JP2017505128A - キメラアルカリホスファターゼ様タンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、改良アルカリホスファターゼ、改良アルカリホスファターゼを含む医薬組成物、および疾患を予防、処置、または治療するための改良アルカリホスファターゼの使用に関する。

Description

本発明は、改良された特性を有するアルカリホスファターゼ、改良された特性を有するアルカリホスファターゼを含む医薬組成物、および、疾患予防、処置、または治療のための改良された特性を有するアルカリホスファターゼの使用に関する。
ホスファターゼは、基質を脱リン酸化する酵素である。すなわち、それは、リン酸モノエステルをリン酸イオンと遊離のヒドロキシル基を有する分子とに加水分解する。この働きは、ホスホリラーゼおよびキナーゼの正反対であり、ホスホリラーゼおよびキナーゼは、ＡＴＰなどのエネルギー性分子を用いることによってリン酸基をそれらの基質に付加する。ホスファターゼは、システイン依存性ホスファターゼ（ＣＤＰｓ）、およびメタロホスファターゼの２つの主なカテゴリーに分類することができる。
メタロホスファターゼは典型的には、それらの活性部位内に触媒的に必要な２つの金属イオンを協調して働かせている。現在、これらの金属イオンの同定に関していくらか混乱があるが、その理由は、それらを同定ための試みが継続して行われており、それらが異なる回答をもたらすからである。現在のところ、これらの金属は、マグネシウム、マンガン、鉄、亜鉛、またはそれらの任意の組み合わせであればよいとの証拠が存在する。２つの金属イオンを結ぶヒドロキシルイオンは、リン酸基上における求核攻撃に参加すると考えられる。
ホスファターゼは、リン酸基をタンパク質に付加するキナーゼ／ホスホリラーゼに対抗して働く。リン酸基の付加または除去は、酵素を活性化、もしくは不活性化（たとえば、キナーゼシグナル経路）するか、またはタンパク質−タンパク質相互作用の発生を可能にすることが可能である（たとえば、ＳＨ３ドメイン）。したがって、ホスファターゼは、多くのシグナル伝達経路に不可欠である。リン酸の付加および除去は、酵素の活性化、または抑制に必ず対応しないことと、数種の酵素は、機能制御を活性化、または抑制するための別個のリン酸化部位を有することとに留意すべきである。ＣＤＫは、たとえば、リン酸化される特定のアミノ酸残基に依存して活性化または不活性化され得る。リン酸は、シグナル伝達において重要である。なぜなら、それらは、それらが付加するタンパク質を制御するからである。調節効果を反転するために、リン酸は、除去される。このことは、加水分解によってそれら自身に起こるか、またはタンパク質ホスファターゼによって媒介される。
ホスファターゼの１種である、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）（ＥＣ３．１．３．１）は、ヌクレオチド、タンパク質、およびアルカロイドなどの多数の分子からリン酸基を除去する原因となる加水分解酵素である。最近まで、アルカリホスファターゼは、その名称が示唆するように、アルカリ性環境において最も効果的であると考えられていた。
ＡＰの１つの可能な生理的役割は、炎症性分子と相互に作用するということであると考えられている。第１に、ＡＰはエンドトキシンを脱リン酸化し、そしてそのようなものとして、これらの高度炎症性分子に対する炎症反応を減少させると仮定されてきた。それ以後、他の作用機序が仮定され、研究されてきている。しかし、現在まで、多数の炎症性および他の疾患におけるその有益な役割にもかかわらず、作用機序は、未だ十分に解明されていない。これまでに、ウシ由来のアルカリホスファターゼは、動物モデルにおいて使用され、敗血症、急性腎障害、炎症性腸疾患、腸炎、虚血再灌流障害、または他の炎症性疾患の処置のための臨床試験において使用された（Riggle et al, J Surg Res. 2013 Mar;180(1):21-6; Peters et al, J Pharmacol Exp Ther. 2013 Jan;344(1):2-7; Martinez-Moya et al, Pharmacol Res. 2012 Aug;66(2):144-53; Pickkers et al, Crit Care. 2012 Jan 23;16(1); Ramasamy et al, Inflamm Bowel Dis. 2011 Feb;17(2):532-42; Lukas et al, Inflamm Bowel Dis. 2010 Jul;16(7):1180-6; Bol-Schoenmakers et al, Eur J Pharmacol. 2010 May 10;633(1-3):71-7; Heemskerk et al, Crit Care Med. 2009 Feb;37(2):417-23; Tuin et al, Gut. 2009 Mar;58(3):379-87; Su et al, Crit Care Med. 2006 Aug;34(8):2182-7; van Veen et al, Br J Surg. 2006 Apr;93(4):448-56; van Veen, Infect Immun. 2005 Jul;73(7):4309-14; Verweij et al, Shock. 2004 Aug;22(2):174-9）。
現在、天然起源から単離された、および組換えて設計されたアルカリホスファターゼは、診断および疾患の処置の両方において有用であるが、たとえば、改変（たとえば、改良）された比活性、安定性（たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏＴ１／２、もしくは貯蔵安定性（有効期間））、または基質特異性を有する新規アルカリホスファターゼが求められている。
本発明は、そのような修飾ホスファターゼであって、ＷＯ２００８／１３３５１１に広く記載されているキメラ組換えアルカリホスファターゼに比べて改良された特性を有する修飾ホスファターゼを提供する。
第１実施形態において、本発明は、ホスファターゼ活性を有する単離タンパク質であって、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２００個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列、配列番号６に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも５０個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列、配列番号７に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも４０個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含み、
全長タンパク質が、配列番号１の全長アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ただし、位置２７９のアミノ酸がロイシン（Ｌ）であり、位置３２８のアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、位置４７８のアミノ酸がロイシン（Ｌ）である単離タンパク質を提供する。
好ましい実施形態において、全長タンパク質は、配列番号１の全長アミノ酸配列に、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ただし、位置２７９に対応するアミノ酸がロイシン（Ｌ）であり、位置３２８に対応するアミノ酸がバリン（Ｖ）であり、位置４７８に対応するアミノ酸がロイシン（Ｌ）である。
本明細書において「対応する」との用語は、「位置１」を示す成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に関連した特定の位置を意味している。用語「対応する」は、特定位置の特定のアミノ酸残基を明示的に表すものではない。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合したアミノ酸を含む化合物を意味しており、これらは同じ意味で用いられる。
本明細書において、「アミノ酸配列」と言及される場合は、タンパク質、またはペプチド分子のアミノ酸配列を表している。「アミノ酸配列」は、タンパク質をコードする核酸配列から推定することができる。しかし、「ポリペプチド」または「タンパク質」などの用語は、アミノ酸配列を、推定されるアミノ酸配列に限定することを意味するのではないが、アミノ酸欠失、付加、ならびに糖鎖形成および脂質部分の付加などの修飾のような、推定アミノ酸配列の翻訳後修飾を含んでもよい。安定性、または薬物動態挙動を向上するためのＤ−アミノ酸などの非天然アミノ酸の使用は、特に示されない限り、用語「アミノ酸配列」の範囲内である。
好ましくは、前記タンパク質の一部は、５０〜６５、好ましくは６０〜６５、より好ましくは６２〜６５、より好ましくは６４〜６５、最も好ましくは６５の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＰＬＡＰの全長クラウンドメインと、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の目的のために、ヒトＰＬＡＰ参照配列の全長クラウンドメインに対応するアミノ酸配列は、図１に示される配列番号３において下線を付されており、その位置３６６〜４３０に対応する。
好ましくは、前記タンパク質の一部は、２００〜３６５、より好ましくは２５０〜３６５、より好ましくは３００〜３６５、より好ましくは３５０〜３６５、より好ましくは少なくとも３６０〜３６５、最も好ましくは３６５の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＮ末端領域に、９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。クラウンドメインに隣接するこのＮ末端領域は、触媒ドメインの２つの部分のうちの１つであると考えられる。
好ましくは、前記タンパク質の一部は、４０〜５４、好ましくは４５〜５４、より好ましくは５０〜５４、より好ましくは５２〜５４、最も好ましくは５４の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端領域に、９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。クラウンドメインに隣接するこのＣ末端領域は、触媒ドメインの２つの部分のうちの２つ目であると考えられる。
本発明の目的のために、ヒトＡＬＰＩ成熟タンパク質参照配列のアミノ酸配列は、図１に記載されている（配列番号２）。触媒ドメインとして共に表わされるＮ末端およびＣ末端隣接領域を決定する目的のために、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインは、図１において下線を付されている。
特に好ましい実施形態において、本発明は、本発明に従ったタンパク質を提供し、前記タンパク質は、５０〜６５、好ましくは６０〜６５、より好ましくは６２〜６５、より好ましくは６４〜６５、最も好ましくは６５の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＰＬＡＰの全長クラウンドメインに、少なくとも９０％の、好ましくは少なくとも９５％の、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記タンパク質の一部は、２００〜３６５、より好ましくは２５０〜３６５、より好ましくは３００〜３６５、より好ましくは３５０〜３６５、より好ましくは３６０〜３６５、最も好ましくは３６５の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＮ末端領域に、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記タンパク質の一部は、４０〜５４、好ましくは４５〜５４、より好ましくは５０〜５４、より好ましくは５２〜５４、最も好ましくは５４の連続するアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端領域に、少なくとも９０％の、好ましくは少なくとも９５％の、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
クラウンドメインのＮ末端隣接領域とは、（図１において下線を付されたアミノ酸に対応する）クラウンドメインの配列に隣接するアミノ酸の区間（すなわち、好ましくは２０アミノ酸未満、より好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは２未満、最も好ましくは離されたアミノ酸はなし）を意味し、クラウンドメインの右手側において、前記右手側は、第１アミノ酸のアミノ（ＮＨ２）基を保持するペプチド鎖の一部として定義される。クラウンドメインのＣ末端隣接領域は、クラウンドメインの配列（図１において下線を付されたもののアミノ酸に対応する）に隣接する位置に対応するアミノ酸の区間（すなわち、２０アミノ酸未満、好ましくは１５未満、より好ましくは１０未満、より好ましくは５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは２未満、最も好ましくは離されたアミノ酸はなし）を意味し、クラウンドメインの右手側において、前記右手側は、最後のアミノ酸の遊離アルファカルボキシル基を保持するペプチド鎖の一部として定義される。
ヒトにおいて、これまでに４種類のアルカリホスファターゼのアイソフォームが同定された。これらは、腸型（ＡＬＰＩ）、胎盤型（ＡＬＰＰ）、胎盤様型（ＧＣＡＰ）、および肝臓／骨／腎臓（または組織非特異型）アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）である。最初の３種類は、２番染色体上に共に位置するが、組織非特異型は、１番染色体に上に位置する。ＡＰの正確な生理的機能は知られていないが、ＡＰは、非常に多くの生理的過程に関与していると思われる。
ヒトアルカリホスファターゼの配列は、当該分野において公知であり、関連するデータベースにおいて容易に見つけることができる。ＰＬＡＰのクラウンドメインとＡＬＰＩの触媒ドメインとに対する配列同一性（％）を測定するために、好ましくは各参照配列が使用される。ヒトＡＬＰＩの参照配列は、配列番号２として記載される。ヒトＡＬＰＰの参照配列は、配列番号３として記載される。図１におけるこれらの参照配列のうち、クラウンドメインとして一般的に知られる配列は、下線を付されている。
胎盤型アルカリホスファターゼは、本明細書において、ＡＬＰＰまたはＰＬＡＰと省略して記載される。略語ＡＬＰＩまたはＩＡＰは、腸型アルカリホスファターゼを表す。胎盤様型２アルカリホスファターゼは、本明細書において、ＡＬＰＰ２、ＡＬＰＧ、またはＧＣＡＰと省略して記載され、略語ＡＬＰＬ、ＴＮＳＡＬＰ、ＴＮＡＰ、またはＢＬＫは、本明細書において、肝臓／組織非特異型アルカリホスファターゼを表すために使用される。全く同一のアルカリホスファターゼについての異なる略語は、本明細書において同じ意味で用いられてもよい。
立体配座の観点から、アルカリホスファターゼは、概ね、クラウンドメインと活性部位ドメインとの２つのドメインからなる（Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications in Medicine and Biotechnology. JosLuis Millan; Wiley, 2006）。活性部位ドメインは、触媒残基と、３つの金属イオン部位（Ｚｎ１、Ｚｎ２、およびＭｇ３）となどの別個の部分に分けることができる。一次構造の観点から、クラウンドメインは、活性部位ドメインを形成するアミノ酸に隣接していることが明らかである。したがって、好ましい実施形態において、触媒ドメインは、アミノ酸の連続配列からなっていないが、クラウンドメインに隣接している。本発明に従った１つのアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す配列番号１について、本発明を限定するものではないが、クラウンドメインは、好ましくは、位置３６６〜４３０におけるアミノ酸を含み、一方、触媒ドメインは、好ましくは、図１に記載されているような成熟タンパク質配列における、位置３６６の前、および位置４３０の後の残りの配列を表す。アルカリホスファターゼのアミノ酸配列、ならびに触媒およびクラウンドメインの相対位置は、当業者に公知である（Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications in Medicine and Biotechnology. JosLuis Millan; Wiley, 2006）。
いくつかの実施形態において、本発明に従ったタンパク質は、したがって、ヒトＡＬＰＰのクラウンドメインに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列と、ヒト腸アルカリホスファターゼの触媒ドメインに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列とを含む。好ましくは、ＡＬＰＰのクラウンドメインに対して前記配列同一性を有する前記配列は、天然ＡＬＰＰタンパク質におけるＡＬＰＰのクラウンドメインとほぼ同じ位置、つまり図１に示される位置１に関しておおよそ３６６〜４３０位置において、本発明に従ったタンパク質内に位置する（クラウンドメインを表す配列は下線を付されている）。
ＡＬＰＰのクラウンドメインに配列同一性を有する配列は、配列番号３における位置３６６〜４３０の下線を付されたアミノ酸によって表わされる、ＡＬＰＰのクラウンドメインの天然配列に、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
アミノ酸もしくは核酸配列の同一性百分率、または用語「配列同一性（％）」とは、本明細書においては、最大パーセントの同一性を達成するために、２つの配列を整列させ、必要なら空隙を導入した後の参照配列における残基と同一である、候補アミノ酸または核酸配列における残基のパーセントとして定義されている。
好ましい実施形態において、前記最低配列同一性（％）の計算は、空隙を導入せずに実施される。整列についての方法およびコンピュータプログラムは、当該分野において周知であり、たとえば、「Ａｌｉｇｎ２」または米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴサービスなどである。
好ましくは、ＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＮ末端部分に少なくとも９０％同一である配列を有する前記配列は、天然ＡＬＰＩタンパク質におけるＡＬＰＩの部分、つまり図１の配列番号１における位置１〜３６５によって表わされるほぼ同一位置において本願に従ったタンパク質内に位置する。
さらに、図１における配列番号２の位置１〜３６５によって表わされるＡＬＰＩの触媒ドメインに同一の配列を有する配列は、ＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＮ末端部分に少なくとも９５％の、より好ましくは少なくとも９８％の同一性を有し、ただし位置２７９におけるアミノ酸は、Ｌであり、位置３２８に対応するアミノ酸は、Ｖである。最も好ましくは、ＡＬＰＩの触媒ドメインのＮ末端部分が、ＡＬＰＩの触媒ドメインの天然配列に同一であり、ただし、位置２７９におけるアミノ酸はＬであり、位置３２８におけるアミノ酸は、Ｖである。
好ましくは、ＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端部分に少なくとも９０％同一である配列を有する前記配列は、天然ＡＬＰＩタンパク質内のＡＬＰＩ部分とほぼ同一位置、つまり配列番号１における位置４３１〜４８４によって表わされるものとほぼ同一位置において本発明に従ったタンパク質内に位置する。
ＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端部分に同一である配列を有する配列は、好ましくは、ＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端配列であって、配列番号２の位置４３１〜４８４によって表わされるＣ末端配列に、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、ただし、位置４７８におけるアミノ酸は、Ｌである。最も好ましくは、ＡＬＰＩの触媒ドメインのＣ末端部分に同一である配列を有する配列は、ＡＬＰＩの触媒ドメインの天然配列に同一であり、ただし、位置４７８のアミノ酸は、Ｌである。
以前に、ＡＬＰＰのクラウンドメインに同一な配列を有するクラウンドメイン配列を有し、ＡＬＰＩの触媒ドメインに同一な配列を有する触媒ドメインを有するアルカリホスファターゼ（本願明細書においてｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰと称される）が、低Ｚｎ２＋培地においてその初期比活性を保持していることが示された。これらの結果は、インビボ活性がＺｎ２＋に非依存的であることを示した。これに対して、ＡＬＰＩは、同一の低Ｚｎ２＋条件下においてその活性を迅速に失った。本発明者らは、活性がＺｎ２＋に非依存的な酵素は、Ｚｎ２＋欠乏が病状の一部である疾患（たとえば、栄養欠乏、アルコール中毒、および腸統合性障害、敗血症などの慢性感染症、もしくは一般的な炎症性疾患）、またはＺｎ２＋の添加（製造における安定化剤として）が禁忌である疾患（たとえば、敗血症の急性期、自己免疫疾患）において有用であると結論付けた。製造および用途の利点の他に、ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｕｗｎＡＬＰＰは、貯蔵の間の安定性に関して利点を有する。ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰの特性は、ＷＯ２００８／１３３５１１に詳細に記載されている。
本願は、驚くべきことに、本発明に従ったタンパク質が低Ｚｎ２＋濃度においてさえより安定であることを示している。本願明細書において、以前に記載されたｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰ配列に関する３つの位置に関与する特定の修飾は、Ｚｎ２＋非依存性をさらに増加させることが示される。要するに、ＡＬＰＩのような天然ＡＰは、低Ｚｎ２＋濃度の環境においてその酵素活性を失い、ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰ（ＷＯ２００８／１３３５１１に記載されたように）は、低Ｚｎ２＋環境においてその活性を保っているが、たとえばＺｎ２＋キレート剤が添加されたとき、その活性を失い、一方、本発明に従ったタンパク質は、ＥＤＴＡなどの亜鉛キレート剤の存在下においてさえその活性の大部分を保持することが示された。したがって、重度のＺｎ２＋欠乏が病状の一部である疾患において、前記天然ＡＰは、炎症部位などの最も有用であると考えられる部位においてその酵素活性を展開することができない。これに対して、組換えＡＰは、非常に低いＺｎ２＋濃度に感受性がなく、特に、本発明のタンパク質は、炎症部位などの非常に低いＺｎ２＋濃度の環境においてその活性を保持している。そのような酵素は、したがって、低Ｚｎ２＋レベルによる、または付随する疾患の治療に非常に有用である。そのような減少したＺｎ２＋レベルは、本発明に従ったタンパク質に比べて、他のアルカリホスファターゼの活性を低下させる。
人体内のいくつかの酵素は、それらの活性についてＺｎ２＋濃度に依存し、たとえば、十分なレベルのＺｎ２＋が存在する場合、免疫性応答はより効果的である。免疫系の先天的、および特定部分は、亜鉛によって影響されることが知られており、亜鉛含有タンパク質が炎症部位に蓄積することが立証された。健常者において、Ｚｎ２＋血清参照値は、１０〜２０μＭである。たとえば、アルコール中毒、または栄養失調において、これらのレベルは、１０μＭ未満、またはさらに１μＭ未満に減少し得る。さらに、リウマチ関節炎、敗血症、およびクローン病などの（亜）慢性炎症は、血清亜鉛欠乏を示す。そのようなＺｎ２＋欠乏環境においては、本発明に従ったタンパク質は、非常に活性が高いままであるが、他の既知のアルカリホスファターゼは、それらのホスファターゼ活性を多かれ少なかれすぐに失ってしまう。
本発明は、したがって、本発明に従ったタンパク質が、局所的、または全身のＺｎ２＋欠乏に付随する疾患の処置において特に有用であるとの知見を提供する。他の公知のアルカリホスファターゼに比べて、本発明に従ったタンパク質は、低Ｚｎ２＋条件下において活性がさらに高い。好ましい実施形態において、したがって、本発明は、Ｚｎ２＋欠乏に付随する疾患の予防または処置における、本発明に従ったタンパク質の使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病からなる群から選択される。
用語「亜鉛欠乏」または「Ｚｎ２＋欠乏」は、（局所的に）利用可能な亜鉛の量が、妨げられていない細胞性および／または酵素活性を可能にするために不十分であることを意味する。亜鉛欠乏は、絶対的または相対的であってもよく、絶対的な亜鉛欠乏は、当該分野で公知である健常者における参照値を参照することによって容易に決定することができる。相対的な亜鉛欠乏は、たとえば、亜鉛濃度が、健常者における基準値によって設定される限界値内に留まっているときに起こり得るが、必要な亜鉛濃度は、たとえば炎症時には、通常よりも高くなる。いくつかの実施形態において、亜鉛欠乏は、対象の（局所的）亜鉛濃度が、１０μＭ未満、より好ましくは５μＭ未満、より好ましくは２μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．１μＭ未満、より好ましくは０．０５μＭ未満、より好ましくは０．２μＭ未満、より好ましくは０．０１μＭ未満、より好ましくは０．００５μＭ未満、最も好ましくは０．００２μＭ未満であることを意味する。いくつかの実施形態において、亜鉛欠乏は、（局所的）亜鉛濃度が、妨げられない細胞性および／または酵素活性に必要であるよりも低いことを意味する。
用語「炎症性疾患」は、有害な試薬と損傷組織との双方を、破壊、希釈、または囲むように働く、組織の、損傷または破壊に対する保護的な組織の応答による、またはそれに付随する疾患を意味する。急性炎症の古典的徴候は、痛み（疼痛）、熱（発熱）、潮紅（発赤）、腫大（腫脹）、機能の損失（機能喪失）である。典型的には、炎症は、Ｃ反応性タンパク質、白血球、およびサイトカイン（ＩＬ−６，ＴＮＦ−アルファなど）などの炎症性パラメータの上昇によって特徴付けられる。炎症とは、生来、当初は保護されているものをいうが、リウマチ性関節炎などの異常性炎症性疾患および（他の）自己免疫疾患なども、「炎症性疾患」の定義の中に含むものとする。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、そのような混乱した、または有害な炎症性疾患の処置における使用のためのものである。
さらに、標準的な薬物動態学的分析の間に、本発明者らは、本発明に従ったタンパク質が、いくつかの器官、特に、皮膚、腎臓、脾臓、肝臓、肺、脳、脂肪、骨、および大腸を標的とすることを予期せず観察した。本発明の放射性ヨウ素結合タンパク質を用いることによって、ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰに比べて、本発明に従ったタンパク質の器官／血中比％が、特に、皮膚、腎臓、脾臓、肝臓、肺、脳、脂肪、骨、および大腸に特に良好であること、つまり、本発明に従ったタンパク質が、公知のｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰタンパク質よりもこれらの器官を相対的により多く標的とすることが観察された。特に、本発明に従ったタンパク質は、ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰよりも血中において低濃度で存在し、言及された器官においてより高い濃度で存在する。肝臓神経皮膚炎、腎障害、肝臓線維化、低ホスファターゼ症などの、これらの器官に関する症状が、処置されるべきであるとき、費用を減少させ、および／または効果を増加させる処置のために必要とされるタンパク質が少ない。これらの器官に関する疾患に伴う実験は、既に行われたか（低ホスファターゼ症）、進行中であるか（腎臓病）、または計画中である。本発明は、したがって、当該技術分野において公知のアルカリホスファターゼに比べて向上した亜鉛非依存性および薬物動態学的挙動を示すタンパク質を提供する。
本発明者らは、様々な使用実施形態において、本発明に従ったタンパク質が医薬として有用であることを示している。本発明に従ったタンパク質によって処置することができる疾患または症状は、腎機能低下、腎障害、腎不全、および低ホスファターゼ症を含む。さらに、使用された公知のアルカリホスファターゼタンパク質を超える改良を構成する、本発明に従ったアルカリホスファターゼタンパク質の特異的な特徴の故に、本発明に従ったタンパク質は、腎機能低下、腎障害、腎不全、および低ホスファターゼ症だけではなく、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病の予防または処置に有用である。これらは、本発明に従ったタンパク質によって標的とされる、および／または（相対的）亜鉛欠乏に付随する、器官に影響を与える疾患のすべてである。
用語「予防」または「予防すること」は、本明細書においては、対象が特定の疾患を誘引することを妨げることを目的とした、対象に対する本発明に係るタンパク質を投与すること（行為）として定義される。処置の意図は、前記対象が前記疾患を誘引することを妨げることであるが、疾患の状態が、本発明に従ったタンパク質の１回または複数回の投与後に完全に妨げられる必要はない。なぜなら、対象は、たとえば、必ずしも特定の処置プロトコールに感受性があるとは限らないからである。全体的に、前記予防の効果は、特定の疾患を予防するために、本発明に従ったタンパク質を受けた対象の一群が、少なくとも疾患の重症度増加の減少、またはたとえば前記疾患の合併症の低減を示す点においてもたらされることが好ましい。たとえば、腎臓病の場合、腎臓病を誘引するリスクのある対象が、本発明に従ったタンパク質で処置された後、前記タンパク質で処置されていない対象に比べて腎機能の低下を低減することが好ましい。対象が、疾患であって、当該疾患を予防するためにタンパク質が投与された疾患を誘引する場合、さらなる投与が、前記疾患状態の悪化を妨げるため、または治療目的の処置として与えられてもよい。
用語「処置」または「処置すること」は、本明細書において、（予期される）疾病の対象を治療すること、または対象の疾病の症状を改良、低減、もしくは除去することを目的として、本発明に従ったタンパク質を対象に投与（の行為）をすることとして定義される。処置の目的は前記対象を治療することであるが、前記対象は、本発明に従ったタンパク質の１回または複数回投与後に治癒する必要はない。なぜなら、対象は、たとえば、必ずしも特定の処置プロトコールに感受性があるとは限らないからである。全体的にみて、前記処置の有効性は、本発明に従ったタンパク質で処置された対象が、未処置（またはプラセボ処置）群に比べて、少なくとも、それらの疾患状態の改善、またはたとえば前記疾患の合併症の低減を示す点においてもたらされることが好ましい。たとえば腎臓病の場合、対象は、本発明に従ったタンパク質で処置された後、前記タンパク質で処置されなかった対象に比べて、腎機能の向上、または腎機能低下の低減を示すことが好ましい。
本発明は、本発明に従ったタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。
本明細書において使用されるように、「核酸配列」ならびに「ポリヌクレオチド」との用語は、たとえば、人工的に修飾された核酸配列、ペプチド核酸、ならびに少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド、ならびに／またはイノシン、ＬＮＡ、モルフォリノ、および２’−Ｏ−メチルＲＮＡなどの非天然ヌクレオチドを含む核酸配列のような核酸配列に基づく、ならびに／または由来する非天然分子を含む。
そのような本発明に従ったポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。そのようなベクターは、好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の翻訳／転写に必要な構成要素のような追加の核酸配列を含む（たとえば、プロモータおよび／またはターミネータ配列）。前記ベクターは、当該ベクターで形質転換された宿主細胞を選択または維持するために、選択マーカ（たとえば、抗生物質）をコードする核酸配列を含む。適したベクターの例は、クローニングまたは発現ベクターである。宿主細胞における発現を調節するために適切な任意のベクターを、本発明に従って使用し、宿主細胞に集積するか、またはエピゾーマリに複製することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、および／もしくはそれらの誘導体）、コスミド、ファージ、またはファージミド、エピソーマルベクター、または人工染色体であってもよい。そのようなポリヌクレオチド、またはベクターは、本発明に従ったタンパク質の産生に非常に有用であるが、遺伝子治療に使用することができない。
本発明は、したがって、本発明に従ったタンパク質の医薬として使用を提供する。本発明に従ったポリヌクレオチドによって、または本発明に従ったタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで発現するために本発明に従ったベクターによって処置される上述の疾患のいずれか１つに罹患している、または罹患するリスクを有する患者を処置することができる。本発明は、したがって、医薬としての使用のための、好ましくは、腎機能低下、腎障害、腎不全、低ホスファターゼ症、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病の予防または処置のための、本発明に従ったポリヌクレオチド、または本発明に従ったベクターを提供する。
また、炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症の予防または処置のための方法における使用のための、本発明に従ったタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクターが提供される。
また、本発明に従ったタンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターの、医薬の製造のための使用であって、好ましくは、腎機能低下、腎障害、腎不全、低ホスファターゼ症、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病の予防または処置のための使用が提供される。
他の実施形態において、本発明は、局所的、または全身のＺｎ２＋欠乏に付随する疾患の処置のための医薬の製造において、本発明に従ったアルカリホスファターゼタンパク質の、本発明に従ったポリヌクレオチドの、または本発明に従ったベクターの、使用を提供する。好ましくは、前記疾患は、炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症であり、好ましくは、前記疾患は、炎症性疾患、より好ましくは、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病からなる群から選択される疾患を含む。
他の実施形態において、本発明は、好ましくはＺｎ２＋欠乏に付随する疾患を処置するために、対象（好ましくは、ヒト）を処置するための方法であって、本発明に従ったホスファターゼの有効量を投与することを含み、前記疾患が、好ましくは、炎症性疾患を含み、より好ましくは、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病からなる群から選択される方法を提供する。
本発明は、したがって、様々な疾患における使用のための、本発明に従ったタンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを提供する。本発明に従ったタンパク質は、その器官分布が原因で、消化管、腎臓、皮膚、肝臓、肺、脳、脂肪組織、または骨に関する疾患の処置における使用のために特に有用である。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、腎臓病の処置における使用のための、本発明に従ったタンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを提供する。
腎障害の病態生理学における継続的な観察が存在し、腎機能を向上させる治療が存在する（Lameire NH, Acute kidney injury: an increasing global concern. Lancet. 2013 Jul 13;382(9887):170-9）が、腎障害を処置するため、および／または腎機能を向上させるための新規の処置が必要とされている。
本発明は、本発明に従った使用のための、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターによってそのような新規の処置を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、本発明に従った使用のための、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを提供し、前記腎臓病は、腎不全、急性腎障害、慢性腎臓病、虚血性腎臓病の群から選択される。
用語急性腎障害（ＡＫＩ）は、以前は急性腎不全と称され、腎機能が迅速に失われることを意味する。
ＡＫＩは、増加した血中尿素窒素およびクレアチニン、または十分な量の尿を生じる腎臓の機能不全（inability）などの特有の臨床検査所見に基づいて診断される。ＡＫＩは、腎前性ＡＫＩ、内因性ＡＫＩ、および腎後性ＡＫＩに細分化することができる。
腎前性ＡＫＩは、腎臓への有効血流量の減少によってもたらされる。腎前性ＡＫＩの典型的臨床検査所見は、Ｕｏｓｍ： ＞５００，ＵＮａ： ＜１０，ＦｅＮａ： ＜１％、およびＢＵＮ／Ｃｒ比率： ＞２０である。
内因性ＡＫＩとの用語は、腎臓そのものに対する損傷源が原因であるときに使用される。内因性ＡＫＩについての典型的臨床検査所見は、Ｕｏｓｍ： ＜３５０，ＵＮａ： ＞２０，ＦｅＮａ： ＞２％、およびＢＵＮ／Ｃｒ比率： ＜１５である。
用語「腎後性ＡＫＩ」とは、尿路閉塞がＡＫＩの原因となる条件のために用意された用語である。腎後性ＡＫＩの典型的臨床検査所見は、Ｕｏｓｍ： ＜３５０，ＵＮａ：＞４０，ＦｅＮａ： ＞４％、およびＢＵＮ／Ｃｒ比率： ＞１５である。
世界的に、慢性腎臓病の分類のためのいくつかのガイドラインが存在する。
１つの例として、米国腎臓財団（２００２）の分類基準「慢性腎臓病のＫ／ＤＯＱＩ臨床ガイドライン」を以下に記載する。当業者は、他のガイドラインに基づいて異なる患者集団を選択してもよい。
通常、腎障害の有無に関わらず、糸球体濾過率（ＧＦＲ）＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を３ヶ月間有する全ての個体は、慢性腎臓病に分類される。これらの個体を含める根拠は、このレベル以下への腎機能の低下が典型的腎機能の成人レベルの半分以上の損失を表し、多くの合併症に付随し得る。一般的に、慢性的な腎障害を有する個体は、ＧＦＲのレベルに関わらず、慢性腎臓病を有すると分類される。ＧＦＲ＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する個体を含める根拠は、ＧＦＲは、実質的な腎障害にもかかわらず、通常または高レベルで維持され得る点と、腎障害を有する患者は、慢性腎臓病の２つの主たる転帰である、腎機能の喪失および循環器疾患の進行というリスクが増大し、そしてこれらは、病的状態および死亡につながることもあるという点にある。
尿中のタンパク質の損失は、腎機能の悪化、および循環器疾患の独立マーカとみなされる。したがって、イギリスのガイドラインは、タンパク質の有意な損失がある場合、慢性腎臓病のステージにアルファベット「Ｐ」を付加した。
慢性腎臓病の５つのステージは、通常以下のように分類される。
ステージ１：わずかな機能低下；通常の、または比較的高いＧＦＲ（≧９０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）による腎障害腎障害とは、血液もしくは尿検査、または画像診断における異常などの、病理学的異常、または障害のマーカとして定義される。
ステージ２：腎障害によるＧＦＲの軽度低下（６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）腎障害は、血液もしくは尿検査、または画像診断における異常などの、病理学的異常、または障害のマーカとして定義される。
ステージ３：ＧＦＲの中程度低下（３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）イギリスのガイドラインは、検診および診察の目的のために、ステージ３Ａ（ＧＦＲ４５〜５９）とステージ３Ｂ（ＧＦＲ３０〜４４）とを区別している。
ステージ４：ＧＦＲの重度低下（１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）。腎臓置換療法の準備。
ステージ５：確立した腎不全（ＧＦＲ＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２）、永続的な腎臓置換療法（ＲＲＴ）、または末期腎不全（ＥＳＲＤ）。
腎不全との用語は、現在のところ、腎臓が、血液に由来する老廃物を適切に濾過することができない医学的状況を示す。２つの主な種類は、多くの場合、適切な処置で回復可能である急性腎障害と、多くの場合、回復可能ではない慢性腎臓病とである。
虚血性腎臓病は、糸球体濾過率の臨床的に重要な低下、または腎実質の損失が、血行力学的に重要な腎動脈狭窄症、または腎臓における血圧低下による他の原因、たとえば血行力学的衝撃、または血流の一時的阻害のための動脈性クランプの使用などによってもたらされる。
本発明者らは、本発明に従ったタンパク質が低ホスファターゼ症（ＨＰＰ）の処置において有用であることを示した。このことは、全く予想外のことであった。なぜなら、低ホスファターゼ症の処置のためにＴＮＡＰを用いる以前の実験は、酵素補充療法が有効であることを示さなかったからである。その結果、ＴＮＡＰ酵素と、骨ホーミングペプチドとの人工融合タンパク質が開発された（Whyte et al, N Engl J Med. 2012 Mar 8;366(10):904-13）。驚くべきことに、本発明に従ったタンパク質は、そのような骨ホーミングペプチドを必要とせず、マウスモデルにおいて低ホスファターゼ症の症状の徴候を効果的に低減することができる。別の好ましい実施形態において、本発明は、したがって、低ホスファターゼ症の処置における使用のための本発明に従った、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またベクターを提供する。
低ホスファターゼ症の代謝基盤は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）をコードする遺伝子における分子的異常に由来する。ＴＮＡＰは、骨芽細胞および軟骨細胞の細胞膜の外表面に繋ぎ止められた外酵素である。ＴＮＡＰは通常、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、およびビタミンＢ６の主要形態であるピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）などのいくつかの物質を加水分解する。
ＴＮＡＰが少ないとき、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）は、細胞外に蓄積し、ヒドロキシアパタイトの形成（石灰化）を強力に抑制し、幼児および小児ではくる病、ならびに成人では骨軟化症（柔らかい骨）をもたらす。ＰＬＰは、ビタミンＢ６の主な形態であり、細胞膜を通過するためには、ＴＮＡＰによってピリドキサール（ＰＬ）に脱リン酸化されなければならない。脳におけるビタミンＢ６欠乏は、癲癇の原因となり得る神経伝達物質の合成を低下させる。いくつかの場合において、無水ピロリン酸カルシウム（ＣＰＰＤ）結晶の関節における沈殿は、偽性痛風の原因となり得る。
今日、ＨＰＰについて承認された治療法は、存在しない。現在の対応は、必要に応じて、症状の緩和、カルシウムバランスの維持、ならびに物理的、作業的、歯科的、および整形外科的介入からなる。ある幼児におけるビスホスホネート（ピロリン酸合成類似体）投与は、骨格に識別可能な効果をもたらさず、幼児の疾患は、１４月齢において死亡するまで進行した。
二人の重度に罹患した幼児における骨髄細胞移植は、Ｘ線検査における、および臨床的な改善効果をもたらすが、効果の機序は、完全には理解されておらず、重大な病的状態が残る。通常の血清による、またはパジェットの骨疾患を有する患者に由来するＡＬＰ豊富な血清による酵素補充療法は、有用ではない（Whyte MP, Valdes R, Ryan LM, McAlister WH (September 1982)）。「幼児の低ホスファターゼ症：パジェットの骨疾患を有する患者に由来するアルカリホスファターゼ豊富な血漿の静脈内注入による酵素補充療法」（J. Pediatr. 101 (3): 379-86][ Whyte MP, McAlister WH, Patton LS, et al. (December 1984)）。「アルカリホスファターゼ豊富なパジェット血漿の静脈内注入によって試みられる幼児性低ホスファターゼ症のための酵素補充療法」（J. Pediatr. 105 (6): 926-33]. J. Pediatr. 101 (3): 379-86][ Whyte MP, McAlister WH, Patton LS, et al. (December 1984)）。これらの酵素補充療法は、効果がないと考えられた。なぜなら、アルカリホスファターゼの機能は、骨表面におけるものであり、血中におけるものではないと考えられるからである。さらに、酵素補充療法の効果を向上するための試みは、それゆえ、有望な結果を有する骨が標的とされるＴＮＡＰ酵素の周囲に構築された（Whyte et al. N Engl J Med. 2012 Mar 8;366(10):904-13）。驚くべきことに、本発明は、人工的な骨標的部分を導入することなく、本発明に従ったタンパク質が、低ホスファターゼ症のマウスモデルにおいて有用であることを示す。本発明のタンパク質の１つの利点は、WhyteおよびMillan［J. Bone Miner. Res. 2008;23(6):777-787］に記載されており、人工的な骨標的部分の欠如が原因で、本発明のタンパク質は、非常に低い免疫原性であると予想される。本発明のタンパク質は、天然に生じるヒトアルカリホスファターゼタンパク質に高い配列同一性を有するタンパク質からなる。さらに、本発明のタンパク質は、製造の容易性および費用に関して骨標的アルカリホスファターゼを超える利点を有する。
好ましい実施形態において、低ホスファターゼ症の処置における使用のための、本発明に従った、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターが提供され、前記低ホスファターゼ症は、周産期型低ホスファターゼ症、幼児型低ホスファターゼ症、小児型低ホスファターゼ症、および成人型低ホスファターゼ症から選択される。
周産期型低ホスファターゼ症は、低ホスファターゼ症の最も悪性の形態である。子宮内において、重度の石灰化不全は、妊娠期間および出生時に膜性頭、変性または短化した四肢をもたらし、呼吸不全による迅速な死亡をもたらす。
小児型低ホスファターゼ症は、生存の最初の６月に生じる。生後発達は、多くの場合、不十分な摂食、および不適切な重量増加が現れ、くる病の臨床的所見が認められるまで正常に見える。高カルシウム血症および高カルシウム尿症も好発し、腎石灰症、腎機能障害、および反復性嘔吐の発症の原因の説明となり得る。死亡率は、生存の最初の１年で５０％であると推定される。
小児型低ホスファターゼ症は、不定の臨床的発現を示す。セメント質の無形成、形成不全、または形成異常の結果として、乳歯の早期損失（たとえば、５歳前）が生じる。多くの場合、切歯は第１に抜け落ち、時折ほぼ全部の乳歯列が早期に脱落する。歯科用Ｘ線写真は、時折、拡張した髄腔と、くる病の「殻状歯」の根管特徴とを示す。患者は、非進行性筋障害に一致する付属筋低下（特に、大腿において）、ならびに歩行遅延、特有の動揺性歩行、硬直および疼痛の症状を経験し得る。通常、Ｘ線写真は、くる病の奇形、および主要な長骨の骨端付近に特有の骨欠損を示す（すなわち、くる病の成長板から骨幹端に延びる放射線透過性の「舌（tongues）」）。成長遅延、高頻度の骨折、および骨減少症が好発する。重度に発症した幼児および幼い小児において、Ｘ線検査における広く「開いた」泉門の出現にもかかわらず、頭蓋縫合の機能的な骨癒合が生じることは珍しいことではない。「開いた」泉門の像は、広い領域で石灰化不全の頭蓋冠をもたらす。続いて、頭蓋縫合の真性早発性骨融合が頭蓋内圧を上昇させ得る。
成人型低ホスファターゼ症は、くる病、乳歯の早発性欠損、または成人歯列の早期欠損を伴い得、比較的に良好な健康状態であり得る。骨軟化症は、中足骨の疲労骨折の反復性の不十分な治癒から生じる足の痛みと、それらがＸ線検査において現れるとき、大腿骨近位部の外側皮質におけるそれらの局在によって大部分の他の種類の骨軟化症（内側に生じる）とは区別される大腿の偽骨折が原因である大腿または臀部における不快感として現れる。ある患者は、関節炎（偽性痛風）の副次的な顕性攻撃を伴うピロリン酸カルシウム二水和物結晶の沈着を患い、この副次的顕性攻撃は、内在性の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）レベルの増加の結果であると考えられる。これらの患者は、関節軟骨の変性、およびピロリン酸関節症を罹患し得る。Ｘ線写真は、近位大腿骨の外側皮質における偽骨折、疲労骨折を明らかにし、患者は、骨減少症、軟骨石灰化症、ピロリン酸関節症の特徴、および石灰沈着性関節周囲炎を経験し得る。
好ましい実施形態において、本発明に従った低ホスファターゼ症の処置における、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターの使用であって、前記処置が、生存期間の延長、体重の増加、改善した骨格表現型（二次骨化中心の誘導、たとえば骨梁および／もしくは皮質骨における骨石灰化の改善、または類骨の誘導など）、顔面頭蓋欠損の減弱（形状異常、および冠状縫合癒合）、歯および歯槽の表現型（大臼歯の高さおよび形状、象牙質厚さ、ならびに骨石灰化の改善など）の改善、ならびに／または患者の血漿ＰＰｉレベルの低下をもたらす使用が提供される。
低ホスファターゼ症の予防、または処置のための医薬の製造のための、本発明に従った、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターの使用であって、前記処置が、生存期間の延長、体重の増加、改善した骨格表現型（二次骨化中心の誘導、たとえば骨梁および／もしくは皮質骨における骨石灰化の改善、または類骨の誘導など）、顔面頭蓋欠損の減弱（形状異常、および冠状縫合癒合）、歯および歯槽の表現型（大臼歯の高さおよび形状、象牙質厚さ、ならびに骨石灰化の改善など）の改善、ならびに／または患者の血漿ＰＰｉレベルの減少をもたらす使用が提供される。
また、低ホスファターゼ症に罹患している、または罹患するリスクを有する対象を処置する方法であって、前記処置が、生存期間の延長、体重の増加、改善した骨格表現型（二次骨化中心の誘導、たとえば骨梁および／もしくは皮質骨における骨石灰化の改善、類骨の誘導など）、顔面頭蓋欠損の減弱（形状異常、および冠状縫合癒合）、歯および歯槽の表現型（大臼歯の高さおよび形状、象牙質厚さ、ならびに骨石灰化の改善など）の改善、ならびに／または前記対象の血漿ＰＰｉレベルの減少をもたらす方法が提供される。
より好ましい実施形態において、本発明に従った低ホスファターゼ症の処置における使用のための、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターであって、前記低ホスファターゼ症が、幼児型、小児型、または成人型低ホスファターゼ症から選択される、タンパク質、ポリヌクレオチド、および／またはベクターが提供される。より好ましくは、前記低ホスファターゼ症は、幼児型低ホスファターゼ症である。
本明細書において、実施例、および当該技術分野における文献、他の命名法がアルカリホスファターゼの各アイソフォームを命名するために使用される。明確にするために、以下の表１において、一般的に使用される、または本願において使用される名称および略称が列挙される。
「分泌可能」との用語は、翻訳後のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーが成熟タンパク質に付加しておらず、タンパク質を分泌可能にし、膜結合しないことを意味する。ＧＰＩアンカーは、糖脂質であり、翻訳後修飾の間にタンパク質のＣ末端に付加され得る。それは、糖含有リンカ（グリコシド結合によるイノシトール残基に対するグルコサミンおよびマンノース）を介して、そして成熟タンパク質のＣ末端アミノ酸に対するエタノールアミンホスフェート（ＥｔＮＰ）架橋を介して結合されたホスファチジルイノシトール基からなる。疎水性のホスファチジルイノシトール基内の２つの脂肪酸は、タンパク質を細胞膜に固定する。このことは、産生および下流プロセシングに有利であるので、本発明に従ったタンパク質は、ＧＰＩアンカーを含まないことが好ましい。
記載された分泌可能な任意の修飾ホスファターゼ（したがって、本発明に従った分泌可能なタンパク質）は、たとえば、調節配列を有する操作可能な結合内に前記分泌可能なホスファターゼをコードすることができる核酸を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞に前記分泌可能なホスファターゼを発現させ、随意に、前記宿主細胞が増殖および／または維持される培地から産生されたホスファターゼを単離することによって産生することが可能である。しかし、上述のＧＰＩ付加配列における変異とは別に、ＧＰＩアンカーの無い分泌タンパク質を作製する他の方法が存在する。たとえば、
１）膜アンカータンパク質として発現させた後、ホスホリパーゼは、ＧＰＩアンカーを切断するために使用することができる。したがって、本発明は、膜アンカーホスファターゼを発現することができる宿主を培養することと、前記宿主細胞に前記ホスファターゼを産生させることと、得られた細胞をホスホリパーゼとともに培養することと、随意に、放出されたホスファターゼを単離することとを含む、分泌ホスファターゼを産生する方法を提供する。
２）ＧＰＩアンカーの産生の阻害、またはＧＰＩアンカー産生を欠く細胞（種）の使用は、別のＧＰＩアンカータンパク質の分泌可能な形態をもたらすために使用することができる。
ＧＰＩアンカー生化学における、不完全にされた細胞株の例としては、Jurkat，AM-B，C84，BW，S49，CHO，およびRajiがある。また、さらなる別の実施形態において、本発明は、したがって、分泌ホスファターゼを産生するための方法であって、分泌可能な（アルカリ）ホスファターゼを発現することができる宿主細胞（たとえば、任意の上述の修飾された分泌（アルカリ）ホスファターゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞）を培養することと、前記分泌可能なホスファターゼを前記宿主に産生させることと、随意に、産生されたホスファターゼを単離することとを含み、前記宿主細胞が、機能的なＧＰＩアンカータンパク質の生合成をすることができない方法を提供する。しかし、宿主細胞は、機能的ＧＰＩシグナル配列を有するホスファターゼを産生してもよい。
３）トランスアミダーゼを欠く細胞の使用、またはトランスアミダーゼの阻害は、タンパク質に対するＧＰＩアンカーの付加を阻害するために使用され、タンパク質をアンカーなしで分泌可能にしてもよい。そのような欠損細胞は、ＣＨＯの突然変異誘発によって得られた。
本発明に従ったベクターは、好ましくは、ホスファターゼをコードする核酸配列の転写／翻訳に必要な構成要素（たとえば、プロモータおよび／またはターミネータ配列）などの追加の核酸配列を含む。前記ベクターは、当該ベクターで形質転換された宿主細胞を選択または維持するための選択マーカ（たとえば、抗生物質）をコードする核酸配列を含むことができる。好ましくは、ＧＰＩアンカー配列をコードする核酸配列は、本発明に従った、ポリヌクレオチド、および／またはベクターには存在しない。好適なベクターの例は、クローニングまたは発現ベクターである。適切な宿主細胞における発現を調節するために適した任意のベクターは、本発明に従って使用されてもよく、宿主細胞において統合的に、またはエピソーマルに複製されてもよい。ベクターは、プラスミド、ウイルス（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、もしくはそれらの誘導体）、コスミド、ファージ、またはファージミド、エピソーマルベクター、または人工染色体であってもよい。
さらに、本発明は、上述されたような、本発明に従った、タンパク質、核酸配列、またはベクターを含む宿主細胞を提供する。細胞は、組換えタンパク質の産生に適した、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、植物細胞、または酵母細胞であってもよい。適した酵母細胞は、たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む。好ましくは、宿主細胞は、BHK、HEK293、CHO、またはPerC6（商標）などの哺乳類（またはより好ましくはヒト）由来細胞である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、CHO細胞である。
本発明に従ったタンパク質をコードする核酸配列、当該核酸配列を含むベクター、および／または前記核酸配列を含む宿主細胞は、本発明に従ったタンパク質の産生に非常に有用である。本発明に従ったタンパク質は、糖化部位を含むので、当該タンパク質は、好ましくは、細胞において産生され、所望の糖鎖修飾パターンを提供する。好ましい実施形態において、使用される産生システムは、哺乳類（たとえば、ヒト）ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生プラットフォームであり、より好ましくは、前記産生は、大規模産生に関する。他の好ましい実施形態において、使用される産生システムは、人工的なヒト様糖鎖修飾パターンが導入された、植物、または酵母、または哺乳類（好ましくは、非ヒト）プラットフォームである。
一実施形態において、本発明は、したがって、本発明に従ったタンパク質を産生する方法であって、本発明に従ったポリヌクレオチド、または本発明に従ったベクターを含む宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を前記宿主細胞に産生させることとを含む方法を提供する。好ましい宿主細胞は、BHK、HEK293、CHO、またはPerC6（商標）などの哺乳類（またはより好ましくはヒト）由来細胞である。好ましい実施形態において、宿主細胞は、CHO細胞である。好ましくは、本発明に従ったタンパク質を産生するための方法は、前記タンパク質を前記培養物から回収し、随意に、精製することをさらに含む。
既に述べられたように、本明細書において記載される、本発明に従ったタンパク質は、治療に有用である。一実施形態において、本発明は、本発明に従ったタンパク質を含む組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、随意に、医薬的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
組成物は、任意の形態で、たとえば、錠剤として、注射可能な液体として、または注入液などとして存在してもよい。さらに、本発明に従った、組成物、タンパク質、ヌクレオチド、および／またはベクターは、たとえば、静脈内、直腸内、気管内、または経口などの異なる経路によって投与することができる。さらに別の適した投与経路は、十二指腸点滴の使用である。
好ましい実施形態において、投与の使用経路は、静脈内経路である。好ましくは、本発明に従ったタンパク質の有効量が送達されることは、当業者にとって明らかである。開始点として、１〜５０，０００Ｕ／ｋｇ／日が使用されてもよい。たとえば、ＨＰＰのための他の適した経路は、皮下経路である。投与の静脈内経路が使用される場合、本発明に従ったタンパク質は、（少なくとも特定の長さの時間にわたって）持続注入によって適用することができる。
本発明に従った前記組成物は、随意に、医薬的に許容される、賦形剤、安定剤、活性化剤、担体、浸透剤、噴射剤、消毒剤、希釈剤、および保存剤を含んでもよい。適切な賦形剤は、医薬製剤の分野において一般的に公知であり、当業者によって容易に見出され、加えられてもよい。たとえば、Remmington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia PA, 17th ed. 1985を参照。
経口投与のために、タンパク質は、カプセル、錠剤（たとえば、腸溶コーティング）、および粉末などの固体投与形態、またはエリキシル剤、シロップ、および懸濁液などの液体投与形態で投与されてもよい。ＡＰは、不活性成分、およびグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースもしくはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリン酸ナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの粉末化担体と共にゼラチン質カプセルに包まれてもよい。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散度、または他の公知の所望の特徴を提供するために添加される追加の不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。同様の希釈剤が、圧縮された錠剤を製造するために使用されてもよい。錠剤およびカプセルの双方は、１時間を超える薬剤の持続的放出を提供するために徐放製品として製造されてもよい。圧縮された錠剤は、不快な味覚を遮蔽し、錠剤を大気から保護するために、糖被覆、もしくは薄膜被覆され、または消化管における選択的分解のために腸溶コーティングされてもよい。経口投与のための液体投与形態は、患者の許容性を増加させるために色および香りを含んでもよい。
好ましい実施形態において、本発明に従ったタンパク質を含む組成物は、経口投与に適しており、胃液、および低ｐＨの有害作用からＡＰを保護する腸溶コーティングを含む。腸溶コーティング、および徐放製剤は、当該技術分野において周知である。当該技術分野における腸溶コーティング組成物は、水溶液中に分散された活性成分および他の賦形剤と混合された水溶性腸溶コーティングポリマーの溶液を含んでもよく、その後、乾燥され、および／またはペレット化されてもよい。腸溶コーティング形態は、大気中の水分、および保存の間の酸素による、ならびに摂取後の胃液および低ｐＨによる本発明に従ったタンパク質の攻撃に対する抵抗性を提供するが、下部消化管に存在するアルカリ条件下において容易に破壊される。
本発明は、好ましくは、局所的、もしくは全身の亜鉛欠乏、炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症に付随する疾患を処置するための本発明に従った組成物の、医薬としての使用を提供する。炎症性疾患は、好ましくは、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病からなる群から選択される。腎臓病は、好ましくは、腎不全、急性腎障害、慢性腎臓病、および虚血性腎臓病からなる群から選択される。低ホスファターゼ症は、好ましくは、周産期型低ホスファターゼ症、幼児型低ホスファターゼ症、小児型低ホスファターゼ症、および成人型低ホスファターゼ症からなる群から選択される。
本発明に従ったタンパク質は、医薬組成物に組み込むことができるという事実に加えて、かかるホスファターゼは、栄養組成物、または機能性食品の一部であってもよい。
本発明に従ったタンパク質は、栄養剤（牛乳など）に添加されてもよいが、前記栄養剤内において製造されてもよい（たとえば、分子工学によって）。さらに、錠剤、および／またはカプセルは、続いて栄養剤に添加され、ヒトによって直接に摂取されてもよい。
さらに、炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症に罹患している対象を処置するための方法が提供され、この方法は、本願に従ったタンパク質、たとえば、ホスファターゼ活性を有する、単離、または組換えタンパク質の有効量を投与することを含み、
前記タンパク質の一部は、少なくとも５０個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＰＬＡＰの全長クラウンドメインに、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記タンパク質の一部は、少なくとも２００個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＮ末端領域に９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記タンパク質の一部は、少なくとも４０個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列であって、ヒトＡＬＰＩのクラウンドメインに隣接するＣ末端領域に９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
全長のタンパク質は、配列番号１の全長アミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列含み、
ただし、位置２７９におけるアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）であり、位置３２８におけるアミノ酸は、バリン（Ｖ）であり、位置４７８におけるアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）であり、または
本願に従ったポリヌクレオチドの有効量、もしくは本願に従ったベクターの有効量を投与することを含む。
本発明は、以下の非限定的な例においてより詳細に説明される。
成熟タンパク質ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ，ｈＩＡＰ，およびｈＰＬＡＰのアミノ酸配列。異なるタンパク質の推定クラウンドメインは、下線を付されている。 ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰと比較したＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの器官分布。血液に対する器官分布ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰで分けられた血液に対する器官分布ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰが示されている（＝ｙ軸は比率）。高い値は、ｃａｔＡＬＰＩ／ｃｒｏｗｎＡＬＰＰと比較した場合、各器官を標的とするＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの徴候である。 ベヒクル、１ｍｇＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日、８ｍｇＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日、または１６ｍｇＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日のいずれかで処置されたＡｋｐ２−／−マウスの生存率を示す。 腎臓虚血／再灌流障害を罹患している子ブタにおける血清クレアチニン濃度である。シャム動物は、外科的処置を受け、その間に左腎が除去された。しかし、腎臓閉塞および再灌流は、行われなかった。０日目において、０．３２ｍｇ／ｋｇ／日を受けた群では、投与量の半分が再灌流の前に投与され、投与量の残り半分が再灌流後８±２時間において投与された。生存期間の残りの間、総量が毎日投与された。 腎臓虚血／再灌流障害を罹患している子ブタにおけるＡＰ濃度である。シャム動物は、外科的処置を受け、その間に左腎が除去された。しかし、腎臓閉塞および再灌流は、行われなかった。０．３２ｍｇ／ｋｇ／日（２００Ｕ／ｋｇ／日）を受けた群では、０日目において、投与量の半分が再灌流の前に投与され、投与量の残り半分が再灌流後８±２時間において投与された。生存期間の残りの間、総量が毎日投与された。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置によるＡｌｐｌ−／−マウスの生存率および体重の改善。Ａ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６は、実験の最後まで生存した。生存率の平均は、ベヒクル、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８のそれぞれについて、ｐ１９、ｐ２２、およびｐ４２．５であった。Ｂ）ベヒクル処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、ＷＴ同腹仔よりも軽量であった。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１処置は、ｐ１８においてＷＴ付近まで体重を改善する。ベヒクル処置されたマウスは、長く生存せず、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８処置されたマウスは、ｐ５３においてＷＴ同腹仔よりも軽量のままであった。一方、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたマウスは、ｐ５３においてそれらのＷＴ同腹仔とは有意に異ならない体重を示す。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、Ａｌｐｌ−／−マウスの骨格表現型を改善する。ベヒクル、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６で処置されたＡｋｐ２−／−マウス、および未処置ＷＴコントロールの、脊椎、前肢、胸郭、後肢、および足のＸ線写真である（拡大率５×）。Ａ）Ａｋｐ２−／−マウスは、椎骨、長骨、および胸郭において重度の骨軟化症（矢印）を示す。二次骨化中心は、Ａｋｐ２−／−マウスにおいて欠けている（アスタリスク）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１を用いる処置は、ｐ１８において、未処置のＷＴと比較して表現型をわずかに治す（矢頭）。Ｂ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６を用いる処置は、椎骨、長骨、および胸郭において骨表現型を明らかに治す。特に、中足骨領域における二次骨化中心の推移が示しているように最遠位が改善される（矢頭）。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける改善された石灰化を示す。Ａ）ベヒクル処置されたＡｌｐｌ−／−（ｐ１８）、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８（ｐ５１）、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６ ｐ５３、および未処置ＷＴマウスｐ５３の大腿骨の組織学的解析である。フォンコッサ染色は、ＬＶＬ-ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６の増加した投与量よる良好な骨石灰化を明らかにした。二次骨化中心および皮質骨領域は、未処置に比較して石灰化の著しい改善を示す（黒色）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６において、ＷＴに比較して海綿骨が少ないが、海綿骨領域における石灰化、および海綿骨になると予期される類骨が増加した。 Ｂ／Ｃ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６について、ＢＶ／ＴＶおよびＯＶ／ＢＶの分析は、同齢のコントロールよりも低下した骨量および増加した類骨量を示した。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける骨軟化症および血漿ＰＰｉレベルの改善。Ａ）ベヒクル処置されたＡｌｐｌ−／−（ｐ１８）、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８（ｐ５１）、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６ ｐ５３、および未処置ＷＴマウス ｐ５３の大腿骨の組織学的解析。大腿骨切片のゴールドナートリクローム染色は、Ａｌｐｌ−／−における重度の骨軟化症を示し、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６の投与量増加による皮質領、および二次骨化中心における石灰化の改善を示す。類骨の拡張領域の存在は、骨の沈着を示唆するが、未だ石灰化されていない。Ｂ／Ｃ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６を受けたＡｋｐ２−／−マウス、およびＷＴの血漿におけるＰＰｉ濃度。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１処置は、ｐ１８において、Ａｌｐｌ−／−マウスにおける高いＰＰｉレベルの有意な減少をもたらす。ｐ５３において、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置は、ＷＴコントロールと同等な血漿ＰＰｉレベルの矯正をもたらした。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける顔面頭蓋欠損の欠如。ｐ２１およびｐ５３における、ＷＴ（Ａ，Ｄ）、ベヒクル処置Ａｌｐｌ−／−（Ｂ，Ｅ）、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６（Ｃ，Ｆ）マウス頭蓋骨のμＣＴイソ表面画像。処置されたＡｌｐｌ−／−マウスの前頭骨も頭頂骨も、ＷＴマウスのものとは有意に異ならなかった。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたＡｌｐｌ−／−マウスの成体頭蓋は、寸法および形状の点でＷＴとは異ならないようであった。 ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、Ａｌｐｌ−／−マウスの歯槽表現型を部分的に回復する。ｐ２５〜２６における野生型コントロールの（Ａ）Ｘ線検査、および（Ｄ）μＣＴ分析に比べて、（Ｂ，Ｆ）未処置のＡｌｐｌ−／−マウス下顎骨は、石灰化不全、および減少した歯槽骨（ＡＢ）、薄い象牙質（ＤＥ）および広い髄腔を有する短い大臼歯（Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３）、ならびに不完全な切歯（ＩＮＣ）の象牙質（白色アスタリスク）の特徴を示す。（Ｅ）コントロールの歯周組織の組織構造に比べて、（Ｇ）Ａｌｐｌ−／−マウスは、無細胞セメント質（ＡＣ）を示さず、歯槽骨類骨は、ＰＤＬ間隙に浸潤し、骨−歯強直を生じる（アスタリスク）。（Ｃ，Ｈ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、大臼歯の高さ、象牙質の厚さ、および骨石灰化の改善されたＸ線検査の外観を示すが、切歯は不完全なままである。（Ｉ）組織学的に、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、無細胞セメント質を歯根表面まで回復しない。（Ｊ，Ｌ）ｐ５３におけるコントロールに比べて、（Ｋ，Ｍ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、大臼歯周辺の歯槽骨石灰化の減少を示す。大臼歯の形状および石灰化は、処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおいて比較的正常であるようであるが、切歯は、歯根類似体に重度に影響されたままである（白色アスタリスク）。（Ｎ）ＷＴコントロール大臼歯の組織構造に比べて、（Ｐ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、石灰化された歯槽骨および類骨の混合物（アスタリスク）、ならびに減少したが維持されたＰＤＬ間隙の特徴を示す。不十分な歯周組織の付着は、セメント質の欠如、ＰＤＬ組織崩壊および脱離、ならびに付着上皮の下方成長によって証明される。歯へのＰＤＬ付着の小領域（山形領域）が確認された。偏光下においてピクロシリウスによって示されるコントロール組織（Ｏ）におけるＰＤＬコラーゲン線維の強固で平行な組織に比べて、（Ｑ）ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、あまり組織化されていないＰＤＬを備えるが、組織および付着の領域は、歯根付着のブレイクスルー領域に隣接して存在する（白色山形領域）。 ＲｅｃＡＰ処置は、ヒト近位尿細管上皮細胞（ｃｉＰＴＥＣ）におけるＬＰＳ誘導サイトカイン産生を減弱する。ｃｉＰＴＥＣは、ｒｅｃＡＰによって前処置（１−５−１０ Ｕ／ｍｌ）され、続いて２４時間にわたってＬＰＳ誘導（１０μｇ／ｍｌ）され、続いて（Ａ）ｑＰＣＲ（１０Ｕ／ｍｌ ｒｅｃＡＰ）によって細胞内の遺伝子レベル、および（Ｂ）ＥＬＩＳＡによって上清のタンパク質レベルでＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８産生が測定された。（Ｃ）ｒｅｃＡＰ（１０Ｕ／ｍｌ）は、ＬＰＳ曝露の２時間前、ＬＰＳと同時に、またはＬＰＳ曝露の２時間後に投与され、続いてＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８タンパク質含有量が測定された。（Ｄ）ｃｉＰＴＥＣは、加水分解特性を欠く不活性ＡＰを用いて２時間にわたって前処置され、続いて２４時間にわたってＬＰＳ培養（１０μｇ／ｍｌ）され、その後、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８タンパク質含有量が測定された。コントロール細胞は、培養培地で培養された。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）、♯ コントロールに比べてｐ＜０．０５、＊ ＬＰＳに比べてｐ＜０．０５として表わされる。 ｒｅｃＡＰの効果は、ＬＰＳ誘導炎症に制限されず、腎臓特異的である。ｃｉＰＴＥＣは、ｒｅｃＡＰ（１０Ｕ／ｍｌ）を用いて２時間にわたって前処理され、続いて（Ａ）ＴＮＥ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、または（Ｂ）ＬＰＳ刺激された末梢血単核球の上清（ＰＢＭＣｓ、１ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ）を用いて２４時間にわたって培養され、その後ＥＬＩＳＡによってＩＬ−６およびＩＬ−８産生が測定された。（Ｃ）ＰＢＭＣｓは、ｒｅｃＡＰ（１０Ｕ／ｍｌ）で２時間にわたって予め培養され、続いて２４時間にわたってＬＰＳ曝露（１ｎｇ／ｍｌ）された。ＩＬ−６およびＴＮＦ−α産生は、ＥＬＩＳＡによって測定された。コントロール細胞は、培養培地を用いて培養された。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）、♯ コントロールに比べてｐ＜０．０５、＊ ＬＰＳに比べてｐ＜０．０５として表わされている。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＰＳ誘導されたＡＴＰ放出におけるｒｅｃＡＰの効果。ｃｉＰＴＥＣは、ｒｅｃＡＰ（１０Ｕ／ｍｌ）を用いて前処置され、ＬＰＳ誘導された（１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ）。３０分後、上清は、バイオルミネッセンスによって細胞性ＡＴＰ放出を測定するために集められた。コントロール細胞は、培養培地で培養された。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５）、♯ コントロールに比べてｐ＜０．０５として表わされる。 ＲｅｃＡＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腎機能のＬＰＳ誘導劣化を妨げる。腎機能は、ＦＩＴＣ−シニストリン ｔ１／２の経皮測定によって評価された。ＡＫＩは、ＬＰＳによってラットにおいて誘導され（０．３ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．、ｔ＝０）、続いてｔ＝２においてｒｅｃＡＰ処置（１０００Ｕ／ｋｇ ｂ．ｗ．）された。Ｔ１／２測定は、ｔ＝２時間、およびｔ＝２１．５時間において測定された（Ａ，Ｂ：２つそれぞれの時点における１匹のラットについて得られたＦＩＴＣ−シニストリン動態の例）。尿は、ｔ＝５とｔ＝１６との間で集められ、血漿は、ｔ＝１．５およびｔ＝２４時間において採取され、（Ｃ）分画尿素抽出物と、（Ｄ）ｔ＝１．５およびｔ＝２４の平均血漿値を有するクレアチニンクリアランスとが算出された。データは、平均値±ＳＥＭ（プラセボ、ＬＰＳ ｎ＝６；ＬＰＳ＋ｒｅｃＡＰ ｎ＝５）、♯ プラセボに比べてｐ＜０．０５として表わされる。 ｒｅｃＡＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＬＰＳ誘導ＡＫＩの間における腎障害を妨げる。（Ａ）尿中のＫＩＭ−１排出量、および（Ｂ）ＮＧＡＬ排出量、（Ｃ）血漿ＮＧＡＬレベル（ｔ＝２４）、ならびに（Ｄ）腎臓ＫＩＭ−１タンパク質含有量は、ＥＬＩＳＡによって測定された。（Ｅ）パラフィン腎臓切片は、抗ＫＩＭ−１で染色され、ＫＩＭ−１タンパク質発現を可視化した。スケールバー：４００μｍ（左パネル）、２００μｍ（右パネル）データは、平均値±ＳＥＭ（プラセボ、ＬＰＳ ｎ＝６；ＬＰＳ＋ｒｅｃＡＰ ｎ＝５；尿パラメータ：プラセボ ｎ＝５）、♯ プラセボに比べてｐ＜０．０５として表わされている。 上清におけるＬＰＳ誘導サイトカインについてｒｅｃＡＰは、効果を示さない。２４時間ＬＰＳ培養（１０μｇ／ｍｌ）された、または培地培養（コントロール）ｃｉＰＴＥＣの上清は、集められ、ｒｅｃＡＰ（１０Ｕ／ｍｌ）の有無でさらに２４時間にわたって培養され、ＥＬＩＳＡによって、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８を測定された。データは、平均値±ＳＥＭ、♯ コントロールに比べてｐ＜０．０５、＊ ＬＰＳに比べてｐ＜０．０５として表わされている。 ２５℃および３７℃におけるヒト血清中のＲｅｃＡＰの酵素活性の相関関係。 ２５℃および３７℃におけるヒト血清中のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの酵素活性の相関関係。 図２０は、ＲｅｃＡＰおよびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰについて、２５℃および３７℃における活性／μｇタンパク質を示す。値は、所定のタンパク質濃度について２５℃と３７℃との間の平均Δ活性を表す。
実施例１
緩衝液におけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの安定性
材料：
ヒト組換えアルカリホスファターゼ：
１．ｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ−ＣＤ （配列番号４） （ＤＯＭ：０４−Ａｕｇ−２００８）
２．ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ （配列番号１） （ＤＯＭ：１４−Ｏｃｔ−２０１１）
方法
亜鉛欠乏
ヒト組換えアルカリホスファターゼバッチの酵素活性およびタンパク質含有量の双方が測定された。続いて、１００μｇ／ｍＬタンパク質溶液が各条件について作製され、表２に概説されるようにｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ−ＣＤ、およびＬＶＬ−ｒｅｃＡＰバッチについて亜鉛欠乏が測定された。作製された試料は、室温で保存され、Ｔ＝０、Ｔ＝２時間、およびＴ＝２４時間において酵素活性を分析した。
酵素活性の測定は、ＳＯＰ ＰＣ００１に示されるような標準の手順に従った。
タンパク質濃度は、ＯＤ２８０測定によって測定された（εｒｅｃＡＰ １．０１ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ ＯＤ２８０）。
結果
表３に明確に示されるように、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、金属キレート剤（ＥＤＴＡ）の存在下において、ｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ ＣＤよりも顕著に安定であり（すなわち、残存するより高い酵素活性；アスタリスクを付された値によって示される）、その活性に関するＺｎ２＋の依存性は低いことを示唆している。
実施例２
緩衝液中におけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの安定性
材料：
ヒト組換えアルカリホスファターゼ：
１．ｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ−ＣＤ （ＤＯＭ： ０４−Ａｕｇ−２００８）
２．ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ （ＤＯＭ：１４−Ｏｃｔ−２０１１）
方法
第２の独立実験において、ｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ−ＣＤおよびＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの安定性は、表４に概説されたようないくつかの条件について試験された。
この実験における両方の組換えＡＰバッチについて、０．０２５Ｍグリシン緩衝液 ｐＨ９．６における１００μｇ／ｍＬタンパク質溶液、ヒト血清、およびヒトクエン酸血漿が、各緩衝条件について作製され、安定性を測定された。
全ての作製された組換えＡＰ試料は、３７℃で培養され、Ｔ＝０、Ｔ＝０．５時間、Ｔ＝１時間、Ｔ＝２時間、およびＴ＝２４時間において酵素活性を分析した。
結果
酵素活性の測定は、ＳＯＰ ＰＣ００１に従って行われた。
タンパク質濃度は、ＯＤ２８０測定によって測定された（εｒｅｃＡＰ １．０１ｍＬ／ｍｇ／ｃｍ ＯＤ２８０）。
表５に明確に示されるように、表３の結果と一致して、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、金属キレート剤（ＥＤＴＡ）の存在下においてｓＡＬＰＩ−ＡＬＰＰ ＣＤよりも顕著により安定であり（アスタリスクを有する値によって示されるように）、その活性に関するＺｎ２＋の依存性が低いことを示唆している。
実施例３
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの熱的安定性、およびＰＬＰ動態
方法
タンパク質発現
分泌された、ＦＬＡＧエピトープタグ化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ−ＣＤ、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを含む発現プラスミドは、以前に記載されたように行われた（Kozlenkov et al. J Biol Chem 277, 22992-22999 (2002) and Kozlenkov et al. J. Bone Miner. Res. 19, 1862-1872 (2004)）。ＦＬＡＧ−タグ化酵素は、ＣＯＳ−１細胞に一過的にトランスフェクトされ、以前に記載されたように（Narisawa et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, G1068-1077 (2007)）、培地が無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Life Technologies社）で置換されたとき、続いてＤＭＥＭ培地において２４時間増殖された。分泌タンパク質を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭは、トランスフェクションの６０時間後に集められ、続いて２μｍのセルロースアセテートフィルタを通して濾過され、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０μＭ ＺｎＣｌ２を含むＴＢＳに対して透析された。
酵素反応速度
ＦＬＡＧタグ化酵素の相対的酵素活性を測定するために、マイクロタイタープレートは、０．２〜０．６μｇ ｍＬ−１において抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で被覆された（Sigma-Aldrich社）。これらのプレートは、ＦＬＡＧタグ化ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ、またはｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの飽和濃度で室温において３時間にわたってインキュベートされ、その後、プレートは、０．００８％ Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳを用いて洗浄され、ＰＬＰについての相対的活性は、Ｍ２飽和された酵素と比較された。物理的基質ピリドキサール−５’−リン酸塩（ＰＬＰ）（Sigma-Aldrich社）の加水分解は、標準的アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２０μＭ ＺｎＣｌ２）中で、ｐＨ７．４において測定された。放出されたホスファターゼの濃度は、Ｐｉカラーロックゴールド（Innova Bioscienses社）を用いて６５０ｎｍ（Ａ６５０）における吸光度を測定することによって測定された。リン酸塩の濃度増加についての検量線は、０〜５０μＭの間で直線であり、全ての実験は、加水分解されたリン酸塩濃度のこの範囲内に入るように計画された。［Ｐｉ］ｓ−１として表わされるモル反応速度は、示された基質濃度範囲について計算され、１つの結合部位モデル（GraphPad Prism）対［基質］に合わされ、Ｋｍが算出された（ラインウィーバーバークプロットは、非常に低い基質濃度における相反する転換の精度が欠如しているので適用されなかった）。
４００μＭのＰＬＰの基質濃度が使用された。溶解可能な酵素濃度は、約１ｎＭであり、インキュベーション時間は、１５〜３０分間であり、各酵素の触媒効率によって決定された。定常状態を確保し、Ｐｉカラーロックゴールド法における非特的基質シグナルを修正するために、早期の読み取り値（５分の時点）を、後の読み取り値から減算し、ΔＡ６５０を、対応するＰｉ標準曲線上で測定して、各実験ごとに個別に構築した。全ての実験は、３〜５回行われ、得られた定数は、平均±ＳＤとして記載された。
熱安定性を測定するために、ＦＬＡＧタグ化酵素は、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０μＭ ＺｎＣｌ２を含む１Ｍ ＤＥＡ（ｐＨ９．８）中において６５℃でインキュベートされた。試料は、異なる時点で除去され、氷上に静置され、続いて残効性が、ｐＮＰＰを用い、以下の方法を用いて測定された。結合酵素の活性が、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０μＭ ＺｎＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ中でｐＮＰＰ（１０ｍＭ）を基質として用いて、ｐＨ７．４において２５℃における時間の関数として４０５ｎｍ（Ａ４０５）における吸光度として測定された。酵素は、この緩衝液中において高温（２５〜１００℃）で１０分間インキュベートされ、残効性が、同様に測定された。
結果
ＦＬＡＧタグ化酵素の作製
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの動態特性をｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰと比較するために、ＰＬＡＰおよびＴＮＡＰの比較研究について以前に行われたように、ＦＬＡＧタグ化配列が双方のｃＤＮＡに付加された。ｃＤＮＡが、ＣＯＳ−１細胞において発現され、分泌酵素を含む培養上清が回収された。連続的な発現、および回収は、抗ＦＬＡＧ抗体ウエスタンブロット解析によって確かめられた。
生理学的基質を用いる動態パラメータ
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ、およびｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰのリン酸加水分解酵素特性は、炎症と癲癇とを関係付ける生理学的基質、特に、ビタミンＢ６ビタマーＰＬＰについて調べられた。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、生理的ｐＨ（７．４）において、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰよりも低いＫｍを示し（３０．１μＭ 対 ６０．７μＭ）、改良されたＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、生理的ｐＨにおいてｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰよりもＰＬＰについて高い親和性を有することを示す。
酵素安定性
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰにおけるアミノ酸変異が酵素の全体的な安定性にもたらす影響は、熱失活試験によって調べられた。ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰは、既に高度に改良された耐熱性（７７．８℃において５０％不活性化）を有するが、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、さらに熱不活性化に対する抵抗性が高い（８０．６℃において５０％不活性化）。
実施例４
ラットにおけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの薬物動態的分布
Ａパート ヨウ素１２５を用いる放射標識
ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ−ＣＤタンパク質、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰタンパク質は、Greenwoodら*によって記載されたクロラミンＴ法を用いてヨウ素１２５で放射標識された。標識化の原理は、ヨウ素を原子ヨウ素への「ｉｎ ｓｉｔｕ」酸化、およびチロシン残基の水酸基のオルト位置におけるフェノール環へのその求核置換に基づく。ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰタンパク質は、〜０．５ｍＣｉ／ｍｇの最終比活性と、〜１ｍｇ／ｍＬ（ＮａＣｌ ０．９％）最終濃度を得るために、クロラミンＴ法を用いて放射ヨウ素標識された。
* F.C Greenwood, V.M Hunter, H.G Glover, The preparation of 131Ilabelled growth hormone of high specific radioactivity, Biochem. J.89 (1963) 114-123
Ａ．１ 材料
ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰアルカリホスファターゼ（４９６．７Ｕ／ｍｇ）、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（６２４Ｕ／ｍｇ）は、２５％グリセロールｗ／ｖ，５ｍＭ Ｔｒｉｓ，２ｍＭ ＭｇＣｌ２，５０μＭ ＺｎＣｌ２，ｐＨ８．０中において、６．３４ｍｇ／ｍＬ濃度でAM-Pharma社によって提供された。ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰタンパク質、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰタンパク質は、４℃で保存された。
ヨウ素１２５放射性核種は、１０−５Ｎ水酸化ナトリウムにおけるヨウ化ナトリウムとしてPerkin Elmer社から購入された（比活性：６４３．８ ＧＢｑ／ｍｇ 放射性核種純度：９９．９５％）。
クロラミンＴ（Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホアミド、ＭＷ２２７．６ｇ／ｍｏｌ）、トリクロロ酢酸、二亜硫酸ナトリウム（ＭＷ １９０．１ｇ／ｍｏｌ）、およびチロシンは、Sigma社から購入された。
Ｔｒｉｓ緩衝液５ｍＭ ｐＨ８は、Chelatec研究室において作製された。０．９％ＮａＣｌは、Versol（登録商標）社によって提供された。
Ａ．２ 方法
８５０μｇのタンパク質、約６００μＣｉのＮａ１２５Ｉ、５０μＬのＴｒｉｓ緩衝液、および１０μＬのクロラミンＴ（４０４．８ｎｍｏｌ、５０当量／タンパク質）は、１．５ｍＬのＬｏ−結合エッペンドルフチューブに連続的に添加された。室温において１分間撹拌されて反応させた。２μＬの放射標識化培地は、５％ＭＢＳ溶液に混合され、放射線標識化効率は、１０％ＴＣＡを溶出液として用いるインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）によって評価された（ストリップの底部においてアルカリホスファターゼが、およびストリップの上部で遊離の１２５−ヨウ素が溶出する）。３０μＬのチロシン溶液（水中で１０ｍｇ／ｍＬ）を未精製混合物に添加した後、ヨウ素化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ、およびヨウ素化ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、０．９％ＮａＣｌを用いて溶出されるゲル濾過（Ｇ１０、GE Healthcare社）によって精製された。０．２ｍＬの画分は、試験管に集められた。各画分の放射活性は、ヨウ素１２５放射性核種に較正された自動ガンマカウンター（Wallace Wizard 2470 Perkin Elmer社）で測定された。所望の放射ヨウ素標識製品を含む画分が貯えられた。
放射標識化化合物の放射化学的純度は、ＩＴＬＣによって検証された。
Ａ．３ 放射標識化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰタンパク質の結果、および特性
ＩＴＬＣによって測定された放射標識の効率は、双方のタンパク質について８５％を超えるものであった。Ｇ１０精製後、標識化反応の放射性純度は、双方のタンパク質について９７％を超えるものであった。
Ｇ１０精製後の放射標識化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ溶液の特性は、表６にまとめられている。
Ａ．４ アルカリホスファターゼ活性
放射標識化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの酵素活性は、ＥＬＩＳＡによって評価された。
材料
アルカリホスファターゼ比色分析キット（参照 ａｂ８３３６９ バッチ番号：ＧＲ１１８１６６−３）
０．９％ＮａＣｌ中において０．２５ｍｇ／ｍＬで希釈された未標識組換えヒトアルカリホスファターゼ
０．９％ＮａＣｌ中において０．２５ｍｇ／ｍＬで希釈された放射標識化組換えヒトアルカリホスファターゼ
プロトコール
Abcam社のキットは、ＡＰによって脱リン酸化されたときに黄色（ラムダマックス＝４０５ｎｍ）に変わるホスファターゼ基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を使用している。キットは、試料中の１０〜２５０μＵ ＡＰを検出することが可能である。アルカリホスファターゼ比色分析アッセイは、未標識、および放射標識化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰにおいて実施された。アッセイは、Abcam社によって提供されるプロトコールに記載されたように実施された。
要約すると、標準曲線は、ｐＮＰＰ標準物質の０〜２０ｎｍｏｌ／ウェルから作成された（最終体積：１２０μＬ）。１０μＬのＡＰ酵素溶液は、各ウェルに添加された。平行して、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ試験試料は、アッセイ緩衝液中で１５０００および８０００倍に希釈された。１０および２０μＬの各希釈液が添加され、最終体積は、アッセイ緩衝液によって８０μＬとされた。続いて、５０μＬのｐＮＰＰ溶液が、試験試料を含む各ウェルに添加された。標準物質、および試料反応物は、暗所にて２５℃で６０分間インキュベートされた。全ての反応は、２０μＬの停止液を用いて停止された。４０５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．は、マイクロプレートリーダにおいて測定された。ｐＮＰ標準曲線が、作成された。試料の読み取り値は、標準曲線に適用され、ＡＰ試料によって生じたｐＮＰ量を得た。試験試料のＡＰ活性は、算出することが可能である。
ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ活性（Ｕ／ｍＬ）＝Ａ／Ｖ／Ｔ×試験試料の希釈係数
Ａ：試料によって生じたｐＮＰ量（μｍｏｌ）
Ｖ：アッセイウェルに添加される試料の体積（ｍＬ）
Ｔ：反応時間（分）
ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ活性（Ｕ／ｍｇ）＝ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ活性（Ｕ／ｍＬ）／ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの濃度（ｍｇ／ｍＬ）
結果
表７は、結果をまとめたものである。
未標識および放射標識化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの酵素活性は、同様であり、約４７５Ｕ／ｍｇである。したがって、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの活性は、クロラミンＴを酸化剤として使用する放射ヨウ素標識によって弱められない。
Ｂパート：健常ラットにおける１２５Ｉ−ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰタンパク質の生体内分布試験
Ｂ．１ 材料
本試験において使用されたラット系統の特徴を以下に示す。
種 ：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット
系統 ：Ｃｒｌ ＣＤ（登録商標）（ＳＤ）ＩＧＳ ＢＲ
供給源 ：Ｃｈａｒｌｅｓ ＲＩｖｅｒ社 フランス
匹数、および性別 ：雄１５匹
体重範囲／週齢 ：試験開始時点において約２５０ｇ
環境順化期間 ：処置前５日間
識別方法 ：群によるケージ識別（屠殺時）
動物の管理
管理 ：ラットは、処置前に動物施設において飼育され、処置後に放射能室において飼育された。
飼料 ：無料のラット飼料。処置前の絶食期間なし。
水 ：水道水をポリウレタンボトルによって自由に与えた。
飼育 ：処置前に、動物は、標準的な条件でポリカーボネートケージに３匹の群で飼育され、試験番号、動物番号、性別、試験開始、および終了の日付を示すカードによって識別された。排出バランスについて指定された動物は、処置後に代謝用ケージに移された（ケージ毎に１匹）。
環境 ：気温は、毎日記録された。室温は、２２〜２４℃であった。人為的な照射サイクルを、自動タイマーを用いて制御した（１０時間照射、１４時間闇）
人員 ：関与する仲間を、適宜選抜し、訓練した。
選別 ：動物は、試験管理者によって受領したときに試験された。健康な動物のみが選択された。動物における炎症反応の任意の徴候（たとえば、腫瘍、皮膚炎など）について特に注意を払った。
Ｂ．２ １２５Ｉ−ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ、および１２５Ｉ−ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの投与溶液
ヨウ化ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰ、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ溶液は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の直前に０．９％ＮａＣｌ中において０．２５ｍｇ／ｍＬで希釈された。
Ｂ．３ 試験計画
試験計画は、表８および９に示される。
Ｂ．４ 投与
実験の時点において、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの平均体重は、約２４０ｇであった。無麻酔のラットは、ラット毎に９６μｇのタンパク質量と、ラット毎に約５８μＣｉの活性とに対応する４００μｇ／ｋｇの投与量で外側尾静脈（左側）に静脈内注射された。注入量は、約３８０μＬであった。個々の投与量は、処置の日における各ラットの個々の体重を用いて算出された。ラットは、競合装置に置かれた。尾部の血管を拡張するために、尾部は、温かい水（４５℃）に浸され、続いてアルコールで殺菌された。投与溶液は、尾静脈にゆっくりと注入された。各ラットが受けた実際の投与量を算出するために、注射器は、処置の前後で計量され、投与溶液の一定分量がガンマカウンターで計測された。
Ｂ．５ 様々な器官における分布
屠殺時において、動物は、ケタミン塩酸塩（５０ｍｇ／ｍＬ）とキシラジン塩酸塩（２０ｍｇ／ｍＬ）との混合物の２．５ｍＬ／ｋｇ体重の腹腔内注射によって麻酔された。ラットは、続いて、心臓穿刺による失血によって迅速に屠殺された。標的の器官は、摘出され、肝臓、胃、小腸、および大腸などの、２ｇを超える小片に切断された。各片は、その後、柔らかいティシュペーパーで水分をふき取られる前に生理的血清で洗われ、別々に計量され、計数された。選択された器官は、肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓、骨格筋、大腿骨、脳、甲状腺、胃、内容物を含む小腸、内容物を含む大腸、皮膚、および腎臓周囲の脂肪である。
組織の放射活性の計測は、ヨウ素−１２５放射線核種について較正された（効率：７４％ 計測時間：１０秒）自動ガンマカウンター（Wallace Wizard 2470 Perkin Elmer社）において行われた。
器官／組織における放射活性の濃度は、組織のグラム毎の注入された投与量の百分率として表わされる。データ分析は、注入された投与量の百分率（％ＩＤ）と、器官または組織毎のタンパク質の当量とを含む。詳細に明らかにされた器官について、これらは、器官全体において計側された放射活性を用いて算出された。血液については、このことは、血液が、全体重の６．４％を占めることを仮定して行った。
また、組織に残った放射活性と、血液中の放射活性との間の割合が計算された（割合 器官／血液）。最後に、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの器官／血液比、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの器官／血液の割合との間の割合が計算された（図２）。
Ｂ．６ ラット血液および血清における分布
血液および血清の放射活性レベル
屠殺の時点において、血液試料は、ＰＢＳ中におけるケタミン塩酸塩とキシラジン塩酸塩との混合物の腹腔内注入によって麻酔されたラットの心臓内穿刺による全採血から得られた。
試験計画において示される他の時点（表８および９）において、血液は、麻酔なしで２３ゲージのバタフライニードルを用いて外側尾静脈（右側）から抜き取られた。各血液試料は、凝結活性化剤を有する予め計量されたMicrovetteチューブに集められた（Sarstedt社）。
血液試料は、３０分間にわたって室温においてインキュベートされ、続いて、それらは、５分間にわたって１００００ｇで遠心され、血清を作製した。血清は、予め計量されたチューブに集められ、ガンマカウンターにおいて計側された。
血中および血清における放射活性濃度は、１ｍＬあたりの、注入量とｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの当量との割合として表わされる。
データ分析は、全血液および血清について注入され計算された百分率を含む。
表１０および１１は、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰおよびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの血清放射活性に関してそれぞれ異なる器官において測定された放射活性の割合を示す。図２は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの器官／血液の割合と、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰの器官／血液の割合との割合を示す。２の割合は、たとえば、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰが、ｓＡＬＰＩ−ＰＬＡＰとして示される器官に２回標的とされている。さらにまた、同一の投与量が使用されるとき、より高い割合は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの相対的にさらに高い活性が、特定の器官に見出されることを示している。
実施例５
幼児型低ホスファターゼ症のＡｋｐ２−／−マウスモデル
幼児型低ホスファターゼ症Ａｋｐ２−／−マウスモデルは、当該技術分野において公知である（J Dent Res 90(4):470-476, 2011）。簡潔に述べると、Ａｋｐ２−／−マウスは、検出可能なＴＮＡＬＰｍＲＮＡまたはタンパク質をもたらさない、機能的に不活性化されたＡｋｐ２遺伝子への相同組換えによって、マウスＴＮＡＬＰ遺伝子（Ａｋｐ２）のエクソン６にＮｅｏカセットの挿入によって作製された。動物の使用、および組織の摘出方法は、サンフォード・バーナム医学研究所動物倫理委員会の承認された手順に従った。動物は、ベヒクル（Ｎ＝１０）、１ｍｇ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日（Ｎ＝１０）、８ｍｇ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日（Ｎ＝８）、または１６ｍｇ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ／ｋｇ／日（Ｎ＝１０）で処置された。生存期間が測定され、骨格の発達が評価された。腎臓の石灰化が評価された。ＰＰｉ、血漿ピリドキサール、血漿カルシウム、およびリン酸塩レベルが測定され、異なる処置群について大腿骨および／または脛骨の長さが、測定された。マイクロＣＴデータは、各投与量で残余の過類骨症の分析について集められた。
結果
向上した長期生存期間 １６ｍｇ／ｋｇ／日において処置された（図３）。
最も高い投与量でさえ、長骨において骨格異常の（不完全な）レスキューが存在した（データは示されていない）。
歯の表現型においていくらかの回復が認められた（データは示されていない）。
頭蓋縫合早期癒合症の回復があると思われる（データは示されていない。以後確認される）。
腎臓の働きは、継続している。未処置マウスの腎臓におけるミネラルの徴候、および処置マウスの腎臓におけるミネラルの低下が認められた（データは、示されていない）。
実施例６
ブタ腎臓モデルにおける虚血再灌流
材料、および方法
ベヒクル、コントロール、および試験品情報
コントロール、および試験品の作製
新鮮なコントロール品、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ希釈液（プラセボ）は、各投与量の投与に先だって試験における使用のために作製され、使用されないときは２〜８℃で冷蔵保存された。
試験品、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、受理されたとおりのもので使用された。試験品製剤を製造する際に、純度の調製はなされなかった。試験品の製剤は、無菌の生理食塩水の適切な体積と混合することによって作製され、０、０．９６、または４．８ｍｇ／ｍｌの公称濃度を達成した。製剤は、無菌装置、および無菌技術を用いて層流ドラフト中で各投与量の投与に先立って作製された。製剤は、適切な数のアンバーガラス血清ボトルに分注され、使用前に氷上で保持され、作製の２時間以内に投与のために使用された。時折、追加の作製を試験期間中必要に応じてなされた。
投与する製剤の分析
集められ、０日目（群 ３〜７）、および７日目（群７）における製造の各日の投薬に先立って、最終投与製剤０．５ｍＬ試料が２回集められた。試料は、中央の層から集められ、起こり得る将来の分析のために凍結して（−５０〜−９０℃）保存された。
試験システム情報
動物の取得および順化
雄の実験的に天然のＤｏｍｅｓｔｉｃ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ交雑ブタ（農場ブタ）（約８〜１０週齢、受入時）は、Midwest Research Swine, Gibbon, Minnesotaから受け取った。１０〜２８日間の順化期間において、動物は、一般的な健康状態、および任意の疾患の徴候について毎日観察された。便試料における卵白アルブミン、および寄生虫の評価が行われ、全ての結果が、試験に採用された動物について陰性であった。
ランダム化、研究への割り当て、および維持
別個の単純なランダム化手順を用いて、動物（ランダム化において１２．５〜２５．０ｋｇ）を、以下の表１２で識別されるコントロール群、および処置群に割り当てた。
試験のために選択された動物は、できるだけ週齢、および体重において同一であった。獣医師が、動物の健康状態を、試験に用いられる前に評価した。試験について得られが、試験に用いられなかった余分の動物は、ストックコロニーに移された。
各動物は、Provantis（商標）データ収集システムにおいて使用される動物番号を付与され、固有の識別番号に関連付けられたマイクロチップを埋め込まれた。各動物は、売り主の耳票によって識別された。個々の動物番号、埋込番号、耳票番号、および試験番号は、各動物について固有に識別された。各ケージは、動物番号、試験番号、群番号、および性別によって識別された。
動物は、高床の囲った場所で、またはプラスチック被覆された床のステンレススチールの移動可能ケージにおいて個別に飼育された。この種類の収納場所は、これらの動物ための運動用の適切な空間を提供した。動物エンリッチメントは、ＭＰＩリサーチＳＯＰに従って提供された。蛍光照明は、１日あたり約１２時間提供された。暗サイクルは、活動に関する試験が原因で、断続的に中断された。温度、および湿度は、それぞれ、６１〜８１°Ｆ、および３０〜７０％の範囲に指摘されるプロトコール内で可能な最大まで、連続的に、観察、記録、および維持された。実際の温度、および湿度の知見は、報告されていないが、試験ファイルにおいて維持されている。飼料（Certified Lab Diet（登録商標）#5K99, PMI Nutrition International, Inc.）は、計画された期間を除いて、限定された知見を介して提供された。繊維ビット、または錠剤などの飼料濃縮物は、必要に応じて提供された。
手術手順
薬物療法に関する手順
以下の表１３は、薬物に関する手順、および試験の期間に使用される投与量レベルを示す。
手術前後の手順は、MPI Research社の標準作業手順書に従って行われた。動物は、手術の少なくとも８時間前に絶食させ、麻酔が導入され、表１３に示されるように維持された。体温は、３７±３℃に維持された。手術前に、超音波が行われ、腎嚢胞が存在するか否か測定された。嚢胞が観察されない場合、左腎が取り除かれ、右腎が以下に記載されるように処置された。嚢胞が１つの腎臓に存在する場合、その腎臓は除去され、反対側の腎臓が閉塞処置を受けた。嚢胞が両方の腎臓に存在する場合、動物は、手術を受けることなく、試験から取り除かれた。
手術手順
腎臓虚血／再灌流傷害は、Leeらによって公開された手順を用いて誘導された（J. Vet. Med. Sci 72(1): 127-130）。一度麻酔され、全ての動物は、背側横臥位に配置され、手術場所は、クロルヘキシジンスクラブおよび溶液で交互に拭き取り準備された。正中線開腹手術が行われ、両方の腎臓が暴露された。超音波所見に基づいて、左腎、または右腎が除去された。
第２群の動物（シャム）については、挿入されたラップスポンジは、続いて除去されて処分され、腹部は、温かい塩化ナトリウムで洗浄された。腹部は、通常の方法で閉じられ、皮膚は、皮膚ステープル、および組織接着剤を用いて閉じられた。動物は、続いて回復させた。
全ての他の動物について、指定の腎臓を除去した後、残った腎臓血管は、分離され、ベッセルループを用いて収縮された。ベッセルループは、４５（±１）分間にわたって血管を閉塞するために使用され、その後血管は、再灌流された。コントロールの静脈内大量投与、または試験物質は、再灌流の直前に０．３３３ｍＬ／ｋｇの投与量で投与された（半分の投与量０．１６７ｍＬ／ｋｇが、第７群動物に投与された）。全ての第１群、第５群、および第６群の動物について（コントロール、０．３２、および１．６ｍｇ／ｋｇ）、埋め込まれたラップスポンジは、続いて除去されて処分され、腹部は、上述のように、洗浄されて閉じられ、動物は、回復させられた。全ての第７群動物について（０．３２ｍｇ／ｋｇ／日）、切開が鼠径部になされ、左側、または右側大腿静脈が分離された。カテーテルを血管内に進入させ、皮膚の下を抜けて胸部に作られた切開部を通って露出させた。出入口は、付着され、非吸収性の縫合によって筋肉に固定された。埋め込まれたラップスポンジは、続いて除去されて処分され、腹部は、上述のように、洗浄されて閉じられ、動物は、回復させられた。
試験、またはコントロール品投与
０日目において、コントロール、または試験品は、それぞれ０、０．３２、および１．６ｍｇ／ｋｇの全投与量において再灌流する直前に、第１群、第５群、および第６群の全ての動物に静脈内に投与された。全ての投与量は、０．３３３ｍＬ／ｋｇの投与量で投与された。０日目において、試験品は、２つの別の半分の投与量０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．１６７ｍＬ／ｋｇの組み合わせた０．３２ｍｇ／ｋｇの投与量で、第７群の動物全てに静脈内に投与された。第１投与量は、再灌流の直前に投与され、第２投与量は、再灌流後、約８（±２）時間において投与された。０．３２ｍｇ／ｋｇ／日の全投与量（０．３３３ｍＬ／ｋｇ）を、１日目〜７日目に、最初の０日目とおおよそ同じ時間に（±２時間）第７群の動物全てに投与した。
統計
以下の表１４は、このセクションに記載された統計的分析において使用される比較の組み合わせを定義する。
生データは、各時間間隔内で表にされ、平均値および標準偏差は、各評価項目および各群について計算された。血清クレアチニン濃度について、処置群は、反復測定分析共分散（ＲＭＡＣＯＶＡ）を用いて参照群に比較された。
反復測定分析共分散（ＲＭＡＮＣＯＶＡ）
３点またはそれより多くの、試験後の時間間隔で測定された評価項目について、反復測定分析（混合モデル）が行われた。各評価項目について、前記モデルは、処置、時間、ならびに処置および時間の相互作用の効果について試験された。試験前データ（投与前の最後の測定値）は、共変数としてモデルに含まれた。
処置と時間との有意な（ｐ＞０．０５）相互作用がないときには、処置の主要な効果を評価した。処置の効果が有意ではない（ｐ＞０．０５）場合、結果は、有意でないと考えられ、変形例についてのさらなる分析は行わなかった。処置の効果が有意である（ｐ＜０．０５）場合、線型対比が、各処置群と参照群との対比較のために構成された。相互作用が有意である（ｐ＜０．０５）場合、各処置群は、各時点についての「処置」の単純な効果による適切な参照群との比較を行った。これらの単一効果の対比較は、「処置と時間との」相互作用から得られた。
全ての対比較の結果は、０．０５および０．０１有意水準において報告されている。試験はすべて、両側試験であった。
結果
血清クレアチニン
図４に示されるように、予備試験値と比較して、全ての期間において、軽度から中程度まで増加したクレアチニンがあった。クレアチニンは、再灌流後２４時間で最大に増加し、続いて後の期間にわたって徐々に減少する。クレアチニンの変化は、処置に伴う腎障害に続く糸球体濾過の低下に一致していた（データは示されていない）。大部分の投与群、および大部分の間隔において、試験品の投与は、クレアチニンの手順関連上昇を減弱させる傾向を有し、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの保護的効果を示す。図５において示されるように、予備試験値と比較して、再灌流後２４時間で試験品を受けるすべての処置群におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の投与量に依存する上昇があった。ＡＬＰ活性は、≦１．６ｍｇ／ｋｇを受けている処置群において徐々に減少したが、０．３２ｍｇ／ｋｇ／日を受けている動物において連続的に増加し続けた。
実施例７
ヒトにおける安全性試験
材料、および方法
目的：
健常な対象の静脈内（ｉ．ｖ．）注入によって投与された組換え改良アルカリホスファターゼ（ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ）の単回、および複数回の投与の安全性、および認容性を評価すること。 ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰを健常な対象に、単回および複数回ｉ．ｖ．注入した後の、ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの薬物動態（ＰＫ）を測定すること。
計画、および処置
これは、計画人数５０人の健康な対象における２部構成、単一施設試験である。Ａ部は、任意に抽出された、二重盲検の、プラセボ対照の、単回投与試験（ＳＡＤ）、８人の健康な男性および女性（６人のＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、および２人のプラセボ）を対象とするそれぞれ連続した４つまでの、群における研究である。試験は、各群ごとに最小で２人、最大で４人の女性とともに、等しい数の男性および女性の被験者を各処置群に含めるように行われる。ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、またはプラセボの単一用量は、１時間の静脈内注入によって投与される。パートＢは、９人の健康な男性および女性の各対象（６人は、ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、および３人はプラセボである）の最大２つの群における、ランダム化、二重盲検、プラセボ制御、反復投与試験（ＭＡＤ）である。等しい数の男性および女性の対象を各処置群に含めるように試みられる。対象は、１、３および５日目において、ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、またはプラセボの１時間静脈内注入を受ける。以下の処置が行われる。
パートＡ
第１群：２００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
第２群：５００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
第３群：１０００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
第４群：２０００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
パートＢ
第５群：第１、第２、および第３日目における５００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
第６群：第１、第２、および第３日目における１０００Ｕ／ｋｇ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰの１時間注入
Ａパートの、第１群の第９日目、および第２群の第４日目の終了後、中間ＰＫ評価が行われる。
結果に依存して、注入およびＰＫ採取計画は、残りのＳＡＤおよびＭＡＤ群に合わせて調整されてもよい。
このファーストインヒューマン試験において、パートＡ（第１群）における最も少ない投与量レベルで参加している対象は、最小のリスクを保証するセンチネル投与デザインに従って投与される。このことは、最初に２人の対象が投与を受けることを意味する。これらの対象の１人は、ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ活性薬物療法を受け、他の対象は、プラセボを受ける。最初の２４時間の安全性、および許容度の結果が主要研究者に受け入れ可能である場合、最も低い投与レベルの他の６人の対象は、プラセボ制御されたランダム化法（５人活性、および１人プラセボ）で投与される。
観察期間
Ａパート：−１日目から薬剤投与後４８時間（第３日目）まで。第４日目、第６日目、第９日目、および第１５日目に、短期外来患者が臨床試験センターを訪問。
Ｂパート：−１日目から最後の薬剤投与後４８時間（第７日目）まで。第８日目、第１０日目、第１３日目、および第１９日目に、短期外来患者が臨床研究センターを訪問。
対象は、試験の各群の（最初の）薬剤投与の３週間前までに適格性についてスクリーニングされる。
追跡試験は、第１５日目（パートＡ）、および第１９日目（パートＢ）において行われる。
対象
パートＡ：３２人の健康な男性および女性の対象
パートＢ：１８人の健康な男性および女性の対象
算入の主要判断基準
性別：男性または女性
年齢：１８〜５５歳、
ボディマス指数（ＢＭＩ）：１８．０〜３０．０ｋｇ／ｍ２、
薬剤試験
活性薬剤
活性物質：ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、内在性ヒトアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の改良された組換え型
活性：リン酸のモノエステルの脱リン酸化の原因となるヒドロラーゼ酵素
徴候：急性腎障害
強度：６００、１５００、３０００、および６０００Ｕ／ｍＬ
投与形態：静脈内注入
製造元：ＰＲＡ製薬
プラセボ
物質：２０ｍＭ クエン酸塩、２５０ｍＭ ソルビトール、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．０
活性：なし
徴候：該当なし
強度：該当なし
投与形態：静脈内注入
製造業者：Nova Laboratories社, Gloucester Crescent, Wigston, Leicester, LE18 4YL, UK
評価の判断基準
安全性：有害事象（ＡＥｓ）、バイタルサイン（仰臥位の収縮期、および拡張期血圧、脈拍、体温、呼吸数など）、１２−リード心電図（ＥＣＧ）、連続的心臓モニタリング（遠隔測定）、臨床検査室（臨床化学［ＡＰは、ＰＫパラメータと考えられる］、血液、および尿など）試験、身体検査、および抗薬剤抗体（ＡＤＡ）
薬物動態学：ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ、およびＡＰ活性の血清濃度分析に基づくＰＫパラメータ
結果
全ての投薬群への投与および観察時間は、終了し、重篤有害事象は、どの群にも観察されなかった。全てのパラメータの分析は、進行中である。
実施例８
材料および方法
マウス
Ａｌｐｌ−／−マウスの作製および特徴は、以前に報告された（Narisawa et al., 1997）。Ａｌｐｌ−／−マウスは、ＴＮＡＰの包括的な欠乏を含む幼児型ＨＰＰ、ＰＰｉ蓄積、および石灰化異常のフェノタイプを示す。ビタミンＢ６を伴う栄養素補充は、短時間で癲癇を抑制し、出生後１８日〜２２日まで生存期間を延ばすが、石灰化不全および類骨の蓄積は、加齢とともに悪化し続ける（Narisawa et al., 1997; Fedde et al., 1999; Narisawa et al., 2001; Millet al., 2008）。したがって、本試験における全ての動物（ブリーダー、看護母親、仔、および離乳仔）は、高レベル（３２５ｐｐｍ）のピリドキシンを含むlaboratory rodent diet 5001に自由にアクセスすることができた。遺伝子型判定は、以前に記載されたように（Yadav et al., 2011）、ゲノムＤＮＡにおいてＰＣＲによって行われた。動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）は、全ての動物実験を承認した。
可溶性キメラヒトアルカリホスファターゼ（ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ）
２５％グリセロールｗ／ｖ、５ｍＭ トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ ＺｎＣｌ２において１０．１ｍｇ／ｍｌのＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ溶液、ｐＨ ８．０が使用された。酵素は、高圧液体クロマトグラフィーによって測定された＞９９．９９％の純度を有していた。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いる用量反応試験
Ａｌｐｌ−／−マウスは、５つのコホートに分けられた。ベヒクル処置：Ａｌｐｌ−／−マウスは、ベヒクルのみで処置された（ｎ＝１４）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１：Ａｌｐｌ−／−マウスは、１ｍｇ／ｋｇ／日でＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いて処置された（ｎ＝１４）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８：Ａｌｐｌ−／−マウスは、８ｍｇ／ｋｇ／日でＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いて処置された（ｎ＝１２）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６：Ａｌｐｌ−／−マウスは、１６ｍｇ／ｋｇ／日でＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いて処置された（ｎ＝１０）。Ａｌｐｌ−／−マウスの野生型同腹仔は、参照動物として用いられ、注入を受けなかった（ｎ＝１４）。ベヒクル、またはＬＶＬ−ＲｅｃＡＰコホートは、毎日肩甲部に皮下注入された。注入薬は、ＡＭ８：００〜１１：００に投与された。投与された量は、注入前に測定された体重に基づいて計算された。全ての処置は、出生後１日から始まり、５３日目まで、または剖検時まで毎日繰り返された。
試料採取
剖検は、出生後５３日目（ｐ５３）、実験プロトコールを終了した動物についてＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの最後の注入後２４時間、または病状末期と考えられる動物に直ちに行われた。アベルチンは、安楽死の前に腹腔内に投与された。血液は、心臓穿刺によってリチウムヘパリンチューブに集められた。剖検は、肉眼所見試験、およびＸ線から構成された。
Ｘ線検査、およびマイクロトモグラフィー（μＣＴ）
骨格のＸ線撮影画像は、２０ｋＶのエネルギーを用いて、Faxitron MX-20 DC4 (Chicago, IL, USA)で得られた。片側下顎骨は、３０ｋＶでスキャンされた。
ｐ２１マウスから遊離された全ての頭蓋骨は固定され、続いてeXplore Locus SP イメージングシステム（GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada）を用いて１８μｍ 等方性ボクセル分解能でスキャンされた。測定値は、試料を１８０度プラス２０度の送風角度で回転させるパーカー法スキャン技術を用いて１６００ｍｓの暴露時間を用いて、８０ｋＶの作動電圧、および８０ｍＡの電流で取得された。スキャンは、ヒドロキシアパタイトファントムに較正され、３Ｄ画像は、１８μｍ３の有効ボクセルサイズで再構築された。１４００ハンスフィールドユニットの固定閾値が、石灰化組織を識別するために使用された。頭頂骨および前頭骨の関心領域（ＲＯＩ’ｓ）は、長さ１ｍｍ、幅１ｍｍ、骨の厚さに等しい深さ、ならびに矢状、および冠状縫合から０．７５ｍｍで始まる位置において、以前に記載されたように設定された（Liu et al., 2014）。骨の、体積、密度、および構造のパラメータは、Microview version 2.2 ソフトウェア（GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON）を用いて測定され、アルゴリズムを設定された（Meganck et al., 2009; Umoh et al., 2009)。スチューデントｔ検定は、遺伝型の間における統計学的に有意な相違を立証するために行われた。μＣＴの骨データは、分析され、Bouxseinら 2010 （Bouxsein et al., 2010）の推奨に従って報告されている。
歯科用画像について、切り出された片側下顎骨は、１０μｍのボクセルサイズにおいてScanco Medical 50（Scanco Medical AG, Bruettisellen, Switzerland）でスキャンされた。下顎骨のｚスタックは、ＤＩＣＯＭファイルとしてエクスポートされ、比較のために選択された切片の、冠状、矢状、および横断平面と同等のImageJソフトウェア（1.48r）を用いて再配置された。定量分析のために、下顎骨は、０．３６度回転段階（１８０度の角度範囲）と、ビュー毎に４００ｍｓ曝露とで、６μｍのボクセルサイズ、５５ＫＶｐ、１４５ｍＡにおいてScanco Medical 35でスキャンされた。Scanco ソフトウェア（HP, DECwindows Motif 1.6）は、３Ｄ再構築、および画像観察のために使用された。３Ｄ再構築後、歯冠、エナメル質、歯根、および歯槽骨の体積は、世界的な閾値０．６ｇ／ｃｃを用いて分割された。全体積（ＴＶ）、骨（石灰化組織）体積（ＢＶ）、および組織石灰化密度（ＴＭＤ）は、全歯冠について、ならびに分岐部領域におけるエナメル質、歯根象牙質、および歯槽骨について別個に測定された。エナメル質および歯根について、厚さも測定された。
組織学的分析
骨試料は洗浄され、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液生理食塩水中において３日間にわたって４℃で固定され、続いて７０％エタノールに移され４℃で保存された。プラスチック切片を以前に記載したように作製した（Yadav et al., 2012）。フォンコッサ、およびヴァンギーソンのトリクローム染色を、以前に記載されたように（Narisawa et al., 1997）プラスチック切片に行った。フォンコッサ、またはヴァンギーソン染色された切片は、ScanScopeXTシステム（Aperio社, Vista, CA, USA）によってスキャンされ、画像は、Bioquant Osteoソフトウェア（Bioquant Osteoanalysis社, Nashville, TN, USA）を用いることによって分析された。組織学に用いられた右側下顎骨は、以前に記載されたように（Foster, 2012）、ブアン固定液中で２４時間にわたって固定され、続いてＡＦＳ溶液（酢酸、ホルムアミド、塩化ナトリウム）中で鉱質除去され、連続切片作製のためにパラフィン中に包埋された。ピクロシリウスレッド染色のために、脱パラフィン化組織切片は、以前に記載されたように（Foster, 2012）、リンモリブデン酸水和物、０．４％ダイレクトレッド８０、および１．３％ ２，４，６−トリニトロフェノール（Polysciences社, Warrington, PA）の０．２％水溶液を用いて染色された。ピクロシリウスレッド染色された切片は、顕微鏡写真撮影のために偏光下で観察された。
バイオメカニカル試験
筋組織の除去後、大腿骨、脛骨、上腕骨、および橈骨の長さは、カリパスを用いて測定された。骨は、凍結され、脱水を回避するために生理食塩水を含むガーゼで包まれた。分離された大腿骨および脛骨は、以前に記載されたように（Huesa et al., 2011）、Instron 1101 万能材料試験機を用いて、３点屈曲試験で評価された。骨は、試験の前にゆっくり解凍され、室温で維持された。未処置の大腿骨および脛骨は、１５ｍｍの距離で離れた２つの支持体上の試験装置に置かれ、骨幹の中央に負荷が加えられ、このようにして２ｍｍ・ｍｉｎ−１の速度における３点屈曲試験を構築した。
ＰＰｉアッセイ
血漿におけるＰＰｉ濃度は、記載された（Hessle et al., 2002; Yadav et al., 2014)ように、反応産物６−ホスホ［６−３Ｈ］グルコネートからＵＤＰ−Ｄ−［６−３Ｈ］グルコース（Amersham Pharmacia社）の活性炭上の示差吸収によって測定された。
統計
異なる生存率をもたらすＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの異なる濃度を考慮して、年齢をマッチさせた方式で３つの処置コホートを比較することが可能である。この理由によって、スチューデントｔ不対パラメトリック、両側試験が行われ、処置されたＡｌｐｌ−／−マウスとＷＴコホートとを比較した。ｐ＜０．０５である場合、相違は、有意であると考えられる。処置コホート間の生存曲線における相違を比較するために、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定が行われた。
結果
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける生存期間および体重の増加
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの、８ｍｇ／ｋｇ／日（ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８）、または１６ｍｇ／ｋｇ／日（ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６）を受けたマウスにおける生存期間は、ベヒクル処置された、および１ｍｇ／ｋｇ／日（ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１）コホートに比べて有意に向上した（ｐ＝０．００１）（図６Ａ）。処置されたコホートの生存曲線を互いと比較したとき、相違は統計学的に有意であった（全ての比較について、ｐ＜０．０００１）。生存期間中央値は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１、およびベヒクル処置コホートにおいて、それぞれ４４日、２２日、および１９日であった。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートについて生存期間中央値は、算出されなかった。なぜなら、動物は、５３日目の実験終了まで生存したからである。Ａｌｐｌ−／−動物の重量は、ｐ７あたりから始まり、それらのＷＴ同腹仔よりも軽量である。１ｍｇ／ｋｇ／日のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いる処置は、ベヒクル処置マウスに比べて統計学的に有意な体重増加をもたらし、処置の１８日目においてＷＴ同腹仔に比べて有意でない相違をもたらした。Ａｌｐｌ−／−マウスは、ビタミンＢ６食餌におけるｐ１８〜２４で通常死亡し、したがって、より長く生存するＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８と、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートとの比較は不可能であり、これらは、代わりにＷＴマウスと比べられた。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８コホートの動物は、ｐ１８からそれらのＷＴ同腹仔よりも有意に軽量であった（図６Ｂ）が、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートにおけるマウスは、体重における標準化を示し、ｐ５３におけるＷＴマウスから区別されなかった（図６Ｂ）。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、Ａｌｐｌ−／−マウスの骨格表現型を向上する。
未処置のＡｌｐｌ−／−マウスのＸ線写真（図７Ａ）は、以前に記載されたように（Yadav et al., 2011)、低下した組織ミネラル密度、および骨折などの重度の骨格異常を示した。我々は、１８日間にわたって１ｍｇ／ｋｇ／日のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを受けたＡｌｐｌ−／−マウスにおいて骨格表現型が改善しており（図７Ａ）、利益は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８、およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートにおいてより顕著である（図７Ｂ）ことを見出した。四肢遠位部は、投与量に関わらず正常の形態を示したが、全ての処置コホートについて、脊椎、前肢、後肢、および胸郭において部分的な補正が観察された。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６マウスは、大腿骨および脛骨において、軽いクラックまたは骨折も示した。膝および肘の間接外形は、ｐ４４およびｐ５３において、それぞれＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６における不規則性を示した（図７）。
骨軟化症の改善の程度を評価するために、我々は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ−処置されたマウス、およびＷＴコントロールマウスの後肢のプラスチック包埋脱灰切片の組織形態計側的分析を行った（図８Ａおよび９Ａ）。我々は、骨および類骨体積を測定し（図８Ｂ、８Ｃ）、血清ＰＰｉレベルを分析した（図９Ｂ、９Ｃ）。初期の知見（Yadav et al., 2011）と一致して、フォンコッサ染色は、Ａｌｐｌ−／−マウスが、石灰化、薄い皮質骨、減少した海綿骨、および損傷した骨化中心において重度の異常を示すことを明らかにした（図８Ａ）が、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置された動物は、双方とも、顕著に、増加した皮質骨、および改善した二次骨化中心を示した。組織形態計側（図８Ｂ、８Ｃ）は、ＢＶ／ＴＶ割合（図８Ｂ）が、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートの双方において、同一齢のＷＴコントロールよりも顕著に低いままであることを明らかにした（０．０３２１、および０．０３０２、Ｎ＝９）が、ＯＶ／ＢＶ百分率（図８Ｃ）は、双方の処置コホートにおいて、ＷＴコントロールに比べて顕著に高かった（０．０００１および０．０１７５、Ｎ＝９）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置コホートの間の相違は、統計学的に有意ではなかった。後肢のプラスチック切片の組織学的なトリクローム染色（図９Ａ）によって、これらの知見が裏付けられた。Ａｌｐｌ−／−マウスは、類骨蓄積によって特徴付けられる皮質骨および海綿骨における欠損とともに、重度に減少した石灰化骨質量（緑染色領域）を有する。これに対して、５３日齢のＷＴコントロールは、二次骨化中心、および骨表面における少ない類骨中に、頑強な皮質骨、海綿骨を有する。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＲｅｃＡＰ１６コホートにおけるＡｌｐｌ−／−マウスは、特にＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートにおいて、皮質骨の有意な改善を示し、ＷＴマウスに比べて主な相違を示さなかった。Ａｌｐｌ−／−マウスにおける二次骨化中心における海綿骨形成は処置によって増加するが、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８およびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６マウスは、類骨の正常領域（赤色）よりも大きいままであった。骨格の知見と一致して、我々は、全ての処置コホートにおける血清ＰＰｉ濃度が補正されていることを見出した。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１動物（図９Ｂ）は、ベヒクル処置されたコントロール動物に比べて、有意に減少したＰＰｉレベルを有していると思われる。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置動物は、ＷＴ同腹仔と統計学的に区別することができないＰＰｉレベルを有する。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける顔面頭蓋奇形の欠如
Ａｌｐｌ−／−マウスは、顔面頭蓋形状異常、および冠状縫合融合の特徴を示す（Liu et al., 2014）。Ａｌｐｌ−／−マウスにおける処置によって影響を受ける顔面頭蓋骨格の範囲を測定するために、我々は、前頭骨および頭頂骨のμＣＴに基づく分析を行った。ｐ２１における結果は、ベヒクル処置Ａｌｐｌ−／−マウスの前頭骨および頭頂骨の双方において、ＷＴ、またはＡｌｐｌ−／−マウスに比べて、骨体積画分、骨塩量、骨密度、組織ミネラル含有量、および組織ミネラル密度が有意に減少したことを示す（表１５）。これに対して、処置されたＡｌｐｌ−／−マウスの前頭骨も頭頂骨も、野生型のものと有意に異なるものではなかった。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６処置されたＡｌｐｌ−／−マウスの成体頭蓋骨は、寸法および形状の点でＷＴと相違がないようであった。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、Ａｌｐｌ−／−の歯槽欠損を部分的に回復する。
マウスにおけるＡｌｐｌ遺伝子の除去は、ＨＰＰに罹患したヒト被験者の症例報告と一致して、セメント質、象牙質、歯槽骨、およびエナメル質における発育上のミネラル欠乏をもたらす（Foster et al., 2014a; Foster et al., 2014b; McKee et al. 2011; Yadav et al., 2012）。無細胞セメント質の欠如は、ＨＰＰの特徴である、歯根表面への歯根膜付着の損失、および未成熟な歯の脱落をもたらす。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ８処置された、およびベヒクル処置されたＡｌｐｌ−／−マウスは、大臼歯形成の完了近くに、ｐ２５〜２６のＷＴと比較された。Ｘ線検査、およびμＣＴ画像は、未処置のＡｌｐｌ−／−マウスの下顎骨が、コントロールに比べて（図１１Ａ、Ｄ）、全体的に石灰化不全の骨、薄い象牙質および広い髄腔の短い大臼歯、ならびに重度に欠損した切歯の特徴を示す（図１１Ｂ、Ｆ）。組織学的検査によって、Ａｌｐｌ−／−マウスの歯は、無細胞セメント質が無いことによって特徴付けられ、歯槽骨類骨は、歯根膜（ＰＤＬ）腔に侵潤し、強直、および機能的な歯根膜の損失をもたらす（図１１Ｇ 対 図１１Ｅ）。８ｍｇ／ｋｇ／日のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ投与は、ｐ２６における、大臼歯の高さ、象牙質の厚さ、および骨石灰化のＸ線検査の外観を改善するが、切歯は、欠損したままである（図１１Ｃ、Ｈ）。組織学的に、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰのこの投与量は、無細胞セメント質を回復しないが、大臼歯に付随するＰＤＬ腔と、歯槽縁は、良好に維持された（図１１Ｉ）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６コホートは、ｐ５０〜５３においてＷＴと比較され、成熟した歯の構造および機能における影響を判断された。Ｘ線検査およびμＣＴ画像は、Ａｌｐｌ−／−マウスの下顎骨における大臼歯周囲の、歯槽骨および隣接面の骨石灰化の低下を示した（図１１Ｊ〜Ｍ）。大臼歯の形状および象牙質は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６マウスにおいて大部分標準化されたように見え、このことは、第１大臼歯のμＣＴ分析によって確認された。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６群におけるエナメル質は、ＢＶ／ＴＶまたはＴＭＤにおいて、ＷＴと相違がなかった。大臼歯の歯冠および歯根は、ＷＴに比べて、ＢＶ／ＴＶおよびＴＭＤにおいて４〜１０％の、軽度であるが、有意な減少を示し、このことは、象牙質の石灰化が完全に回復しなかったことを意味し、歯根の厚さは、１５％減少した。歯槽骨の石灰化は、ＷＴに比べて、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６群においてより重度に欠損したままであり、ＢＶ／ＴＶは、２７％減少し、ＴＭＤは１３％減少した。処置されたＡｌｐｌ−／−マウスにおける切歯も、重度に影響を受けたままであった（図１１Ｋ，Ｍ）。 組織学的検査によって、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６マウスは、石灰化された歯槽骨および類骨の混合、ならびに低下したが、維持されたＰＤＬ腔の特徴を示した（図１１Ｎ，Ｐ）。ｐ５３までにＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ１６群において、歯の損失は確認されなかったが、セメント質の欠如、ＰＤＬ組織崩壊、および歯根表面からの脱離、ならびに付着上皮の成長鈍化によって証明されるように、歯周組織の付着は欠損したままであった。しかし、歯にＰＤＬが付着した小さな領域が、組織化されたＰＤＬ繊維と関連して確認され（図１１Ｏ，Ｑ）、このことは、大臼歯を保持するように機能し得るいくらかの易感染性付着の存在を示している。
実施例８についての参考文献
Anderson H.C., Sipe J.B., Hessle L., Dhanyamraju R., Atti E., Camacho N.P., MillJ.L. Impaired calcification around matrix vesicles of growth plate and bone in alkaline phosphatase-deficient mice. Am. J. Pathol. 2004;164(3):841-847.
Bouxsein ML, Boyd SK, Christiansen BA, Guldberg RE, Jepsen KJ and MR. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res 2010;25(7):1468-86.
Fedde KN, Blair L, Silverstein, J, Coburn SP, Ryan LM, Weinstein RS, Waymire K, Narisawa S, MillJL, MacGregor GR, Whyte MP, Alkaline phosphatase knockout mice recapitulate the metabolic and skeletal defects of infantile hypophosphatasia. J Bone Miner Res 1999; 14: 2015-2026.
Foster BL, Nagatomo KJ, Nociti FH, Fong H, Dunn D, Tran AB, Wang W, Narisawa S, MillJL, Somerman MJ 2012 Central role of pyrophosphate in acellular cementum formation. PLoS One 7(6):e38393.
Foster B.L., Nagatomo K.J., Tso H.W., Tran A.B., Nociti F.H., Jr., Narisawa S., Yadav M.C., McKee M.D., Millan J.I., Somerman M.J. Tooth root dentin mineralization defects in a mouse model of hypophosphatasia. J Bone Miner Res. 2013;28(2):271-82.
Foster BL, Nociti FH, Jr., Somerman MJ (2014a). The rachitic tooth. Endocr Rev 35(1):1-34.
Foster BL, Ramnitz MS, Gafni RI, Burke AB, Boyce AM, Lee JS et al. (2014b). Rare Bone Diseases and Their Dental, Oral, and Craniofacial Manifestations. J Dent Res 93(7 suppl):7S-19S.
Hessle L., Johnson K.A., Anderson H.C., Narisawa S., Sali A., Goding J.W., Terkeltaub R., MillJ.L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002;99(14):9445-9449.
Huesa C., Yadav M.C., FinnilM.A., Goodyear S.R., Robins S.P., Tanner K.E., Aspden R.M., MillJ.L., Farquharson C. PHOSPHO1 is essential for mechanically competent mineralization and the avoidance of spontaneous fractures. Bone. 2011;48(5):1066-1074.
Liu J, Nam HK, Campbell C, Gasque KC, MillJL, Hatch NE. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase deficiency causes abnormal craniofacial bone development in the Alpl(-/-) mouse model of infantile hypophosphatasia. Bone 2014;67:81-94.
McKee M.D., Nakano Y., Masica D.L., Gray J.J., Lemire I., Heft R., Whyte M.P., Crine P., MillJ.L. Enzyme replacement therapy prevents dental defects in a model of hypophosphatasia. J. Dent. Res. 2011;90(4):470-476.
Meganck JA, Kozloff KM, Thornton MM, Broski SM and Goldstein SA. Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone 2009;45(6):1104-1116.
MillJL, Narisawa S, Lemire I, Loisel TP, Boileau G, Leonard P, Gramatikova S, Terkeltaub R, Pleshko Camacho N, McKee MD, Crine P and Whyte MP, Enzyme replacement therapy for murine hypophosphatasia. J Bone Miner Res 2008; 23: 777-787.
Narisawa S, Wennberg C. MillJL, Abnormal vitamin B6 metabolism in alkaline phosphatase knock-out mice causes multiple abnormalities, but not the impaired bone mineralization. J Pathol 2001; 193: 125-133.
Narisawa S, FrN, MillJL, Inactivation of two mouse alkaline phosphatase genes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia. Dev Dyn 1997; 208: 432-446.
Umoh JU, Sampaio AV, Welch I, Pitelka V, Goldberg HA, Underhill TM et al. In vivo micro-CT analysis of bone remodeling in a rat calvarial defect model. Phys Med Biol 2009;54(7):2147-61.
Yadav M.C., Lemire I., Leonard P., Boileau G., Blond L., Beliveau M., Cory E., Sah R.L., Whyte M.P., Crine P., MillJ.L. Dose response of bone-targeted enzyme replacement for murine hypophosphatasia. Bone. 2011;49(2):250-256.
Yadav M.C., de Oliveira R.C., Foster B.L., Fong H., Cory E., Narisawa S., Sah R.L., Somerman M., Whyte M.P., MillJ.L. Enzyme replacement prevents enamel defects in hypophosphatasia mice. J. Bone Miner. Res. 2012;27(8):1722-1734.
Yadav, M. C., Huesa, C., Narisawa, S., Hoylaerts, M. F., Moreau, A., Farquharson, C. and MillJ. L. Ablation of osteopontin improves the skeletal phenotype of Phospho1-/- mice. J. Bone Miner. Res. In Press (2014).
実施例９
アルカリホスファターゼは、腎臓の炎症を防ぐ。
方法
細胞培養
通常、ｃｉＰＴＥＣは、３３℃で培養された（Wilmer, 2010）。細胞は、サルウイルス４０Ｔ抗原と、ヒトテロメラーゼの必須触媒サブユニットとともに遺伝子導入され、一定に増殖された。細胞は、ＩＴＳ（５μｇ／ｍｌ インスリン、５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ セレニウム；Sigma-Aldrich社, Zwijndrecht, The Netherlands）を追加した、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ／Ｈａｍ Ｆ−１２（Gibco社, Paisly, United Kingdom）において培養された。実験の前に、細胞をウェルプレートに播種した（４８４００細胞／ｃｍ２）、３３℃で１日間、続いて３７℃で７日目の成熟期まで培養した。実験の日、細胞は、２時間にわたってＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いて（１、５、または１０Ｕ／ｍｌ、AM-Pharma社, Bunnik, The Netherlandsから提供された）プレインキュベートされ（Kiffer-Moreira, 2014）、続いて１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４（HEPES: Roche Diagnostics社, Mannheim, Germany; HBSS: Gibco社）に溶解された１０μｇ／ｍｌ ＬＰＳを用いて２４時間にわたってインキュベートされた。また、１０Ｕ／ｍｌ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（〜１７μｇ／ｍｌ）を、ＬＰＳ誘導細胞に対して、同時、または２時間後に投与した。コントロール細胞は、培養培地と共に単独でインキュベートされた。ＤＬＰＳ（E. coli 055: B5; Sigma-Aldrich社, １０μｇ／ｍｌ）および不活性のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（１７μｇ／ｍｌ、AM-Pharma社から提供された）は、ネガティブコントロールとして使用された。異なる実験において、ＬＰＳは、ヒトＴＮＦ−α組換えタンパク質、またはＰＢＭＣの上清に置換され、ＬＰＳの有無で２４時間にわたって前刺激された。全ての実験（ｎ＝５）は、最小限で行われ、二度実施された。
末梢血単核球細胞の単離
ＰＢＭＣは、Ficoll-Pague Plus（GE Healthcare社, Diegem, Belgium）を用いる分画遠心分離によって健常な血液ドナー（blood bank Nijmegen, n=5）から得られた軟膜から単離された。ＰＢＭＣは、０．５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Sigma-Aldrich社)、１ｍＭ ピルビン酸（Gibco社）、および２ｍＭ glutamax（Gibco社）で強化されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco社）において再懸濁された。細胞は、９６ウェルプレートに０．５×１０６細胞／ウェルの密度で播種され、ＡＰ（１０ユニット／ｍｌ）の有無で２時間プレインキュベートされ、続いて２４時間にわたってＬＰＳインキュベーション（１ｎｇ／ｍｌ）された。全ての実験は、二度行われた。
ＡＴＰ測定、および細胞生存アッセイ
上清は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ前処理の有無に関係なくＬＰＳ投与の３０分後に集められ、続いて、製造業者のプロトコールに従ってＡＴＰバイオルミネッセンスアッセイキットＣＬＳ ＩＩ（Roche Diagnostics社）を用いてＡＴＰ産生を直接測定した。細胞生存は、ＭＴＴアッセイを行うことによってＬＰＳ培養の２４時間後に評価した。要約すると、培地は、３７℃で３時間にわたって予め温められた１００μｌのＭＴＴ溶液（Sigma-Aldrich社; 培養培地において０．５ｍｇ／ｍｌ）に置き換えられ、続いて２００μｌのＤＭＳＯを、可溶化された細胞内沈殿ホルマザン結晶に添加した。色素の消退は、６７０ｎｍの波長補正を用いて５７０ｎｍにおいて測定された。
動物モデル
動物実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従って行われ、プロトコールは、動物実験審査委員会によって承認された。特定病原菌フリーの雄スプラーグドーリーラット（RjHan:SD; Janvier, France）は、プラセボ（ｎ＝６）、ＬＰＳ（ｎ＝６）、またはＬＰＳ ＋ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（ｎ＝６）の３つの群に分けられた。基準の血漿試料（リチウム−ヘパリン血液）は、実験の７日前にMultivette（Sarstedt社, Etten-Leur, the Netherlands）を用いる尾静脈穿刺によって集められた。実験の３日前に、基準の腎臓機能をＦＩＴＣ−シニストリン ｔ１／２として評価した（Schock-Kusch, 2011）。ｔ＝０において、プラセボ（０．９％ ＮａＣｌ、生理食塩水）、または０．３ｍｇ／ｋｇ ＢＷ ＬＰＳ（生理食塩水に溶解されたE. coli 0127:B8）を、静脈内ボーラスとして投与し、ＬＰＳ誘導腎不全を誘導した。ｔ＝１．５時間において、上述のように、血漿を得た。ｔ＝２時間で、ラットは、プラセボまたはＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの静脈内ボーラス（生理食塩水に希釈された１０００Ｕ／ｋｇ ＢＷ）を受け、腎臓機能の第２測定がそれに続いた。ｔ＝５時間で、全ての動物は、脱水症状を防ぐために５ｍｌの生理食塩水（皮下注入）を受け、１６時間の尿採取期間がそれに続いた。ｔ＝２１．５時間において、第３の経皮的測定が行われた。ｔ＝２４時間において、ラットを麻酔し（腹腔内、３ｍｇ／ｋｇ ＢＷ キシラン、および８０ｍｇ／ｋｇ ＢＷ ケタミン １０％）、血漿を得るために球後リチウム−ヘパリン血液試料を取り除き、全身灌流を開始した（６分間、生理食塩水＋５０ＩＵ／ｍｌ ヘパリン、２１０ｍｂａｒ；３分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；２１０ｍｂａｒ））。生理食塩水の灌流後、右腎は、注意深く取り除かれ、迅速に凍結され、処理まで−８０℃で保存された。左腎は、ＰＦＡ灌流後に除去され、組織学的検査および免疫組織化学的検査のための処理まで４％ＰＦＡ中で４℃において保存された。ＬＰＳ ＋ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ群に由来する１匹の動物と、プラセボ群に由来する１つの尿試料とは、それぞれ注入および回収の困難性が原因で排除された。
腎機能の測定
腎機能は、以前に発表されたように（Schock-Kusch 2011, Schock-Kusch 2009）、新規の測定装置を用いることによって、ＧＦＲの市販マーカ、ＦＩＴＣ−シニストリンの、経皮的に測定された排泄動態によってフリームービング覚醒ラットにおいて評価された（Fresenius Kabi社, Linz, Austria）。要約すると、ラットをイソフルラン吸入によって麻酔し（５％誘導、１．５〜２％維持；Abbott Laboratories社, Illinois, USA）、背中の毛を剃った。装置の光学部は、特に設計された両面接着パッチを用いてこの脱毛領域に固定された（Lohmann社, Neuwied, Germany）が、装置の電子部は、げっ歯類用ジャケットに組み込まれた（Lomir Biomedical社, Malone, USA）。基準シグナルの設定後、ＦＩＴＣ−シニストリン（１００ｇ ＢＷあたり５ｍｇ、緩衝生理食塩水中に希釈した）を尾静脈に注入した。その後、注入後約１２０分間にわたって測定を継続する間に動物を麻酔から回復させた。Ｔ１／２は、経皮的に測定されたＦＩＴＣ−シニストリン排泄動態に適用された一分画モデルによって計算された（Schock-Kusch, 2009）。また、腎機能のパラメータは、Hitachi 704自動分析機（Boehringer Mannheim社, Mannheim, Germany）を用いて、血漿および尿試料において測定された。分画された尿素排出量および内在性クレアチニンクリアランス値は、ｔ＝１．５およびｔ＝２４の平均血漿値を用いて計算された。
組織学的検査、および免疫組織化学的検査
少なくとも２４時間の固定後、組織は処理され、paraplast中に包埋され、３μＭの厚さで切片にされた。通常の組織学的検査のために、ＨＥ染色を腎臓組織に行った。腎障害は、０〜４のスケールで点数化して評価された（０＝変化無し、４＝重度の損傷、たとえば顕著な尿細管細胞変化）。ＫＩＭ−１は、ヤギ抗ラットＫＩＭ−１一次抗体（1:50; AF3689, R&D Systems社, Abingdon, UK）、およびウサギ抗ヤギＩｇＧ（1:200; P0449, DAKO社, Heverlee, Belgium）によって検出された。免疫染色は、VECTASTAIN Eline ABCシステム試薬（Vector Labs社, Amsterdam, Netherlands）、および３，３’−ジアミノベンジジン（DAB, Sigma-Aldrich社）、続いてヘマトキシリン対比染色によって可視化された。全ての点数化は、盲検法で行われた。
サイトカイン、および腎障害マーカ
ヒトＥＬＩＳＡキット（R&D Systems社）は、製造業者の説明書に従って、上清におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８を測定するために使用された。血漿サイトカインレベル（ＩＬ−１β，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＴＮＦ−α，ＩＮＦ−γ)は、製造業者の説明書（Millipore社, Cork, Ireland）に従って、同時ルミネックスアッセイによって測定された。ＫＩＭ−１およびＮＧＡＬは、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡ（R&D Systems社）によって測定された。
組織均質化
迅速に凍結された腎臓は、製造業者の説明書に従って、コンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Roche Applied Science社, Almere, The Netherlands）を添加した組織タンパク質抽出試薬（T-PER; Thermo Scientific社, Rockford, USA）中において、TissueLyser LT（Qiagen社, Venlo, The Netherlands）によって均質化された。総タンパク質含有量は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Thermo Scientific社）を用いて測定され、試料は、−８０℃でアッセイまで保存された。
リアルタイムＰＣＲ分析
ＲＮＡは、凍結された細胞ペレット、または微粉砕された腎臓からトリゾール試薬を用いて抽出された（２０００，３０秒; Mikro-dismembrator U, Sartorius Stedim Biotech社, Aubagne Cedex, France）。ＲＮＡは、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素（Invitrogen社, Breda, The Netherlands）を用いてｃＤＮＡに逆転写された。リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＱ−ＰＣＲ）は、Taqman（登録商標）（Applied Biosystems社, Carlsbad, USA）を用いて行われた。遺伝子を増幅し、ＧＡＰＤＨの発現について標準化した（ｃｉＰＴＥＣ：Ｃｔ：１８．９±０．１；腎臓組織：Ｃｔ：２４．８±０．２）。ＰＣＲ反応は、５０℃の２分間インキュベーションステップで開始し、続いて１０分間９５℃の初期変性、および１５秒間９５℃の４０サイクル、および１分間６０℃で行った。群の間の相違は、比較ΔΔＣｔ法によって計算された。プライマー／プローブの組み合わせは、表１７にまとめた。
尿中のプリン含有量
尿中の、アデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、およびｃＡＭＰ含有量は、ＨＰＬＣによって測定された。要約すると、４体積の尿を１体積のクロロアセトアルデヒド（１Ｍ 酢酸緩衝液に６×希釈、ｐＨ４．５、Sigma-Aldrich社）に混合し、誘導体化（６０分間、７０℃、５００ｒｐｍ）、および遠心分離（３分間、室温、１３４００ｒｐｍ）し、その後、上清をＨＰＬＣバイアルに移し、注入した。プリン体は、溶出液Ａ（０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４，１０ｍＭ ＴＢＡＨＳ（ｐＨ６．５）、および２％ ＭｅＯＨ)、および溶出液Ｂ（Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ：ＴＨＦ；５０：４９：１）を用いるグラジエント溶出によって、Polaris C18-A カラム（１５０×４．６ｍｍ）を用いるＨＰＬＣシステム（Thermo Scientific社）によって分離された保持時間は、７．１分間（アデノシン）、８．４分間（ＡＭＰ）、１２．５分間（ＡＤＰ）、１６．２分間（ＡＴＰ）、および１４．８分間（ｃＡＭＰ）であった。定量化は、試料のピーク領域、および蛍光によって測定された標準試料に基づいた（励起：２８０ｎｍ；発光：４２０ｎｍ）。
統計分析
データは、平均値±ＳＥＭ、または中央値として表わされる［第２５パーセンタイル、第７５パーセンタイル］。データの正規性は、コルモゴロフ−スミルノフ検定によって評価された。群間の統計学的な相違を、ボンフェローニの多重比較試験を用いるポストホック比較によるＡＮＯＶＡによって、またはDunnのポスト試験によるKruskal-Wallis試験によって、評価した。０．０５未満の両側ｐ値は、統計学的に有意であるとみなされた。全ての試験は、WindowsのGraphpad Prism 5.00を用いて行われた（Graphpad Software社 San Diego, CA, USA）。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＬＰＳ誘導炎症反応を弱める。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰによるヒトｃｉＰＴＥＣの前処置（Wilmer, 2010）は、遺伝子およびタンパク質レベルにおける、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−８の、ＬＰＳ誘導サイトカイン産生を、容量に依存して減弱した（図１２Ａ−Ｂ）。解毒されたＬＰＳ（ｄＬＰＳ）は、ネガティブコントロールとして使用され、影響を与えなかった。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰが、ＬＰＳと同時、またはＬＰＳ曝露の２時間後に投与されたとき、タンパク質レベルにおける同様の抑制結果が得られた（図１２Ｃ）。コントロール実験は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰが、培地に排出されたサイトカインを脱リン酸化するか否かを確かめるために行われ、これはそのようなものではなかった（図１７）。サイトカイン産生のＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ誘導減少が、酵素の脱リン酸化特性によるものであることを確かめるために、加水分解特性を欠く不活性なＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの効果を調べた。不活性ＬＶＬ−ＲｅｓＡＰは、ｃｉＰＴＥＣにおけるＬＰＳ誘導炎症反応を減弱しない（図１２Ｄ）。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける効果は、腎臓特異的であり、ＬＰＳ誘導炎症に限定されない。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの腎臓保護機能をさらに調べるために、ｃｉＰＴＥＣは、仔ウシＩＡＰによって脱リン酸化することができないプロ炎症性サイトカインＴＮＦ−αと共にインキュベートされた（Chen, 2010）。ＩＬ−６およびＩＬ−８のＴＮＦ−α誘導サイトカイン産生も、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ前処理によって減弱したが、不活性ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは効果が無かった（図１３Ａ）。敗血症随伴性ＡＫＩの病態形成において、ＬＰＳは、ＰＴＥＣ上に発現したＴＬＲ４に対する結合を介して局所的な炎症反応を誘導する（ｃｉＰＴＥＣ Ｃｔ： ３０．５±３．９；ｎ＝５）。疾患の他の特徴は、全身の炎症反応であり、腎臓上皮、および内皮細胞の双方に影響を与え、ＡＫＩの発症の原因となる（Peters, 2014）。このエンドトキシン誘導腎臓炎症を模倣するために、ｃｉＰＴＥＣを、ＬＰＳ刺激された末梢血単核球細胞の上清とともにインキュベートした（ＰＢＭＣ、１ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ）。これは、ＩＬ−６およびＩＬ−８の産生を誘導し、ｃｉＰＴＥＣがＬＶＬ−ＲｅｃＡＰとともに前処理されたとき減少した（図１３Ｂ、ＴＮＦ−αは検出されなかった）。ＴＮＦ−αによって媒介される炎症性反応は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置によって減弱するとの知見と共に、このことは、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰによって標的とされる他の介在物質の存在を示唆する。これに対して、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰを用いるＰＢＭＣの前処理は、これらの細胞におけるＬＰＳ誘導炎症反応に影響を与えなかった（図１３Ｃ）。このことは、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの効果が腎臓特異的であることを示している。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、ＡＴＰ／アデノシン経路を介して、腎臓保護性のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を発揮する。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの第２の潜在的標的は、たとえば炎症および低酸素症によってもたらされる細胞ストレスの間に放出されたＡＴＰである(Eltzschig, 2012)。細胞外ＡＴＰは、有害な効果を有するが、エクトヌクレオチダーゼ（たとえば、ＡＰ）によって、ＡＤＰ、ＡＭＰ、および最終的にアデノシンに変換することができ、アデノシン受容体Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３の１つに対する結合を介して抗炎症および組織保護効果を発揮する（Bauerle, 2011, Di Sole, 2008）。興味深いことに、ｃｉＰＴＥＣにおけるアデノシン受容体Ａ１、Ａ２Ｂ、およびＡ３の発現は、ＬＰＳインキュベーションによって影響を受けない（データは示されていない）が、Ａ２Ａ発現は、ＬＰＳ刺激下において上方制御された（倍率：４．１±０．４；プラセボに比べてｐ＜０．００１）。この効果は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ同時処理によって減弱し（倍率:２．９±０．２；プラセボに比べてｐ＜０．００１；ＬＰＳに比べてｐ＜０．０５）、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの保護効果におけるアデノシン経路の役割を示唆する。さらに、我々は、ＬＰＳインキュベーションに続いて細胞外ＡＴＰ濃度増加を観察した。これは、より高いＬＰＳ濃度でさらに明確であったが、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰのプレインキュベーションによって反転した（図１４）。ＬＰＳは、２４時間まで細胞生存率に影響を与えなかった（データは示されていない）。このことは、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、ＡＴＰ／アデノシン経路を介する腎臓保護効果を発揮し得るとの仮説を支持する。
ラットにおけるＬＰＳ誘導ＡＫＩの間にＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、腎機能障害を減弱する。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの有利な効果を確認するために、ＡＫＩは、ラットにおいてＬＰＳ（０．３ｍｇ／ｋｇ ＢＷ）によって誘導され、腎臓機能は、以前に報告されたように（Schock-Kusch, 2011）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−標識化シニストリン動態の経皮測定によって評価された。ＦＩＴＣ−シニストリンは、濾過のみによって腎臓で除去され、血漿画分からのその消失は、リアルタイムで経皮的に測定することができる。このことは、一般的に使用されるクレアチニンクリアランス値に比べてより正確な方法でＡＫＩの進行を調べることを可能にする。ＬＰＳ注入前に、ベースライン血液試料は、臨床パラメータ、および血漿サイトカインを測定するために取得され、ベースラインＦＩＴＣ−シニストリン半減期（ｔ１／２）は、群間の均一性を確認するために、測定された動態から決定された（データは、示されていない）。１．５時間後、ＬＰＳ処置は、血漿サイトカインレベルの増加、いくつかの血漿パラメータにおける異常（表１８）、立毛、下痢、および自発活性の低下をもたらしたので、全身性炎症の存在を裏付けている。ＬＰＳ投与の２時間後、ラットは、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（１０００Ｕ／ｋｇ ＢＷ）またはプラセボ（生理食塩水）で処置され、次いで経皮的な腎機能測定が行われた。ＬＰＳは、ＦＩＴＣ−シニストリン ｔ１／２を有意に遅延し、腎機能の有意な減少を明らかにした。この傾向は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置によって減弱された（図１５Ａ）。全ての群において、腎機能は、２４時間以内に完全に回復した（図１５Ｂ）。さらに、血漿尿素レベルは、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰなしにＬＰＳを受けた動物に比べて、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置された動物において有意に低下した（表１９）。また、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、分画された尿素排出量のＬＰＳ誘導性増加（図１５Ｃ）と、内在性クレアチニンクリアランスのＬＰＳ誘導性減少（図１５Ｄ）とを抑制した。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ生理活性は、血漿において確かめられ、注入の２２時間後に８倍の増加を示した（プラセボ：２９３±１２Ｕ/ｍｌ； ＬＰＳ： ２６０±１３Ｕ/ｍｌ； ＬＰＳ＋ＡＰ：２１５０±６０Ｕ/ｍｌ；ｐ＜０．０００１）。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬＰＳ誘導性ＡＫＩの間に腎障害を抑制する。
ＬＰＳ誘導性ＡＫＩにおけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの腎臓保護効果は、腎臓の組織学的検査、および特定の尿細管損傷マーカの評価によって、さらに調べられた。処置された群の間において、組織学的検査における相違は、見出されなかった。損傷無しの範囲内の変化（０）、近位尿細管細胞の、泡沫状の外観、およびわずかな膨張のような変性変化まで（１）、泡沫状の外観および中程度の膨張、ならびに少数のアポトーシス（２）(プラセボ：１[０．７５−２]；ＬＰＳ：１．５[０−２]；ＬＰＳ ＋ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ：１[０−１．０]）。ＬＰＳ処置は、腎臓のＩＬ−６発現レベルの有意な増加をもたらすが、他のサイトカインおよび損傷マーカ（ＭＰＯ、ミエロペルオキシダーゼ；ＢＡＸ、Ｂｃｌ２随伴性Ｘタンパク質；ｉＮＯＳ、誘導型一酸化窒素合成酵素）は、影響を受けなかった（表２０）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰは、腎臓のＩＬ−６発現レベルを減少させることができなかったが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の腎臓における発現を強く増強した（表２０）。さらに、ＬＰＳ投与は、腎臓遺伝子発現レベルの増加に付随する、腎臓損傷分子（ＫＩＭ）−１、および好中球ゼラチナーゼ関連リポカイン（ＮＧＡＬ）の尿中排出量における有意な増加をもたらした。この効果は、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの同時投与によって妨げられる（図１６Ａ−Ｂ、表２０）。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの同様の効果は、血漿ＮＧＡＬレベルについて（図１６Ｃ）、近位尿細管上皮細胞の頂端膜側に主に局在したＫＩＭ−１の腎臓タンパク質レベルについて（図１６Ｄ）観察された。
ｉｎ ｖｉｖｏ ＬＰＳ誘導性ＡＫＩの間における尿中アデノシン排出量の減少
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの腎臓保護機能をさらに解明するために、我々は、ＡＴＰ−アデノシン経路の役割を調べた。ＬＰＳ処置は、４つ全てのアデノシン受容体について腎臓における遺伝子発現レベルを減少させる傾向があり、そのうちアデノシン受容体Ａ３のみが統計学的に有意に達した（表２０）。興味深いことに、ＬＰＳ処置は、ｃＡＭＰ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰの排出量を変えることなく（データは、示されていない）、アデノシンの尿中排出量を有意に減少させた（プラセボ：６８．０±７．８ｐｇアデノシン／１０μｇ クレアチニン；ＬＰＳ：１９．４±６．３ｐｇ アデノシン／１０μｇ クレアチニン；ｐ＜０．００１）。このことは、腎臓がＬＰＳ誘導性ＡＫＩの間にアデノシンを利用していることを示唆している。ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ処置は、ＬＰＳ単独に比べて、アデノシン受容体遺伝子発現（表２０）、または尿中のアデノシン排出量に影響を与えなかった（ＬＰＳ ＋ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ：１６．７±６．８ｐｇ アデノシン／１０μｇ クレアチニン： プラセボに比べてｐ＜０．００１）。
実施例９の参考文献
Bauerle, J.D., Grenz, A., Kim, J.H., Lee, H.T., and Eltzschig, H.K. 2011. Adenosine generation and signaling during acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 22:14-20.
Chen, K.T., Malo, M.S., Moss, A.K., Zeller, S., Johnson, P., Ebrahimi, F., Mostafa, G., Alam, S.N., Ramasamy, S., Warren, H.S., et al. 2010. Identification of specific targets for the gut mucosal defense factor intestinal alkaline phosphatase. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299:G467-475.
Di Sole, F. 2008. Adenosine and renal tubular function. Curr Opin Nephrol Hypertens 17:399-407.
Eltzschig, H.K., Sitkovsky, M.V., and Robson, S.C. 2012. Purinergic signaling during inflammation. N Engl J Med 367:2322-2333.
Kiffer-Moreira, T., Sheen, C.R., Gasque, K.C., Bolean, M., Ciancaglini, P., van Elsas, A., Hoylaerts, M.F., and Millan, J.L. 2014. Catalytic signature of a heat-stable, chimeric human alkaline phosphatase with therapeutic potential. PLoS One 9:e89374.
Peters, E., Heemskerk, S., Masereeuw, R., and Pickkers, P. 2014. Alkaline Phosphatase: A Possible Treatment for Sepsis-Associated Acute Kidney Injury in Critically Ill Patients. Am J Kidney Dis. 63:1038-48
Schock-Kusch, D., Sadick, M., Henninger, N., Kraenzlin, B., Claus, G., Kloetzer, H.M., Weiss, C., Pill, J., and Gretz, N. 2009. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol Dial Transplant 24:2997-3001.
Schock-Kusch, D., Xie, Q., Shulhevich, Y., Hesser, J., Stsepankou, D., Sadick, M., Koenig, S., Hoecklin, F., Pill, J., and Gretz, N. 2011. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int 79:1254-1258.
Wilmer, M.J., Saleem, M.A., Masereeuw, R., Ni, L., van der Velden, T.J., Russel, F.G., Mathieson, P.W., Monnens, L.A., van den Heuvel, L.P., and Levtchenko, E.N. 2010. Novel conditionally immortalized human proximal tubule cell line expressing functional influx and efflux transporters. Cell Tissue Res 339:449-457.
実施例１０
異なる温度条件下におけるＬＶＬ−ＲｅｃＡＰとＲｅｃＡＰとの比較
１０．６． 材料
１０．６．１ 標準試料
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ
バッチ番号 ： ＮＢ１９６３ｐ１
ＰＲＡ ＩＤ ： １４−０４９
タンパク質含有量 ： ９．９ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ２８０）
活性 ： ６５３７Ｕ／ｍＬ（６６０Ｕ／ｍｇ）
保存条件 ： 表示値 −７０℃
終了日 ： ２０１５年１月８日
ＲｅｃＡＰ
バッチ番号 ： ２０１３−０５２，ロット６２
ＰＲＡ ＩＤ ： １４−３１１
タンパク質含有量 ： １３．３ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ２８０）
活性 ： ９８７１Ｕ／ｍＬ（７４２Ｕ／ｍｇ）
保存条件 ： ２〜８℃
終了日 ： ２０１６年６月６日
１０．６．２ ブランクマトリックス
以下の生物学的マトリックスが試料溶液の作製に使用された。
マトリックス ：血漿
種 ：ヒト
供給者 ：Sera Laboratories International社, Haywards Heath, UK
保存条件 ：表示値 保存温度 −２０℃
ＰＲＡ ＩＤｓ ：１４−０６２４，１４−０６４７，および１４−０６５２
終了日 ：２０１６年５月２日（１４−０６２４）
２０１６年５月６日（１４−０６４７および１４−０６５２）
１０．７． 方法
１０．７．１ 溶液の作製
１０．７．１．１ ２Ｍ 水酸化ナトリウム
２モルの水酸化ナトリウム水溶液は、８ｇの水酸化ナトリウムを約９０ｍｌのミリＱ水に溶解させ、室温に冷却し、体積を１００ｍＬに調整することによって作製された。溶液は、室温で、最大１月まで保存された。
１０．７．１．２ １Ｍ 塩化マグネシウム
１モルの塩化マグネシウム溶液は、４．０６ｇの塩化マグネシウム６水和物を、約１６ｍＬのミリＱ水に溶解させることによって作製された。 溶解後、体積は、２０ｍＬに調整された。溶液は、表示値＋４℃で、最大１月まで保存された。
１０．７．１．３ ０．１Ｍ 塩化亜鉛
０．１モルの塩化亜鉛溶液は、２７２．５ｍｇの塩化亜鉛を、約１６ｍＬのミリＱ水に溶解させることによって作製された。溶解後、体積は、２０ｍＬに調整された。溶液は、表示値＋４℃で、最大１月まで保存された
１０．７．１．４ ２５℃法のためのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液
ｐＨ９．６ ０．０２５モルのグリシン溶液は、３．７６ｇのグリシンを、１８００ｍＬのミリＱ水に溶解させることによって作製された。溶液は、２５℃に温められ、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．６に調整された（セクション１０．７．１．１を参照）。体積は、２０００ｍＬまで作製され、ｐＨは、再度確認された。ｐＨは、２５℃においてｐＨ９．６であるべきである。溶液は、表示値＋４℃で、最大１週間まで保存された。
１０．７．１．５ ２５℃法のための酵素希釈緩衝液
酵素希釈緩衝液は、０．５ｍＬの１Ｍ 塩化マグネシウム（セクション１０．７．１．２を参照）を、０．５ｍＬの０．１Ｍ 塩化亜鉛（セクション１０．７．１．３を参照）、およびｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液（セクション１０．７．１．４を参照）に混合することによって作製された。この溶液のために、５．００ｇのマンニトールと、０．２５ｇの仔ウシ血清アルブミンとを添加し、攪拌しながら溶解した。ｐＨは、再度確認され、必要がある場合、２Ｍの水酸化ナトリウムを用いて、２５℃でｐＨ９．６に調整された。酵素希釈緩衝液は、毎日新たに作製された。
１０．７．１．６ ２５℃法のためのｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩
ｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩は、１５２８ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸塩を、約３６０ｍＬのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液に溶解させることによって作製された（セクション１０．７．１．４を参照）。ｐＨは、再度確認され、必要である場合、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて、２５℃でｐＨ９．６に調整された（セクション１０．７．１．１を参照）。ｐＨを再度確認した後、体積は、ｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液を用いて４００ｍＬに調整された。溶液は、表示値＋４℃で、最大５日まで保存された。
１０．７．１．７ ３７℃法のための使用基質
使用基質は、１２０ｍＬの ｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩溶液（セクション１０．７．１．６を参照）を、１．２５ｍＬの１Ｍ 塩化マグネシウム溶液（セクション１０．７．１．２を参照）に混合することによって作製された。この溶液に、約１５ｍＬの ｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液（セクション１０．７．１．４を参照）が添加され、ｐＨは、再度確認され、必要であれば、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて、２５℃でｐＨ９．６に調整された（セクション１０．７．１．１を参照）。体積は、ｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液を用いて１４５ｍＬに調整された。使用基質は、毎日新たに作製された。
１０．７．１．８ ３７℃法のためのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液
ｐＨ９．６ ０．０２５モルのグリシン溶液は、３．７６ｇのグリシンを約１８００ｍＬのミリＱ水に溶解させることによって作製された。溶液は、２５℃に温められ、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．６に調整された（セクション１０．７．１．１を参照）。体積は、２０００ｍＬまで作製され、ｐＨは、再度確認された。ｐＨは、３７℃においてｐＨ９．６であるべきである。溶液は、表示値＋４℃で、最大１週間まで保存された。
１０．７．１．９ ３７℃法のための酵素希釈緩衝液
酵素希釈緩衝液は、０．５ｍＬの１Ｍ 塩化マグネシウム（セクション１０．７．１．２を参照）を、０．５ｍＬの０．１Ｍ 塩化亜鉛（セクション１０．７．１．３を参照）および５００ｍＬのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液（セクション１０．７．１．８を参照）に混合することによって作製された。この溶液に、５．００ｇのマンニトールと０．２５ｇの仔ウシ血清アルブミンとを添加し、攪拌しながら溶解させた。ｐＨは、再度確認され、必要である場合、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて、３７℃でｐＨ９．６に調整された。酵素希釈緩衝液は、毎日新たに作製された。
１０．７．１．１０ ３７℃法のためのｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩
ｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩は、１５２８ｍｇのｐ−ニトロフェニルリン酸塩を、約３６０ｍＬのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液に溶解させることによって作製された。ｐＨは、再度確認され、必要であれば、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて、３７℃でｐＨ９．６に調整された（セクション１０．７．１．１を参照）。ｐＨを再確認後、体積は、ｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液を用いて４００ｍＬに調整された。溶液は、表示値＋４℃で、最大５日まで保存された。
１０．７．１．１１ ３７℃法のための使用基質
使用基質は、１２０ｍＬのｐＨ９．６ ０．０１０３Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩溶液（セクション１０．７．１．１０を参照）を１．２５ｍＬの１Ｍ 塩化マグネシウム溶液（セクション１０．７．１．２を参照）に混合することによって作製された。この溶液に、約１５ｍＬのｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシン溶液（セクション１０．７．１．４を参照）を添加し、ｐＨを再確認し、必要であれば、２Ｍ 水酸化ナトリウムを用いて、３７℃でｐＨ９．６に調整した（セクション１０．７．１．１を参照）。体積は、ｐＨ９．６ ０．０２５Ｍ グリシンを用いて１４５ｍＬに調整された。使用基質は、毎日新たに作製された。
１０．７．２ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ スパイク溶液（５００μｇ／ｍＬ）
ｒｅｃＡＰスパイク溶液は、２５２．５μＬ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ（セクション１０．６．１）を、酵素希釈緩衝液（セクション１０．７．１．５）を用いて５．００ｍＬに希釈することによって作製された。スパイク溶液の最終濃度は、５００μｇ／ｍＬであり、この溶液は、ｒｅｃＡＰ添加されたヒト血漿試料の作製に使用された（セクション１０．７．４）。
１０．７．３ ＲｅｃＡＰスパイク溶液（５００μｇ／ｍＬ）
ＲｅｃＡＰスパイク溶液は、１８８．０μＬのＲｅｃＡＰ（セクション１０．６．１）を、酵素希釈緩衝液（セクション１０．７．１．５）を用いて５．００ｍＬに希釈することによって作製された。スパイク溶液の最終濃度は、５００μｇ／ｍＬであり、この溶液は、ＲｅｃＡＰ添加されたヒト血清試料（セクション１０．７．５）の作製に使用された。
１０．７．４ ＬＶＬ−ｒｅｃＡＰ添加されたヒト血清試料の作製
１０．７．５ ＲｅｃＡＰ添加されたヒト血清試料の作製
１０．７．６ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよびＲｅｃＡＰ酵素活性のための試料溶液の作製
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよびＲｅｃＡＰ酵素活性のための試料溶液は、酵素希釈緩衝液（２５℃法についてのセクション１０．７．１．５ または３７℃法についてのセクション１０．７．１．９）を用いる、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ産物試料、またはＲｅｃＡＰ産物試料の希釈によって作製された。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料１は、１２５μＬのＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．５０ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料２は、１２５μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料３は、１６７μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料４は、２５０μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料５は、５００μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する試料６は、１０００μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ試料に由来する内在性（試料７）は、１０００μＬのＬＶＬ-ＲｅｃＡＰおよび／またはＲｅｃＡＰ血清試料を取得し、酵素希釈緩衝液を用いて２．００ｍＬに希釈することによって希釈され、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰまたはＲｅｃＡＰ酵素活性のための最終試料溶液を作製した。
１０．８ 実施、結果、および考察
１０．８．１ 装置および設定
以下の方法および設定が使用された。
分光光度計 ：シングルセルペルチェヒータを備えるThermo Fisher Evolution 300 UV/VISを、マグネチックスターラを用いて、２５℃（ＡＮ−１８−３）、または３７℃（ＡＮ−１８−４）に設定した。
波長 ： ４０５ｎｍ
測定 ： ３分間、各１５秒で測定。最初の１分間は、計算のために考慮なかった。
キュベット型 ： ガラス
以下の溶液は、ガラスキュベットに滴下された。溶液の温度は、ＡＮ−１８−３について２５℃±０．５℃、またはＡＮ−１８−４について３７℃±０．５℃であった。
最初に、使用基質および酵素希釈液は、試料が添加される前に混合された。溶液は、混合され、キュベットは、分光光度計に直ちに設置され、吸光度の増加は、１５秒間の工程において１〜３分間測定され、少なくとも９つのデータポイントを得た。３分（最後の）データポイントにおいて、吸光度は、≦１．５であった。さらに、直線性は許容範囲内にあった。各複製物についての相関係数（ｒ）は、≧０．９９０であるべきである。相関係数（ｒ）≧０．９９０の試料の結果はすべて、評価のために考慮され、相関係数（ｒ）＜０．９９０の試料の結果は、単に情報として報告された。酵素活性は、各希釈の１試験である、二重モードにおいて実施された。
１０．８．２ ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰおよびＲｅｃＡＰ酵素活性
実験計画は、２つの個別の希釈結果を認めるために、２つの個別の結果（酵素活性）についての相違が≦５．０％であるべきであることを記載しているが、各測定についての相関係数（ｒ）≧０．９９０の全ての結果が評価に使用された。なぜなら、酵素活性法は、２５℃±０．５℃においてＬＶＬ−ＲｅｃＡＰ産物について検証され、他のアルカリホスファターゼ起源、および／または他の条件については、検証されなかったからである。
図１９は、ヒト血清中のＲｅｃＡＰの酵素活性の、２５℃および３７℃の間の相関関係を示す。図２０は、２５℃および３７℃における、ＬＶＬ−ＲｅｃＡＰの酵素活性の間の相関関係を示す。
図２０は、ＲｅｃＡＰおよびＬＶＬ−ＲｅｃＡＰについて、２５℃および３７℃における活性／μｇタンパク質を示す。値は、所定のタンパク質濃度について、２５℃および３７℃の間の平均Δ活性を表す。

Claims (16)

  1. ホスファターゼ活性を有する単離タンパク質であって、配列番号５に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２００個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列と、配列番号６に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも５０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列と、配列番号７に少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも４０個の連続するアミノ酸のアミノ酸配列とを含み、
    前記全長タンパク質は、配列番号１の全長アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    位置２７９のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）であり、位置３２８のアミノ酸は、バリン（Ｖ）であり、位置４７８のアミノ酸は、ロイシン（Ｌ）であることを特徴とする単離タンパク質。
  2. 請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
  4. 医薬としての使用のための、請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクター。
  5. 局所的、または全身の亜鉛欠乏に付随する疾患の、予防、または処置のための、請求項４に記載の、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクター。
  6. 炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症の、予防、または処置のための、請求項４または５に記載の使用のための、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクター。
  7. 前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、消化管の炎症性疾患、感染症、敗血症、神経皮膚炎、炎症性肝疾患、炎症性肺疾患、および炎症性腎臓病から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の使用のためのタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクター。
  8. 前記腎臓病は、腎障害、急性腎障害、慢性腎臓病、腎不全、急性腎不全、虚血性腎臓病、および虚血／再灌流腎損傷から選択されることを特徴とする請求項６に記載の使用のためのタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクター。
  9. 前記低ホスファターゼ症は、周産期型低ホスファターゼ症、幼児型低ホスファターゼ症、小児型低ホスファターゼ症、および成人型低ホスファターゼ症から選択されることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質、ポリヌクレオチド、またはベクター。
  10. 請求項１に記載のタンパク質、請求項２に記載のポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
  11. ＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の宿主細胞。
  12. 請求項１０または１１の宿主細胞を培養し、当該宿主細胞に前記タンパク質を産生させることを含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質を産生する方法。
  13. 請求項１に記載の、および／または請求項１２に記載の方法によって得ることができるタンパク質を含むことを特徴とする組成物。
  14. 医薬としての使用のための、請求項１３に記載の組成物。
  15. 局所的、もしくは全身の亜鉛欠乏、炎症性疾患、腎臓病、または低ホスファターゼ症に付随する疾患の、予防、または処置における使用のための、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 低ホスファターゼ症の前記予防または処置が、生存期間の延長、体重の増加、改善した骨格表現型、顔面頭蓋欠損の減弱、歯−歯槽表現型の改善、ならびに／または血漿ＰＰｉレベルの減少をもたらすことを特徴とする、請求項６もしくは９に記載の使用のためのタンパク質、ポリヌクレオチド、もしくはベクター、または請求項１５に記載の使用のための組成物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020512363A (ja) * 2017-03-31 2020-04-23 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 成人及び青年における低ホスファターゼ症（ｈｐｐ）を治療する方法
JP2021515022A (ja) * 2018-03-08 2021-06-17 アーエム−ファルマ ベー．フェー．ＡＭ−Ｐｈａｒｍａ Ｂ．Ｖ． 敗血症関連急性腎障害の治療に使用するための組み換えアルカリホスファターゼ
US12433938B2 (en) 2019-12-09 2025-10-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2937328C (en) 2014-01-24 2022-09-27 Am-Pharma B.V. Chimeric alkaline phosphatase-like proteins
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
MX389350B (es) 2014-12-05 2025-03-19 Alexion Pharma Inc Fosfatasas alcalinas recombinantes y usos de las mismas para el tratamiento de convulsiones.
JP6868561B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法
CN108350440A (zh) * 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
JP7613826B2 (ja) 2016-04-01 2025-01-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
EP3345614A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-11 Amrif B.V. Composition comprising alkaline phosphatase for use in the treatment of arthritides
US11338020B2 (en) * 2018-01-09 2022-05-24 Synthetic Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders
ES3032290T3 (en) 2018-03-20 2025-07-16 Theriva Biologics Inc Intestinal alkaline phosphatase formulations
US11654184B2 (en) 2018-03-20 2023-05-23 Theriva Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase
CN110499285A (zh) * 2018-05-17 2019-11-26 西安组织工程与再生医学研究所 Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用
US12268733B2 (en) 2018-08-10 2025-04-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurofibromatosis type 1 and related conditions with alkaline phosphatase
JP7660523B2 (ja) 2019-05-06 2025-04-11 セリバ・バイオロジクス・インコーポレイテッド アルカリリン酸塩に基づいた癌治療
JP7813706B2 (ja) * 2020-01-03 2026-02-13 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 歯周の健康を促進するために局所投与されるｔｎａｐ
CN111110835A (zh) * 2020-01-22 2020-05-08 李鑫荣 一种肠碱性磷酸酶的新应用及其制剂的细胞活性检测方法
AU2021337652B2 (en) 2020-09-04 2025-01-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating bone mineralization disorders
WO2022055350A1 (en) 2020-09-09 2022-03-17 Am-Pharma B.V. Recombinant alkaline phosphatase for use in treating acute respiratory distress syndrome
BR112023016048A2 (pt) 2021-02-12 2023-11-14 Alexion Pharma Inc Polipeptídeos de fosfatase alcalina e métodos de uso dos mesmos
CN118580341B (zh) * 2024-06-24 2025-03-18 浙江大学 一种寄生线虫spi-i8蛋白及其在防治炎症疾病中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06284885A (ja) * 1993-04-02 1994-10-11 Tosoh Corp 組換えヒト小腸アルカリフォスファタ−ゼ
JP2010524496A (ja) * 2007-04-27 2010-07-22 アーエム−ファルマ ベー．フェー． 修飾ホスファターゼ
EP2662448A1 (en) * 2007-05-11 2013-11-13 Alexion Pharma International SARL Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8328918D0 (en) 1983-10-28 1983-11-30 Unilever Plc Alkaline phosphatase
ES2106737T3 (es) 1990-02-07 1997-11-16 Abbott Lab Enzimas de fosfatasa alcalina con actividad especifica mejorada para uso en reactivos indicadores.
EP0584343B1 (en) 1992-03-10 1999-01-20 La Jolla Cancer Research Foundation Recombinant calf intestinal alkaline phosphatase
EP0701441A1 (en) 1993-06-01 1996-03-20 Cortex Pharmaceuticals, Inc. Alkaline and acid phosphatase inhibitors in treatment of neurological disorders
WO1995005455A1 (en) 1993-08-13 1995-02-23 Rijksuniversiteit Te Groningen Pharmaceutical composition comprising phosphatase or a derivative thereof
CA2176709A1 (en) 1993-11-15 1995-05-26 Howard R. Higley Method of treating renal disease by administering igf-i and igfbp-3
MXPA97009909A (es) 1995-06-06 2004-08-23 Gensci Regeneration Lab Inc Materiales osteogenicos modificados.
FR2736065B1 (fr) 1995-06-29 1997-09-19 Commissariat Energie Atomique Phosphatases alcalines bacteriennes modifiees et leurs applications.
JP3488327B2 (ja) 1995-12-21 2004-01-19 よつ葉乳業株式会社 牛乳脂肪球膜含有画分の製造法
US20020114802A1 (en) 1998-02-10 2002-08-22 Tjellstrom Bo Arthur Einar Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease
DE19819962A1 (de) 1998-05-05 1999-11-11 Roche Diagnostics Gmbh Hochaktive alkalische Phosphatase
JP2002533679A (ja) 1998-12-21 2002-10-08 フアーマアウエア・アイピー・ベー・ブイ アルカリホスファターゼのｌｐｓ−結合部分を使用する敗血症の診断
JP2000350596A (ja) 1999-06-11 2000-12-19 Toyobo Co Ltd 分泌性アルカリフォスファターゼの選択的活性測定方法
DE60120007T2 (de) 2000-01-31 2006-11-16 Pfizer Products Inc., Groton Verwendung von Aktivatoren des Prostaglandinrezeptores 4 zur Behandlung von akuter oder chronischer Niereninsuffizienz
DE60129442T2 (de) 2000-07-19 2008-04-17 Mitsubishi Pharma Corp. Sulphonsäurederivate von hydroxamsäuren und deren verwendung in medizinischen produkten
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
DE10101793A1 (de) 2001-01-17 2002-08-01 Manfred Nilius Verwendung von SLPI zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen
WO2002057430A2 (en) 2001-01-20 2002-07-25 Cardion Ag Pluripotent adult stem cells derived from regenerative tissue
EP1393734A4 (en) 2001-06-01 2006-04-12 Ajinomoto Kk DRUG AGAINST DARMER DISEASES
US7157260B2 (en) 2001-07-26 2007-01-02 Japan Science & Technology Agency Nicotianamine synthase and gene encoding the same
JP4169966B2 (ja) 2001-11-14 2008-10-22 株式会社ヤクルト本社 炎症性腸疾患予防治療剤
CN1425766A (zh) 2001-12-19 2003-06-25 复旦大学 一种多肽——人含碱性磷酸酶活性位点的蛋白－9.24和编码这种多肽的多核苷酸
EP1578940A4 (en) * 2002-11-13 2007-12-12 Genentech Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR DYSPLASED DIAGNOSIS
US7048914B2 (en) 2002-12-12 2006-05-23 Zoltan Laboratories Placental alkaline phosphatase to control diabetes
WO2004056987A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Rijksuniversiteit Groningen Modulation of the thioredoxin pathway
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
JP4305071B2 (ja) 2003-06-30 2009-07-29 株式会社ニコン 信号補正方法
JP2005065564A (ja) 2003-08-22 2005-03-17 Hiroshi Ueda センサー蛋白質
US7157261B2 (en) 2003-10-27 2007-01-02 Canji, Inc. Rat secreted embryonic alkaline phosphatase
JP4999467B2 (ja) 2004-02-04 2012-08-15 ファルマアウェア セプシス ビー．ブイ． 粘膜関門に存在するｌｐｓを解毒するためのアルカリホスファターゼの使用
US20110142817A1 (en) 2004-02-04 2011-06-16 Pharmaaware Sepsis B.V. Means and method for treating and/or preventing necrotizing enterocolitis
WO2006096527A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Diversa Corporation Nucleic acids and proteins and methods for making and using them
US20070059300A1 (en) 2005-09-12 2007-03-15 Zoltan Laboratories Llc Compounds and compositions to control abnormal cell growth
US7695714B2 (en) 2005-12-28 2010-04-13 Zoltan Laboratories Llc Use of alkaline phosphatase to maintain healthy tissue mass in mammals
RU2006103770A (ru) * 2006-02-08 2007-08-20 Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук (Тибох Дво Ран) (Ru) Высокоактивная бактериальная щелочная фосфатаза и фрагмент днк, кодирующий щелочную фосфатазу
US20070280922A1 (en) 2006-06-06 2007-12-06 Zoltan Kiss Consulting Combinations of human proteins to enhance viability of stem cells and progenitor cells
US7718170B2 (en) 2006-08-21 2010-05-18 Essential Skincare, Llc Alkaline phosphatase compositions to reduce skin cancer
EP1952823A1 (en) 2007-01-30 2008-08-06 AM-Pharma B.V. The use of alkaline phosphatase in the treatment of reduced renal function
WO2008104199A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Gelato Corporation N.V. Use of ecto-phosphatases for the treatment of (acute) myocardial infarction
EP2030980A1 (en) 2007-08-28 2009-03-04 AM-Pharma B.V. Mutants of lactoferrin
WO2009106368A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Gelato Corporation N.V. Method for increasing the activity of the immune system of a mammal at risk of inflammatory diseases
JP2011521916A (ja) 2008-05-19 2011-07-28 バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ 腸アルカリホスファターゼモジュレーターおよびそれの使用
WO2010025267A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 The General Hospital Corporation Methods of modulating gastrointestinal tract flora levels with alkaline phosphatase
BR112012027765A2 (pt) * 2010-04-30 2019-09-24 Enobia Pharma Inc. métodos, composições e kits para tratamento de distúrbios de mineralização da matriz.
EP3222286B1 (en) 2011-06-08 2020-10-21 AM-Pharma B.V. The use of alkaline phosphatase for preserving renal function
ES2810813T3 (es) 2014-01-24 2021-03-09 Am Pharma Bv Procesamiento para recuperación y purificación de una fosfatasa alcalina
CA2937328C (en) 2014-01-24 2022-09-27 Am-Pharma B.V. Chimeric alkaline phosphatase-like proteins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06284885A (ja) * 1993-04-02 1994-10-11 Tosoh Corp 組換えヒト小腸アルカリフォスファタ−ゼ
JP2010524496A (ja) * 2007-04-27 2010-07-22 アーエム−ファルマ ベー．フェー． 修飾ホスファターゼ
EP2662448A1 (en) * 2007-05-11 2013-11-13 Alexion Pharma International SARL Bone targeted alkaline phosphatase, kits and methods of use thereof

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020512363A (ja) * 2017-03-31 2020-04-23 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 成人及び青年における低ホスファターゼ症（ｈｐｐ）を治療する方法
JP2021515022A (ja) * 2018-03-08 2021-06-17 アーエム−ファルマ ベー．フェー．ＡＭ−Ｐｈａｒｍａ Ｂ．Ｖ． 敗血症関連急性腎障害の治療に使用するための組み換えアルカリホスファターゼ
JP2022078186A (ja) * 2018-03-08 2022-05-24 アーエム－ファルマ ベー．フェー． 敗血症関連急性腎障害の治療に使用するための組み換えアルカリホスファターゼ
JP7502994B2 (ja) 2018-03-08 2024-06-19 アーエム－ファルマ ベー．フェー． 敗血症関連急性腎障害の治療に使用するための組み換えアルカリホスファターゼ
US12433938B2 (en) 2019-12-09 2025-10-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof

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