管のために配合され得る。故に、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、２〜８℃（例えば、４℃）で少なくとも１年間の保管において安定である。
薬学的組成物は、様々な形態をとり得る。これらの形態としては、例えば、液体、半固体及び固体剤形、例えば液体溶液（例えば、注射溶液及び注入溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、及び坐剤が挙げられる。好ましい形態は、部分的に、意図される投与様式及び治療適用に依存する。例えば、全身または局所送達を意図した組成物を含有する組成物は、注射溶液または注入溶液の形態をとり得る。したがって、組成物は、非経口様式（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋内注射）による投与のために配合され得る。「非経口投与」、「非経口的に投与される」、及び他の文法的に同等の表現は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、無制限に、静脈内、鼻腔内、眼内、肺、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、肺内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、脳内、頭蓋内、頸動脈内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる（下記を参照されたい）。
組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高濃度での安定した保管に適した他の秩序構造として配合され得る。滅菌注射溶液は、必要な量の本明細書に記載の組成物を、必要に応じて上に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒に組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、本明細書に記載の組成物を、塩基性分散培地及び上に列挙されるものから必要な他の成分を含む滅菌媒体中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のための方法は、本明細書に記載の組成物の粉末に加えて、その以前に滅菌ろ過した溶液からの任意の追加の所望の成分（下記を参照されたい）を産生する、真空乾燥及び凍結乾燥を含む。溶液の適切な流動性は、例えば、レチシンなどの被覆の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
本明細書に記載の組成物は、イムノリポソーム組成物中で配合することもできる。かかる製剤は、当該技術分野において既知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：３６８８、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４０３０、及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載の方法などによって調製され得る。増加した循環時間を有するリポソームは、例えば、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
ある特定の実施形態において、組成物は、化合物を速放から保護する担体、例えば、埋め込み片及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤と配合され得る。酢酸ビニルエチレン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製のための多くの方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９７８）″Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，″Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
いくつかの実施形態において、組成物は、ヒトなどの哺乳動物に対する肺内投与（例えば、吸入器または噴霧器を介した投与）に適した組成物中に配合され得る。かかる組成物を配合するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許出願公開第２００８０２０２５１３号、米国特許第７，１１２，３４１号及び同第６，０１９，９６８号、ならびにＰＣＴ公開第００／０６１１７８号及び同第０６／１２２２５７号に記載されている（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。乾燥粉末吸入器製剤及び製剤の投与に適したシステムは、例えば、米国特許出願公開第２００７０２３５０２９号、ＰＣＴ公開第００／６９８８７号、及び米国特許第５，９９７，８４８号に記載されている。肺内投与に適した追加の製剤（ならびにポリペプチドを配合するための方法）は、例えば、米国特許出願公開第２００５０２７１６６０号及び同第２００９０１１０６７９号に記載されている。
いくつかの実施形態において、組成物は、目に送達するために配合され得る。本明細書で使用される場合、「目」という用語は、目に関連した任意かつ全ての解剖学的組織及び構造を指す。目は、３つの別個の層、すなわち外側強膜、中間脈絡膜層、及び内側網膜からなる壁を有する。レンズの後ろにある房は、硝子体液と称されるゲル状流体で満たされている。目の後部には光を検出する網膜がある。角膜は、画像を目の背後に伝える光学的に透明な組織である。角膜は、目の中に薬物を浸透させるための１つの経路を含む。目に関連した他の解剖学的組織構造としては、分泌系、分配系、及び排泄系を含む導涙系が挙げられる。分泌系は、涙液蒸発、及び遠心性副交感神経供給を有し、身体的または感情的刺激に反応して涙液を分泌する反射分泌体に起因する瞬き及び温度変化によって刺激される分泌体を含む。分配系は、瞼及び開いた目の蓋縁の周りに涙液メニスカスを含み、これが瞬きによって涙液を眼表面全体に広げ、故に乾燥面積が拡大するのを低減する。
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、局所適用または硝子体内注射によって局所的に投与され得る。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、点眼液による投与のために配合され得る。
目を治療するための治療調製物は、薬学的に許容される溶液、懸濁液、または軟膏中に１つ以上の活性剤を、約０．０１重量％〜約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．５％の濃度で含有することができる。調製物は、好ましくは、例えば、限定されないが、保存剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤及び安定剤、非イオン性湿潤剤または清澄剤、ならびに増粘剤などの追加成分を含有する滅菌水性溶液の形態をとる。
かかる溶液中に使用するための好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられる。好適な緩衝剤は、例えば、ホウ酸、重炭酸ナトリウム及びカリウム、ホウ酸ナトリウム及びカリウム、炭酸ナトリウム及びカリウム、酢酸ナトリウム、ならびに二リン酸ナトリウムを、ｐＨを約ｐＨ６〜ｐＨ８の間、好ましくは約ｐＨ７〜ｐＨ７．５の間に維持するのに十分な量で含む。好適な等張剤は、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、及び塩化ナトリウムである。
好適な抗酸化剤及び安定剤には、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、及びチオウレアが挙げられる。好適な湿潤剤及び清澄剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２、及びチロキサポールが挙げられる。好適な増粘剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。調製剤は、従来の方法による治療を必要とする対象（例えば、ＡＭＤに罹患した対象）の目に、例えば、液滴の形態で、または１つ以上の組成物を含有する治療溶液中に目を浸すことによって局所的に投与され得る。
加えて、薬物を目の硝子体空洞に導入するために、様々なデバイスが開発された。例えば、米国特許出願公開第２００２００２６１７６号は、硝子体空洞内に突き出して、製剤を硝子体空洞に送達するように、胸膜を通して挿入され得る製剤含有プラグを説明する。別の例において、米国特許第５，４４３，５０５号は、目の内部への薬物の持続放出のための、上脈絡膜腔または無血管領域への導入のための埋め込み型デバイスを説明する。米国特許第５，７７３，０１９号及び同第６，００１，３８６号は各々、目の胸膜表面に取り付け可能な埋め込み型薬物送達デバイスを開示する。このデバイスは、難溶解性薬剤に対して浸透性の非生体分解可能なポリマーによって被覆された有効量の難溶解性薬剤を含有する内部コアを備える。動作中、この難溶解性薬剤は、デバイスから出る持続放出のために、生体分解可能なポリマー被覆に浸透する。目への治療薬の送達のための追加の方法及びデバイス（例えば、経胸膜パッチ及びコンタクトレンズを介した送達）は、例えば、Ａｍｂａｔｉ ａｎｄ Ａｄａｍｉｓ（２００２）Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２１（２）：１４５−１５１、Ｒａｎｔａ ａｎｄ Ｕｒｔｔｉ（２００６）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ５８（１１）：１１６４−１１８１、Ｂａｒｏｃａｓ ａｎｄ Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ５（１）：１−１０（１０）、Ｇｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｃｈａｕｈａｎ（２００４）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４５：２３４２−２３４７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ ３９：２４４−２５４、及びＰＣＴ公開第０４／０７３５５１号に記載されており、それらの開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
上記のように、比較的高濃度の組成物が作製され得る。例えば、これらの組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ（例えば、約９ｍｇ／ｍＬ〜９０ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜１１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜８０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜８５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で配合され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、５ｍｇ／ｍＬ超〜５０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で配合され得る。水性溶液中でタンパク質を配合するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第７，３９０，７８６号、ＭｃＮａｌｌｙ ａｎｄ Ｈａｓｔｅｄｔ（２００７），″Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，″Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １７５，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、及びＢａｎｇａ（２００５），″Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ″ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに記載されている。いくつかの実施形態において、水性溶液は、中性ｐＨ、例えば、６．５〜８（例えば、両端値を含む７〜８）のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、水性溶液は、約６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、水性溶液は、６超（または等しい）（例えば、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、または７．９以上）であるが、ｐＨ８未満のｐＨを有する。
治療用ポリペプチドをコードする核酸は、細胞内で発現し、薬剤を生成するために使用され得る核酸を送達するように、遺伝子治療プロトコルの一部として使用される遺伝子構成体に組み込まれ得る。かかる成分の発現構成体は、任意の治療上有効な担体、例えば、インビボで細胞に成分遺伝子を有効に送達することができる任意の製剤または組成物中で投与されてもよい。手法としては、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）、または組換え細菌もしくは真核プラスミドを含むウイルスベクター中の対象遺伝子の挿入が挙げられる。ウイルスベクターは、細胞を直接形質転換することができ、プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオンリポソーム（リポフェクチン）または誘導されたポリリジン複合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープまたは他のかかる細胞内担体の助けを借りるとともに、インビボで実行される遺伝子構成体またはＣａＰＯ４沈降（例えば、国際公開第０４／０６０４０７号を参照されたい）の直接注射によって送達され得る。（下記の「体外手法」も参照されたい。）好適なレトロウイルスの例としては、当業者に既知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、及びｐＥＭが挙げられる（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号及び同第４，９８０，２８６号、ならびにＰＣＴ公開第８９／０７１３６号、同第８９／０２４６８号、同第８９／０５３４５号、及び同第９２／０７５７３号を参照されたい）。別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを利用する（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照されたい）。アデノウイルス株Ａｄ型５ ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の好適なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。対象遺伝子の送達に有用な更に別のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）である。例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３４９−３５６、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３：３８２２−３８２８、及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３−１９７３を参照されたい。
いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の追加の治療薬、例えば、対象において補体関連障害（例えば、ＡＰ関連障害またはＣＰ関連障害）を治療または予防するための追加の療法と配合され得る。対象において補体関連障害を治療するための追加の薬剤は、治療される特定障害に応じて異なるが、無制限に、降圧剤（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤）［例えば、ＨＥＬＬＰ症候群を治療する際に使用するため］、抗凝固剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）、または免疫抑制剤（例えば、ビンクリスチンまたはシクロスポリンＡ）を挙げることができる。抗凝固剤の例としては、例えば、ワルファリン（クマジン）、アスピリン、ヘパリン、フェニンジオン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、及びトロンビン阻害剤（例えば、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、またはダビガトラン）が挙げられる。本明細書に記載の組成物は、補体関連障害の治療のための線維素溶解剤（例えば、アンクロッド、ε−アミノカプロン酸、抗プラスミン−ａ１、プロスタシクリン、及びデフィブロチド）と配合することもできる。いくつかの実施形態において、組成物は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の阻害剤などの脂質低下剤と配合され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）などの抗ＣＤ２０剤と配合され得るか、またはそれとともに使用され得る。いくつかの実施形態において、例えば、ＲＡの治療の場合、組成物は、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）及びメトトレキセート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（登録商標）、Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））の一方または両方と配合され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と配合され得る。多くの異なるＮＳＡＩＤＳが入手可能であり、いくつかの店頭薬としては、イブプロフェン（Ａｄｖｉｌ（登録商標）、Ｍｏｔｒｉｎ（登録商標）、Ｎｕｐｒｉｎ（登録商標））及びナプロキセン（Ａｌｌｅｖｅ（登録商標））が挙げられ、他の多くは、処方によって入手可能であり、メロキシカム（Ｍｏｂｉｃ（登録商標））、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ（登録商標））、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ（登録商標））、スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標））、トレメンチン（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ（登録商標））、コリンマグネシウムサリチル酸塩（Ｔｒｉｌａｓａｔｅ（登録商標））、ジクロフェナク（Ｃａｔａｆｌａｍ（登録商標）、Ｖｏｌｔａｒｅｎ（登録商標）、Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ（登録商標））、ジフルシナル（Ｄｏｌｏｂｉｄ（登録商標））、インドメチシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ（登録商標））、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ（登録商標）、Ｏｒｕｖａｉｌ（登録商標））、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ（登録商標））、及びピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ（登録商標））が挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物は、降圧剤、抗てんかん剤（例えば、硫酸マグネシウム）、または抗血栓薬とともに使用するために配合され得る。降圧剤としては、例えば、ラベタロール、ヒドララジン、ニフェジピン、カルシウムチャネル拮抗薬、ニトログリセリン、またはニトロフェリシアン化ナトリウム挙げられる。（例えば、Ｍｉｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ １６（４）：４１９−４２４を参照されたい。）抗血栓薬としては、例えば、ヘパリン、抗トロンビン、プロスタシクリン、または低用量アスピリンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、肺内投与のために配合される組成物は、肺障害を治療するための少なくとも１つの追加活性剤を含み得る。この少なくとも１つの活性剤は、例えば、抗ＩｇＥ抗体（例えば、オマリズマブ）、抗ＩＬ−４抗体もしくは抗ＩＬ−５抗体、抗ＩｇＥ阻害剤（例えば、モンテルカストナトリウム）、交換神経模倣薬（例えば、アルブテロール）、抗生物質（例えば、トブラマイシン）、デオキシリボヌクレアーゼ（例えば、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））、抗コリン薬（例えば、イプラトロピウム臭化物）、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）、β−アドレノ受容体作動薬、ロイコトリエン阻害剤（例えば、ジレウトン）、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ＰＤＥ阻害剤、ＣＤ２３拮抗薬、ＩＬ−１３拮抗薬、サイトカイン遊離阻害剤、ヒスタミンＨ１受容体拮抗薬、抗ヒスタミン、抗炎症薬（例えば、クロモリンナトリウム）、またはヒスタミン遊離阻害剤であり得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、目の補体関連障害を治療する際に使用するための１つ以上の追加の治療薬とともに投与するために配合され得る。かかる追加の治療薬は、例えば、ベバシズマブもしくはベバシズマブのＦａｂ断片、またはラニビズマブ（いずれもＲｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって販売されている）、及びペガプタニブナトリウム（Ｍｕｃｏｇｅｎ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）であり得る。かかるキットは、任意選択で、組成物を対象に投与するための指示書を含むこともできる。
いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内γグロブリン療法（ＩＶＩＧ）、血漿交換療法、血漿置換、または血漿交換とともに対象に投与するために配合され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、腎移植前、腎移植中、または腎移植後に配合され得る。
組成物が第２の活性剤との組み合わせで使用されるべきとき、組成物は、第２の薬剤と共配合され得るか、または組成物は、第２の薬剤配合とは別個に配合され得る。例えば、それぞれの薬学的組成物は、例えば、投与直前に混合され、一緒に投与され得るか、または例えば、同時もしくは異なる時点で別個に投与され得る（下記を参照されたい）。
適用
本明細書に記載の組成物は、いくつかの診断及び治療適用において使用され得る。例えば、検出可能に標識された抗原結合分子をアッセイにおいて使用し、試料（例えば、生体試料）中の標的抗原の存在または量を検出することができる。組成物は、標的抗原機能の阻害を研究するために、インビトロアッセイにおいて使用することができる。例えば、組成物が補体タンパク質に結合し、阻害するいくつかの実施形態において、組成物は、補体活性を阻害するか、またはそうでなければ補体関連障害を治療するために有用な追加の新規化合物を特定するように設計されたアッセイにおいて、正の対照として使用され得る。例えば、Ｃ５阻害組成物は、Ｃ５の生成またはＭＡＣの形成を低減または抑制する追加の化合物（例えば、小分子、アプタマー、または抗体）を特定するためのアッセイにおいて、正の対照として使用することができる。組成物は、下で詳述される治療方法において使用することもできる。
治療方法
本明細書に記載の組成物は、投与経路に部分的に依存する様々な方法を使用して、対象、例えばヒト対象に投与され得る。経路は、例えば、静脈内注射または注入（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）注射、または筋内注射（ＩＭ）であり得る。
皮下投与は、デバイスによって達成され得る。このデバイス手段は、シリンジ、充填済みシリンジ、使い切りまたは再使用可能な自動注射器、ペン注射器、パッチ注射器、装着可能な注射器、皮下注射セットを有する形態型シリンジ注射ポンプ、または皮下注射のための抗体薬と化合するための他のデバイスであってもよい。
投与は、例えば、局所注入、注射、または移植片によって達成され得る。移植片は、シラスティック膜などの膜、または繊維を含む多孔質、非多孔質、またはゲル状材料であり得る。移植片は、対象への組成物の持続放出または定期放出のために構成され得る。例えば、米国特許出願公開第２００８０２４１２２３号、米国特許第５，５０１，８５６号、同第４，８６３，４５７号、及び同第３，７１０，７９５号、欧州特許第４８８４０１号、及び同第４３０５３９号を参照されたい（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載の組成物は、例えば、拡散系、浸食系、または対流系、例えば、浸透圧ポンプ、生分解性移植片、電子拡散系、電子浸透軽、蒸気圧ポンプ、電解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、浸食ベース系、または電気機械系に基づく埋め込み型デバイスによって対象に送達され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、局所投与によって対象に治療的に送達される。本明細書で使用される場合、「局所投与」または「局所送達」は、血管系を介してその意図される標的組織または部位への組成物または薬剤の輸送に依存しない送達を指す。例えば、組成物は、その組成物もしくは薬剤の注射もしくは埋め込みによって、またはその組成物もしくは薬剤を含有するデバイスの注射もしくは埋め込みによって送達されてもよい。標的組織または部位付近の局所投与に続いて、組成物もしくは薬剤、またはその１つ以上の成分は、意図される標的組織もしくは部位に拡散することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、接合部（例えば、関節）に局所的に投与され得る。例えば、障害が関節炎である実施形態において、治療上適切な組成物は、接合部（例えば、関節腔内）に、または関節付近に直接投与され得る。本明細書に記載の組成物が局所的に投与され得る関節内接合部の例としては、例えば、臀部、膝、肘、手首、胸鎖、側頭下顎、手根骨、足根骨、足首、及び関節炎病態の対象となる任意の他の接合部が挙げられる。本明細書に記載の組成物は、例えば、肩峰、二頭筋橈骨、肘橈骨、三角筋、膝蓋下、坐骨、及び医療分野において既知の任意の他の嚢などの嚢に投与することもできる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、目に局所的に投与され得る。本明細書で使用される場合、「目」という用語は、目に関連した任意かつ全ての解剖学的組織及び構造を指す。目は、３つの別個の層、すなわち外側強膜、中間脈絡膜層、及び内側網膜からなる壁を有する。レンズの後ろにある房は、硝子体液と称されるゲル状流体で満たされている。目の後部には光を検出する網膜がある。角膜は、画像を目の背後に伝える光学的に透明な組織である。角膜は、目の中に薬物を浸透させるための１つの経路を含む。目に関連した他の解剖学的組織構造としては、分泌系、分配系、及び排泄系を含む導涙系が挙げられる。分泌系は、涙液蒸発、及び遠心性副交感神経供給を有し、身体的または感情的刺激に反応して涙液を分泌する反射分泌体に起因する瞬き及び温度変化によって刺激される分泌体を含む。分配系は、瞼及び開いた目の蓋縁の周りに涙液メニスカスを含み、これが瞬きによって涙液を眼表面全体に広げ、故に乾燥面積が拡大するのを低減する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、目の後房に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、硝子体内に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、経強膜的に投与される。
いくつかの実施形態において、例えば、ＣＯＰＤまたは喘息などの障害の治療または予防のための実施形態では、本明細書に記載の組成物は、肺によって対象に投与され得る。肺薬物送達は、吸入によって達成されてもよく、本明細書での吸入による投与は、経口及び／または経鼻であり得る。肺送達のための薬学的デバイスの例としては、定用量吸入器、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、及び噴霧器が挙げられる。例えば、本明細書に記載の組成物は、乾燥粉末吸入器によって対象の肺に投与され得る。これらの吸入器は、分散性かつ安定した乾燥粉末製剤を肺に送達する、推進薬を含まないデバイスである。乾燥粉末吸入器は、医療分野において周知であり、無制限に、ＴｕｒｂｏＨａｌｅｒ（登録商標）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ＡＩＲ（登録商標）吸入器（Ａｌｋｅｒｍｅｓ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられる。例えば、ＰＣＴ公開第０４／０２６３８０号、同第０４／０２４１５６号、及び同第０１／７８６９３号も参照されたい。ＤＰＩデバイスは、インスリン及び成長ホルモンなどのポリペプチドの肺投与のために使用されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、定用量吸入器によって肺内投与され得る。これらの吸入器は、別個の用量の化合物を肺に送達するために推進薬に依存する。定用量吸入器によって投与される化合物の例としては、例えば、Ａｓｔｏｖｅｎｔ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）及びＦｌｏｖｅｎｔ（登録商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）が挙げられる。例えば、米国特許第６，１７０，７１７号、同第５，４４７，１５０号、及び同第６，０９５，１４１号も参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、噴霧器によって対象の肺に投与され得る。噴霧器は、圧縮空気を使用して、化合物を液化エアロゾルまたはミストとして送達する。噴霧器は、例えば、ジェット噴霧器（例えば、空気もしくは液体ジェット噴霧器）、または超音波噴霧器であり得る。追加のデバイス及び肺内投与方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５０２７１６６０号及び同第２００９０１１０６７９号に記載されている（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される組成物は、単位投薬形態で存在し、特に自己投与に好適であり得る。本開示の配合生成物は、典型的に、例えば、バイアルカートリッジ、充填済みシリンジ、または使い切りペンなどの容器内に含まれ得る。米国特許第６，３０２，８５５号に記載の投与器デバイスなどの投与器は、例えば、本開示の注射システムとともに使用されてもよい。
本開示の注射システムは、米国特許第５，３０８，３４１号に記載されるような送達ペンを用いることができる。糖尿病患者へのインスリンの自己送達のために最も一般的に使用されるペンデバイスは、当該技術分野において周知である。かかるデバイスは、少なくとも１つの注射針（例えば、長さ約５〜８ｍＭの３１ゲージ針）を備えることができ、典型的に、１つ以上の治療単位用量の治療溶液で充填済みであり、可能な限り少ない痛みで溶液を対象に急速送達するために有用である。
ある薬品送達ペンは、インスリンまたは他の薬品のバイアルが受容され得るバイアル保持具を含む。このバイアル保持具は、近位端及び遠位端を有する細長い略管状構造である。バイアル保持具の遠位端は、両端針カニューレに係合するための載置手段を含む。近位端もまた、駆動具及び用量設定装置を含むペン本体に係合するための載置手段を含む。先行技術のバイアル保持具とともに使用するためのバイアルを含む使い切り薬品（例えば、本明細書に記載の組成物の高濃度溶液）は、両端針カニューレの一端によって穿刺され得る穿刺可能な弾性中隔を有する遠位端を含む。このバイアルの近位端は、バイアルの円筒壁との液密係合で摺動可能に配設された停止具を含む。この薬品送達ペンは、薬品のバイアルをバイアル保持具に挿入することによって使用される。次に、ペン本体がバイアル保持具の近位端に接続される。ペン本体は、ペンによって送達される薬品の用量を指定するための用量設定装置、及び選択された用量に対応する距離だけ遠位に、バイアルの停止具を推進するための駆動装置を含む。ペンの使用者は、両側針カニューレをバイアル保持具の両端に載せ、針カニューレの近位先端がバイアル上の中隔を穿刺するようにする。次に患者は、用量を選択し、ペンを操作して停止具を遠位に推進し、選択された用量を送達する。用量選択装置は、選択された用量を注射するとゼロに戻る。次に患者は、針カニューレを除去及び破棄し、薬品送達ペンを、次に必要とされる薬品投与に便利な場所で保持する。バイアル中の薬品は、かかる薬品の数回投与後に使い果たされる。次に患者は、バイアル保持具をペン本体から分離する。次に空のバイアルを除去して破棄することができる。新たなバイアルをバイアル保持具に挿入することができ、バイアル保持具及びペン本体を、上で説明されるように再度組み立てて使用することができる。したがって、薬品送達ペンは、一般に、正確な投薬及び使用の容易性のための駆動機序を有する。
回転ノブなどの投薬機序は、使用者が、事前包装された薬品のバイアルからペンによって注射される薬品の量を正確に調整することを可能にする。その薬品の用量を注射するために、使用者は、針を皮下に挿入し、それが押せるだけ遠くにノブを１回押す。ペンは、全体的に機械的なデバイスであり得るか、または使用者に注射される薬品の投薬量を正確に設定及び／または指示するために、電子回路と組み合わされてもよい。例えば、米国特許第６，１９２，８９１号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、ペンデバイスの針は使い切りであり、キットは、１つ以上の使い切り交換針を含む。本明細書で取り上げられている組成物のうちのいずれか１つの送達に適したデバイスは、例えば、米国特許第６，２７７，０９９号、同第６，２００，２９６号、及び同第６，１４６，３６１号にも記載されている（各々の開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。微小針ベースのペンデバイスは、例えば、米国特許第７，５５６，６１５号に記載されている（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｌｔｄによって製造される精密ペン注射器（ＰＰＩ）デバイス、Ｍｏｌｌｙ（商標）も参照されたい。
本開示は、本明細書に記載の組成物などの薬品の慢性及び／または自己投与に適した制御放出または長期放出製剤も提示する。様々な製剤は、ボーラスとして薬品を用いるか、または長期間にわたる連続注入による治療を必要とする患者に投与され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の高濃度組成物は、持続放出、長期放出、時限放出、制御放出、または連続放出投与のために配合される。いくつかの実施形態において、デポー製剤は、それを必要とする対象に組成物を投与するために使用される。この方法において、組成物は、数時間または数日の期間にわたって活性剤の段階的放出を提供する１つ以上の担体とともに配合される。かかる製剤は、体内に段階的に分散して活性剤を放出する分解マトリックスに基づく場合が多い。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、噴霧器または吸入器によってそれを必要とする対象に投与される。例えば、本明細書に記載の組成物は、噴霧器または吸入器によって、喘息またはＣＯＰＤなどの障害に罹患した対象（例えば、ヒト）に送達され得る。
対象において障害を治療または予防することができる好適な用量の本明細書に記載の組成物は、例えば、治療される対象の年齢、性別、及び体重、ならびに使用される特定の阻害剤化合物を含む様々な因子に依存し得る。例えば、ＲＡを有する対象を治療するために必要とされる異なる組成物（例えば、抗ＴＮＦα組成物）の用量と比較して、異なる用量の１つの組成物（例えば、抗Ｃ５組成物）が、その対象を治療するために必要とされ得る。対象に投与される用量に影響を及ぼす他の因子としては、例えば、障害の種類または重症度が挙げられる。例えば、ＲＡを有する対象は、ＰＮＨを有する対象とは異なる投薬量の本明細書に記載の抗Ｃ５組成物の投与を必要とし得る。他の因子としては、例えば、対象が現在罹患しているか、または以前に罹患していた他の医的障害、対象の一般的健康、対象の遺伝的素因、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、及び対象に投与される任意の他の追加治療薬を挙げることができる。任意の特定の対象に対する特定の投薬及び治療計画は、治療する医療実践者（例えば、医師または看護師）の判断にも依存することも理解すべきである。
本明細書に記載の組成物は、固定用量として、または１キログラム当たりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）用量で投与され得る。いくつかの実施形態において、用量は、抗体の生成または組成物中の抗原結合分子のうちの１つ以上に対する他の宿主免疫反応を低減または回避するように選択することもできる。決して限定することを意図しないが、本明細書に記載の組成物などの抗体の例示的投薬量としては、例えば、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜２０ｍｇ／ｋｇ、及び１〜１０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。本明細書に記載の組成物の例示的投薬量としては、無制限に、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、または２０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
薬学的溶液は、治療上有効な量の本明細書に記載の組成物を含み得る。かかる有効量は、投与される組成物の効果、または複数の薬剤が使用される場合は、組成物及び１つ以上の追加活性剤の複合効果に部分的に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。治療上有効な量の本明細書に記載の組成物は、個人の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに組成物（及び１つ以上の追加活性剤）がその個人において所望の反応、例えば、少なくとも１つの状態パラメータの改善、例えば、補体媒介障害の少なくとも１つの症状の改善を引き出す能力などの因子によっても異なり得る。例えば、治療上有効な量の本明細書に記載の組成物は、特定の障害及び／または当該技術分野において既知または本明細書に記載の特定の障害の症状のうちのいずれか１つを阻害する（その重症度を軽減するか、またはその発生を排除する）、及び／または防止することができる。治療上有効な量は、その組成物のいかなる傷害性または有害効果よりも、治療上有益な効果が上回るものでもある。
本明細書に記載の組成物のうちのいずれかの好適なヒト用量は、例えば、第Ｉ相用量漸増研究において更に評価され得る。例えば、ｖａｎ Ｇｕｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ８（８）：１７１１−１７１８、Ｈａｎｏｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（２，ｐａｒｔ １）：５２３−５３１、及びＨｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５０（１０）：３４９９−３５００を参照されたい。
「治療上有効な量」または「治療上有効な用量」という用語、または本明細書で使用される類似語は、所望の生物学的または医的反応（例えば、補体関連障害の１つ以上の症状の改善）を引き出す薬剤（例えば、本明細書に記載の組成物）の量を意味することが意図される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の薬学的溶液は、治療上有効な量の該組成物のうちの少なくとも１つを含有する。いくつかの実施形態において、この溶液は、１つ以上の組成物及び１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上）の追加の治療薬を含有し、組成物が全体として治療上有効であるようになる。例えば、溶液は、本明細書に記載の抗Ｃ５組成物、及び免疫抑制剤を含有することができ、この組成物及び薬剤は各々、組み合わされたときに、対象において補体関連障害（例えば、ＣＯＰＤ、喘息、敗血症、もしくはＲＡなどの補体関連炎症性障害）を治療または予防するために治療上有効な濃度である。
かかる組成物の傷害性及び治療効果は、細胞培養物または実験動物（例えば、本明細書に記載の補体媒介障害のうちのいずれかの動物モデル）において、既知の薬学的手順によって決定され得る。これらの手順は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために使用され得る。傷害性と治療効果との間の用量比率は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。高い治療指数を呈する本明細書に記載の組成物が好ましい。傷害性副作用を呈する組成物が使用されることがあるが、罹患した組織の部位に対してかかる化合物を標的とする送達系を設計すること、及び性状細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減することに注意を払うべきである。
細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を策定する際に使用することができる。本明細書に記載の組成物の投薬量は、一般に、傷害性をほとんど有しないか、または全く有しない、ＥＤ５０を含む組成物の循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態及び投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本明細書に記載の組成物の場合、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように策定され得る。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。例えば、局所投与（例えば、目または接合部への）が所望されるいくつかの実施形態において、細胞培養物または動物モデリングを使用して、局所部位内で治療上有効な濃度を達成するために必要な用量を決定することができる。
いくつかの実施形態において、これらの方法は、補体関連障害のための他の療法と併せて行うことができる。例えば、組成物は、血漿交換療法、ＩＶＩＧ療法、または血漿交換と同時、その前、またはその後に対象に投与され得る。例えば、Ａｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １６：１３９２−１４０４を参照されたい。いくつかの実施形態において、組成物は、腎移植と同時、その前、またはその後に対象に投与され得る。
「対象」は、本明細書で使用される場合、任意の哺乳動物であり得る。例えば、対象は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、オランウータン、ゴリラ、マカク、ヒヒ、またはチンパンジー）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスであり得る。いくつかの実施形態において、対象は、幼児（例えば、ヒト幼児）である。
本明細書で使用される場合、「予防を必要とする」、「治療を必要とする」、または「それを必要とする」対象は、適切な医療実践者（例えば、ヒトの場合は医師、看護師、または看護実践者、非ヒト哺乳動物の場合は獣医）の判断によって、所与の治療からある程度の利益を享受するものを指す。
「予防する」という用語は、当該技術分野において認識されており、病態に関連して使用されるとき、当該技術分野において十分に理解され、本明細書に記載の組成物を受けない対象と比べて、対象における医的病態の症状の発症の頻度を低減するか、または遅延させる組成物の投与を含む。故に、喘息などの補体関連障害の予防は、例えば、未治療対照集団と比べて、予防処置を受ける患者の集団における咳、喘鳴、または胸痛の程度または頻度を低減すること、及び／または治療集団対未反応対照集団において、例えば、統計的及び／または臨床的に有意な量によって、咳または喘鳴の発生を遅延させることを含む。
上記のように、本明細書に記載の組成物は（例えば、抗Ｃ５組成物）を使用して、関節リウマチ（ＲＡ）、ループス腎炎、虚血再灌流傷害、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、定型溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、多発性硬化症（ＭＳ）、黄斑変性（例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ））、溶血、高肝酵素及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群、敗血症、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自然流産、少数免疫性血管炎、表皮水疱症、習慣性流産、多発性硬化症（ＭＳ）、及び外傷性脳損傷などであるが、これらに限定されない様々な補体関連病態を治療することができる。例えば、Ｈｏｌｅｒｓ（２００８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２２３：３００−３１６及びＨｏｌｅｒｓ ａｎｄ Ｔｈｕｒｍａｎ（２００４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４１：１４７−１５２を参照されたい。いくつかの実施形態において、補体媒介障害は、心血管障害、心筋炎、脳血管障害、末梢（例えば、筋骨格）血管障害、腎血管障害、腸間膜／腸血管障害、移植片及び／または再移植片に対する血管再生、血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、全身性エリテマトーデス関連血管炎、関節リウマチに関連した血管炎、免疫複合体血管炎、臓器または組織移植、高安病、毛細管漏出症候群、拡張型心筋症、糖尿病性血管障害、胸腹部大動脈瘤、川崎病（動脈炎）、うっ血性基体塞栓（ＶＧＥ）、及びステント留置に続く再狭窄、回転式粥腫切除術、及び経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）などであるが、これらに限定されない補体媒介血管障害である。（例えば、米国特許出願公開第２００７０１７２４８３号を参照されたい。）いくつかの実施形態において、補体関連障害は、重症筋無力症、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、発作性寒冷ヘモグロビン尿症（ＰＣＨ）、皮膚筋炎、強皮症、温式自己免疫性溶血性貧血、グレーブス病、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、グッドパスチャー症候群、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、デゴス病、及びカタストロフィーＡＰＳ（ＣＡＰＳ）である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、単独で、または第２の抗炎症薬との組み合わせで使用して、ＲＡ（上記）、炎症性腸疾患、敗血症（上記）、敗血症性ショック、急性肺傷害、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、またはクローン病などであるが、これらに限定されない炎症性障害を治療することができる。いくつかの実施形態において、第２の抗炎症薬は、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、エタネルセプト及びインフリキシマブなどの抗ＴＮＦ薬、リツキシマブなどのＢ細胞低下剤、インターロイキン−１拮抗薬、またはアバタセプトなどのＴ細胞共刺激遮断剤からなる群から選択されるものであり得る。
いくつかの実施形態において、補体関連障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳傷害、アルツハイマー病、及び慢性炎症性脱髄ニューロパシーなどであるが、これらに限定されない補体関連神経学的障害である。
補体関連障害は、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺疾患、α−１抗トリプシン欠損症、気腫、気管支拡張症、閉塞性細気管支炎、肺胞炎、サルコイドーシス、肺線維症、及びコラーゲン血管障害などであるが、これらに限定されない補体関連肺障害も含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、対象において補体関連炎症反応（例えば、補体関連障害の補体関連炎症反応の態様）の少なくとも１つの症状を治療、予防、または改善するために対象に投与される。例えば、組成物を使用して、移植片拒絶／移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、再灌流傷害（例えば、心肺バイパスまたは組織移植に続く）、及び火傷（例えば、重度火傷）、鈍的外傷、脊髄損傷、または凍傷などの他の形態の外傷に続く組織損傷などの補体関連炎症反応に関連した１つ以上の症状を治療、予防、及び／または改善することができる。例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎｅｓｔｈ Ａｎａｌｇ ９９（１）：４２−４８、Ｔｏｆｕｋｕｊｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ １１６（６）：１０６０−１０６８、Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｓｈｏｃｋ ８（２）：１１９−１２４、及びＢｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６（１）：Ｌ５７−Ｌ６３を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、単剤療法として対象に投与され得る。代替として、上記のように、この組成物は、別の治療、例えば、補体関連障害または補体関連炎症反応に対する別の治療との複合療法として対象に投与され得る。例えば、この複合療法は、敗血症を有するか、または発症する危険性のある対象に対して治療利益をもたらす、１つ以上の追加の薬剤（例えば、抗凝固剤、降圧剤、または抗炎症薬（例えば、ステロイド））を対象（例えば、ヒト患者）に投与することを含み得る。別の例において、複合療法は、ＣＯＰＤまたは喘息などの補体関連肺障害を有するか、発症する危険性があるか、または有することが疑われる対象に対して治療利益をもたらす、１つ以上の追加薬剤（例えば、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−５抗体、または抗ヒスタミン）を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物及び１つ以上の追加の活性剤は、同時に投与される。他の実施形態において、組成物が最初に投与され、１つ以上の追加の活性剤が２番目に投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の活性剤が最初に投与され、組成物が２番目に投与される。
本明細書に記載の組成物は、以前に投与された、または現在投与されている療法に代わり得るか、または増強することができる。例えば、本明細書に記載の組成物で治療する際、１つ以上の追加活性剤の投与を停止または減少させることができ、例えば、より低いレベルで、例えば、本明細書に記載の抗Ｃ５組成物の投与に続いて低レベルのエクリズマブが投与され得る。いくつかの実施形態において、以前の療法の投与が維持され得る。いくつかの実施形態において、組成物のレベルが治療効果をもたらすのに十分なレベルに到達するまで、以前の療法が維持される。２つの療法を組み合わせて投与することができる。
本明細書で定義されるように、障害（例えば、敗血症、重度火傷、ＲＡ、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群、または喘息）の改善について対象（例えば、ヒト患者）を監視することは、疾患パラメータの変化、例えば、所与の障害の１つ以上の症状の改善について対象を評価することを意味する。上記障害（例えば、補体関連障害）のうちの多くの症状は、医学の分野において周知である。いくつかの実施形態において、評価は、本明細書に記載の組成物の投与後、少なくとも１時間、例えば、少なくとも２、４、６、８、１２、２４、もしくは４８時間、または少なくとも１日、２日、４日、１０日、１３日、２０日以上、または少なくとも１週間、２週間、４週間、１０週間、１３週間、２０週間以上にわたって行われる。対象は、次の期間、すなわち、治療の開始前、治療中、または治療のうちの１つ以上の要素が投与された後のうちの１つ以上において評価され得る。評価は、更なる治療の必要性を評価すること、例えば、投薬量、投与頻度、または治療期間を変更すべきかどうかを評価することを含み得る。選択された治療形態を追加または除外する、例えば、本明細書に記載の補体関連障害に対する治療のうちのいずれかを追加または除外する必要性を評価することも含み得る。
以下の実施例は、単なる例示であり、多くの変化型及び均等物は、本開示を読むことで当業者に明らかとなるため、いかなる方法においても本開示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１．エクリズマブの半減期は、いくつかのクリアランス速度の組み合わせである
規定された投与計画を受けるＰＮＨ及びａＨＵＳ患者におけるエクリズマブの平均半減期は、約１１〜１２日であるが、ＩｇＧ２／４ Ｆｃを有するヒト化モノクローナル抗体について予期される半減期は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃを含有する抗体のそれに類似する、約２１〜２８日であると予測される。Ｍｏｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ４９（４）：６７３−６８０。エクリズマブの全体クリアランス速度に対する抗原媒介クリアランスの潜在的影響を理解するために、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ｈＦｃＲｎ）マウスモデル（マウスは、内因性ＦｃＲｎを欠失するが、ｈＦｃＲｎに対してトランスジェニックである（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ、保管番号０１４５６５、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））を使用して以下の実験を行った。トランスジェニックＦｃＲｎモデルは、例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８（１２）：１７５９−１７６９、Ｏｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５（２７）：９３３７−９３４２、及びＲｏｏｐｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６０２：９３−１０４に記載されている。
２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのエクリズマブの単一用量を、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって５匹のｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスの各々に投与した。約１００μＬの血液試料を、投与後１、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、マウスの各々から収集した。血清中のエクリズマブの濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に言えば、アッセイプレートをヒツジ抗ヒトＩｇκ軽鎖捕捉抗体でコーティングし、遮断した。次にプレートのウェルを、エクリズマブが血清中に存在する場合、捕捉抗体に結合するのを可能にする条件下で血清試料と接触させた。各ウェルに結合したエクリズマブの相対量は、検出可能に標識された抗ヒトＩｇＧ４抗体を使用して検出され、既知量のエクリズマブを含有するナイーブマウス血清から生成された標準曲線と比べて定量された。
抗体血清半減期は、以下の式を使用して計算した。
Figure 2017113028
 式中、Ｔ＝経過した時間、Ａｏ＝抗体の元の血清濃度（本研究の１日目における濃度）、Ａｔ＝経過時間Ｔ後に残留する抗体の量（最小検出可能濃度、または本研究での最後の出血時点（３５日目））。
実験の結果を図１に示す。ｈＦｃＲｎマウスモデルにおけるエクリズマブの半減期は、１３．４９±０．９３日であった。
ｈＦｃＲｎモデルを使用して、エクリズマブの半減期に対するヒトＣ５の影響を決定するために、抗体を、投与する前に４：１のモル比でヒトＣ５（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，カタログ番号：Ａ１２０）と予備混合し、１００μｇのエクリズマブの用量を、０日目に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。約１００μＬの血液を、１、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、後眼窩出血によって血清のために１．５ｍＬのエッペンドルフ管に収集した。
図１に示されるように、Ｃ５の存在下でのｈＦｃＲｎマウスモデルにおけるエクリズマブの半減期は、４．５５±１．０２日であった。これらの結果は、長い半減期がＦｃＲｎ媒介再生利用によって主に支配されるエンドサイトーシス媒介抗体クリアランス機序に加えて、エクリズマブの半減期が、ヒトＣ５を通じた抗原媒介クリアランスによって著しく影響され得ることを示す。
実施例２．エクリズマブのＦｃドメイン内のアミノ酸置換は、エクリズマブの半減期を増加させるが、エクリズマブクリアランスに対するＣ５の影響を上回るには十分でない
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域内の、ある特定のアミノ酸置換は、循環からの抗体の排除速度を低減することが示された。ｐＨ６．０でのＦｃＲｎについてのＩｇＧ抗体の結合親和性を増加させる置換は、かかる生物学的効果の例である。例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１７：１１２９−１１３８及びＧｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：６３７−６４０を参照されたい。Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．［（２０１０）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２８：１５７−１５９］は、血清中のＩｇＧ抗体の半減期を増加させることができるいくつかのアミノ酸置換、例えば、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを説明している。他の半減期を延長するアミノ酸置換には、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅが挙げられる。例えば、国際特許出願公開第２００８／０４８５４５号及びＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４−２３５２４を参照されたい。エクリズマブのＦｃ定常領域内の１つ以上のアミノ酸置換が、血清中のエクリズマブの半減期を延長することができるかどうかを決定するために、ＥＵ付番指標に基づいて、以下の置換、すなわちＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅをエクリズマブに導入した（以降、このエクリズマブの変異体は、ＹＴＥ変異体と称される）。重鎖定常領域は、以下のアミノ酸配列で構成される。
Figure 2017113028
 エクリズマブのＹＴＥ変異体の完全長重鎖ポリペプチドについてのアミノ酸配列は、配列番号１６に示される。
ＹＴＥ変異体は、実施例１に記載されるｈＦｃＲｎマウスモデルにおけるエクリズマブとともに評価した。つまり、１００μｇのエクリズマブ（ＩｇＧ２／４ Ｆｃ領域）、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のエクリズマブのＦｃまたはＹＴＥ変異体を含有するエクリズマブの変異体を、８匹のｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスの各々に静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって投与した。投与後１、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に各マウスから血清を収集した。血清中の各抗体の濃度は、ＥＬＩＳＡによって測定し、実施例１に記載されるように半減期を計算した。結果を図２及び表２に示す。
Figure 2017113028
図２及び表２に示されるように、ＹＴＥ置換は、エクリズマブの平均半減期を１４．２８±１日から２９．０７±４．７日に２倍より多く増加させた。
エクリズマブのＹＴＥ変異体の半減期に対するヒトＣ５の影響を決定するために、実施例１において上に記載されるように、マウスにヒトＣ５を投与した。１００μｇのエクリズマブ、エクリズマブ−ＩｇＧ２変異体、またはエクリズマブ−ＩｇＧ２ ＹＴＥ変異体の用量を、０日目に静脈内投与した。図３及び表３に示されるように、エクリズマブ、エクリズマブ−ＩｇＧ２変異体、及びエクリズマブ−ＩｇＧ２ ＹＴＥ変異体の半減期は、モル過剰のヒトＣ５の存在下で著しく減少した。故に、エクリズマブのＦｃＲｎ結合ドメイン内のアミノ酸置換は、エクリズマブの半減期に対するＣ５媒介クリアランスの寄与を上回るには不十分であった。
Figure 2017113028
実施例３．半減期に対するエクリズマブのＣＤＲ内のアミノ酸置換の影響
上記のように、マウスにおけるエクリズマブの半減期は、その抗原、ヒトＣ５（ｈＣ５）の存在下で著しく短縮される。いかなる特定の理論または作用機序にも拘束されないが、抗原の存在下での加速したクリアランスは、部分的に、Ｃ５についてのエクリズマブの非常に高い親和性（ＫＤ ｐＨ７．４で約３０ｐＭ、及びｐＨ６．０で約６００ｐＭ）の結果であると仮定され、これは飲作用後の早期エンドソームコンパートメント内の抗体：Ｃ５複合体の効率的な解離を可能にしない。解離なしに、抗体：抗原複合体は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介して細胞外コンパートメントに再生利用されるか、またはリソソーム分解の標的とされるかのいずれかである。いずれかの場合、抗体は、その寿命において、２つを超えるＣ５分子を結合することはできない。
Ｃ５についてのエクリズマブの強い親和性（ＫＤ 約３０ｐＭ）は、血中の全Ｃ５のほぼ完全な結合を可能にし、ごくわずかなＣ５が活性化されてＣ５ａ及びＴＣＣを形成することを確実にする。したがって、Ｃ５についてのエクリズマブの親和性は、抗体で治療された患者におけるその抗体のインビボ有効性に関連づけられる。発明者らは、エクリズマブのインビボでの有効性を損なうことなく、Ｃ５についてのエクリズマブの親和性を弱めることを提示する。この開示は、かかる手法に限定されないが、これは、エクリズマブのＣＤＲ内の１つ以上の位置にヒスチジンを導入することによって達成された。ヒスチジンは、６．０４のｐＫａを有する。これは、ｐＨ値が７．４（血液）から６．０未満（早期エンドソーム）に低下するとき、ヒスチジンがプロトンを得ることを意味する。故に、エンドソーム内で、ヒスチジンはより正電荷を持つようになる。発明者らは、エクリズマブ内のＣ５に対する結合部位またはその付近にヒスチジンを導入することが、中性ｐＨで血中のＣ５に対する高い親和性を維持しながら、エンドソーム内の電荷シフトがエンドソーム内の結合を破壊し得ると仮定した。かかる置換は、エンドソームの酸性環境内で、抗体：Ｃ５複合体からの抗体の解離を促進することによって半減期を増加させ、それによりＣ５がリソソーム内で分解される一方で遊離抗体が再生利用されると仮定される。
エクリズマブを親抗体として使用し、全てのＣＤＲ位置がヒスチジンで置換された一連の変異抗体を生成した。エクリズマブの重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
Figure 2017113028
 （重鎖可変領域のＣＤＲ領域に下線が引かれる。）エクリズマブの軽鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
Figure 2017113028
このヒスチジンを走査する試みの結果は、エクリズマブの６６の単一ヒスチジン置換変異体であった。これらの抗体変異体についての軽鎖及び重鎖コード配列を、確認された哺乳動物細胞及び配列内での発現に適した別個の「単一遺伝子構成体」プラスミドにクローン化した。単一アミノ酸置換を含有する抗体は、単一軽鎖または重鎖をコードする単一遺伝子構成体の同時形質移入によって、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で一時的に発現された。未修飾のエクリズマブＣＤＲ配列を表す「野生型」重鎖及び軽鎖の同時形質移入も行った（ＥＨＬ０００）。組織培養上清を抗体発現レベルについて正規化し、それらを使用して、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ器具（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｉｎｃ．）上でバイオレイヤー干渉法を用いて、ＥＨＬ０００と比べたヒトＣ５への抗体結合を評価した。簡単に言えば、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５００１）上で抗体を捕捉した。次に装填されたチップを、１２．５ｎＭの天然精製ヒトＣ５を含有するｐＨ７．４の緩衝溶液に８００秒間曝露して、親抗体と比べた会合の動態を評価した。解離動態は、チップをｐＨ７．４緩衝溶液またはｐＨ６．０緩衝溶液に８００秒間移すことによって評価した。全ての測定を繰り返して、読み取り値の一貫性を確実にした。
エクリズマブの単一ヒスチジン置換変異体は、エクリズマブと比べた一連の３つの特性に基づいて選択された。好ましいヒスチジン変異体は、ｐＨ７．４でのエクリズマブのｋａ及びｋｄからわずかに逸脱するにすぎないが、ｐＨ６．０でのエクリズマブのｋｄから著しく逸脱した。相対閾値選択基準は以下のとおりであった。
（１）ｐＨ７．４での会合動態の最大変動が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒で３３％小さいピーク相シフト、
（２）ｐＨ７．４での解離動態の最大変動が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒超で３倍以下のピーク相シフトの低減、及び
（３）ｐＨ６．０での解離動態の最小変化が、エクリズマブについて観察される８００秒での平均化ピーク相シフトと比較して、８００秒超で少なくとも３倍低減したピーク相シフト。
例えば、上記の項目（１）に関して、８００秒のエクリズマブとの会合の後の平均ピーク相シフトが、約０．７５ｎＭである場合、０．５ｎＭ未満（例えば、２回以上複製された）の相シフトを有する試験抗体は、上記基準を満たさない。対照的に、８００秒で０．５ｎＭを超えるピーク相シフトを有する試験抗体は、第１の基準を満たす。
これらの閾値を満たす軽鎖可変領域内の単一置換は、全て配列番号８に対して、Ｇ３１Ｈ、Ｌ３３Ｈ、Ｖ９１Ｈ、及びＴ９４Ｈであった。これらの閾値を満たす重鎖可変領域内の単一置換は、全て配列番号７に対して、Ｙ２７Ｈ、Ｉ３４Ｈ、Ｌ５２Ｈ、及びＳ５７Ｈであった。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、及び５Ｄを参照されたい。
単一置換が閾値基準を満たす位置における２つのヒスチジン置換の全ての可能な組み合わせを含む、第２の一連の抗体を生成した。表１を参照されたい。これらの会合及び解離動態は、同じ方法によって分析し、元の親抗体及び単一ヒスチジン置換の両方と比較した。同様に、それぞれ３つまたは４つのヒスチジン置換を含む第３及び第４の一連の抗体を生成し、関連する２つまたは３つのヒスチジン置換先行体と比較して、会合及び解離動態を分析した。表１を参照されたい。各段階において、ｐＨ７．４での会合動態の最小閾値、ｐＨ７．４での解離動態の最大閾値に対して、及びｐＨ６での解離動態の最小閾値に対して同じ基準を使用した。８つの置換の組み合わせが上記基準を満たし、ＳＰＲによるｐＨ７．４及びｐＨ６．０での親和性決定のために選択された。親和性を表４に記載する。
Figure 2017113028
これらの置換の組み合わせの場合、Ｃ５に対するエクリズマブの親和性は、ｐＨ６．０で１０００倍を超えて低減されたが、ｐＨ７．０において、親和性は、２０倍以下の親和性の低減を受けた。これらから、ＥＨＧ３０３（表４）が、ｐＨ７．４でのその高い親和性（０．１４６ｎＭ）及び８，０００超の（ｐＨ６．０でのＫＤ）／（ｐＨ７．４でのＫＤ）の比率に起因して、更なる分析のために選択された。ＥＨＧ３０３抗体の重鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 ＥＨＧ３０３抗体の軽鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 上記配列において、下線部分は、各ポリペプチドのリーダー配列に対応し、イタリック体部分は、クローニングによって導入された異種アミノ酸である。
ＥＨＬ０４９抗体も選択された。その重鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 ＥＨＬ０４９抗体の軽鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 上記配列において、下線部分は、各ポリペプチドのリーダー配列に対応し、イタリック体部分は、クローニングによって導入された異種アミノ酸である。
最後に、ＥＨＬ０００重鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 ＥＨＬ０００抗体の軽鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 上記配列において、下線部分は、各ポリペプチドのリーダー配列に対応し、イタリック体部分は、クローニングによって導入された異種アミノ酸である。
実施例４．ヒスチジン置換は、血清中のエクリズマブの半減期を延長する
上記ＥＨＬ及びＥＨＧ抗体の各々の軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドは、単一遺伝子構成体から発現された。ＥＨＧ３０３からの重鎖及び軽鎖コード配列は、ＥＨＬ０４９抗体についての軽鎖及び重鎖配列と同様に、二重遺伝子発現ベクターに組み入れられた。結果として生じるＥＨＧ３０３クローンは、ＢＮＪ４２１と指定され、結果として生じるＥＨＬ０４９クローンは、ＢＮＪ４２３と指定された。ＢＮＪ４２１の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
 ＢＮＪ４２１の軽鎖可変領域アミノ酸配列は以下のとおりである。
Figure 2017113028
 ＢＮＪ４２３抗体の重鎖可変領域は、以下のアミノ酸配列を含む。
Figure 2017113028
 ＢＮＪ４２３の軽鎖アミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
これらの２つの分子は、免疫不全（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ）及びＣ５欠乏のマウスにおいて、ＥＨＬ０００とともに評価した。２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのＥＨＬ０００、ＢＮＪ４２１、またはＢＮＪ４２３の単一用量を、８匹のマウスの各々に静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって投与した。投与後１、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、マウスの各々から血清を収集した。血清中の各抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。抗体血清半減期は、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．３ソフトウェアを使用し、非コンパートメント分析（ＮＣＡ）及び直接応答Ｅｍａｘを使用することによって計算した。血清中に残留する抗体のパーセンテージは、以下のように計算した。
Figure 2017113028
 式中、Ｃｔ＝所与の日の抗体濃度、及びＣ１＝１日目の抗体濃度。
結果を図６及び表５に示す。
Figure 2017113028
同じマウスモデルを使用してこれらの抗体の半減期に対するヒトＣ５の影響を決定するために、マウスにヒトＣ５を、−１日目（抗体をマウスに投与した日の前日）に２５０μｇの負荷用量、続いて５０μｇのＣ５の１日２回用量を皮下投与して、血清Ｃ５濃度を約２０μｇ／ｍＬで維持した（実施例１に記載のとおり）。
図７（及び下の表６）に示されるように、ヒト（ｈＣ５）の存在下でのマウスモデルにおけるＥＨＬ０００（エクリズマブ−ＩｇＧ１）の半減期（Ｃ５対エクリズマブのモル比が１：１を超える濃度で）は、２．４９±０．３４日であったが、ＢＮＪ４２１及びＢＮＪ４２３抗体（ヒスチジン置換を含む）の半減期は、それぞれ１５．２５±０．９０日及び２２．７１±０．７１日で実質的により優れていた。これらの結果は、エクリズマブのＣＤＲ内のヒスチジン置換、及び結果として生じるＣ５についてのｐＨ依存性親和性は、エクリズマブと比べて、血清からのエクリズマブ変異体のクリアランスの速度を著しく減少させることを示す。
Figure 2017113028
実施例５．ヒスチジン置換エクリズマブ変異体は、補体阻害活性を喪失しない
更に、実施例４に記載の実験からのヒトＣ５を含有する試料の各々における血清溶血活性も評価した。マウス血清中の終末補体活性は、ニワトリ赤血球を溶解するその能力を評価することによって決定した。使用したマウスは、Ｃ５欠乏であったため、溶血活性は、試料中のヒトＣ５の活性に直接反映する。簡単に言うと、０．１％ ゼラチン、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び１．８ｍＭ バルビタールナトリウムを含有するゼラチンベロナール緩衝生理食塩水（ＧＶＢＳ）（Ｃｏｍｐｔｅｃｈカタログ番号Ｂ１００）中の５０、３、及び０μｇ／ｍＬでの抗体を、それぞれ低度、中度、及び１００％溶解対照として使用した。実験試料は、マウス試験血清をＧＶＢＳ中１：１０に希釈することによって調製した。ＧＶＢＳ中の等量の２０％マウスＣ５欠乏血清及び２０％ヒト血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＭＳＲＭ−ＣＯＭＰ＋）を対照ウェルに含み、等量のＧＶＢＳ中の２０％マウスＣ５欠乏血清及び２０％ヒトＣ５欠乏血清（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ３２０）を試験試料ウェルに含む、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ カタログ番号３７９９）の対応する三重ウェルに試料分量（５０μＬ）を分注した。ＥＤＴＡ（５００ｍＭで２μＬ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ−９８８４）を、対照及び試料三重体の両方を第３のウェルに添加して、「溶血なし」血清色対照を生成した。ニワトリ赤血球をＧＶＢＳ中で洗浄し、感作して、４℃で１５分間の抗ニワトリＲＢＣポリクローナル抗体（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０．１％ ｖ／ｖ）でのインキュベーションによって補体古典経路を活性化し、再度洗浄して、約７．５×１０７細胞／ｍＬの最終濃度でＧＶＢＳ中に再懸濁した。感作したニワトリ赤血球（約２．５×１０６細胞）を、対照及び試料を含有するプレートに添加し、プレート撹拌器上で簡単に混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。試薬を再度混合し、８４５×ｇで３分間遠心分離して、８５μＬの上清を９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｐｅｎｆｉｅｌｄ，ＮＹ、カタログ番号４３９４５４）のウェルに移した。マイクロプレートリーダーを使用して、４１５ｎＭでの吸光度を測定し、以下の式を使用して溶血のパーセンテージを決定した。
Figure 2017113028
図８に示されるように、エクリズマブと比べたｐＨ７．４での親和性のわずかな低減にもかかわらず、ＢＮＪ４２１及びＢＮＪ４２３の両方は、依然として循環中に存在するヒトＣ５のほぼ全てを結合し、溶血を阻害することができた。これらの結果は、Ｃ５についてのエクリズマブの親和性が、インビボでの抗体の有効性を損なうことなく脆弱化され得、抗体に増加した血清半減期を付与することを示す。
実施例６．Ｃ５へのｐＨ依存性結合及び強化されたＦｃＲｎ媒介再生利用は、エクリズマブ変異体の血清半減期に対する追加要素である
上に示されるように、ヒトＣ５の存在下、ヒスチジン置換エクリズマブ変異体の半減期は、トランスジェニックマウスにおいて著しく延長される。Ｃ５及びＦｃＲｎへのｐＨ依存性結合の、構成的Ｃ５合成及びヒトＦｃＲｎの存在下での抗Ｃ５抗体の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）に対する潜在的な追加の効果を評価するために、トランスジェニックマウス発現ヒトＦｃＲｎ内にヒト定常領域を有する抗マウスＣ５抗体を使用して、一連のＰＫ／ＰＤ実験を行った。これらのマウス抗Ｃ５抗体は、ＢＢ５．１の可変領域から操作され、マウス抗体は、マウスＣ５に結合し、活性代謝断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂへのその切断を防止するため、エクリズマブの薬理学的代理として機能する［Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３：３７５−３８２］。高親和性抗マウスＣ５抗体（ＢＨＬ０１１と指定される）は、ＢＢ５．１マウス可変領域、ならびにヒトＩｇκ及びヒトＩｇＧ２／Ｇ４定常領域の親和性最適化変異体で操作された。ＢＨＬ０１１のｐＨ依存性変異体は、３つのヒスチジン置換をマウス可変領域に組み込むことによって操作された（この変異体は、ＢＨＬ００６と指定された）。第３の抗体は、ｈＦｃＲｎについての親和性を増加させるために、２つのアミノ酸置換をヒト定常領域重鎖（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）に組み込むことによって操作された（この変異体は、ＢＨＬ００９と指定された）。
ＢＨＬ００６の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
 ＢＨＬ００６抗体の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
ＢＨＬ００９の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
 ＢＨＬ００９の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
ＢＨＬ０１１の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
 ＢＨＬ０１１の重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
Figure 2017113028
精製されたマウスに結合するＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００６、及びＢＨＬ００９の動態は、抗Ｆｃヒト捕捉方法を使用して、ＢＩＡＣｏｒｅ ３０００器具上のＳＰＲを介して決定された。簡単に言うと、ｐＨ５．０の１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈された抗ヒトＦｃ（ＫＰＬ、カタログ番号：０１−１０−２０）を、アミンカップリングによって８分間、ＣＭ５チップの２つのフローセル上に固定した。抗体を、泳動緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｖ／ｖ 界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：ＢＲ１００１−８８）中で０．２５μｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈した抗体を１つのフローセルに注射し、続いて６ｎＭ マウスＣ５を両方のセルに注射した。第２のフローセルは、参照表面として使用した。結合を、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で評価した。表面を毎回２０ｍＭ ＨＣｌ、０．０１％ Ｐ２０で再生した。１：１ラングミュアモデルを用い、ＢＩＡ評価４．１ソフトウェアを「二重参照」で使用してデータを処理した。ｐＨ６．０でのマウスＣ５に複合されたＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００６、及びＢＨＬ００９の解離は、６ｎＭ マウスＣ５（ｐＨ７．４）の注射に続いて、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ｐＨ６．０）の注射を用いて同様に評価した。これらの実験の結果を表７に示す。
Figure 2017113028
構成的Ｃ５合成の存在下での抗Ｃ５抗体の薬物動態（ＰＫ）に対するＣ５へのｐＨ依存性結合の影響、及び半減期の追加の増加を付与するための強化ＦｃＲｎ再利用の可能性を決定するために、実施例１に記載のトランスジェニックＦｃＲｎマウスモデルを使用して、ＢＨＬ０１１、ＢＨＬ００６、及びＢＨＬ００９の総血清濃度を分析した。総抗体血清濃度及び１日目の濃度のパーセンテージとしての血清濃度を図９〜１１に示す。雄マウスは、実線で表され、雌は点線で表される。１日目の総抗体血清濃度は、体重の差及び分布量に比例して、雄よりも雌のほうが高かった。この性差は、恐らく、Ｃ５媒介クリアランスから生じる用量依存性非線形性に起因する、ＢＨＬ０１１薬物動態の動物間の変異性に寄与した（図９Ａ及び９Ｂ）。一般に、動物間変異性は、加速したクリアランスを示したＢＨＬ００６用量群中の１匹の雌（２９３９）を除いて、ＢＨＬ００６（図１０Ａ及び１０Ｂ）ならびにＢＨＬ００９（図１１Ａ及び１１Ｂ）に対して低かった。動物２９３９における加速したクリアランスの理由は不明である。
Ｃ５及びｈＦｃＲｎの構成的合成の存在下、高親和性ＩｇＧ２／４抗Ｃ５抗体（ＢＨＬ０１１）は、６日の平均終末半減期を有し、２１日目に約９８％が循環から一掃された（図１２及び１３、表８）。ＩｇＧ２／４ Ｆｃ領域を有するｐＨ依存性抗Ｃ５抗体（ＢＨＬ００６）についての平均クリアランス速度は減衰され、１６〜１９日の平均β相半減期を有する。ＩｇＧ２／４ Ｆｃ領域を有するｐＨ依存性抗Ｃ５抗体に対して、ｈＦｃＲｎについての向上した親和性とともに、半減期の追加の約２倍の増加が観察された（約３６日のＢＨＬ００９半減期）。これらのパラメータは、ｈＦｃＲｎマウスにおける抗原の非存在下、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ置換の有無にかかわらずＩｇＧ２／４抗体に対して観察されるものと一致する。これらの結果は、ｐＨ依存性Ｃ５結合及びＦｃＲｎについての増加した親和性は、抗Ｃ５抗体のＰＫ曝露を延長するために追加の効果を付与することを実証する。
Figure 2017113028
ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける抗マウスＣ５抗体の薬力学
血清試料中の抗マウスＣ５抗体の薬理活性は、補体古典経路媒介ニワトリ赤血球（ニワトリ赤血球細胞、ｃＲＢＣ）溶血アッセイにおいて体外で評価された。溶血活性は、投与前試料における活性のパーセンテージとして計算され、図１４〜１６に示される。雄は実線、及び雌は点線で表される。体外溶血活性の拮抗作用は、試料中の総抗体の濃度に比例する。溶血活性の拮抗作用の期間における性差は、ＢＨＬ０１１に対して顕著であり（図１４）、ＢＨＬ０１１ ＰＫについての体重依存性動物間変異性に対応する（図９）。一般に、動物間変異性は、加速した抗体クリアランスを示したＢＨＬ００６用量群中の雌（２９３９）を除いて（図１０）、ＢＨＬ００６（図１５）及びＢＨＬ００９（図１６）に対して低かった。
総抗体血清濃度と体外溶血活性の拮抗作用との相関の差は、Ｃ５についての抗体の親和性に比例する。高親和性抗体（ＢＨＬ０１１）は、約２００μｇ／ｍＬにおいて溶血活性をほぼ完全に抑制したが（図１７）、弱親和性、ｐＨ依存性抗Ｃ５抗体は、体外で完全な拮抗作用を達成するために、２〜３倍高い濃度を必要とする（図１８及び１９）。
ｐＨ依存性抗Ｃ５抗体におけるこの能力の喪失にもかかわらず、各郡からの動物全体のｃＲＢＣ溶血に対する平均活性レベルは、それらが延長された投与間隔を支持し得ることを示唆する。１４日目に、高親和性抗Ｃ５（ＢＨＬ０１１）で治療された動物は、４０％を超える平均溶血活性レベルを有していたが、ｐＨ依存性抗Ｃ５（ＢＨＬ００６及びＢＨＬ００９）で治療された動物は、それぞれ２１日目及び２８日目まで４０％未満の平均溶血活性レベルを維持した（図２０）。
高親和性抗マウスＣ５抗体（ＢＨＬ０１１）と比べて、マウスＣ５（ＢＨＬ００６及びＢＨＬ００９）に対するｐＨ依存性結合を有する抗体の半減期及び対応する拮抗作用の期間の著しい延長は、ｐＨ依存性抗ヒトＣ５抗体（ＢＮＪ４２１、ＢＮＪ４２３、またはＢＮＪ４４１）が、ヒトＣ５を同時投与したマウスにおけるその高親和性の相手（ＥＨＬ０００またはエクリズマブ）と比べて、同様の半減期増加を呈した、実施例４及び７に記載の研究と一致していた。これらの発見は、ＣＤＲ内の選択ヒスチジン置換を通じてｐＨ依存性抗原結合を操作することが、Ｃ５を通じて抗原媒介クリアランスを著しく減衰させ得、遊離抗体が循環に戻り、再生利用されるのを可能にするという概念を更に立証する。更に、ＢＨＬ００９におけるｐＨ依存性抗原結合と、ＦｃＲｎについての強化された親和性の組み合わせは、ＰＫ特性に対する影響の追加要素であり、ｐＨ依存性結合単独（ＢＨＬ００６）よりも半減期を二倍にする。これらの観察は、Ｃ５へのｐＨ依存性結合が、ＦｃＲｎについての向上した親和性との組み合わせで、エクリズマブについて観察されるＰＫパラメータ及び治療的ＰＤの期間の著しい延長をもたらし得、月１回以上の投与を可能にするという仮説と一致している。
実施例７．Ｃ５へのｐＨ依存性結合を有する変異エクリズマブの生成及びＦｃＲｎ媒介再生利用の強化
エクリズマブを親分子として使用して、抗体を生成した。エクリズマブと比べて、変異抗体（ＢＮＪ４４１と指定される）は、重鎖内に４つのアミノ酸置換、Ｔｙｒ−２７−Ｈｉｓ、Ｓｅｒ−５７−Ｈｉｓ、Ｍｅｔ−４２９−Ｌｅｕ、及びＡｓｎ−４３５−Ｓｅｒを含んでいた（ＢＮＪ４４１の４２９位及び４３５位は、ＥＵ付番システム下で４２８位及び４３４位に対応することに留意されたい）。重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１４に示される。軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１に示される。これらの突然変異を操作して、２つの別個の機序、すなわち（１）標的媒介抗体クリアランスを通じて抗体クリアランスを低減すること、及び（２）ＦｃＲｎ媒介抗体再生利用の効率性を増加させることを通じて循環半減期を増加させることによって、ＢＮＪ４４１（エクリズマブと比較して）の投与間隔の延長を可能にする。
重鎖可変領域の第１及び第２の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の２つのアミノ酸置換、Ｔｙｒ−２７−Ｈｉｓ及びＳｅｒ−５７−Ｈｉｓは、Ｃ５についてのＢＮＪ４４１の親和性解離定数（ＫＤ）を、エクリズマブと比較して、ｐＨ７．４で約１７倍、及びｐＨ６．０で約３６倍弱める。第３の重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ３）内の２つの突然変異、Ｍｅｔ−４２９−Ｌｅｕ及びＡｓｎ−４３５−Ｓｅｒは、ＦｃＲｎに対するＢＮＪ４４１の親和性を、エクリズマブと比較して、ｐＨ６．０で約１０倍増加させる。
結合動態（Ｃ５に対する抗体）
Ｃ５に結合するＢＮＪ４４１またはエクリズマブの動態は、ｐＨ８．０、７．４、７．０、６．５、及び６．０で抗Ｆｃ捕捉方法を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００器具上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介して決定された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（ＫＰＬ番号０１−１０−２０）を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈し、アミンカップリングによって８分間、ＣＭ５チップの２つのフローセル上に固定した。試験抗体（ＢＮＪ４４１またはエクリズマブ）を、泳動緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：ＢＲ１００１−８８）中で０．２０μｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈した抗体を、１つのフローセルに注射し（ｐＨ７．４実験の場合２０μＬ、及びｐＨ６．０実験の場合４０μＬ）、続いて異なる濃度のＣ５を両方のセルに注射した。泳動緩衝液は、３Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７．０、６．５、及び６．０動態について、ならびに０．５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ８．０動態について滴定した。２０ｍＭ ＨＣｌ、０．０１％ Ｐ２０を用いて、サイクル毎に表面を再生した。１：１ラングミュアモデルを用い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を「二重参照」で使用してデータを処理した。
ｐＨ８．０、７．４、７．０、６．５、及び６．０におけるＢＮＪ４４１またはエクリズマブからのＣ５の解離速度は、上記の抗Ｆｃ捕捉方法を以下の修正とともに使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００器具上でＳＰＲを介して決定された。希釈した試験抗体を１つのフローセルに注射し、続いて６ｎＭのＣ５を両方のセルに注射した。Ｃ５注射後直ぐに、様々なｐＨの２５０μＬの泳動緩衝液を注射した。泳動緩衝液は、上記のように調製した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を「二重参照」で使用してデータを処理した。ＢＮＪ４４１及びエクリズマブのＣ５の解離％は、ｔ＝０及びｔ＝３００秒での解離の差を取ることによって計算した。
結合動態（ＦｃＲｎに対する抗体）
ヒトＦｃＲｎに結合するＢＮＪ４４１またはエクリズマブの動態は、ｐＨ７．４及び６．０でのＦ（ａｂ’）２捕捉方法を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００器具上でＳＰＲを介して決定された。ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で０．０４ｍｇ／ｍＬに希釈されたヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カタログ番号：７０９−１１１８）を、アミンカップリングによって７分間、ＣＭ５チップの２つのフローセル上に固定した。試験抗体（ＢＮＪ４４１またはエクリズマブ）を、泳動緩衝液（（ＨＢＳ−ＥＰ、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号ＢＲ１００１−８８）中で２μｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈した抗体を、１つのフローセルに注射し、続いてＦｃＲｎを両方のセルに注射した。泳動緩衝液は、３Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ６．０動態について滴定した。１０ｍＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ１．５）を用いて、サイクル毎に表面を再生した。１：１ラングミュアモデルを用い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を「二重参照」で使用してデータを処理した。
結合研究の結果
抗体：Ｃ５結合の動態は、ｐＨ依存性であることが見出され、会合及び解離速度の両方に対する影響を表９に示す。
Figure 2017113028
早期エンドソームの飲作用及び酸性化後の抗体：Ｃ５複合体の解離の相対速度をモデル化する試みにおいて、抗体：Ｃ５複合体は、ｐＨ７．４緩衝液中で形成することが可能になり、次に緩衝液のｐＨ状態は、解離中に切り替えられた。３００秒後の抗体複合体解離のパーセント（共鳴単位［ＲＵ］の減少によって推定される）は、各ｐＨ条件に対して計算された（表１０）。ｐＨ６．０でのＢＮＪ４４１のみが、５分後に５０％を超える抗体：Ｃ５複合体解離をもたらした。
Figure 2017113028
図２１Ａ及び２１Ｂは、ｐＨの関数として、ＢＮＪ４４１：Ｃ５複合体またはエクリズマブ：Ｃ５複合体の解離のパーセンテージの半対数及び線形プロットを示す。
重鎖可変領域の第１及び第２の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の２つのアミノ酸置換、Ｔｙｒ−２７−Ｈｉｓ及びＳｅｒ−５７−Ｈｉｓは、Ｃ５についてのＢＮＪ４４１の親和性解離定数（ＫＤ）を、エクリズマブと比較して、ｐＨ７．４で約１７倍、及びｐＨ６．０で約３６倍弱める。Ｃ５についてのＢＮＪ４４１の親和性のｐＨ依存性が、２７及び／または５７位に導入されたヒスチジンのプロトン化状態の変化の結果であるか、または単にＣ５についての親和性の全体的脆弱化であるかは不明である。しかしながら、他の抗Ｃ５抗体において、これらの突然変異は、追加のヒスチジン置換との組み合わせで、６．５を下回るｐＨレベルではるかに顕著な親和性の喪失をもたらしたことが観察された。第３の重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ３）内の２つの突然変異、Ｍｅｔ−４２９−Ｌｅｕ及びＡｓｎ−４３５−Ｓｅｒは、ＦｃＲｎについてのＢＮＪ４４１の親和性を、エクリズマブと比較して、ｐＨ６．０で約１０倍強化する。
ＢＮＪ４４１抗体のＰＫ特性
ＢＮＪ４４１抗体及びエクリズマブは、免疫不全（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ）及びＣ５欠乏のマウスにおいて評価した。２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００μｇのＢＮＪ４４１またはエクリズマブの単一用量を、８匹のマウスの各々に静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって投与した。投与後１、３、７、１４、２１、２８、及び３５日目に、マウスの各々から血清を収集した。血清中の各抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡによって測定した。
図２２に示されるように、ヒトＣ５の非存在下で、血清抗体濃度は、３５日の期間にわたってＢＮＪ４４１及びエクリズマブを投与したマウスにおいて同様に低下した。しかしながら、ヒトＣ５の存在下で、エクリズマブ血清濃度は、１４日後に検出不可能なレベルに急速に低下したが、ＢＮＪ４４１の血清濃度は、更にゆっくりと研究期間にわたって一定速度で低下した（図２３）。
ヒトＣ５の存在及び非存在下で２つの抗体のＰＫプロファイルを比較したとき、エクリズマブのクリアランスは、ヒトＣ５の非存在下でのそれと比較して、ヒトＣ５の存在下で加速されたが、ヒトＣ５の存在下でのＢＮＪ４４１のＰＫプロファイルは、２８日目のヒトＣ５の非存在下でのＢＮＪ４４１のそれと類似しており、クリアランスは、２８日目〜３５日目に加速されただけであった（図２４）。ＢＮＪ４４１の半減期及びエクリズマブの半減期は、ヒトＣ５の非存在下で同等であった（ＢＮＪ４４１の場合、２５．３７±１．０２日、及びエクリズマブの場合、２７．６５±２．２８日）。しかしながら、ヒトＣ５の存在下でＢＮＪ４４１は、エクリズマブと比較して、３倍を超える半減期の増加を実証した（ＢＮＪ４４１の場合、１３．４０±２．１８日対エクリズマブの場合、３．９３±０．５４日）。ＢＮＪ４４１のクリアランス速度は、ヒトＣ５の存在または非存在下で、２８日目まで著しく異ならなかったことに留意すべきである。表１１を参照されたい。
Figure 2017113028
Figure 2017113028
血清溶血活性
抗体の溶血活性に対するヒスチジン置換の効果を決定するために、体外溶血アッセイを、実施例６に記載のように行った。ＢＮＪ４４１またはエクリズマブの存在下で、終末補体活性は、各抗体のそれぞれのＰＫプロファイルと一致し（図２５）、つまり血清溶血活性の阻害のレベルは、血清中に残留する各抗体の濃度に比例していた。両方の抗体は、３日目まで溶血のほぼ完全な阻害を付与した。しかしながら、エクリズマブは、１４日目まで拮抗作用を示さなかったが、ＢＮＪ４４１は、１４日目まで約８３％の阻害を維持し、２８日目まで部分的な補体阻害を維持した。
結論
この研究からの発見は、ヒトＣ５の存在下でＢＮＪ４４１が、エクリズマブと比較して３倍を超える半減期の延長を示したことを示唆する。更に、エクリズマブと比べたＢＮＪ４４１の血清半減期は、長い溶血阻害によって証明されるように、延長された薬力学的プロファイルに翻訳された。
実施例８．健康なヒト対象におけるＢＮＪ４４１の安全性、耐性、ＰＫ、及びＰＤ
ＢＮＪ４４１の安全性、耐性、ＰＫ、及びＰＤは、第１相ランダム化盲検プラセボ対照単一上昇用量（ＳＡＤ）ヒト臨床研究において評価し、ＢＮＪ４４１を健康な対象に静脈内投与した。
ＢＮＪ４４１を、滅菌の保存量を含まない水性溶液中で配合賦形剤と配合した。ＢＮＪ４４１製剤は、いかなる異常な賦形剤も動物またはヒト起源の賦形剤も含有しなかった。製剤をｐＨ７．０にリン酸緩衝化した。成分は、ＢＮＪ４４１を１０ｍｇ／ｍＬ、リン酸ナトリウム一塩基３．３４ｍＭ、リン酸ナトリウム二塩基６．６３ｍＭ、塩化ナトリウム１５０ｍＭ、ポリソルベート８０ ０．０２％、及びＱ．Ｓ．水を含んでいた。
ＢＮＪ４４１製剤は、２０ｍＬ単回使用バイアル中の１０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液として供給され、ＩＶ投与のための市販の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム注射液、Ｐｈ Ｅｕｒ）にそれを希釈することによって注射用に設計された。
Figure 2017113028
健康な１０対象が単一用量のＢＮＪ４４１を受けた。４対象は、２００ｍｇの用量を受け、６対象は４００ｍｇの用量を受けた。この研究のＰＫ及び安全性データを決定し、下で考察した。
薬物動態
２００ｍｇ及び４００ｍｇ用量のＩＶ投与後の血清ＢＮＪ４４１濃度−時間プロファイルを図２６に示す。濃度−時間データは、それぞれ２００ｍｇ及び４００ｍｇ用量後、最大９０日（２１３６時間）及び５７日目（１３４４時間）まで入手可能であった。平均血清濃度は、２００ｍｇ用量後、２〜４日間（４８〜９６時間）にわたって、及び４００ｍｇ用量後、１４〜２１日（３３６〜５０４時間）にわたって５０μｇ／ｍＬ超を維持した。
ＢＮＪ４４１ ＰＫパラメータの要約を下の表１２で報告する。ＢＮＪ４４１の幾何平均（ＣＶ）Ｃ最大は、２００ｍｇ用量後、７８．５（１０．２％）μｇ／ｍＬであり、４００ｍｇ用量後、１３９（１６．２％）μｇ／ｍＬであった。観察された中央値（範囲）ｔ最大は、２００ｍｇ用量の場合、注入開始後２．４（０．７９〜８．０）時間であり、４００ｍｇ用量の場合、０．５８（０．５８〜１．１）時間であった。幾何平均（ＣＶ）ＡＵＣ（０〜５６日）は、２００ｍｇ用量の場合、３２，８００（８．６％）μ‐ｈｒ／ｍＬであり、４００ｍｇ用量の場合、５８，１００（１８．９％）μｇ‐ｈｒ／ｍＬであった。幾何平均Ｃ最大及びＡＵＣ（０〜５６日）は、明らかな用量比例的様式で曝露が増加したことを示す。幾何平均ｔ１／２（ＣＶ）は、それぞれ２００ｍｇ及び４００ｍｇ用量の場合、３８．５（１８．４％）日及び３２．９（１３．３％）日であった。
要約すると、ＰＫデータは、平均ＢＮＪ４４１ Ｃ最大及びＡＵＣ（０〜５６日）が、用量比例的様式で増加したことを示唆し、ＩＶ投与後の３５．５±６．１日の平均（標準偏差［ＳＤ］）ｔ１／２を支持する。ニワトリ赤血球細胞（ｃＲＢＣ）溶血データの分析は、ＢＮＪ４４１濃度が１００μｇ／ｍＬを超えたとき、終末補体が、単一４００ｍｇＩＶ用量後、最大２日間にわたって完全に阻害されたことを示す。
Figure 2017113028
薬力学
図２７に示されるように、長期間にわたってｃＲＢＣ溶血を阻害するＢＮＪ４４１の能力も評価した。平均ｃＲＢＣ溶血活性は、プラセボを受けた対象において比較的安定していた。ｃＲＢＣ溶血阻害の発症は急速であり、注入の最後に完全な終末補体阻害が観察された（２００ｍｇ用量の場合、０．２９時間、及び４００ｍｇ用量の場合、０．５８時間）。ＢＮＪ４４１は、用量依存的作用期間を有し、４〜１４日間続いた。
ＢＮＪ４４１濃度とｃＲＢＣ溶血との関係をプロットし、図２８に示す。図２８に示されるように、完全な終末補体阻害は、５０μｇ／ｍＬを超えるＢＮＪ４４１濃度で起こり、２５μｇ／ｍＬを下回るＢＮＪ４４１濃度で阻害は観察されなかった。
実施例９．カニクイザルにおける単一用量研究
ＢＮＪ４４１の単一ＩＶ用量を、カニクイザルに６０または１５０ｍｇ／ｋｇの用量で（各用量群に対してｎ＝４、１用量群当たり雄２匹及び雌２匹）、２時間注入として投与した。ＢＮＪ４４１分析のための血液試料は、１日目〜１１２日目に収集した。
全てのＢＮＪ４４１治療したサルを、投与前（０時間）、ならびに８、１４、２８、５６、８４、及び１１２日目に、カニクイザル抗ヒト抗体（ＣＡＨＡ）の存在についてスクリーニングした。
６０及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量群の全てのサルは、１５０ｍｇ／ｋｇ用量群の動物２００２を除いて、少なくとも単発で陽性であると確認された。動物２００２におけるＣＡＨＡの存在、または他の動物に対する非陽性時点は、ビオチニル化ＢＮＪ４４１及びルテニル化ＢＮＪ４４１架橋アッセイによる投与されたＢＮＪ４４１の緩衝の可能性に起因して、排除することはできない。陽性ＣＡＨＡ結果は、６０ｍｇ／ｋｇ用量群において投与後５６日目〜１１２日目、及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量群において２８日目〜１１２日目に観察された。６０ｍｇ／ｋｇにおいて最初に確認されたＣＡＨＡ陽性試料は、５６日目であり（動物１００２及び１５０３）、８４日目に２匹（動物１００２及び１５０３）、１１２日目に３匹（動物１００１、１００２、及び１５０２）であった。５６日目及び８４日目にＣＡＨＡ陽性であった動物１５０３は、１１２日目においてもはやＣＡＨＡ陽性ではなかった。１５０ｍｇ／ｋｇ用量群において最初に確認されたＣＡＨＡ陽性試料は、２８日目の動物２５０２であり、続いて５６日目に２匹のサル（動物２００１及び２５０２）、８４日目に３匹のサル（動物２００１、２５０１、及び２５０２）、ならびに１１２日目に３匹のサル（動物２００１、２５０１、及び２５０２）であった。
個々のＢＮＪ４４１濃度−時間プロファイルを計算した。６０ｍｇ／ｋｇ用量群において、全てのサルは、１１２日目のＰＫ試料まで定量可能な血漿ＢＮＪ４４１濃度を有していたが、１５０ｍｇ／ｋｇ用量群において、１匹のサル（動物２００２）のみが１１２日目まで定量可能な血漿ＢＮＪ４４１濃度を有していた。濃度−時間データは、サルの全身循環中のＢＮＪ４４１の長い滞留を示した。
ＢＮＪ４４１の非コンパートメントＰＫパラメータ及び要約統計を、全てのサルについて用量レベル毎に計算し、６０ｍｇ／ｋｇ及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量レベルについてそれぞれ表１３及び１４に示す。注入期間と一致して、中央値ｔ最大は、６０ｍｇ／ｋｇ及び１５０ｍｇ／ｋｇ用量レベルに対して２時間であった。１５０ｍｇ／ｋｇ用量群における１匹のサル、動物２５０１は、投与後１２時間のｔ最大を有し、投与後２〜１２時間は比較的平坦なプロファイルを有し、投与後１２時間の試料濃度は、投与後２時間で観察されたものよりも約５％高かった。幾何平均Ｃ最大、ＡＵＣ∞、及びＡＵＣ最後は全て、漸増用量で増加した。幾何平均用量正規化したＣ最大値は、２つの用量にわたって類似し、用量の増加に伴うピークＢＮＪ４４１濃度の用量比例的増加を示すが、幾何平均用量正規化ＡＵＣ∞値は、用量群間で異なった。この差は、１５０ｍｇ／ｋｇ用量群におけるＢＮＪ４４１ＣＬのＣＡＨＡ媒介増加に起因する可能性があり、ＢＮＪ４４１のクリアランスは、６０ｍｇ／ｋｇを投与したサルと比較して、１５０ｍｇ／ｋｇを投与したサルにおいて約３７％高かった。幾何平均Ｖｓｓは、２つの用量群間で類似していた（１２％以内）。
Figure 2017113028
Figure 2017113028
実施例１０．インビトロでＦｃ−γ受容体Ｃ１ｑに結合するＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１の比較評価 抗体エフェクタ機能の媒介物質であることが知られている分子への３つのヒト化抗体、ＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１の結合を調べた。ＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１は各々、固有の機能及び治療プロファイルを有する。しかしながら、３つの全てが終末補体のヒト化抗体拮抗薬であり、ヒト補体成分Ｃ５上で非常に類似したエピトープに結合し、補体活性中のその活性代謝物Ｃ５ａ及びＣ５ｂへの切断を防ぐ。
ＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１は、それらの 軽鎖 配列において同一であり、各々がヒト化可変領域及びヒトＩｇκ定常領域を有する。ＢＮＪ４４１及びエクリズマブはいずれも、ヒトハイブリッドＩｇＧ２‐Ｇ４ Ｆｃを含み、ヒトＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３の残りに融合されたヒトＩｇＧ２からのＣＨ１領域、ヒンジ、及びＣＨ２領域の最初の２９アミノ酸を含む。このキメラＦｃは、ＩｇＧ２の安定したジスルフィド結合対合を、ＩｇＧ４のエフェクタのない特性と組み合わせる。ＢＮＪ４４１及びエクリズマブは、可溶性抗原に対して向けられるため、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を開始するそれらの能力を直接評価することは不可能であった。代わりに、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）及び補体成分Ｃ１ｑへのＢＮＪ４４１またはエクリズマブ結合の直接測定を行い、結合の非存在下で、それらがＡＤＣＣまたはＣＤＣをそれぞれ媒介することができないことが推測された。ｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１（エクリズマブと同じヒト化可変領域を有するＩｇＧ１アイソタイプ抗体）は、対照として含まれた。ＩｇＧ１アイソタイプＦｃ領域は、エフェクタ機能分子を完全に結合することが予期されるが、ｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１自体は、細胞関連抗原の非存在下でＡＤＣＣまたはＣＤＣを引き出さないであろう。
実施例７において上述されるように、ＢＮＪ４４１は、４つのアミノ酸置換を重鎖に導入することによって、そのインビボでの半減期を増加させるようにエクリズマブから操作された。ヒト化重鎖可変領域内の２つのアミノ酸変化、Ｔｙｒ‐２７‐Ｈｉｓ及びＳｅｒ‐５７‐Ｈｉｓをそれぞれ（Ｋａｂａｔらによる重鎖アミノ酸付番）導入して、ｐＨ６．０でのＣ５への結合を脱安定化させたが、ｐＨ７．４でのＣ５への結合への影響は最小であった。第３の重鎖定常領域ドメイン（ＣＨ３）内の突然変異、Ｍｅｔ‐４２８‐Ｌｅｕ及びＡｓｎ‐４３４‐Ｓｅｒを導入して、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を強化した。これらの突然変異は一緒に、飲作用後の早期エンドソームの酸性化環境において、抗体：Ｃ５複合体の遊離抗体への解離を増加させることによって、抗原媒介薬物クリアランスを著しく減衰させるように、及び早期エンドソームからＦｃＲｎによって血管コンパートメントに戻って再利用された抗体の断片を増加させるように設計された。
これらの研究において、ＦｃγＲサブクラス（ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂ）の、３つの抗体全てとの多量体相互作用を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において評価し、ＦｃγＲとの単量体相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して評価した。バイオレイヤー干渉法及びＳＰＲを使用して、３つの抗体へのＣ１ｑの結合を調べた。これらの分析を行うために使用された試薬を表１５に示す。
Figure 2017113028
ＦｃγＲへの多価抗体複合体の結合
ＢＮＪ４４１、エクリズマブ、またはｈ５Ｇ１．１‐ｈＧ１を終夜、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）を用いて、２：１抗体：Ｆ（ａｂ’）２モル比で、１．５ｍＬ微量遠心管内のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートすることによって、抗体複合体を調製した。
Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）で事前にコーティングしたマイクロタイタープレートを、５０μＬ／ウェルの６Ｘヒスチジンタグ付きヒトＦｃγＲ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩｂ）を用いて、ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの受容体濃度で、終夜４℃でインキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ‐２０で３回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ‐２０中の５０μＬの抗体複合体を、プレート内で６０分間、室温（ＲＴ）でインキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ‐２０で洗浄した後、ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ‐２０中５０μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプレートに添加し、６０分間室温でインキュベートした。このインキュベーション及び洗浄に続いて、７５μＬのＴＭＢ‐ＥＬＩＳＡ基質（３，３’，５，５’‐テトラメチルベンジジン、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。反応を７５μＬの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を４５０ｎＭで読み取る。
試料を２回実験し、データを平均値として提示した。結果をスプレッドシートプログラムに入力した。各濃度の抗体免疫複合体の４５０ｎＭでの吸光度、または抗体免疫複合体の非存在下での吸光度を、グラフ表示としてプロットした。主要な解離定数を計算し、表１６に要約して、下で考察する。
ＦｃγＲへの一価抗体の結合
ＦｃγＲへのＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ結合の動態は、直接固定を使用し、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００器具上でＳＰＲを介して決定された。ＢＮＪ４４１、エクリズマブ、及びｈ５Ｇ１．１を、ｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム中に希釈し、アミンカップリングによってＣＭ５チップの１つの流動セル上で固定した。第２のフローセルを、参照表面として使用した。泳動緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４）中に希釈したＦｃγＲの濃縮物を両方のセルに注射した。２０ｍＭ ＨＣｌ、０．０１％ Ｐ２０を用いてサイクル毎に表面を再生した。安定状態親和性モデルを使用し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）において「二重参照」でデータを分析した。
ＦｃγＲＩへのｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１結合の動態は、その強力な親和性に起因して、単一サイクル動態を介して評価した。抗体を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中に希釈し、アミンカップリングによってＣＭ５チップの１つのフローセル上で直接固定した。第２のフローセルを、参照表面として使用した。泳動緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４）中に希釈したＦｃγＲ１の濃縮物を両方のセルに注射した。このアッセイは、再生を必要としなかった。「二重参照」を伴うＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ソフトウェアにおいて、滴定動態１：１モデルを使用してデータを分析した。
Figure 2017113028
抗体免疫複合体及びＦｃγＲの結合活性により駆動される多量体相互作用を検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果を表１６に要約する。ＢＮＪ４４１及びエクリズマブは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｂ／ｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、またはＦｃγＲＩＩＩｂへの検出可能な結合を示さず、それぞれ４倍〜８倍弱いＦｃγＲＩＩａとの会合を示した。 ＳＰＲにより誘導されたＢＮＪ４４１及びエクリズマブへの単量体ＦｃγＲ結合に対する解離定数（ＫＤ）は、ＦｃγＲ相互作用が非常に弱く、２つの抗体間でほぼ区別できないことを確認した。ＦｃγＲＩ（約４μＭ）、ＦｃγＲＩＩａ（約２μＭ）、ＦｃγＲＩＩｂ（約９μＭ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（約７μＭ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ（約３μＭ）。ＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｈ５Ｇ１．１‐ＩｇＧ１）に対する解離定数は、ＦｃγＲ１との高い親和性相互作用（１２３ｐＭ）、及びＩｇＧ２‐Ｇ４アイソタイプ抗体、すなわちＦｃγＲＩＩａ（約１μＭ）、ＦｃγＲＩＩｂ（約３μＭ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（約１μＭ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ（約２μＭ）と比べて、低親和性ＦｃγＲへの結合の中度の増加と一致した。表１６を参照されたい。Ｃ１ｑとＢＮＪ４４１またはエクリズマブとの間の相互作用は、バイオレイヤー干渉法によって検出できなかった。これらの結果は、エクリズマブのキメラヒトＩｇＧ２‐Ｇ４ Ｆｃが、ＦｃγＲまたはＣ１ｑを通じてエフェクタ機能を引き出し、それぞれＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する能力をほとんどまたは全く有しないという考えと一致する。更に、これらの結果は、ＢＮＪ４４１に組み込まれた重鎖アミノ酸置換が、エクリズマブと比べて、これらへの結合を著しく改変しないことを示す。
実施例１１．組織交差反応性研究
１．ＧＬＰヒト交差反応性研究
ヒト組織との潜在的交差反応性は、蛍光化したＢＮＪ４４１（ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣと指定される）及び異なる抗原特異性を有する対照抗体（ＯＸ‐９０Ｇ２Ｇ４‐ＦＩＴＣ）を使用して決定した。
ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣは、陽性対照材料（精製されたヒト補体タンパク質Ｃ５紫外線［ＵＶ］−樹脂スポットスライド、ｈＣ５と指定される）の中度〜強度の染色をもたらしたが、陰性対照材料（悪性ペプチドのヒト高カルシウム血症、アミノ酸残基１〜３４、ＵＶ‐樹脂スポットスライド、ＰＴＨｒＰ １〜３４と指定される）とは特異的に反応しなかった。対照物品、ＯＸ‐９０Ｇ２Ｇ４‐ＦＩＴＣは、陽性または陰性対照材料のいずれかと特異的に反応しなかった。ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣの、陽性対照材料との優れた特異的反応、及び陰性対照材料との特異的反応性の欠失、ならびに対照物品の反応性の欠失は、アッセイが感受性、特異的、及び複製可能であることを示した。
ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣによる染色は、下に要約されるように、ヒト組織パネルにおいて観察された。
・大部分のヒト組織中のタンパク質性材料
・以下の組織要素中の細胞質及び／または細胞質性顆粒
‐ 結腸、食道、リンパ節、副甲状腺、脾臓、及び扁桃腺内の単核細胞
‐血液塗抹及び骨髄中の血小板
‐骨髄中の巨核球
‐卵管、肝臓（肝細胞）、膵管、及び子宮頸部内の上皮
‐肺内の中皮
Ｃ５は、循環血清タンパク質であるため、タンパク質性材料の染色が予期された。単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの単核細胞、ならびに血小板は、Ｃ５を分泌することが報告されているため、ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣによるこれらの細胞型の染色も予期された。追加として、中皮細胞株は、Ｃ５を生成することが示された。しかしながら、本研究におけるＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣ、または巨核球で染色された上皮細胞型によるＣ５の発現について記載する文献は入手できなかったが、Ｃ５を生成することが示された血小板は、メガロサイトから誘導される。したがって、上皮細胞型の染色は、Ｃ５発現の以前に認識されていない部位、または組織区分の、類似しているが未関連のタンパク質もしくは他の構成体（複数可）からのタンパク質配列もしくは構造との組織交差反応性のいずれかを表し得る。しかしながら、タンパク質性材料の染色を除いて、この研究で観察された全ての染色は、性質上細胞質性であり、細胞質及び細胞質構造がインビボで試験物品にアクセス可能である可能性は低い。まとめると、治療関連毒性の予想につながるであろうＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣ染色の特異的交差反応性は観察されなかった。
２．ＧＬＰカニクイザル組織の交差反応性研究
標準ＧＬＰ組織の交差反応性研究もまた、カニクイザル組織の集団を使用して行い、ヒト組織結合研究において使用したものと同じ試薬を用いて、オフターゲット及びオンターゲット結合の両方を調べた。
下に要約されるように、カニクイザル組織集団において、ＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣによるいくらかの染色が観察された。
・大部分のカニクイザル組織中のタンパク質性材料
・以下の組織要素中の細胞質及び／または細胞質性顆粒
‐リンパ節、脾臓、及び扁桃腺内の単核細胞
‐卵管内の上皮
カニクイザル組織集団内で観察されたＢＮＪ４４１‐ＦＩＴＣ染色は、コンパニオンヒト組織交差反応性研究においてヒト組織集団内で観察されたものよりも全体的に低い強度及び少ない頻度であった。更に、ヒト組織集合において、血小板、巨核球、膵臓管上皮、子宮頸部上皮、肝細胞、及び中皮の染色が観察されたが、これらの組織要素は、カニクイザル組織集合内で染色されなかった。更に、タンパク質性材料の染色を除いて、この研究で観察された染色は、性質上細胞質性であり、細胞質及び細胞質構造がインビボで試験物品にアクセス可能である可能性は低い。ＢＮＪ４４１は、ヒトＣ５に対して非常に特異的である（かつ非ヒト霊長類からのＣ５とは交差反応性でない）ことが示されたため、この研究で観察された限定結合は、未特定の交差反応性材料との非特異的結合に起因していた可能性が高い。
実施例１２：終末補体活性アッセイにおけるエクリズマブと比較したＢＮＪ４４１の能力
Ｃ５へのｐＨ依存性結合をもたらすようにＢＮＪ４４１内で操作された突然変異は、ｐＨ７．４でのその親和性（約４９１ｐＭ）を、エクリズマブと比べて（約２９．３ｐＭ）約１７倍弱め、エクリズマブと比較してＣ５媒介終末補体活性のＢＮＪ４４１阻害能力を低減することが予期され得る。生理学的に関連した条件下でのＢＮＪ４４１及びエクリズマブの能力を推定するために、３種の一般的に使用される動物モデル（ニワトリ、ヒツジ、及びウサギ）からの赤血球細胞（ＲＢＣ）の補体媒介溶血の拮抗作用を、９０％正常ヒト血清中で評価した。
ＲＢＣ及びヒツジ赤血球細胞（ｓＲＢＣ）を抗体で事前に感作し、補体古典経路（ＣＣＰ）の活性化を開始した。ウサギ赤血球細胞（ｒＲＢＣ）を事前に感作せず、補体代替経路（ＣＡＰ）活性化のモデルとして使用する。１００、２００、及び４００ｎＭの血清中で抗体を事前にインキュベートし、それぞれ約０．５：１、１：１、及び２：１の抗原結合部位対Ｃ５のモル比をもたらした。抗体ＢＮＪ４３０は、ＢＮＪ４４１と同じＦｃ領域を含むが、ヒトＣ５に結合せず、陰性対照として含まれた。０、１、２、３、４、５、６、及び８分での溶血パーセントを測定し、反応が初期速度条件下で観察されたことを保証した。
図２９に示されるように、ＢＮＪ４４１もエクリズマブも、ｃＲＢＣ溶血において、１００ｎＭで拮抗作用を示さなかった。両方の抗体は、エクリズマブと比べて低減した能力を有するＢＮＪ４４１により、２００ｎＭで部分的拮抗作用を呈した（約１：１モル比の抗原結合部位対Ｃ５）。溶血の阻害は、２：１モル比の抗原結合部位対Ｃ５（４００ｎＭ）でインキュベートしたとき、いずれかの抗体に対してほぼ完全であった。ｓＲＢＣ溶血アッセイの結果は類似しており、ＢＮＪ４４１の存在下、２００ｎＭで２０％未満の溶血、及び４００ｎＭで各抗体によりほぼ完全な阻害を示した（データ図示せず）。ＣＡＰ媒介ｒＲＢＣ溶血アッセイは、抗Ｃ５抗体の存在下でより高レベルの溶血を呈し、２００ｎＭで検出可能な阻害はなく、４００ｎＭでは部分的阻害のみであった（データ図示せず）。
結論として、これらのインビトロ補体活性アッセイにおいて、エクリズマブと比べたＢＮＪ４４１の能力の中度喪失は、Ｃ５に対するその弱い親和性と一致する。Ｃ５についてのＢＮＪ４４１の親和性は、インビボでＣ５の濃度及びＢＮＪ４４１の標的治療レベルより更に約１０００倍低く、したがって、その治療効果を損なう可能性は低い。
実施例１３：終末補体活性アッセイにおけるエクリズマブと比較したＢＮＪ４４１の選択性
非ヒト動物モデルにおけるＢＮＪ４４１の薬理活性を評価するために、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、ビーグル、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスからの血清中の抗体感作されたｃＲＢＣの補体媒介溶血を拮抗するＢＮＪ４４１の能力を測定した。ヒトＩｇＧ２／Ｇ４ Ｆｃ（ＢＮＪ４３０）を有するエクリズマブ及び抗マウス−Ｃ５抗体を、アイソタイプ対照として使用した。
各アッセイに対して、Ａｌｓｅｖｅｒ（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）中４００μＬのニワトリ全血から感作ｃＲＢＣを調製し、１ｍＬのＧＶＢＳを用いて４℃で４回洗浄し、ＧＶＢＳ中に５×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。ニワトリ赤血球を感作するために、ポリクローナル抗ニワトリＲＢＣ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１５０μｇ／ｍＬで細胞に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。ＧＶＢＳで１回洗浄した後、細胞を３．６ｍＬの最終容量までＧＶＢＳ中に再懸濁した。
以下の哺乳類、すなわち、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル、カニクイザル、ビーグル、ウサギ、モルモット、及びラットからの血清を含むＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから補体保存血清を得た。抗体ＢＮＪ４４１（１０ｍｇ／ｍＬ）、エクリズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＢＮＪ４３０（０．８７３ｍｇ／ｍＬ）を、ＧＶＢＳ中の３０％血清中で最終濃度０、６０、３００、及び６００ｎＭに希釈し、室温で３０分間インキュベートした。感作されたｃＲＢＣを、３０μＬ／ウェル（２．５×１０６細胞）で抗体／血清混合物に添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、３０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを各ウェルに添加することによって反応を停止させた。プレートを１８００Ｘｇで３分間遠心分離し、８０μＬの上清を新たな平底９６ウェルプレートに移した。吸光度を４１５ｎＭで測定した。
マウス血清は古典経路補体活性の不良な供給源であるため、マウス血清を１：１でＣ５欠乏ヒト血清と混合し、マウスにおける潜在的ＢＮＪ４４１薬理活性を評価した。抗体を、ＧＶＢＳ中の５０％総血清（２５％マウス血清、２５％ Ｃ５欠乏ヒト血清）中で最終濃度０、６０、３００、及び６００ｎＭに希釈し、室温で３０分間インキュベートした。感作されたｃＲＢＣを抗体／血清混合物に３０μＬ／ウェル（２．５×１０６細胞）で添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、３０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを各ウェルに添加することによって反応を停止させた。プレートを１８００Ｘｇで３分間遠心分離し、８０μＬの上清を新たな平底９６ウェルプレートに移した。吸光度を４１５ｎＭで測定した。
抗Ｃ５抗体を有しない血清を含む試料を、１０ｍＭ ＥＤＴＡとともに、またはなしに、それぞれ溶解なし、または完全溶解として使用した。試料条件は、３回または２回実験した。
結果をスプレッドシートに入力し、溶解なし対照のバックグラウンド除去、及び完全な溶血対照と比べた溶血率の正規化、平均値の計算（±ｓ．ｄ．）、及びデータのグラフィック表示を可能にする。溶解なし対照からの平均バックグラウンドの吸光値を、各複製から控除し、試料の吸光度を以下の等式に従い、完全溶解対照における溶解のパーセントとして表した。ｃＲＢＣ溶血の％＝（各試料複製試料におけるＡ４１５値−溶解なし対照における平均Ａ４１５値）／（完全溶解対照における平均Ａ４１５値−溶解なし対照における平均Ａ４１５値）×１００。
試料複製のｃＲＢＣ溶血％の平均及び標準偏差を、グラフィック表示としてプロットした（データ図示せず）。
ＢＮＪ４４１は、Ｃ５に対する８倍モル過剰の抗原結合部位において試験したいかなる非ヒト血清においても、カニクイザルからの天然Ｃ５への検出可能な結合、及びインビトロでの薬理活性を有しないことが示された。まとめると、これらのデータは、ヒトにおける薬物動態または薬力学をモデル化するために適した任意の容易にアクセス可能な非ヒト種において、ＢＮＪ４４１がいかなる関連薬理活性も有しないという結論と一致する。
実施例１４：ＢＮＪ４４１の物理化学的特徴付け
ＢＮＪ４４１抗体は、組換え、ヒト化抗体であり、２つの同一の４４８アミノ酸重鎖及び２つの同一の２１４アミノ酸軽鎖で構成される。図３０を参照されたい。ＢＮＪ４４１の定常領域は、ヒトκ軽鎖定常領域及びハイブリッドヒトＩｇＧ２‐ＩｇＧ４重鎖定常領域（「Ｇ２／Ｇ４」とも称される）を含む。ＩｇＧ２／Ｇ４定常領域は、抗体のエフェクタ機能活性、補体活性、及び免疫原性を低減するように適切に設計された。重鎖ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、及びＣＨ２ドメインの最初の５アミノ酸は、ヒトＩｇＧ２アミノ酸配列、ＣＨ２領域内の残基６〜３６に一致し、ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４アミノ酸配列の両方に共通であるが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの残りは、ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列に一致する。ヒトフレームワーク領域からなるヒトＣ５結合部位を形成する重鎖及び軽鎖可変領域を、マウス相補性決定領域に移植した。ＢＮＪ４４１抗体内の鎖間ジスルフィド結合を図３１に示す。ジスルフィド結合対合及びＮ結合グリカン部位の全てに対しる残基番号を図３１に示す。
表１７は、ＢＮＪ４４１抗体の一般特性を列挙する。下に提示される主成分の理論的化学式及び理論的平均分子量は、抗体が１８ジスルフィド結合、２つの重鎖Ｎ−末端ピログルタミン酸化、２つの重鎖Ｃ末端リジンのクリッピング、及び２つのＧ０Ｆグリカン残基の付加を含むことを想定する。ＢＮＪ４４１中のアミノ酸残基の数は、アミノ酸分析によって予測された。
Figure 2017113028
ＢＮＪ４４１を発現する安定したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、ＢＮＪ４４１の作製のために発達させた。この細胞株を生成するために使用されたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞源は、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＣＨＯＫ１ＳＶマスター細胞バンク２６９‐Ｍから得られた。この細胞源は、細菌及び真菌汚染物質、ならびに感染性でない細胞内因性レトロウイルス粒子以外の全ての検出可能なウイルスを含まないことが検証された。宿主ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞を、プラスミドｐＢＮＪ４４１．１で形質導入し、安定したクローンは、ＭＳＸにより選択した。一次クローン３Ａ５は、ＢＮＪ４４１の作製のための生成細胞株として選択された。
ＢＮＪ４４１バルク薬物バッチの操作及びＧＭＰバッチを調製し、表１８に列挙される試験によって物理化学的に特徴付けた。操作バッチは、２００Ｌバイオリアクター内で成長させたＣＨＯ細胞を使用するパイロットプラント内で生成し、精製された材料をＰＫ研究において使用した。ＧＭＰバッチは、２００Ｌバイオリアクターを使用して、パイロットプラント内で成長させたＣＨＯ細胞を使用して生成した。ＢＮＪ４４１操作及びＧＭＰバルク薬物バッチを配合し、約１０ｍｇ／ｍＬで試験した。これらのバッチの物理化学的特性を表１９に要約する。
Figure 2017113028
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Figure 2017113028
Figure 2017113028
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表１９は、操作バッチに対して決定された無傷分子量が１４７８３０．８０Ｄａであり、ＧＭＰバッチが１４７８３０．７２Ｄａであったことを示す。これらの値は、表１７のＢＮＪ４４１について計算された主成分分子量値の１４７，８２７．６２Ｄａと一致し、外部的に較正されたＥＳＩ−ＴｏＦ−ＭＳの１００ｐｐｍ質量精度内であった。１４７，０００〜１４９，５００Ｄａ範囲を超えて、主要ピークは観察されなかった。この方法は、無傷分子量に基づいて分子を特定した。試験試料をＣ４ ＲＰ‐ＨＰＬＣカラム上に注射し、水性：有機溶媒勾配で溶出した。次に、溶出液をＴｏＦ質量分光計にエレクトロスプレーし、クロマトグラフィーピークの上半分からのスペクトルを逆重畳して、無傷分子量を提供した。
表１９は、ＢＮＪ４４１バッチに対して決定されたＮ末端配列を示す。重鎖及び軽鎖の決定されたＮ末端配列は、ＢＮＪ４４１バッチに対するアミノ酸配列と一致した。重鎖は、予期されたとおり、ＰｙｒｏＱで遮断されることが見出され、ピログラルタミン酸アミノペプチダーゼ（ＰＧＡＰ）で非遮断された。ポリペプチド鎖のＮ末端におけるタンパク質の一次配列は、連続エドマン分解及びＨＰＬＣ分析によって決定した。
表１９は、ＢＮＪ４４１バッチに対して決定された１分子当たりのアミノ酸分析残基を示す。これらの値は、表１９の第１カラムに示される一次配列に基づいて、ＢＮＪ４４１バッチに対して計算された１モル当たりの残基数と全て一致した。アミノ酸分析データを３回取得した。この方法は、タンパク質の、その個々のアミノ酸構成体への酸性加水分解によって分子の一次構造を評価する。この方法は、システインまたはトリプトファンを検出しない。アスパラギン及びアスパラギン酸塩は、単一ピーク内で検出され、Ａｓｘと標識された。グルタミン及びグルタミン酸塩も単一ピーク内で検出され、Ｇｌｘと標識された。２０標準アミノ酸のうち、１４はこの方法によって固有に検出され、Ａｓｘ基及びＧｌｘ基を加えて合計１６アミノ酸となる。表示されるもののうち、ＢＮＪ４４１は、これらの方法によって検出され得る合計１２６２の残基を有する。
表１９は、ＢＮＪ４４１バッチに対する円形二色性（ＣＤ）近ＵＶ局所特徴、遠ＵＶ局所特徴、及び逆重畳結果を示す。逆重畳は、所与の参照の組に対してＣＤＰｒｏソフトウェアによって決定されたα‐らせん、３／１０らせん、β‐シート、回転、ポリ（Ｐｒｏ）ＩＩの量、及び無秩序構造を説明する。各バッチに対する近ＵＶ（三次構造）及び遠ＵＶ（二次構造）のＣＤスペクトルを決定した。この方法は、タンパク質などの光学活性（キラル）分子の吸収帯域内に呈された左及び右円偏波光の差分吸収によって、分子内のより高次の分子構造（２ｏ及び３ｏ）を評価した。ＣＤスペクトルの逆重畳を行い、結果を表１９に示す。
表１９は、決定された各グリカンの平均分子量を示す。ＢＮＪ４４１バッチについて観察されたＮ結合オリゴ糖またはグリカン分子量は、表２０に示される理論的グリカン分子量と一致した。遊離グリカン分子量スペクトルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によって決定された。この方法は、分子量により薬物分子と関連付けられたグリカンを特定した。グリカンは以前に、ＰＮＧａｓｅ Ｆによって抗体から酵素的に切断された。次に、グリカンを固相抽出し、３，４‐ジヒドロキシ安息香酸マトリックス溶液と混合して、ＭＡＬＤＩ標的上で同時沈降させた。この乾燥試料を、窒素レーザーを用いてＴＯＦ質量分光計中にイオン化した。ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋スペクトルを収集した。
Figure 2017113028
ＢＮＪ４４１バッチについて決定されたオリゴ糖パーセンテージを表１９に示す。様々な型のＮ結合オリゴ糖についての合計、すなわち（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆの合計）、酸性、高マンノース、中性、モノシアリル化、及びジシアリル化を計算した。Ｎ結合オリゴ糖のみが中性オリゴ糖を含有していた。中性オリゴ糖のレベルは、操作及びＧＭＰバッチそれぞれについて、９９．９９及び１００．０％であった。オリゴ糖を、ＨＰＬＣを使用して検出し、クロマトグラムを定量的に評価した。この方法は、酵素的に放出され、蛍光的にタグ付けされたオリゴ糖の保持時間に基づいて、薬物分子と関連したＮ結合オリゴ糖を特定することによって、グリコシル化パターンを評価する。この方法は、各オリゴ糖種を相対的に豊富に提供した。簡単に言えば、オリゴ糖をＰＮＧａｓｅ Ｆにより抗体から酵素的に切断し、アントラニル酸でタグ付けした。ＨＩＬＩＣろ過工程を使用して、過剰なアントラニル酸を除去した。Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ａｓａｈｉｐａｋアミノカラムを有するＷＡＸ−ＨＰＬＣシステム上に試料を注射し、蛍光検出器を用いてタグ付けされたオリゴ糖を検出した（３６０ｎＭ励起及び４２０ｎＭ放出）。
ＢＮＪ４４１について単糖パーセンテージを決定し、表１９に示す。単糖パーセンテージを、蛍光標識に続いて、逆相高圧クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して、５つの単糖（ＧｌｃＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、フコース）について決定した。このアッセイは、蛍光的に標識された単糖の保持時間に基づいて、薬物分子に関連した単糖を決定することによって、グリコシル化パターンを特徴付ける。簡単に言うと、酸加水分解は、オリゴ糖をタンパク質から除去し、その構成単糖にする。次に、遊離単糖を還元アミン化によってアントラニル酸（ＡＡ）で標識した。次に試料を、Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ‐１８カラムを有するＲＰ−ＨＰＬＣシステム上に注射し、ＡＡタグ付けされた単糖を蛍光検出器により検出した（３６０ｎＭ励起、４２０ｎＭ放出）。試料を２回試験し、報告される値は、２つの結果の平均であった。
次に、シアル酸Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）、及びＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を決定した。各例において、ＢＮＪ４４１バッチの決定したＮＡＮＡ及びＮＧＮＡシアル酸含有量は、表１９に示される定量の限界を下回っていた（６ｍＭｏｌ／ｍｏｌ未満）。ＮＧＮＡは、いずれのバッチについても観察されなかった。シアル酸を測定し、蛍光標識に従い、多点較正を使用してＲＰ−ＨＰＬＣ上で分離した。この方法は、薬物分子に関連したシアル酸の型及び相対量を決定することによって、グリコシル化パターンを評価する。シアル酸は、重硫酸ナトリウムでのインキュベーションによって抗体から化学的に切断し、次にＯ−フェニレンジアミンでタグ付けした。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ１８ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅカラムを有するＲＰ‐ＨＰＬＣシステム上に試料を注射し、タグ付けしたシアル酸を、蛍光検出器により検出した（２３０ｎＭ励起、４２５ｎＭ放出）。試料を２回試験し、２つの結果の平均を報告した。
表１９に示されるように、各ＢＮＪ４４１バッチの決定されたＴｍ値は、６７．０℃であった。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）走査を行い、熱量測定データを、Ｍｉｃｒｏ‐Ｃａｌ ＶＰ‐ＤＳＣを使用し、７５℃／時の速度、２０℃〜９５℃で上方走査することによって取得した。試料を試験する前に、Ｙ軸及び温度較正を行った。Ｙ軸偏向％誤差は、１％未満であり、移行中点は、２８．２℃及び７５．９℃の両方で±０．２℃の許容範囲内であった。同じ緩衝液組成物及び容積のブランクに対して、試料を走査した。ＤＳＣは、熱変性に起因する展開のエンタルピー（ΔＨ）を測定する。溶液中の生体分子は、天然（折り畳み）構造とその変性（展開）状態との間で平衡している。移行中点（Ｔｍ）は、タンパク質の５０％がその天然構造であり、５０％が変性される温度である。各試料のＴｍは、部落細胞のそれと比較して、試料細胞中の温度勾配にわたってΔＨを測定することによって決定される。
ＢＮＪ４４１操作及びＧＭＰバッチ材料についての親和性（ＫＤ）は、それぞれ４６１ｐＭ及び４２１ｐＭであり、良好に適合する。各ＢＮＪ４４１バッチの結合動態を表１９に示す。表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００）を使用して、ヒトＣ５への抗Ｃ５抗体（ＢＮＪ４４１）の結合動態を評価した。センサーグラムは示さない。Ｃ５に対するＢＮＪ４４１の動態は、抗Ｆｃヒト捕捉方法を使用して決定した。ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中０．１ｍｇ／ｍＬに希釈された抗Ｆｃヒト（ＫＰＬ＃０１‐１０‐２０）を、アミンカップリングによって、ＣＭ５チップの２つのフローセル上で８分間固定した。抗Ｃ５抗体（ＢＮＪ４４１）を、泳動緩衝液（ＨＢＳ‐ＥＰ、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で０．３５μｇ／ｍＬに希釈した。次に、希釈した抗体を他のフローセル上に注射し、続いてＣ５（０．１９〜６ｎＭ）を両方のフローセル上に注射した。二次フローセルを参照として使用した。表面を毎回２０ｍＭのＨＣｌ、０．０１％のＰ２０で再生した（１００μＬ／分、２００μＬ注射）。１：１ラングミュアモデルを用い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを「二重参照」で使用してデータを処理した。
ＢＮＪ４４１操作及びＧＭＰバッチ材料の自己会合に対する親和性（ＫＤ）は、それぞれ７．１ｍＭ及び０．２７ｍＭであった。表１９を参照されたい。不良な適合は、ＢＮＪ４４１操作及びＧＭＰバッチ材料の両方について観察された低レベルの結合に起因し、自己会合及び測定された親和性は、器具の検出の限界レベルを下回った。低レベルの自己会合は、製造性に対して、及び最終的に患者への投与に有益である。センサーグラムは示さない。表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００）を使用して、抗Ｃ５抗体（ＢＮＪ４４１）の自己会合動態を評価した。ＢＮＪ４４１の自己会合動態は、抗体（ＢＮＪ４４１）の直接固定によって決定した。ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中約３１μｇ／ｍＬに希釈したＢＮＪ４４１を、ＣＭ５チップの１つのフローセル上で固定し、アミンカップリングによって２０００ＲＵを得た。二次フローセルを参照として使用した。次に、抗Ｃ５抗体、ＢＮＪ４４１（泳動緩衝液中１．６〜５０μＭ、ＨＢＳ‐ＥＰ、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ Ｐ２０、ｐＨ７．４）の希釈液を、両方のフローセル上に注射した。不良な結合に起因して、再生は不要であった。安定状態親和性モデルを用い、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを「二重参照」で使用してデータを処理した。
ＢＮＪ４４１の物理化学的特徴付けを、操作及びＧＭＰバッチを使用して行ったところ、抗体のアミノ酸配列と一致することが示された。この例において要約される物理化学的データは、純度、分子サイズ、同一性、構造、グリコシル化、熱安定性、動態、及び自己会合を含む特性の範囲を包含し、ＢＮＪ４４１バルク薬物の特徴付けの基礎として役立つことが予期される。
本開示は、その特定の実施形態を参照して説明されたが、本開示の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、様々な変化を行うことができ、均等物が代用され得ることは、当業者によって理解されるべきである。加えて、多くの修正を行い、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセス工程を、本開示の目的、趣旨、及び範囲に適合させることができる。全てのかかる修正は、本開示の範囲内であることが意図される。

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  1. 本願明細書に記載の発明。
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