SA516371532B1 - بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز - Google Patents

بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز Download PDF

Info

Publication number
SA516371532B1
SA516371532B1 SA516371532A SA516371532A SA516371532B1 SA 516371532 B1 SA516371532 B1 SA 516371532B1 SA 516371532 A SA516371532 A SA 516371532A SA 516371532 A SA516371532 A SA 516371532A SA 516371532 B1 SA516371532 B1 SA 516371532B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
rrr
lvl
eee
recap
protein
Prior art date
Application number
SA516371532A
Other languages
English (en)
Inventor
فان إلساس أندريا
جان فان دين بيرج إيرك
لويس ميلان جوس
جونس كورنليوس جونك لويجي
رابين وليام
Original Assignee
إيه إم-فارما بي.في.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by إيه إم-فارما بي.في. filed Critical إيه إم-فارما بي.في.
Publication of SA516371532B1 publication Critical patent/SA516371532B1/ar

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

يتعلق الاختراع بإنزيمات فوسفاتاز قلوية alkaline phosphatases محسنة، تركيبات صيدلانية تشتمل على إنزيمات فوسفاتاز قلوية محسنة واستخدام إنزيمات فوسفاتاز قلوية محسنة للوقاية، أو علاج أو شفاء الأمراض. شكل1.

Description

— \ — بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز ‎Chimeric alkaline phosphatase-like proteins‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع بإنزيمات فوسفاتاز قلوية ‎alkaline phosphatases‏ بخواص محسنة, تركيبات صيدلانية تشتمل على إنزيمات فوسفاتاز قلوية بخواص محسنة واستخدام إنزيمات فوسفاتاز قلوية بخواص محسنة ‎All‏ أو علاج أو شفاء الأمراض. © يعتبر إنزيم الفوسفاتاز ‎phosphatase enzyme‏ إنزيم ينزع الفوسفوريل ‎dephosphorylates‏
من ركائزه: أي أنه يحلل الإسترات الأحادية ‎monoesters‏ لحمض فوسفوريك ‎phosphoric acid‏ بالماء إلى أيون فوسفات 100 ‎Phosphate‏ وجزيء بمجموعة الهيدروكسيل الحرة ‎free hydroxyl‏ يكون هذا التأثير مقابل مباشرةٌ لذلك الخاص بالفسفرة ‎phosphorylases‏ وانزيمات كيناز ‎kinases‏ ‏, التي تصل مجموعات الفوسفات ‎phosphate‏ بركائزها بواسطة استخدام جزيئات نشطة ‎Jie‏
‎ATP Yo‏ يمكن تصنيف إنزيمات الفوسفاتاز في اثنين من التصنيفات الرئيسية: إنزيمات الفوسفاتاز المعتمدة على سيستين ‎Phosphatases‏ 01/516106-1080600601) (0005) وانزيمات الفوسفاتاز المعدنية ‎metallo—phosphatases‏ . تنسق إنزيمات الفوسفاتاز المعدنية نمطياً ¥ من الأيونات الفلزية (100)5 ‎metal‏ الأساسية حفزياً داخل موقعها النشط. يوجد حالياً بعض الالتباس بشأن هوية هذه الأيونات الفلزية, نتج عن
‎Ye‏ المحاولات المتتالية لتحديدها إجابات مختلفة. توجد حاليا أدلة على أن هذه المعادن قد تكون مغنيسيوم ‎magnesium‏ منجنيز ‎manganese‏ , حديد ‎iron‏ الزنك ‎zinc‏ أو أية توليفة ‎Jee‏ ‏نعتقد أن أيون الهيدروكسيل ‎hydroxyl ion‏ الذي يعمل على تكوين رابطة جسرية لاثنين من الأيونات الفلزية 1005 ‎metal‏ يشارك في الهجوم الآلف للنواة ‎nucleophilic‏ على مجموعة الفوسفات ‎.phosphate‏
‎TY
ا تقوم إنزيمات الفوسفاتاز بوظيفتها على نحو معارض لإنزيمات كيناز 61085©65/إنزيمات فوسفوريلاز ‎,phosphorylases‏ التي تضيف مجموعات الفوسفات إلى البروتينات. قد تعمل إضافة أو إزالة مجموعة الفوسفات على تنشيط أو تثبيط الإنزيم (على سبيل المثال, مسار إرسال إشارة كيناز) أو تمكين حدوث تفاعل بروتين-بروتين: بناءً عليه تكون إنزيمات الفوسفاتاز متكاملة مع الكثير من © مسارات الانتقال العارض للإشارة. تجدر بنا الإشارة إلى أن إضافة الفوسفات وإزالته لا تناظر بالضرورة تنشيط الإنزيم أو تثبيطه, وأن العديد من الإنزيمات تشتمل على مواقع فسفرة مستقلة لتنشيط أو تثبيط التنظيم الوظيفي. على سبيل المثال, أو تثبيطه بناءً على وحدة بنائية حمض أميني ‎amino‏ ‏0 المحددة الخاضعة للفسفرة. تعتبر مركبات الفوسفات هامة في الانتقال العارض للإشارة لأنها تنظم البروتينات التي تتصل بها. لعكس التأثير المنظم, يمكن إزالة الفوسفات. يحدث ذلك من تلقاء ‎٠‏ ذاته بواسطة التحلل بالماء, أو يتوسط في حدوثه إنزيمات الفوسفاتاز للبروتين. يتجسد نوع من إنزيم الفوسفاتاز, إنزيم فوسفاتاز قلوي ‎ALP" alkaline phosphatase‏ " أو إنزيم فوسفاتاز ‎(EC 3. 1. 3. 1( ) "AP"‏ في إنزيم هيدروليز ‎hydrolase‏ المسؤول عن ‎A)‏ ‏مجموعات الفوسفات من الكثير من أنواع الجزيئات, بما في ذلك, على سبيل المثال, النيوكليوتيدات ‎nucleotides‏ , البروتينات ‎proteins‏ وأشباه القلويات 81/810105. حتى الآونة الأخيرة, كنا نعتقد ‎٠‏ أن إنزيمات فوسفاتاز قلوية هي الأكثر فاعلية في وسط قلوي ‎alkaline environment‏ كما يقترح الاسم. من الشائع في المجال أن أحد الأدوار الفسيولوجية الممكنة ل ‎AP‏ قد تتمثل في تفاعله مع جزيئات التهابية. أولاً قد تم افترض أن ‎AP‏ ينزع فوسفوريل الذيفان ‎dephosphorylates endotoxins‏ الداخلي وعلى هذا النحو يخفض الاستجابة الالتهابية لهذه الجزيئات الالتهابية للغاية. ومنذ ذلك ‎٠‏ الحين؛ تم افتراض آليات أخرى للتأثير وملاحقتها. ومع ذلك؛ حتى الآن, على الرغم من دوره المفيد في العديد من الأمراض الالتهابية وغيرها أخرى, لم تتضح آلية العمل تماماً. في الماضي, تم استخدام إنزيم فوسفاتاز قلوي من أصل بقري في نماذج حيوانية وتجارب إكلينيكية لعلاج, على سبيل المثال, الإنتان ‎sepsis‏ , إصابة الكلى الحادة ‎kidney injury‏ 80016, مرض الأمعاء الالتهابي ‎inflammatory bowel disease‏ التهاب الأمعاء ‎enterocolitis‏ فقر الدم الموضعي بسبب ‎Yo‏ تلف ‎sale)‏ التروية ‎ischemia reperfusion damage‏ , أو الأمراض الالتهابية فضت
سا ‎inflammatory diseases‏ الأخرى )2013 ‎Riggle et al, J Surg Res.‏ ‎Mar;180(1):21-6; Peters et al, J Pharmacol Exp Ther. 2013 Jan;344(1):2-‏ ‎Martinez—Moya et al, Pharmacol Res. 2012 Aug;66(2): 144-53; Pickkers‏ ;7 ‎et al, Crit Care. 2012 Jan 23;16(1); Ramasamy et al, Inflamm Bowel Dis.‏ ‎Feb;17(2):532-42; Lukas et al, Inflamm Bowel Dis. 2010 ©‏ 2011 ‎Jul;16(7):1 180-6; Bol-Schoenmakers et al, Eur J Pharmacol. 2010 May‏ ‎Heemskerk et al, Crit Care Med. 2009 Feb;37(2):417-‏ ;10;633(1-3):71-7 ‎Tuin et al, Gut. 2009 Mar;58(3):379-87; Su et al, Crit Care Med. 2006‏ :23 ‎Aug;34(8):2182-7; van Veen et al, Br J Surg. 2006 Apr;93(4):448-56; van‏ ‎Veen, Infect Immun. 2005 Jul;73(7):4309-14; Verweij et al, Shock. 2004 ٠‏ ‎(Aug;22(2):174-9‏ ‏على الرغم من أنه في الوقت الحالي, تتوفر إنزيمات فوسفاتاز قلوية, معزولة من مصادر طبيعية فضلاً عن المهندسة ‎Ls‏ لناتج عودة الاتحاد الجيني, المفيدة في كل من تشخيص وعلاج المرض, توجد حاجة إلى إنزيمات الفوسفاتاز البديلة مع على سبيل المثال نشاط مبدل (على سبيل المثال ‎Vo‏ متطور) محدد, ثبات (على سبيل المثال عمر النصف في الكائن ‎all‏ 11/2, أو الثبات في ضوء التخزين (مدة الصلاحية)) أو خصوصية الركيزة. يقدم الاختراع الحالي إنزيمات الفوسفاتاز المعدلة المذكورة, التي تتمتع بخواص متطورة مقارنة بإنزيم فوسفاتاز قلوي خيمري ناتج عودة الاتحاد الجيني الموصوف على نحو موسع في الطلب الدولي ‎oA‏ 7/7 ‎٠‏ الوصف العام للاختراع في نموذج أول, يقدم الاختراع بروتين معزول ‎isolated protein‏ له نشاط إنزيم فوسفاتاز, حيث يشتمل البروتين المذكور على متوالية حمض أميني ‎amino acid sequence‏ بها على ‎JN‏ ‎٠٠‏ حمض أميني متتابع يتسم بتطابق متوالية بنسبة ‎9٠0‏ 96 على الأقل مع متوالية بهوية رقم: *, متوالية حمض أميني بها على الأقل ‎5٠‏ حمض أميني متتابع يتسم بتطابق متوالية بنسبة 90 96 لضت
‎Qo _‏ _ على الأقل مع متوالية بهوية رقم: 7, ومتوالية حمض أميني بها على الأقل £0 أحماض أمينية متتابعة لها تطابق متوالية يبلغ 90 96 على الأقل مع متوالية بهوية رقم: 7, حيث يشتمل البروتين ذو الطول الكامل على متوالية الحمض الأميني لها تطابق متوالية يبلغ ‎9٠8‏ 96 على الأقل مع متوالية الحمض الأميني ذات الطول الكامل لمتوالية بهوية رقم: ‎,١‏ بشرط أن الحمض الأميني عند الموضع © 774 يكون ليوسين ‎leucine‏ (ا), والحمض الأميني ‎amino acid‏ عند الموضع ‎YA‏ يكون فالين ‎(V) valine‏ و والحمض الأميني عند الموضع ‎EVA‏ يكون ليوسين (ا). في نموذج مفضل, يشتمل البروتين ذو الطول الكامل على متوالية الحمض الأميني التي لها تطابق بنسبة على الأقل 6 969, على الأقل 9695, أو على الأقل 96978 تطابق متوالية مع متوالية الحمض الأميني ذات الطول الكامل لمتوالية بهوية رقم: ‎,١‏ بشرط أن الحمض الأميني ‎amino acid‏ المناظر ‎٠‏ للموضع 779 يكون ليوسين ‎leucine‏ (ا), الحمض الأميني المناظر للموضع 7748 يكون فالين ‎(V) valine‏ والحمض الأميني المناظر للموضع ‎EVA‏ يكون ليوسين (ا). المقصود بالتعبير "'مناظر ل" في الطلب الحالي, أن يعني الموضع المعين, بالنسبة إلى الحمض الأميني للطرف لا من البروتين الناضج, الذي يتم تحديده عند ' الموضع ‎."١‏ التعبير 'مناظر ل" لا يشير صراحة إلى الوحدة البنائية للحمض الأميني المعين على ذلك الموضع المعين. ‎Vo‏ التعبيرات "بروتين” و "بولي ببتيد ‎polypeptide‏ " تشير إلى مركبات تشتمل على أحماض أمينية مرتبطة عن طريق روابط الببتيد ‎peptide bonds‏ ويمكن استخدامها على نحو تبادلي. وفقاً لاستخدامه في الطلب الحالي, حيثما يرد ذكر 'متوالية الحمض الأميني" فإنها تشير إلى متوالية الحمض الأميني لبروتين أو جزيء ببتيد ‎٠‏ يمكن استنتاج 'متوالية الحمض الأميني" من متوالية الحمض الأميني التي تشفر البروتين. ومع ذلك؛ التعبيرات ‎Jie‏ "بولي ‎a‏ أو 'بروتين" لا يقصد ‎Lae Yo‏ أن تقيد متوالية الحمض الأميني على متوالية الحمض الأميني المستنتجة, ولكن يمكن أن تتضمن تعديلات ما بعد الترجمة الوراثية لمتواليات الحمض الأميني المستنتجة, مثل عمليات حذف الحمض الأميني, والإضافات, والتعديلات مثل عمليات المعالجة بالجليكوسيل ‎glycosylations‏ ‏واضافة شقوق دهنية. كذلك يقع استخدام الأحماض الأمينية غير الطبيعية, ‎Jie‏ أحماض أمينية -
‎h —‏ _ 0 لتحسين الثبات أو الخواص الحركية الدوائية في نطاق مجال التعبير 'متوالية الحمض الأميني", ما لم يتم بيان خلاف ذلك. يُفضل, أن يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية الحمض الأميني من ‎5٠0‏ = 10 يُفضل ‎To - 1‏ يُفضل أكثر 7+ - ‎To‏ يُفضل أكثر 64 - ‎eo‏ الأفضل ‎To‏ حمض أميني متتابع, التي لها تطابق بنسبة على الأقل 9690, يُفضل على الأقل ‎Bde‏ يُفضل أكثر على الأقل 96978
‏تطابق متوالية مع النطاق التاجي ذي الطول الكامل ل ‎PLAP‏ البشري. لأغراض الاختراع الحالي, يتم وضع خط تحت متوالية الحمض الأميني المناظرة للمتوالية المرجعية للنطاق التاجي ذي الطول الكامل ل ‎PLAP‏ البشري في المتوالية بهوية رقم: ؟, المصورة في الشكل ‎١‏ وتناظر المواضع ‎FIT‏ ‎EY -‏ فيها.
‎٠‏ يُفضل, أن يشتمل ‎eda‏ من البروتين المذكور على متوالية الحمض الأميني من ‎You‏ = 68 , يُفضل أكثر ‎Fe - Yoo‏ يُفضل أكثر ‎Ye - 0٠0‏ يُفضل أكثر ‎Fe - Yoo‏ يُفضل أكثر على الأقل ‎Fo - ٠‏ الأفضل 7715 أحماض أمينية متتابعة لها + 969, ‎Jind)‏ على الأقل 96925, يُفضل أكثر على الأقل 9698 تطابق متوالية مع منطقة الطرف لا التي تجانب النطاق التاجي ل اطام البشري. تعد منطقة الطرف ‎N‏ التي تجانب النطاق التاجي منطقة من جزأين للنطاق الحفزي.
‎Ve‏ يُفضل, أن يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية الحمض الأميني من £0 - 4, يُفضل ‎to‏ - 08 يُفضل أكثر ‎Jad) ,4 - 5٠‏ أكثر ‎oF‏ - 08 الأفضل 08 أحماض أمينية متتابعة لها + 969, يُفضل على الأقل 1695, يُفضل أكثر على الأقل 9698 تطابق متوالية مع منطقة الطرف © التي ‎clas‏ النطاق التاجي ل 801 البشري. تعد منطقة الطرف © المذكورة التي تجانب النطاق التاجي الثانية من جزأين للنطاق الحفزي.
‎Yo‏ لأغراض الاختراع الحالي, يتم تصوير متوالية الحمض الأميني من الموالية المرجعية لبروتين ناضج ل بشري ‎human PLAP‏ في الشكل ‎١‏ (متوالية بهوبة رقم: ؟). لغرض تحديد المناطق المجانبة للطرف ل والطرف ©, يشار إليها معاً باسم النطاق الحفزي, يتم وضع خط تحت النطاق التاجي ل ‎ALP‏ البشري في الطلب الحالي.
ل في نموذج مفضل معين, يقدم الاختراع بروتين وفقاً للاختراع, حيث يشتمل البروتين المذكور على متوالية الحمض الأميني من ‎5٠0‏ - 10 يُفضل 10 - 15, يُفضل أكثر 17 - ‎to‏ يُفضل أكثر 4 - 15, الأفضل 15 أحماض أمينية متتابعة, التي لها تطابق بنسبة على الأقل + 969, يُفضل على الأقل 9695, يُفضل أكثر على الأقل 96978 تطابق متوالية مع النطاق التاجي ذي الطول الكامل ل ‎PLAP‏ البشري, أن يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية الحمض الأميني من ‎٠٠00‏ - ‎Tho‏ يُفضل أكثر ‎You‏ - 15, يُفضل أكثر ‎Yo - 3٠0١‏ يُفضل أكثر ‎vou‏ - 15, يُفضل أكثر 310 - ‎v0‏ الأفضل 7765 أحماض أمينية متتابعة التي لها تطابق بنسبة على الأقل + 969, يُفضل على الأقل 9695, يُفضل أكثر على الأقل 9698 تطابق متوالية مع منطقة الطرف لا التي تجانب النطاق التاجي ل ا0ا2 البشري, وأن يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية الحمض ‎Ya‏ الأميني من 6 - 08 يُفضل £0 - 08 يُفضل أكثر ‎ov‏ - 08 يُفضل أكثر 7ه - ‎of‏ ‏الأفضل ‎of‏ أحماض أمينية متتابعة التي لها تطابق بنسبة على الأقل 0 964, يُفضل على الأقل 58, يُفضل أكثر على الأقل 9698 تطابق متوالية مع منطقة الطرف © التي تجانب النطاق التاجي ل ‎ALP‏ البشري. المقصود بمنطقة مجانبة للطرف لا من النطاق التاجي امتداد أحماض أمينية مجاور (أي؛ يُفضل ‎Ve‏ أقل من ‎٠١‏ أحماض أمينية, يُفضل أكثر أقل من ‎V0‏ يُفضل أكثر أقل من ‎,٠١‏ يُفضل أكثر أقل من «, يُفضل ‎ST‏ أقل من ©, يُفضل ‎ST‏ أقل من ‎,١‏ الأفضل عدم تباعد أي حمض أميني) إلى متوالية النطاق التاجي (الأحماض الأمينية المناظرة منها الموضوع تحتها خط في الشكل ‎,)١‏ عند الجانب الأيسر من النطاق التاجي, حيث يتم تعريف الجانب الأيسر باعتباره ذلك الجزءِ من سلسلة الببتيد التي تحمل المجموعة الأمينية ‎(NH2) Amino radical‏ من الحمض الأميني الأول.
‎٠‏ المقصود بمنطقة مجانبة للطرف لا من النطاق ‎all)‏ امتداد أحماض أمينية مجاور (أي؛ يُفضل أقل من ‎٠١‏ أحماض أمينية, يُفضل أكثر أقل من ‎V0‏ يُفضل أكثر أقل من ‎,٠١‏ يُفضل أكثر أقل من «, يُفضل ‎ST‏ أقل من ©, يُفضل ‎ST‏ أقل من ‎,١‏ الأفضل عدم تباعد أي حمض أميني) إلى متوالية النطاق التاجي (الأحماض الأمينية المناظرة منها الموضوع تحتها خط في الشكل ‎,)١‏ عند الجانب الأيسر من النطاق التاجي, حيث يتم تعريف الجانب الأيسر باعتباره ذلك الجزءِ من سلسلة
‎Yo‏ الببتيد التي تحمل المجموعة الأمينية ‎(NH2)‏ من الحمض الأميني الأول.
—A— ‏المقصود بمنطقة مجانبة للطرف © من النطاق التاجي امتداد أحماض أمينية مناظر للمواضع‎ ‏يُفضل‎ ,٠١ ‏يُفضل أكثر أقل من‎ V0 ‏أحماض أمينية, يُفضل أقل من‎ ٠١ ‏المجاورة (أي أقل من‎ ‏أكثر أقل من «, يُفضل أكثر أقل من ©, يُفضل أكثر أقل من ؟, الأفضل عدم تباعد أي حمض‎ ‏أميني) إلى متوالية النطاق التاجي (الأحماض الأمينية المناظرة منها الموضوع تحتها خط في الشكل‎ ‏عند الجانب الأيمن من النطاق التاجي, حيث يتم تعريف الجانب الأيمن باعتباره ذلك الجزء من‎ ,)١ ‏سلسلة الببتيد التي تحمل مجموعة كربوكسيل ألفا الحرة من الحمض الأميني الأخير.‎ ‏في البشرء تم تمييز أربع صور متساوية من إنزيم فوسفاتاز القلوي حتى الآن. وهي إنزيم فوسفاتاز‎ idl (ALPP), ‏؛‎ intestinal ‏المعوي‎ (ALPI) alkaline phosphatase ‏القلويي‎ ‏العظم‎ [liver asl ‏والمأخوذ من‎ «(GCAP) placental-like ‏وشبه المقيمي‎ placental ‏توجد الثلاث الأولى‎ ٠ (TNAP) ( tissue non-specific ‏الكلى (أو غير المحدد بنسيج‎ / 09006 ٠ ‏؟ في حين توجد الصورة غير المحددة بنسيج على الكروموزوم‎ chromosome ‏على الكروموزوم‎ las ‏يكون مشتركاً في عدد كبير‎ AP ‏الوظائف الفسيولوجية الدقيقة ل 805 لا تعرف؛ وإنما يبدو أن‎ .١ ‏من العمليات الفسيولوجية.‎ ‏تُعرف متوالية إنزيمات فوسفاتاز القلوية البشرية في المجال ويمكن العثور عليها بسهولة في قواعد‎
PLAP ‏البيانات ذات الصلة. لتحديد النسبة المثوية 96 لتطابق المتوالية إلى النطاق التاجي من‎ ١ ‏والنطاق الحفزي من ا0ا2, يُفضل استخدام المتواليات المرجعية المناظرة . يتم تصوير المتوالية‎ ‏البشري‎ ALPP ‏المرجعية ل اظا البشري كمتوالية بهوية رقم: 7. يتم تصوير المتوالية المرجعية ل‎ ‏يتم وضع خط تحت المتوالية‎ ,١ ‏داخل تلك المتواليات المرجعية في الشكل‎ LY ‏كمتوالية بهوية رقم:‎ ‏التي تعرف على نحو شائع باسم النطاق التاجي.‎ ‏أى طهاط. تشير الاختصارات اطاحم‎ ALPP ‏يختصر إنزيم فوسفاتاز القلوي المشيمي بالاختصار‎ Yo ‏إلى إنزيمات فوسفاتاز القلوية المعوية. ويتم اختصار إنزيم فوسفاتاز القلوي الشبيه بالمشيمي‎ IAP ‏أو‎ ‎ALPL ‏الاختصارات‎ saudi; GCAP ‏أو‎ ALPG ‏أو‎ (ALPP2 ‏في الطلب الحالي باسم‎ " ‏في الطلب الحالي لتشير إلى إنزيم فوسفاتاز قلوي غير محدد بالكبد/‎ BLK ‏أو‎ TNAP (TNSALP ‏النسيج. ويمكن استخدام الاختصارات المختلفة لأحد إنزيمات فوسفاتاز قلوي والإنزيم ذاته بالتبادل في‎ ‏الطلب الحالي.‎ Ye ‏فضت‎
‎q —_‏ _ من وجهة نظر توافقية, يتكون إنزيم فوسفاتاز قلوي بالكاد من نطاقين: نطاق تاجي ونطاق موضع ‎Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications in ( lis‏ ‎Luis Millan; Wiley, 2006‏ 056ل ‎(Medicine and Biotechnology.‏ يمكن تقسيم نطاق موضع نشط إلى ‎shal‏ منفصلة ‎Jie‏ الوحدة البنائية الحفزية وثلاثة مواضع أيون فلز ‎metal ion‏ © (الزنك ‎١ Zinc‏ (0)ء الزنك ‎Zinc‏ ؟ (20) ؛ المغنسيوم ؟ ‎(Mg) Magnesium‏ . من وجهة النتظر الأساسية الأولية, من الواضح أنه يتم تقسيم النطاق التاجي بواسطة الأحماض الأمينية التي تشكل نطاق الموضع النشط. من ثم؛ في نموذج مفضل, لا يتألف النطاق الحفزي من متوالية متماسة من أحماض أمينية, ولكن التي تجانب النطاق التاجي. بالإشارة المرجعية إلى متوالية بهوية رقم:٠‏ تشير إلى متوالية الحمض الأميني من إنزيم فوسفاتاز قلوي واحد وفقاً للاختراع, مما لا يقيد الاختراع ‎٠‏ الحالي بأي حال, يشتمل النطاق التاجي على نحو مفضل على الأحماض الأمينية في الموضع ‎YT‏ ‏- 3,670( حين النطاق الحفزي يُفضل أن يشير إلى المتواليات المتبقية قبل الموضع 717 وبعد الموضع ‎EF‏ في متواليات البروتين الناضج كالمصور في الشكل ‎.١‏ تعرف متوالية الحمض الأميني من إنزيمات فوسفاتاز قلوية والمواضع النسبية للنطاق الحفزي والنطاق التاجي من قبل الشخص المتمرس ( ‎Mammalian Alkaline Phosphatases: From Biology to Applications‏ ‎.(in Medicine and Biotechnology.
José Luis Millan; Wiley, 2006 ٠‏ في بعض النماذج, يشتمل بروتين وفقاً للاختراع بهذه الطريقة على متوالية لها تطابق متوالية يبلغ ‎٠‏ % على الأقل مع النطاق التاجي لبروتين ‎ALPP‏ البشري ومتوالية لها تطابق متوالية يبلغ ‎Ue‏ ‏6 على الأقل مع النطاق الحفزي لإنزيم فوسفاتاز قلوي معوي بشري. يُفضل أن تتسم المتوالية المذكورة بالتطابق المذكور لمتوالية للنطاق التاجي ل ‎ALPP‏ يوجد في بروتين وفقاً للاختراع عند ما ‎Yo‏ يقرب من نفس الموضع باسم النطاق التاجي لبروتين ‎ALPP‏ في بروتين ‎ALPP‏ الأصلي : أي تقريباً عند الموضع تن — ‎EV‏ بالنسبة إلى الموضع ‎١‏ كما هو مبين في الشكل ‎١‏ (يتم وضع خط تحت المتوالية التي تمثل النطاق التاجي). المتوالية التي لها تطابق متوالية مع النطاق التاجي لبروتين ‎ALPP‏ يُفضل أن يكون لها على الأقل 5, يُفضل أكثر على الأقل 9648, الأفضل 96100 تطابق متوالية مع المتوالية الأصلية للنطاق بد
-١- 470 — YU ‏التاجي لبروتين 8100, يتم تمثيله بواسطة أحماض أمينية تحتها خط في المواضع‎ ‏في المتوالية بهوية رقم: ؟.‎ ‏يتم تعريف النسبة المئوية لتطابق الحمض الأميني أو متوالية حمض نووي, أو التعبير "96 تطابق‎ ‏متوالية", في الطلب الحالي بالنسبة المئوية للوحدات البنائية في حمض أميني مرشح أو متوالية حمض‎ ‏نووي تكون متطابقة مع الوحدات البنائية في متوالية مرجعية بعد محاذاة المتواليتين و فراغات الإدخال,‎ © ‏إذا لزم الأمر, لتحقيق أقصى تطابق متوالية. في نموذج مفضل, يتم إجراء حساب النسبة المئوية‎ ‏المذكورة على الأقل لتطابق متوالية بدون فراغات إدحال. تعرف الطرق والبرامج الحاسوبية للمحاذاة‎
National Center ‏للمركز‎ BLAST ‏أو خدمة‎ "Align 2" ‏جيدا في المجال, على سبيل المثال‎ .(NCBI) for Biotechnology Information ‏يُفضل أن تكون المتوالية المذكورة التي لها متوالية تكون متطابقة بنسبة على الأقل 9696 مطابقة‎ ٠ ‏الذي يجانب النطاق التاجي ل ااه الذي يقع في بروتين وفقاً للطلب عند ما يقرب‎ N ‏لجزء الطرف‎ ‏من نفس الموضع كما ذلك الجزء من ا©اه بروتين ااه الأصلي, أي طبقاً لما يتم تمثيله بواسطة‎ .١ ‏في الشكل‎ ١ ‏في المتوالية بهوية رقم:‎ 2765 - ١ ‏المواضع‎ ‏علاوة على ما سبقء المتوالية التي لها تطابق متوالية مع النطاق الحفزي ل ا0ا8ه يُفضل أن يكون‎ ‏.لها على الأقل 9695, يُفضل أكثر على الأقل 9698 تطابق متوالية مع جزء الطرف ل الذي يجانب‎ Vo ‏متوالية بهوية رقم:‎ ,١ ‏في الشكل‎ 315 - ١ ‏يتم تمثيله بواسطة المواضع‎ ALPE ‏النطاق التاجي‎
YYA ‏بشرط أن الحمض الأميني عند الموضع 779 يكون ! والحمض الأميني المناظر للموضع‎ ," ‏الأفضل, أن تكون المتوالية التي لها تطابق متوالية مع جزء ذلك الطرف لا للنطاق الحفزي‎ LV ‏يكون‎ ‏باستثناء الحمض الأميني عند الموضع‎ ALP ‏مطابقة للمتوالية الأصلية للنطاق الحفزي ل‎ ALP ‏ل‎ ‎VITA ‏يكون ا ويكون الحمض الأميني عند الموضع‎ 7714 0 ٠ ‏يُفضل أن تكون المتوالية المذكورة التي لها متوالية تكون متطابقة بنسبة على الأقل 9696 مطابقة‎ ‏لجزء الطرف © الذي يجانب النطاق التاجي ل ا0ا2 واقعة في بروتين وفقاً للاختراع عند ما يقرب‎ ‏من نفس الموضع كما ذلك الجزء من ااه لبروتين ااه الأصلي, أي طبقاً لما يتم تمثيله بواسطة‎ .١ ‏في المتوالية بهوية رقم:‎ EAE - £7) ‏المواضع‎ ‏ير نض‎
-١١- ‏إن المتوالية التي لها تطابق متوالية مع جزء الطرف © الذي يجانب النطاق التاجي ل اا يُفضل‎ ,© ‏أن يكون لها على الأقل 9695, يُفضل أكثر على الأقل 96978 تطابق متوالية مع متوالية الطرف‎ ‏في المتوالية بهوية‎ EAE - 47١ ‏ويتم تمثيلها بواسطة المواضع‎ ALPE ‏التي تجانب النطاق التاجي‎ ‏يكون ا. والأفضل, أن تكون المتوالية التي‎ EVA ‏بشرط أن الحمض الأميني عند الموضع‎ | Y ‏رقم:‎ ‏لها تطابق متوالية مع جزء الطرف © ذلك للنطاق الحفزي ل اا مطابقة للمتوالية الأصلية للنطاق‎ © ‏الحفزي ل ا210, باستثناء الحمض الأميني الذي يكون عند الموضع 597/8 ا.‎ ‏فيما سبق, تبين أن إنزيم فوسفاتاز قلوي له متوالية نطاق تاجي لها تطابق متوالية مع النطاق التاجي‎ ‏وله نطاق حفزي له تطابق متوالية مع النطاق الحفزي ل ااه (يُشار إليه في الطلب‎ ALPP ‏لبروتين‎ ‎+202 ‏وقد احتفظ بنشاطه المحدد الأولي في وسط منخفض‎ (catALPI/crownALPP ‏الحالي باسم‎ ‏أظهرت هذه النتائج أن النشاط في الكائن الحي يكون مستقلاً عن 202+ . بالمقارنة, فقد اطاحم‎ . ‏هذا‎ Jie ‏بسرعة نشاطه تحت تأثير نفس ظروف الانخاض في 202+ . استنتج المخترعون أن‎ ‏الإنزيم الذي يكون نشاطه مستقلا عن 202+ يمكن أن يكون مفيداً في المرض حيث يكون استنفاذ‎ ‏جزءٍ من المرض (على سبيل المثال العيوب الغذائية, إدمان الكحول وتلف مرتبط بالأمعاء,‎ +2 ‏حالات عدوى مزمنة بما في ذلك الإنتان, أو الأمراض الالتهابية بصفة عامة) أو حيثما يمكن أن‎ ‏تتعارض إضافة 202+ (كعامل تثبيت في التصنيع) (على سبيل المثال الطور الحاد من الإنتان,‎ ١ catALPI/crownALPP ‏الإنتاج والتطبيق, اتسم‎ Lhe ‏أمراض المناعة الذاتية). بغض النظر عن‎ catALPl/crown ALPP ‏كذلك بميزات فيما يتعلق بالثبات أثناء التخزين. يتم وصف خواص‎
CY RANT ‏بالتفصيل في الطلب الدول رقم‎ ‏يبين الطلب الحالي على نحو يثير الاندهاش أن البروتين وفقاً للاختراع الحالي أكثر ثباتا كذلك عند‎ ‏تركيز منخفض من 202+ . وقد تبين هنا, أن التعديل المحدد الذي يتضمن ثلاثة مواضع بالنسبة‎ Vo +202 ‏الموصوفة فيما سبق يزيد من عدم الاعتمادية على‎ catALPI/crownALPP ‏إلى متوالية‎ ‏الأصلي, مثل ا©ال, يفقد نشاطه الإنزيمي في‎ AP ‏بصورة أكبر. باختصار, تبين بالتالي أن بروتين‎ ‏لما تم وصفه في‎ lay) catALPI/crownALPP ,+202 ‏البيئات ذات تركيزات منخفضة من‎ ‏يحتفظ بنشاطه في البيئات ذات 202+ منخفض ولكن يفقد نشاطه عندما, تتم‎ (Yee A/V TT ONY ‏على سبيل المثال إضافة عوامل خالبة ل 202+, في حين يحتفظ البروتين وفقاً للاختراع الحالي‎ YO ‏ير نض‎ yy
بكثير من نشاطه حتى في وجود خالب زنك, ‎EDTA Jie‏ بالتالي» في الأمراض حيث يمثل الاستنفاذ الحاد ل 202+ ‎sa‏ من المرض, يكون بروتين ‎AP‏ الأصلي المذكور غير قابل على فك طي نشاطه الإنزيمي عند الموضع حيث يعتقد أنه يمثل الأكثر ‎leis‏ على سبيل المثال عند موضع الالتهاب. على ‎(adil)‏ إن بروتين 86 ناتج الاتحاد الجيني غير المعرض لتركيزات منخفضة جدا من 202+, © على وجه الخصوص بروتين وفقاً للاختراع يحتفظ بنشاطه في وسط به تركيز منخفض للغاية من 2م, على سبيل المثال في موضع التهاب. يكون مثل هذا الإنزيم بالتالي مفيد للغاية لعلاج الأمراض التي تكون راجعة إلى أو تصاحبها مستويات منخفضة من 202+ . يمكن أن تجعل ‎Jie‏ ‏هذه المستويات المنتخفضة من 202+ إنزيمات فوسفاتاز قلوية أخرى أقل فعالية, مقارنة ببروتين وفقاً
للاختراع.
‎٠‏ يعتمد العديد من الإنزيمات في الجسم البشري على 202+ لنشاطها وعلى سبيل المثال تكون الاستجابات المناعية أكثر فعالية في حالة وجود مستويات كافية من 202+ . من المعروف أن الأجزاء الخاملة فضلا عن المحدد من الجهاز المناعي تتأثر بالزنك وقد تقرر أن البروتينات التي تحتوي على الزنك تتراكم في مواضع الالتهاب. في الفرد السليم, تتراوح القيم المرجعية لمصل 212+ بين ‎٠١‏ و70 ميكرو مولار. على سبيل المثال في حالة إدمان الكحول أو أثناء سوء التغذية, يمكن
‎Ve‏ أن تنخفض هذه المستويات إلى أقل من ‎٠١‏ ميكرو مولار أو حتى أقل من ‎١‏ ميكرو مولار. علاوة على ما سبق؛ يصاحب الالتهاب دون المزمن, مثل التهاب المفاصل الروماتويدي, الإنتان, ومريض ‎aii Crohn‏ الزنك في المصل. في ‎Jie‏ هذه الأوساط التي تفتقر إلى 202+, يكون بروتين ‎Gay‏ ‏للاختراع مع ذلك فعال للغاية في حين تفقد إنزيمات الفوسفاتاز القلوية الأخرى المعروفة بسرعة أكبر أو أقل نشاطها الخاص بإنزيم الفوسفاتاز. بالتالي يقدم الاختراع وجهة نظر تفيد ‎ob‏ بروتين وفقاً
‎+202 ‏للاختراع يكون مفيدا بصورة خاصة في علاج مرض يصاحبه نقص موضعي أو جهازي في‎ ٠ ‏مقارنة بإنزيمات فوسفاتاز قلوية أخرى معروفة, يكون البروتين وفقاً للاختراع أكثر فعالية تحت‎ . ‏تأثير ظروف 202+ منخفضة. لذلك في نموذج مفضل, يقدم الاختراع بروتين وفقاً للاختراع‎ ‏للاستخدام في الوقاية من أو علاج مرض يصاحبه نقص في 202+ . يُفضل, أن يتضمن المرض‎ ‏المذكور مرض التهابي, يُفضل أكثر أن يكون منتقى من المجموعة التي تتكون من أمراض المناعة‎
‎, rheumatoid arthritis ‏التهاب المفاصل الروماتويدي‎ , autoimmune diseases ‏الذاتية‎ ©
١س‎
الربيو ‎asthma‏ ؛ ومرض الانسداد الرثوي المزمن ‎chronic obstructive pulmonary disease‏ ‎٠‏ وتصلب الشرايين ‎atherosclerosis‏ » وأمراض التهاب في ‎stall‏ الهيضمية ‎inflammatory‏ ‎disease of the gastro-intestinal tract‏ « والعدوى ‎infection‏ ؛ وتعفن الدم ‎sepsis‏ ء التهاب الجلد العصبي ‎Nneurodermatitis‏ « ومرض التهاب الكبد ‎inflammatory liver disease‏ © ومرض التهاب الرئة ‎inflammatory lung disease‏ ومرض التهاب الكلى ‎inflammatory‏ kidney disease ‏أو 'نقص في 202+ " أن كمية الزنك‎ zine deficiency ‏المقصود بالتعبير "نقص الزنك‎ ‏(موضعياً) المتوفرة تكون غير كافية لإتاحة نشاط خلوي و/ أو إنزيمي غير معاق. يمكن أن يكون‎ ‏نقص الزنك مطلق أو نسبي, حيث يمكن أن يكون نقص الزنك المطلق محدد بسهولة بالرجوع إلى‎
‎٠‏ القيم المرجعية في الأفراد الأصحاء, معروفاً في المجال. يمكن أن يحدث نقص الزنك النسبي, على سبيل المثال, عندما تكون تركيزات الزنك لا تزال في نطاق الحدود المعينة من قبل القيم المرجعية في الأفراد الأصحاء, ولكن تكون تركيزات الزنك المطلوب أعلى من المعتاد, على سبيل المثال أثناء الالتهاب. في بعض النماذج, يعني نقص الزنك أن تركيز الزنك لدى الخاضع (موضعياً) يكون أدنى من ‎٠١‏ ميكرو مولار, يُفضل ‎ST‏ أدنى من © ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من ‎١‏ ميكرو مولار,
‎١‏ يُفضل أكثر أدنى من ‎١‏ ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من ‎١١‏ ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من ‎١05‏ ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من 07 ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من ‎٠.01‏ ‏ميكرو مولار, يُفضل أكثر أدنى من 0058© ميكرو مولار, والأفضل أدنى من 5007© ميكرو مولار. في بعض النماذج, يعني نقص الزنك أن تركيز الزنك (الموضعي) يكون أقل من الضروري لنشاط خلوي و/ أو إنزيمي غير معاق.
‎٠‏ المقصود بالتعبير 'مرض التهابي ‎inflammatory disease‏ ", أي مرض يكون راجع إلى أو يصاحب استجابة نسيج واقي للإصابة أو تدمير الأنسجة, مما يؤدي إلى تدمير, تخفيف, أو يقاوم كل من العامل المؤدي إلى الإصابة والأنسجة المصابة. تتمثل العلامات التقليدية للالتهاب في الألم (التألم), السخونة (الحرارة), الاحمرار (تورد الجلد), تورم (الورم), وفقد الوظيفة (الوظائف). نمطياً, يتميز الالتهاب بزيادة في متغيرات الالتهاب, ‎Jie‏ بروتين ‎C‏ التفاعلي ‎C-reactive protein‏ ,
‎Yo‏ الكريات البيض ‎IL-6) cytokineslis silly leucocytes‏ عال] 1 ألفا, إلخ).
‎TY yg ‏على الرغم من أن الالتهاب يكون وقائي بصورة أولية بطبيعته, إلا أن المرض الالتهابي المختل, مثتل‎ ‏التهاب المفاصل الروماتويدي وأمراض المناعة الذاتية (الأخرى), تقع كذلك في نطاق تعريف 'مرض‎ ‏للاستخدام في علاج المريض‎ Jal ‏التهابي”. في نموذج مفضل, يفيد البروتين وفقاً للاختراع‎ ‏الالتهابي المختل أو الضار.‎ ‏علاوة على ما سبق؛ أثناء التحليل الحركي الدوائي القياسي, لاحظ المخترعون الحاليون على نحو‎ © ‏غير متوقع أن البروتين وفقاً للاختراع يكون مستهدفاً للعديد من الأعضاء, على وجه الخصوص‎ ‏الجلد والكلى والطحال والكبد والرئتين والدماغ؛ والدهون والعظام؛ والقولون. باستخدام بروتين يود‎ ‏مشع- مقترن وفقاً للاختراع, لوحظ أن النسبة المئوية من نسبة العضو//لدم للبروتين وفقاً للاختراع‎ ‏تكون محبذة بصورة خاصة للجلد والكلى‎ catALPI/crownALPP ‏بالنسبة إلى تلك الخاصة ب‎ ‏والدهون والعظام؛ والقولون, أي يكون البروتين وفقاً للاختراع‎ gladly ‏والطحال والكبد والرئتين‎ ٠ catALPI/crownALPP ‏مستهدفاً بصورة نسبية أكبر منه بالنسبة لهذه الأعضاء من بروتين‎ ‏المعروف. على وجه الخصوص, يستقر البروتين وفقاً للاختراع بتركيزات أقل في الدم عن‎ ‏في الأعضاء المذكورة. عندما يتطلب الأمر علاج‎ lef ‏ويستقر بتركيزات‎ catALPI/crownALPP ‏تتعلق بهذه الأعضاء, مثل التهاب الجلد العصبي الكبد؛ إصابة الكلى؛ وتليف الكبد؛ ونقص‎ Alla ‏الفوسفاتاز أو ما شابه ذلك يتطلب الأمر بروتين أقل للعلاج, مما يقلل التكلفة و/ أو يزيد من الفعالية.‎ ٠ ‏تم إجراء التجارب التي تتضمن الأمراض المتعلقة بهذه الأعضاء بالفعل (نقص الفوسفاتاز‎ ‏أو يتم التخطيط‎ ,) kidney disease ‏الأخذة في الزيادة (مرض الكلى‎ ,(hypophosphatasia ‏لها. بالتالي يقدم الاختراع بروتين يظهر استقلالية محسنة عن الزنك وخواص حركية دوائية عند‎ ‏المقارنة بإنزيمات فوسفاتاز قلوية معروفاً في المجال.‎ ‏أظهر المخترعون, في نماذج عاملة متنوعة, أن البروتين وفقاً للاختراع يكون مفيداً كدواء. تتضمن‎ al ٠ reduced ‏الأمراض أو الحالات التي يمكن علاجها ببروتين وفقاً للاختراع: انخفاض وظائف الكلى‎ ‏ونقص الفوسفاتاز‎ renal failure ‏الفشل الكلوي‎ , kidney injury ‏إصابة الكلى‎ renal function ‏علاوة على ما سبق؛ بسبب سمات محددة من بروتين إنزيم فوسفاتاز قلوي‎ . 38 ‏وفقاً للاختراع مما يشكل تحسينات على بروتينات إنزيم الفوسفاتاز القلوي المعروفة التي تم استخدامها,‎ ‏يعد البروتين وفقاً للاختراع مفيداً ليس فقط لانخفاض وظائف الكلى, إصابة الكلى, الفشل الكلوي‎ Yo ‏ير نض‎
اج \ _
ونقص الفوسفاتاز, ولكن كذلك الوقاية من أو لعلاج أمراض المناعة الذاتية, التهاب المفاصل
الروماتويدي, الربوء ومرض الانسداد الرئوي المزمن؛ وتصلب الشرايين ‎atherosclerosis‏ «
وأمراض التهاب في القناة الهضمية؛ والعدوى؛ وتعفن الدم؛ التهاب الجلد العصبي؛ وتعفن الدم؛ التهاب
الجلد العصبي؛ ومرض التهاب الكبد ومرض التهاب الرئة ومرض التهاب الكلى. وهذه جميعا © الأمراض التي تصيب الأعضاء التي يستهدفها بروتين وفقاً للاختراع و/ أو يصاحبها نقص الزنك
‎zinc deficiency‏ (النسبي).
‏التعبير 'وقاية " أو 'واقي” يتم تعريفه في الطلب الحالي ‎aly‏ القيام بإعطاء (إحداث تأثير) بروتين
‏وفقاً للاختراع إلى خاضع بقصد منع الخاضع المذكور من الإصابة بمرض معين. على الرغم من
‏أن القصد من العلاج هو وقاية الخاضع المذكور من الإصابة بالمرض المذكور, إلا أنه ليس من
‎٠‏ الضروري أن تتم الوقاية تماما من الحالة المرضية بعد إعطاء واحد أو عدة إعطاءات لبروتين وفقاً للاختراع, حيث لا يكون الخاضعون؛ على سبيل المثال؛ بالضرورة معرضين لبروتكول علاج. على كل حال يفضل أن, يتم تحقيق فعالية الوقاية المذكورة في تلك المجموعة من الخاضعين التي تلقت بروتين وفقاً للاختراع للوقاية من مرض معين تبدي على الأقل زيادة منخفضة في حدة المرض أو على سبيل المثال مضاعفات أقل للمرض المذكور, عند المقارنة بمجموعة من الخاضعين لم تتلقى
‎١‏ البروتين المذكور. على سبيل المثال في حالة مرض الكلى, يُفضل أن يبدي الخاضعون المعرضين لخطر الإصابة بمرض كلوي, بعد المعالجة ببروتين وفقاً للاختراع تدني أقل في وظيفة الكلى, بالنسبة إلى الخاضعين الذين لم يتم علاجهم بالبروتين المذكور. في ‎Alla‏ إصابة خاضع بمرض تم إعطاؤه بروتين من أجل ذلك للوقاية من المرض المذكور, يمكن تقديم أي من إعطاء إضافي (يُشار إليه في الطلب الحالي باسم "معالجة") لمنع زيادة حالات المرض المذكور سوءاً أو كعلاج بنية المعالجة.
‎٠‏ التعبير "معالجة" أو 'يعالج” يتم تعريفه في الطلب الحالي بأنه إجراء (إحداث تأثير) إعطاء بروتين وفقاً للاختراع إلى خاضع بقصد علاج الخاضع من مرض (متوقع) أو تحسين, تقليل, أو إزالة ‎(led‏ مرض لدى الخاضع. على الرغم من أن القصد من المعالجة هو علاج الخاضع المذكور, إلا أنه ليس من الضروري أن يتم علاج الخاضع المذكور بعد إعطاء واحد أو عدة إعطاءات لبروتين وفقاً للاختراع, حيث لا يكون الخاضعون؛ على سبيل المثال؛ بالضرورة معرضين لبروتكول علاج.
‎Yo‏ على كل ‎(Ja‏ يفضل أن يتم تحقيق فعالية المعالجة المذكورة لدى أولئك الخاضعين الذين تم علاجهم
‏ير نض
-؟١-‏ ببروتين وفقاً للاختراع فيبدي على الأقل تحسين للمرض- الحالة لديهم على سبيل المثال مضاعفات أقل للمرض المذكور, عند المقارنة بمجموعة غير معالجة (أو معالجة بعلاج إرضائي) . على سبيل المثال في حالة مرض الكلى, يفضل أن يبدى الخاضعون, بعد علاجهم ببروتين وفقاً للاختراع وظيفة كلى محسنة أو أقل تدنياً في وظيفة الكلى, بالنسبة إلى الخاضعين الذين لم يتم علاجهم بالبروتين © المذكور. كما يقدم الاختراع بولي نيوكليوتيد يشتمل على متوالية نيوكليوتيد تشفر بروتين وفقاً للاختراع. وفقاً لاستخدامها في الطلب الحالي, تضم التعبيرات 'متوالية حمض ‎ols "ges‏ نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ " كذلك جزيئات غير طبيعية بناء على و/ أو مشتقة من متواليات حمض نووي, مثل على سبيل المثال متواليات حمض نووي معدلة صناعياً, أحماض نووية للببتيد ‎peptide‏ ‎nucleic 80105 ٠‏ فضلاً عن متواليات حمض نووي ‎Ja‏ على الأقل على نيوكليوتيد ‎nucleotide‏ ‏واحد معدل و/ أو نيوكليوتيد غير طبيعي ‎non-natural nucleotide‏ مثل على سبيل المثال إينوسين ‎LNA inosine‏ مورفولينو ‎,Morpholino‏ ىو 7:-0-ميتيل ‎2’-O-methyl RNA‏ ‎.RNA‏ ‏كما يتم تقديم ناقل يشتمل على البولي نيوكليوتيد المذكور وفقاً للاختراع. يُفضل أن يشتمل الناقل ‎Vo‏ المذكور على متواليات حمض نووي إضافية ‎ie‏ عناصر ضرورية للانتساخ/ الترجمة الوراثية لمتوالية الحمض الأميني التي تشفر إنزيم الفوسفاتاز (على سبيل المثال معزز و/ أو متواليات المنهي). يمكن كذلك أن يتضمن الناقل المذكور متواليات حمض نووي تشفر مرقمات الانتقاء (على سبيل المثال مضاد حيوي ‎(antibiotic‏ لانتقاء أو المحافظة على الخلايا العائلة المحولة بالناقل المذكور. تكمن الأمثلة على النواقل المناسبة في نواقل الاستنساخ أو التعبير. يمكن استخدام أي ناقل مناسب للتوسط ‎٠‏ في التعبير في خلية ‎dle‏ منتقاة طبقاً للاختراع» إما مدمج أو ينتسخ يصبوغياً في خلية عائلة. يمكن أن يكون الناقل بلازميد؛ أو فيروس (على سبيل ‎JBI‏ فيروس قهقري ‎TErOVIIUS‏ فيروس غدي 5)م, فيروس مرتبط بالغدة ‎adeno-associated virus‏ فيروسة عصوية ‎baculovirus‏ 5/5 مشتقات منها), قفيصة ‎cosmid‏ ملتهمة ‎phage‏ أو مجموعة ملتهمة ‎Ji phagemid‏ يصبوغي ‎ episomal vector‏ أو كروموزوم صناعي ‎artificial‏ ‎TY‏
‎.chromosome‏ يكون البولي نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ المذكور أو الناقل ‎fade‏ للغاية لإنتاج
‏البروتين وفقاً للاختراع, ولكن يمكن استخدامه كذلك للعلاج بالجين ‎gene‏ .
‏بالتالي يقدم الاختراع بروتين وفقاً للاختراع للاستخدام كدواء. من الممكن كذلك علاج مريض يعاني
‏من أو معرض لخطر المعاناة من أي واحد من الأمراض المذكورة فيما سبق مطلوب علاجه ببولي
‏© نيوكليوتيد وفقاً للاختراع, أو بناقل وفقاً للاختراع, للتعبير عن بروتين وفقاً للاختراع في الكائن الحي.
‏بالتالي يقدم الاختراع كذلك بولي نيوكليوتيد وفقاً للاختراع أو ناقل ‎Tay‏ للاختراع للاستخدام كدواء,
‏يُفضل للوقاية من أو لعلاج انخفاض وظائف الكلى, إصابة الكلى, الفشل الكلوي, أمراض المناعة
‏الذاتية المتعلقة بنقص الفوسفاتاز, التهاب المفاصل الروماتويدي, الربوء ومرض الانسداد الرئوي
‏المزمن 3 وتصلب الشرايين ¢ وأمراض الالتهاب في القناة الهضمية؛ والعدوى؛ وتعفن الدم 3 التهاب الجلد ‎٠‏ العصبي؛ مرض التهاب الكبد, مرض التهاب الرئة ومرض التهاب الكلى.
‏كما يتم تقديم بروتين, بولي نيوكليوتيد أو ناقل وفقاً للاختراع للاستخدام في طريقة للوقاية من أو
‏لعلاج مرض التهابي, مرض الكلى أو نقص الفوسفاتاز.
‏كما يتم تقديم استخدام بروتين, بولي نيوكليوتيد و/ أو ناقل للاستخدام وفقاً للاختراع لتصنيع دواء,
‏يُفضل للوقاية من أو لعلاج انخفاض وظائف الكلى, إصابة الكلى, الفشل الكلوي, نقص الفوسفاتاز, ‎Vo‏ أمراض المناعة الذاتية, التهاب المفاصل الروماتويدي, الربو؛ ومرض الانسداد الرثئوي المزمن؛
‏وتصلب الشرايين» وأمراض التهاب في القناة الهضمية؛ والعدوى؛ وتعفن الدم؛ التهاب الجلد العصبي؛
‏مرض التهاب الكبد, مرض التهاب الرئة ومرض التهاب الكلى.
‏في نموذج آخر, يقدم الاختراع استخدام بروتين إنزيم فوسفاتاز قلوي وفقاً للاختراع, لبولي نيوكليوتيد
‎laa‏ للاختراع, أو ناقل وفقاً للاختراع, في تحضير دوا ‎sc‏ لعلاج مرض يصاحبه نقص موضعي أو ‎Ye‏ جهازي في 202+, يُفضل أن يكون المرض المذكور مرض التهابي, مرض الكلى أو نقص
‏الفوسفاتاز, يُفضل أن يتضمن المرض المذكور مرض التهابي, يُفضل أكثر مرض أن يكون منتقى
‏من المجموعة التي تتكون من أمراض المناعة الذاتية, التهاب المفاصل الروماتويدي, ‎sul‏ ومرض
‏الانسداد الرثئوي ‎(Cadell‏ وتصلب الشرايين؛ وأمراض التهاب في القناة الهضمية؛ والعدوى؛ وتعفن
‏الدم؛ التهاب الجلد العصبي؛ مرض التهاب الكبد, مرض التهاب الرئة ومرض التهاب الكلى.
‏ير نض
م \ — في نموذج آخر كذلك, يقدم الاختراع طريقة لعلاج خاضع (يُفضل إنسان) لعلاج مرض يُفضل أن يصاحبه نقص في 202+, تشتمل على إعطاء كمية فعالة من إنزيم الفوسفاتاز وفقاً للاختراع, حيث يُفضل أن يشتمل المرض المذكور على مرض التهابي, يُفضل أكثر أن يكون منتقى من المجموعة التي تتكون من أمراض المناعة الذاتية, التهاب المفاصل الروماتويدي, الربو؛ء ومرض الانسداد الرئوي © المزمن؛ وتصلب الشرايين؛ وأمراض التهاب في القناة الهضمية؛ والعدوى؛ وتعفن الدم؛ التهاب الجلد العصبي؛ مرض التهاب الكبد, مرض التهاب الرئة ومرض التهاب الكلى. بالتالي يقدم الاختراع بروتين, بولي نيوكليوتيد, و/ أو ناقل وفقاً للاختراع للاستخدام في تنوع من الأمراض. يكون البروتين وفقاً للاختراع مفيداً بصفة خاصة, بسبب توزيع أعضائه, للاستخدام في علاج مرض يتضمن القناة الهضمية, الكلية الجلد, الكبد, الرئة, المخ, النسيج الدهني, أو العظم. ‎٠‏ في أحد النماذج المفضلة, يقدم الاختراع بروتين, بولي نيوكليوتيد و/ أو ناقل وفقاً للاختراع للاستخدام في علاج مرض الكلى. على الرغم من وجود رؤية متواصلة في علم فسيولوجيا الأمراض لإصابة الكلى وهناك علاجات تحسن من وظيفة الكلى [ ‎Lameire NH, Acute kidney injury: an increasing global‏ ‎<[concern.
Lancet. 2013 Jul 13;382(9887):170-9‏ إلا أنه لا يزال هناك ‎dala‏ ‏ا لعلاجات بديلة لعلاج إصابة الكلى و/أو تحسين وظيفة الكلى. يقدم الاختراع الحالي ‎Jie‏ هذا العلاج البديل بتوفير بروتين, بولي نيوكليوتيد و/ أو ناقل للاستخدام وفقاً للاختراع. في نموذج مفضل, يقدم الاختراع بروتين, بولي نيوكليوتيد و/ أو ناقل للاستخدام وفقاً للاختراع, حيث يتم انتقاء مرض الكلى المذكور من المجموعة التي تتكون من الفشل الكلوي, إصابة الكلى الحادة, مرض الكلى المزمن, مرض الكلى المتعلق بنقص التروية. ‎Yo‏ التعبير إصابة ‎SH‏ الحادة ‎(AKI) acute kidney injury‏ كان يطلق عليه ‎Lad‏ سبق الفشل الكلوي الحاد, يعني أنه يتم فقد وظيفة الكلى بسرعة. يتم تشخيص ‎AKT‏ على أساس النتائج المعملية المميزة, ‎Jie‏ نيتروجين اليوريا ‎urea nitrogen‏ والكريتينين المرتفع في الدم ‎creatinine‏ « أو عدم قدرة الكلى على إنتاج كميات كافية من البول. يمكن تقسيم ‎AKI‏ فرحياً إلى ‎AKI‏ ما قبل الكلى؛ ‎AKI‏ ‏داخلي المنشاً ‎AKI‏ بعد الكلى. بي yee ‏النتائج المعملية النمطية‎ Jian ‏ما قبل الكلى بسبب تدفق الدم الفعال المنخفض إلى الكلية.‎ AKI Las, ‏ونسبة‎ %) > :FeNa 0٠0 > :UNa 200 ‏ل الكل ما قبل الكلى في: (050لا: أكبر من‎ .٠١ > :BUN/Cr ‏عندما تمتل مصادر التلف للكلى ذاتها السبب. تتمثل النتائج‎ Land) ‏داخلي‎ AKT ‏يستخدم التعبير‎ ‏ونسبة‎ %Y <:FeNa ٠> ‏فلالا:‎ (Vo .>:Uosm ‏في:‎ Lad) ‏المعملية النمطية ل الكل داخلي‎ 0 .Yo > :BUN/Cr ‏بعد الكلى على تلك الحالات التي تتمثل في انسداد القناة البولية وهي سبب‎ AKI ‏يقتصر التعبير‎ :UNa 5 .< :Uosm ‏بعد الكلى في:‎ AKI ‏الإصابة ب اكال. تتمثل النتائج المعملية التمطية ل‎ .١٠> :BUN/Cr duu, %¢ > :FeNa ٠> ‏عبر العالم, هناك العديد من الإرشادات لتصنيف مرض الكلى المزمن. كمثال على ذلك, يتم فيما‎ ٠ ‏تصنيف مؤسسة الكلية الوطنية (7007) "إرشادات الممارسة الإكلينيكية‎ ules ‏يلي وصف‎ ‏لمرض الكلية المزمن". بمقدور الشخص المتمرس انتقاء مجموعات مرضى مختلفة؛ بناء‎ K/DOQI ‏على إرشادات أخرى.‎ glomerular filtration rate ‏نمطياًء يتم تصنيف جميع الأفراد ذوي معدل الارتشاح الكبيبي‎ ‏م7 لمدة ؟ شهور بأنهم مصابون بمرض الكلية المزمن؛‎ ١,77 ‏ملي لتر/ دقيقة/‎ ٠١ > (GFR) ٠ ‏بغض النظر عن وجود أو عدم وجود تلف بالكلية. الأساس المنطقي لإدراج هؤلاء الأفراد هو‎ ‏فقد نصف أو أكثر من المستوى لدى‎ Jia ‏الانخفاض في وظيفة الكلية إلى هذا المستوى أو أقل‎ ‏الكبار في وظيفة الكلية العادية؛ الذي يمكن أن يكون مرتبط بعدد من المضاعفات. بصفة عامة يتم‎ ‏مزمن بأنهم يعانون من مرض كلية مزمن؛ بغض النظر عن‎ BIS ‏تصنيف الأفراد المصابين بتلف‎ ١,77 ‏ملي لتر/ دقيقة/‎ ٠0 > GFR ‏يتمثل الأساس المنطقي لإدراج الأفراد ذوي‎ (GFR ‏مستوى‎ Yo ‏عند مستويات عادية أو متزايدة بغض النظر عن تلف الكلية‎ GFR ‏أنه يمكن المحافظة على‎ Va ‏الأساسي وأن المرضى الذين يعانون من تلف الكلية يكونون معرضين لخطر متزايد لاثنين من النتائج‎ ‏الأساسية لمرض الكلية المزمن: فقد وظيفة الكلية وتكوين مرض وعائي قلبي؛ يمكن أن يؤدي إلى‎ ‏الهلاك أو الوفاة.‎ ‏ير نض‎
=« \ _ يعتبر فقد البروتين في البول مرقم مستقل لازدياد وظيفة الكلى سوءاً ومرض وعائي قلبي. ومن ثم؛ ترفق الإرشادات البريطانية حرف ”ا إلى مرحلة مرض الكلية المزمن إذا كان هناك فقد كبير في البروتين. يتم نمطياً تصنيف المراحل © (الخمسة) لمرض الكلية المزمن على النحو التالي: © المرحلة ‎:١‏ وظيفة منخفضة قليلاً؛ ‎Cali‏ الكلية بمستوى ‎GFR‏ عادي أو مرتفع نسبياً (>90 ملي لتر/ دقيقة/ ‎٠,77‏ م7). يتم تعريف تلف الكلى بأنه حالات غير سوية مرضية أو مرقمات للتلف؛ بما في ذلك الحالات غير الطبيعية في اختبار الدم أو البول أو دراسات التصوير. المرحلة : التخفيض المعتدل في ‎GFR‏ (0 89-7 ملي لتر/ دقيقة/ ‎(Ya), VY‏ بتلف في الكلية. يتم تعريف تلف الكلى بأنه حالات غير سوية مرضية أو مرقمات للتلف؛ ‎Ley‏ في ذلك الحالات غير ‎٠‏ الطبيعية في اختبار الدم أو البول أو دراسات التصوير. المرحلة ؟: التخفيض المعتدل في ‎GFR‏ (54-70 ملي لتر/ دقيقة/ ‎٠,١77‏ م7). تميز الإرشادات البريطانية بين المرحلة ‎(GFR 45-59) IF‏ والمرحلة "ب )30-44 ‎(GFR‏ لأغراض الفحص والإشارة المرجعية. المرحلة ؛: التخفيض الحاد في ‎75-١١( GFR‏ ملي لتر/ دقيقة/ ‎(Ya ١,١77‏ تحضير لعلاج ‎١٠‏ باستبدال الكلى. المرحلة ©: فشل كلوي مقرر ‎١١< GFR)‏ ملي لتر/ دقيقة/ ‎(Ya), VY‏ علاج دائم باستبدال الكلية ‎«(RRT) renal replacement therapy‏ أو مرض كلوي في المرحلة النهائية ‎end stage‏ ‎(ESRD) renal disease‏ التعبير فشل كلوي يشير الآن إلى حالة طبية تخفق فيها الكلية في ترشيح نواتج الفضلات بكفاءة من ‎Yo‏ الدم. وتكمن الصورتان الرئيسيتان منه في إصابة الكلية الحادة؛ التي غالباً ما تكون قابلة للمعالجة باستخدام علاج كافي؛ ومرض الكلية المزمن الذي غالبا ما يكون مستعصياً على العلاج. يتم الاحتفاظ بمرض الكلى المتعلق بنقص التروية لتلك الحالات وفيها ينتج انخفاض هام إكلينيكياً في معدل الترشيح الكبيبي الكلوي أو فقد حمة كلوية عن تضيق الشريان الكلوي ديناميكياً دموياً على yy نحو كبير أو أسباب أخرى ينتج عنها ضغط الدم المنخفض في الكلى, مثلاً على سبيل المثال صدمة ديناميكية دموية أو استخدام مشبك شريان في الإيقاف المؤقت لتدفق الدم. أوضح المخترعون أيضاً أن البروتين وفقاً للاختراع يكون مفيد في علاج نقص الفوسفاتاز ‎(HPP) hypophosphatasia‏ وكان هذا غير متوقع ‎la‏ نظراً لإخفاق التجارب السابقة © باستخدام ‎TNAP‏ لعلاج نقص الفوسفاتاز في تعرض فعالية علاج إحلال الإنزيم. ‎sly‏ عليه تم تطوير الدمج الاصطناعي للبروتين بين إنزيم ‎TNAP‏ وببتيد قذيفة العظم ( لا ‎Whyte et al,‏ ‎Med. 2012 Mar 8:366)10(:904-3‏ ل ا09ع). المثير للدهشة, لا يحتاج البروتين طبقاً للاختراع الحالي على ببتيد قذيفة العظم المذكور ويتمكن بفعالية من خفض مؤشرات على أعراض نقص الفوسفاتاز في نموذج فأر. في نموذج مفضل آخر, بالتالي يقدم الاختراع بروتين, بولي ‎٠‏ نيوكليوتيد و/ أو ناقل وفقاً للاختراع للاستخدام في علاج نقص الفوسفاتاز. ينبع أساس أيض نقص الفوسفاتاز من عيب جزيئي في جين يشفر إنزيم فوسفاتاز قلوي غير محدد النسيج ‎TNAP) tissue non-specific alkaline phosphatase‏ ) يكون إنزيم خارجي مقيد بالسطح الخارجي لخلية ‎oly‏ العظم وغشاء الخلايا الغضروفية. يعمل ‎TNAP‏ على نحو طبيعي على تحلل العديد من الموادة بالماء, بما في ذلك بايرو فوسفات غير عضوي ‎(PPi) pyrophosphate‏ ‎Vo‏ وبيريدوكسال © '-فوسفات ‎(PLP) pyridoxal 5° —phosphate‏ الصورة الرئيسية من فيتامين ‎BO‏ ‏عندما يكون ‎TNAP‏ منخفضاً, يتراكم بايرو فوسفات غير العضوي ‎inorganic pyrophosphate‏ ‎(PPI)‏ خارج الخلايا ويثبط على نحو فعال تكوين هيدروكسيباتيت ‎hydroxyapatite‏ (تمعدن ‎(Mineralization‏ متسبباً في كساح الأطفال في الرضع والأطفال ولين العظام (العظام ‎(Aah‏ في البالغين. 010 يكون صورة رئيسية من فيتامين ‎BO‏ ويمكن نزع الفوسفوريل منه بواسطة ‎TNAP‏ ‎٠‏ إلى بيريدوكسال ‎pad (PL) pyridoxal‏ غشاء الخلية. يعوق نقص فيتامين ‎BO‏ في المخ تخليق أجهزة الإرسال العصبية, مما يتسبب في النوبات. في بعض الحالات, قد يتسبب تحلل بلورات كالسيوم بايرو فوسفات ديهيدرات ‎(CPPD) calcium pyrophosphate dehydrate‏ في المفاصل في ‎joint can cause pseudogout ‏النقرس الكاذب‎
TY
ل" لا توجد علاجات معتمدة ل ‎HPP‏ اليوم. تتألف وسائل التحكم الحالية من شرح الأعراض, متابعة توازن الكالسيوم واستخدام إجراءات التدخل الجسدي والمهني وعلاج الأسنان والعظمي حسب الضرورة. لم يكن لإعطاء بيس فوسفونات (نظير تصنيعي لبايرو فوسفات ‎pyrophosphate‏ ‎(Synthetic analog‏ في طفل رضيع واحد تأثير مميز على الهيكل العظمي, وتطور المرض لدى الرضيع حتى الوفاة بعمر ‎Ded VE‏ نتج عن غرس خلية نخاع العظام في طفلين رضيعين متأثرين تأثراً بالغاً تطور في التصوير الإشعاعي والإكلينيكي, على الرغم من عدم استيعاب ألية الفاعلية على نحو تام واستمرار قسط كبير من نسبة انتشار المرض. لم يكن علاج إحلال الإنزيم بالمصل الطبيعي أو بالمصل الغني ب ‎ALP‏ من مرضى مرض العظم ‎Paget‏ مفيداً [ ‎Whyte MP, Valdes R, Ryan LM, McAlister WH‏ ‎(September 1982). 'Infantile hypophosphatasia: enzyme replacement ٠‏ ‎therapy by intravenous infusion of alkaline phosphatase-rich plasma from‏ ‎patients with Paget bone disease’. J. Pediatr. 101 (3): 379-86] Whyte MP,‏ ‎McAlister WH, Patton LS, et al. (December 1984). "Enzyme replacement‏ ‎therapy for infantile hypophosphatasia attempted by intravenous infusions‏ in three additional ‏آ0النتائج‎ alkaline phosphatase-rich Paget plasma: Vo ‏كانت علاجات استبدال الإنزيم المذكورة غير‎ [patients’. J. Pediatr. 105 (6): 926-33 ‏فعالة لأنه من المفترض أن تكون وظيفة إنزيم فوسفاتاز قلوي عند سطح العظم وليس في الدم. علاوة‎ ‏الذي‎ TNAP ‏عليه إلى إنزيم‎ sli ‏الإنزيم‎ Pla) ‏على ذلك استندت محاولات تطوير فعالية علاج‎
Whyte et al. N Engl J Med. 2012 Mar] ‏يستهدف العظم مع تتائج واعدة‎ ‏على نحو يثير الدهشة, يعرض الاختراع الحالي, دون تقديم شق استهداف‎ .]8:366)10(:904-13 ٠٠ ‏لنقص الفوسفاتاز. تكمن أحد‎ al) ‏العظام الصناعي, بروتين وفقاً للاختراع يكون مفيد في نموذج‎
J. Bone Miner. [ Millan et al Whyte et al ‏مزايا البروتين الحالي على ذلك الموصوف في‎ ‏في, لأنه بسبب غياب شق استهداف العظام الصناعي, من‎ [Res. 2008;23(6):777-787 ‏المتوقع أن يكون البروتين الحالي أقل توليداً للمانعة. يتألف البروتين الحالي من بروتين له تطابق‎ ‏متوالية مرتفع مع بروتينات إنزيم فوسفاتاز قلوي بشرية تحدث طبيعياً. علاوة على ما سبق؛ يتمتع‎ YO
اا البروتين وفقاً للاختراع الحالي بميزة على إنزيم فوسفاتاز قلوي يستهدف العظم بالنسبة إلى سهولة وتكلفة الإنتاج. في نموذج مفضل, يتم توفير بروتين, بولي نيوكليوتيد, و/ أو ناقل وفقاً للاختراع للاستخدام في علاج نقص الفوسفاتاز, حيث يتم انتقاء نتقص الفوسفاتاز المذكور من نقص الفوسفاتاز في الفترة المحيطة © بالولادة, نقص الفوسفاتاز في الأطفال, نقص الفوسفاتاز في مرحلة الطفولة, ونقص الفوسفاتاز في البالغين. نقص الفوسفاتاز في الفترة المحيطة بالولادة يكون الصورة الأكثر خبثاً من نقص الفوسفاتاز. في الرحم, ينتج عن فرط التمعدن العميق في غشاء قبة الرأس, تشوه أو قصر الأطراف أثناء الحمل وعند الولادة والموت السريع بسبب فشل الجهاز التنفسي. يظهر نقص الفوسفاتاز في الأطفال في ‎TJs‏ ‎Vo‏ شههور من العمر. يظهر التطور عقب الولادة طبيعياً حتى بداية التعرف على سوء التغذية وعدم كفاية زيادة الوزن» والأعراض الإكلينيكية وكساح الأطفال. يشيع فرط كالسيوم الدم وفرط كالسيوم البول ‎Lad‏ وقد يفسر كلاس كلوي؛ وسط الكلوي؛ و نوبات القيء المتكرر. ثقدر معدلات الوفيات بنسبة ‎Wo‏ في أول سنة من العمر. يشتمل نقص الفوسفاتاز في مرحلة الطفولة على تعبير إكلينيكي متغير. نتيجة لعدم التنسج, نقص ‎Vo‏ التنسج, أو خلل تنسج الطبقة الملاطية بالأسنان, يحدث فقد الأسنان اللبنية السابق لأوانه (أي قبل عمر © سنوات). في كثير من الأحيان؛ تسقط القواطع أولاً: في بعض الأحيان يتعرض التسنين الأساسي للتقشير تقريباً بأكمله قبل الأوان. تعرض صور أشعة الأسنان في بعض الأحيان خصائص اتساع غرف اللب وقنوات الجذور "الأسنان الصدفية ‎shell teeth‏ لكساح الأطفال. قد يتعرض المرضى ‎Lad‏ إلى تأخير المشي, تمايل مميز في طريقة المشي؛ الشكوى من ألم وتيبيس؛ وضعف ‎٠‏ العضلات الزائدي (خاصة في الفخذين ‎(thighs‏ بما يتفق مع الاعتلال العضلي غير التدريجي. نمطياً, يعرض التصوير الإشعاعي تشوهات رخدية وعيوب عظمية مميزة قرب نهايات العظام الطويلة الكبرى (أي ‎tongues dnl‏ " الإسقاطات الشفافية الإشعاعية من لوح النمو الرخدي في الكردوس). يشيع تأخر النمو, كسور متكررة وهشاشة. من غير الشائع في الرضع المتضررين بشدة والأطفال الصغار, على الرغم من مظهر اليافوخ الواسع "المفتوح” في دراسة التصوير الإشعاعي, حدوث التحام ‎Yo‏ العظام الوظيفية من الغرز في الجمجمة. ينتج وهم اليافوخ 'المفتوح” من مساحات كبيرة من القبة
"١ ‏مفرطة التمعدن . فيما بعد قد يرفع الاندماج العظمي السابق لأوانه للغرز في الجمجمة الضغط داخل‎ ‏الجمجمة.‎ ‏قد يرتبط نقص الفوسفاتاز في البالغين بكساح الأطفال, فقد سابق لأوانه للأسنان اللبنية, أو فقد مبكر‎ ‏للأسنان في البالغين يلي ذلك نسبياً صحة جيدة. يظهر لين العظام في قدم مؤلمة ناجمة عن سوء‎ ‏شفاء الكسور المتكرر في مشط القدم, وعدم الراحة في الفخذين أو الأرداف بسبب كسور الفخذ الزائفة‎ © ‏والتي عند ظهورها في دراسة التصوير الشعاعي؛ يمكن تمييزها عن معظم الأنواع الأخرى من لين‎ ‏العظام (والتي تحدث على نحو وسطي) بواسطة موقعها في القشور الجانبية للأفخاذ الدانية. يعاني‎ calcium pyrophosphate ‏بعض المرضى من تحلل بلورات كالسيوم بايرو فوسفات ديهيدرات‎ ,(pseudogout ‏مع هجمات مفرطة أحياناً لالتهاب المفاصل (نقرس كاذب‎ dihydrate crystal ‏غير العضوي‎ Land) ‏والتي على ما يبدو تكون نتاجاً لارتفاع مستويات بايرو فوسفات باطني‎ ٠ .(PPi) pyrophosphate articular cartilage ‏من تآكل الغضاريف المفصلية‎ Lad ‏قد يعاني هؤلاء المرضى‎ ‏قد‎ . pyrophosphate arthropathy ‏والاعتلال المفصلي بايرو فوسفات‎ 007 ‏للأفخاذ الدانية‎ lateral cortices ‏يكشف التصوير الإشعاعي عن كسور زائفة في القشور الجانبية‎ ‏؛ وقد يعاني المرضى من الهشاشة‎ stress fractures ‏كسور الإجهاد‎ proximal femora Ve ‏؛ وملامح الاعتلال المفصلي بايرو‎ chondrocalcinosis ‏كلاس الغضاريف‎ « osteopenia ‏والتهاب حوائط المفصل المكلس‎ features of pyrophosphate arthropathy ‏فوسفات‎ ‎.calcific periarthritis ‏في نموذج مفضل, يتم توفير بروتين, بولي نيوكليوتيد, و/ أو ناقل للاستخدام في علاج نقص‎ ‏الفوسفاتاز وفقاً للاختراع, حيث ينتج عن العلاج إطالة البقاء على قيد الحياة: زيادة في وزن الجسم:‎ ٠ ‏حث مراكز التعظم‎ (Jie) improved skeletal phenotype ‏تطور النمط الظاهري للهيكل العظمي‎ ‏تطور تمعدن العظم‎ , induction of secondary ossification centres ‏الثانوي‎ ‎trabecular ‏على سبيل المثال في العظم التربيقي‎ ,improvement of bone mineralization ‏توهين العيوب‎ (induction of osteoid ‏أو حث العظمانيات‎ cortical bone ‏أو القشري‎ / shape Jill ‏تشوهات‎ Jie) attenuation of craniofacial defects ‏القحفية الوجهية‎ vo
TY
اج \ _ ودمج الغرزة الإكليلية ‎suture fusion‏ ا600008): تطور النمط الظاهري السني -السنخي ‎(Jie) improvement of dento-alveolar phenotype‏ تطور الضرس الطاحن ‎improvement of molar height‏ وصورة, سمك الأسنان ‎,dentin—thickness‏ وتمعدن العظم ‎;(bone mineralization‏ و أو انخفاض مستويات ‎PPI‏ في البلازما ‎plasma‏ في المرضى.
0 كما يتم تقديم استخدام لبروتين, بولي نيوكليوتيد, و/ أو ناقل وفقاً للاختراع لتحضير دواء للوقاية من أو لعلاج نقص الفوسفاتاز, حيث ينتج عن العلاج إطالة البقاء على قيد الحياة: زيادة في وزن الجسم: تطور النمط الظاهري للهيكل العظمي (مثل حث مراكز التعظم الثانوي, تطور تمعدن العظم, على سبيل المثال في العظم التربيقي و/ أو القشري, أو حث العظمانيات): توهين العيوب القحفية الوجهية (مثل تشوهات الشكل ودمج الغرزة الإكليلية): تطور النمط الظاهري السني-السنخي (مثل تطور
‎٠‏ الضرس الطاحن وصورة, وسمك الأسنان, وتمعدن العظم): و/ أو انخفاض مستويات ‎PPI‏ في البلازما في المرضى. كما يتم تقديم طريقة لعلاج خاضع يعاني من أو معرض لخطر المعاناة من نقص الفوسفاتاز, حيث ينتج عن العلاج إطالة البقاء على قيد الحياة: زيادة في وزن الجسم: تطور النمط الظاهري للهيكل العظمي (مثل حث مراكز التعظم الثانوي, تطور تمعدن العظم, على سبيل المثال في العظم التربيقي ‎Vo‏ و/ أو القشري, أو حث العظمانيات): توهين العيوب القحفية الوجهية ‎(Jie)‏ تشوهات الشكل ودمج الغرزة الإكليلية): تطور النمط الظاهري السني-السنخي (مثل تطور الضرس الطاحن وصورة, وسمك الأسنان, وتمعدن العظم): و/ أو انخفاض مستويات ‎PPI‏ في البلازما في الخاضع المذكور. في نموذج أكثر تفضيلاً, يتم توفير بروتين, بولي نيوكليوتيد, و/ أو ناقل للاستخدام في علاج نقص الفوسفاتاز وفقاً للاختراع, حيث يتم انتقاء نتقص الفوسفاتاز المذكور من في الرضع, مرحلة الطفولة ‎٠‏ أو نقص الفوسفاتاز في البالغين. يُفضل أكثر, يكون نقص الفوسفاتاز نقص الفوسفاتاز في الأطفال. هلال المواصفة, الأمثلة والمراجع في المجال, يتم استخدام تسمية أخرى لتخصيص الأنواع النظيرة من إنزيم فوسفاتاز قلوي. بغرض الإيضاح, يتم إدراج في الجدول ‎١‏ فيما يلي أسماء واختصارات مستخدمة على نحو شائع, أو مستخدمة في هذا الطلب. ير نض
_ أ \ _ الجدول ‎:١‏ المرادفات والاختصارات المستخدمة في الطلب الحالي أو المعروفة عامةً لمختلف أنواع إنزيمات فوسفاتاز قلوية إنزيمات فوسفاتاز القلوية الاختصارات إنزيم فوسفاتاز قلوي المشيمي ‎ALPP, PLAP, | Placental alkaline‏ ‎phosphatase‏ ‏إنزيم فوسفاتاز قلوي المشيمي القابل للفراز ‎shPLAP, sALPP | Secretable‏ ‎Placental alkaline phosphatase‏ إنزيم فوسفاتاز قلوي معوي ‎ALPI, IAP hIAP | Intestinal alkaline‏ ‎phosphatase‏ ‏إنزيم فوسفاتاز قلوي معوي قابل للإفراز ‎shlAP, sALPI | Secretable‏ ‎Intestinal alkaline phosphatase‏ إنزيم فوسفاتاز قلوي شبيه بالمشيمي ‎GCAP | Placental-like‏ ‎alkaline phosphatase‏ إنزيم فوسفاتاز قلوي غير محدد النسيج ‎TNAP,BLK, ALPL, | Tissue‏ ‎TNSALP nonspecific alkaline phosphatase‏ إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني يشتمل على | ‎catALPI/crownALPP,‏ ‏النطاق الحفزي ل اا والنطاق التاجي لبروتين ‎RecAP, Xinplap, sALPI-| ALPP‏ ‎ALPP-CD‏ ‎Recombinant alkaline phosphatase‏ ‎comprising the catalytic domain of ALPI and‏ ‎the crown domain of ALPP‏ ‎Try‏
ل البروتين وفقاً للاختراع ‎RecAP LVL-RecAP‏ المقصود بالتعبير "قابل ‎HBL‏ عدم توصيل مثبت جليكوسيل فوسفاتيديل إينوسيتول ‎(GPI) Glycosylphosphatidylinositol‏ مرحلي لاحق ببروتين ناضج, مما يساعد على إفراز البروتين وليس الارتباط بالغشاء. يكون مثبت ‎GP‏ دهن سكري يمكن توصيله بالطرف ‎C‏ للبروتين أثناء التعديل المرحلي اللاحق. وهو يتألف من مجموعة فوسفاتيديل إينوسيتول المرتبطة من خلال © رابط يحتوي على الكربوهيدرات (جلوكوسامين ومانوز بالوحدة البنائية إينوسيتول من خلال رابطة جليكوسيد) وعن طريق رابطة جسرية إيثانول أمين فوسفات ‎ethanolamine phosphate‏ ‎(ENP)‏ بالحمض الأميني عند الطرف © لبروتين ناضج. تقوم اثنين من الأحماض الدهنية داخل مجموعة فوسفاتيديل -إينوسيتول غير ‎AY)‏ للماء بتثبيت البروتين في غشاء الخلية. من المفيد للإنتاج والمعالجة البعدية, وبالتالي من المفضل ألا يشتمل البروتين وفقاً للاختراع على مثبت ا65. ‎٠‏ يتضح لنا إمكانية إنتاج أي من إنزيمات الفوسفاتاز المعدلة الموصوفة التي تكون قابلة للإفراز (وبالتالي أيضاً البروتين القابل للإفراز وفقاً للاختراع) على سبيل المثال بواسطة التقديم إلى خلية عائلة حمض نووي يمكنه تشفير إنزيم الفوسفاتاز المذكور القابل للإفراز في رابطة تشغيلية مع المتواليات المنظمة والسماح للخلية العائلة المذكورة بالتعبير عن إنزيم الفوسفاتاز القابل للإفراز المذكور واختيارياً عزل إنزيم الفوسفاتاز المنتج من الوسط الذي تنمو فيه الخلية العائلة و/ أو حفظه. ‎VO‏ ومع ذلك؛ بغض النظر عن الطافرات في المذكورة سابقاً متوالية توصيل ‎GP‏ توجد طرق أخرى تعمل على تكوين بروتينات مفرزة غير قابلة للتثبيت 501, على سبيل المثال: ‎)١‏ بعد التعبير في صورة بروتينات مثبتة في الغشاء, إنزيمات فوسفوليباز يمكن استخدامها لشطر مثبت ا60. ومن ثم يقدم الاختراع أيضاً طريقة لإنتاج إنزيم الفوسفاتاز المفرز يشتمل على استتبات عائل يمكنه التعبير عن إنزيم الفوسفاتاز المتبت في الغشاء, مما يسمح للخلية العائلة المذكورة بإنتاج ‎٠‏ إنزيم الفوسفاتاز المذكور وحضانة الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام إنزيم فوسفوليباز واختيارياً عزل إنزيم الفوسفاتاز الذي تم تحريره. ير نض
“YA ‏أو استخدام خلية (نوع) يوجد بها نقص في إنتاج‎ GPI ‏يمكن استخدام التداخل مع إنتاج مثبت‎ )" ‏أمثلة على سلالات‎ AT GPI ‏للإفراز من بروتين مثبت‎ ALE ‏مثبت ا60 أيضاً لتصنيع صورة‎ ‏الخلية التي تم تكوينها ليكون بها نقص في الكيمياء الحيوية لمثبت 601809 هي على سبيل المثال‎ ‏وازهةا. في نموذج أخر كذلك من الاختراع بناءً‎ CHO ,549 BW ,C84 ,B-AM Jurkat ‏عليه يتم تقديم طريقة لإنتاج إنزيم الفوسفاتاز المفرز تشتمل على استنبات خلية عائلة يمكنها التعبير‎ 5 ‏(على سبيل المثال خلية عائلة تشتمل على متوالية حمض‎ (co) ‏عن إنزيم الفوسفاتاز قابل للإفراز‎ ‏نووي تشفر أي من إنزيمات الفوسفاتاز المفرزة المعدلة (قلوية) المذكورة), والسماح للعائل المذكور‎ ‏بإنتاج إنزيم الفوسفاتاز القابل للإفراز المذكور واختيارياً عزل إنزيم الفوسفاتاز المنتج, حيث يتعذر‎ ‏على خلية عائلة مذكورة التخليق الحيوي لبروتينات مثبت 60160 الوظيفية. ومع ذلك؛ يمكن لخلية‎ ‏الوظيفية.‎ GPL ‏عائلة أيضاً إنتاج إنزيم الفوسفاتاز باستخدام متوالية إشارة‎ ٠ ‏يمكن‎ transamidases ‏التداخل مع أو استخدام خلية بها نقص في إنزيمات ترانس أميداز‎ )٠ ‏بالبروتين, مما يجعل البروتين غير قابل للتثبيت وقابل للإفراز.‎ GP ‏استخدامها لتثبيط توصيل مثبت‎ ‏تم الحصول على الخلية المذكورة التي تعاني من النقص من خلال التطفير 11711898676515 في‎ .CHO ‏عناصر ضرورية‎ Jie ‏يشتمل الناقل وفقاً للاختراع على متواليات حمض نووي إضافية‎ of ‏يُفضل‎ ١٠ ‏للانتساخ/ الترجمة الوراثية لمتوالية الحمض الأميني التي تشفر إنزيم الفوسفاتاز (على سبيل المثال‎ ‏يمكن كذلك أن يتضمن الناقل المذكور‎ .) terminator sequences ‏معزز و/ أو متواليات المنهي‎ ‏لانتقاء‎ (antibiotic ‏متواليات حمض نووي تشفر مرقمات الانتقاء (على سبيل المثال مضاد حيوي‎ ‏أو المحافظة على الخلايا العائلة المحولة بالناقل المذكور. يُفضل, ألا تتواجد متوالية نيوكليوتيد تشفر‎ ‏في بولي نيوكليوتيد و/ أو ناقل وفقاً للاختراع. تشتمل أمثلة على النواقل المناسبة‎ GP ‏متوالية مثبت‎ ٠ ‏على نواقل الاستنساخ أو التعبير. أي ناقل مناسب للتوسط في التعبير في خلية عائلة مناسبة يمكن‎ ‏استخدامه وفقاً للاختراع, إما على نحو متكامل أو انتساخ جسيم ملقح بالكروموسومات في خلية‎ ‏فيروس غدي‎ FOtrovirus ‏عائلة. الناقل قد يكون بلازميد, فيروس (على سبيل المثال فيروس قهقري‎ ‏فيروسة عصوية‎ adeno-associated virus ‏5)م, فيروس مرتبط بالغدة‎ ‏أو مجموعة ملتهمة‎ phage ‏ملتهمة‎ cosmid ‏و/ أو مشتقات منها), قفيصة‎ baculovirus Yo ‏ب‎ vq artificial ‏أو كروموزوم صناعي‎ episomal vector ‏ناقل يصبوغي‎ phagemid .chromosome ‏علاوة على ما سبق يقدم الاختراع أيضاً خلية عائلة تشتمل على بروتين, متوالية حمض نووي أو‎ ‏ناقل وفقاً للاختراع وفقاً للموصوف. قد تكون الخلية حقيقة النواة, يُفضل خلية من الثدييات, خلية‎ ‏نباتات أو خلية خلية خمائر, تكون مناسبة لإنتاج بروتينات ناتج عودة الاتحاد الجيني. تشتمل خلايا‎ ©
Pichia ‏و‎ Saccharomyces cerevisiae ‏عائلة من الخمائر المناسبة على, على سبيل المثال,‎
Jie ‏الخلايا العائلة المفضلة تكون ثديية (أو على نحو أكثر تفضيلاً بشرية) خلايا مشتقة‎ pastoris ‏أو‎ (CHO) Chinese hamster ovary ‏>اا8, 1-1293 , مبيض الهامستر الصيني‎
Chinese ‏في نموذج مفضل معين, خلية عائلة تكون خلية مبيض الهامستر الصيني‎ . 17 hamster ovary (CHO) ٠ ‏تشتمل متوالية حمض نووي تشفير بروتين وفقاً للاختراع, ناقل يشتمل على متوالية حمض نووي‎ ‏المذكورة, و/ أو خلية عائلة على متوالية حمض نووي مذكورة وتكون مفيدة للغاية في إنتاج البروتين‎ ‏وفقاً للاختراع. البروتين وفقاً للاختراع يشتمل على مواقع المعالجة بالجليكوسيل ومن ثم يُفضل إنتاج‎ ‏البروتين في الخلايا التي توفر نمط المعالجة بالجليكوسيل المطلوب. في نموذج مفضل, نظام الإنتاج‎ ‏المستخدم يكون ثديي (على سبيل المثال بشري) منصة إنتاج في المعمل ويُفضل أكثر كذلك يتضمن‎ ١ ‏الإنتاج إنتاج على نطاق واسع. في نموذج مفضل آخر, نظام الإنتاج المستخدم يكون منصة نبات‎ ‏غير بشري) وفيها يتم تقديم نمط المعالجة بالجليكوسيل الشبيه بالبشري‎ Join) ‏أو خمائر أو ثديي‎ ‏الصناعي.‎ ‏النماذج, يقدم الاختراع بالتالي طريقة لإنتاج بروتين وفقاً للاختراع, تشتمل الطريقة على‎ af ‏في‎ ‏استنبات خلية عائلة تشتمل على بولي نيوكليوتيد وفقاً للاختراع أو ناقل وفقاً للاختراع وتسمح لخلية‎ Ys ‏بإنتاج البروتين المذكور. الخلايا العائلة المفضلة تكون ثديية (أو على نحو أكثر تفضيلاً‎ dle
Chinese hamster ‏مبيض الهامستر الصيني‎ , 1-1293 BHK (fic ‏مشتقة‎ WIA ‏بشرية)‎ ‏في نموذج مفضل معين, خلية عائلة تكون خلية مبيض الهامستر‎ .PerC6TM ‏أو‎ ovary (CHO) ‏يُفضل, تشتمل طريقة لإنتاج بروتين وفقاً للاختراع‎ .Chinese hamster ovary (CHO) ‏الصيني‎ ‏علاوة على ذلك على تجميع واختيارياً تنقية البروتين المذكور من المستنبت المذكور.‎ Yo
TY
=« اذ وفقاً للمذكور بالفعل, البروتين الموصوف في الطلب الحالي وفقاً للاختراع يكون مفيد في العلاج. في أحد النماذج, يقدم الاختراع تركيبة, يُفضل تركيبة صيدلانية, تشتمل على بروتين وفقاً للاختراع. ‎Jas‏ تركيبة صيدلانية مذكورة اختيارياً على ‎sale‏ حاملة مقبولة صيدلانياً, مادة مخففة أو سواغ ‎.excipient‏ ‏© يمكن تقديم التركيبة في أية صورة, على سبيل المثال في صورة قرص, مائع قابل للحقن أو في صورة مائع تسريب إلخ. علاوة على ما سبق, يمكن إعطاء التركيبة, البروتين, النيوكليوتيد و/ أو الناقل وفقاً للاختراع عن طريق مسارات مختلفة, على سبيل المثال في الوريد, في المستقيم, في الشعب الهوائية, أو عن طريق الفم. وكذلك يكون مسار ‎AT‏ مناسب للإعطاء باستخدام بالتنقيط في الإثنى عشر ‎duodenal drip‏ . ‎Yo‏ في نموذ ‎d‏ مفضل , يكون المسار المستخدم للإعطا عِِ مسار في الوريد . يتضح للشخص المتمرس , أنه يُفضل توصيل كمية فعالة من البروتين وفقاً للاختراع. كنقطة بداية؛ يمكن استخدام ‎Sunn a=)‏ وحدة/كجم/يوم. المسار الآخر المناسب, على سبيل المثال, ل ‎HPP‏ يكون مسار تحت الجلد. إذا تم استخدام المسار في الوريد للإعطاء, يمكن وضع البروتين وفقاً للاختراع ‎JAY) le)‏ لمدة زمنية محددة) عن طريق التسريب المتواصل ‎continuous infusion‏ . ‎Vo‏ قد تشتمل التركيبة المذكورة وفقاً للاختراع اختيارياً على سواغات ‎excipients‏ مقبولة صيدلانياً, مواد مثبتة ‎stabilizers‏ منشطات ‎activators‏ مواد حاملة ‎carriers‏ مواد نفاذية ‎,permeators‏ مواد دافعة ‎propellants‏ مطهرات 065/016018015, مواد ‎diluents dai.‏ ومواد حافظة ‎.preservatives‏ ‏تكون السواغات المناسبة معروفة على نحو شائع في مجال الصيغة الصيدلانية ويمكن العثور عليها ‎Remmington’s ‏سريعاً واستخدامها بواسطة الحاذق المتمرس, في المراجع على سبيل المثال‎ ٠
Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia PA, .17th ed. 1985 ‏بالنسبة للإعطاء عن طريق الفم, يمكن إعطاء البروتين, على سبيل المثال, في صور جرعة صلبة,‎ ‏مثل كبسولات, أقراص (على سبيل المثال, مع تغليف معوي), ومساحيق, أو في صور جرعة سائلة,‎ ‏بي
“yy ‏في كبسولات هلامية إضافة إلى المكونات‎ AP ‏مثل الإكسير؛ العصائر؛ والمعلقات. يمكن تغليف‎ ‏؛ السكروز‎ lactose ‏؛ اللاكتوز‎ glucose ‏غير الفعالة ومواد حاملة مسحوقة, مثل الجلوكوز‎ ‏أو مشتقات السليلوزء ستيرات‎ cellulose ‏؛ النشاء السليلوز‎ mannitol ‏؛ مانيتول‎ sucrose ‏سكرين الصوديوم‎ ¢ stearic acid ay ‏حامض‎ ¢ magnesium stearate ‏المغنيسيوم‎ ‏وما‎ magnesium carbonate ‏كربونات المغنيسيوم‎ ¢ talcum ‏التلك‎ « sodium saccharin © ‏شابه.‎ ‏تشتمل الأمثلة على المكونات غير الفعالة الإضافية التي يمكن إضافتها لتوفير اللون والطعم والثبات‎ ‏المرغوب فيه؛ والقدرة على التخزين المؤقت؛ والتشتت أو السمات الأخرى المعروفة المطلوبة على‎ ‏؛ كبريتات لوريل الصوديوم‎ silica gel ‏؛ هلام السيليكا‎ red iron oxide ‏أكسيد الحديد الأحمر‎ ‏؛ حبر أبيض صالح‎ titanium dioxide ‏؛ ثاني أكسيد التيتانيوم‎ sodium lauryl sulphate). ‏للأكل وما شابه.‎ ‏يمكن استخدام المواد المخففة المشابهة لتصنيع أقراص مضغوطة. يمكن تصنيع كل من الأقراص‎ ‏والكبسولات في صورة منتجات الإطلاق المستديم لتوفير الإطلاق المتواصل للدواء على مدى ساعات.‎ ‏قد تكون الأقراص المضغوطة مغلفة بالسكر أو غشاء لإخفاء أي طعم غير سار وحماية القرص من‎ ‏سائلة‎ deja ‏المناخ الجوي, أو مغلفة معوياً لتفكك انتقائي في الجهاز الهضمي. قد تحتوي صور‎ Vo ‏للإعطاء عن طريق الفم على لون ونكهة لزيادة قبول المريض.‎ ‏في نموذج مفضل, تشتمل التركيبة على بروتين وفقاً للاختراع يكون مناسب للإعطاء عن طريق الفم‎ ‏من الآثار السلبية للعصارة المعدية والرقم الهيدروجيني‎ AP ‏وتشتمل على تغليف معوي لحماية‎ ‏المنخفض. صيغ التغليف المعوي والإطلاق المتحكم فيه تكون معروفة جيداً في المجال. قد تشتمل‎ ‏تركيبة تغليف معوي في المجال على محلول من بوليمر تغليف معوي قابل للذوبان في الماء مختلط‎ ٠ ‏مع المكونات الفعالة وسواغات أخرى, والتي تتشتت في محلول مائي والتي يمكن تجفيفها بالتالي و/‎ ‏أو تحويلها إلى كريات. يوفر التغليف المعوي المتكون مقاومة لهجمات البروتين وفقاً للاختراع بواسطة‎ ‏أثناء التخزين وبواسطة الموائع المعوية والرقم‎ OXYGEN ‏الرطوبة في الغلاف الجوي و الأوكسجين‎ ‏الهيدروجيني المنخفض بعد الهضم, في حين يتم تفتيته بسهولة تحت ظروف فلوية توجد في الجهاز‎ ‏المعوي.‎ Yo ‏فضت‎
دج يقدم الاختراع تركيبة وفقاً للاختراع للاستخدام كدواء, يُفضل لعلاج مرض أن يصاحبه نقص موضعي أو جهازي في الزنك ‎Zine‏ , الأمراض الالتهابية, مرض الكلى, أو نقص الفوسفاتاز. يُفضل أن يكون المرض الالتهابي منتقى من المجموعة التي تتكون من أمراض المناعة الذاتية, التهاب المفاصل الروماتويدي, الربوء ومرض الانسداد الرثوي المزمن؛ وتصلب الشرايين» وأمراض التهاب في القناة © الهضمية ‎gastrointestinal tract‏ ؛ والعدوى ‎«infection‏ وتعفن الدم؛ التهاب الجلد العصبي؛ الإنتان ‎sepsis‏ التهاب الجلد العصبي 76700611781105 , مرض التهاب الكبد ‎inflammatory‏ ‎liver disease‏ مرض التهاب الرئة 0156856 ‎lung‏ /071307172107أومرض التهاب الكلى ‎kidney disease‏ /100800021017. يُفضل أن يكون مرض الكلى ‎renal disease‏ منتقى من المجموعة التي تتكون من الفشل الكلوي, إصابة الكلى الحادة, مرض الكلى المزمن, ومرض الكلى
‎٠‏ المتعلق بنقص التروية. يُفضل أن يكون نقص الفوسفاتاز منتقى من المجموعة التي تتكون من نقص الفوسفاتاز في الفترة المحيطة بالولادة, نقص الفوسفاتاز في الأطفال, نقص الفوسفاتاز في 558 الطفولة ‎childhood hypophosphatasia‏ ونقص. الفوسفاتاز ‏ في البالغين ‎adult‏ ‎.hypophosphatasia‏ ‏إضافة إلى حقيقة أن البروتين وفقاً للاختراع يمكن دمجه في تركيبة صيدلانية قد يكون إنزيم الفوسفاتاز
‎١‏ المذكور أيضاً جزء من تركيبة مغذية أو طعام مغذي. يمكن إضافة البروتين وفقاً للاختراع إلى ‎sale‏ مغذية ‎Jie)‏ اللبن) ويمكن إنتاجه أيضاً داخل ‎sale‏ ‏مغذية مذكورة (على سبيل المثال بواسطة الهندسة الجزيئية). علاوة على ما سبق, يمكن تحضير أقراص و/ أو كبسولات ‎Ally‏ تضاف لاحقاً إلى ‎sale‏ مغذية أو والتي يمكن تتاولها مباشرة بواسطة إنسان.
‎٠‏ علاوة على ذلك على يتم تقديم طريقة لعلاج خاضع يعاني من مرض التهابي, مرض الكلى أو نقص الفوسفاتاز, تشتمل على إعطاء كمية فعالة من البروتين وفقاً للطلب, على سبيل المثال, بروتين معزول أو ناتج عودة الاتحاد الجيني له نشاط إنزيم فوسفاتاز, حيث يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية حمض أميني بها على الأقل ‎5٠‏ أحماض أمينية متتابعة, لها تطابق متوالية يبلغ 90 6 على الأقل مع النطاق التاجي ذي الطول الكامل ل ‎PLAP‏ البشري, يشتمل جزء من البروتين
‎YO‏ المذكور على متوالية حمض أميني بها على الأقل ‎٠٠١‏ أحماض أمينية متتابعة لها ‎969٠0‏ تطابق
‏فضت
اخ متوالية مع منطقة الطرف لا التي تجانب النطاق التاجي ل ا0ا البشري, وأن يشتمل جزء من البروتين المذكور على متوالية حمض أميني بها على الأقل £0 أحماض أمينية متتابعة لها 96496 تطابق متوالية مع منطقة الطرف © التي تجانب النطاق ‎ALPE all‏ البشري, حيث يشتمل البروتين ذو الطول الكامل على متوالية الحمض الأميني لها تطابق متوالية يبلغ ‎9٠0‏ 96 على الأقل © مع ‎Adige‏ الحمض الأميني ذات الطول الكامل لمتوالية بهوية رقم: ‎,١‏ بشرط أن الحمض الأميني في الموضع 779 يكون ليوسين ‎(L) leucine‏ الحمض الأميني في الموضع 778 يكون فالين ‎(V) valine‏ والحمض الأميني في الموضع ‎EVA‏ يكون ليوسين (ا), أو كمية فعالة من بولي نيوكليوتيد وفقاً للطلب أو كمية فعالة من ناقل وفقاً للطلب. يمكن شرح الاختراع بمزيد من التفاصيل في الأمثلة التالية غير المقيدة. ‎pi Ye‏ 2 مختصر للرسومات الشكل ‎:١‏ متواليات الحمض الأميني لبروتين ناضج ‎MPLAP hIAP LVL-RECAP‏ يتم وضع خط أسفل المجالات التاجية المفترضة للبروتينات المختلفة. الشكل ‎Y‏ توزيع الأعضاء ل ‎LVL-RecAP‏ مقارنة ب ‎.CatALPI/crownALPP‏ يتم تصوير توزيع العضو إلى الدم من ‎LVL-RECAP‏ مقسوم على توزيع العضو إلى الدم ل ‎catALPI/crownALPP‏ ‎٠‏ (-نسبة المحور لا) . القيمة الأعلى ‎Ju‏ على استهداف ‎LVL-ReCAP‏ لعضو مناظر عند المقارنة ب ‎.catALPI/crownALPP‏ ‏الشكل ‎oY‏ بقاء ‎yi‏ 8»02/-/- المعالجة بإما مادة ناقلة, ‎١‏ مجم 480/5-/11/كجم/يوم, ‎A‏ ‏مجم 480/80]-ا/١ا/إكجم/يوم,‏ أو ‎٠١‏ مجم 0/0©|-ا/١اإكجم/يوم.‏ الشكل ؛: تركيزات الكرياتينين في المصل في خنازير صغيرة تعاني من نقص تروية الكلى/تلف ‎sale) ٠‏ التروية. الحيونات ‎Sham‏ خضعت إلى إجراء جراحي تم في أثنائه إزالة الكلى اليسرى. ومع ‎cell‏ لم يتم إجراء الانسداد الكلوي واعادة التروية. في المجموعة التي تلقت ‎YY‏ + مجم/كجم/يوم, في اليوم ‎,٠‏ تم إعطاء نصف الجرعة قبل ‎sale)‏ التروية وتم إعطاء نصف الجرعة المتبقي عند ‎A‏ ‏+ ؟ ساعة بعد ‎sale)‏ التروية. تم إعطاء جرعة كاملة يومياً لبقية المدة الزمنية أثناء الحياة. ير نض
سي الشكل #: تركيزات ‎AAP‏ خنازير صغيرة تعاني من نقص تروية الكلى/تلف ‎sale)‏ التروية. الحيونات 70 خضعت إلى إجراء جراحي تم في أثنائه إزالة الكلى اليسرى. ومع ذلك؛ لم يتم إجراء الانسداد الكلوي وإعادة التروية. في المجموعة التي تلقت ‎١77‏ مجم/كجم/يوم ‎٠٠١(‏ وحدة/كجم/يوم). في اليوم ‎٠‏ , تم إعطاء نصف الجرعة قبل ‎sale)‏ التروية وتم إعطاء نصف الجرعة المتبقي في 8 + ؟ © ساعات بعد ‎sale)‏ التروية. تم إعطاء جرعة كاملة يومياً لبقية المدة الزمنية أثناء الحياة. الشكل 6: تطور البقاء على قيد الحياة ووزن الجسم لفئران اما8/-/- بواسطة علاج ‎LVL-ReCAP‏ ‎(i‏ بقت ‎LVL-RecAP16‏ على ‎ad‏ الحياة حتى نهاية التجربة. بلغ متوسط البقاء على قيد الحياة 9 2 و042.5 ‎sald‏ ناقلة, ‎LVL-RecAP8 5 LVL-RecAP]‏ على الترتيب. ب) تكون فئران ‎—/—Alpl‏ المعالجة بمادة ناقلة أخف وزناً من ‎WT‏ الصغيرة من نفس الولدة: حسن العلاج ‎LVL-RecAP1 ٠‏ من وزن الجسم قريباً من ‎WT‏ عند 018. الفئران المعالجة بمادة ناقلة لم تبقى على قيد ‎shall‏ لفترة أطول ‎yall,‏ المعالجة ب ‎LVL-RecAP8‏ لا زالت أخف ‎bys‏ من ‎WT‏ ‏الصغيرة من نفس الولدة عند 053. في حين الفئران المعالجة ‎LVL-RECAP16‏ تعرض وزن جسم لا يختلف كثيراً عن 1//ا الصغيرة من نفس الولدة عند ‎P53‏ ‏الشكل ‎:v‏ علاج ‎LVL-ReCAP‏ يُحسن النمط الظاهري للهيكل العظمي لفئران ا0ل/-/-. صور ‎Vo‏ الأشعة للعمود ‎(gill‏ أطراف المقدمة؛ القفص الصدريء الكفوف والأطراف الخلفية لفئران ‎sala dalled) —/Akp2—‏ ناقلة, ‎LVL-RecAP16 ,LVL-RecAP8 LVL-RecAP1‏ والمجموعات المقارنة ‎WT‏ غير المعالجة (تكبير ‎(Xo‏ أظهرت فئران ‎—AKP2—‏ لين عظام ‎da‏ ‏(الأسهم) في الفقرات؛ العظام الطويلة؛ والقفص الصدري. مراكز التعظم الثانوية مفقودة في ‎Oh‏ ‏2م-/- (نجمة). يصحح العلاج باستخدام ‎LVL-ReCAP]‏ على نحو طفيف النمط الظاهري ‎٠٠‏ (رؤوس الأسهم) مقارنة ب ‎WT‏ غير ‎dalled)‏ عند 018. ب) يصحح العلاج باستخدام -ا/اا 88 و4808016-ا/ا على نحو جلي من النمط الظاهري العظمي في الفقرات, العظام الطويلة ‎Gail;‏ الصدري. تحديداً تتحسن معظم الأطراف البعيدة مع اتضاح تطوير مراكز التعظم الثانوية في منطقة مشط القدم (رؤوس الأسهم). الشكل ‎tA‏ تمعدن متطور في الفئران امل-/- المعالجة ب 480/8©5-ا/ا-. أ) التحليل النسيجي ‎Yo‏ لأفخاذ فئران ا0لل-/- (018), المعالجة ‎sale;‏ ناقلة ‎LVL-RecAP16 ,)051( LVL-RecAP8‏ ير نض
و 3, وفتران ‎WT‏ غير ‎dalled)‏ 053. كشف تبقيع ‎Von Kossa‏ عن تمعدن عظمي أفضل مع الجرعات المتزايدة من ‎LVL-ReCAP16 5 LVL-ReCAPS‏ اوضح مراكز التعظم الثانوية ومنطقة العظام القشرية تطور مدهش في التمعدن (أسود) مقارنة بغير المعالجة. توجد عظام تربيقية أقل في ‎LVL-RecAP16 5 LVL-RecAP8‏ مقارنة ب ‎WT‏ ولكن زيادة في التمعدن في المنطقة تربيقية © فضلاً عن المزيد من العظمانيات, ومن المتوقع أن تصبح عظام تربيقية. ‎(B/C‏ تحليل ‎BV/TV‏ ‏و/01//81 ل ‎LVL-RecAP16; LVL-RecAP8‏ حجم عظمي ‎Ji‏ وحجم عظمانيات أعلى من المجموعات المقارنة المماثلة في العمر. الشكل 9: تطور لين ‎allie‏ ومستويات ‎PPI‏ في البلازما في فثئران اما8/-/- المعالجة ب ‎LVL=‏ ‎.RecAP‏ أ) التحليل النسيجي للأفخاذ لامل-/- المعالجة ‎sale;‏ ناقلة (18م), ‎LVL-RecAP8‏ ‎,(p51) ٠‏ 53م ‎LVL-RecAP16‏ والفئران ‎WT‏ غير المعالجة 053. أوضح ‎Goldner’s ais‏ ‎Trichrome‏ لقطاعات الأفخاذ لين عظام حاد في امل/-/-, وتطور التمعدن في المنطقة القشرية وفي التعظم الثانوي مع زيادة جرعات ‎.LVL-RecAP16 5 LVL-RecAP8‏ وجود مساحات كبيرة من من العظمانيات, مما يقترح تحلل العظام, وليس تمعدنها. ‎(B/C‏ تركيزات ‎PPI‏ في بلازما فئران ‎—/Akp2—‏ المستقبلة ل ‎LVL-RecAP16 ,LVL-RecAP1‏ و ‎JWT‏ يؤدي العلاج بت ‎LVL=‏ ‎RecAPL ١٠‏ إلى انخفاض كبير في مستويات ‎PPI‏ المرتفعة في ‎i‏ ا0ل/-/- في 018. عند 53م أدى العلاج ب ‎LVL-ReCAP16‏ إلى تصحيح مستويات ‎PPI‏ في البلازما مقارنة بالمجموعات المقارنة ‎WT‏ ‏الشكل ‎:٠١‏ غياب العيوب القحفية الوجهية في فئران ا0لل-/- المعالجة ب ‎LVL-ReCcAP‏ صور السطح النظير ‎UCT‏ ل ‎WT‏ (ا, د), ‎—/=Alpl‏ المعالجة بمادة ناقلة (ب, ه) 5 ‎LVL-ReCAP16‏ ‎Yo‏ (ج, و) جماجم ‎Jl‏ عند 021 و053, على الترتيب. لم تختلف العظام الجبهية ولا العظم الجداري لفثران ‎—/=Alpl‏ المعالجة عن تلك في فتران ‎WT‏ جماجم البالغين في فثران اما /-/- المعالجة ب ‎LVL-RecAP16‏ لم تبدو مختلفة عن 1//ا في ضوء الحجم والشكل. الشكل ‎:١١‏ أنقذ علاج ‎Lia LVL-RecAP‏ النمط الظاهري السنخي السني في ‎(ya‏ املم/-/-. مقارنة ب ‎(A)‏ التصوير الإشعاعي و(د) تحليل ‎UCT‏ مقارنات من نوع رئيسي عند ‎P25-26‏ (8, ‎Yo‏ ) فرط تمعدن الفك السفلي في فئران امل8/-/- غير معالجة وانخفاض العظم السنخي ‎(AB)‏ ‏ير نض
أضراس قصيرة ‎M2 M1)‏ و1/43) مع عاج رقيق ‎(DE)‏ وغرف لب واسعة, وعاج معيب (نجمة بيضاء) في سن قاطعة ‎(INC)‏ مقارنة ب ‎(E)‏ التحليل النسيجي لأنسجة اللثة المقارنة, (6) لا تظهر فثران امالم-/- طبقة ملاطية لا خلوية ‎(AC)‏ وتغزو عظمانيات العظم السنخي حيز ‎PDL‏ تكوين تصلب عظام الأسنان (نجمة). (©, ‎(H‏ تُظهر فئران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎LVL-ReCAPS‏ تطور © مظهر التصوير الإشعاعي لارتفاع الضرس الطاحن, سمك العاج, وتمعدن العظام, على الرغم من استمرار عيوب الأسنان القاطعة. )1( لا تستعيد ‎LVL-ReCAP‏ على نحو نسيجي الطبقة الملاطية اللا خلوية إلى سطح الجذر. مقارنة بالمجموعات المقارنة ‎(LJ)‏ عند 053, ‎(MK)‏ تُظهر ‎Oh‏ ‏اما /-/- المعالجة ب ‎LVL-RecAP16‏ انخفاض تمعدن العظم السنخي حول أسنان الطحن. يظهر تكوين الضرس الطاحن والتمعدن على نحو طبيعي نسبي في ‎GE‏ ام1/-/- المعالجة, في حين ‎٠‏ تبقى الأسنان القاطعة متأثرة على نحو شديد على الجذر التناظري (نجمة بيضاء). مقارنة ب التحليل النسيجي ل ‎(N)‏ الأضراس المقارنة ‎(P) WT‏ تصور ‎(hy‏ ا0ا-/- المعالجة ب ‎LVL-ReCcAP16‏ ‏مزيج من العظم السنخي المتمعدن والعظمانيات (نجوم), وانخفاض حيز ‎PDL‏ مع باقئه. يتجلى تعلق ضئيل باللثة بسبب عدم وجود طبقة ملاطية, انعدام تنتظيم ‎PDL‏ وانفصاله, وانخفاض نمو ظهارة موصلية. تمت ملاحظة المناطق الصغيرة من توصيل ‎PDL‏ (شارة) بالسن. مقارنة بالتنظيم ‎Veo‏ القوي والموازي ‎GLE‏ كولاجين ‎PDL‏ في )0( الأنسجة المقارنة, الموضح بواسطة تبقيع تحت ضوء مستقطب, ‎(Q)‏ فئران امل /-/- المعالجة ب ‎LVL-RecAP16‏ تمتل ‎PDL‏ أقل تنظيماً, على الرغم من تواجد مناطق التنظيم والتوصيل مجاورة لمناطق الاختراق لتوصيل
جذور الأسنان. الشكل ‎:١١‏ يوهن العلاج ب 08 من إنتاج الستيوكين ‎cytokine‏ المحفز ب ‎LPS‏ في الخلايا ‎٠‏ الظهاريب الأنبوبية القريبة من البشرية ‎human proximal tubule epithelial cells‏ (©0015©0). تمت معالجة ‎CIPTEC‏ مسبقاً ب ‎٠١-#-١( recAP‏ وحدة/مل) يليه حضانة ‎LPS‏ ‎٠١(‏ ميكرو جرام/مل) لمدة ‎YE‏ ساعة وبالتالي تم قياس إنتاج ‎TNF-a‏ 6-اا و8-اا ‎(A)‏ ‏مستوى الجين في ‎WAN‏ بواسطة ‎V+) QPCR‏ وحدة/مل ‎(FeCAP‏ و(8) في مستوى البروتين في محلول طافي بواسطة ‎(C) (ELISA‏ تم إعطاء 6085© ‎٠١(‏ وحدة/مل) قبل ساعتين من التعرض ‎Yo‏ إلى ‎LPS‏ بالتزامن مع ‎LPS‏ أو بعد ساعتين من التعرض إلى ‎LPS‏ يلي ذلك قياس محتوى
ير نض
لا البروتين ‎IL-6 , TNF-a‏ و8-اا. (0) تمت ‎dallas‏ 0017856 مسبقاً ب © غير نشط لمدة ساعتين, يفتقر إلى خواص التحلل بالماء, يلي ذلك حضانة 10( ‎LPS‏ ميكرو جرام/مل) ‎sad‏ ؛ ؟ ‎dels‏ وبعدها تم قياس محتوى البروتين ‎IL-6 TNF—0t‏ و8-اا. تمت حضانة الخلايا المقارنة بأوساط المستنبت. تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط ‎SEM:‏ (ع-2), # م< 00+ مقارنة © بالمجموعة المقارنة, * ‎٠,٠5 >p‏ مقارنة ب ‎LPS‏ ‏الشكل ‎yy‏ تتقيد تأثيرات ‎recAP‏ بالالتهاب المحفز ب ‎LPS‏ وتكون خاصة بالكلى. تمت معالجة ‎CIPTEC‏ مسبقاً ب ‎V+) recAP‏ وحدة/مل) لساعتين يلي ذلك الحضانة مدة ؛ "ساعة باستخدام ‎٠١( TNF-a (A)‏ نانو جرام / مل) أو ‎(B)‏ محلول طافي من الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي المحاكاة ب ‎١ ,081/08( LPS‏ نانو جرام / مل ‎(LPS‏ وبعدها تم قياس إنتاج 6-اا و8-اا في ‎Vo‏ مستوى البروتين بواسطة ‎(C) ELISA‏ تمت حضانة ‎PBMCs‏ مسبقاً لمدة ساعتين باستخدام ‎٠١( recAP‏ وحدة/مل) يلي ذلك التعرض إلى ‎١( LPS‏ نانو جرام / ‎YE sad (de‏ ساعة. تم قياس إنتاج 6-اا و0-لا1 بواسطة ‎ELISA‏ تمت حضانة الخلايا المقارنة باستخدام أوساط المستنبت. تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط +ا/ا58 (ع<*), # 0<0*.,. مقارنة بالمقارن, * م< ., . مقارنة ب ‎LPS‏
CIPTEC ‏في المعمل. تمت معالجة‎ LPS ‏المحفز ب‎ ATP ‏على إطلاق‎ recAP ‏الشكل ؟١: تأثير‎ Ve ‏ميكرو‎ ٠٠١ ‏ميكرو جرام/مل أو‎ ٠١( LPS ‏وحدة/مل) يلي ذلك حضانة‎ ٠١( 6080© ‏مسبقاً ب‎ ‏الخلوي بواسطة التألق‎ ATP ‏دقيقة, تم تجميع محلول طافي لتحديد إطلاق‎ To ‏جرام/مل). بعد‎ ‏الحيوي. تمت حضانة الخلايا المقارنة بأوساط المستنبت. تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط‎ ‏(ع<*), # << ., . مقارنة بالمقارن.‎ SEM+ ‎٠‏ _ الشكل ‎:Vo‏ يمنع ‎RECAP‏ التدهور المحفز ب 105 في وظيفة الكلى في الكائن الحي. تم تقييم وظيفة ‎KI‏ بواسطة قياس عبر الجلد 16١7-سينسترين‏ 5015010 11/2. تم تحفيز اكلم في الجرذان بواسطة ‎LPS‏ ).+ مجم/كجم /0.07., ‎,)٠<!‏ يلي ذلك العلاج ب م6 ‎Vee)‏ وحدة /كجم ‎(bow‏ عند ‎.Y=t‏ تم إجراء قياسات 11/2 عند )<ساعتين ‎YY ,0=t;‏ ساعة ‎LA)‏ 8: أمثلة على حركيات ‎(iain FITC‏ تم الحصول عليها لجرذ واحد عند اثنين من النقاط الزمنية المتتالية). ‎Yé=ty),o=t ‏وتم الحصول على عينة من البلازما عند‎ Vist o=t ‏بين‎ Urine ‏تتم تجميع البول‎ Yo ‏ير نض
م اذ ساعة, والسماح بحساب ‎(C)‏ إفراز اليوريا الجزيئي ‎(D) 5 Fractional Urea excretion‏ الخلو من الكرياتينين ‎Creatinine‏ مع متوسط قيمة البلازما ‎١,941‏ و)-؟ ؟. تم التعبير عن البيانات في صورة المتويط +/5]1 (العلاج الوهمي, ‎LPS+recAP ;1 =z LPS‏ ع<*), # م<ه .,. مقارنة 2 العلاج الوهمي. ‎oe‏ الشكل ‎RecAP part)‏ إصابة الكلى أثناء ‎AKI‏ المحفز ب 05 في الكائن الحي. ‎(A)‏ إفراز
‎KIM-1‏ في البول 5 ‎(B)‏ إفراز ‎(C) ,NGAL‏ مستويات ‎NGAL‏ في البلازما ‎(D) 5, (Ye=t)‏ وتحدد محتوى بروتين ‎KIM=1‏ في الكلى بواسطة 5/8اا. ‎(BE)‏ تم تبقيع أقسام الكلى في البارافين ‎Paraffin kidney sections‏ باستخدام مضاد ل ‎KIM=1‏ لمشاهدة التعبير عن بروتين ‎KIM=T‏ ‏أشرطة القياس: 500 ميكرو مولار (اللوحة اليسرى), ‎٠٠١‏ ميكرو مولار (اللوحة اليمنى). تم التعبير
‎LPS+recAP ;1=¢ LPS ,186800 ‏(العلاج الوهمي‎ SEM* ‏عن البيانات في صورة المتوسط‎ ٠ ‏ع ©: متغيرات البول: العلاج الوهمي ع 6 # م<ه.,. مقارنة بالعلاج الوهمي.‎ ‏في محلول‎ LPS ‏المحفزة ب‎ cytokines ‏على السيتوكينات‎ recAP ‏يوجد تأثير لز‎ YY ‏الشكل‎ ‏ميكرو جرام/مل)‎ ٠١( ‏ساعة‎ YE ‏تمت حضانته لمدة‎ LPS ‏طافي 500610781801. محلول طافي من‎ ٠١( recAP ‏أو حضانته في الوسط (مققارن) تم تجميع ©010185, وحضانته باستخدام أو دون‎
‎٠‏ وحدة/مل) لمدة ؛ 7 ساعة أخرى يلي ذلك قياس ‎IL-6 ,TNF-o‏ و8-اا بواسطة ‎ELISA‏ تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط ‎SEM‏ # م<5 ‎٠,‏ مقارنة بالمقارن, * م05<0, مقارنة ب ‎.LPS‏ ‏الشكل ‎VA‏ العلاقة بين أنشطة الإنزيم ل ‎RECAP‏ في مصل بشري عند ‎YO‏ درجة مئوية وعند ‎TV‏ ‏درجة مئوية.
‎٠‏ الشكل ‎V4‏ العلاقة بين أنشطة الإنزيم ل ‎LVL-RecAP‏ في مصل بشري عند ‎YO‏ درجة مئوية وعند ‎TV‏ درجة مئوية. الشكل ‎٠١‏ يعرض نشاط / ميكرو جرام البروتين عند ‎Yo‏ درجة مئوية وعند ‎TV‏ درجة مئوية ل ‎.LVL-RecAP 5 RecAP‏ تمثل القيم متوسط النشاط ‎A‏ بين ‎Yo‏ درجة ‎TV 5 Asie‏ درجة مثوية لتركيز بروتين محدد.
‏بي
‎q —‏ اذ الوصف ‎١‏ لتفصيلي: الأمثلة المثال ‎١‏ ‎LVL-RecAP «li‏ في محلول منظم © المواد: ‏إنزيمات فوسفاتاز قلوية ناتج عودة الاتحاد الجيني البشري ‎Human recombinant alkaline‏ ‎:phosphatases‏ ‎SALPI-ALPP-CD .١‏ (متوالية بهوية رقم: ¢( ‎(DOM: 04-Aug-2008)‏ ‎LVL-TecAP ."‏ (متوالية بهوية رقم: ‎(DOM: 14-Oct-2011) )١‏ ‎Ye‏ الطرق: الاعتمادية على الزنك ‎Zinc‏ : تحدد نشاط ‎١‏ لإنزيم ومحتوى البروتين لكل من دفعات إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني البشري. محاليل البروتين في الخطوة التالية ‎٠٠١‏ ميكرو جرام/مل تم تحضيرها لكل حالة لتحديد الاعتماد على الزنك للدفعات ‎LVL-recAP 4 SALPI-ALPP-CD‏ وفقاً للمبين في الجدول 7. ‎7-1 ,¢=T ‏تم تخزين العينات التي تم تحضيرها في درجة حرارة الغرفة وتحليلها لنشاط الإنزيم عند‎ Vo ٠س‎ Y¢ =T, IS,
SALPI-ALPP-CD ‏ظروف دفعات إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني‎ :١ ‏الجدول‎ ‏لتحديد ثباتها (نشاط محتفظ به) في وجود وغياب الزنك وتأثير عامل خلاب‎ LVLE-recAP (EDTA) ‎TY gm
CT me HT ‏الحالة مانيتول(96)‎ ‏مولار )%( مولار) مولار‎
IEE ‏ا‎ ‏ل ل‎ I I ‏دن‎ ‏ل ل‎ I ‏دن ل‎ ‏من قا كن ل ل‎ ‏سس ل ل ل‎
IE ‏كن ا ا ان‎
I ‏نا ا ا ل ل‎ ‏ل ل‎ I ‏كن ا‎
IS ‏ان ل‎ I ‏كن ا‎
I I i I
SOP ©6001 ‏كانت تحديدات أنشطة الإنزيم طبقاً للإجراءات القياسية, وفقاً للمبين في‎ (OD280 ‏مل لتر /مجم/سم‎ ٠٠١١٠ erecAP) 010280 ‏تحددت تركيزات البروتين بواسطة قياسات‎ ‏النتائج‎ ‏الجدول ؟:‎ .7 ‏نشاط إنزيمات فوسفاتاز قلوية المختلفة في ظل الظروف وفقاً للمحدد في الجدول‎ © [ma]
Ivy
PR
1 ‏نا نت ات نعل‎ ‏نت شت لتتك لثنكا نشكا تتنكا تا‎ كما يتضح على نحو جلي في الجدول ؟ : يكون ‎LVL-RecAP‏ بدرجة كبيرة أكثر ثباتاً (أي يعرض نشاط إنزيم متبقي أكثر: مشار إليه بواسطة ‎of‏ بنجوم) في وجود عامل خلاب فلزي ‎(EDTA)‏ أكثر من ‎,SALPI-ALPP CD‏ مما يشير إلى تبعية أقل ل 202+ لنشاطه. ° المثال ‎١‏ ‏ثبات ‎LVL-RecAP‏ في محلول منظم المواد: إنزيمات فوسفاتاز قلوية ناتج عودة الاتحاد الجيني البشري: ‎(DOM: 04-Aug-2008) SALPI-ALPP-CD .\‏
(DOM: 14-Oct-2011) LVL-recAP .¥
الطرق
في تجربة مستقلة ثانية, تم اختبار ثبات ‎LVL-recAP 5 SALPI-ALPP-CD‏ في عدة ظروف وفقاً للمبين في الجدول 4 .
2 بالنسبة لكل من دفعات ‎AP‏ ناتج عودة الاتحاد الجيني في هذه التجربة ثم تحضير ‎Yeo‏ ميكرو جرام/مل بروتين محاليل في ‎١.075‏ مولار محلول منظم جليسين ‎glycine buffer‏ الرقم الهيدروجيني ‎has ,4,7 pH‏ بشري وبلازما سيترات بشري لكل حالة محلول منظم لتحديد الثبات. تمت حضانة جميع عينات ‎AP‏ ناتج عودة الاتحاد الجيني التي تم تحضيرها عند ‎TY‏ درجة مئوية وتحليل نشاط الإنزيم لها عند :
‎v,0 -1 ,. =T Ye‏ ساعة, ‎١ =T‏ ساعة, ‎-١‏ ؟ ساعة و 1- ‎YE‏ ساعة. الجدول 4 : ظروف إنزيم فوسفاتاز قلوي لدفعات ‎SALPI-ALPP-CD‏ و ‎LVL-recAP‏ ناتج 3350 الاتحاد الجيني في محلول منظم جليسين لتحديد ثباتها (نشاط محتفظ به) في وجود/ غياب الزنك وتأثير عامل خلاب ‎EDTA)‏ أو سيترات 0610816). مانيتول ‎Zn‏ (ميكرو ‎Mg‏ (ملي ‎EDTA‏ ‏الحالة % ‎Mannitol | ~ BSA‏ مولار) مولار) (ملي مولار) )%( 6 ا أ ‎or‏ ‏6 أ أ ل 6 6 ا أ ل 6 د ‎Ce‏ ‏با
-." _ النتائج الجدول © - نشاط إنزيمات فوسفاتاز قلوية المختلفة في ظل ظروف وفقاً للمحدد في الجدول 6 . الحال | ‎sALPI-ALPP-CD LVL-recAP‏ ‎Vt=| ..t=| t=‏ لحك ‎T=| Yét=|‏ احا |= اح ‎Yet=|‏ ‎٠ o lo]‏ ‎iY | A.eo| Y.eo| .0¢| Y.ov | .oo ١‏ مه | ‎Y.oo| oY | .oY‏ ‎A A 9 ١‏ ‎7.١١ | .١ 0) EA Lo] 3| T.e) oY | 57 04 Y‏ ‎o * * o‏ ب" ‎Ay‏ ‎Y.gd LOY | coy | Lon Y‏ لما | ‎YA | YY AY Vee | YY‏ 9 1 * * 7 9 3 4. |17 امف ‎١|‏ امنا لحف ايا | ‎YAY Ya‏ ‎A * * 7 \‏ 1 3 ‎oY | 1.4 AY A‏ اما ‎٠.7‏ ده, 25 اهم ‎NAA‏ 25 ‎Y‏ 9 9 9 ° تم إجراء تحديدات أنشطة الإنزيم طبقاً ل ‎SOP PCO01‏ تم تحديد تركيزات البروتين بواسطة قياسات 00280 ‎٠١٠١ erecAP)‏ مل لتر إمجم/إسم 00280). ‎٠‏ كما يتضح على نحو جلي في الجدول © وتماشياً مع النتائج في الجدول 3, ‎LVL-RecAP‏ يكون بدرجة كبيرة أكثر ثباتاً في وجود عامل خلاب فلزي ‎(EDTA)‏ أكثر من ‎SALPI-ALPP CD‏ (وفقاً للمشار إليه بواسطة قيم بنجوم), مما يشير إلى اعتمادية أقل ل 202+ لنشاطه. المثال ؟ بن لضي
— ¢ ¢ — الثبات الحراري وحركيات ‎LVL-RecAP 1PLP‏ الطرق التعبير عن البروتين تم إنشاء بلازميدات التعبير التي تحتوي على ‎SALPI-PLAP-CD‏ و ‎LVL-RecAP‏ المفرز المعلم © بالقمة اللاصقة ‎FLAG‏ وفقاً للموصوف ‎Kozlenkov et al. J Biol Chem 277,( ls‏ ‎and Kozlenkov et al. J. Bone Miner. Res. 19, 1862-‏ )2002( 22992-22999 2004( 1872(( .25 نقل عدوى الإنزيمات المعلمة ب ‎FLAG‏ على نحو انتقالي إلى الخلايا ‎COS-‏ ‏1 بواسطة الاستشراد الكهربائي, وبعد ذلك تم استنباتها في وسط ‎DMEM‏ لمدة 7 ساعة, وفقاً للموصوف سابقاً ( ‎Narisawa et al. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.‏ ‎٠‏ 2007) 1068-1077 ,293)) عندما تم استبدال الوسط ب ‎Opti-MEM‏ الخالي من المصل ‎Technologies)‏ عآنًا). تم تجميع بروتينات المفرزة التي تحتوي على ‎Opti-MEM‏ بعد ‎Te‏ ‏ساعة من نقل العدوى, وبعد ذلك تم ترشيحها من خلال مرشح ¥ ميكرو مولار أسيتات سيليلوز وديلزتها مقابل ‎TBS‏ يحتوي على ‎١‏ ملي مولار ‎MGCI2‏ و١٠‏ ميكرو مولار ‎.ZnCI2‏ ‏حركيات الإنزيم ‎ull Vo‏ الأنشطة الحفزية النسبية للإنزيمات المعلمة ب ‎FLAG‏ تم تغليف أطباق عيار دقيق بالجسم المضاد ل ‎(Sigma-Aldrich) FLAG M2‏ عند ‎1-٠,‏ ميكرو جرام مل لتر-١.‏ تمت حضانة هذه الأطباق باستخدام تركيزات مشبعة من ‎LVL-ReCAP‏ أو ‎sALPI-PLAP‏ المعلم ب ‎FLAG‏ ‏لمدة ؟ ساعات عند درجة حرارة الغرفة, وبعدها تم غسل الأطباق ب 085, يحتوي على 960.000 ‎Tween—-80‏ وتمت مقارنة الأنشطة النسبية ل ‎PLP‏ لإنزيمات مشبعة ‎M2‏ ‎pyridoxal-5'-phosphate ‏ثم قياس التحلل بالماء لركيزة فسيولوجية بيريدوكسال-#'-فوسفات‎ ٠ ov) ‏في محلول منظم قياسي للتجربة‎ ١,4 ‏عند الرقم الهيدروجيني‎ (Sigma-Aldrich) (PLP) ‏ميكرو‎ Ye. ‏و‎ MGCI2 ‏ملي مولار‎ ١ ,NaCl ‏ملي مولار‎ Yen ‏محلول منظم,‎ Tris—HCI ‏ملي مولار‎
Innova ) Pi ColorLock Gold ‏مولار 200012). تحدد تركيز الفوسفات الذي تم إطلاقه باستخدام‎ ‏كانت المنحنيات‎ (A650) ‏مولار‎ sl Tov ‏بواسطة قياس الامتصاص عند‎ + 05 ‏فضت
اج _
القياسية التي تم إنشاؤها لزيادة تركيزات الفوسفات خطية بين ‎90-١‏ ميكرو مولار وجميع التجارب
تم تصميمها لتقع داخل هذا المدى من تركيزات الفوسفات المتحلل بالماء. تم حساب معدلات التفاعل
المولاري المعبر عنها في صورة ] 5-1 ‎Pi]‏ لمدى تركيز الركيزة المحدد وثمتث موائمتها مع نموذج
موقع ربط واحد ‎(GraphPad Prism)‏ مقابل [الركيزة] لحساب ‎Km‏ (لم يتم تطبيق مخططات
‎Lineweaver-Burk ©‏ بسبب الافتقار إلى دقة التحويلات المتبادلة عند تركيزات الركيزة بالغة
‏الانخفاض).
‏تم استخدام تركيز الركيزة ل ‎PLP‏ البالغ 5060 ميكرو مولار. بلغ تركيز الإنزيم القابل للذوبان حوالي
‎١‏ نانو مولار وتراوحت أزمنة الحضانة من ‎0-١١‏ دقيقة, بناءً على الكفاءة الحفزية لكل إنزيم.
‏لضمان ظروف الحالة الثابتة ولتصويب إشارات الركيزة غير المحددة في طريقة ‎Pi ColorLock‏ ‎٠‏ 6014, تم طرح القراءة المبكرة (عند © دقائق) من قراءة أخيرة, وتم قياس 118650 على منحنى
‏قياسي مناظر ‎PE‏ تم إنشاؤه لكل تجربة على حدة. تم ‎shal‏ جميع التجارب من ثلاث إلى خمس
‏مرات وتم تسجيل الثوابت المشتقة في صورة المتوسط + 50.
‏لقياس الثبات الحراري, تمت حضانة الإنزيمات المعلمة ب ‎FLAG‏ عند 10 م في ‎١‏ مولار ‎DEA‏
‏(الرقم الهيدروجيني ‎A‏ 4( يحتوي على ‎١‏ ملي مولار ‎MGCI2‏ و١٠‏ ميكرو مولار 2. تمت ‎A) ٠‏ العينات عند نقاط زمنية مختلفة وتم وضعها على الثلج, وبعد ذلك تم قياس النشاط المتبقي
‏باستخدام ‎pNPP‏ باستخدام الطريقة التالية: تم قياس الإنزيمات المرتبطة بالنشاط في صورة
‏الامتصاص عند 565 نانو مولار ‎(A405)‏ كدالة على الزمن عند ‎Yo‏ درجة مئوية, باستخدام
‎٠١( PNPP‏ ملي مولار) في صورة الركيزة, عند الرقم الهيدروجيني ‎١,4‏ في ‎٠‏ * ملي مولار محلول
‏منظم 100 ‎Tris=HCI,‏ ملي مولار ‎NaCl‏ يحتوي على ‎١‏ ملي مولار 1/6612 و١7‏ ميكرو مولار ‎٠‏ 20012. تمت حضانة الإنزيمات أيضاً في هذا المحلول المنظم لمدة ‎٠١‏ دقائق عند درجات حرارة
‏متزايدة ‎(pV += YO)‏ وتم قياس النشاط المتبقي بنفس الطريقة.
‏النتائج
‏إنتاج الإنزيمات المعلمة ب ‎FLAG‏
‏ير نض
— أ ¢ — لمقارنة خصائص ‎iS all‏ ل ‎LVL-RecAP‏ ب ‎,SALPI-PLAP‏ تمت إضافة متوالية ‎FLAG-tag‏ ‏إلى كل من ‎cDNAs‏ وفقاً لما تم إجراؤه سابقاً لدراسة على نحو ‎PLAP jie‏ وط0حلا7 ‎Kozlenkov et al.
J Biol Chem 277, 22992-22999 (2002) and Kozlenkov (‏ ‎(et al.
J.
Bone miner.
Res. 19, 1862-1872 (2004‏ تمت استعادة ‎cDNAs‏ المعبر © عنه في الخلايا 0605-1 ومحلول طافي للمستنبت يحتوي على الإنزيمات المفرزة. تم تأكيد التعبير الناجح والاستعادة بواسطة تحليل لطخة ويسترن للجسم المضاد ل ‎FLAG‏ ‏متغيرات الحركيات باستخدام الركائز الفسيولوجية تم بحث خصائص إنزيم فوسفوهيدروليز ل ‎SALPI-PLAP 5 LVL-RecAP‏ بالنسبة إلى الركائز الفسيولوجية المتضمنة في الالتهاب والنوبات, تحديداً فيتامين ‎LVL- ki .86 vitamer PLP‏ ‎Jil Km RecAP ٠‏ من ‎١( SALPI-PLAP‏ 3 ميكرو مولار مقابل 10,7 ميكرو مولار) عند الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي (7,5), مما يدل على أن ‎LVL-RecAP‏ المتطور له ألفة ارتباط أعلى ل ‎PLP‏ أعلى من ‎SALPI-PLAP‏ عند الرقم الهيدروجيني الفسيولوجي. الثبات الإنزيمي ‎Enzyme stability‏ تم بحث تأثير طافرات الحمض الأميني ‎amino acid mutations‏ في ‎LVL-RecAP‏ على ‎Vo‏ الثبات الكلي للإنزيم بواسطة دراسات التثبيط الحراري. على الرغم من اشتمال ‎SALPI-PLAP‏ على مقاومة للحرارة متطورة مرتفعة بالفعل ( .%0 تثبيط عند ‎(a YYLA‏ كان ‎LVL-RecAP‏ أكثر مقاومة للتثبيط الحراري ‎١(‏ 965 تثبيط عند 8051 م). المثال 6 توزيع الحركية الدوائية ل ‎LVL-RecAP‏ في الجرذان ‎Yo‏ الجزء ‎A‏ الترميز الإشعاعي باستخدام اليود- ‎١١5‏ ‏بروتين ‎SALPI-PLAP-CD‏ وبروتين ‎LVL-RecAP‏ تم ترميزهم إشعاعياً باستخدام اليود- ‎١١5‏ ‏باستخدام الإجراء كلورامين ‎Chloramine‏ -1 وفقاً للموصوف بواسطة ‎Greenwood et al‏ * يكون مبداً الترميز بناء على الأكسدة 'في الموقع” لليود إلى اليود الذري والاستبدال الآلف للنواة له بلي
إلى حلقات الفينول في الموضع أورثو من مجموعة الهيدروكسيل 77203071 للوحدات البنائية تيروسين ‎tyrosine‏ ‏تم تعريض بروتين ‎SALPI=PLAP‏ للترميز باليود المشع باستخدام تقنية كلورامين-آ ‏ ؛ كي يتسنى الحصول على 57 مأ0)/مجم نشاط محدد ‎Aled‏ و١‏ مجم/مل لتر ‎١,9 NaCl)‏ 76) تركيز نهائي. ‎*F.C Greenwood, V.M Hunter, H.G Glover, The preparation of 131llabelled ©‏ ‎growth hormone of high specific radioactivity, Biochem.
J.89 (1963) 114-‏ 123 . أ المواد ‎٠‏ -إنزيم فوسفاتاز قلوي ‎£47,Y) sSALPI-PLAP Alkaline Phosphatase‏ وحدة/مجم) وحا/نا ‎١ 4( RecAP‏ وحدة/مجم) تم توفير بواسطة ‎AM-Pharma‏ عند ‎1,١‏ مجم/ مل لتر تركيز في 68 جليسيرول ‎glycerol‏ حجم/وزن, © ملي مولار ‎Tris‏ ؟ ملي مولار ‎5٠ MGCI2‏ ميكرو مولار 20012, الرقم الهيدروجيني ‎Ae‏ تم تخزين البروتين ‎SALPI=PLAP‏ والبروتين ‎LVL=‏ ‎RecAP‏ عند 4 م ‎Vo‏ - تم شراء نيوكليد مُشع ‎radionuclide YYo-agll‏ 100006-125 من ‎Perkin Elmer‏ في صورة يود الصوديوم ‎sodium iodide‏ في ‎5-٠١‏ ع هيدروكسيد الصوديوم ‎sodium‏ ‏06 (نشاط محدد: 147,8 680/مجم — نقاء نيوكليد مُشع ‎radionuclide purity‏ : %44,90( - تم شراء كلورامين ‎Chloramine‏ -1 (ل١-كلورو-م-تولين‏ سولفوناميد ‎N-chloro—p—‏ ‎MW toluenesulfonamide ٠‏ تاح ‎١‏ جم/مول), حمض تراي كلورو أستيك ‎trichloroacetic‏ ‏0, ميتا بيسلفات الصوديوم ‎٠95.١ MW) sodium metabisulfite‏ جم/مول) وتيروسين ‎tyrosine‏ من ‎.Sigma‏ ‏محلول منظم ‎Tris‏ © ملي مولار الرقم الهيدروجيني / تم تحضيره في معمل ‎.Chelatec‏ ‏بد
م ¢ —
- تم توفير ‎NaCl‏ 960,9 بواسطة ‎Versol®‏
‎YI‏ الطريقة
‏تمت إضافة ‎Ao‏ ميكرو جرام من البروتين, حوالي ‎٠١‏ ميكرو ‎Ci‏ من ا818125, ‎on‏ ميكرو لتر
‏من محلول منظم ‎THiS‏ و١٠‏ ميكرو لتر من كلورامين-7 (4,48 ‎٠‏ نانو مول, ‎٠٠‏ مكافئات/ بروتين) ° تتابعياً في 5 مل لتر أنبوب 1 ل10-81000. التفاعل تم تركه للتقليب ‎١‏ دقيقة عند درجة
‏حرارة الغرفة. تم خلط ¥ ميكرو لتر من وسط الترميز الإشعاعي مع محلول ‎MBS‏ %0 وتم تقييم
‏كفاءة الترميز الإشعاعي بواسطة كروماتوجراف طبقة رقيقة فورية ‎Instant thin layer‏
‎(ITLC) chromatography‏ باستخدام ‎TCA 90٠١‏ صورة ناتج تصفية تتابعية (تمت تصفية
‏إنزيم فوسفاتاز قلوي في قاع الشريط و١©"١-اليود‏ الحر تتابعياً عند قمة الشريط).
‎٠‏ بعد إضافة ‎٠١‏ ميكرو لتر من محلول تيروسين ‎٠١(‏ مجم/ مل لتر في ماء) الخليط الخام, تمت تنقية ‎SALPI-PLAP‏ المعالج باليود و ‎LVL-ReCAP‏ المعالج باليود بواسطة ترشيح الهلام ‎G10,)‏ ‎(GE Healthcare‏ وتصفيته تتابعياً باستخدام ‎NaCl‏ 0,9 96. تم تجميع أجزاء من حجم 07 مل لتر في أنابيب الاختبار. تم قياس النشاط الإشعاعي في كل جزء في عداد ‎Gamma‏ آلي معاير لليود-© ‎١١‏ نيوكليد مُشع ‎Wizard 2470 — Perkin Elmer)‏ ©1//80186). تم تجميع الأجزاء
‎Ve‏ التي تحتوي على المنتج المطلوب المعالج باليود المشع. تم التحقق من النقاء الكيميائي الإشعاعي ‎radiochemical purity‏ للمركب المرمز إشعاعياً ‎radiolabelled‏ بواسطة ‎ATLC‏ ‎vf‏ النتائج وخصائص بروتين ‎SALPI-PLAP‏ المرمز إشعاعياً تجاوزت كفاءة الترميز الإشعاعي المحددة بواسطة ‎ITLC‏ 90685 لكل من بروتينات. بعد تنقية 510, يكون النقاء الإشعاعي لتفاعل الترميز أعلى 9697 لكل من بروتينات.
‎.6 ‏في الجدول‎ 10 AEs ‏المرمز إشعاعياً بعد‎ SALPI-PLAP ‏ثم إيجاز خصائص محلول‎ ٠ ‏بعد التنقية‎ 1251-SsALPI-PLAP ‏خصائص محلول‎ :١ ‏الجدول‎
‏فت
‎q —_‏ _ ‎1251-LVL-RecAP 1251-sALPI-‏ ‎PLAP‏ ‎i} “‏ > ا ‎eee‏ ‏تركيز (مجم/مل لتر) ‎Yeo.) yea.)‏ النشاط الحجمى ‎YY.‏ ‏إ: ...لكلا (مأ0/مل لتر) النقاء الإشعاعى ل مضق ‎Radiopurity‏ )%( أ.؛ نشاط إنزيم فوسفاتاز قلوي تم تقييم النشاط الإنزيمي ل ‎SALPI-PLAP‏ المرمز إشعاعياً عن طريق ‎ELISA‏ ‏المواد ‏- طقم تجربة القياس اللوني إنزيم فوسفاتاز قلوي (المرجع 80683369 — رقم الدفعة: -5]4118166 © 3( - إنزيم فوسفاتاز قلوي بشري ناتج عود ‎NEARS‏ الجيني غير مرمز مخفف عند ‎YO‏ ,+ مجم/ ‎Je‏ لتر في ‎NaCl‏ 960,5 - إنزيم فوسفاتاز قلوي بشري ناتج عودة الاتحاد الجيني المرمز إشعاعياً مخفف عند ‎Yo‏ .+ مجم/ مل لتر في ‎NaCl‏ 960,5
ير - البروتوكول يستخدم طقم ‎Abcam‏ م-نيترو فينيل فوسفات ‎(PNPP) p-nitrophenyl phosphate‏ في صورة ركيزة إنزيم الفوسفاتاز ‎phosphatase substrate‏ والتي تحولت إلى الأصفر ‎Lamda max)‏ = 8 نانو مولار) عند نزع الفوسفوريل 00107/18180م0005م06بواسطة ‎JAP‏ يمكن للطقم رصد بإحخدا ميكرو وحدة ‎AP‏ العينات. تم إجراء تجربة القياس اللوني لإنزيم فوسفاتاز قلوي على 581-01-8 غير مرمز والمعالج باليود المشع. تم إجراء التجربة وفقاً لما تم وصفه في البروتوكول المقدم بواسطة ‎Abcam‏ ‏بإيجاز, تم تكوين المنتحنى القياسي من ‎٠‏ إلى ‎٠١0‏ نانو مول/عين من ‎PNPP‏ قياسي (حجم نهائي: ‎٠‏ ميكرو لتر). تمت إضافة ‎٠١‏ ميكرو لتر من محلول إنزيم ‎AP‏ في كل عين. على التوازي, تم ‎٠‏ تخفيف عينة الاختبار من 15000 ‎SALPI-PLAP‏ و8000 مرة في محلول منظم للتجربة. تمت إضافة ‎٠١‏ و70 ميكرو لتر من كل تخفيف وتم الوصول بالحجم النهائي إلى ‎Av‏ ميكرو لتر بمحلول منظم للتجربة. وبعد ذلك, تمت إضافة ‎5٠‏ ميكرو لتر من محلول ‎PNPP‏ إلى كل عين ‎sing‏ على عينة الاختبار. تمت حضانة التفاعلات القياسية وتفاعلات العينة ‎Te‏ دقيقة عند ‎YO‏ درجة مئوية في الظلام. تم ‎٠‏ إيقاف جميع التفاعلات بعد ذلك باستخدام ‎To‏ ميكرو لتر من محلول الإيقاف. تم قياس ‎OD‏ عند نانو مولار في قارئة طبق صغير. تم تخطيط المنحنى القياسي ‎pNP‏ . تم تطبيق قراءات العينة على المنحنى القياسي للحصول على مقدار ‎pNP‏ المتولد بواسطة ‎JAP due‏ يمكن حساب نشاط ‎AP‏ لعينات الاختبار: ‎SALPI-PLAP Ll‏ (وحدة/مل) = ‎XT /١/ [A‏ عامل تخفيف عينة الاختبار ‎Ye‏ ل: مقدار ‎pNP‏ المتولد بواسطة العينات (بميكرو مول) /ا: حجم ‎dial)‏ المضافة إلى عين التجربة ‎de)‏ لتر) آ: زمن التفاعل في الدقيقة بي
-١ه-‏ نشاط ‎SALPI-PLAP‏ (وحدة/مجم)- نشاط ‎SALPI-PLAP‏ (وحدة/مل) / تركيز ‎SALPI-PLAP‏ ‏(مجم/مل لتر) النتائج يوجز الجدول ‎١‏ النتائج. © الجدول ‎iy‏ النشاط الإنزيمي ل ‎ALPI-PLAP ; sALPI-PLAP‏ -ا125 غير المرمز الت ‎pe‏ ١/تخفيف ‏ / الاح تا -اطامع-ا125 حالا-ا125 يتشابهه النشاط الإنزيمي ل ‎SALPI-PLAP‏ غير المرمز والمرمز إشعاعياً مع حوالي 75 وحدة/مجم. بالتالي؛ لا يتم المساس بنشاط ‎SALPI-PLAP‏ بواسطة المعالجة بالإشعاع باستخدام كلورامين-آ في صورة ‎sale‏ مؤكسدة ‎oxidant‏ ‎٠‏ الجزء ب: دراسة التوزيع الحيوي لبروتين ‎1251-SALPI-PLAP‏ في الجرذان السليمة ‎Vom‏ المواد ‎SARs‏
اج يتم عرض خصائص سلالة الجرذ المستخدمة في هذه الدراسة فيما يلي: الأنواع: جرذان ‎Sprague Dawley‏ السلالة: ‎Crl CD® (SD) IGS BR‏ المصدر: ‎Charles Rlver France‏ 0 العدد والنوع: ‎١١‏ ذكراً
مدى وزن الجسم/العمر: تقريباً ‎You‏ جم في بداية الدراسة مدة التأقلم : خمسة أيام قبل العلاج طريقة التمييز: تمييز القفص باستخدام المجموعة (زمن الزبح). معاملة الحيوان
‎٠‏ التربية: إيواء الجرذان في مرافق الحيوان قبل العلاج وفي غرفة النشاط الإشعاعي بعد العلاج. الطعام: نظام غذائي متاح بحرية للفئران. لا توجد فترة صيام قبل العلاج. الماء: توصيل ماء الصنبور بواسطة زجاجة بولي بروبلين على نحو تلقائي. المبيت: قبل العلاج, تم إيواء الحيوانات في مجموعات من ثلاثة في أقفاص من بولي كربونات في ظروف قياسية, وتمييزها بواسطة تمييز رقم بطاقة الدراسة, رقم الحيوان, النوع, ومواعيد بداية ونهاية
‎٠‏ الدراسة. تم نقل الحيوانات المحددة لتوازن الإخراج إلى أقفاص الأيض (جرذذ في كل قفص) بعد العلاج. الوسط البيئي: تسجيل درجة الحرارة يومياً. تراوحت درجة حرارة الغرفة بين 77 ‎YES‏ -م. تم التحكم في دورة الضوء الصناعي باستخدام موقت آلي ‎٠١(‏ ساعات إضاءة, ‎VE‏ ساعات ظلام). طاقم العمل: المشاركون مؤهلون ومدربون بشكل مناسب.
‎Ad —_‏ جم الانتقاء: تم فحص الحيوانات عند القدوم بواسطة مدير الدراسة. يتم انتقاء الحيوانات السليمة فقط. تم الانتباه على نحو خاص لأي مؤشر على تفاعل التهابي في الحيوانات (على سبيل المثال خراج: التهاب الجلد؛ إلخ). ‎Y.‏ محلول ‎dc all‏ من ‎1251-LVL-RecAP 4 125I-SALPI-PLAP‏ © تم تخفيف محاليل ‎LVL-ReCAP 5 SALPI-PLAP‏ المعالجة باليود عند ‎+,Y0‏ مجم/ مل لتر في ‎NaCl 0.9%‏ قبل الإعطاء في الكائن الحي. ب.7 تصميم الدراسة يتم عرض تصميم الدراسة في الجداول ‎A‏ و ‎٠ a‏ الجدول ‎tA‏ تصميم الدراسة لتوزيع ‎1251-SALPI-PLAP‏ في الكائن الحي المجموعة زمن التضحية ٍ الحيوانات عينة الدم "نانو مولارء الدم والأعضاء 7 ذكور ‎Ye‏ مليون ‎٠‏ مليون دنانو مولار ‘ الدم والأعضاء ؟ ذكور "سس ©؟ مليون ©٠٠نانو‏ الدم والأعضاء ؟ ذكور ‎et‏ ‎Ede‏ س اس, ‎EA‏ الدم والأعضاء ؟ ذكور ‎EAR:‏ ‏اس ‎EEE‏ ~ ’ - ‎٠‏ * تم الإيواء على حدة في أقفاص الأيض مع تجميع البول والبراز عند ‎YE‏ س ‎EAs‏ س ير نض
— جم الجدول 19 تصميم الدراسة لتوزيع ‎1251-LVL-RecAP‏ في الكائن الحي زمن ‏ أخذ التوزيع الحيوي المجموعة | عدد الحيوانات زمن التضحية عينة الدم "نانو مولارء الدم والأعضاء 81 ؟ ذكور ‎٠‏ مليون ‎٠‏ مليون دنانو مولار ‘ الدم والأعضاء 82 ذكور "سس £0 مليون ©٠٠نانو‏ الدم والأعضاء 83 ؟ ذكور ‎ual‏ ‎Ese‏ سس اس, ‎NER‏ الدم والأعضاء 84 ذكور كس اس ~ ’ - ب.؛ الإعطاء في زمن التجربة, بلغ متوسط وزن جرذان ‎Sprague Dawley‏ حوالي ‎YE‏ جم. تم حقن الجرذان غير المخدرة في الوريد في وريد الذيل الجانبي (يسار) عند مستوى جرعة 500 ميكرو جرام / كيلو 0 جام مناظر لكمية بروتين 976 ميكرو جرام لكل جرذ ونشاط حوالي ‎0A‏ ميكرو أن لكل جرذ. بلغ ‎aaa‏ الحقن حوالي ‎TAY‏ ميكرو لتر. تم حساب أحجام الجرعة الفردية باستخدام وزن الجسم الفردي لكل ‎a‏ في يوم العلاج. تم وضع الجرذان في جهاز المحتوى. كي تتسنى ديلزة الأوعية الدموية في الذيل, تم غمس الذيل في ماء دافئ (©؛_م) وبعد ذلك التطهير بالكحول. ‎٠‏ تتم حقن محلول الجرعة ببطء في وريد الذيل. كي يتسنى حساب الجرعة الفعلية المستلمة بواسطة كل جرذ, تم وزن المحاقن قبل وبعد العلاج وتم عد حصة من محلول الجرعة في عداد ‎Gamma‏ ‏بض
ب.5 التوزيع في الأعضاء المتنوعة في زمن التضحية, تم تخدير الحيوانات بواسطة الحقن في الغشاء البريتوني ل 7,5 مل لتر / كجم وزن الجسم من خليط هيدروكلوريد كيتامين ‎ketamine hydrochloride‏ (0 © مجم/ مل ‎(A‏ ‏وهيدروكلوريد زيالين ‎Y +) xylazine hydrochloride‏ مجم/ مل لتر) في ‎PBS‏
تم قتل الجرذان بعد ذلك سريعاً بواسطة الاستنزاف عن طريق ثقب داخل القلب. تم تجميع الأعضاء المعنية يلي ذلك التقطيع إلى أجزاء للأعضاء التي تزن أكثر من ¥ جم مثل الكبد, المعدة, الأمعاء الدقيقة والقولون . تم شطف كل قطعة بعد ذلك بمصل فسيولوجي قبل المسح بالمناديل الورقية الناعمة, وززنها وعدها على حدة. كانت الأعضاء المنتقاة ‎cag‏ الكلى؛ القلب, الرئتين, الطحال, الهيكل العظمي, عظم
‎٠‏ الفخذء؛ المخ؛ والغدة الدرقية؛ المعدة, الأمعاء الدقيقة مع المحتوى, القولون مع المحتوى, الجلد والدهون المحيطة بالكلية. تم إجراء عد النشاط الإشعاعي للنسيج في ‎dae‏ آلي ‎Wallace Wizard 2470 - ( Gamma‏ ‎(Perkin Elmer‏ معاير لليود-١١‏ نيوكليد مُشع (كفاءة: ‎PVE‏ - زمن عد: ‎٠١‏ ثواني). تم التعبير عن تركيز النشاط الإشعاعي في الأعضاء/الأنسجة في صورة النسبة المئوية للجرعة التي
‎Vo‏ تم حقنها لكل جرام من النسيج (1096/جم). تحليل البيانات يشتمل على النسبة المئثوية للجرعة التي تم حقنها (1076) وكمية بروتين مكافئ لكل عضو أو نسيج. بالنسبة للأعضاء المعرفة على نحو محدد, تم حساب ما سبق باستخدام النشاط الإشعاعي المعدود في كامل العضو . بالنسبة للدم, تم التوصل لذلك بافتراض أن عدات الدم ل 967,4 من إجمالي وزن الجسم.
‎٠‏ على نحو إضافي, تم حساب النسبة بين النشاط الإشعاعي المحتجز في الأنسجة والنشاط الإشعاعي في الدم (نسبة العضو / الدم). أخيراً, تم حساب النسبة بين ‎olf small‏ نسبة ‎SALPI-PLAP‏ ‏ونسبة العضو/الدم ‎LVL-ReCAP‏ (الشكل ‎.)١‏
‏ير نض
‎h —‏ جم ب١٠‏ التوزيع في دم ومصل الجرذ المستوى النشط إشعاعياً في الدم والمصل في زمن التضحية, تم الحصول على عينات الدم من مرات الاستنزاف عن طريق ثقب داخل القلب في جرذ تم تخديره بواسطة الحقن في الغشاء البريتوني لخليط من هيدروكلوريد كيتامين ‎ketamine‏ ‎hydrochloride | ©‏ وهيدروكلوريد زيالين ‎xylazine hydrochloride‏ في ‎PBS‏ ‏في نقاط زمنية أخرى مبينة في تصميم الدراسة (الجدول ‎A‏ و9), تم سحب الدم من وريد الذيل الجانبي (يمين) باستخدام إبرة فراشة قياس ‎YY‏ دون تخدير. تم تجميع كل عينة دم في أنابيب ‎Microvette‏ مسبقة تحديد الوزن مع منشط تخثر ‎(Sarstedt)‏ ‏تم وزن الأنابيب وتم قياس النشاط الإشعاعي في عداد ‎Gamma‏ ‎٠‏ تمت حضانة عينات الدم عند درجة حرارة الغرفة لمدة ‎٠‏ ؟ دقيقة وبعد ذلك, تم طردها مركزياً لمدة © دقيقة عند ‎٠٠٠٠١‏ جم لتحضير المصل. ثم تجميع المصل في أنابيب مسبقة تحديد الوزن وثم ‎Lac‏ ‏في عداد ‎.Gamma‏ ‏تم التعبير عن تركيز النشاط الإشعاعي في الدم والمصل في صورة النسبة المئوية للجرعة التي تم حقنها وكمية مكافئة ‎.SALPI-PLAP per mL‏ ‎Ve‏ يشتمل تحليل البيانات على النسبة المئثوية للمحقون المحسوب لإجمالي الدم والمصل. تعرض الجداول ‎٠١‏ و١١‏ نسبة النشاط الإشعاعي المقاس في مختلف الأعضاء فيما يتعلق بالنشاط الإشعاعي في الدم المصل ل ‎LVL-RecAP 5 sALPI-PLAP‏ على الترتيب. الشكل ¥ يعرض نسبة ‎LVL-ReCAP‏ العضو/الدم إلى نسبة ‎SALPI-PLAP‏ العضو/الدم. نسبة ", على سبيل المثال, تشير إلى أن ‎LVL-RECAP‏ يكون مستهدف مرتين بنسبة كبيرة بالنسبة إلى ‎٠‏ العضو المبين متل ‎SALPI-PLAP‏ ‏تشير النسب الأعلى علاوة على ذلك إلى أن نشاط أكبر نسبياً من ‎LVL-ReCAP‏ يتم اكتشافه في عضو محدد عند استخدام نفس الجرعة. ب
الاج الجدول ‎٠١‏ - نسبة العضو/ لدم ل ‎SALPI=PLAP‏ ‏الجدول ‎٠١‏ - نسبة العضوالام ل ‎SALPI-PLAP‏ ‏الغدة الدرقية/ ‎VY E‏ 6,1991+ | ءار | ‎£Y ANT‏ | دل الال : | لادلا |29 أدلااره 1 7 القصبة الهوائية الجلد انتب | ‎YALY‏ ,20 011+ 58+ ا لاا ‎FY,‏ ‎Yolo SYYY ee wea Yo‏ نال الكلى ‎VT‏ لد | ‎FETA‏ £0 لافار لاطي | ‎EYA‏ ,£0 ‎ARE eve)‏ 4 0 4 المعدة 3+ 494+ | ‎£Y, YY‏ ارا | ‎+V,0AYA‏ ‏الا ‎eve‏ متتل ‎AA ٠ AVY‏ ‎Jalal)‏ لامب + | الى + | ‎To, YYVYY | £20,YY0T | 2, YAA‏ ‎vo You ve YY oe YAY 0 YYY oe Van‏ الكبد 67 ,+ | 48 ,)2 ا ‎YYY | 2 EAYY‏ 20 الى + ا ل و 0 ‎AVY‏ بت ‎Yao 0 YYo‏ 0 القلب 48 ++ الكماكات+ | صتضنتاب+ | الكلاابء+ | ‎+o, YA‏ 7 مق فى ‎Ye o,f YAY oe YY‏ الرئتين فلخل + | ‎+o, 74YY | 2, YAYY | £4, ¥VAV | 24, YVIV‏ ‎AAR Le YYA SERRE‏ كي ادا ‎Try‏
- ‏مه‎ ‎Fo, ‏اعد لذ رن‎ AV 2,0 ALY | 20 AVA £00 ‏الهيكل العظمى لاف‎ veo vo VA vv YYA oe) ay ve VY
To, AVE | ‏ماج‎ | £008 £0, YY | +, ‏الدهون‎ ‏ل‎ I ie SERRE eva Va 0 YY
Fo, cE A Ee Yo | £0 YAY | + ‏الإداء‎ +٠8 ‏المخ‎ ‏داري ا‎ vee VY vee VY EEA +11١ | 2, YT | £0380) | £0339) | £4, YAAT ‏عظم الفخذ‎ ١ 4 ‏از 0 مدي‎ ae YY +,AVYA | 2), VY | ‏ادف اراح‎ HALE | 20 YAAY ‏الأمعاء الدقيقة‎ "7". ‏بت متكلب‎ AYY ‏تخي‎ IEA ‏امعد‎ £0 FEVY | Ea, ‏لغفف ناف‎ da YYY ‏القولون‎ ‏7د ى “,م‎ ve ‏ا‎ RRA vv oe YA
LVL-ReCAP ‏نسبة العضو//لدم ل‎ - ١١ ‏الجدول‎ ‎+Y VOY | + ‏47م | أت‎ 4١ ‏الغدة الدرقية/ 5654 الم ام ارلا‎ ١١د‎ ¢, Yao ١٠١ ‏دالا‎ ١, 4 ‏كي‎ ٍ ٍ ‏القصبة الهوائية‎ +71١ | ENVY | ‏تالبك‎ | 2 EY ‏الجلد 7+ ا‎ ‏متكذى‎ ١ vv AY. ‏مخ‎ ev VY
FYVYEAY | v2 ‏امتاخ‎ 2,TEYA | + ‏الكلى 77+ | مذا غاب‎ ‏نض اكد ل‎ I WN +, 1000 YAY
Try
‎q —‏ جم ‎+0,39Y | YY, ‏أل‎ | £1, Y4VYY | 2), 009A | +7 ‏المعدة‎ ‎٠ YY 79 ,Y VY Y,e1 A ٠ ,Y «49 ٠ ٠١١ ‏الطحال ‎+9١‏ ا لألأق + | ألمب + | ‎v2, YIVYY‏ | 11 711+ "للب قل 7 ,+ ا ‎IRE‏ ‏الكيد مركلا ش“"” خا | النكالل,+ ا ‎0A‏ بك اللنفكلكلات+ ‎ve 77 ,ًٌ Vv ve q+ ve YVV ٠ 19-2‏ ‎+, ١5 ‏ا .كاب‎ 20, YVYAC] £0, YVAY | +١٠ ‏القلب‎ ‎١ 7, ee YY ‏سن ال حي‎ ‏الرثتين لد لد التفغدت الطاف - ‎ETAT‏ داف ا ‎YY ,+YYo SERRE ve 287 ١‏ ‎+ ‏اغلاب + | امح‎ 2, YF +. ‏الهيكل العظمى 7+ الأحق‎ ‏ما‎ FARA ve, Yo) ee Vey eve VY ‏الدهون يي ‎VAY | +. 45| + VAC‏ ب | ‎Fo, AV‏ امل 0 اح .م مدلء, معاي ‎Fo, TET ‏أما .+ الات‎ | +. VAY ‏المخ ,+ ا‎ vv Ye EER vv oe YA ver Ao v, ve 0 ‎Fo WWE ve YAS | £0, YET | £0,YAVYY | +648 ‏عظم الفخذ‎
EAR ,+YYo "7 ve QA ve, YY ‎+0, TY | v8 Y | ‏الأمعاء الدقيقة لف ,4+ | زات د املف لض‎ ٠ ‏ا‎ ,ًٌ yo ٠ ١6 ve vay ve £9 ‎Try
— ‏أ‎ «=
EXPE ‏اننع لقف حا السك‎ ENR I LI RE ‏القولون لاف‎ ae ‏الل‎ any ve 14Y oe YY rv, 5+ ‏ف‎ o ‏مثال‎ 2 ه-/- نموذج فأر لنقص الفوسفاتاز في الأطفال نموذج فثران 8!002/-/- لنقص الفوسفاتاز في الأطفال يكون معروف في المجال ( ‎J Dent Res‏ 1 ,90)4(:470-476). بإيجاز, تم تكوين فثران 8002/-/- بواسطة إدراج شريط ‎Neo‏ في © إكسون + لجين ‎TNALP‏ فأر ‎(AKP2)‏ عن طريق ناتج ‎sage‏ الاتحاد الجيني ‎lad)‏ لتثبيط على نحو وظيفي جين ‎,AKP2‏ مما يترتب عليه ‎TNALP mRNA‏ أو بروتين غير قابل للرصد. تتبع إجراءات الاستخدام الحيواني وتجميع النسيج البروتوكولات المعتمدة من ‎Sanford-Burnham‏ .Medical Research Institute Animal Ethics Committee
A :)٠١ =N) as/aaS/LVL-ReCAP ‏مجم‎ ١ ,)٠١ =N) ‏تمت معالجة الحيوانات بإما مادة ناقلة‎ .)٠١ =N) موي/مجكإا١/ا-|4ع0/ ‏مجم‎ V1 ‏أو‎ (A =N) موي/مجكإا١/ا-٠+ع06/ ‏مجم‎ ٠ تم قياس البقاء على قيد الحياة وتقييم التطور العظمي. تم تقييم تمعدن الكلى. تم قياس مستويات ‎PPI‏ في البلازما, بيريدوكسال في البلازما, الكالسيوم في البلازما ومستويات فوسفات, تم قياس عظم ‏الفخذ و/ أو طول الساق لمختلف مجموعات العلاج. تم تجميع بيانات ‎MicroCT‏ لتحليل فرط ‏الجرعة العظمية المتبقية عند كل جرعة. ‎٠‏ النتائج ‏- البقاء على ‎ad‏ الحياة المتطور طويل الأمد للحيوانات المعالجة عند ‎VT‏ مجم/كجم/يوم (الشكل ‎10 ‏- يوجد إنقاذ (غير كامل) لعيوب الهيكل العظمي في العظام الطويلة حتى عند أعلى جرعة (بيانات ‎Yo‏ - يوجد بعض الإنقاذ في النمط الظاهري لللأسنان (بيانات غير موضحة). ‏بي
‎h \ —_‏ _ - يبدو أن هناك إنقاذ لتعظم الدروز الباكر (بيانات غير موضحة: مطلوب تأكيدها) - لا زال العمل على الكلى مستمراً. يوجد مؤشر على التمعدن في كلى الفئران غير المعالجة وتمعدن أقل في كلى ‎hall‏ المعالجة (بيانات غير موضحة). © المثال + : إعادة تروية فقر الدم الموضعي في نموذج كلية خنزير المواد والطرق : معلومات مادة ناقلة, مقارنة ومادة الاختبار تحضير المادة المقارنة ومادة الاختبار مادة مقارنة جديدة, محلول ‎sale LVL-ReCAP‏ مخففة (العلاج الوهمي), تم تحضيره للاستخدام في الدراسة قبل كل جرعة الإعطاء وتم حفظه مبرداً من ؟ إلى ‎A‏ م في ‎Ala‏ عدم استخدامه. تتم استخدام ‎sale‏ الاختبار, ‎LVL-RecAP‏ كما تم استلامها. لم يتم إجراء أي تعديل على النقاء عند تحضير صيعغ ‎١ sale‏ لاختبار . صيعغ ‎J sala‏ لاختبار ثم تحضيرها بواسطة الخلط مع حجم مناسب من محلول ملحي معقم لتحقيق تركيزات اسمية ‎,٠‏ 97,», أو £4 مجم/ مل لتر. تم تحضير الصيغ قبل كل جرعة إعطاء تحت غطاء تدفق صفائحي باستخدام معدة معقمة وتقنيات التعقيم. تم تفريغ الصيغ بالعدد المناسب في زجاجات المصل من زجاج العنبر, وحفظها على الثلج قبل الاستخدام ‎٠‏ واستخدامها لإعطاء الجرعة في غضون ¥ ساعة من التحضير. أحياناً, يتم تكوين تحضيرات إضافية حسب الضرورة أثناء مسار الدراسة. تحليل صيغ الجرعة : تم تجميع عينات مزدوجة ‎١,5‏ مل لتر من صيغة الجرعة النهائية قبل إعطاء الجرعة كل يوم من التحضير في اليوم ‎٠‏ (مجموعات ؟ إلى ) واليوم ‎١‏ (المجموعة ‎(V‏ تم تجميع العينات من الطبقات الوسطى وتم حفظها بالتجميد (-<0 © إلى -90 ‎(a‏ للتحليل المستقبلي المحتمل. ‎٠‏ معلومات نظام الاختبار : الحصول على الحيوان والتأقلم تم استلام خنزير هجين 701450126 ذكر غير معالج تجريبياً محلي (خنازير المزرعة ‎(farm pigs‏ (بعمر يتراوح تقريباً من ‎٠١ NA‏ أسابيع, عند الاستلام) من ‎Midwest Research Swine‏ ير نض
‎h \ —_‏ _ الجيبون, منسوتا. أثناء مدة التأقلم من ‎٠١‏ إلى ‎YA‏ يوماً, تمت ملاحظة الحيوانات يومياً بالنسبة إلى الصحة العامة وأي مؤشرات على المرض. تم إجراء تقييم البويضات والطفيليات في عينات البراز, وكانت جميع النتائج سالبة للحيوانات المشاركة في الدراسة. التقسيم العشوائي, التخصيص إلى الدراسة, والمتابعة © باستخدام إجراءات التقسيم العشوائي المنفصلة البسيطة تم تعيين الحيوانات (التي تزن من ‎١.9‏ إلى ‎٠‏ ؟ كجم عند التقسيم العشوائي) إلى مجموعات المادة المقارنة والعلاج وتحديدها في الجدول ‎١١‏ ‏التالي. ‏الجدول ‎AY‏ تعيينات المجموعة عدد الحيوانات الذكور ‎a‏ رقم المجموعة ّ : جا ' مج لاجم عي ل ل ‎YY.‏ ل مجم /كجم /يوم6 8 في اليوم ‎,٠‏ خضعت الحيوانات إلى إجراء جراحي وفي أثنائه تمت إزالة الكلة اليسرى أو اليمنى وتمت تغطية الشريان الكلوي في الجانب المقابل لمدة £0 دقيقة. عقب التغطية, تم السماح للوعاء بإعادة التروية. تم إخضاع سبعة من الحيوانات إلى الجراحة في كل مجموعة بهدف تحقيق ستة حيوانات في الدراسة.) خضعت الحيوانات ‎Sham‏ إلى ير نض
© إجراء جراحي وفي أثنائه تمت إزالة الكلى اليسرى. ومع ذلك؛ لم يتم إجراء الانسداد الكلوي واعادة التروية.0 في ‎,٠ asl)‏ تم إعطاء نصف الجرعة قبل ‎sale)‏ التروية وتم إعطاء نصف الجرعة المتبقية عند 4 + ‎Y‏ ساعات بعد ‎sale)‏ التروية. تم إعطاء جرعة ‎ALIS‏ يومياً لبقية الفترة الزمنية للحياة.. كانت الحيوانات المنتقاة للدراسة متجانسة في العمر والوزن قدر الإمكان. قيم الطبيب البيطري صحة الحيوانات قبل تسجيلها في الدراسة. تم نقل الحيوانات الإضافية التي تم الحصول عليها في الدراسة, ولم يتم تسجيلها في الدراسة, إلى المستعمرة. تم تخصيص لكل حيوان رقم حيوان مستخدم في نظام تجميع البيانات ‎Provantis™‏ وتم غرس © شريحة دقيقة فيه تحمل رقم تعريف فريد. تم تعريف كل حيوان أيضاً بواسطة علامة الأذن المحددة من المورد. تضمن رقم حيوان فردي, رقم الغرس, رقم علامة الأذن, ورقم الدراسة معرف فريد لكل حيوان. تم تمييز كل قفص بواسطة رقم الحيوان, رقم الدراسة, رقم المجموعة, والنوع. تم وضع الحيوانات في مبيت على نحو فردي في تشغيلات ذات أرضيات مرتفعة أو أقفاص متحركة من الفولاذ الذي لا يصداً مع الأرضيات البلاستيكية المغلفة. يوفر هذا النوع من المبيت غرفة مناسبة ‎٠‏ لاللتدريب لهذه الحيوانات. تم توفير تخصيب الحيوان طبقاً ل ‎MPI Research SOP‏ تم توفير إضاءة فلورية لمدة تقريباً ‎VY‏ ساعة في اليوم. تم إيقاف دورة الظلام على نحو متقطع بسبب الأنشطة ذات الصلة بالدراسة. تمت مراقبة درجة الحرارة والرطوبة على نحو متواصل, وتسجيلها, والحفاظ عليها إلى أقصى حد ممكن ضمن قيم المدى المصممة في البروتوكول من ‎1١‏ إلى ‎A‏ ف و١3‏ إلى 9676, على الترتيب. لم يتم تسجيل نتائج درجة الحرارة والرطوبة الفعلية, ولكن تم الحفاظ عليها ‎٠‏ في ملف الدراسة. ثم عرض الحمية الغذائية ) ‎Certified Lab Diet® #5K99, PMI Nutrition International,‏ ‎(Inc‏ عن طريق الوجبات محدودة؛ باستثناء أثناء المدد الزمنية المصممة. تم عرض التخصيب الغذائي, بما في ذلك أجزاء الألياف أو الأقراص, حسب الحاجة. الإجراءات الجراحية ‎٠‏ التعديلات ذات الصلة بالإجراء ير نض vg يقدم الجدول ‎VY‏ التالي التعديلات ذات الصلة بالإجراء ومستويات الجرعة المستخدمة أثناء مسار الدراسة. الدواء الجراحة (اليوم +( يومياً ‎IN‏ ‎I‏ ‏اس ا ‎I‏ ‏الا ا ال فذقت 00 ‎EE el‏ بوبرينورفين ‎Y.‏ + مجم/كجم0ا7 ‎Yor | IM‏ + مجم/كجم0ا7 ‎IM‏ ‏حا ‎a i‏ كيتوبروفين ¥ ‎IMasS/one‏ ¥ مجم/كجم ‎IM SID X‏ ان ب اق ا ‎I I‏ ‎¥.Y Ceftiofur‏ مجم/كجما/!| ".7 مجم/كجم ‎IM SID‏ اسلا ‎i Hi‏
Ivy
اج ‎h‏ _ محلول ‎Ringer‏ معالج بلاكتات | ‎٠١‏ إلى ‎Yo‏ مل لتر /كجم/ ‎(LRS)‏ ساعة /اا ‎eee ” ١ i | |‏ ‎IV‏ - في الوريد ‎IM‏ - في العضلات ‎TID | - INF‏ — مرتين ‎Lass‏ ‏ين ب ف الشةٌ تسريب في الشق (كل 6 إلى 4 ساعات) 0 - مرة يومياً قبل وبعد إجراء الإجراءات الجراحية طبقاً ل 500 ‎MPI Research‏ تم تجويع الحيوانات لمدة على الأقل ‎A‏ ساعات قبل الجراحة وتم تحفيز التخدير ومتابعته في الصورة المبينة في الجدول ‎AY‏ ‏تم إبقاء درجة حرارة الجسم عند ‎TY‏ + 7 م. قبل الجراحة, تم ‎sha)‏ الموجات فوق الصوتية لتحديد وجود الكيسات الكلوية. إذا لم تتم ملاحظة أي كيسات, تمت إزالة الكلى اليسرى وتمعالجة الكلى اليمنى وفقاً لالموصوف ‎Led‏ يلي. في حالة وجود الكيسات في ‎AK‏ واحدة, تتم إزالة تلك الكُلية وتخضع الكُلية الجانبية المقابلة إلى إجراء التغطية. في حالة وجود الكيسات في كل من الكلى, تتم إزالة الحيوان من الدراسة دون خضوع إلى إجراء جراحي. الإجراء الجراحي تم تحفيز إصابة نقص تروية الكلى/إعادة التروية باستخدام الإجراء المنشور بواسطة ‎Lee et al‏ ‎Vet.
Med.
Sci 72)1( : 127-130 ٠١‏ . ل( ‎٠‏ بمجرد التخدير, يتم وضع جميع الحيوانات في وضع الاستلقاء على الظهر ‎alg‏ تحضير المواقع الجراحية بمسحات بالتتاوب باستخدام مناديل فرك كلور ير نض
هيكسيدين ومحلول. تم إجراء عملية فتح البطن من خط الوسط لكشف كل من الكليتين. بناءً على نتائج الموجات فوق الصوتية, تمت ‎A)‏ الكُلية اليسرى أو اليمنى. للمجموعة ؟ من الحيوانات ‎cuss, (Sham)‏ إزالة لفة الإسفنج المدرجة بعد ذلك وفحصها وتم ‎Ju‏ ‏البطن بكلوريد الصوديوم الدافئ. تم غلق البطن بالطريقة الروتينية وتم غلق الجلد باستخدام دبابيس 0 الجلد وصمغ النسيج. تم ترك الحيوانات بعد ذلك تستفيق. جميع الحيوانات الأخرى, بعد إزالة الكُلية المحددة, تم عزل الأوعية الكلوية المتبقية وسحبها باستخدام حلقات وعاء. تم استخدام حلقات وعاء في سد الأوعية لمدة £0 (+ ‎)١‏ دقيقة, بعدها تم ترك الأوعية لإعادة التروية. تم إعطاء جرعة بلعة في الوريد من مادة مقارنة أو مادة الاختبار عند حجم جرعة ‎YYY‏ مل لتر / كجم (تم إعطاء نصف جرعة من ‎١,117‏ مل لتر / كجم إلى المجموعة ‎١‏ من ‎٠‏ الحيوانات) قبل ‎sale)‏ التروية على الفور. لجميع المجموعة ‎,١‏ © و7 من الحيوانات (مادة مقارنة, ‎TY‏ , و1 مجم/كجم), تمت إزالة لفة الإسفنج المزروعة بعد ذلك وفحصها, وغسل البطن ‎Ledley‏ ‎la‏ للموصوف سابقاً, وتم ترك الحيوانات تستفيق. لجميع المجموعة ‎١7‏ من الحيوانات ‎LY)‏ ‏مجم/كجم/يوم), تم إحداث شق في الفخذ وتم عزل الوريد الفخذي الأيسر أو الأمين. تم إدخال قسطرة في الوعاء وتم تمرير قسطرة في نفق تحت الجلد ومن الداخل للظاهر من خلال شق في القفص ‎١‏ الصدري. تم توصيل ‎Mie‏ وتثبيته في العضلة باستخدام غرزة غير ‎ALE‏ للامتصاص. تم بعد ذلك إازلة اسفنجات اللفة التي تم غرسها وفحصها, تم غسل البطن وغلقه وفقاً للموصوف سابقاً, وتم ترك الحيوانات تستفيق. إعطاء مادة الاختبار أو مادة مقارنة في ‎asl‏ , تم إعطاء مادة مقارنة أو ‎sale‏ الاختبار في الوريد إلى جميع المجموعة ‎,١‏ #, و1 من ‎٠‏ الحيوانات قبل ‎sale)‏ التروية على الفور بجرعة كاملة ‎FY ,٠‏ 0 ,1,15 مجم/كجم, على الترتيب. تم إعطاء جميع الجرعات عند حجم جرعة ‎١777‏ مل لتر / كجم. أيضاً في اليوم ‎٠‏ , تم إعطاء ‎sale‏ ‏الاختبار في الوريد إلى جميع المجموعة 7 من الحيوانات عند مستوى جرعة مدمج ‎TY‏ + مجم/كجم في اثنين من جرعات نصف منفصلة تبلغ ‎VT‏ + مجم/كجم عند حجم جرعة ‎TY‏ + مل لتر / كجم. تم إعطاء الجرعة الأولى قبل ‎sale)‏ التروية على الفور وتم إعطاء الجرعة الثانية تقريباً عند ‎A‏ (+ ير نض
‎h 7 _‏ _ ") ساعات بعد ‎sale)‏ التروية. تم إعطاء جرعات ‎FY ALK‏ + مجم/كجم/يوم ‎YTYY)‏ + مل لتر / كجم) إلى جميع المجموعة 7 من الحيوانات في الأيام ‎١‏ إلى ‎١‏ عند ما يقرب من نفس زمن ‎asd)‏ ‏في صورة اليوم الأولي ‎٠‏ جرعة (+ ساعتين). الإحصائيات © يحدد الجدول ‎VE‏ فيما يلي مجموعة من المقارنات المستخدمة في التحليلات الإحصائية الموصوفة
‏في هذا القسم.
‏الجدول ؛١:‏ جدول المقارنات الإحصائية
‏ل ‏تم وضع البيانات غير المعالجة في جدول داخل كل فاصل زمني, وتم حساب المتوسط والاتحراف المعياري لكل نقطة نهائية والمجموعة. لتركيزات الكرياتينين في المصل, تمت مقارنة مجموعات ‎zk‏ بالمجموعات المرجعية باستخدام تحليل القياسيات المتنوعة للتباين المشترك
‎.(RMANCOVA) ٠٠ (RMANCOVA) ‏تحليل القياسيات المتنوعة للتباين المشترك‎ ‏للنقاط النهائية المقاسة عند ثلاث أو أكثر بعد الفواصل الزمنية للاختبار, تم إجراء تحليل القياسيات‎ ‏المتتوعة (نموذج مختلط). لكل نقطة نهائية, تم تضمين النموذج المختبر لتأثيرات العلاج, الزمن,‎ ‏ير نض‎
‎h A —‏ _ وتفاعل العلاج والزمن. قبل بيانات الاختبار (القياس الأخير قبل إعطاء الجرعة) في النموذج في ‎i x i} 3‏ تق :
‏)13 لم يوجد ‎0<P)‏ 0 ,+( علاج ملحوظ بواسطة التفاعل الزمني, تم تقييم التأثير الرئيسي للعلاج. )13 كان تأثير العلاج غير كبير ‎,)٠,٠05>0(‏ تعتبر النتائج غير هامة ولا يتم إجراء تحليلات علاوة على © ذلك على المتغير. إذا كان تأثير العلاج كبير ‎,)٠.٠5<0(‏ يتم إنشاء التناقضات الخطية لمقارنة زوجية لكل مجموعة علاج بالمجموعة المرجعية. إذا كان التفاعل كبير ‎(1002p)‏ كل مجموعة علاج تكون مقارنة بالمجموعة المرجعية المناسبة من خلال التأثير البسيط ل "العلاج” لكل نقطة
‏زمنية. تم الحصول على هذه المقارنات الزوجية التأثير البسيطة من تفاعل "العلاج في الزمن". تم تسجيل نتائج جميع المقارنات الزوجية عند المستويات الملحوظة 605 5 ‎vn)‏ كانت جميع
‎٠‏ الاختبارات اختبارات مزدوجة الذيل. النتائج الكرياتينين في المصل كما يتضح في الشكل ؛, كانت هناك ارتفاعات في الكرياتينين متوسطة إلى معتدلة عند جميع الفواصل الزمنية, بالنسبة إلى قبل قيم الاختبار. يميل الكرياتينين إلى الزيادة بأقصى حد عند ‎Vi‏
‎Vo‏ ساعة بعد ‎sale)‏ التروية, وبعد ذلك ينخفض تدريجياً خلال الفواصل الزمنية اللاحقة. تتفق التغيرات في الكرياتينين مع انخفاض الترشيح الكبيبي الثانوية إلى إصابة الكلى ذات الصلة بالإجراء الجراحي (بيانات غير موضحة) . في معظم مجموعات العلاج, وعند معظم الفواصل الزمنية, يميل إعطاء مادة الاختبار إلى توهين الارتفاعات في الكرياتينين ذات الصلة بالإجراء الجراحي, مما يوضح التأثير الواقي ل ‎.LVL-RecAP‏
‎٠‏ كما يتضح في الشكل © كانت هناك ارتفاعات معتمدة على الجرعة في نشاط إنزيم فوسفاتاز قلوي ‎(ALP)‏ في جميع مجموعات العلاج التي استقبلت ‎sale‏ الاختبار عند ‎YE‏ ساعة بعد ‎sale)‏ التروية, بالنسبة إلى ما قبل قيم الاختبار. انخفض نشاط ‎ALP‏ تدريجياً في مجموعات العلاج المستلمة > ا مجم/كجم لكنها استمرت في زياد 8 تدريجية في الحيوانات المستقبلة ا مجم إكجم ‎asf‏ .
‎h q —_‏ _ ‎١7 Jed‏ اختبارات السلامة في البشر المادة والطرق الأهداف: © لتقييم السلامة وقابلية تحمل الجرعات الفردية والمتعددة لإنزيم فوسفاتاز قلوي المتطور ناتج ‎sage‏ ‏الاتحاد الجيني ‎(LVL-TeCAP)‏ الذي تم إعطاؤه بواسطة التسريب في الوريد (7.أ.) في خاضعين أصحاء. لتحديد الحركيات الصيدلانية ‎(PK)‏ ل ‎LVL-recAP‏ بعد تسريب في الوريد للجرعات الفردية والمتعددة ل ‎LVL-TecAP‏ في خاضعين أصحاء. أ التصميم والعلاجات دراسة ثنائية الجزء, متحدة المركز في عدد مخطط من ‎5٠‏ خاضعين أصحاء. يكون الجزء ‎A‏ دراسة عشوائية, مجهولة من الطرفين , بعلاج وهمي خاضع للسيطرة, وجرعة ‎sac Laie‏ فردية ‎single‏ ‎(SAD)ascending dose‏ في ما يصل إلى ؛ مجموعات متتابعة من / ذكور أصحاء واناث في كل منها (7 في ‎LVL-TecAP‏ و7 في العلاج الوهمي). سيتم إجراء محاولة لتضمين في كل ‎VO‏ مجموعة علاج عدد مساوي من الخاضعين الذكور والإناث, بحد أدنى ¥ وحد أقصى ؛ إناث لكل مجموعة. سيتم إعطاء جرعة فردية من ‎LVL-TECAP‏ أو العلاج الوهمي الذي تم إعطاؤه بواسطة تسريب في الوريد لمدة ساعة واحدة. سيكون الجزء 8 دراسة عشوائية, مجهولة من الطرفين, علاج الوهمي خاضع للسيطرة, جرعة متصاعدة متعددة 0056 ‎(MAD)multiple ascending‏ فيما يصل إلى ؟ مجموعات من 9 ذكور واناث خاضعين أصحاء في كل منها )31 ‎LVL-recAP‏ ‎٠‏ و؟ في العلاج الوهمي). هناك محاولة لتضمين في كل مجموعة علاج عدد مكافئ من الذكور والإناث؛ بحد أدنى 7 وحد أقصى ؛ إناث لكل مجموعة. يتقلى الخاضعون تسريب في الوريد ‎sad‏ ‎dela‏ واحدة من ©808+-ا/ا أو العلاج الوهمي في الأيام ‎,١‏ 7 و#. سيتم إعطاء العلاجات التالية: ير نض
‎١ «=‏ الجزء م المجموعة ‎:١‏ ١-ساعة‏ تسريب ل ‎Yoo‏ وحدة /كجم ‎LVL-recAP‏ ‏المجموعة ؟: ١-ساعة‏ تسريب ل ‎٠٠0‏ وحدة /كجم ‎LVL-recAP‏ ‏المجموعة ؟: ١-ساعة‏ تسريب ل ‎٠٠٠١‏ وحدة /كجم ‎LVL-TecAP‏ ‏© المجموعة ‎if‏ ١-ساعة‏ تسريب ل ‎٠0680‏ وحدة /كجم ‎LVL-TeCAP‏ ‏الجزء 8 المجموعة ©: ١-ساعة‏ تسريبات ل ‎©٠0٠0‏ وحدة /كجم ‎ALVL-TeCAP‏ الأيام ‎,١‏ 7 و3 المجموعة 76: ١-ساعة‏ تسريبات ل ‎٠٠٠١‏ وحدة /كجم ‎LVL-TeCAP‏ في الأيام ‎,١‏ ؟ و3 بعد اكتمال اليوم 9 من المجموعة ‎١‏ واليوم ؛ من المجموعة ؟ من الجزء ‎A‏ يتم ‎cha)‏ تقييم ‎PK‏ ‎Ye‏ مؤقت . ‎ly‏ 5 على النتائج, يمكن ضبط التسريب وجداول عينات ‎PK‏ لمجموعات ‎MAD 5 SAD‏ المتبقية. في الدراسة الأولى في البشر تلك, يحصل الخاضعون المشاركون في أدنى مستوى جرعة في الجزء ‎A‏ (المجموعة ‎)١‏ على جرعة طبقاً لتصميم إعطاء الجرعة الإنذاري لضمان أدنى مخاطرة. وهذا يعني إعطاء الجرعة ل ؟ من الخاضعين على نحو أولي. سيتلقى أحد هؤلاء الخاضعين الدواء النشط ‎LVL-recAP ١‏ وسيتلقى الخاضع ‎JAY)‏ العلاج الوهمي. إذا كانت نتائج السلامة وقابلية التحمل لأول ‎YE‏ ساعة بعد إعطاء الجرعة للخاضعين الأوليين مقبولة للباحث الرئيسي, سيتلقى 6 من الخاضعين الآخرين من أدنى مستوى جرعة جرعة العلاج الوهمي الخاضع للسيطرة بطريقة عشوائية )0 نشط و١‏ العلاج الوهمي). فترة المراقبة ‎٠‏ الجزء ‎tA‏ من اليوم ‎١-‏ حتى ‎$A‏ ساعة (اليوم 7) بعد إعطاء العقار. زيارات خارجية قصيرة إلى مركز البحث الإكلينيكي في الأيام 4, 9,3 و5١‏ ير نض
‎yy —‏ الجزء 8: من اليوم ‎١-‏ حتى 48 ساعة (اليوم ‎(V‏ بعد آخر إعطاء للعقار. زيارات خارجية قصيرة إلى مركز البحث الإكلينيكي في الأيام 8, ‎VAST ,٠١‏ سيتم فحص الخاضعين للأهلية ضمن ؟ أسابيع قبل (أول) إعطاء للعقار في كل مجموعة من الدراسة. تتم اختبارات المتابعة في اليوم ‎Vo‏ (الجزء ‎(A‏ واليوم ‎١9‏ (الجزء 8).
‏الخاضعون ‏الجزء ‎YY GA‏ خاضع ذكر وأنثى سليم الجزء 8: ‎YA‏ خاضع ذكر وأنثى سليم المعيار الرئيسي للتضمين
‎yy‏ النوع: ذكر أو أنثى العمر: 85-17 سنة, شامل مؤشر ‎ABS‏ الجسم ((0/ا8): 18.6 - ‎Yoo‏ كجم/م ؟, شامل عقار الدراسة عقار نشط
‎Vo‏ المادة الفعالة: ‎LVL-TecAP‏ صورة ناتج عودة الاتحاد الجيني متطورة من إنزيم فوسفاتاز قلوي بشري ‎(AP) human alkaline phosphatase‏ النشاط: إنزيم هيدروليز ‎hydrolase enzyme‏ المسؤول عن المعالجة بنزع الفوسفوريل ‎dephosphorylation‏ من إسترات أحادية لحمض فوسفوريك ‎mono-esters of phosphoric‏ ‎acid‏
‎٠‏ المؤشر: إصابة الكلى الحادة
القوة: ‎١ , YO uu , Tow‏ و ‎Teen‏ وحدة/مل صورة الجرعة: تسريب في الوريد ‎dea‏ التصنيع: صيدلية ‎PRA‏ ‏5 المادة: ‎٠١0‏ ملي مولار سيترات, ‎You‏ ملي مولار سوربيتول, ؟ملي مولار ‎5٠ MGCI2‏ ميكرو
مولار 002 الرقم الهيدروجيني ًٌ, 7 النشاط: لا يوجد المؤشر: غير قابل للتطبيق القوة: غير قابل للتطبيق
‎Yo‏ صورة الجرعة: تسريب في الوريد جهة التصنيع: ‎Nova Labratories Ltd, Gloucester Crescent, Wigston, Leicester,‏ ‎LE18 4YL, UK‏ معايير التقييم السلامة: ‎haat)‏ العكسية 676015 ‎(AEs) adverse‏ المؤشرات الحيوية (بما في ذلك دم
‎٠‏ اتقباضي ضعيف وضغط الدم الانبساطي, النبض, درجة حرارة الجسم, معدل التنفس), صورة بيانية كهربائية للقلب ‎(ECG) electrocardiogram‏ المراقبة المستمرة للقلب ‎continuous cardiac‏ 9 (مقياس عن بُعد ‎(telemetry‏ | اختبارات المعمل الإكلينيكي ‎Ly)‏ في ذلك الكيمياء الإكلينيكية [يعتبر ‎AP‏ متغير ‎[PK‏ مبحث الدم وتحليل البول), الفحص الجسدي والأجسام المضادة للعقاقير ‎(ADA) anti-drug antibodies‏
‎LVL-recAP ‏بناء على تحليل تركيزات نشاط‎ PK parameters ‏الحركيات الصيدلانية: معلامات‎ Yo ‏وا في المصل.‎
‏برضت
‎Ad —‏ 7 — النتائج تم الانتهاء من إعطاء الجرعة وزمن الملاحظة لجميع مجموعات الجرعة ولم تتم ملاحظة أي أحداث عكسية خطيرة في أي من المجموعات. يستمر تحليلات جميع المتغيرات المقاسة. المثال ‎A‏ ‏5 المواد والطرق ‎Obl‏ ‏تم تسجيل توليد وتوصيف فثران امل -/- سابقاً )1997 ‎.(Narisawa et al.,‏ فثران امل -/- نسخة ظاهرية رضيعة ‎Ly HPP‏ في ذلك عجز كامل في 80ل/1, تراكم ‎PPE‏ وعيوب التمعدن ‎Fedde et al., 1999; Narisawa et al., 2001; Anderson et al., 2004; Millan )‏ ‎(et 81., 2008 ٠‏ يكبت المكمل اليغذائي مع فيتامين 86 بإيجاز النوبات ويمد العمر حتى أيام بعد الولادة 77-18 ولكن يستمر فرط التمعدن وتراكم العظمانيات في الازدياد سوءاً مع تقدم العمر ‎Narisawa et al., 1997; Fedde et al., 1999: Narisawa et al., 2001; Millan )‏ ‎(et al., 2008‏ بناءً عليه, تم توفير وصول حر إلى جميع الحيوانات (المربين» والأمهات المرضعات؛ والجراء؛ والفطيم) في هذه الدراسة إلى الحمية الغذائية للقوارض معملية معدلة ‎ove)‏ ‎Vo‏ تحتوي على مستويات متزايدة ‎TYO)‏ جزء في المليون) من بيريدوكسين 07/100*106. تم ‎shal‏ ‏التنتميط الوراثتي على حمض النووي الوراثي وفقاً للموصوف ‎(Yadav et al., 2011) Glu‏ اعتمدت اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (نالا0ها) جميع دراسات الحيوان. إنزيم فوسفاتاز قلوي بشري خيمري قابل للذوبان ‎(LVL-RECAP)‏ ‏تم استخدام محلول من ‎LVL-ReCAP‏ عند ‎٠١١١‏ مجم/ مل لتر في 90675 جليسيرول حجم/وزن, ‎٠‏ « ملي مولار ‎Tris/HCl‏ ؟ ملي مولار ‎٠ MGCI2‏ © ميكرو مولار ‎ZNCI2‏ , وعند الرقم الهيدروجيني ‎٠‏ . كان للإنزيم نقاء <99,99 96 وفقاً للمكتشف بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الضغط. دراسة الاستجابة للجرعة باستخدام ‎LVL-RecAP‏ ‏بي
و١‏ تم تقسيم فتران اما/-/- إلى © مجموعات نموذجية: ‎dallas‏ بمادة ناقلة: ‎—/-Alpl fy‏ المعالجة بمادة ناقلة ‎)١٠ 6 = n)‏ فقط: ‎:LVL-RecAP]‏ فتران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎LVL-RecAP‏ عند ‎١‏ ‏مجم/كجم/يوم ‎:LVL-RecAPS8 ;(V¢ = nN)‏ فتران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎LVL-RecAP‏ عند ‎A‏ ‏مجم/كجم/يوم ‎:LVL-RecAP16, :)١١ =n)‏ فتران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎LVL-RecAP‏ عند ‎١١ 0‏ مجم/كجم/يوم ‎.)٠١ =n)‏ تمثل ‎Oh‏ من النوع الرئيسي الصغيرة من نفس الولدة من ‎Ob‏ املم-/- مرجع الحيوانات ولم تتلقة مرات الحقن ‎.)١4 =N)‏ تم حقن مجموعات نموذجية ‎sale‏ ناقلة أو ‎LVL-RecAP‏ يومياً ‎SC‏ في منطقة الكتف. تم إعطاء مرات الحقن بين الساعة 8 و١١‏ صباحاً. تم حساب الأحجام المعطاة 80بناء على وزن الجسم المقاس قبل الحقن. بدأت جميع العلاجات في اليوم ‎١‏ عقب الولادة, وتكررت يومياً لمدة تصل إلى ‎oF‏ يوماً أو حتى وقت التشريح. ‎٠‏ تجميع العينة تم إجراء التشريح في اليوم ‎oF‏ عقب الولادة (053), بعد ‎YE‏ ساعة من الحقن النهائي ل ‎LVL=‏ ‎RecAP‏ لتلك الحيوانات التي أتمت بروتوكول التجربة, أو ‎Sale‏ لتلك الحيوانات التي بدت مريضة الأطراف. تم إعطاء أفرتين في الغشاء البريتوني قبل التخدير. تم تجميع الدم في أنابيب ليثيوم هيبارين بواسطة ثقب في القلب. تألف التشريح من فحص الأمراض الشامل وأشعة إكس. ‎microcomputed tomography ‏التصوير الإشعاعي والتصوير المقطعي الحاسوبي الدقيق‎ Vo (uC)
Faxitron MX-20 DC4 ‏تم الحصول على صور التصوير الإشعاعي للهياكل العظمية باستخدام‎ ‏كيلو فولت. تم تصوير نصفي الفك السفلي عند‎ Ye ‏باستخدام طاقة تبلغ‎ (Chicago, IL, USA)
YA ‏كيلو فولت. تم تثبيت كامل الجماجم المشرحة من الفئران 021, وبعد ذلك مسحها بدقة‎ ٠ ‎GE ( eXplore Locus SP PCT jail ‏ميكرو مولار فوكسل موحد الخواص باستخدام نظام‎ Yo ‏تم الحصول على‎ .(Healthcare Before Clinical Imaging, London, ON, Canada ‏ملي‎ 6٠0 ‏ملي أمبير, مع زمن تعرض‎ Av ‏القياسات عند فولطية تشغيل 80 كيلو فولت وتيار‎ ‏درجة بالإضافة إلى‎ YA ‏التي تعمل على تدوير العينة‎ the Parker ‏ثانية باستخدام تقنية مسح‎ hydroxyapatite phantom ‏درجة. تم معايرة المسح إلى شبح هيدروكسيباتيت‎ Yo ‏زاوية مروحة‎ ‏فضت
م7١‏ وتم تكوين صور ‎ADE‏ الأبعاد عند حجم فوكسل فعال ‎VA‏ ميكرو مولار”. تم استخدام قيمة حدية ثابتة ‎٠608٠‏ وحدة ‎Hounsfield‏ لتمييز النسيج المتمعدن. تم تحديد المناطق ذات الأهمية ‎(ROI’s)‏ ‏من العظام الجبهية والجدارية ‎١‏ ملي مولار في الطول, ‎١‏ ملي مولار في العرض, مكافئ عمق لسمك العظام وبداية الموضع عند مسافة ‎١578‏ ملي مولار من الغرز السهمية والإكليلية, وفقاً للموصوف © سابقاً )2014 ‎et all,‏ نانا). تم قياس متغيرات حجم العظام, الكثافة والبنية باستخدام برامج ‎(GE Healthcare before Clinical Imaging, London, ON) Microview version 2.2‏ والخوارزميات ‎algorithms‏ القائمة )2009 ‎.(Meganck et al., 2009; Umoh et al.,‏ تم إجراء اختبارات + ل ‎Student‏ لمقارنة النتائج الكمية لتحديد الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين الأنماط الوراثية. تم تحليل وتسجيل بيانات عظام ‎PCT‏ طبقاً لتوصيات 2010 ‎Bouxsein et al.‏ ‎.((Bouxsein et al., 2010 ٠‏ بالنسبة إلى تصوير الأسنان, تم مسح تشريح نصف الفك السفلي ‎Lisa‏ على ‎Scanco Medical‏ ‎(Scanco Medical AG, Brtittisellen, Switzerland) MCT 50‏ عند ‎٠١‏ ميكرو مولار حجم فوكسل ا70*8. تم استيراد رزم 2 الفك السفلي في صورة ملفات ‎DICOM‏ واعادة توجيهها باستخدام برامج ‎IMaged‏ +1.48)), مع مقارنة المستويلات الإكليلية؛ السهمية؛ والمستعرضة للقسم المنتقى ‎Vo‏ _للمقارنة. للتحليل النوعي, تم مسح الفك السفلي ‎liga‏ على 35 61ل ‎Medical‏ 508000 عند 1 ميكرو مولار حجم فوكسل, ‎goo‏ فولت, ‎١55‏ ملي أمبير, مع 0,77 درجة خطوة دوران ‎VAG)‏ ‏درجة مدى زاوي) و١٠50‏ ملي ثانية تعرض لكل منظر. تم استخدام برامج ‎HP, ( 508000 UCT‏ ‎(DECwindows Motif 1.6‏ لإعادة إنشاء ثلاثية الأبعاد ومشاهدة الصورة. بعد ‎sale)‏ إنشاء ثلاثية الأبعاد, تمت تجزئة أحجام التاج؛ الميناء الجذور؛ والعظم السنخي باستخدام قيمة حدية عالمية ‎٠,1‏ ‎Yo‏ جم/سنتيمتر مكعب. تم قياس إجمالي الحجم ‎(TV) Total volume‏ حجم العظام (النسيج المتمعدن ‎,(BV) (mineralized tissue‏ وكثافة المعادن في النسيج ‎(TMD)tissue mineral density‏ لكامل التاج وعلى حدة للمينا, عاج الجذرء؛ العظم السنخي في منطقة المنفرق. للمينا والجذور, تم قياس السمك أيضاً. التحليلات النسيجية فضت
‎h —‏ 7 — تم تنظيف عينات العظام, وتثبيتها في 4 96 بارافورمالدهيد/,محلول ملحي منظم بفوسفات لمدة © أيام عند 5 م, وبعد ذلك تم نقلها إلى ‎967٠0‏ إيثانول للتخزين عند 4 م. الأقسام البلاستيكية تم تحضيرها وفقاً للموصوف سابقاً )2012 ‎et al.,‏ 780817). تم إجراء تبقيع ‎Van Gieson 1/00 Kossa‏ ثلاثي اللون على الأقسام البلاستيكية وفقاً للموصوف سابقاً )1997 ,.21 ‎(Narisawa et‏ .5 مسح © أقسام ‎Von Kossa‏ أو ‎Van Gieson‏ المبقعة ‎Lisa‏ بواسطة نظام ‎Aperio, ) ScanScopeXT‏ ‎(Vista, CA, USA‏ وتم تحليل الصور بواسطة باستخدام برامج ‎Bioquant ) Bioquant Osteo‏ ‎٠ (Osteoanalysis Co., Nashville, TN, USA‏ ثم تثبيت نصف الفك السفلي الأيسر المستخدم لتحليل النسيج في محلول ‎Bouin‏ لمدة ‎YE‏ ساعة, وبعد ذلك تم نزع المعادن منه في محلول ‎AFS‏ ‏(حمض أسيتيك ‎acetic acid‏ فورمالديهيد ‎formaldehyde‏ كلوريد الصوديوم ‎sodium‏ ‎(chloride ٠‏ وتضمينه في بارافين ‎paraffin‏ للتقسيم التسلسلي, وفقاً للموصوف مابقاً ( ‎Foster,‏ ‏2) لتبقيع ‎picrosirius‏ أحمر, تم تبقيع أقسام النسيج منزوع المعادن ب 9607 محلول مائي من هيدرات حمض الفسفومولبديك 17/0816 ‎phosphomolybdic acid‏ , 960,4 أحمر ‎Direct‏ ‏0, و 961,7 ‎LY‏ 4 استراي نتروفينول ‎Polysciences, Inc., ) 2,4,6-trinitrophenol‏ ‎(Warrington, PA‏ وفقاً للموصوف سابقاً )2012 ‎(Foster,‏ تمت ملاحظة الأقسام المبقعة ‎١٠‏ بأحمر ‎Picrosirius‏ تحت ضوء مستقطب للتصوير مجهرياً. الاختبارات الكيميائية الحيوية بعد إزالة النسيج العضلي, تم قياس أطوال عظم الفخذ, الظنبوب؛ عظم العضد والشعاع باستخدام فرجار. تم تجميد العظام؛ ولفها في شاش يحتوي على محلول ملحي لتجنب الجفاف. تم تقييم عظام الفخذ والظنبوب المعزولة باستخدام اختبار انثناء ثلاثي النقاط بواسطة استخدام ماكينة مادة الاختبارات ‎Instron 1101 universal ٠‏ وفقاً للموصوف سابقاً )2011 ‎et al.,‏ 1658). تمت إذابة العظام ببطء وتثبيتها عند درجة حرارة الغرفة قبل الاختبارات. تم وضع عظام الفخذ السليمة والظنبوب في ماكينة الاختبارات على دعامتين تفصلهما مسافة ‎١١‏ ملي مولار وتم تسليط الحمل على منتصف الجدل, بالتالي تكوين اختبار انثناء ثلاثي النقاط بسرعة ¥ مم:دقيقة-٠.‏ تجربة ‎PPi‏ ‏فضت
_ 7 7 _ تحددت تركيزات ‎PPI‏ في البلازما بواسطة الامتزاز التفاضلي على ‎aad‏ نشط لجلوكوز ‎UDP-D-‏
UDP— ‏اإجلوكونات‎ ١ - [وفسوف-١ ‏من التفاعل المنتج‎ (Amersham Pharmacia) [[6-3H .(Hessle et al., 2002; Yadav et al., 2014) ‏للموصوف‎ laa , D—-[6-3H]glucose © الإحصائيات في ضوء ‎of‏ التركيزات المختلفة ‎LVL-RecAP‏ نتج عنها معدلات بقاء على قيد الحياة مختلفة, تعذت مقارنة مجموعات العلاج الثلاث نموذجية بطريقة متطابقة في العمر. لهذا السبب, تم إجراء اختبار ‎Student It‏ غير المزدوج, المعياري, مزدوج الذيل لمقارنة فئران امل /-/- المعالجة بمجموعة ‎JWT‏ كانت الاختلافات ملحوظة عندما >00 ‎SL,‏ تتسنى مقارنة الاختلافات في منحنيات البقاء ‎٠‏ على قيد الحياة بين مجموعات العلاج النموذجية, تم إجراء اختبار ‎Gehan-Breslow—‏ ‎Wilcoxon ‏النتائج ‏ارتفاع البقاء على قيد الحياة ووزن الجسم في فئران امل -/- المعالجة ب ‎LVL-RecAP‏ ‏تحسن معدل البقاء على ‎ad‏ الحياة في الفئران التي استقبلت ‎A‏ مجم/كجم/يوم ‎(LVL-ReCAPS)‏ ‎٠‏ أو ‎V1‏ مجم/كجم/يوم ‎(LVL-ReCAP16)‏ من ‎LVL -ReCAP‏ بدرجة كبيرة مقارنة بالمعالجة بمادة ‏ناقلة ومجموعة ‎١‏ مجم/كجم/يرم ‎)٠.٠ ١٠ =p) (LVL-ReCAP1)‏ (الشكل 0 . الاختلافات كانت ‏ملحوظة إحصائياً عند مقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة لمجموعات نموذجية معالجة مقابل ‏بعضها البعض (م<0001.١‏ لجميع المقارنات). متوسط البقاء على قيد الحياة 68 77 و9١ ‎Lost‏ ‏في مجموعات نموذجية معالجة ب ‎LVL-RecAP] ,LVL-RecAPS8‏ ومادة ناقلة, على الترتيب. ‎Yo‏ تعذر حساب متوسط البقاء على ‎shall ad‏ للمجموعة ‎LVL-ReCAP16‏ لأن الحيوانات ظلت على ‏قيد الحياة حتى إنتهاء التجربة في اليوم ‎OF‏ ‏تزن حيوانات امل8-/- أقل من ‎WT‏ الصغيرة من نفس الولدة, بداية من حوالي ‎pT‏ أدى العلاج ‏باستخدام ‎١‏ مجم/كجم/يوم ‎LVL-RECAP‏ إلى زيادة كبيرة إحصائياً في وزن الجسم مقارنة بالفئران ‎TY
YA
‏يوماً من العلاج‎ VA ‏المعالجة بمادة ناقلة, ولا فرق كبير مقارنة ب 1//ا الصغيرة من نفس الولدة عند‎ ‏بواسطة 018-24 على حمية فيتامين 86, بناءً عليه لم تكن‎ —/-Alpl ‏(الشكل 7ب). ماتت فتران‎
LVL-ReCAP16 5 ‏التي عاشت لمدة طويلة‎ LVL-ReCAPS ‏مقارنة المجموعات النموذجية‎ ‏الفثران. تزن الحيوانات في مجموعة‎ WT ‏المعالجة بمادة ناقلة ممكنة, وبدلاً من ذلك مقارنة ب‎ of ill ‏الصغيرة من نفس الولدة من 018 (الشكل 7ب) في‎ WT ‏بدرجة كبيرة أقل من‎ LVL-RecAP8 © ‏تكن مميزة عن‎ aly ‏تعادل في وزن الجسم,‎ LVL-RECAP16 ‏حين أظهرت الفثران في مجموعة‎ ‏عند 053 (الشكل 7ب).‎ WT ‏الفتران‎ ‎—Alpl ‏من النمط الظاهري للهيكل العظمي في صور الأشعة للفئران‎ LVL-ReCAP ‏حسن علاج‎ ‏بما يوضح تشوهات عميقة في الهيكل العظمي بما في ذلك انخفاض‎ (IY ‏(الشكل‎ dalled) ‏غير‎ —/ ‏عثرنا‎ .)178021/ et al., 2011) ‏كتثافة المعادن في النسيج وتصدع العظام, وفقاً لالموصوف سابقاً‎ ٠
LVL= ‏مجم/كجم/يوم‎ ١ ‏التي استقبلت‎ —/=Alpl oh ‏على تحسن في أمراض الهيكل العظمي في‎
LVL= ‏وكانت الفائدة أكثر عمقاً في مجموعات نموذجية‎ (IV ‏يوماً (الشكل‎ YA sad RecAP ‏(الشكل ١ب). أظهرت الأطراف البعيدة شكل مورفولجي طبيعي,‎ LVL-RecAP16 5; RecAPS ‏في العمود الفقري» الأطراف‎ a ‏بغض النظر عن الجرعة, في حين تمت ملاحظة تصحيح‎
Ob ‏الأمامية؛ والأطراف الخلفية, وضلوع القفص لجميع مجموعات العلاج النموذجية. عرضت‎ ١ ‏أيضاً تصدعات ثانوية أو كسور في الأفخاذ والظنبوب.‎ LVL-RecAP16 5 LVL-RecAPS ‏عند‎ LVL-RecAP16 5 LVL-RecAPS ‏يعرض كفاف المفصل في الركب والمرافق شذوذ في‎ .) ‏و053, على الترتيب (الشكل‎ 4 ‏لتقييم درجة تطور لين العظام, أجرينا تحليل القياس النسيجي لأقسام غير مصنفة بلاستيكية مضمنة‎ ‏و1أ). تم‎ TA ‏(الأشكال‎ WT ‏وبمادة مقارنة‎ LVL-ReCAP ‏من الأطراف الخلفية لفئران المعالجة ب‎ Yo ‏في المصل‎ PPI ‏وتحليل أيضاً مستويات‎ (2A ‏قياس أحجام العظم والعظمانيات (الأشكال هب,‎ von ‏كشف تبقيع‎ (Yadav et al., 2011) ‏(الأشكال *ب, *ج). تمشياً مع النتائج السابقة‎ ‏امل/-/- تعرض عيوب حادة في التمعدن, العظم القشري الرقيق, انخفاض‎ hi ‏عن أن‎ +8 ‏حين أظهرت كل من الحيوانات المعالجة ب‎ A, (IA ‏العظم التربيقي وضعف مراكز التعظم (الشكل‎ ‏تحسن العظم القشري بدرجة كبيرة وتحسن مراكز التعظم‎ LVL-RecAP16 5 LVL-RecAPS Yo
4ل الثانوية. كشف قياس الشكل النسيجي (الأشكال هب, 4ج) عن أن نسبة /81//11 (الشكل هب), في كل من المجموعات النموذجية ‎LVL-RecAP16 5 LVL-RecAPS‏ لا تزال منخفضة بدرجة كبيرة في فئران ‎WT‏ المعالجة ‎sale‏ مقارنة المطابقة في العمر ‎LTT YY)‏ لا 9), في حين النسبة المئوية ل /01//81 (الشكل 8/ج) كانت أعلى بدرجة كبيرة لكل من مجموعات العلاج © النموذجية مقارنة بفئران ‎WT‏ المعالجة بمادة مقارنة ‎<١! Veg een)‏ 9). لم تكن الاختلافات بين مجموعات العلاج النموذجية ‎LVL-ReCAP16 5 LVL-ReCAPS‏ كبيرة إحصائياً. أكد التبقيع النسيجي ثلاثي اللون (الشكل ؟أ) في الأقسام البلاستيكية للأطراف الخلفية هذه النتائج. انخفضت ‎AES‏ تمعدن العظام لدى فتران ام0/-/- على نحو حاد (مناطق مبقعة أخضر), مع عيوب في العظم القشري والتربيقي المحدد بواسطة تراكم العظمانيات (مناطق مبقعة أحمر). على النقيض, ‎٠‏ كان لدى ‎WT hy‏ المعالجة بمادة مقارنة بعمر ‎OF‏ يوم عظام قشري أقوى, العظم التربيقي الموجود في التعظمات الثانوية والقليل من العظمانيات عند سطح العظم. تعرض كثران امل -/- في مجموعات نموذجية ‎LVL-ReCAP16 5 LVL-ReCAPS‏ تحسن كبير في العظم القشري, خاصة في مجموعة ‎LVL-RECAP16‏ حيث لم تتم ملاحظة اختلافات رئيسية مقارنة بالفئران 1//ا. في حين تحسن تكوين العظم التربيقي في مراكز التعظم الثانوية في فثران ام81/-/- بواسطة العلاج, لا ‎٠‏ تزال فتران ‎LVL-RecAP8‏ و84808016-/1 تحتفظ بأكبر من المناطق الطبيعية من العظمانيات ‎(eal)‏ ‏تمشياً مع نتائج الهيكل العظمي, اكتشفنا تصحيح لتركيزات ‎PPI‏ في المصل في جميع مجموعات العلاج النموذجية. تؤوي حيوانات ‎LVL-ReCAP]‏ (الشكل 4ب) بدرجة كبيرة مستويات ‎PPI‏ ‏منخفضة عند المقارنة بالحيوانات المعالجة بمادة ناقلة-المعالجة بمادة مقارنة. تشتمل الحيوانات ‎dalled) ٠‏ ب ‎LVL-RecAP16‏ على مستويات ‎PPI‏ يصعب التمييز بينها إحصائيا عن تلك لفئران 1/ا الصغيرة من نفس الولدة. شذوذ غياب القحفية الوجهية في فئران اما /-/- المعالجة ب ‎LVL-RecAP‏ ‏تمتل فئران ‎—/~Alpl‏ شذوذ الشكل القحفي الوجهي ودمج الغرزة الإكليلية )2014 ‎(Liu et al.,‏ لتحديد مدى تأثر الهيكل العظمي القحفي الوجهي بالعلاج في فئران اما8/-/-, أجرينا تحليلات ‎Yo‏ أساسها ‎PCT‏ على العظام الأمامية والعظم الجداري القحفي. تعرض النتائج عند 021 أن كل من
‎A «=‏ _ العظام الأمامية والعظم الجداري القحفي في فثران ام81-/- المعالجة بمادة ناقلة انخفضت بدرجة كبيرة في حجم كسر العظام, المحتوى المعدني في العظم, كثافة المعادن, المحتوى المعدني في النسيج وكثافة المعادن في النسيج عند المقارنة ب ‎WT‏ أو فثران ام8-/- المعالجة (الجدول 10( على التقيض, لم تختلف العظام الأمامية ولا القحفية في فثران ام81-/- المعالجة بدرجة كبيرة عن تلك © في فثران النوع الرئيسي. لا يظهر اختلاف في جماجم الكبار في فثران معالجة ب ‎LVL-RECAP16-‏ ‏امل-/- عن ‎WT‏ في ضوء الحجم والشكل (الشكل ‎.)٠١‏ ‏الجدول ‎Vo‏ تحليلات ‎PCT‏ للعظام القحفية. تم تحليل العظام الأمامية والقحفية في ‎WT‏ فئران ‎—/-Alpl‏ (مادة ناقلة), وفثران ‎—/=Alpl‏ المعالجة ب 8868016 عند 021. تم تسجيل القيم في صورة المتوسطات + ‎SD‏ ‏جزء حجم ا لمحتو ى كثافة ا لمحتو ى كثافة العظام المعدني في | المعادن المعدني في | المعادن في العظم (مجم) | (مجم/سم) | النسيج (مجم) | النسيج (مجم/سم 7) ‎EN FE EY ET) Te‏ الا #* ‎YA * eee) ® YY * vee)‏ * ‎av | + veo | + Yo | + Le YA + AAT LVL-‏ > ‎Ye RecAP16‏ 0 ا عم 1« ‎ov ve‏ ‎1١٠0 | + 9 | + A WT‏ + | 01ل + | .لا > ‎of ve UN Ya ٠. «A 7‏
+ ‏99ه‎ | + vero | £9¢ | + YA ‏ا ل عع‎ Alpl-/- * VY Foo ee) * ١ *# ea) #00 > 1951 | + veo | + TA | + Le YA + AAT LVL-
Wy eve Vie vey ‏يب‎ RecAP16 + YY | + velY | 1:5 | + A ON I ST (a WT ‏اه‎ ve AY VY La AY ١ ٠ ‏جزء حجم ا لمحتو ى كثافة ا لمحتو ى كثافة‎ ‏العظام المعدني في | المعادن المعدني في | المعادن في‎ ‏العظم (مجم) | (مجم/سم") | النسيج (مجم) | النسيج‎ )7 ‏(مجم/سم‎ ‏له اا ان أن ا ا‎ 595 ‏0.41ا+ 0.008ا+ 464|+ 0.004ا+‎ + Alpl-/- 28 * 0.001 * 27 * 0.001 *| 0.06 * 697 +£|0.015 +615 +£|0.018 =£|0.72 + LVL- 57 0.006 84 0.005 0.15| RecAP16 709 +£]0.016 £615 +£|0.019 £|0.70 = WT 56 0.008 79 0.008 0.12
I I ‏من اا‎ 597 +]0.005 +[494 +£|0.018 +£|0.52 + Alpl-/- 12 * 0.001 * 21 * 0.001 *| 0.05 *
‎A \ —‏ — ‎LVL-‏ + 0.72ا+ 0.018[ 608+ 0.015|£+ 691 6ه | 0.08 0.007 74 0.006 61 ‎WT‏ = 0.76( 0.020( £645 0.017(£ 726 0.10 0.007 73 0.007 51 * تشير إلى الأهمية الإحصائية بين الأنماط الوراثية وبين مجموعات العلاج النموذجية. ينقذ ‎Wi LVL-RecAP ~3e‏ العيوب السنخية السنية ‎dentoalveolar defects‏ ‎—/-Alpl 2 Ablation‏ ينتج عن اجتثاث ‎Alpl‏ في الفتران عيوب التمعدن المتطورة في العظام الملاطية؛ العاجي؛ السنخية, © رالمينا ‎Foster et al., 20148: Foster et al., 20145: McKee et al. 2011; Yadav)‏ ‎(et al, 2012‏ بما يتماشى مع تقارير الحالة في خاضعين من البشر مصابين ب ‎HPP‏ يتتج عن غياب الطبقة الملاطية اللا خلوية فقد التوصيل اللثوي بسطح جذر السن وتقشير الأسنان السابق لأوانه, كسمة مميزة ل ‎HPP‏ تمت مقارنة فئران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎WT; LVL-RecAP8‏ معالجة ‎sale‏ ناقلة مقارنة عند ‎Laie ,p25-26‏ يقترب تكوين السن الطاحن من الاكتمال. كشف ‎٠‏ التصوير الإشعاعي وتصوير ‎MCT‏ مقارنة بالمقارنات (الأشكال ١١أ,‏ د), يصور الفك السفلي لفئران امل-/- غير المعالجة عظم مفرط في المعدن, الأضراس الطاحنة القصيرة مع عاج رقيق وحجرات اللب الواسعة؛ والقواطع العلوية المعيبة بشدة (الشكل ١١ب,‏ و). بواسطة تحليل النسيج, ‎ia‏ أسنان الفأر امل /-/- عدم تواجد طبقة ملاطية لا خلوية, وغزو عظمانيات العظم السنخي لحيز الرباط ‎(PDL) aL)‏ مما يؤدي إلى تلاحم العظام وفقد دواعم السن الوظيفية (الشكل ١١ز‏ مقابل ١١ه).‏ ‎V0‏ يحسن إعطاء ‎A‏ مجم/كجم/يوم ‎LVL-ReCAP‏ من المظهر الإشعاعي لارتفاع الضرس الطاحن, سمك العاج, وتمعدن العظم عند 026, على الرغم من استمرار عيب السن القاطعة (الشكل ١١ج,‏ ‎٠ (a‏ نسيجياً, على الرغم من أن هذه الجرعة من ‎LVL-ReCAP‏ لم تستعيد طبقة ملاطية لا خلوية إلى سطح الجذور, تم الحفاظ على الحيز ‎PDL‏ المرتبط بالضرس الطاحن وحدود العظم السنخي على نحو أفضل (الشكل ١١ط).‏ ‎TY‏
الم تمت مقارنة مجموعة ‎LVL-ReCAP16‏ ب ‎WT‏ عند 050-53 لتحديد التأثيرات على بنية الأسنان الناضجة والوظيفة. خفض التصوير الإشعاعي وتصوير ‎POT‏ المبين تمعدن العظم السنخي والمتلاصق حول السن الطاحن في الفك السفلي لفأر ا0ل-/-, مقارنة بالمقارنات (الشكل ١١ي-‏ م). يظهر تكوين السن الطاحن والعاج في حالته الطبيعية إلى حد كبير في فئران ‎LVL-ReCAP16‏ ‏0 وتأكد ذلك بواسطة تحليل ‎PCT‏ للضرس الطاحن الأول (الجدول ‎L(V‏ المينا في المجموعة ‎LVL=‏ ‏6 لم تكن مختلفة عن ‎WT‏ في ‎BV/TV‏ أو ‎TMD‏ أظهرت التيجان الطاحنة والجذور انخفاض معتدل ولكنه هام من 9610-4 في /81//11 و ‎TMD‏ مقارنة ب ‎lee WT‏ يشير إلى تمعدن العاج في الذي لم يتم إنقاذه على نحو كامل, وانخفاض سمك الجذور بنسبة 9615. ظل تمعدن العظم السنخي ‎came‏ بشدة في المجموعة 4608016-ا/1ا, مع انخفاض /81//11 بنسبة 9671 ‎٠‏ وانخفاض ‎TMD‏ بنسبة 9617, مقارنة ب 1//ا. ظلت الأسنان القاطعة في فئران امل/-/- المعالجة أيضاً متأثرة بشدة (الشكل ١١ك,‏ م). بواسطة تحليل النسيج, تمثل ‎mie LVL-RECAPL6 oh‏ من العظم السنخي المتمعدن والعظمانيات, وحيز ‎PDL‏ منخفض ولكن متواجد (الشكل ١١ن,‏ ع). لم نلاحظ فقد في الأسنان في ‎LVL-ReCAPL6 de seal)‏ بواسطة 053, على الرغم من بقاء التوصيل اللثوي عاجزاً, كما يتضح ‎Vo‏ بواسطة الافتقار إلى الطبقة الملاطية, عدم تنظيم ‎PDL‏ والانفصال عن سطح الجذور, ونمو الظهارة الموصلية لأسفل. ومع ذلك؛ تمت ملاحظة مناطق صغيرة من توصيل ‎PDL‏ بالسن بالاقتران مع ألياف ‎PDL‏ منظمة (الشكل ١١س,‏ ف), مما يشير إلى وجود بعض التوصيل الخطر الذي قد يعمل على احتجاز الأضراس الطاحنة . الجدول ‎VT‏ تحليلات ‎PCT‏ للأنسجة السنخية السنية. تمت مقارنة أضراس الفك السفلي الأولى ‎٠‏ والعظم السنخي المرتبط بها عند 050-53 في ‎=n) WT‏ 6( وفتران ‎—/-Alpl‏ المعالجة ب ‎=RecAP16 (n‏ ؛). تم تسجيل القيم في صورة المتوسطات + 50. ‎BV/TV| (Ya) BV| (Yao) TV‏ )%( | 1100 (جم | السمك ‎(TaHA‏ .| (ميكرو مولار)
+973, | + ٠1,15 | + AAVY | ‏ل‎ OYE | + ‏ا‎ WT v0 +, v0 +, ov oe, oe, oF +7, | + VIA + AAAY | + oY | + A LVL- v,0 o,f 7 YY GI | aay RecAP16
ND ND | + 11,302 | + 1 | + 11 WT ٠ J 4 ve Ay La 4
ND ND | + ATAY | + ARE: «ov LVL- * 4 aay oY RecAP16
Yeo, 8 | + Yo | + AONE | + vol | + «lo WT
A, ¢ > La ١ Ve +, 20 vr, 20 ١١١,25 | + ٠,7 | £ YY,YVY | + LEE | + v,0 LVP- ‏لاا‎ + oa) *Y.YY Fang ‏لم‎ RecAP16 * 1 ” ‏ض | ض‎
ND | + ٠,١ | + ‏آلابمأة‎ | + Ya ‏عدا‎ ee WT oe, Oo, «A +, 20 v0
ND | + SAAN ‏,ا‎ | + io | + A LVL- aay * ¢,¥o GI | * 4 a0 RecAP16
_ A ‏اج‎ * م >00 ‎v,‏ بواسطة اختبار ‎t‏ للعينات المستقلة ‎ND‏ = غير محدد ‏مراجع المثال ‎A‏ ‎Anderson H.C., Sipe J.B., Hessle L., Dhanyamraju R., Atti E., Camacho ‎N.P., Millan J.L. Impaired calcification around matrix vesicles of growth © ‎plate and bone in alkaline phosphatase—deficient mice. Am. J. Pathol. ‎2004;164(3):841-8417. ‎Bouxsein ML, Boyd SK, Christiansen BA, Guldberg RE, Jepsen KJ and ‎Miller R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro—computed tomography. J Bone Miner Res 2010;25(7):1468-86. ٠ ‎Fedde KN, Blair L, Silverstein, J, Coburn SP, Ryan LM, Weinstein RS, ‎Waymire K, Narisawa S, Millan, JL, MacGregor GR, Whyte MP, Alkaline ‎phosphatase knockout mice recapitulate the metabolic and skeletal defects ‎of infantile hypophosphatasia. J Bone Miner Res 1999; 14: 2015-2026.
Foster BL, Nagatomo KJ, Nociti FH, Fong H, Dunn ‏,نا‎ Tran AB, Wang W, ١٠٠ ‎Narisawa S, Millan JL, Somerman MJ 2012 Central role of pyrophosphate ‎in acellular cementum formation. PLoS One 7(6):e38393. ‎Foster B.L., Nagatomo K.J., Tso H.W., Tran A.B., Nociti F.H., Jr., ‎Narisawa S., Yadav M.C., McKee M.D., Millan J.l., Somerman M.J. Tooth root dentin mineralization defects in a mouse model of hypophosphatasia. Y. ‎J Bone Miner Res. 2013;28(2):271-82. ‎Foster BL, Nociti FH, Jr., Somerman MJ (2014a). The rachitic tooth. Endocr ‎Rev 35(1):1-34. ‎Try
- h —_
Foster BL, Ramnitz MS, Gafni RI, Burke AB, Boyce AM, Lee JS et al. (2014b). Rare Bone Diseases and Their Dental, Oral, and Craniofacial
Manifestations. J Dent Res 93(7 suppl): 75-198.
Hessle L., Johnson K.A., Anderson H.C., Narisawa S., Sali A., Goding
J.W., Terkeltaub ‏ب‎ Millan J.L. Tissue—nonspecific alkaline phosphatase © and plasma cell membrane glycoprotein—1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002;99(14):9445-9449.
Huesa C., Yadav M.C., Finnila M.A., Goodyear S.R., Robins S.P., Tanner
K.E., Aspden R.M., Millan J.L., Farquharson C. PHOSPHO] is essential ٠ for mechanically competent mineralization and the avoidance of spontaneous fractures. Bone. 2011;48(5):1066-1074.
Liu J, Nam HK, Campbell C, Gasque KC, Millan JL, Hatch NE. Tissue— nonspecific alkaline phosphatase deficiency causes abnormal craniofacial bone development in the Alpl(-/-) mouse model of infantile ٠ hypophosphatasia. Bone 2014;67:81-94.
McKee M.D., Nakano Y., Masica D.L., Gray J.J., Lemire ٠٠١, Heft R., Whyte
M.P., Crine P., Millan J.L. Enzyme replacement therapy prevents dental defects in a model of hypophosphatasia. J. Dent. Res. 2011;90(4):470- 476.0 ٠
Meganck JA, Kozloff KM, Thornton MM, Broski SM and Goldstein SA. Beam hardening artifacts in micro—computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD. Bone 2009;45(6):1104-1116.
Try
_ A 7 _
Millan JL, Narisawa 5, Lemire |, Loisel TP, Boileau G, Leonard P,
Gramatikova S, Terkeltaub R, Pleshko Camacho N, McKee MD, Crine P and Whyte MP, Enzyme replacement therapy for murine hypophosphatasia.
J Bone Miner Res 2008; 23: 777-787.
Narisawa S, Wennberg C. Millan JL, Abnormal vitamin B6 metabolism ١ © alkaline phosphatase knock-out mice causes multiple abnormalities, but not the impaired bone mineralization. J Pathol 2001; 193: 125-133.
Narisawa S, Frohlander N, Millan JL, Inactivation of two mouse alkaline phosphatase genes and establishment of a model of infantile hypophosphatasia. Dev Dyn 1997; 208: 432-446. 0 ٠
Umoh JU, Sampaio AV, Welch |, Pitelka V, Goldberg HA, Underhill TM et al. In vivo micro-CT analysis of bone remodeling in a rat calvarial defect model. Phys Med Biol 2009;54(7):2147-61.
Yadav M.C., Lemire |., Leonard P., Boileau G., Blond L., Beliveau M., Cory
E., Sah R.L., Whyte M.P., Crine P., Millan J.L. Dose response of bone- ١٠١ targeted enzyme replacement for murine hypophosphatasia. Bone. 2011 ;49(2) 1250-256.
Yadav M.C., de Oliveira R.C., Foster B.L., Fong H., Cory E., Narisawa S.,
Sah R.L., Somerman M., Whyte M.P., Millan J.L. Enzyme replacement prevents enamel defects in hypophosphatasia mice. J. Bone Miner. Res. Y. 201 2;27(8) 11722-1734.
Yadav, M. C., Huesa, C., Narisawa, S., Hoylaerts, M. F., Moreau, A.,
Farquharson, C. and Millan, J. L. Ablation of osteopontin improves the
م ‎A‏ _ ‎skeletal phenotype of Phosphol-/- mice.
J.
Bone Miner.
Res.
In Press‏ .)2014( ‎q Jud‏ إنزيم فوسفاتاز قلوي يقي ضد الالتهاب الكلوي ‎oo‏ الطرق : مستتبت ‎Cell Cultured all‏ على نحو روتيني, تم استتبات ‎CIPTEC‏ في ‎Tv‏ م ( ‎(Wilmer, 7٠١٠١‏ تم نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام مولد ضد ‎T‏ فيروس ٠؛ ‎Simian‏ والوحدة الفرحية الحفزية الأساسية لإنزيم تيلوميراز ‎٠‏ بشري ‎human telomerase‏ والسماح لها بالتكاثر على نحو ثابت. تم استتبات الخلايا في ‎,DMEM/Ham’s F-12‏ فينول أحمر-حر ‎(Gibco, Paisly, United Kingdom)‏ مكمل ب ‎ITS‏ )© ميكرو جرام/مل إنسولين, © ميكرو جرام/مل ترانسفرين ‎transferrin‏ © نانو جرام / مل سلينيوم ‎١ ,(Sigma—Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands ;selenium‏ نانو جرام / مل هيدروكورتيزون ‎٠١ (Sigma-Aldrich) hydrocortisone‏ نانو جرام / مل عامل نمو ‎٠‏ بشروي ‎5٠ (Sigma-Aldrich) epidermal growth factor‏ بيكو ‎faba‏ مل لتر تراي-يود ثيرونين ‎tri-iodothyronine‏ و١1‏ مصلل ‎(pin‏ بقري ( ,856-0068 ‎Greiner‏ ‎(Kremsmiinster, 15-98‏ قبل التجربة, تم غرس الخلايا في طبق به عيون ‎EAE)‏ ‏خلايا/سم7), وحضانته لمدة يوم واحد في ‎La PY‏ ذلك مدة إنضاج 7 أيام في ‎TY‏ .م. في يوم التجربة, تمت حضانة الخلايا لمدة ساعتين ب ‎٠ Jon ( LVL-RecAP‏ وحدة/مل, طعم من ‎,(Kiffer—Moreira, 2014) (AM-Pharma, Bunnik, The Nether-lands ٠‏ يلي ذلك الحضانة ‎YE sad‏ ساعة ب ‎٠١‏ ميكرو جرام/مل ‎(E. coli 0127:B8; Sigma-Aldrich) LPS‏ مذاب في ‎٠١‏ ملي مولار ‎HEPES HBSS‏ \ الرقم الهيدروجيني ‎HEPES: Roche ) ١,4‏ ‎.(Diagnostics, Mannheim, Germany; HBSS: Gibco‏ على نحو بديل, تم إعطاء ‎٠١‏ ‏وحدة/مل ‎١١-( LVL-RecAP‏ ميكرو جرام/مل) إلى ‎WIA‏ تمت حضانتها في ‎LPS‏ بالتزامن أو بد
-04- بعد ساعتين. تمت حضانة الخلايا المقارنة بوسط المستنبت فقط. تم استخدام ‎E. coli ( DLPS‏ ‎٠١ ,055:B5; Sigma-Aldrich‏ ميكرو جرام/مل) ‎LVL-RecAP;‏ غير النشط ‎VY)‏ ميكرو ‏جرام/مل, طعم جيد من ‎(AM-Pharma‏ في صورة مقارنات سالبة. في مختلف مجموعات التجارب, ‏تم استبدال ‎LPS‏ ببروتين ناتج عودة الاتحاد الجيني ‎TNF-a‏ بشري ) ‎Ebioscience, Vienna,‏ ‎(Austria ©‏ أو محلول طافي ‎PBMCs‏ محاكى مسبقاً لمدة 7 ساعة ب أو دون ‎١( LPS‏ نانو ‏جرام / مل). تم إجراء جميع التجارب ‎=N)‏ ©( من نسختين. ‏عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ‏تم ‎PBMCs Jie‏ من الغلافات الزغبة التي تم الحصول عليها من متبرعين أصحاء بالدم ‎blood)‏ ‎GE) Ficoll-Pague Plus ‏بواسطة الطرد المركزي التفاضلي فوق‎ )# =n bank Nijmegen
RPMI-1640 ‏في وسط‎ PBMCs ‏تعليق‎ sale ‏تمت‎ .(Healthcare, Diegem, Belgium | ٠ ‎(Gibco)‏ غني ب 0+ مجم/ مل لتر جنتاميسين ‎١ (Sigma-Aldrich) gentamicin‏ ملي ‏مولار بيروفات ‎(Gibco) pyruvate‏ و ‎Y‏ ملي مولار جلوتاماكس ‎(Gibco) glutamax‏ غرس ‏الخلايا في أطباق بها 76 عيناً عند كثافة تبلغ 4,0 ‎٠١ x‏ 7 الخلايا/عين, قبل الحضانة ب أو دون ‎Ve ‏نانو جرام / مل) لمدة‎ ١( ‏الحضانة‎ LPS ‏يلي ذلك‎ delay ‏وحدات/ مل لتر) لمدة‎ ٠١( AP ‏ساعة. تم إجراء جميع التجارب من نسختين.‎ Yo ‏قياس ‎ATP‏ وتجربة حيوية الخلية ‏تم تجميع محلول طافي بعد ‎Vo‏ دقيقة من إعطاء ‎LPS‏ مع أو دون العلاج المسبق ب ‎LVL=‏ ‏00ع4, يلي ذلك قياس مباشر لإنتاج ‎ATP‏ باستخدام طقم تجربة التألق الحيوي ‎ATP CLS ١١‏ ‎(Roche Diagnostics)‏ طبقاً لبروتوكول جهة التصنيع. تم تقييم حيوية الخلية بعد ‎YE‏ ساعة من ‎٠‏ حضانة ‎LPS‏ بواسطة إجراء تجربة ‎(MTT‏ بإيجاز, الوسط تم استبداله ب ‎٠٠١‏ ميكرو لتر محلول ‎MTT‏ مسبق التدفئة ‎;Sigma-Aldrich)‏ 2 مجم/ مل لتر في وسط المستنبت), والحضانة لمدة ‏¥ ساعات في ‎a FY‏ يلي ذلك إضافة ‎Yoo‏ ميكرو لتر ‎DMSO‏ لإذابة بلورات فورمازان ‎formazan crystals‏ المترسبة داخل الخلايا. تم قياس تلاشي الصبغة عند ‎5١76‏ نانو مولار ‏باستخدام تصحيح طول موجي ‎١7١‏ نانو مولار. ‏فضت
النموذج الحيواني تم إجراء التجارب على الحيوان طبقاً ل ‎National Institutes of Health guidelines‏ وتم اعتماد البروتوكلات بواسطة مجلس المراجعة المؤسسية للتجارب على الحيوان. تم تقسيم جرذان -18908م50 ‎Dawley‏ ذكور خالية من مسبب مرض محدد ‎(RjHan:SD; Janvier, France)‏ إلى ثلاث © مجموعات: العلاج الوهمي ‎=n) LPS ,)1 =n)‏ 1) أو ‎.)١ =n) LPS+LVL-RecAP‏ تم تجميع عينة بلازما القيمة القاعدية (ليثيوم-هيبارين ‎lithium—heparin‏ الدم) قبل 7 أيام من التجربة من خلال قطع في وريد الذيل باستخدام ‎Sarstedt, Etten—Leur, the ) Multivette‏ ‎.(Netherlands‏ ¥ أيام قبل التجربة, تم تقييم القيمة القاعدية لوظيفة الكلى في صورة ‎“FITC‏ ‏سينسترين ‎.(Schock-Kusch, 2011) t1/2‏ عند ‎٠ =t‏ ساعة, تم إعطاء العلاج الوهمي )+ % ‎NaCl ٠‏ محلول ‎(ak‏ أو ¥,+ مجم/كجم ‎E.coli 0127:88( BW LPS‏ مذاب في محلول ملحي) في صورة بلعة في الوريد لتحفيز الفشل الكلوي المحفز ب ‎LPS‏ عند ‎V0 =t‏ ساعة تم الحصول على البلازما وفقاً للموصوف سابقاً. عند ‎=t‏ ساعتين, تلقى الجرذ بلعة في الوريد من العلاج الوهمي أو ‎٠٠٠١( LVL-RecAP‏ وحدة/كجم ‎BW‏ مخففة في محلول ملحي) يلي ذلك قياس ثاني لوظيفة الكلى. عند ‎=t‏ © ساعة, تلقت جميع الحيوانات © مل لتر محلول ملحي (5.6.) للوقاية من ‎Ye‏ الجفاف, يلي ذلك ‎VT‏ ساعة ‎sae‏ تجميع البول. عند + ‎7٠,5‏ ساعة تم إجراء ثالث قياس عبر الأدمة. عند ‎YE =t‏ ساعة, تم تخدير الجرذان (0.أ., ؟مجم/كجم ‎BW‏ زيلازين ‎xylazine‏ و80 مجم/كجم ‎BW‏ كيتامين ‎,)76٠١‏ تم سحب عينة دم خلف المقلة ليثيوم -هيبارين ‎lithium—heparin‏ ‏للحصول على البلازما, ‎agg‏ كامل التسريب إلى الجسم ‎GET)‏ , محلول ملحي + © وحدة دولية/مل هيبارين ‎٠١ heparin‏ مل بار ؟دقيقة, 964 بارافورمالديهيد ‎;PFA) paraformaldehyde‏ ‎7٠١ ٠‏ مل بار). بعد تسريب محلول ملحي, تمت إزالة ‎KI‏ اليمنى بحرص, وتجفيفها فجأة وحفظها عند ‎Av‏ 2 حتى المعالجة. الكُلية اليسرى, إزالتها بعد تسريب ‎PFA‏ وتم حفظها في 964 ‎PFA‏ ‏عند ؛ْ م حتى المعالجة لتحليل النسيج وكيمياء النسجي المناعي. تم استبعاد حيوان واحد من المجموعة ‎LPS+LVL-RecAP‏ وعينة بول واحدة من مجموعة العلاج الوهمي بسبب الحقن وصعوبات التجميع, على الترتيب. ‎Yo‏ قياسات وظيفة الكلى ‎TY‏ gy ‏تم تقييم وظيفة الكلى في جرذان مستيقظة تتحرك بحرية من خلال حركيات الإزالة المقاسة عبر الجلد‎ ‏مرقم متوفر تجارياً من‎ (Fresenius Kabi, Linz, Austria) 5015010 ‏7-سينسترين‎ ١10 J
Schock-Kusch 2011, ) ‏بواسطة استخدام جهاز القياس الجديد وفقاً للمنشور سابقاً‎ GFR ‏بإيجاز, تم تخدير الجرذان بواسطة استنشاق أيزوفلوران (965 حث,‎ .(Schock-Kusch 2009 ‏ثم تثبيت الجزء‎ ٠ ‏وحلق شعر الظهر‎ (Abbott Laboratories, Illinois, USA ‏متابعة:‎ %Y-Y,0 © ‏المرئي من الجهاز على المنطقة منزوعة الشعر باستخدام لصقة مزدوجة الجانب مصممة خصيصاً‎ ‏في حين تم دمج الجزء الإلكتروني من الجهاز‎ ,(Lohmann GmbH, Neuwied, Germany) ‏بعد تحديد إشارة خط الأساس,‎ . (Lomir Biomedical, Malone, USA) ‏في دثار الحيوان القارض‎ ‏مخفف في محلول ملحي منظم)‎ BW ‏جم‎ ٠٠١ ‏مجم لكل‎ 0) sinistrin ‏+-سينسترين‎ ١120 ‏تم حقن‎ ٠١١ ‏في وريد الذيل. بعد ذلك, تم ترك الحيوانات تفيق من التخدير بينما استمر القياس لمدة تقريباً‎ ٠ ‏دقيقة بعد الحقن. تم حساب 11/2 بواسطة نموذج مكون واحد مسلط على حركيات الإزالة المقاسة‎ ‏إضافة لذلك, تحدد متغيرات‎ (Schock-Kusch, 2009) sinistrin ‏ا-سينسترين‎ ١16 ‏عبر الجلد‎
Boehringer) SY Hitachi 704 ‏وظيفة الكلى في عينات البلازما والبول باستخدام جهاز التحليل‎ ‏تم حساب إفراز اليوريا الجزيئية والخلو باطني المنشا‎ (Mannheim, Mannheim, Germany
Ye ‏وا-‎ ١,8 =t ‏باستخدام متوسط قيم البلازما‎ creatinine ‏.من الكرياتينين‎ ٠
Histology and immunohistochemistry ‏تحليل النسيج وكيمياء التسجي المناعي‎
Salas ‏ساعة, تمت معالجة النسيج, وتضمينه في بارابلاست وتقسيمه‎ YE ‏بعد التثبيت لمدة على الأقل‎ ‏على نسيج الكلى. تم تقييم إصابة‎ HE ‏؟ ميكرو مولار. لتحليل النسيج الروتيني, تم إجراء تبقيع‎ ‏لا تغيير: ؛ - تلف حاد على سبيل المثال‎ = ١( ‏إلى ؛‎ ٠ ‏الكلى باستخدام نظام درجات بمقياس من‎ ‏بواسطة جسم مضاد أولي من الماعز مضاد‎ KIM=1 ‏تفيرات في خلية الأنيبيب الملحوظة). تم رصد‎ ٠ ‏وجسم مضاد ثانوي‎ (AF3689, R&D Systems, Abingdon, UK : ٠ :١( ‏للجرذان 1-//4ا‎ ‏تمت‎ .)00449, DAKO, Heverlee, Belgium :٠٠١0 :1) IgG ‏من الأرانب مضاد للماعز‎
Vector ) VECTASTAIN Eline ABC ‏مشاهدة التبقيع المناعي باستخدام المواد المتفاعلة لنظام‎
Diaminobenzidine ‏أمينو بنزيدين‎ shay Ys (Labs, Amsterdam, Netherlands
TY
‎q \ —_‏ _ ‎(DAB, Sigma-Aldrich)‏ يلي ذلك تبقيع مضاد توكسيلين الدم ‎.haematoxyline‏ تم ‎shal‏ ‏جميع تسجيل النقاط بطريقة مجهولة. السيتوكينات ‎Cytokines‏ ومرقمات إصابة الكلى 0 تم استخدام أطقم ‎IL-8 5 IL-6 ,TNF—0 yaa (R&D Systems) Human ELISA‏ في ‏محلول طافي طبقاً لتعليمات جهة التصنيع. تحددت مستويات السيتوكين في البلازما ()1-ا, اا 6 -ا, ‎(INF-y TNF-a‏ بواسطة تجربة ‎Luminex‏ طبقاً لتعليمات جهة التصنيع ‎.(Millipore, Cork, Ireland)‏ تحدد ‎NGAL 5 KIM=1‏ براسطة ‎(R&D Systems) ELISA‏ طبقاً لتعليمات جهة التصنيع. ‎Tissue homogenization ‏تجانس النسيج‎ ٠
Qiagen, Venlo, The ( TissuelLyser LT ‏تم تجانس الكلى المجففة فجأة بواسطة‎
T=) ‏طبقاً لتعليمات جهة التصنيع, في المادة المتفاعلة لاستخلاص بروتين النسيج‎ (Netherlands ‏المكملة بأقراص مزيج مثبط إنزيم بروتيز‎ (PER; Thermo Scientific, Rockford, USA ‏تحدد‎ .(Roche Applied Science, Almere, The Netherlands) JK EDTA ‏الخالي من‎ ‎bicinchonicic acid ‏إجمالي محتوى البروتين باستخدام طقم تجربة بروتين حمض بأي سينكونينيك‎ Vo ‏م حتى إجراء التجربة.‎ Ae— ‏والعينات تم حفظها عند‎ (Thermo Scientific) ٍ ‏في الوقت 1 قرة‎ PCR - Wi 8 - ,٠٠٠١( ‏أو مسحوق الكلى‎ frozen cell pellet ‏من كرية خلية مجمدة‎ RNA ‏تم استخلاص حمض‎
Mikro—dismembrator U, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne Cedex, ‏ثانية:‎ ٠ ‎(France ٠‏ بواسطة المادة المتفاعلة ‎Trizol‏ تم انتساخ حمض ‎RNA‏ عكسياً في ‎cDNA‏ باستخدام فيروس لوكيميا الفثران مولوني ‎(M=MLV) Moloney Murine Leukemia Virus‏ إنزيم ترانسكريبتاز عكسي ‎.(Invitrogen, Breda, The Netherlands) Reverse Transcriptase‏ تم إجراء ‎PCR‏ في الوقت الحقيقي كمي ‎(RQ-PCR)‏ باستخدام ‎Applied ) Tagman®‏ ‏بد
سمو ‎٠ (Biosystems, Carlsbad, USA‏ ثم تكبير الجينات ومعادلتها للتعبير عن ‎GAPDH‏ ‎Ct)‏ ناا ظاه: تلغاجلبت: النسيج الكلوي ‎«,Y+Y¢ A :Ct :renal tissue‏ . بدأ تفاعل ‎PCR‏ ‏ب ‎Y‏ دقيقة خطوة حضانة عند + © .م يلي ذلك تغيير في الطبيعة أولي لمدة ‎٠١‏ دقائق عند 56 ‎a‏ ‏و56 دورة ‎١5‏ ث عند 90 .م و١‏ دقيقة عند ‎Te‏ -م. تم حساب الاختلافات بين مجموعات بواسطة © الطريقة المقارنة ‎AACE‏ تم إيجاز مجموعات البرايمرات ‎Primers‏ / المسبار ‎probe‏ في الجدول ‎RY‏ ‏محتوى البورين في البول ‎Urinary purine‏ تحدد محتوى أدينوسين في البول ‎ATP ,ADP ,AMP , Urinary adenosine‏ و ‎cAMP‏ بواسطة ‎HPLC‏ بإيجاز, تم ‎LA‏ ؛ أحجام من البول مع ‎١‏ حجم كلوروأسيتالديهيد ‎chloroacetaldehyde ٠‏ )1 ضعف مخفف في ١مولار‏ محلول منظم أسيتات, الرقم الهيدروجيني ‎(Sigma-Aldrich 8‏ يلي ذلك الاشتقاق ) ‎٠‏ دقيقة, ‎٠‏ م, ‎©0٠0‏ دورة في الدقيقة) والطرد المركزي ‎T)‏ دقئق, درجة حرارة الغرفة, ‎١3408٠5‏ دورة في الدقيقة), وبعد ذلك تم نقل المحلول الطافي إلى قارورة ‎HPLC‏ وحقنه. تم فصل مركبات البورين ‎Purines‏ بواسطة نظام ‎Thermo ( HPLC‏ ‎(Scientific‏ باستخدام عمود ‎You) Polaris C18-A‏ 7 5,6 مم) مع التصفية التتابعية المتدرجة ‎Vo‏ باستخدام ناتج تصفية تتابعية أ )1+ مولار ‎٠١ K2HPO4‏ ملي مولار 18/115 ( الرقم الهيدروجيني 1,0( 5 ‎(MeOH %Y‏ وناتج تصفية تتابعية ب ‎ACN: THF)‏ :120 00 £9 )( كانت أزمنة الاحتجاز 1,لا (أدينوسين ‎(ADP) VY,o (AMP) A,¢ ,( adenosine‏ ترح ‎(ATP)‏ 5 1,0 دقيقة ‎SL (CAMP)‏ التحديد الكمي ‎sly‏ على مناطق الذروة للعينات والمعايير المرجعية المقاسة بالتألق الفلوري (استثارة: ‎YA‏ نانو مولار: انبعاث: ‎47٠0‏ نانو مولار). ‎Ye‏ التحليل الإحصائي تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط + ‎SEM‏ أو متوسط [النسبة المئوية الخامسة والعشرين, النسبة المثوية الخامسة والسبعين]. تم تقييم الحالة الطبيعية للبيانات بواسطة اختبار ‎Kolmogorov—‏ ‏50010017. تم تقدير الاختلافات الإحصائية بين المجموعات بواسطة ‎ANOVA‏ مع مقارنات لاحقة باستخدام اختبار المقارنة المتعدد ل ‎Bonferroni‏ أو بواسطة اختبار ‎Kruskal-Wallis‏ باستخدام فضت
— q ¢ —
اختبار ‎Dunn‏ تعتبر قيمة م مزدوجة الجانب أقل من 05 كبيرة إحصائياً. تم إجراء جميع الاختبارات باستخدام 5.00 ‎Graphpad Prism‏ ل ‎Graphpad Programs Inc. ) Windows‏ ‎.(San Diego, CA, USA‏ ‎LVL-RecAP‏ يوهن الاستجابة الالتهابية المحفزة ب ‎LPS‏ في المعمل
© القبل علاج المسبق ل ‎CIPTEC‏ البشري )2010 ‎(Wilmer,‏ بجرعة معتمدة على ‎LVL-RecAP‏ ‏يعمل على توهين إنتاج الستيوكين ‎cytokine‏ المحفز ب ‎TNF-a 1 LPS‏ 6-اا و8حاا على الجين ومستوى البروتين (الشكل ‎١‏ ١أحب)‏ . تم استخدام ‎LPS‏ مزال السُم ‎(ALPS)‏ في صورة مقارن سالب ولم يكن له تأثير. تم الحصول على النتائج الواقية المشابهة عند مستوى البروتين عند إعطاء ‎LVL-RecAP‏ بالتزامن مع ‎LPS‏ أو بعد ساعتين من التعرض إلى ‎LPS‏ (الشكل ‎١١‏ ج). تم إجراء
‎٠‏ تجربة مقارنة للتحقق ‏ من ما إذا كان ‎gi LVL-RecAP‏ فوسفوريل السيتوكينات 0000005 _المفرزة في الوسط, وهذا ليس الحال (الشكل ‎.)١١7‏ لتأكيد أن الانخفاض المحفز ب ‎LVL-RecAP‏ في إنتاج السيتوكين كان بسبب طبيعة نزع الفوسفوريل للإنزيم, تم بحث تأثير ‎LVL-RecAP‏ غير النشط الذي يفتقر إلى خواص التحلل بالماء. لم يوهن ‎LVL-RecAP‏ ‏غير النشط من الاستجابة الالتهابية المحفزة ب ‎LPS‏ في ]0101 (الشكل ‎(VY‏
‎LPS ‏خاصة بالكلى وغير مقيدة بالالتهاب المحفز ب‎ LVL-RecAP ‏تكون التأثيرات في المعمل ل‎ Ye ‏بسيتوكين‎ CIPTEC ‏تمت حضانة‎ LVL-RecAP ‏ل‎ KU ‏لبحث علاوة على ذلك الآلية الواقية‎ .(Chen, 2010) ‏بقري‎ IAP ‏يتعذر عليه نزع الفوسفوريل بواسطة‎ [TNF-a ‏مساعد على الالتهاب‎ ‏بواسطة العلاج المسبق ب‎ Lad ‏تم توهين إنتاج السيتوكين المحفز ب 18-8 ل 6-اا و8-اا‎ . 0 vo ‏أي تأثير (الشكل‎ Lal) ‏غير‎ LVL-RecAP ‏في حين لم يكن ل‎ LVL-RecAP
‎٠‏ 0 في مسببات الأمراض ل لكل المرتبط بالإنتان, يحفز ‎LPS‏ الاستجابة الالتهابية الموضعية من خلال الارتباط ب ‎TLR4‏ المعبر عنه على ‎=n :”,5+٠ ١,٠5 :ciPTEC Ct) PTEC‏ #). تتمثل العلامة المميزة الأخرى للمرض في الاستجابة الالتهابية الجهازية, التي تؤثر على كل من ‎WAY‏ الظهارية والبطانية الكلوية مما ينتج عنه ‎AKI) ghai‏ )2014 ,061815). لمحاكاة هذا الالتهاب الكلوي المحفز بالذيفان الداخلي, تمت حضانة ‎CIPTEC‏ بمحلول ‎Ala‏ من الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي
‏فضت
-ه4- المحاكاة ب ‎١ PBMCs) LPS‏ نانو جرام / مل ‎(LPS‏ وهذا يحفز إنتاج 6-اا و8-ا, والذي انخفض عند المعالجة المسبقة ‎GIPTEC J‏ ب ‎LVL-ReCAP‏ (الشكل ١٠١ب,‏ لم يتم رصد ‎TNF—‏ ‏©). إضافة إلى اكتشاف توهين الاستجابات الالتهابية التي يتوسط فيها ‎TNF-‏ بواسطة علاج ‎LVL-RecAP‏ هذا يقترح وجود وسيط آخر مستهدف بواسطة ‎LVL-ReCAP‏ على النقيض, © العلاج المسبق ل ‎PBMCs‏ ب ‎LVL-RecAP‏ لم يؤثر على الاستجابة الالتهابية المحفز ب ‎LPS‏ ‏في هذه الخلايا (الشكل ١١ج),‏ مما يشير إلى أن تأثيرات ‎LVL-RecAP‏ خاصة بالكلية. ‎LVL-RecAP‏ يمكنه توفير تأثيرات حماية الكلى في المعمل من خلال مسار ‎Osu dATP‏ ‎adenosine‏ ‏الهدف المحتمل الثاني ل ‎LVL-RecAP‏ هو ‎ATP‏ والذي يتم إطلاقه أثناء إجهاد الخلية الناتج عن ‎٠‏ على سبيل المثال الالتهاب ونقص الأكسجة )2012 ,1250019ا). يكون ل ‎ATP‏ خارج الخلايا تأثيرات خطيرة, بل يمكن تحويله بواسطة إنزيمات إكتونيوكليوتيداز (على سبيل المثال ‎(AP‏ ‎AMP ADP‏ وفي النهاية في أدينوسين ‎adenosine‏ ليبذل تأثير مضاد للالتهاب وواقي للنسيج من خلال الارتباط بواحد من مستقبلات أدينوسين ‎,A2A Al‏ 28م 5 ‎Bauerle, 2011, ( A3‏ ‎Sole, 2008‏ ألا). على نحو يثير الاندهاش, في حين لم يتأثر التعبير عن مستقبلات أدينوسين ‎Al ٠5‏ 828 و83 في ‎CiPTEC‏ بواسطة حضانة ‎LPS‏ (بيانات غير موضحة), تم تنظيم التعبير عن ‎A2A‏ بمجرد محاكاة ‎LPS‏ (زيادة مضاعفة: ‎:»,4+54,١‏ 0< 0.0 مقارنة بالعلاج الوهمي). تم توهين هذا التأثير بواسطة العلاج المشترك ‎LVL-RecAP‏ (زيادة مضاعفة: 1+7,9,»: 0< 0+ مقارنة ب العلاج الوهمي: 002 ,+ مقارنة ب ‎Les, (LPS‏ يقترح دور مسار أدينوسين في التأثير الواقي ل ‎.LVL-RecAP‏ علاوة على ما سبق»؛ لاحظنا زيادة في تركيزات ‎ATP‏ خارج الخلايا ‎٠‏ بعد حضانة ‎lly LPS‏ كانت أكثر وضوحا مع تركيز ‎LPS‏ الأعلى ولكنه معكوس بواسطة الحضانة المسبقة ل ‎LVL-ReCAP‏ (الشكل ‎.)١6‏ لم يؤثر ‎LPS‏ على حيوية الخلية إلى ‎Ye‏ ساعة (بيانات غير موضحة). هذا يؤيد افترارض أن ‎LVL-ReCAP‏ قد يبذل تأثيره الواقي للكلى من خلال مسار 1 /أدينوسين. علاج ‎LVL-RecAP‏ أثناء ‎AKI‏ المحفز ب ‎ALPS‏ الجرذان يوهن فشل وظيفة الكلى ير نض
لتأكيد التأثيرات المفيدة ل ‎LVL-RecAP‏ في الكائن الحي, تم تحفيز ال في الجرذان بواسطة ‎LPS (0.3‏ مجم/كجم ‎(BW‏ تم تقييم وظيفة الكلى بواسطة قياس عبر الجلد حركيات سينسترين المرمزة بثيوسيانات فلوريسثين ‎(FITC) fluorescein isothiocyanate‏ وفقاً للمسجل سابقاً ‎.(Schock-Kusch, 2011)‏ تم إخلاء ©1١٠-سينسترين‏ 5015010 بواسطة الكلى من خلال © الترشيح فقط ويمكن قياس اختفاؤه من مكون البلازما عبر الأدمة في في ‎cdg‏ الحقيقي ‎Schock-)‏ ‎(Kusch, 2011, Schock-Kusch, 2009‏ .1385 يسمح بالتحقق من تطور ‎AKI‏ بطريقة أكثر دقة مقارنة بالخلو من الكرياتينين ‎creatinine‏ المستخدم على نحو شائع. قبل حقن ‎a3, LPS‏ سحب عينة دم خط الأساس لتحديد المتغيرات الإكلينيكية والسيتوكينات في البلازما, وتحدد عمر نصف ©76-سينسترين خط الأساس (11/2) من الحركيات المقاسة للتأكد من التجانس بين المجموعات ‎٠‏ (بيانات غير موضحة). بعد 1,0 ساعة, نتج عن العلاج ب ‎LPS‏ زيادة مستويات السيتوكينات في البلازما, الشذوذ في متغيرات البلازما المتعددة (الجدول ‎,)١8‏ انتصاب الشعر, الإسهال والنشاط التلقائي المنخفض, مما يؤكد وجود الالتهاب الجهازي. بعد ساعتين من إعطاء ‎LPS‏ تمت معالجة الجرذان ب ‎٠٠٠١( LVL-RecAP‏ وحدة/كجم ‎(BW‏ أو العلاج الوهمي (محلول ملحي), يلي ذلك مباشرةً قياسات وظيفة الكلى عبر الأدمة. يُطيل ‎LPS‏ بدرجة كبيرة من عمر نصف ‎“FITC‏ ‎VO‏ سينسترين, مما يكشف عن انخفاض كبير في وظيفة الكلى. تم توهين هذا التوجه بواسطة علاج ‎LVL-RecAP‏ (الشكل ١١أ).‏ في جميع المجموعات, تمت استعادة وظيفة الكلى بالكامل في غضون ‎YE‏ ساعة (الشكل ١١ب).‏ كذلك, كانت مستويات اليوريا في البلازما أقل بدرجة كبيرة في الحيوانات المعالجة ب ‎LVL-ReCAP‏ مقارنة بالحيوانات التي تلقت ‎LPS‏ دون ‎LVL-RecAP‏ ‏(الجدول ‎.)١9‏ أيضاً, يمتع علاج ‎LVL-ReCAP‏ الزيادة المحفزة ب ‎LPS‏ في إفراز اليوريا الجزيئي ‎٠‏ (الشكل ١١ج)‏ والانخفاض المحفز ب ‎LPS‏ في الخلو من الكرياتينين باطني المنشاً (الشكل ‎(ove‏ ‏تم ‎ash‏ النشاط الحيوي ل ‎LVL-ReCcAP‏ في البلازما وأظهر زيادة ‎A‏ أضعاف بعد ساعتين من الحقن (العلاج الوهمي: ‎١+797‏ وحدة/مل: 26013 ‎LPS:‏ وحدة/مل: ‎LPSHAP‏ مناخ وحدة/مل: م0001<0.). ‎LVL-RecAP‏ يمنع إصابة الكلى أثناء ‎AKI‏ المحفز ب ‎LPS‏ الكائن الحي ير نض
—qy— ‏علاوة على تقييم تحليل‎ LPS ‏المحفز ب‎ AKI ‏على‎ LVL-RecAP ‏تم بحث التأثير الواقي للكلى ل‎ ‏النسيج الكلوي ومرقمات الإصابة الأنبوبية المحددة. لم يتم العثور على اختلافات في تحليل النسيج‎ ‏المظهر‎ Jie ‏إلى تغيرات متدهورة ثانوية‎ )١( ‏بين مجموعات العلاج, مع تغيرات تتراوح من لا تلف‎ ‏عن حالات‎ Shad ‏ونظهر رغوي وتورم معتدل‎ )١( ‏الرغوي وتورم دقيق في الخلايا الأنبوبية القريبة‎
LPS+ LVL= :]٠-١[ ٠.5 :LPS [Y= Yo] ١ ‏(العلاج الوهمي:‎ )( WAN ‏قليلة من تلاشي‎ © ‏زيادة كبيرة في مستويات التعبير الكلوي عن -ا!‎ LPS ‏نتج عن العلاج ب‎ .)]٠,.-١[ ١ :RecAP ‏ميلوبيروكسيديز‎ MPO) . ‏السيتوكينات الأخرى ومرقمات الإصابة‎ pls J ‏6م بينما‎ ‏إنزيم سينزاز أكسيد النيتريك‎ INOS ‏المرتبط ب 2ا80:‎ X ‏البروتين‎ , BAX; myeloperoxidase ‏خفض‎ LVL-RecAP ‏تعذر على‎ .)٠١ ‏للتحفيز) (الجدول‎ Bla nitric oxide synthase ‏مستويات التعبير عن 6-اا في الكلى, لكنه لم يحسن التعبير الكلوي عن السيتوكين المضاد للالتهاب‎ Vo ‏زيادة كبيرة في إفراز البول‎ LPS ‏علاوة على ما سبق؛ نتج عن إعطاء‎ .)٠١ ‏(الجدول‎ 1-0 ‏وكالين دهني مرتبط بإنزيم جيلاتيناز‎ kidney injury molecule )41/(-1 ‏لجزيء إصابة الكلى‎ ‏والذي تصاحبه‎ ,(NGAL) neutrophil 961810856-3550018160 lipocalin ‏للعدلات‎ all
LVL= ‏مستويات تعبير وراثي كلوي مرتفعة. تم تجنب هذا التأثير بواسطة الإعطاء المشترك ل‎ ‏على‎ LVL-ReCcAP ‏تمت ملاحظة تأثيرات مشابهة‎ .)٠١ ‏الجدول‎ REAR ‏(الشكل‎ RecAP ٠ ‏(الشكل‎ KIM=1 ‏ج) وعلى مستويات البروتين الكلوي ل‎ ١١ ‏في البلازما (الشكل‎ NGAL ‏مستويات‎ ‏والتي تتواجد على نحو أولي في السطح القمي للخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة (الشكل‎ (2) ‏ه).‎ ‏الكائن الحي‎ LPS ‏المحفز ب‎ AKL ‏إفراز أدينوسين المنخفض في البول أثناء‎ —ATP ‏بحثنا دور مسار‎ LVL-RecAP ‏علاوة على ذلك الآلية الواقية للكلى ل‎ mung ‏كي يتسنى‎ ٠ ‏لجميع‎ LY ‏إلى خفض مستويات التعبير الوراثي في‎ LPS ‏أدينوسين ©80600510. يميل العلاج ب‎ ‏على‎ .)7١ ‏أهمية إحصائية (الجدول‎ AB ‏مستقبلات أدينوسين الأربع, ومنا بلغ مستقبل أدينوسين فقط‎ ‏بدرجة كبيرة الإفراز في البول لأدينوسين (العلاج‎ LPS ‏نحو يثير الاندهاش, يخفض العلاج ب‎ ‏بيكو‎ TYEE LPS ‏كرياتينين:‎ aha ‏ميكرو‎ ٠١ / ‏بيكو جرام أدينوسين‎ VARTA ‏الوهمي:‎ ‎ADP ATP cAMP ‏دون تبديل إفراز‎ ,) ٠ ‏ميكرو جرام كرياتينين: م<01‎ ٠١ / ‏جام أدينوسين‎ Yo ‏فضت‎
‎q A —_‏ _ ‎AMP‏ (بيانات غير موضحة). قد يقترح هذا أن الكّلية تستفيد من أدينوسين أثناء ‎AKL‏ المحفز ب ‎LPS‏ لم يكن للعلاج ب ‎LVL-RecAP‏ أي تأثير على التعبير الوراثي عن مستقبل أدينوسين (الجدول ‎)٠١‏ , أو على إفراز أدينوسين في البول ‎(LPS+LVL-RecAP)‏ 1,1,7 بيكو جرام أدينوسين / ‎٠١‏ ميكرو جرام كرياتينين: م<01 ‎١.0‏ مقارنة بالعلاج الوهمي) مقارنة ب ‎LPS‏ بمفرده. الجداول الجدول ‎VY‏ مواصفات البرايمر/المسبار جلسير الدهيد -؟- فوسفات ديهيدروجيناز ‎glyceraldehyde—3- GAPDH‏ 15027589911 ‎phosphate‏ ‎dehydrogenase‏ ‏عامل تنكرز الورم ‎Hs01113624_91 | tumor neciosis TNF-a‏ ‎factor‏ ‏إنترليوكين ‎interleukin‏ ‎Hs00985639_m1 IL-6‏ 1 ‎TLR4‏ مستقبل شبيه ب 4 ‎m1 | toll‏ 1500152939 ‎Try‏
_ q q —_
Al ‏مستقبل أدينوسين‎
Hs00379752 ml i — adenosine Al ADORA1 receptor
Hs00169123 m1 | 828 ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA2A
Hs00386497 m1 | A2b ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA2B
Hs01560269 m1 | A3 ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA3 ‏جلسير ألد هبد -؟‎ 40017757631 GAPDH ‏فوسفات ديهيدروجيناز‎ ‏إنترفيرون جاما‎
Rn00594078_m1 IFN-y interferon gamma ‏مستقبل خلوي لفيروس‎ 4000597703701 | ‏لاخر الالتهاب الكبدي الوبائي‎ 1 ١ ‏بد‎
_ \ a= lipocalin ‏كالين دهنى‎ 005906121 1 LCN2
Y
‏ميلوبيروكسيديز‎ ‎Rn01460204 m1 MPO myeloperoxidase ‏البروتين 76 المرتبط ب‎ 02532082 1 BAX 802 ‏سينزاز أكسيد النيتريك‎ nitric oxide 4005616461 2 synthase ‏قابل إل فيز‎ , 7
RNO0567668 M1 | Al ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA1
RN00583935 m1 | A2a ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA2A
RNO0567697 m1 | A2b ‏مستقبل أدينوسين‎
ADORA2B 4005636801 ‏مستقبل أدينوسين 3م‎
ADORA3 ‏السيتوكينات في البلازما والمتغيرات التجريبية‎ A ‏الجدول‎ ‎ESS ‎Try
“yy
I I ‏سد‎ ‎Hi YodtoVvit 8717+ +95 ١ ‏8--اا(بيكو‎ ii ii ‏نا‎ ‎١ - IL‏ (بيكو ‎١‏ نالا وه ادق ‎SANE‏ اذك لمق ا لاا ةا ‏اا - ‎٠١‏ (بيكو | ‎HYONYEATAY | #١48 ١72197‏ انا نا ا ‎*HANALY ‏غاص‎ 77750717 V+) ١ ‏(بيكو‎ TNF-a i
I
‎ND ND ND (de / ‏جرام‎ ‏المتغيرات في‎
I vet Yo ‏رفن‎ EAE TAN ‏كرياتينين‎ ‎i ‏اهنا‎ ‎* #6 7+4 1+ ‏اليوريا‎ ‏ع‎ a ‏ا‎ ‎Y+YY + ‏لاكتات 5ه‎ ‏اا فا ا‎
AREA RE 7+٠ ‏جلوكوز از ركع‎ > 7 ‏الت‎
-١ ٠ Y-— [cA=c1] 0 [WY=¢A] oA | [eA] oA | ‏بروتين (مجم/مل‎ ‏لتر)‎ ‎He, oY, 8) Be, YLY, LY +4 ‏كالسيوم (مل‎ ‏مول/لتر)‎ ‏الراتحن ل‎ EAA Ye) ‏فوسفور غير‎ ‏عضوي (مل‎ ‏مول/لتر)‎ ‎+ + VEY Ed ‏صوديوم | (مل|‎ ‏مول/لتر)‎ ‎-,/1[ 2 -¢,11] £,AY -0,11] 2,4 ‏بوتاسيوم (مل‎ [oA [e,¥Y [1,7 ‏مول/لتر)‎ ‏تم التعبير عن البيانات في صورة‎ LPS ‏تحددت متغيرات البلازما بعد ساعة ونصف من إعطاء‎ ‏ومتوسط [النسبة المثوية الخامسة والعشرين, النسبة المتئوية الخامسة والسبعين],‎ ,SEM+ ‏المتوسط‎ ‎2 ‏إلا فتلافات في توزيع .0 ف ات البلازما مقارنة‎ 5. 1 vor ‏أن‎ ١ - 0 ‏من‎ ٠ ‏بناء على توزيع كل .0 حي‎ ‏أحادي الاتجاه واختبار‎ ANOVA ‏بحجم العينة. تم تقدير الاختلافات الكبيرة باستخدام‎ 74 =t ‏اللاحق. العلاج الوهمي,‎ Dunns ‏مع اختبار‎ Kruskal-Wallis ‏اللاحق, أو اختبار‎ Bonferroni © ‏مقارنة بالعلاج الوهمي. * م<5.. مقارنة ب‎ .,. <0 # 0 =LPS+recAP 0:1 =n LPS : ‏إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني‎ ,recAP ‏عديد السكريد الدهني:‎ LPS LPS ‏نالا: غير محدد.‎ ‏البلازما ومتغيرات البول‎ .١9 ‏الجدول‎ ‎LPS +
LPS recAP ‏العلاج الوهمي‎ ‏بد‎
١,
HEE
YES Ya | YEG YE | VEY ‏كرياتينين‎ ‎i ‏تق‎ ‎* +١ HELEN + Urea
TT ‏اا‎ ‎-٠١[ ١٠٠١١ [YY] VE] ‏لحح]‎ ٠ ‏لاكتات‎ ‎A ‏ا‎ ‎+101 11+77 ‏جلوكوز 46 +لا‎ ‏تتا تنا تتا‎ ‏[04-يه]‎ ot [eY—0oY] 0 [eY—0t] 0 ‏بروتين‎ ‏سس‎ [P= “VAL ‏لاح ا مت لتحا يلا‎ YAS | ‏(مل‎ مويسلاك‎ ‏حي ديا كنا انا‎
EF ‏فوسفور غير | راحب تالت لمح‎ ‏عضوي (مل‎ ‏مول/لتر)‎ ‎-:1[ Vee ‏وفنحا‎ Yet ‏[منتحا‎ Ven | ‏صوديوم مل‎
EE
‏(مل 4575 | "كيار | لكان‎ مويساتوب‎ i
TY
-١
I ‏حا‎ ألبومين (ميكرو | ‎FY. ]117-٠ ]5 4-01 ٠‏ 11-1؟] دعي مه سي +11 ١ TEVA | ‏بروتين (ميكرو‎
Te
VEY, CARY 145,١ | ‏كالسيوم (ميكرو‎ كي وو ل ا =A] ‏لتحا كا‎ IY SY] ee ‏فوسفور غير‎ [+A ٠, [+4 | ‏عضوي (مل‎ مول) صوديوم مل ‎[YT NT‏ تا احا ‎VE]‏
TT
بوتاسيوم (مل | ,7+1 ‎Heavy‏ ال ين ا لا لا تحددت متغيرات البلازما بعد ‎YE‏ ساعة من إعطاء 5ا. تحددت متغيرات البول بين © و١‏ ؟ ساعة بعد إعطاء ‎(LPS‏ تم التعبير عن البيانات في صورة المتوسط 581/2, ومتوسط [النسبة المثوية الخامسة والعشرين, النسبة المئوية الخامسة والسبعين], ‎sly‏ على توزيع كل متغير. تم تقدير الاختلافات الكبيرة باستخدام اختبار ‎Kruskal-Wallis‏ مع اختبار ‎Dunns‏ اللاحق أر ‎ANOVA‏ هت أحادي الاتجاه مع اختبار ‎onferroni‏ اللاحق. العلاج الوهمي, ‎=n LPS+recAP 1 =n LPS‏
-١ ١. ‏مقارنة‎ v, 00 >p * ‏سن ,+ مقارنة بالعلاج الوهمي.‎ >p # .0 =n ‏ات البول : العلاج الوهغمي‎ 1 0 . ‏إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني‎ FeCAP ‏عديد السكريد الدهني:‎ LPS. LPS ‏ب‎ ‏مستويات التعبير الوراثي الكلوي‎ Ye ‏الجدول‎ ‎ae (ass a = ‏العلاج‎ LPS +| zl LPS +
LPS LPS
‏الوهمي‎ recAP ‏الوهغمي‎ recAP
IN-EAR AY +11 ‏الى‎ ox), 2), ot) Y
IL-1p oY Y Y °
YV,¢ Yv,e Yev AO ١ 43 #Y Y+o ¥
IL-6 -3 1-1١ ‏1؛.؟3-‎ 1 #o [YA «| [YEA [v1,¢ ‏الى‎ EAN] YY, 0 | ‏حر الى‎ ENN | 2YY | #١7 +5
IL-10 ٠ ‏و‎ Y q
TNF- ٠ 0 Y + ٠ ‏خا‎ ٠ , 2) , ١ ٠ , 2) , ٠ YE) i. a 4 ‏هت‎ 7 ١
PU M3 oi VR I ‏لاح اباط | لراطى للبم الى | لبقا‎
INF—y vt Y Y v ‏مرقمات‎ ‏الإصابة‎
-١ ٠ -
GEEYYY | + ١ ‏اح‎ oA EY | —eY] ٠
KIM-1 a Tl -.,1[١ Yael [¥¥1 [V,q | #[eY. ‏كاحت‎ | EYE) | ‏ترا | مار‎ | #577 AYA
NGAL ‏ا‎ 1 Y
GYEYY,E | EY), EY), ‏الف‎ A ‏كرا‎ | =X] 1
MPO RY ٠ a IR [VY [¥,4 A ‏فى‎ ١ EYE A ‏لأ و14 بداب‎ [=e],
BAX ‏ا‎ YI ‏[لا,.-‎ ١ -.,[ [V,¥ [Y,e [¥,)
GOEYTLY | ‏الى راط | لراطى مرق الى ما‎
INOS
٠, A ‏أ‎ 2 ‏تقبلات‎ ‏أدينوسين‎ ‎oYEYAT | 2YV,A ١ 7 YY GY =X] A
Al oY Tl ‏|[؛,.-‎ -.,*[ [V,o [¥,¥ [V,¢ ‏الى‎ | EYE 2YYY ١ ‏لد نطب | تباط‎
A2A ٠" 1 ¢ \
Tr
-١ ٠ ‏ل‎ ‎6 17 Ya,v | 2, Y | 2A OYE A
A2B YA 4] | -YAN] -YA,4] Y Y [Y4,Y [Ya,. [VY
GYEV EY | VEY | ‏أب ساسح‎ ob), | ‏الا تحت‎ VEY
A3 ‏ع‎ 1 ١ #) ‏ومتوسط [النسبة المئوية الخامسة والعشرين,‎ SEM ‏تم التعبيرعن البيانات في صورة المتوسط‎ ‏النسبة المثوية الخامسة والسبعين], بناءً على توزيع كل متغير. تم تقدير الاختلافات الكبيرة للزيادة‎ ‏أحادي‎ ANOVA ‏مع اختبار 00005 اللاحق أو‎ Kruskal-Wallis ‏المضاعفة باستخدام اختبار‎ # .0 =n LPS+recAP : =n LPS ‏اللاحق. العلاج الوهمي,‎ Bonferroni ‏الاتجاه مع اختبار‎ ‏عديد السكريد الدهني:‎ LPS LPS ‏مقارنة بالعلاج الوهمي. * م5<0.,. مقارنة ب‎ .,.#0<( 0 ‏ميلوبيروكسيديز‎ MPO ; ‏إنزيم فوسفاتاز قلوي ناتج عودة الاتحاد الجيني‎ ,recAP ‏إنزيم سينزاز أكسيد النيتريك‎ INOS ‏المرتبط ب 2ا806:‎ X ‏بروتين‎ , BAX myeloperoxidase ‏القابل للتحفيز.‎ nitric oxide synthase 1 ‏مراجع المثال‎
Bauerle, J.D., Grenz, A., Kim, J.H., Lee, H.T., and Eltzschig, H.K. 2011. ٠
Adenosine generation and signaling during acute kidney injury. J Am Soc
Nephrol 22:14-20.
Chen, K.T., Malo, M.S., Moss, A.K., Zeller, S., Johnson, P., Ebrahimi, F.,
Mostafa, G., Alam, S.N., Ramasamy, S., Warren, H.S., et al. 2010.
Identification of specific targets for the gut mucosal defense factor intestinal ٠ alkaline phosphatase. Am J Physiol Gastrointest liver Physiol 299:G467- 475.
Di Sole, F. 2008. Adenosine and renal tubular function. Curr Opin Nephrol
Hypertens 17:399-407.
Try
-١ ٠ ‏م‎
Eltzschig, H.K., Sitkovsky, M.V., and Robson, S.C. 2012. Purinergic signaling during inflammation. N Engl J Med 367:2322-2333.
Kiffer—Moreira, T., Sheen, C.R., Gasque, K.C., Bolean, M., Ciancaglini, P., van Elsas, A., Hoylaerts, M.F., and Millan, J.L. 2014. Catalytic signature of a heat-stable, chimeric human alkaline phosphatase with therapeutic © potential. PLoS One 9:e89374.
Peters, E., Heemskerk, S., Masereeuw, R., and Pickkers, P. 2014. Alkaline
Phosphatase: A Possible Treatment for Sepsis—Associated Acute Kidney
Injury in Critically lll Patients. Am J Kidney Dis. 63:1038-48
Schock-Kusch, D., Sadick, M., Henninger, N., Kraenzlin, B., Claus, G., yo
Kloetzer, H.M., Weiss, C., Pill, J., and Gretz, N. 2009. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.
Nephrol Dial Transplant 24:2997-3001.
Schock-Kusch, D., Xie, Q., Shulhevich, Y., Hesser, J., Stsepankou, ‏.ا‎ ‎Sadick, M., Koenig, S., Hoecklin, F., Pill, J., and Gretz, N. 2011. ٠
Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int 79:1254-1258.
Wilmer, M.J., Saleem, M.A., Masereeuw, R., Ni, ‏.ما‎ van der Velden, T.J.,
Russel, F.G., Mathieson, P.W., Monnens, L.A., van den Heuvel, L.P., and Y.
Levtchenko, E.N. 2010. Novel conditionally immortalized human proximal tubule cell line expressing functional influx and efflux transporters. Cell
Tissue Res 339:449-457.
Try
-١.4- ٠١ ‏المثال‎ ‏ب 8ه تحت ظروف مختلفة درجة الحرارة‎ LVL-RecAP ‏مقارنة‎ ‏المواد‎ TY ‏المقاييس المرجعية‎ ٠٠
LVL-RecAP ©
NB1963p1 ‏رقم الدفعة:‎
PRA ID: 14-049 (OD280) ‏محتوى البروتين: 4,9 مجم/ مل لتر‎ ‏وحدة/مجم)‎ TT 0) ‏النشاط: 19797 وحدة/مل‎ ‏م‎ Vim ‏ظروف التخزين: اسمية عند‎ ٠ ‏يناير 015؟‎ A ‏تاريخ انتهاء الصلاحية:‎
RecAP lot 62 , + 07-7007 ‏رقم الدفعة:‎
PRA ID: 14-311 (OD280) ‏مجم/ مل لتر‎ ١,7 ‏محتوى البروتين:‎ ٠ ‏وحدة/مجم)‎ VEY) ‏النشاط: 54891 وحدة/مل‎ a A-Y ‏ظروف التخزين: عند‎
Yo ‏تاريخ انتهاء الصلاحية: 6 يونيو‎ ‏؟ مصفوفة فارغة‎ LY ‏بض‎
“Ny ‏تم استخدام المصفوفة البيولوجية التالية لتحضير محاليل العينة.‎ ‏المصفوفة: المصل‎ ‏الأنواع: بشري‎
Sera Laboratories International, Haywards Heath, UK ‏المورد:‎ ‏.م‎ Vom ‏ظروف التخزين: عند درجة حرارة التخزين الاسمي‎ © ‏بصنت ل احلاكت وفناجاعمت‎ (PRA IDs 1 AYE) £) Yo 1 ‏تاريخ انتهاء الصلاحية: ؟ مايو‎ 0 ‏حت ومفناحافما‎ £) ٠١130 ‏مايو‎ ١ ‏الطرق‎ LY .٠ ‏تحضير المحاليل‎ ١٠١7.٠١ ٠ sodium hydroxide ‏هيدروكسيد الصوديوم‎ Nee ‏؟‎ ٠١١١7 .٠ ‏جم من هيدروكسيد الصوديوم في‎ A ‏تم تحضير محلول ؟ مولار هيدروكسيد الصوديوم بواسطة إذابة‎ ‏مل‎ ٠٠١ ‏وبعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة تم ضبط الحجم إلى‎ Milli-Q ‏مل لتر ماء‎ 9٠ ‏تقريباً‎ ‏لتر. المحلول تم حفظه في درجة حرارة الغرفة بحد أقصى شهر واحد.‎
Magnesium chloride ‏مولار كلوريد المغنيسيوم‎ ١ ‏؟‎ .٠ LV .٠١ No ‏مولار محلول كلوريد المغنيسيوم بواسطة إذابة 5,07 جم هكساهيدرات كلوريد المغنيسيوم‎ ١ ‏تم تحضير‎ ‏بعد الإذابة تم‎ Milli-Q ‏مل لتر ماء‎ VT ‏في تقريباً‎ magnesium chloride hexahydrate ‏مل لتر. المحلول تم حفظه عند درجة حرارة اسمية +؛ .م حتى شهر واحد‎ Yo ‏ضبط الحجم إلى‎
Zinc chloride ‏مولار كلوريد الزنك‎ oY ١ .١ LY .٠ Ye
TY
-١١١- ‏مجم كلوريد‎ YYY,0 ‏بواسطة إذابة‎ Zinc chloride ‏مولار كلوريد الزنك‎ ١,١ ‏تم تحضير محلول‎ ‏مل لتر.‎ ٠١ ‏بعد الإذابة, تم ضبط الحجم إلى‎ Milli-Q ‏الزنك في تقريباً 17 مل لتر ماء‎ ‏.م بحد أقصى شهر واحد.‎ E+ ‏المحلول تم حفظه عند درجة حرارة اسمية‎ ‏طريقة 075 مولار محلول جليسين70776ا9. الرقم الهيدروجيني 9,6 في طريقة‎ £0) LY .٠ ‏درجة مئوية‎ Yoo ‏مولار جليسين الرقم الهيدروجيني 9,6 بواسطة إذابة 7,77 جم من‎ ١.075 ‏تم تحضير محلول‎ ‏درجة مئوية وضبطه‎ Yo ‏تمت تدفئة المحلول إلى‎ MIlli—Q ‏مل لتر ماء‎ ١886 ‏جليسين في تقريباً‎ .)١ ١٠ ١7 2.٠١ ‏إلى الرقم الهيدروجيني 9,6 باستخدام ؟ مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر القسم‎ ‏مل لتر وإعادة التحقق من الرقم الهيدروجيني. يجب أن يكون الرقم‎ ٠008٠6 ‏تم الوصول بالحجم إلى‎ ‏درجة مئوية. المحلول تم حفظه عند درجة حرارة‎ Yo ‏الهيدروجيني هو الرقم الهيدروجيني 9,6 عند‎ - ٠ ‏اسمية + م بحد أقصى أسبوع واحد.‎
Lge ‏درجة‎ Yo ‏مخففة لإنزيم في‎ sold ‏طريقة محلول منظم‎ © LY LY . ‏مولار كلوريد المغنيسيوم‎ ١ ‏لتر‎ Je +,0 ‏ثم تحضير محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم بواسطة خلط‎
OY ٠ ‏مولار كلوريد الزنك (انظر القسم‎ ٠ ١ ‏لتر‎ Ja v0 ‏مع‎ (Y JY ٠ ‏(انظر القسم‎ . ١ VY . ١ ٠ ‏محلول (انظر القسم‎ 9 J ‏مولار جليسين الرقم الهيدروجيني‎ ve Y o ‏لتر‎ Je Ov ‏و‎ ( ١ o ‏جم ألبومين مصل بقري ومذاب تحت‎ +, Y0 5 ‏جم مانيتول‎ 5,٠٠0 ‏؛). إلى هذا المحلول, تمت إضافة‎ 1,76 ‏التقليب. تم التحقق من الرقم الهيدروجيني وإذا اقتضى الأمر تم ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني‎ ‏مولار هيدروكسيد الصوديوم . محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم ثم‎ Y ‏درجة مثوية باستخدام‎ Yo ‏عند‎ ‏تحضيره جديد كل يوم.‎ ‏درجة‎ Yo ‏مولار م-نيترو فينيل فوسفات الرقم الهيدروجيني 1 في‎ 0 ٠ Y ‏كاء ل. أ طريقة‎ A) ‏مئوية‎ ‏الرقم‎ p-Nitrophenyl phosphate ‏تم تحضير 0007 مولار م-نيترو فينيل فوسفات‎ ‏مل لتر‎ TT ‏مجم 0-نيترو فينيل فوسفات في تقريباً محلول‎ ١574 ‏الهيدروجيني 9,7 بواسطة إذابة‎ ‏بض‎
-١١١- ‏تم التحقق من الرقم‎ .)4 .١ LY .٠١ ‏مولار جليسين الرقم الهيدروجيني 7 (انظر القسم‎ ١8 ‏درجة مئوية باستخدام‎ YO ‏الهيدروجيني وإذا اقتضى الأمر تم ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني 9,7 عند‎ ‏بعد التحقق من الرقم الهيدروجيني,‎ ٠. ( APR IA I ‏مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر القسم‎ Y
A ‏مل لتر باستخد ام محلول از 0 مولار جليسين الرقم الهيدروجيني‎ gen ‏الحجم ثم ضبطه إلى‎ ‏المحلول تم حفظه عند قيمة اسمية + .م إلى حد أقصى > أيام.‎ ©
YEP ‏درجة‎ Yo ‏لا ل لا طريقة ركيزة التشغيل في‎ ٠ ‏مل لتر 0.0107 مولار محلول 8-نيترو فينيل‎ ١7١ ‏ركيزة التشغيل تم تحضيرها بواسطة خلط‎ ‏مع‎ )1 .١ LY 2.٠١ ‏الرقم الهيدروجيني 7 (انظر القسم‎ p—Nitrophenyl phosphate ‏فوسفات‎ ‏إلى هذا محلول‎ L(Y .١ .7 .٠١ ‏محلول كلوريد المغنيسيوم (انظر القسم‎ Wee ١ ‏مل لتر‎ 5 ‏مل لتر 075 مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني 9,6 (انظر القسم‎ Vo ‏تقريباً تمت إضافة‎ ٠ ‏لأمر تم ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني‎ ١ ‏اقتضى‎ ١ ‏وتم التحقق من الرقم الهيدروجيني واذ‎ (8) LY) i ١ I It ‏باستخدام ؟ مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر القسم‎ YEP ‏درجة‎ Yo ‏عند‎ 1
A ‏مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني‎ ve Yo ‏مل لتر باستخدام‎ ٠5 ‏الحجم ثم ضبطه إلى‎ as ‏ركيزة التشغيل ثم تحضيرها جديد كل‎ ‏درجة مثوية‎ vv ‏طريقة ماي مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني 1 في‎ AY ‏كا‎ Yo ‏حلا جم من‎ .١ ‏مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني 7 بواسطة إذابة‎ ١,075 ‏ثم تحضير‎ ‏درجة مئوية وتم‎ Yo ‏المحلول تمت تدفئته إلى‎ Milli-Q ‏جليسين في تقريباً 1886 مل لتر ماء‎ ‏مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر القسم .لا‎ Y ‏ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني 13 باستخدام‎ ‏مل لتر وإعادة التحقق من الرقم الهيدروجيني. يجب أن‎ ٠٠0٠١ ‏تم الوصول بالحجم إلى‎ L(V ١١ ‏درجة مثوية . المحلول ثم حفظه عند قيمة‎ ١ ‏يكون الرقم الهيدروجيني الرقم الهيدروجيني 1 عند‎ A) ‏اسمية + م إلى حد أقصى أسبوع واحد.‎ ‏طريقة محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم في وخ درجة مثوية‎ 5 PR RV ‏مولار كلوريد المغنيسيوم‎ ١ ‏لتر‎ Je +,0 ‏ثم تحضير محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم بواسطة خلط‎
OY ٠ ‏مولار كلوريد الزنك (انظر القسم‎ ٠ ١ ‏لتر‎ Ja v0 ‏مع‎ (Y JY ٠ ‏(انظر القسم‎ ‏ير نض‎
-١1©-
A ‏.لا‎ ٠ ‏(انظر القسم‎ 9 J ‏مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني‎ ve Yo ‏لتر‎ Je 20.6 ‏و‎ ( ‏جم ألبومين مصل بقري ومذاب تحت‎ +, Y0 ‏جم مانيتول و‎ 5,٠٠ ‏إلى هذا محلول, تمت إضافة‎ .)4 1,76 ‏التقليب. تم التحقق من الرقم الهيدروجيني وإذا اقتضى الأمر تم ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني‎ ‏باستخد ام ¥ مولار هيدروكسيد الصوديوم . ثم تحضير محلول منظم لمادة مخففة‎ YEP ‏في وخ درجة‎ ‏الإنزيم جديد كل يوم.‎ © vv ‏ل مولار م-نيترو فينيل فوسفات الرقم الهيدروجيني 1 في‎ Y ‏طريقة‎ Yeo ld WY Ye ‏درجة مئوية‎ ‏ثم تحضير اا ل مولار م-نيترو فينيل فوسفات الرقم الهيدروجيني 1 بواسطة إذابة ما‎ ‏مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني‎ ١.075 ‏مل لتر‎ TT ‏مجم 0-نيترو فينيل فوسفات في تقريباً‎ ‏تم التحقق من الرقم الهيدروجيني واذا اقتضى الأمر تم ضبطه‎ .)8 LY LY .٠١ ‏(انظر القسم‎ 9,310 ٠ ‏مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر‎ ١ ‏درجة مئوية باستخدام‎ TY ‏إلى الرقم الهيدروجيني 9,6 عند‎ ‏بعد التحقق من الرقم الهيدروجيني, الحجم ثم ضبطه إلى 6 مل لتر‎ ٠. ( ANP IPS ٠ ‏القسم‎ ‏مولار جليسين الرقم الهيدروجيني 9,7 محلول. المحلول تم حفظه عند قيمة اسمية‎ +, Yo ‏باستخدام‎ ‏+؛ .م إلى حد أقصى > أيام.‎
YEP ‏درجة‎ Yv ‏طريقة ركيزة التشغيل في‎ YY ‏ال‎ LY ٠١ yo ‏ل مولار محلول 9 -نيترو فينيل فوسفات‎ Y ‏لتر‎ Ja YY. ‏لتشغيا 1 بواسطة خلط‎ et] ‏ثم تحضير ركيزة‎ ‏مولار محلول كلوريد‎ ١ ‏مل لتر‎ Yo .١ ‏مع‎ (Ve) LY .٠١ ‏الرقم الهيدروجيني 9,7 (انظر القسم‎ ٠,075 ‏مل لتر‎ Vo ‏إلى هذا محلول تقريباً تمت إضافة‎ (YL) LY .٠١ ‏المغنيسيوم (انظر القسم‎ ‏وتم التحقق من الرقم‎ )4 .١ .7 .٠١ ‏مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني 9,6 (انظر القسم‎ ‏درجة مئوية باستخدام‎ TV ‏الهيدروجيني وإذا اقتضى الأمر تم ضبطه إلى الرقم الهيدروجيني 9,76 عند‎ Yo ‏مل لتر‎ Veo ‏الحجم ثم ضبطه إلى‎ . ( ١ IR A I ‏مولار هيدروكسيد الصوديوم (انظر القسم‎ Y ‏باستخدام 0.075 مولار محلول جليسين الرقم الهيدروجيني 09,7 ركيزة التشغيل تم تحضيرها جديدة‎ as ‏كل‎ ‏ميكرو جرام/مل)‎ vv) LVL-RecAP Spike ‏؟ محلول‎ .V .٠ ‏و‎
-١١6- .٠١ ‏(القسم‎ LVL-RecAP ‏ميكرو لتر‎ YOY, 0 ‏بواسطة تخفيف‎ recAP spike ‏تم تحضير محلول‎ .)# .١ .7 .٠١ ‏مل لتر باستخدام محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم (القسم‎ ٠٠ .* ‏إلى‎ (YT ‏ميكرو جرام/مل, تم استخدام هذا المحلول في تحضير‎ 50٠0 ‏يبلغ‎ spike ‏التركيز النهائي لمحلول‎ .)6 ١ ٠١ ‏(القسم‎ recAP spiked ‏عينات مصل بشري‎
RecAP spike ‏ميكرو جرام/مل) تم تحضير محلول‎ 000) RecAP Spike ‏؟ محلول‎ LV .٠١ 0 ‏مل لتر باستخدام‎ 5,٠٠0 ‏إلى‎ )١ .١ .٠١ ‏(القسم‎ RecAP ‏ميكرو لتر‎ 188,٠ ‏بواسطة تخفيف‎ 550 spike ‏بلغ التركيز النهائي لمحلول‎ .)#© .١ LY .٠١ ‏محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم (القسم‎ ‏(القسم‎ RecAP spiked ‏ميكرو جرام/مل, تم استخدام هذا المحلول في تحضير عينات مصل بشري‎ . (° ‏لا‎ ٠ ‏.تم تحضير عينات المصل‎ LVLE-recAP Spiked ‏ل 4 تحضير عينات مصل بشري‎ .٠ ٠١ ‏من المصل باستخدام التركيز التالي:‎ Al ‏إلى ثلاث دفعات فردية‎ LVL-RecAP ‏بواسطة تمور‎ ‏عينات المصل التركيز (ميكروا النشاط المحسوبا حجم التمورا إجمالي‎ ‏(ميكرو لتر) | الحجم (مل‎ (ls) ‏جام/مل)‎ | LVS ‏لتر)‎ RecAP
ERE
‏ا سا اس‎ ‏نا نش نا سن‎ ‏ا لسن ا سن‎ ‏نه لس أن سن‎
ERE
TY
-ه١١-‏ عينات المصل تم حفظها عند قيمة اسمية ‎Vem‏ م حتى تحليلها. ‎WV .٠‏ © تحضير عينات مصل بشري ‎RecAP Spiked‏ تم تحضير عينات المصل بواسطة تمور ‎RECAP‏ إلى ثلاث دفعات فردية تامة من المصل باستخدام التركيز التالي: عينات المصلتركيز (ميكرواالنشاط المحسوباحجم التموراإجمالي ‎ RecAP‏ أجام/مل) . ‎(hag)‏ أميكرو لتر) الحجم (مل لتر) حا شل ل ا تا ما نس تا أ ‎CE‏ ا كن لا الا ان ةا ‎OC 5‏ تا ‎HG OG I‏ ‎meee‏ ] © عينات المصل تم حفظها عند قيمة اسمية ‎a Vem‏ حتى تحليلها. ‎TLV ٠‏ تحضير محاليل العينة لنشاط الإنزيم ‎RecAP 5 LVL-ReCcAP‏ تم تحضير محاليل العينة لنشاط الإنزيم ‎RECAP 5 LVL-ReCAP‏ بواسطة تخفيف عينة المنتج ‎LVL-RecAP‏ أو عينة المنتج ‎RECAP‏ باستخدام محلول منظم لمادة مخففة لإنزيم (القسم ‎.٠١‏ ‎.٠ LY‏ © في طريقة ‎Yo‏ درجة مئوية أو القسم ‎LY .٠١‏ )0 9 في طريقة ‎TV‏ درجة ‎(Asie‏ ‏ير نض
-١١- ‏ميكرو لتر من‎ ١7١ ‏بواسطة أخذ‎ RECAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏من العينة‎ ١ dill ‏تم تخفيف‎ sald ‏مل لتر بمحلول منظم‎ 7,5٠0 ‏واخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-RecAP ‏المصل‎ die
RecAP i LVL-ReCAP ‏مخففة لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ ‏ميكرو لتر من عينة‎ ١7١5 ‏بواسطة أخذ‎ ReCAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏من‎ ١ ‏تم تخفيف العينة‎ ‏مل لتر بمحلول منظم لمادة مخففة‎ ٠,٠0 ‏وتخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-RecAP ‏المصل‎ ©
RecAP i LVL-ReCAP ‏لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ ‏ميكرو لتر من‎ ١1١ ‏بواسطة أخذ‎ RECAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏من العينة‎ ¥ dill ‏تم تخفيف‎ ‏مل لتر بمحلول منظم لمادة‎ 7٠,٠060 ‏وتخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-RecAP ‏المصل‎ die
RecAP i LVL-ReCAP ‏مخففة لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ ‏ميكرو لتر من‎ You ‏بواسطة أخذ‎ RECAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏تم تخفيف العينة ؛ من العين‎ ٠ ‏مل لتر بمحلول منظم لمادة‎ 7٠,٠060 ‏وتخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-RecAP ‏المصل‎ die
RecAP i LVL-ReCAP ‏مخففة لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ ‏ميكرو لتر من‎ ov ‏بواسطة أخذ‎ RECAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏تم تخفيف العينة © من العينة‎ ‏مل لتر بمحلول منظم لمادة‎ 7٠,٠060 ‏وتخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-RecAP ‏المصل‎ die ‏أى طخمع.‎ [5 LVL-RecAP ‏مخففة لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ Vo ‏ميكرو لتر من‎ ٠٠٠١ ‏بواسطة أخذ‎ RECAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏تم تخفيف العينة + من العينة‎ ‏مل لتر بمحلول منظم لمادة مخففة‎ 7,0٠8 ‏وتخفيفها إلى‎ ReCAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCAP ‏مصل‎ die .RecAP ‏أى‎ [5 LVL-ReCcAP ‏لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ ‏و/ أو 085 بواسطة أخذ‎ LVL-ReCAP ‏من العينة‎ (V ‏تم تخفيف العينة باطنية المنشاً (العينة‎ ‏مل لتر‎ ٠,٠0١ ‏وتخفيفها إلى‎ RecAP ‏و/ أو‎ LVL-ReCcAP ‏المصل‎ die ‏ميكرو لتر من‎ ٠0١١ Yo ‏و/‎ LVL-ReCAP ‏بمحلول منظم لمادة مخففة لإنزيم لتحضير محلول العينة النهائي لنشاط الإنزيم‎ .RecAP ‏أر‎ ‏ير نض‎
-١١- ‏التنفيذ, النتائج والمناقشات‎ LA LY ‏المعدات والإعدادت‎ VLA .٠ ‏تم استخدام الطريقة والإعدادات التالية:‎ ‏مجموعة سخان‎ xe Thermo Fisher Evolution 300 UVVIS ‏مقياس الضوء الطيفي:‎ ‏درجة مئوية (81-18-4) مع‎ ١ ‏أو‎ (AN=18-3) ‏درجة مثوية‎ Yo ‏بخلية واحدة في‎ Peltier © ‏وسيلة تقليب مغنطيسية‎ ‏طول موجي: £00 نانو مولار‎ ‏ثانية. لم يتم أخذ الدقيقة الأولى في الاعتبار في الحسابات.‎ ١١ ‏القياس: لمدة ؟ دقائق, القياس كل‎ ‏نوع كوفيت: زجاج‎ + ‏درجة مئوية‎ Yo ‏تم سحب المحاليل التالية بماصة في كوفيت زجاجي. بلغت درجة حرارة المحاليل‎ ٠
AN-18-4 ‏درجة مئوية + در م ل‎ YY ‏أو‎ AN-18-3 1, +0 ‏لفسا اا اسار‎
Bee ‏تم خلط أولاً ركيزة التشغيل ومادة مخففة لإنزيم قبل إضافة العينة. تم خلط المحلول ووضع الكوفيت‎ ‏إلى ؟ دقائق في‎ ١ ‏على الفور في مقياس الضوء الطيفي وتم قياس الزيادة في الامتصاص من‎ ‏ثانية للحصول على الأقل على9 نقاط بيانات. عند ؟ دقائق (أخيرة) نقطة البيانات‎ Vo ‏خطوات من‎ ‏علاوة على ما سبق كانت الخطية مقبولة: يجب أن تكون علاقة‎ .5 .١ > ‏كانت الكثافة الضوئية‎ ١ ‏ير نض‎
حم ‎-١‏ ‏معامل الارتباط (©) لكل منتسخ > 60 99,. تم أخذ جميع نتائج العينة بعلاقة معامل الارتباط )1( > ‎٠‏ في الاعتبار أثناء التقييم, تم تسجيل نتائج العينة بعلاقة معامل الارتباط )1( > ‎LA‏ ‏للمعلومات فقط. تم إجراء نشاط الإنزيم من وضع من نسختين, اختبار واحد لكل تخفيف. ‎.٠‏ . ؟ نشاط الإنزيم ‎RecAP 5 LVL-RecAP‏ © على الرغم من الوصف في خطة الدراسة أن الفرق في اثنين من النتائج المستقلة (نشاط الإنزيم) يجب أن يكون > 0 ‎٠‏ 96 لقبول اثنين من النتائج الفردية للتخفيف, تم استخدام جميع نتائج علاقة معامل الارتباط (©) لكل قياس > 84,990 التقييم. يرجع ذلك إلى التحقق من طريقة نشاط الإنزيم لعينات منتج عقار ‎LVL-ReCAP‏ في ‎Yo‏ درجة مئوية + © .م وليس لأصل إنزيم فوسفاتاز قلوي و/ أو الظروف الأخرى. ‎٠‏ يعرض الشكل ‎١9‏ العلاقة بين أنشطة الإنزيم ل ‎RECAP‏ في مصل بشري عند ‎YO‏ درجة مئوية وعند ‎TV‏ درجة مئوية. يعرض الشكل ‎٠١0‏ العلاقة بين أنشطة الإنزيم ل ‎LVL-ReCAP‏ في مصل بشري عند ‎Yo‏ درجة مئوية وعند ‎TY‏ درجة مئوية. يعرض الشكل ‎Yo‏ النشاط / ميكرو ‎aha‏ بروتين عند ‎VO‏ درجة مئوية وعند ‎TV‏ درجة مثئوية ل ‎.LVL-RecAP ; RecAP‏ تمثل القيم المتوسط 4النشاط بين ‎Yo‏ درجة مئوية 5 ‎TV‏ درجة مئوية ‎Ye‏ لتركيز البروتين المحدد. ير نض

Claims (1)

  1. -؟4١١-‏ عناصر الحماية ‎-١‏ بروتين معزول ‎isolated protein‏ له نشاط الفوسفاتاز القلوي ‎alkaline phosphatase‏ حيث يشتمل البروتين المذكور على متوالية حمض أميني ‎amino acid sequence‏ بها 259 حمض أميني متتابع ذات تطابق متوالية بنسبة 9698 على الأقل ذات متوالية بهوية رقم: ©؛ كما مبين في الشكل ١؛‏ متوالية حمض أميني من أحماض أمينية ‎acids‏ 807100 متتابعة 10( ذات © تطابق متوالية بنسبة 96948 على الأقل ذات متوالية بهوية رقم: ‎GU‏ كما مبين في ‎OSE‏ ‏ومتوالية حمض أميني من أحماض أمينية ‎acids‏ 807100 متتابعة ؛ 5 ذات تطابق متوالية بنسبة 6 على الأقل ذات متوالية بهوية رقم: ‎١‏ كما مبين في الشكل ٠؛‏ حيث يشتمل البروتين كامل الطول على متوالية حمض أميني ذات تطابق متوالية بنسبة 9648 على الأقل بها متوالية الحمض الأميني كاملة الطول ذات متوالية بهوية رقم: ‎١‏ كما مبين في الشكل ١؛‏ بشرط أن يكون الحمض ‎٠‏ الأميني ‎amino acid‏ في الموضع 779 ليوسين ‎(leucine L)‏ ويكون الحمض الأميني ‎amino acid‏ في الموضع ‎YYA‏ فالين ‎(V)‏ ويكون الحمض الأميني ‎amino acid‏ في الموضع ‎VA‏ ليوسين ‎leucine‏ (ا). "- عديد نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ يشتمل على متوالية حمض نووي تشفر بروتين 5 ‎pawl Ve‏ الحماية ‎.١‏ ‏*- ناقل ‎vector‏ يشتمل على عديد النيوكليوتيد ‎Gy polynucleotide‏ لعنصر الحماية ؟. ¢— بروتين ‎Gy‏ لعنصر الحماية ‎١‏ عديد النيوكليوتيد ‎Gay polynucleotide‏ لعنصر الحماية ‎Y‏ ‎٠»‏ . أو ناقل ‎vector‏ وفقًا لعنصر الحماية ‎(oF‏ لاستخدامه كدواء. 5- بروتين أو عديد النيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ أو ناقل ‎vector‏ للاستخدام وفقًا لعنصر الحماية ‎of‏ للاستخدام في طريقة منع أو علاج مرض التهابي ‎inflammatory disease‏ أو مرض في الكلى ‎kidney disease‏ أو نقص الفوسفاتاز ‎hypophosphatasia‏ . ‎-١ Yo‏ بروتين أو عديد النيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ أو ناقل ‎vector‏ للاستخدام وفقًا لعنصر الحماية ‎co‏ حيث يتم اختيار المرض الالتهابي ‎inflammatory disease‏ المذكور من المجموعة التي تضم أمراض المناعة الذاتية ‎autoimmune diseases‏ التهاب المفصل فضت
    ١١9. ‏مرض الانسداد الرثوي المزمن‎ «asthma ‏الربو‎ « rheumatoid arthritis ‏الروماتويدي‎ ‎« atherosclerosis ‏الشرايين‎ lai «chronic obstructive pulmonary disease inflammatory disease of the gastro-intestinal ‏مرض التهاب القناة المعدية المعوية‎ « neurodermatitis ‏؛ التهاب جلدي عصبي‎ sepsis ‏تعفن الدم‎ ¢ infection ‏العدوى‎ « tract inflammatory lung ‏؛ مرض الرئة الالتهابي‎ inflammatory liver ‏الالتهابي‎ asl ‏مرض‎ © Inflammatory kidney disease ‏ومرض الكلى الالتهابي‎ 6 ‏لعنصر‎ Ey ‏للاستخدام‎ vector ‏أو ناقل‎ polynucleotide ‏بروتين أو عديد النيوكليوتيد‎ -١ ‏المذكور‎ inflammatory kidney disease ‏الحماية ©؛ حيث يتم اختيار مرض الكلى الالتهابي‎ acute kidney ‏؛ إصابة حادة في الكلى‎ Kidney injury ‏من مجموعة تضم إصابة في الكلى‎ Vo « renal failure ‏؛ الفشل الكلري‎ chronic kidney disease ‏مرض الكلى المزمن‎ «injury ischemic renal ‏؛ المرض الكلوي الإقفاري‎ acute renal failure ‏الكلوي الحاد‎ Jal) ischemia / reperfusion kidney ‏وتلف في الكلى ناتج عن الإقفار/معاودة التروية‎ 6 .damage Vo ‏للاستخدام وفقًا لعنصر‎ vector ‏أو ناقل‎ polynucleotide ‏بروتين أو عديد النيوكليوتيد‎ —A ‏المذكور من‎ hypophosphatasia ‏مرض نقص الفوسفاتاز‎ loa) ‏الحماية 0 حيث يتم‎ ‏في فترة ما حول الولادة؛ نقص‎ hypophosphatasia ‏المجموعة التي تضم نقص الفوسفاتاز‎ ‏الطفليء نقص الفوسفاتاز 700005011818518 الطفولي؛‎ hypophosphatasia ‏الفوسفاتاز‎ ‏في البالغين.‎ hypophosphatasia ‏ونقص الفوسفاتاز‎ ٠ ‏النيوكليوتيد‎ ديدع‎ ١ ةيامحلا_رصنعل‎ Gy ofp ‏مضيفة . تشتمل على‎ ةيلخ‎ 9 YF ‏وفقًا لعنصر الحماية‎ vector ‏وفقًا لعنصر الحماية ؟ أو ناقل‎ polynucleotide host cell ‏لعنصر الحماية 9 حيث تكون الخلية العائئة‎ Gy host cell ‏خلية مضيفة‎ -٠ .Chinese hamster ovary (CHO) ‏المذكورة خلية مبيض الهامستر الصيني‎ © ‏لعنصر‎ Gay ‏لعنصر الحماية ١؛ تشتمل على زراعة الخلية العائلة‎ Bay ‏طريقة لإنتاج بروتين‎ -١ ‏والسماح للخلية العائلة بإنتاج البروتين المذكور.‎ ٠١ ‏الحماية 9 أو‎ ‏فضت‎
    RAR ‏و/أو يمكن الحصول عليها من خلال‎ ١ ‏لعنصر الحماية‎ Bay ‏تركيبة تشتمل على بروتين‎ -١ .١١ ‏لعنصر الحماية‎ Gg ‏طريقة‎ ‏لاستخدامها كدواء.‎ VY ‏لعنصر الحماية‎ Wy ‏تركيبة‎ -١؟‎ ©
    6- تركيبة لاستخدامها وفقًا لعنصر الحماية ‎OF‏ حيث يتم استخدام الدواء في منع أو علاج مرض التهابي ‎inflammatory disease‏ أو مرض في الكلى ‎kidney disease‏ أو نقص الفوسفاتاز ‎hypophosphatasia‏ .
    "0 ‎-١‏ بروتين أو عديد النيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ أو ناقل ‎vector‏ للاستخدام وفقًا لعنصر الحماية © ‎AS‏ أو تركيبة لاستخدامها وفقًا لعنصر الحماية ‎OE‏ حيث ينتج عن منع أو علاج مرض نقص الفوسفاتاز ‎hypophosphatasia‏ _البقاء على ‎ad‏ الحياة لفترة طويلة؛ زيادة وزن الجسم؛ وتحسين النمط الظاهري الهيكلي ‎improved skeletal phenotype‏ ؛ وتخفيف العيوب
    ‎Vo‏ القحفية الوجهية ‎of craniofacial defects‏ 2116018100 ؛ تحسين النمط الظاهري السنخي السني ‎improvement of dento-alveolar phenotype‏ « و/أو تقليل مستويات بيروفوسفات ‎pyrophosphate‏ البلازما.
    ‎TY
    و قرا لت و وراك نا (ه م 3 نا م ثم 3 ‎NR: I‏ ل ‎HER 8 le RI Bt ed En‏ قي ‎SRE SRE I‏ قرسا م ‎i‏ ا ‎ BREg 5‏ وزقئزئة وئدة ‎shag‏ ‏8 > م كير رايم م لبا احم ‎He‏ 4 اب ا ا ب ‎EE Has HEN AEE: Den‏ ‎SEE a 8 pl 8 = he 8 od = a u 3 8 2‏ ‎Rd 037074 fe‏ ا ‎OFT‏ ب ‎SR‏ ل ل اب ب ل ا ا ‎fd‏ 703 يا يا آلا م ب ‎[EOE‏ تم ]3 دن ا ‎QE‏ ‎Go Ed Son E‏ ل ‎Sak BE BoE‏ ‎Re od Bm Boa fe EER Bad‏ ‎EbEd BREE RRER SRE‏ ةذ م لم يح زم رح ليو الا اح ل ‎LY Ell fot‏ يات 00 ا ل ا بل اانا ايل كر با يا با يم ا ل ا ا ‎RHEE 0 oHs‏ ممقققة لتق ‎CREE‏ ‎I] CS I SESE‏ لم »> وي ‎BoM SORE‏ ‎Bopdle sug‏ وبق قبا انال با ‎fa Th‏ زات با ‎Ba Ph‏ ا وما ‎he SE‏ ا لا يا ‎LER gb‏ ل ‎ER‏ جا اليا الا ل لحا الي ‎uy‏ ل ا ل 3 8 ‎Be Ss‏ ‎Re EE MOE OD‏ أ ‎BOE M0 Moma‏ أ ‎gn‏ ‏ا يجا ‎RRS‏ ال ا ‎CER DA FRR co J RS pO rs‏ ‎weg MCLE Dy Chel LX i‏ بد ‎Somer‏ بد ‎RL OF A]‏ به اا 5 5 ‎Jefnk GE‏ لد ذو 245 لل وا قا 5 3 ‎BH ET = PRU‏ الم ال نا نر | للا أن بام لاخ ‎Rg‏ خا الج واو ماج ماو وق و0 قو تق ‎Pt‏ ب ‎i‏ سن ‎id oe EE Bh‏ كا ىا الا لب ا إن لا رن ا ا ل يا ال ل ‎Es Ry 2 ba bu 5 i 8 i ka i Be 8‏ 8 ب 8 ‎BR 8 3 bs i‏ = 3 ب ااي يك اي امع الاي يي ‎Rl‏ اما نا يج با ني ااا با 9 ‎i Ei i] 8 8 Bl 5‏ ا ا اا اد ا ا ا ا ا 5 8 ‎i‏ ‏ل ا د قا كان نه قله كات سق ل نان شي لا ‎Rd‏ الا إن" نيا ان ابت اع ‎ol‏ 4 احم اله جا الم ا اح الا يما بم الم ‎1d 0 8 8 ka‏ 8# بق اعم 8] 7 8 - يوان قا 2 ‎i ro] BR‏ ل ‎RE‏ جا ل عات نلا قي - ‎EAE EESdN‏ و ‎Rule Ed fal ed ROE‏ ل ‎Bel‏ ا ا | بم را حم ب ‎Cry‏ 3 بل 85 ا ل ‎oh‏ حا ل يغ راض ‎B DEER‏ م ‎TR]‏ 1 اد ال لد 1 و5 ‎pe‏ 4 8 8 بر لقا به اي ا 5 ‎Mob wg oe Ig‏ 8 د ا ‎ih‏ 0 58 8 ل 20 9 2 ا ‎RE REEVE‏ مر 2 بط + ب ل لسار ب ‎Copa i‏ ب ا ال ‎Go‏ الا الا ل اع اسان اله ا ا ال ا ا ا ‎pRESd gREd A‏ قيلت وق "يقي ‎Jhb‏ ‏5 ا ‎RE‏ ل ا ب اي أي مراع و ل م نع الا للم حر اج م الجر إن الم الا ا ‎oe‏ حا الم ‎OF‏ ‎BEHELD ow‏ لداجي ‎SHUGHS‏ لتأائعةة ‎Domed‏ ‏53 جلا م لي ‎He be‏ م اا ‎OF‏ ا 3 ‎te TS Th‏ تق ‎ERIN RET‏ ‎NA 5‏ بن نا لت ال © ل ا ا و اضر جا اال ‎OE BEN‏ ‎ALD NE 8 LY‏ أ ا ل ا الاي ال ا ا ‎HuhagH Lhegd RRR 9‏ لوا ‎NEGES‏ ‏: 1 م إن 2 ‎fd On Sou Be CF Ww nr ped REBAR‏ 8 0 4 م ال ‎hdres‏ قطئةة ق#ثدققةء حدقا ‎DEERE‏ ‏0 8 ا نم ال ‎Fed‏ 5 سر ‎MOT‏ عا لم ‎el‏ يم ب ‎LE‏ ا ا د ‎Ba Bl Beis 8 4 8‏ ا ‎el ERE‏ حم جنا لعا ابح تل م نا لعا »م 4 ‎i‏ ا 3 ‎ox By 5 i 8 = br‏ £0 اي 3 = 0 £4 الي 8 5 5 3 8 5 3 5 2 ‎ERR 10 gd‏ 50 مرق لل ‎GEER:‏ ‎Aon‏ إلا 3 ‎BOER‏ لق 8 ‎EREDEHT BEDEHYS Bode‏ اا اي 3 انو ‎hg 0 i ok BEE RE gap EN‏ ل ا با 5 اي ‎b‏ ‏ل 4“ الأ بح ع ا ذا ازج وز يوا اجن الحا لما يجا سا م ا أ اع ‎ae RE‏ لي 1 8 ‎pe‏ ار اك ‎SY‏ با نه عر را ا ‎NI‏ اح اد ‎pes‏ ل ام ‎Kom‏ + ‎es End i‏ 3[ جا ‎be‏ اي ‎Fer he JF‏ جا اا ا بط ‎fe py Dy [= Bod SR FA‏ £ يي ‎HH‏ © ؟ 1 ل ا ماي بم ‎DT‏ عد بمج جح حم تي ات ما و جا ‎LC‏ ‎Boe il gH +‏ 5 5 بق ا اله الاي ‎SOaBEEE OOPS HEE AER wl Eh‏ ال يف ‎Hae‏ الا سج 2 ‎Ql RUBE‏ و ‎AREE SR WREEan‏ ‎UR LE‏ و ااي ا ل ا ا 3 0 ال كرا ‎DA‏ و لو ار اذ ا ‎Re‏ ‏ذل )3 ‎f9desd CREAR JERE‏ ةل مادق 3 اع ‎km‏ اال وا م ال الم ‎Da‏ با ‎be‏ 3 لم لا بنط كا ‎Goel ba‏ با وم ‎Goel DUH‏ ‎Ck‏ 8 ل ا لا اام ام ‎[RAR‏ حا إن لما © 0 ‎EI ry‏ ا أ ان 4 ‎Tb‏ وا ‎wl They‏ 4 ‎BL Ip ca hel § K‏ 5 تم لض ثم بط ل حر ‎cS‏ نملك نط 0 و بض لت يا 0 لقاو ققالة ‎godEs‏ قوق جات ‎CARNE‏ ‏نر اط ‎SHERRY‏ الا ا ال ب ل ‎CT‏ ان ا أ ل ا بلا ‎REE‏ حا ال عم و ادا ل ‎SER Sable ad 0‏ م ‎was‏ 0 ا لاه قا ل ا ا ا لقند اانا ان ل نا ا ‎a‏ 8 ل لتقا 1 لاج انها لب جعي ‎RS‏ كيه ب آنا ليا كر ‎REE‏ نت ارخ لات ‎Bp Rad Ob odd‏ 0ك قت »د ‎eRddED esos‏ ةي - ‎RE ReRuw 9 =‏ ا ا ا ا 305 ‎Son 2‏ اسع 3 5 و ووجة ‎BEM‏ 5 5553435 ‎ti‏ الام ب كك ات 38ت 1 8 ‎fx DLE Ly‏ ين اح أ ل #] عا ابح ااا ب ا ات يد ات 1ع ل لا ار أ أ ‎ICT‏ يا و و ل يواح اق يا ا ا ‎Soe‏ ‎Ed 3 a i‏ ا 58 ~ ‎bd pl‏ 4 5 3 ير اغا يط ان ير ار ا يط ا | ‎RR i‏ به ‎mo will‏ ل قا ا 5 ‎oy‏ ال ‎LO‏ ل اد ا ‎Por‏ ب زو بأد ب يا ا ‎IN RC‏ ب ا ‎(LE‏ با اجا ا ا با ما + 7 لد © وم يا !ا لا ‎Ba 8 vd CR CON‏ 7 5 اج نا نا © ‎oe ERE CUT J VE J EN CI CI I‏ م ‎qn RS‏ ‎Seg [| Rl‏ يا نط 0 با لي ام ال ‎alo “PR Seta‏ ا ب ‎Wok aI‏ ‎sRpRdE HERES GopEE op 5‏ وتقاةة ‎Abad‏ ‎ol 0 & SA pe BENE RARE Sn w [i‏ يل 5 8 ‎SIRE | RE‏ ‎i‏ ات و ل م اا ال م مد م م ا ‎Tol‏ ا ‎el tn‏ ا ‎ISR Ba‏ اب 2 ا ال ‎Sa‏ 13 ال ايا اي نا لا خم ما ليه لها يا لا لك ا ل يد ‎TI‏ للم ب يا ب ‎fe 8 5 2 8 1 5 5 2 i 8 i ol &‏ 8 8 8 سر اب ب بو ‎Py 8 Hi 2 & a [AL‏ | 5 ‎dew LEN ED REC 5 oo‏ 8 ال لخ ا ال ا ا 8 ‎Lond BY‏ ‎id foo BU mend fal BR) and Teg RE onl ly Bh nl bye Ew‏ ‎By iQ Bly a 8 3 8 3 8 = ¥,‏ لد ب ل ‎YE‏ سج با ‎HS Bh) aff‏ ال ‎Lewd ada dn a Balm nb IRENE JBREH YE 8‏ ‎fH 1 3‏ :13 بلا بع ا لل , ب ‎ED‏ ا يتل ما ا ‎SA‏ ايج لم ‎Sa‏ ‎Ba Oh‏ :80 505 3080 نئي ‎Keio‏ ‏م و الس م يي ىل الاق يت لعل لق وي و الس أو يي ا جات ‎HE‏ ‎on 8 i‏ ا ا ا ا ا 9 ووو وق الل ىك ‎Ho Eh og Ehobad Ei aoa EE Rang l © © BE‏ 8 ل ب اا 44 ‎HEHE‏ 8 الم مه ا : امع ا ويل ]<> 5 ~ ليت يا اد اانا ارا ‎BR fe RO‏ ا ال ‎yf‏ ‏و لو ق50قة 8508 تييع ‎(BUBERE‏ لقوقةة 8 55 ا 2 لا لثم بق ‎ER‏ ذا لمر ‎Dy‏ ا إن ‎Ria‏ م يتا ا 4 ‎[SOR‏ ‏د 0 55د 550 85300 5 5303-0 اق ‎I‏ أ ان الي الحا نان ااه ا ل أ ل آل بن اا ا ‎FR) wo‏ لم ‎wld‏ الو سن عه امه مما و ‎Boh‏ انه ‎god‏ ‎ER‏ وق ققةقةة قوق لج قدجءة8 ‎TANESY Abend‏ ‎td 5 oF ex ~ Sa wl‏ = ب ‎Yn 8 "a‏ ب 8 ‎fu t=‏ يا حر بلط ‎id fu‏ ا بنط عا ب اا م با الي ‎ab B 8‏ لجع ‎[ENERO A a FEE A J DESERVE‏ 5 ل ل راج 8 ا ا ا 8 ‎RU‏ 0 اند د 8:0 ‎®d |e one‏ كت ‎De‏ ‎RE Ei Ci ed eels a 0 8‏ ااا 8 : ‎ow‏ ّ ل 8 ‎Fe‏ ا( ‎a Sw, toed ed edo‏ عات لع ان ‎IE i‏ اعد لبا انا اجالع لإ احا بم ايم دارج ‎Now o 0. of‏ 38 ب ا اح 8 ب اد جات 4 أ تت وات 7 ب ‎BS 1 PN a‏ ‎Jf 5‏ دا ‎a‏ = تم رض ‎Ts i wd‏ ليث ات ‎To‏ احم حا اد اا ‎fet SUNY of [Rss‏ ‎ES‏ 5 1 0
    اجات ‎CELT WT Wp |‏ ....- م في جل يط اليا ين ممعم ا سا ال الي احج :ا ‎bis:‏ ‏ٍ الست ل ‎rE ERE TY‏ 5 ف ‎TREAT ree‏ 3 3 33 إٍ يي ‎[ETS TC SY‏ 3 ال 0 | 1 ‎i i‏
    ‎a. sR‏ ‎ETT ET LLEE Fs (ef‏ ‎FE SERINE ACLS NTNEHAIS ١ ١‏ ‎ee TERA‏ ‎RRR =‏ = ‎Bere sowss J‏ ‎AME ١‏ يوم الاي ‎ptr‏ ‎SANT‏ ‎aww ees SUNY‏ العامة ‎CSCS‏ | | } } ‎i K 1 0 ARK 5 0 : NK‏ 0 1 8 ال ‎SASTRY‏ ‎ERIE 5‏ ‎eras Shs Cello‏ رح ررض حت ‎Ea 7‏ ‎Bw 3‏ الي اليب ياي اي ‎fis‏ | ا ل ل 1 | المي ا ‎Pe 1 E‏ ‎BST‏ ‎SRM RNS‏ ‎FT ERTL LEP ore‏ ‎rm BRL‏ ‎SAREE NE‏ + الج بحا شت شل ل ا ابيا “لي كبا اليم اير انيد ليد يرا ‎Tl‏ ات ا ل 4 ‎Fans‏ ‏ترا ال ‎ee‏ دع ‎١‏ ل ‎Cr ERR RE NR‏ ‎FED]‏ اليد لكر ‎EEF ETE ET‏ ‎i f 1 7‏ 3 و لكا دا اللا ماع ا ‎SOD‏ لاا ‎SRT‏ له متايه ‎SNE EP‏ يي ‎phi‏ ‎ng 3‏ ب" ‎es‏ ‎(ore‏ ل ال ا ا ‎wee‏ | اح ا سس 3 ِ ال د جد عد اه" جد داه عدا د عد ا اك ين ل ‎[ores‏ ال د ‎a‏ ‏لدج ا ا 2 1 اا ‎SPEIER‏ ا ‎fn ST‏ ال ال اتا الا © ا اي ل الات ان ف الت ‎EERE Aa‏ ترفو صر في لخ اع ‎wep‏ ل ‎er REF XT‏ ‎١‏ مج ل يوي ‎Bnd RENAN 1 3 R X 1 3 REE ¥ 3 1 x 3‏ 0 بي سل سس ب 8 ~ : ‎t‏ ‏3
    ‏.0 8 3 ¥ لي i] + + ‏زف( وتيا للد المح ا حا‎ ERR NEE se 8 8 RN 8 ‏ا‎ 3 Xx N = ) 8 : 8 XR { N 8 3 ‏ممخخ:8جًاًجْ-8!ح<ا+ه-ز0ذ-د .سس صا سيت ه.ا ليسي ا به‎ 8 : ‏م‎ ‎¥ RV RY 8 : N 8 3 py nN 3 i XR 8 8 a . x 6... ‏عم حص‎ EE ‏مسحت مت‎ = 8 TR 0 3 EN 3 4 1 8 “8 ; DEE. 2 3 8 8 pi ‏اه‎ 8 8 8 8 bY * ‏رتل لل ال ال الم الس سس حت حم م سس ا‎ Rs RR ‏ب‎ 8 8 3 8 gt 31 3 N 8 tt by ‏ع“‎ 8 1 ¥ N Re o Tv ~ RR ‏ام‎ ‎2 0, 1 ‏ب‎ ‎ٍ ‏ا‎ SEE ‏و ال‎ = H RS : 8 Be { NS ‏ا‎ 8 3 bS BS . 8 by WW 3 8
    ‏.أ‎ 3 Ww 3 BD 3 ‏ا الا ا الج ل ل ست ا لالس نا قي‎ ‏ئ‎ i 8 “8 8 ‏د‎ ¥ py WN 2 3 pS oy aN BN ; 8 2 : BSS k 5 ‏ب‎ 1 a » 3 po , ‏ا‎ 2 AAA ‏امي ا ات لاا مستت م ل ل لا ل‎ - od 3 3 ‏مج‎ 3 2) 4 H BS EY: i 8 NY B 8 8 8 8 3 8 A RS p: 4 ) ‏ب‎ * BR A EE EE ‏اح 8 ال د الح ل‎ ‏ع‎ i X 8 Pa 8 [ 3 x oe ¥ “8 ‏ا‎ ‎ٍ 8 8 ‏ال‎ ‎¥ bY 8 1 4 : 3 : 8 ‏متحي :متمد لت لد لد الت لات لاد التق تت للدت للدم الا الات الات اتام .الا الا تت امسا للدت للدت المح الت اتات ال ال ل ل ل‎ i 8 ES RR BRN 3 RN: : % 3 i Ni 1 R You ‏بسحا حو حك لاح جاح مج لا جح ححا ححا سح حم مح جحت جاح جا مسح لست الت لد حا لم لح ل لا‎ Re : i R R i ES 3 i RX 3 LE EOE ‏ات ل ل‎ IRAE ERIE NEARS EA AEE RECEP AEE NSE EEN EEE OREN = SEN ! 4 3 : ‏ف‎ ay kp 5 4 35 13 5 3 ha £4 5 2 v El PFN ERP ‏م :كبا عجعياء‎ Wi
    — \ \ ‏اج‎ ‏ردي‎ ‎a, ’ ? en: —— i) ps 53 oe rove
    4 . ‏كاذب‎ ‎3 > = 4 ‏ل‎ p= ‏قن‎ J | ‏كجم —— اح‎ li dass Yad i ~~ 3 * ‏بوم 3ج‎ asdf ‏يك ونير‎ x Ty -
    A, . 7 i yd - 5 ‏جم هه‎ REET AER ١ ‏ما‎ . he y ‏بسح ااا سر‎ a I: ‏أ‎ 2 - ‏اج ب‎ + iY Yi ji Eh ET) ¥Y ‏(بالساعا‎ po ih ) Ped & ES + ‏شخل‎
    -١- a « FAI ‏جد “ يد‎ 75 rR : + Sel YG 43 ‏لا‎ wa ‏ما‎ ‎8 ‏ا ا‎ ‏جيبلا‎ ‏د‎ I 1 ١ i Nf 1 Pood A nr - / \ va 2 | f= < i EF, 3 ٍّْ ‏بت‎ ‎/ ٍ LN / | BE a / Io 4 d — ‏اع‎ ‎an, % : 1 ‏اسيل‎ ‎0 kL. or ul 2 - ‏شكل ه‎ reer J eer ‏لاا‎
    —\YV- LVL-RECAP ‏معدلات البقاء بعد العلاج ب‎ ‏جد عوطقم الس«‎ ‏ادر لل د بس سم‎ ‏سه‎ DVL-RecAPL ‏عي‎ ' ‏و‎ ad ‏ماج‎ 3 1 i= £2 324 | : 2 ‏ا مم ا ا‎ a 1 ‏ض‎ ‎= Sa of ْ 3 ‏تدا‎ ‎he 0 * 5 * ‏ا‎ ‏أيام مه الم‎ ‏ى| شكل كا‎ ‏الت‎
    -١ ١ (0- ‏المحم ل‎ Tha.
    Lo 1 ‏ا‎ ‎ha — RRR: Nae LL a La Fay LL ea | LL Ie ‏ااا‎ 5 SE ‏يا الما 0 الا‎ To ‏وب سس‎ a SRRRE : os : aaa age = I | Tn aa = ‏ا ل‎ SREY > 1 RRS. - ahaa Mont : Nh. 1 ‏ا : ا‎ : Lee 3 © ly =~ NSS. . ARR RNR: 3 RRR RRA ‏ديا اج‎ INARA RAN: — ‏ممم‎ on : ; 0 3 8 i 2 < | O La ad 1 Ww ‏ال‎ ; 0 ‏اا اج ل‎ . : 7 ‏لسسع‎ on j 4 é 1 ‏م‎ = 2d 1 § : 10 eed | ; Th = Fa: 1 : i al : XL pe : 1 1 1 ‏أل ب‎ 3 Bes 2 3 ‏لمش لد د‎ 1 : 1 3 : ; x ] ee Se : ‏ليد‎ ‎١ 1 3: pc : : Th ; EO : RE <TH ¥ } <3 J ) 3 ? bt 3 Fe 3 pi > La ‏صب‎ ‏حو‎ [PRN ir a ‏ل‎ ‎i 2 ‏اج الس ا‎ AEE ‏لمعن اسن‎ 4 - 0 a ~ rt bs ‏م‎ ْ He ‏اح ال‎ 1 J i ٍْ Ha {3 ww ] : ‏الاق‎ 3 oe _- : rad 3 ‏أ لج دك‎ © ‏لب‎ wR | Fores J ‏ب‎ ‎5 © ff ‏سي‎ © = wf : Po XX ‏أ‎ ‎aor WEE ‏ا الل‎ RY ‏ب‎ = 3 1 3 NN : a ab wi | ‏اد‎ ES to pus 4 agg nN ARR ‏لسن‎ ‎KB f En | : ‏ب‎ a > 0 ‏جح‎ ‏السب‎ : 3 3 pang £2 SNE = 3 : ‏م ا اي مما‎ ‏ع ~ سجر ةا‎ : SRE = FoR ‏مه‎ ‎1] 3 CORR TTT ‏شكل +“ ب‎ ‏جني جو ع‎ ‏حا‎ gmt {ell Cov 1 Fo TvVY
    -١؟4-‎ ] ‏ال سحت ا ا اتا‎ : ‏ايا | رمم‎ | WT AAA AAR AA HNN 8 aaa FY aay NEE NF Yaa EN ‏ا اا ا الل" ااا ا‎ ‏و ا الى‎ TRE yon i NE 3 TN X Na : ‏لي‎ La > an > HEE Tan ‏ا‎ 1 8 ‏ب سر‎ > ١ % i ‏ب اال‎ Aa ‏ااا ا تاها‎ a 0 ١ 2 2. TEES 0 ‏يب‎ ‎| E ‏ا‎ = rT HEE EE REE RE A EE A a aE Mm. i ‏المج‎ NE — _ oe ‏ا ا‎ CU TEE EEN a Ns a. MEY - 0 + TERN TEN 8 8 TER 8 Ry rR -- TL. = a8 NG ‏ا الم‎ Ex aN | TN DN =. - J = ESO ‏د‎ ' - 21 1 \ ] “ Fr yr 8 ‏ل‎ J i : 3 8 ‏ألم تن‎ |- | © a ‏بلي د‎ a. 8 ‏لبا‎ 0 a FF . a EJ SR LL RSE 1 aT 3 8 ‏ا ا 8 ا‎ 3 3 1 gh 1 NN ARR Ry 3 01 i= (IE ‏ااا 3 ا‎ SEEN Si EE . 8 ‏ا‎ ‏اد ا‎ -s oe ‏ق‎ ‎cd ‏أ‎ | NY ‏ل اا‎ 1 i Ll . L 4 ‏ااا أ أ‎ 0 | | . vi \ fT LE. i i . LES BRA ‏ارارق‎ ‎LI ] ‏ا‎ Nl NN Fs =» ‏ا ا‎ TE = 5
    H.R EE aa ‏ا‎ ‎{ER Eo 0 Er = Js ES a ‏ا‎ ‎A EE ‏لز ا‎ 4H Nu Nn NY Ll = 0 | Ff = oH aa ho | NL 1 Fi ‏ا‎ ‏ةذ | لب لوا ا‎ mE * | EEE "a | ‏ا‎ ‎il a i aaa TEE . I Na ER Rat i LL = LL Lo 5 ‏د‎ Nn 1 ‏ا ا‎ 0 ‏عن ان‎ TENE ETE. ‏ان‎ ‎iy, Le Rr
    ARE rrr 168 i ii SEE 5 SR : 60 : A = pe 1 oe ‏ا : ل‎ rp -Re 4 34 . + ‏ا‎ pS = NL re 8 LV <5 ‏يه‎ Na LL = 4 Zeon wR £ STE re EN 8 3 3 Ca L Tn ‏ل‎ ‏ع‎ = _ : 9 - ( & S$ : 0 LE = eS EER DR AER FRR RRA x 3 5 NE 3 nN 1 § : | LV: ‏ص‎ T= a E 0 At I 1 Ei HH : Se ‏اا‎ NN. 3 ‏ة‎ ْ : td HEH J RR BR 3 ‏ا‎ I A ‏إٍْ‎ Lo 1 1 8 8 nn 1 ‏د ل"‎ ‏أل‎ i Et AR \ : LL J “4 i Hy ER 3 3 HER SE Ne ْ : 3 | (s ‏ل‎ ; LL . 0 ‏ب‎ | a aN ; FHA — E i = ‏ا‎ ~~ Bi 1 an ‏ا آذ بي‎ so i 8 NR TE BE 3 LD i FE ht 1 3 SE NE £7 gE . Im ge \ E . 3 . Nn Lk. Nd Eh ~~ Fd +i SR FOREN EN CARNE 3 EE 3 + . Na ia FEN aE 3 GE tN
    I= . 0 ‏اا‎ ْ 0 ْ: I - : SAL > AQ 3 Lo RE ‏ض 0 ٍْ ا > ا ا‎ a Po VE > ‏ض‎ py 3 4 EL. NJ a SR i SA il 0 7 i 1 ©“ i SEER NS 0 pe Fi 3 SR ‏الاب‎ ‎8 1 San 3 ‏ب‎ NR 2 88 a I Nr 3 3 i oo \ = i es ‏ا‎ 0 Se i - 0 SAN ER EE I . 1 ; | A ‏هه‎ - ْ fg ‏يي‎ 1 x ‏د‎ : {1 Sa ‏اا ا‎ Nd i = oo Bl 1 ‏ا اد لوو - الا‎ ‏ض‎ 7 - . > - ei a = ‏ااا 3 ؤ‎ > Pa Pe 0 i i Nh Ne IN LL Nee ba - ‏سا‎ of ‏مسن‎ 88 an N 8 . = 0 0 ‏اا ا‎ Ba 11 NEE 2 3 a Naa NL . Sa En ; © ‏ا ا ا ان‎ 3 i } i A LL No RN RRR Na an = =! 2 Nh \ No f Nn NE a NL = ; - 1 ANY ER NEN 4: ‏ا ا ا اا‎ : , . 7 nn ) a Xa No Sa : 1 ‏ل‎ HE aE CON ND ES THIER ARR ER : ‏اا‎ ‎: 4 1 5 SN ‏اد ااا ان ا‎ - . i ‏اا ا" د‎ NN Na Se Bi lo Sha Li = ae ee ‏ؤ‎ | 3 ec ‏د‎ ol i = ; : 2 a = es \ LL rt} 42 ‏اا اا‎ = 5 ER IR \ 8 0 ‏ا اا ا‎ Al an Nii NN UR 8 ‏برا‎ nn - — AN a ‏ا‎ FES No 8 ‏ا 0" 0 ا ا‎ َّ ‏ا 8 اال ال إٍْ‎ 0 1 = § FE . Sf HE Vi EL a4 1 ig I N a | NL 3 SN 1 ‏أ‎ | EE a 1 ‏ؤ‎ 1 H B = NN i 83 ‏سسب‎ ‏أ‎ 3 11 TT Y 3 ‏سي‎ ٍ EH | 0 NL h : TR ry : | ‏لج : 0 كد‎ FRX § ® | 1 ER a aN rere he § ‏ال‎ i FE ‏د‎ a | 7 3 0 ‏م‎ + EE Nw ESSN OR ES 2 ny i al 0 i = | Tf [a nn i i NE nN ‏إ‎ ‎| il Es 3 NE i LL Na : rr Ra ‏اا ْ ب‎ = I '" a | 0 aa NN Na i AN Hh i | 0 ™ | LL ‏ا‎ 0 lL Lan 3 3 Ra oF ‏ا‎ i} Nan NR 8 i ‏ب‎ ‎8 ‏د‎ i AN 8 3 ‏إٍْ‎ i 3 i 0 FE pe: NaN 8 ae 3 1 ER ‏نس اا ل"‎ BE I 1 ١ ‏ل‎ LL. ‏واس‎ 1 ‏شا‎ | LL oN T | a — = 0 1 8 Ri ‏ل‎ . ١ i | 8 ‏جحجا احج‎ 9 ‏الا‎ ‎| ‏امم‎ ‏ير ضيد‎
    ‎AAAS +‏ اج ددج لاحت ‎OR a : : :‏ تج راجا توح ات ال اا ‎Re‏ ا نا اللا ا ا ل ل ‎SERN i Re‏ د لش ا ‎NE 8 85 ed‏ اح الا ‎LT BR Ho ET =‏ الوه ا ا ل ا 0 ا ا
    ‎NE. Na Ea SE Ar Nhe of Ne 0‏ اا الام حك ادي لايس ااا ادا ل اله اام ‎gg EE ER‏ ل ‎Re BIR nn RE‏ ل اه ا ‎ARH‏ ل ا ‎SHOR GE YR Ea had‏ ‎go ;‏ ل ا ا امن لمجي ال ‎RR‏ ا ا ا ‎Sp mR. SRK‏ ا ‎ERE SEER 5 FT eR‏ ا ‎WTR REE RR‏ ‎BS BE a 304‏ # ل ‎NEE ae Bao i NR‏ ‎IE Re EER RR RR ERR‏ ‎HE d a‏ لي ل ‎PRI RR SER Bo‏ ا ل ا ‎Bod So‏ الحا ‎fe Bi Et Te‏ ما ا ‎Bae‏ ل ل ا ‎EE ERS SR SR iE‏ ‎Wad roa‏ اا ا لها ‎li‏ ل ‎SR‏ اد لان د يي الك و ا ‎TR‏ ال 0000007 0 يا ‎HER ae SO ENR‏ ‎RRR TN CR RL a BI Bet gd‏ سر ‎RRR UNG TN aE ER Nh 9 RR‏ ا ‎pl Se iio NNR‏ ‎i aN Si STREET REE Be 2s Be: RR SRR TY ar RUN‏ ل 8 ‎CR‏ اس .الج ‎Lo BRR ae A RT‏ الا يي ‎i‏ ا ل ال ل الل اا ا ‎TERE ay RUNNER‏ ‎Tae‏ اج ا ل ا 3 الا ‎Raat RRR‏ ‎ated‏ لا ‎y oT‏ كا سن ‎EEL MRE NA‏ اال ل مت # مد ل ‎Fortin Go‏ ل ‎HEE i‏ الج أ ا ا ‎ab ML Neal eee‏ ا ال ‎SEL‏ ا ل ا ل ل ل ا ا ‎a‏ ل ا ا ال ا ‎FREE‏ ‎See FTI ER en He Re i oa 1‏ ا ‎UE SEE NEE nnn OBR FS Wan‏ ألا الي 0 55 ل ل ا 8 ‎RED: Ee NEN‏ ا ا ا 8 8 ههه ‎a I SI‏ الجا اه د ا را ات ا ال ا ‎BRR pa‏ ل 0 اا لت لا 6 ‎HE RN NRE Se‏ ل اا لا ل ال ‎bigs TR ERR a ety hw‏ ل ‎a Lo‏ 5 ‎Be Re Shed 0 cA‏ يت لد 8 ‎SR ON Re ER RRR ada‏ ‎Thos ENTER CERN Re RETIREE EC LS‏ ‎Rh ERNE SR BA RR Raa Rt an Lay‏ اج ‎RA EE‏ ‎Sn Ey‏ 0 لد ‎EL nist Saal ae Beige LL oN A SEY‏ ا ‎RR FE NNR a ea‏ أ ‎SEN RD RR HR ad Fae‏ 0 ا 0 ‎a‏ ‎BER RRR RARE Bans RE. SR a‏ اال ل ا الى ‎Re‏ مادا دن ‎MRL‏ اي 7 ‎SH‏ ‎ea SR 5 CRN RE ENE‏ ران أن ا ‎I ER Ra Tee‏ م ا ل ال ‎Deol) SHR Nears Be Nas EEN RR Naa NN coke Sa‏ ‎BER NE be NES SR‏ ‎ay ay 1‏ ل يا ب ا ‎i an CR LE aE SR‏ ‎EE RN RN SR a a‏ ات ‎ER‏ الا اب مس جر ل ‎SRE be NN Cg Sok‏ ل ل ‎Higa dln‏ اها ل ‎Fe BE RAR‏ اللا ‎EE RR RR SRLS HE‏ ل ل ‎sa CT Tham TE a‏ ل الا ل ‎i ey Semis mE SEE oT a eo Gl‏ ‎Se‏ ل ‎ry RRA ASE Fea I RR‏ اند الب ات ‎NA‏ ا ‎WaT‏ ‎rea]‏ و ‎SLR ei od et‏ ددا اليا ‎Ea‏ ل | ‎fever Netra Ne SE RE ea‏ § > 8# ا ب ال ا 0 ‎eee‏ ل ‎Reh Sn iE‏ ‎HERE Re Ne SEE ER RT RR RRR NE el‏ : ل 8 ‎Pe‏ ا ا ‎Ta‏ " ‎Tu dan‏ ال ل ا ل 8 ‎WY WE‏ ‎RAR Ee Te RR RY Re 0‏ 333 ا ‎UNE‏ ل ل ل ا ا ال ا ا اا الت ا م ا لي ل ‎SRI‏ اا ل الت و الت الا الات الا ‎Ng SA SRR‏ وو م 2 ‎a iE a iE‏ كا اا ‎ta LR banat Raa NE aa EY‏ ‎ea le ae SFB‏ ا ان جه ‎REE NE eta‏ ‎Lad aes ante 8 Sag‏ معي ‎RETR RE‏ ا ‎RIE NT‏ ‎TR RES ER a Rel 6 LL ae‏ ا ل 4 ‎de Se SLR TE ae‏ ا ‎of i ORIN GR‏ ‎me a EER Je]‏ ل ‎Riana CNN EERE TE RRB CI‏ ال ال لشب م ال ‎SE a‏ اح ‎SEEING ORE‏ الا ا ا ا ا المج ا ا البو ا مك ا ا يا اح ا لا و ا ا 1 ‎vw 0 RE‏ ا ل لع ل ا الخ الها ‎LD a‏ ل ال ‎sadly‏ ‎Md 8‏ الى ئ ئسي لإ ‎We han‏ | ري ا ‎Na mo‏ الي ‎CEN ora EERE a‏ ل اال و ا ‎a Cod‏ ل ‎BER‏ ان ا ‎EER‏ ل ‎That‏ ‏له ا ‎ay ; ah‏ ل با ‎I ER A CREE i‏ ‎Fo Bry‏ لمي ا يوي ات انا انا اش ا ل ‎dE Sy LY‏ 0 —— الا اا ا ‎EE Ee BRA NE AN Tl ar Tui‏ ا ا ‎Fe‏ ‎CARE Nae SRE 0 EE NE‏ الا ‎qa‏ ان الس ‎FO‏ 8 ا ‎bon a AT Some oN TH SRR RINE.‏ اال جيه اا ا ا ل الل لخي © ‎te 0 Ea eS eR‏ ل ل ل ل ‎Ra aaa Naan‏ و ‎bs HIN La‏ ا ل ‎fs‏ وو ال ات ا ‎age‏ لش ا ‎Marwan Teg‏ اي ال ا" ا ‎aa‏ الج ‎ae‏ ا ‎Soi TR‏ الال ‎Seif ae‏ ااا ع لا ل ات الا ‎ee‏ 0 الا ا ا ا ‎ve aE Ne ERE RRR RRR‏ ا ل ا ا ‎ay‏ ل ووه لاد ال ا ا ل ا ا مو ل 6 ل ا ال ‎Ey NAT TR SHEEN aa BN Ma‏ ‎THE Sa Daal Se RE naa CRE Ry BEE RAR SS ADS et‏ ‎ER 88 RE RE RR a as BR‏ 8 ا ا ا ا 8 ‎Ri Er EE A RR RN RR AE AR‏ ما ل ا 2 ع 0 ا 8 ‎Neo al‏ اا ا ا 5 بد اا ا اال ل اي ‎Shin ee 08 wha 2D a Nea wT‏ 1 ‎TEETER‏ لالم ا ‎Wa SRR REN I A‏ ‎CHEN‏ ال ‎an i RR RR‏ لله ال وي ا ا ا ‎ANE‏ و ا ا سس ين الس اي ‎a. a oe‏ ا ل لاا ا ا ا اا الابما لدت بمج ا ل ا للم جر ع حا ل ا و لد ا و و ‎tea Ry Sim A BR‏ ل ا ا ‎as‏ ال ‎Weg ane Nhs EE HE i ba ae‏ ‎WES ToT SERRE EERE‏ اج ال ‎sg Sian TER‏ لال ‎Wola‏ ‎SR INE SR RR Bas SE Tato Ne‏ ‎ae: AEE i‏ ل ‎NEN SAN ER‏ }£3 ‎Ne Satan Ne Aig a‏ ا اكع ‎So‏ ل ا ل ‎TRESS‏ ل ل اد ال ا ا ااا ‎a‏ ا 0 ‎Sh‏ اتا ا الما ا ‎St 1 Fon aN TENNER pa 1 :‏ ا ا ا الم ل ا ‎Ta‏ الت ‎ae‏ . ‎Ta‏ ل ا ‎Ny HE ay Ea ER‏ ‎aa‏ الاك اا ااا اليد تا ‎a‏ ‏ا اي تاق ل اد الت ا لأ ااال ا ل ا الك الاو ‎Cnt SE No pa‏ = ‎SE SERS ; ae HS ay‏ ههه اا ال ال ال ل ا ‎BH SE aR at ii RRR RE a A A Woe A‏ ‎i‏ ا 0 ‎Wr Gel RRR i ER RE pa Ra‏ اباد الح ‎Ea By‏ ال ا 5 ‎Haw daa CERN eT‏ ‎ae‏ ال ‎be‏ ايا لض ا ‎thee. ae Wm ER pase‏ ال ال ا # ‎EE‏ ‎a‏ ل ا ‎now | aang Fe‏ ممستدرهي) ‎geen nad‏ اللو ‎oan NHS‏ الج ‎IATA NOWH‏ ‎BES MES EEE SAREE TCE IONE Jl Be LAR bales‏ ‏اوج ‎v‏ ‏ها ما
    -١7- ‏حجر العفار‎ : ‏م‎ Apt Moy | [r—-1 WT ‏جو اد ادا إ‎ + ¢ > | ‏م تج سم‎ Eat ‏م‎ pe { => I. | ‏سسا‎
    ‎By. + | | ‏الا أي‎ : iy : = 3 Ea mE 0 mE : 4 RE RR © +0 ‏ل إ 1 ل‎ men LVL-RecAPS LVL -RecAP 656 pda pha ‏شكل بيه‎ Saket ‏الحجر‎ ‎ns ‏زوم‎ ‎| ‏.4سو(/1(101(««س«‎ TE me ‏زا‎ ‏ا‎ ry ‏ا‎ ‏ا‎ PE a £ Lucy 8 = : 3 Tod ‏الي‎ T oy ‏أ ا ض‎ BN BE ‏توس‎ we ‏م‎ ‏ا | ا‎ ‏ل لللد‎ ‏يف فطظ اب خوج اط الا‎ 5 ‏4م‎ 53 o ‏م‎ RE ‏برضي‎
    -- « ‏ان‎ ‎3 = N + 8 So 8 TRAN NE EN “a RN De . Rr SE 5 ‏ا ا 8 ا‎ a No UR LL LL , \ a ‏ا ا : اا ا للا‎ ‏ال ا‎ Ne BE NN NR LL 8 ‏ا‎ ‏الا‎ a ‏ا اا حا 8 ل‎ a Na IR ‏ا 8 ا ال‎ \% RE 8 ‏ا‎ a Ey - DH, i IN IN Red a = of No NY Ne an a Nn RR NN N ‏ا ااا اال ا الأ ااا ل‎ En 8 LL NL LL 0 a \ \ : 8 ‏ا‎ NR 0 ‏اح‎ RN 8 RN Nh AR 8 ‏ا‎ N RR 8 RN ANN : FN Ni LL 3 Na X oo RN NN aa SE La 1 ‏د ا اا ا‎ BN a aa racy NN a NN . LL aaa nd ٍ ‏نجه‎ ‎3 ‏اا‎ a *« NN RD a LL EYL a ON EN - NN : LL 0 2 Ya Nr i ae 2 Sh an LL CRD Na ‏:2ض ا‎ = = BA 1 Ne TUN oN 3 SEIN RRL Ne RR TRAN INN : = 5 a oo ae : 2 P ‏جح‎ ] a a on > NO N RW eS oh LL Yo x ER) ER XD AN NN hs Na RR NL Ra 0 0 0 ٍ
    JR . | : Sa RN 3 a ; NN ND RRR NN NN 3 ‘a Cee oo 0 0 : 0 ‏ض‎ 0 of oo LL NR Th i > = Le NN . XN ‏ا ا‎ Loa vu IR a RA RR Sa ‏ال‎ :
    3 0. ane = OR > NN RR NY NR A NN a ‏ب‎ ‏اا ا‎ RN Nd Ga ON N NER RN Sn 3 SN ‏ا‎ ‎iad N 8 ‏ا ا‎ i. CRON Bis nN 0 fs x 0 : Lo a Fo ‏د‎ NN 8 8 EAN 8 ‏ا‎ ‎i & Vi a a ‏ع‎ aE 3 : 3 : 8 ٍ
    I a. a °F NN - : ps ea DY ‏اال ا ا 2د‎ a a rE Be oo Ya me Co a Bie Ne . a ‘ H |] ١١ ‏ا ااا ل‎ LT
    Eo . Lo Be 3 . NY . Sa 5 | : Ny me i a 1 ‏ا اا ا‎ i a 0 ‏ال‎ a LL ‏حي‎ ‎1 | ho a Si 0 3 Sl 0 ‏اا‎ | LL ‏ب‎ Ra an 1 8 ‏أ 0" م‎ . dH = EER RN as HR RY Sa ‏ا الل‎ hm Ts — a he Soi NE : 4 ‏ا ل ا ا‎ Aaa Na ard E i i ‏لمحب‎ 7 ha AN ! = La FL . ‏ل‎ ‎| NY eon ٍ ‏ا اتات‎ [ae Ln ‏ا‎ Ne LL hy 8 Ne . nd 5 RN RR Ne NAY \ a = on & ‏ا ا هك 0 يا‎ ‏ا ا‎ R 3 x A 8 nN ERR WR x NR 8 ‏ا‎ Ni FR NN < ‏ا‎ RR . uN ‏ا‎ ‎- XN \ oo . oo NN 3 i 2D, \ oe | . i : 3 ٍ TN . . oo a ‏بي‎ ‏ا‎ a aN a rE Hn ) a LL a 0 ‏ا‎ ‏ا‎ No dN al td PN — —_ Va NA Re 8 : ‏ل ا‎ RO AN x vy ff ae 2 ‏ا‎ 0
    ١4- . halt ‏في‎ = Fi P= FEY i 10d 3 ‏بس 2 بت‎ Ha Lo Ll 1 ‏سن‎ ١ ‏ااا أذ‎ ‏ل ا مس ل ملع‎ ْ ‏م‎ ١ ‏ب‎ ‎4 I ‏الل‎ ‏اس از 1 لق‎ ' ‏ا‎ : . ٍْ ٍ 2 8 Lan i : * ‏ل خخ اا لوبت‎ TEESE, LVL-RecAP1 ‏“دري‎ ‏شكل 5 ليبا‎ * Ta Pp 53 : a ‏البمل‎ geo pe ns Pi ‏سم ؟‎ 4 ‏ل‎ JIE ١ ‏سس‎ ‏ب‎ | . | a ‏م‎ i : 8 3 88 1 3 mn 3 J1 1 1 Ti | ‏أ‎ ‎HB == ‏ا‎ | 3
    NEN. ‏[.__ل_‎ ‎LVL-RecAP18 WT & & 9 bos
    ١٠ه‎ k ‏ال = ا اج‎ 1 BE 8B EE SE ss oR. Sic ‏ل‎ ‎=F SiR ‏م‎ © RIO AR 3 RSIS AR RCE EE ‏ا‎ © > BRRRRENAN 1 RRR RRR ITN NE BY ON FF NNN YN fo ‏ا‎ ah ae EE NY FRR i NS NN ‏ا‎ ‎RRR 3 aaa ‏ال ا ا‎ 0 8 NER LL Tea # oo ‏لاإ أ أ ا ا د 1077:0000 5 أ أ أ أ أ ا أ أ أ‎ a ‏ا لإ 7 أ _ أ‎ Nah Baa £5 HE: SNE Lan on Naas TEN REN REE RNR 0 Nm JRE : RE REET ET Nee SNR EERIE 01 ERNE PT ONES REET 1 ‏ل‎ ENE SON ERE TON ‏أ ا د ال‎ ‏ا ل ل ا ا‎ 8 Nr NEE ‏ل‎ SR LN EEE NN EEE TN aa NE EEN aE oN Nh NE EE aN PF ARR LN NR EEE AN FR rE ‏ا اه‎ pte SN ‏ااا د‎ RRR SERB ERSRRRR RRS 3 EINE ‏ا ا‎ 3 ‏ا‎ 8 NE EE aE ‏ل‎ er FT a ee ‏لذ ل‎ 000 1858 ‏اذ ابح د لد 7 نا - الى‎ Esa ON ‏لي‎ SaaS Eo EEN Re REE ‏ا‎ ‎RR NEE Ny RE hha oo oo RIOR N= RR RR 5 ‏ا‎ NEN EE EE ‏ا‎ ‎EE REE 100 ‏ل ال‎ 1 ESO ‏ا‎ ER a RRR ; SANE 00 3 RR ‏ا‎ A ARR RT a he DEERE ‏ل ا‎ ENN ‏ل ا ا‎ ; SN EE EN ‏ال‎ naan LN ea NE a TN aN RN a FE NR ; 0 NL a RRR 0 1 LE ERR ERROR? ENN Bn > ‏ل‎
    ‎i. =i oa ol ISN ‏لم 0 ادا ب_ذ الل‎ EEE EE ENG EE EE RY EEE = a ‏لا ا ل‎ A A ‏ا‎ ‏ل‎ AR RRR EN RRR ‏ااا تان لمم لخ ا ا ل الجا ا ا ا ا ا ا‎ © Re SE a ‏ال‎ ‏ال ا‎ EN Ra © ey Na 3 SEER Na RR No BR ER EN EF AR RR Ry PE RN EN Ea CE RRR
    La . aes] fi ER EE Rn ER Ey Bee. ame 0 ‏شن أ أ‎ TT ‏الس خخ‎ Rd RRR SERN REE BREEN NE REE ‏ل ا‎ BEEN 1 ‏م ا ا ا د ل ا‎ + ٍ ‏ا اي ا‎ RAN a ‏شت ا ها‎ 020000077000 PPR aR ceo. 1 RRR I RRRRERES ERE ‏ال‎ ee 2 : 0 ‏ا‎ : BE A RE ‏ا‎ BE ER 33 ‏ا‎ ‏مس‎ > I SARA: ‏ا اا ا ا ا ا شع‎ ‏ا ا‎ NN ‏ل‎ ‎EY SE NEN ‏ا ا‎ FENN NEE Te I Vie EN ETI RR ey a NL Wai 3 ‏ا‎ a نبب 1 3 ¥ Sa
    -؟- 1 ‏ا‎ ‎: ‏ل ل ا ا‎ 1 ‏ا‎ a ‏ا‎ Saas 1 8 ‏ا ا‎ 0 1 SE TEEN RE a -- ٠ ‏ا‎ ‎1 a ‏ا ا‎ EL a 1 ‏ا ا ا‎ Saas Pan 3 ‏اا ا ل‎ Ee oo LT VEL ‏ا‎ 2 LE o 8 Loe ‏ا ا الا‎ ay 1 ‏ايه ا‎ 3 ys Noa he i 5 ‏ا ا اا 8 8 5 اال‎ 2 8 ‏اص داه‎ a 1 5 * | : wm HR — Ral 7٠2 ‏لها‎ ao
    CE. =e Ta { 5 EAE NE : Co EEE TRE Vad 3 ‏م‎ ow ‏الل أت ال‎ 1 : ‏ا ا الات ا‎ a Aaa ‏أ‎ 200 aa ‏ب‎ 0 0 ‏وا اللا» ا‎ ٍ ‏ب ا‎ Zn ‏اا أي‎ ْ SB Seg 2 = 1 Ne | A TE § 1 SRR aE ‏ل‎ mn 1 TE Law 1 3 ‏ل‎ SEN Nn ARERR. SE aE . a § 3 CEST Cr RY EE SIENA NEE a 1 : § 3 BE A CNN i : CEE ER . 1 3 BE = =e ‏ا ا‎ ْ ‏ا ا الا ا‎ 1 OE Mn ER Pod oa .. See § 80 ‏ا : يه‎ CR. OTR RE ‏اا‎ B®
    Ee. g =. oh Pos WNL B® ‏اخ‎ ‏سد اذ‎ - TE - ‏"ل ا‎ ‏ويج : ل‎ NEES EA: em ‏ا‎ ‎Ee = a RE.
    a. - = Tn 1 1 CONE : he 1 A EE AEE 1 : fy Ff NR 5 9 ff Er 3 1 ‏د اكد انا اا ا ات الكت ا‎ ْ any Ta TN 1 ‏الات ف د‎ REE a A ‏د‎ i a : ‏ل‎ 2 9. 2 ‏لا له ا ا ع‎ © 1 ee ‏سس اد د 0 سسيس‎ 1 ‏لا ال‎ diel ‏اه ا ا‎
    Oe. = TE 1 ‏م‎ a RN xr BG 1 : ‏ال ل د ل‎ 1 - : Ne Reng 1 3 a NN. Na 1 : Ri a Tee ْ ‏ا اا ا الأ‎
    N a. a 0 ‏ا‎ TR 1 ‏اما‎ E SITTER nee 4 1 NES Noumea ny nm: a 5 fof 8 HEE 4 EER COE ACW wl = 3 ‏ال د ا ل‎ i <= ‏ا 0 الأ‎ EEE. Eg NN | ii Hy 3 1 ‏وس ا‎ Ek 1 1 TRS 1 : COONAN 8 Ea § : ‏اد ا اا اا ا ا‎ 1 5 ‏اا‎ SRY am . i 3 ‏ا‎ LR meee hid SOFA RE 1 ‏الا ال» يدا ااا ا‎ 1 3 Le SAY a ‏انب‎ EE : ‏الاي اسع ل“ ال ا‎ [/ aE ha 8 3 i - 3 fa TE 3 ‏م2‎ 8 oa Ivy
    -١- 1 oo re vg Lo WT LVL-RecAP16 ْ of a GE 0 K 0 00 ve. Tn oe. a ‏اا‎ Loew ] ‏ا الم‎ Tea ‏ض ال‎ ‏د أ كأ ا‎ aaa = ' 0 ‏عب‎ Ea ١1 Tae ‏يخ 8 د‎ gy : M bas ‏ال ا 881 مح ب‎ ; AE aaa RY SNE ‏لا ات اا ا‎ RE RR aN 0 lie ae ‏اب ص ال أ‎ OE a EE a EE aE ‏لس‎ - | Na Te B a a ‏الخال‎ ‏لد ا ا الى‎ on EL. ‏اللي‎ ‎| ERE ‏ان‎ FERRE mee BCR, MON © nS S— ‏يسبب‎ ‎; NN 00000 br a . sass... ‏ا‎ ‏ا ا ا ل ا ا ا ا إْ‎ 3 HER a Le LL CITE NE IN ae a RE on ae sak a ‏ار‎ ‎ْ ‏ا ل ا ا ا ا‎ 3 oo In ‏ل‎ SRT ‏الم اا‎ a ‏ا‎ Boe ‏ال اا‎ a ٍْ ‏ا‎ Ee ‏ا‎ ‏اهارا ا اند ا ا‎ a .. oe ‏ا‎ ‏اا لق‎ La ‏ا 7 الس ا‎ ThE, NN ae a Naan 0 3 a a 3 pam Ee ya aa ‏د‎ CEL N sso 0 WY Pen En ‏تمنتعجم‎ ‏الي سنا‎ el 2 ‏الف‎ ER at 33 ‏شكل‎
    0 Bonn 8 H 1 I 4 ¥ 8 hee 3 Er : i Boog § ‏ل‎ ‎8 0 : 1 : rE naa 8 SR = ‏ب‎ H 1 Ce 1 i H I ‏اللا‎ NNN 8: ‏ب : م 13 ل‎ od ‏اللي اجيج‎ : Am 7 #3 Sa EH CI + 8 000:8 ‏بجي 5 بج‎ Aa: q 1 RCN He FRR = i | 3508 ‏ال‎ © 5: RR, Aly x ‏:م“‎ a aa oa 1 ‏ا‎ EH pam ‏لسوت‎ ‏فلن + الك‎ BLA 0 ‏تت حا اخ ب‎ Lop bed i ‏مس و‎ : x ¥ ‏ب 2 ا‎ dt E SRR - Eo E ‏ألسايسييي تب‎ | Hl ‏سس‎ : i J Fr: I ‏ب ل‎ 0 ٍ 8 ‏ال‎ TB ِ len i : 1 H 3 «i Fone ‏ل‎ 1 > hl 5 > . i > - 0 [EERE TE SE TE SE *# 8 ‏ا‎ : * a - " 0 PA ‏تا كوف‎ 03 : TE ‏الل اليه اج وعدم ور ايع‎ * © 3 = yf ‏امب‎ ‏ان‎ BH ‏ص جا‎ BOS SA BH ‏للجلا اع جحت‎ oF ١ 8 8: ‏ا‎ 1 R ‏اا 0 ؟:‎ ~ Ea ‏ا‎ he N RR ‏يرا‎ N 0 Baa ‏حت‎ ‎8 ‏ا‎ x H ‏ا‎ RRs 8 ‏امسق‎ Ph, H ; 7 { 8 i ‏ال‎ ‎a i ‏الت م‎ 2 : hy ‏ا‎ ELI © i 33338 ey, 3 : ٍ ١ ‏ا‎ RRR N 3 Ea id oi Wo SRM N BRN 1 FE A ER A 3 —~ = od : BRT 3 EOE aS 9 1 Ea 3 ‏ف‎ 11 1 IER i FER [RS a 1 0 ER tH RNIN Ba . #8: \ = Me ‏7ع‎ ‎1 ‏ودسممتت-تديست<<<<<<< ب |[ مي أي‎ ‏ا‎ i 5%} gr i ‏مجك‎ + ‏م الي ا‎ i J ok H oH A 1 ? 0 — 1 £ H 1 1 . 8 Rainn © RS 1 ‏ا‎ i ‏ل يبي‎ 1 7 8 4 ‏لست تت سم سا م ال د ا ا‎ ‏اخ الها ام‎ es EEE < IE Fe Te - i > > . ‏مدا‎ ‎{Envi SE TES LR a + = ‏بيدا‎ A Be ho x FH Ter serie = ‏ا‎ ‎: EE 8 wt ; LH BR Cod wi sel : = 8 ‏ل‎ 8: ne : ] ‏ل 1 دك‎ 8 Rea EA H i | 3805808 - Ra, H : i 1 ‏اا‎ ie N NT 3 1 . Ey HPI 1 ‏ألم‎ “be ‏السنت ا اله‎ ‏بس‎ pa fv EL 1 + Spe ‏الم‎ ’ Fle a ‏ا‎ ‏اخ‎ EN Boy 00 ‏ا ل‎ ‏ل‎ 1 3 Tdi EES TEE: ss TET © YE ¥ 1 7 1 1 ‏لج«‎ LE SE TE = ts Dl ‏و‎ ‏لعا إٍْ ّ َ الس‎ ١ ‏اسسسسسس سس‎ _ ‏مج‎ Jl hE 3 WR 8 ‏ا‎ = EY > ‏لوي‎ ‎1 iii 3 : 1 ES i i : ES ‏ا‎ ‎| ِ i ‏احص‎ ‏لي مد‎ i 0: iF : TT eg » 2 ٍ Ny ¢ as & ‏حي ل‎ ae @ vo N + ٍ ‏ا‎ ‎0 ‏مي الع - سج‎ PR 3 : : id = 1 ‏صحف‎ RL 2 ‏اح © ب 1 ب‎ Me ‏ال جا واد اها‎ HARE rer ‏مي‎ TERNAL Fn ‏حا‎ ‎3 ¥ ‏الخ‎
    ‎. ‏ين نمب‎ 5 1 ‏ا‎ ‎١؟ ‏نكا‎ ‎fad
    ‎LAE 0 RRR «‏ الود ‎oR eons 20 I AT‏ ل ‎oo RE Lod > = EY 5, ‏يج ال ا 8 ‎R 1: : 3 ‏ا‎ Ha ‎H k RR By Ea ‎N : - ‏ا‎ 0 ‎i ORR RRL TAT * 31 PRI eI— ‏ا‎ ‎HS ‏ا‎ 5 ٍ J fo are Re ‏ا‎ a i > ‏بين‎ (3 ‎8 I, 5 1 A ‏ا ا‎ 5 ‎Ya 0 0 ich TAT Th STE Et ‎08 ‏م‎ RE - hk bh ‏ل‎ ‎7 ‏ا‎ gE | ets ‎3 ‏ا‎ 1 3 EE: ‏ال‎ > ¥ NEES 1 : 1 Lad X 1 ‏3ت م‎ Bd Ad _ _ : ‏ا‎ ‎o gE 0‏ © ا ‎i 0 ‏ججببر‎ k: : fit ‎8 RRs : - H 3 ‎§ ERR es sy H I: : ‎H Fey ¥ 1 : : ‎H 4 1 H : ‎13 3 hy ‏ب ل أ‎ i ‎H ne : ‎i , ‏سم‎ : Se w= i 5 i 0 ‎H CURES 8 o nd ‎i , Fo i : he ‎8 1: > he ‏ا‎ ‎ًُ ‏87م‎ mee i ‎x ‏ا‎ = i ¥ : 1 a . 3 < + 1 * A > > + 4 ~ 2 « be - * x a a 0 - . wv + 0 * v « o N > 3 < oi a “0 3 = 7 ‏الب ينا ل ب‎ = ‏ل‎ x BT ET EY Hadid LR ‏واد دحي‎ oi, ix Far " ‏ابي الها + را‎ 3 SE ‏اللا‎ SL ‏ام و‎ hg BN 5 al I ‏ال‎ ‎- ‏ا[ اح‎ av ‏ل‎ TAT GE 811 ye 3 BR ‏7ن ل‎ 8 1 ‏ا‎ qe ‏ا‎ ‎N Ati N ears JR a 3 TN 321 83 ‏ل 0 ا‎ wy er. Vo 055: 13*77 1417 1 i = 3 J SE X fA ] . ‏ا المت ممت‎ ‏ا ل‎ 1 1% ‏ا جح‎ - 2 ad pony 3 Ya RRA 14 JX TAT #4 8 41 A Ra: J NES ba RRR Sa ; nny Bh aw 7 1 ‏ال‎ 3 ‏اا 8 0 ا‎ 1:1 - 1 : ‏جل‎ ‎11 ‏بخ‎ ) : 0 Fay a %, 3 d 1 : ‏اح‎ borg EN 3 - A : H sna I in . 1 & 8 3 BCI ‏وي‎ by 1 ‏ا‎ Eg i poy Rh: ) i § Fy 0 3 8 I 7 ‏امح‎ 0 : 3) ٠ ‏ا مدت ع‎ 8 ® Co BE $F noone BR ¥ 3 ‏ا‎ i : i : wy = i 8 ye N ‏ل‎ a N H ‏ا‎ ‎8 ‏ب ٍ اببس‎ § LX 3 5 ¥ h a ‏يسيس‎ ‎~ © N ‏و‎ > 5 N x s - 5 + © > " N ~ ~ ES N « M 2 3 + z : * : a : = = 4 - 1 ‏ب‎ bed ‏اخ و‎ fs = ~< ‏خب‎ wi ‏اجيج‎ ‏ل‎ : ¢ —- he Dg ad al ‏م‎ RS JR ‏ل‎ ‎Fiat ‏راد‎ fell ‏وى الج‎ ‏ناهر ا ا اال‎ 0 ‏ا ل ا د‎ 0 ‏رودي ا‎ TAT > #51 ‏ا‎ a 1 ‎¥ TRE ١ ¢ 0 RRR: ‏بها‎ : ‎H ‏ع‎ J A RAR RR RUA Ba) 7 ‏الال ا ‎RR‏ وجوج وب ججح ومن ‎H‏ ‎H PY SR ‏مح ها مارت ار ور‎ a oa] % : ‎HN epi Ag SNE 1 wg 1 ‏ين‎ ‎re kN LI RRR 127 ERY ES #8 1 3 %, rh] ‏البيييييييييييي:‎ 00 ‎Hi ‏بج‎ : pony By ‎HN RR I Ee FE a fF Saas: ‎a ir Ro avs 7 Haas fee] a ens Me ‏جد ديت‎ ١ RR ‏ل‎ ‎1 1 1 ‏ال ا ا‎ ‏لو‎ 1 a IS E Be LAL 1 ‏ص‎ i 3 2, © N F ‏:ادها‎ Bi = Wa ‏ب ' ّ مقا‎ ‏إ : = | الم ا‎ %, ‎H 0 N 1 7 ‎i E i ‏ل‎ : & i CET Yh ES { ] : x ‎Eo ER $i 3 ‏:3 ب لا : ‎H Ed 0 H 3 ‎H 1 Aang + H 3 ‎i ae Ba 8 ١ ٍ ‎H 8 : 1 ‏م 1 3 > 5 د ‎i‏ ‏تو : § ب 1 ‎smn 3 v‏ { : ‎B 5 PR « IEE EC‏ ‎N > : & bd “ ©‏ ‎oN LS - 0 1 N‏ سح سا ب = ‎all 8‏ راي ألا ربد اط " مرح ورد يط ا ‎a‏ د ‎CR)‏ ‎Pa i ١ -‏ ى ‎YE : 4 8‏ و مت ‎a ER‏ وين
    5 . ¥ 0 م 0 م 3 ناج ل 1 8 تع ‎{WORE‏
    _ \ ¢ «= i. 8 Vereera og ‏تلم‎ ‎- } 3 nai 3 I aS SN 4 ‏امس‎ ‎i IRE A arr ado 0 3 a ‏ل‎ RR a. 1 ERE ” ] RRS +] 4 i SRNR 3 1 ‏لب‎ RRS * 1 1 : ‏ا‎ ‎: ; ‏اا‎ Rs ES rate wg ] RBI 1 REE Yo : aa ‏بويت‎ RRR bo 4 i FOREN ian RRR “A ] RRR ‏ا الت‎ 2 ee 1 Bae 1 RR ‏ود لم‎ a 1 ‏لاا تا‎
    : . 3 i Flan 0 FRR ' - ‏ا ا | له‎ AEE SURE ERR § : Soon 20000258 pa wT : pe ‏#دا2‎ pial Beene 1 ‏ا دلجي‎ 0 1 1 0 J RR RIERA. | ‏ا‎ ‎i Joab: J IRENE BRIS | ERNE ] EEE ‏لاسا د‎ SRS | one 1 PIATRA 0 0 TR: 9 8 i FARBER FLEES RRA | SRR 3 ++ ‏ا 1 ف م جا‎ 0# 1 ‏ل‎ EE Ree FSR: | EEE i i ‏ال‎ RONEN 1 | ERIN 1 1 ‏ا‎ 0 BRR 1 0 ‏اج‎ 1 PE ] 1 J RR 0 | EERE 1 0 | ‏ا ال‎ 5555 wt BHR 8 1 ‏مج‎ ‎= A d JB LE ‏م ب مج‎ ‏نبب‎ NT a A5 ‏الك الال‎ oF ‏ال‎ ‏الي‎ > 5 Ra a oF & ox ‘ ‏يي‎
    ‎. ‏راع اخ ا‎ vy Css ro ‏مت‎ E ERRNRON [ ] 0 : ‏ا‎ ‎: _ i FE i ‏ا‎ ‎i ] wi; Baas * i f- Buen ng : penton ‏ال‎ SEER ‏جا‎ aE Foon 4 ‏ب‎ [ | SRNR ‏ا‎ f RN ¥ i Bilin BEE 1 ‏ا‎ ١ ‏ل‎ : REE . ER : 0 ‏ل‎ A iB $ 3 | RS 2 ‏#ا ا‎ RONAN ‏لد ن‎ | BIRR SI Hast RE ‏ل‎ ‎Te i$ : ‏لاط‎ Boal Baad Ea] 1 ‏ا ا‎ Ty i ny aad baal Baa i “ 18 es TH ER ‏ل‎ SSRN ‏اخ‎ + : i ‏موود عمد‎ RRR FRESE Esai REN SEF eo Reo SER Rant BUSEY wo 3 | RRs ‏الس‎ SRE Eoin ~ i ‏ل ل 1 ؟‎ SH ‏ل‎ SE | RRS ¥ | Ra ERR 0 BEER : Bl ‏الما‎ En Fae § 0 BRR, ty 0 ‏الل 5 ا‎ Radi SRR ‏ل‎ ‎: 3 | BRERA ‏الات ا‎ RAAT: 0 : 1 0# ‏ل ا‎ JE RISSNNRE : ‏ا ا ا‎ 0 1 ‏ل ا‎ RRS Be ‏ل‎ ‎5 Ri ‏اللا ا ا‎ SRE Fay 1 ‏ا‎ [ERR 8 ‏ا‎ ‏ل ال الما 1 000 ا‎ 4 CB «2 “2 xX ‏ل‎ ‎pa pe i Ry : : = RL 3 oc ‏ا ري ب‎ 3 3 : La 1 : Py 8 J ¥ :
    & . ot ‏م لي‎ & ‏ا $2 : ب بك‎ © a >“ & 3 3 ‏ا‎ ‎1 3 ¥ { 5 & ‏ب‎ ‎: : i =
    SARA ‏الا ال الا‎ avear—TAT - ‏سا‎ ‏فقس سي ل‎ * ‏بلس ا انا‎ EN SET EE G0 ‏لها‎ all ‏ب 04 عمد‎ ‏إٍْ‎ ! 3 ٍ i ‏ات : اي أ اي بن‎ ‏ف ااا ال‎ Fe Dal i ‏خخخ‎ ‎4 ْ A i ! J ne a i SEE Sanat { : " 1 i + . * ‏ب بطر‎ Th ‏د‎ 3 z ‏مع‎ ‎Foo ‏ااا ا‎ : [ak figs ie [oy ‏و‎ ‏ا ام ام‎ fet ‏دي‎ ‎” ‏ال‎ AVIRA & as SNE NE i AE SEE ‏باط عضي خض‎ ‏م‎ [ -_ | re ed ‏الات ال تا + ل‎ : ‏ا‎ Cae Le : ‏اال‎ 7 ENG I A A | TE EY =u | [ aworan ‏سر‎ ‎£3 0 ‏ب‎ + = * - + hd * + = ‏ب‎ a - . w= kad 2 - - 7 ‏شكل‎ = OE ata 4 " ‏م‎ ‎{nt at 8 i ha! 3 Fa A l= 3+1( TY
    ER A RE ‏ال ل‎ ‏ا اين‎ CR ‏ل‎ ORY | ‏الاج‎ ‎H ER RS RS NSN So i BE ‏ال‎ Ada 1 i aid 1 } + ‏اا انا اه‎ i 1 ‏ار‎ ‎if R E wd : 1 ٍ | | 2 ‏م‎ - © “2 3 4 : ir i 1 | nie ‏ب 1 مني‎ 4 ‏د داعو‎ i 4 y tx BE 5] 1 3 3 § mo A : i xh > > x ’ ‏د - 5 - ب‎ 0 a - > ‏و‎ po -— So ERNE SL SRR TY LENGE aa we ‏ب“ ير‎ ‏ااي ام م‎ RITE £57 ‏راد‎ ‎0 K ‏ل‎ a ‏لتر الك‎ ‏ا ا ا ل ا‎ A IRA ‏ا‎ ‏ل‎ ‏ال ل ل ل جع‎ 0 3 } [REE 8 1 1 1 1] R 1 ‏ا‎ ‎H 1 NE ‏ال‎ ‎+ i ‏ف م‎ 3 x 1 1 8 5 . 1 i ] 3 7 ‏زر‎ ‎5 : + ‏ل"‎ 0 x . ES ts ) Aa Ang : “ 8 . ¥ 0 1 k , o£ 3 i 1 ‏ا رن‎ 8 1 P Ge 3 8 1: 3 4 i 3 La i { 1 1 0: hE 27:7: ‏يس‎ ¥ 4 RE | 1 ‏تت‎ 0 By ٠ it Mal ‏ال‎ ale 34 gosh a) 1 3 ‏ابا‎ ‏الي‎ : 1 : :: 1 4 wacom + LY 3 3# : : He: pe =F Ad Ho f > H i 1 He [1% Hi ‏با‎ ‎1 1814 8 1 EgE Ta f 3 . FIR 3 3 Zo y i § : 3 po 3 ‏ا‎ - 1 x : 1 I 1 "1 y 1 7 Li 1 Erin ‏ب‎ a + > > ~ # 0 « > * - ES ‏ب‎ > > ‏ع ب‎ ~ > > £ a ‏حل ب‎ ha Ned ‏ابر ا الا حي‎ J . UE i «i = 3 ™ 1 4 5 : 1 he ‏ببح‎ ‏يرثج لي‎ oe 1 “3
    Se ‏ع‎ # ‏ني‎ i a : cg i ee J EE oy p 19 | 1 ٍ “= ¥ ‏ل‎ ‎ors 1 2 ‏الى‎ [ ‏إٍْ اا عرد ال‎ ‏ل‎ i = ‏ب‎ i EL 1 01 ‏ل‎ 1 # 1 1 = | ill. $$ # Bio 7 : ‏امي‎ 2 Ronaag ‏اس سح 1 ] ا‎ i RRas : 2 1 ] ‏ا( م ا‎ = § . Lg 3 i RE TE 0 ‏ب 2 | ا كلاج دن ب‎ Fb ‏ا‎ ‏و‎ 0 ERE Epps ‏ا‎ ‎0 j ] | See anand ] ‏ل‎ ‎: 0 ] 1 ‏ال ل أ ا 1 0 ل ا‎ ] anny j 2 © 0 ‏ال‎ >. 0 1 ‏ل‎ 0 I RNAS y RNR ROR RN | BB Boone ] | SERRE | REE 0 1 ‏ا ا ل 0 | ا ا‎ ‏اج‎ 9 | | b Ro 1 1 1 0 1 ‏با 0 ب - ب‎ a jut * < 7 < < 3 0 8 ‏م‎ 0 ¥ 2 $ Ye, pd 3 [£1 Ca & 5 : << ‏ب يما اله‎ ْ Hoo } - i 1 ie § : k, + ‏به‎ : > i ' R be ‏سح‎ Re ‏اع‎ ‎or Ro Res ae 0 Hy Ree : ee, 0 re [ES at 7 Ee wd 3, 3, pt Ay p= A, 7 0 Ww +L 8 > 5 ‏ب‎ Ba 3 Ra ond pid = + ‏شكا‎ ‎Vid
    ‎vo‏ . لق ا ‎NN‏ ترا اوري سب" جد ا ا على ‎Whe @=Y=t RITC-Sinistrint dh‏ ‎en . ) §‏ : ودس تأ ‎dy‏ لاج إرضاتي اد 0 - ورا عدج كام ‎Ab‏ اليا : ا مج ‎vy L Fo‏ ‎verve tin |‏ رون #قعع اليا +ق تا << " ‎i‏ & ٍ ‎boo aN ek hE :‏ ‎ft 5‏ ٍ مشخ ‎i)‏ كلا ا ‎je‏ ‏ما يالا : ‎fF: NN‏ 8 ا م ‎NLL‏ كلا 0 2 ‎st 33 F NE Ne hs CT‏ ا 8 :3 - ‎Ea + Af TERR‏ واه اا 3 الا ‎TREE‏ لمش ا 8 ل ‎do TP‏ امت ‎XN Eh‏ .~= ا ‎pot Le f fa TN TUR‏ ‎“Msg 1 Rina 4 i 1 Rik Bo Lo‏ ال 1 ع ‎a‏ ا اطع ا ححا : ‎Foes‏ 1 1 ‎po‏ سس 8 ‎aH ¥ LLIN RNR‏ ¥ موا ‎etn‏ ‎H PRE TH Sass CL .‏ 3 ‎NE ASNT NT SRE RN aise‏ > 3" ‎te‏ يها حفن ب بلا 4 ال ف ف ‎Li‏ 1 * شكل ‎Dre‏ ‎I Tot YET TET‏ ل #ادا# ان اة على ‎le Yi = Yee =U FITC.
    Sinistrinlainy‏ 8 5 راي لاد ب دلق هلاج 2 ‎a WF‏ وا ودجو كا ‎HEE‏ دنا ‎a‏ م ‎wis rpvrntin‏ فوا اقم << ٍ: ‎Proud ld‏ ‎RR EE RARR—‏ له ‎i TI 3 Ai‏ ‎THe‏ ليا 8 § ‎LEE‏ ‎FON‏ ‎Ny ay‏ ‎TE J ERR AR‏ للا ‎Sl‏ ا ‎SRE Lo‏ ا 0 ما ‎Fe 8 ER ae‏ الخاس ‎Bra BD‏ 4 ‎RN ig‏ 3 5 ‎RE ho‏ 3 3 ‎ved Nl secs Pon 7‏ الي ‎TER a i,‏ 1 لل عو ‎EE Rl SN CT‏ : ‎EA :‏ نز ب + ‎aa‏ مر دك ‎١‏ يل ارا 44 ‎te $6 5x a‏ ا . ملكا © ‎FO‏ ‎pry fod‏
    _ \ ¢ ‏اج‎ ‎Ar 1 : #
    4 5 LINE 8 8
    با ,3
    ‎EB ign‏ ب
    ‎3 81 ge 1 ==
    ‎x 1 ‏تسد اتيب‎ Fg
    ‎=) ٍ 0
    ‏| ,‘ * ‎LPS LPS+LVLrecAP‏ علاج إرضائي شل داج .«* نا
    ‎= a ‏ا‎ ‎0 , ng
    ‎1 ٠ r= Ee by a jt 3 & 2 4
    ‏ا ‎FERS LPS LPS+L VL recAP‏ شكل ‎ye‏ ‎Try‏
    -١؟1-‎ * Ve > ‏جين ؟‎ 3 : PR # vs hry oy : uw ho 1 ‏ا ا«‎ i. “3 ye xed “= A & 3 ‏علاج إرضاني‎ LPS LPS +recAP A Se 2 Yoo xX¥ EE ‏مق‎ ‎8 ‎| ‏ا‎ ‏ل‎ ١ pS 3 { ‏ا‎ ‎zy eo fF = 0" a | ‏سي‎ Aa « ‏به‎ ً ‏ما‎ Bn q Yo Xe,0 ٍ | —
    [| . * ‏لعي‎ LPS LPS +recAP ‏شكل ب‎ ‏بوب‎
    —yev— Yy vo LO rg # 4 a 33 een = 8 = wea? 8 ‏يد‎ 8 Yo X Ya : A " ‏حت ل‎ ot (ha? Lo 8 ‏كنم مس 0 آل“‎ ‏يي ال اام بل‎ 8 * £1 & HN . & | 8 8 A ‏علاج إرضاني‎ LPS LPS + recAP z ٠“ ‏شكل‎ ‎Yo ‏ا َي‎ ey 8 ‏سس سس إ‎ » 4 ‏ث‎ | 8 My 5 0 ‏اجاج«‎ ‎WF ‎Ey 4 | me 2# ‏سا‎ Nea ad a | 0 : = | ‏اد‎ ‏الل‎ Rad 22a " Ah ‏علاج إرضالي‎ LPS 05 + ‏مقع‎ ‎<١ ‏شكل‎ ‏ب وب‎
    ال شيع ب 1018-1 ‎asd‏ ‏= ب مجح مقع ‎i Pe‏ ‎RE 7 me‏ : ا ‎SERRE‏ ‎ng .‏ ل اا : ___.... ‎Yo‏ ا 0 0 1 ‎SRT‏ ‏ال 0 ‎Cala‏ ا ا اتات اتا ا اا ل ا ا 1 § 55:55 1 ‎EERE RRR RE‏ 0 ‎Tae‏ ا ا ا
    _.- _. .
    ا . و ا ا ا ل ا ا و ا ل ا الا ‎Ee‏ 88 ا ٍ ااا ا ‎Smee a‏ 0 اا شن ا ااا ا ا ا ل ‎REE EEE RRR EE ase EEE ERE SRE‏ ‎a IRA‏ 0 ا 0 0 ‎RI Raa ENE‏ 0 ا 3 ‎Na‏ ا . ا ‎ra) mg‏ ‎SHEE a a‏ ا ا د 1 ‎Ta FRAY Le‏ ا : ‎a aaa‏ ‎a EEE EEE aol maa aE Tae Hh a Ga‏ ا ال : ‎a‏ ا ا ا م ‎RL SERRE Tass‏ ا ا 0 ‎Soumya CEE SE ea ERR Ra : on‏ :
    ‎i . ama Gl La 0 a‏ ‎a ae SEE SRE 0 Rs Be pes CRE 0 0‏ . ل ا ‎ENN SER Ee‏ ا . 1 ‎da‏ كاد لات ‎ES‏ ا ل ا اا ا ا 0 1 ‎Boe RRR TERE 1 CR‏ ‎CHE 0 NR‏ 0 1 م 0 ا 0 ا ا ‎ri REE EERE EN REE RRR Shea = a‏ ‎i Tw .‏ ا ل ا ‎ee ER Colinas‏ للد 0 ااا ا اا ا ل لاا 8 ‎TERE a a‏ ‎Pr 3‏ 1 و ا ا ‎SERIES a 0 RA IEA Ma rE SEE ERE = a‏ اا ‎ee‏ ‏ا ا ااا ‎EERE 0 0‏ اا ا اام ‎EEE SEER Emma aE Et aa Conia HE‏ ا اا ل ال ا ‎rem a SEE Ea Foes sw #‏ ‎SERRE BS 011 1 aay‏ ل ‎es‏ ا ا را ا 4 0 0 ‎NEE‏ ‏ا ا لما ال ‎Sis EEX i WE 3 CERNE TT‏ احا ا ا 8 ا ا ‎RR Re ee we‏ ا 5 ‎SE CL‏ . سس ‎ERE Cai is‏ 8 ‎RR RE RE SERRE EER ma eee‏ ‎i Er 5‏ ال ‎Svan i RE bss a HERS LE‏ ‎Ones A Sa NER i Bey ShEEEERRaa le Aa‏ ال يد ا اب ا 0 ‎heme‏ ‎ee Na i ;‏ ل 0 ل 0« ا اد ‎REN‏ 0 ‎RR ER Rr REN DE‏ 8 ال ‎SE RR REC rr aR‏ ال ‎s aan ye‏ اا 0 ا ا ‎SOE‏ ا ا م ااا ا ا ا ا ا ا ‎Nd a a‏ 9 ا ا ا ‎ee‏ 88 ل ‎Lo oo on ee Sa SERRE SII a 1 a: 0 0 NAR‏ ‎EEE Saas SEER Ra Cann hENaaEs HE EN EEE a aN ERATE Ee‏ ‎Be RRR RE Basa SEEN Ca aaa EEE EES CSE Cpa ee 8‏ ‎SER RE 0 0 ni Ro Sada aa NER Thea‏ ااا ا ا ‎FRR Benet ER 1 ea ay RR EE 1 0 0 0‏ ا الا اح ل ا ال لي ا ‎RE hE SRT FE NTI SE Gana Ta a‏ 0 ال 8 ‎RR‏ ‎a Tha Cae Ghana EEE FN a RSE RR TE 0‏
    ا . . ‎ae SEE SE Sore‏ ‎Sa ERs 1 0 ray SR SRA 1 SEINE RARER 1 1 1‏ اا ا اا أ ‎oe EE a.‏ ا £1 ‎ERR nr RE 0 EEE SRR BE aR aay‏ 0 ا إل 0 ل 1 1 ل 1 ‎i Sama EEE ERR RT SEE‏ ‎EE‏ 0 0 ا ا 0 اا ‎al‏ اد ا ‎Sela: SE‏ ‎TR Baan anaes =‏ ا 5 ‎aE =‏ لل ا دا ‎Pana a a Ha‏ 8 ل ‎Le EAN CoE Sa‏ ا 0 ‎Tae i a EEE‏ ل ‎SRE ae‏ ااا الا ا ا اا ا ‎Re SEER RR HS ERR EER SET 1 REE SRR‏ ل ا - ‎SR NRE‏ 0 0 0 ل 0 ‎a Ta ERIE 0 RR ROR‏ ‎BE Le aa‏ ا ‎oe ee‏ ا ‎Laan He aE‏ ‎RRR RARE 1 0 A‏ ل ‎Fo a . Sha Sa BEERS SEI RE RY‏ ‎a‏ ا 01 0 الت حدر ‎Th‏ ‎oe a‏ 1 ل ا 0 ‎EER‏ ‎BS ESR RS a Sea EEE dae EAN EI ER Ream ha‏ ا ا ا اا ا ا ا ‎ae‏ ‏ا لاج ‎SEEN SRR Ratan aaa SEE SEE 1 RE EEE‏ ا ‎a Chana amma Snow‏ ا مخ ‎SEN ee nA SE a pam Sa 0 CRA SEER a‏ ا ‎ERR 1 avai EERE ERR Sa Sai bo: HR aa 0 0 TO Lan La‏ ا ل تا 1 ‎oo Loman ae ght SEE 0 REE a a‏ ‎SEE Es SER Soran TREE 0 SEES = . >‏
    ا . ‎oe a aE a Lae‏ ‎TN SERRE a REE ae es 8‏ ا ‎EERE Sanaa an‏ ا ل ا 8 0 ‎fr‏ اا ا 5 ا ا ا ال ا ا ا ا ووو ل ل - ‎EE‏ ‎NE EN a 0 IN SER RAO 8 eS BNR‏ الحا ‎a SEE SR SE SI AR‏ ْ ب ا ا ا 1 ا ‎SEEN RR EE‏ ‎SERA RRR a Ed - :‏ 1 . حا ل ‎NIT a Rae a‏ ‎RARER SRR Halex Toe 8 H‏ ب ا ا ل الات ا ل 01 5 8 1 ‎Te Sam Bsa CAEN‏ ‎Si ENE i —‏ ا ا اا ‎BR 1 0 Re 0 CRE Ry A ae a Co‏ ‎EEE SE — es‏ ل 3 ...= ‎Lo‏ ‏3 لان ا لان ‎Lane‏ ‏- ا ‎Lo‏ ‏ا 1 ‎Toa = ama SE‏ اا ا 0 ل 8 ‎SR Rane aaa SR‏ ا ا ا ‎Poem‏ ‏ااا ا اا ‎aE‏ : ا 0 ا ا ااا ‎CERES 0 rE i SEE a aE Ea‏ ا 0 8 ا الل ا لاد ا اا ب ‎FER Ea RR Se EEE ak Sa a a Lae‏ جز ‎=F EEE RETIN Sa FERRARA EEE tran Es SR SR a‏ ‎TNE 0 0 0 ENE Raa Saw oe‏ ا 5 ‎SEEN aaa .‏ 1 ا ‎Bak Bae EEE A a SESE‏ ااا ا ‎Ea Coa The‏ ا ‎SE a a a SEER maa 8 Es a‏
    ا ... ‎haan‏ الا ‎Nona me Shona‏ ¢ ‎N‏ ا ا ال ا ‎a‏ ا ا ا ا ااا ‎I‏ 4 ا 0 0 ا ل 5 ‎BER Nana SER EEE Ree i Nh‏ .
    ا . ‎Le ee‏ 3 ‎Ema 5 0‏ ا ا اا 4 ‎Lm See CRRA‏ . ‎ne Na a‏ ا ا ا ‎ne aa ee 8 SEE Ca‏ 3 ا اس اي اا ‎BS Toa 8 be‏ ا طخ ا ‎seed ine eng my‏ 0 اا ان ‎me a‏ الا ‎a EE Be Haasan‏ ‎ED RTS SRRRRRAANY SEER REA RR Sa a TRI‏ = ال تم 0 ‎RRR BNE‏ اد اا ا ‎ee‏ اي 0 3 0 ‎Rasa BO Sha maa Rhian‏ ا ‎ma CL‏ اا ا اال اا = ا ا ل ل ‎SNe Laan RA aaa‏ اا ا ا ا ‎me‏ ‎aE .. Daa ma :‏ ا ا : ا ‎Loe ede be‏
    ا . ‎Sa Ce‏ ا ا ا ا م ‎nam Ne‏ د الحم ل ا _ = = ‎Be RRR Ry : 0 ERE Ca Naa‏ 5 وك ا ا 0 ل ا ا اللا 4 لاحي ات ا ‎EE‏ ‎Li Soa Ni SEER 09 RE A‏ 2 لأ ااا ‎RA ARRAY RE Sa Coa ee n‏ ا ل : ‎SEES a‏ ‎he : :‏ ا ان 8 مي د ‎Ean Coat 0 FE‏ ‎Ee hb odio X ER‏ ل 1 ‎SH REE RS SEN =‏ ‎RNR‏ ‎Pn ge‏ . ‎LO | 3‏ ‎a ELIE‏
    TNF-a va. ETT os Foy
    La . | SARC w of re Eo “١ ‏ا متكي واي‎ Le! Ne [JE EEE Boia geval bo A 8 3 ‏ا | لا حي‎ 3 3 3 BE EERSTE. | ‏ا‎ ‎= hb ‏ا ا ال‎ ١ 3 A Ht ER : J foi : [ BREE | pun \ Liq ba ‏اج ل ل‎ A 3, ¢® 8 3 3 ‏مج بي‎ + Th a < J 5 > 8 ‏بط‎ ‎IL-6 ‎# 2 ‏ا م‎ SE Tey ‏وو ووو مج ويل‎ 0 EN os aa EE w J en : ‏ل‎ ‎8 ‏ا حا‎ 0 RRC & EE ® oa iti Sa ad << Ben ‏سوسس‎ SERS 3, — : ob ES Tease EF EE 4 1 2 Ta 1 Sig EE + : ini] SR 4 4 - Q 50a FF ‏علد‎ * & fii 2 : 4 ‏عل‎ ‎0 ‎oi:
    ‎H.-8 ‎LE TEE 1 ‏بستحت‎ ‎Fy en ‏أ‎ EN 0: q a: ‏حا اللا‎ i : EE fa oF | as ‏ا ات تع د .ل‎ ‏ب‎ | a ‏ا ا‎ 1 on La J ed 1 grote Sia =A Hi i SE = | § | IEEE NS SEs sold} oon ERE Faint B EEE 1 Pi HE SEE bi | HEE as + I rg i. a: 1 4 1 40 ‏م | سمي‎ 3 1 ‏ب ا‎ + x [x ‏ص"‎ ١ < ‏يِ‎ ‎2 ‎1 # Vy ‏شل‎
    — \ OW — Ar er ‏اير‎ ‏ل‎ ‎a ‎& Se 3, Tew ٍ he & = 01 “2 ٠ ‏ون‎ ‎A Eee ° % 8 _ ‏ب‎ i 3 Yoon * ue YS XRAY _- ‏َم د‎ 2 = a AY a 4 ٠ 7 » Yao ARERR Tana ‏راع اول“ ا قاع .رج‎ RecAP ‏درجة منوية ووحدة ا لس‎ Yo YA ‏شكل‎ ‎Arr + ‏ما‎ ‎: » 2 os, 4 * ‏يب‎ ‎0 ev ‏اب # و‎ 3 ‏ا‎ ‎5 ‏م‎ ‏ا‎ 3 o ES 3 ‏ب يج‎ 1 ‏ا‎ ‎ES ‏اهن‎ ‎0 ; a © Yous ra ER SAL IE ‏مرخ ات‎ o oF rie ‏سدح‎ ‎i & wd * 1 | : ¥ Youn ‏قلا بج ولا‎ gaan ‏دي وج‎ AE LVL-Re CAP (= / ‏درجة منوية زوحدة‎ v0 vd 2 14 ‏شخل‎
    — \ o \ — ‏اسهد‎ gale ‏دسالا‎ RecAP ‏ل‎ is hus ‏ميا درجة ميزيد سه‎ ROC AR LV Lad We ‏ريط‎ ‎Yoo vos my A i Le = a Yas aod Er 3 of 0 Co ٠ ‏ا‎ rd - 0 * =, yd ‏يب‎ ‎= oe 8 ‏ال‎ ‎fe] LE pd : ١ ‏ل‎ i 3 A ya ‏ل لحر‎ i at ‏(ميكر ور‎ a ٠١ ‏شكل‎ ‏ير نض‎
    مدة سريان هذه البراءة عشرون سنة من تاريخ إيداع الطلب وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها أو سقوطها لمخالفتها لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية صادرة عن مدينة الملك عبدالعزيز للعلوم والتقنية ؛ مكتب البراءات السعودي ص ب ‎TAT‏ الرياض 57؟؟١١‏ ¢ المملكة العربية السعودية بريد الكتروني: ‎patents @kacst.edu.sa‏
SA516371532A 2014-01-24 2016-07-21 بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز SA516371532B1 (ar)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14152526 2014-01-24
EP14188158 2014-10-08
PCT/NL2015/050048 WO2015112017A1 (en) 2014-01-24 2015-01-26 Chimeric alkaline phosphatase-like proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA516371532B1 true SA516371532B1 (ar) 2019-02-11

Family

ID=52464544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA516371532A SA516371532B1 (ar) 2014-01-24 2016-07-21 بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز

Country Status (22)

Country Link
US (4) US9926544B2 (ar)
EP (2) EP3097189B1 (ar)
JP (3) JP6940949B2 (ar)
KR (1) KR102166110B1 (ar)
CN (2) CN106164262B (ar)
AU (1) AU2015209783B2 (ar)
BR (1) BR112016017041B1 (ar)
CA (1) CA2937328C (ar)
DK (1) DK3097189T3 (ar)
ES (1) ES2684639T3 (ar)
HU (1) HUE039784T2 (ar)
IL (1) IL246898B (ar)
MX (1) MX369041B (ar)
PE (1) PE20161442A1 (ar)
PH (1) PH12016501441B1 (ar)
PL (1) PL3097189T3 (ar)
RU (1) RU2683635C2 (ar)
SA (1) SA516371532B1 (ar)
SG (1) SG11201606060WA (ar)
SI (1) SI3097189T1 (ar)
WO (1) WO2015112017A1 (ar)
ZA (1) ZA201605028B (ar)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2937328C (en) 2014-01-24 2022-09-27 Am-Pharma B.V. Chimeric alkaline phosphatase-like proteins
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
MX389350B (es) 2014-12-05 2025-03-19 Alexion Pharma Inc Fosfatasas alcalinas recombinantes y usos de las mismas para el tratamiento de convulsiones.
JP6868561B2 (ja) 2015-01-28 2021-05-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼ欠損を有する被験者を治療する方法
CN108350440A (zh) * 2015-08-17 2018-07-31 阿雷克森制药公司 碱性磷酸酯的制造
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
JP7613826B2 (ja) 2016-04-01 2025-01-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
EP3345614A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-11 Amrif B.V. Composition comprising alkaline phosphatase for use in the treatment of arthritides
EP3600383A4 (en) * 2017-03-31 2020-10-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATMENT OF HYPOPHOSPHATASIA (HPP) IN ADULTS AND ADOLESCENTS
US11338020B2 (en) * 2018-01-09 2022-05-24 Synthetic Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders
FI3762018T3 (fi) * 2018-03-08 2024-04-22 Am Pharma Bv Rekombinantti alkalinen fosfataasi käytettäväksi sepsikseen liittyvän akuutin munuaisvaurion hoitamiseen
ES3032290T3 (en) 2018-03-20 2025-07-16 Theriva Biologics Inc Intestinal alkaline phosphatase formulations
US11654184B2 (en) 2018-03-20 2023-05-23 Theriva Biologics, Inc. Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders
US11913039B2 (en) 2018-03-30 2024-02-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for producing recombinant alkaline phosphatase
CN110499285A (zh) * 2018-05-17 2019-11-26 西安组织工程与再生医学研究所 Alpl基因在制备预防和/或治疗低碱性磷酸酶症的产品中的应用
US12268733B2 (en) 2018-08-10 2025-04-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurofibromatosis type 1 and related conditions with alkaline phosphatase
JP7660523B2 (ja) 2019-05-06 2025-04-11 セリバ・バイオロジクス・インコーポレイテッド アルカリリン酸塩に基づいた癌治療
CA3161266A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
JP7813706B2 (ja) * 2020-01-03 2026-02-13 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 歯周の健康を促進するために局所投与されるｔｎａｐ
CN111110835A (zh) * 2020-01-22 2020-05-08 李鑫荣 一种肠碱性磷酸酶的新应用及其制剂的细胞活性检测方法
AU2021337652B2 (en) 2020-09-04 2025-01-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating bone mineralization disorders
WO2022055350A1 (en) 2020-09-09 2022-03-17 Am-Pharma B.V. Recombinant alkaline phosphatase for use in treating acute respiratory distress syndrome
BR112023016048A2 (pt) 2021-02-12 2023-11-14 Alexion Pharma Inc Polipeptídeos de fosfatase alcalina e métodos de uso dos mesmos
CN118580341B (zh) * 2024-06-24 2025-03-18 浙江大学 一种寄生线虫spi-i8蛋白及其在防治炎症疾病中的应用

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8328918D0 (en) 1983-10-28 1983-11-30 Unilever Plc Alkaline phosphatase
ES2106737T3 (es) 1990-02-07 1997-11-16 Abbott Lab Enzimas de fosfatasa alcalina con actividad especifica mejorada para uso en reactivos indicadores.
EP0584343B1 (en) 1992-03-10 1999-01-20 La Jolla Cancer Research Foundation Recombinant calf intestinal alkaline phosphatase
JPH06284885A (ja) * 1993-04-02 1994-10-11 Tosoh Corp 組換えヒト小腸アルカリフォスファタ−ゼ
EP0701441A1 (en) 1993-06-01 1996-03-20 Cortex Pharmaceuticals, Inc. Alkaline and acid phosphatase inhibitors in treatment of neurological disorders
WO1995005455A1 (en) 1993-08-13 1995-02-23 Rijksuniversiteit Te Groningen Pharmaceutical composition comprising phosphatase or a derivative thereof
CA2176709A1 (en) 1993-11-15 1995-05-26 Howard R. Higley Method of treating renal disease by administering igf-i and igfbp-3
MXPA97009909A (es) 1995-06-06 2004-08-23 Gensci Regeneration Lab Inc Materiales osteogenicos modificados.
FR2736065B1 (fr) 1995-06-29 1997-09-19 Commissariat Energie Atomique Phosphatases alcalines bacteriennes modifiees et leurs applications.
JP3488327B2 (ja) 1995-12-21 2004-01-19 よつ葉乳業株式会社 牛乳脂肪球膜含有画分の製造法
US20020114802A1 (en) 1998-02-10 2002-08-22 Tjellstrom Bo Arthur Einar Oral immunoglobulin treatment for inflammatory bowel disease
DE19819962A1 (de) 1998-05-05 1999-11-11 Roche Diagnostics Gmbh Hochaktive alkalische Phosphatase
JP2002533679A (ja) 1998-12-21 2002-10-08 フアーマアウエア・アイピー・ベー・ブイ アルカリホスファターゼのｌｐｓ−結合部分を使用する敗血症の診断
JP2000350596A (ja) 1999-06-11 2000-12-19 Toyobo Co Ltd 分泌性アルカリフォスファターゼの選択的活性測定方法
DE60120007T2 (de) 2000-01-31 2006-11-16 Pfizer Products Inc., Groton Verwendung von Aktivatoren des Prostaglandinrezeptores 4 zur Behandlung von akuter oder chronischer Niereninsuffizienz
DE60129442T2 (de) 2000-07-19 2008-04-17 Mitsubishi Pharma Corp. Sulphonsäurederivate von hydroxamsäuren und deren verwendung in medizinischen produkten
EP1191097A1 (en) 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
DE10101793A1 (de) 2001-01-17 2002-08-01 Manfred Nilius Verwendung von SLPI zur Behandlung chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen
WO2002057430A2 (en) 2001-01-20 2002-07-25 Cardion Ag Pluripotent adult stem cells derived from regenerative tissue
EP1393734A4 (en) 2001-06-01 2006-04-12 Ajinomoto Kk DRUG AGAINST DARMER DISEASES
US7157260B2 (en) 2001-07-26 2007-01-02 Japan Science & Technology Agency Nicotianamine synthase and gene encoding the same
JP4169966B2 (ja) 2001-11-14 2008-10-22 株式会社ヤクルト本社 炎症性腸疾患予防治療剤
CN1425766A (zh) 2001-12-19 2003-06-25 复旦大学 一种多肽——人含碱性磷酸酶活性位点的蛋白－9.24和编码这种多肽的多核苷酸
EP1578940A4 (en) * 2002-11-13 2007-12-12 Genentech Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR DYSPLASED DIAGNOSIS
US7048914B2 (en) 2002-12-12 2006-05-23 Zoltan Laboratories Placental alkaline phosphatase to control diabetes
WO2004056987A1 (en) * 2002-12-23 2004-07-08 Rijksuniversiteit Groningen Modulation of the thioredoxin pathway
AU2003225410A1 (en) 2003-03-21 2004-10-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
JP4305071B2 (ja) 2003-06-30 2009-07-29 株式会社ニコン 信号補正方法
JP2005065564A (ja) 2003-08-22 2005-03-17 Hiroshi Ueda センサー蛋白質
US7157261B2 (en) 2003-10-27 2007-01-02 Canji, Inc. Rat secreted embryonic alkaline phosphatase
JP4999467B2 (ja) 2004-02-04 2012-08-15 ファルマアウェア セプシス ビー．ブイ． 粘膜関門に存在するｌｐｓを解毒するためのアルカリホスファターゼの使用
US20110142817A1 (en) 2004-02-04 2011-06-16 Pharmaaware Sepsis B.V. Means and method for treating and/or preventing necrotizing enterocolitis
WO2006096527A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Diversa Corporation Nucleic acids and proteins and methods for making and using them
US20070059300A1 (en) 2005-09-12 2007-03-15 Zoltan Laboratories Llc Compounds and compositions to control abnormal cell growth
US7695714B2 (en) 2005-12-28 2010-04-13 Zoltan Laboratories Llc Use of alkaline phosphatase to maintain healthy tissue mass in mammals
RU2006103770A (ru) * 2006-02-08 2007-08-20 Тихоокеанский Институт Биоорганической Химии Дальневосточного Отделения Российской Академии Наук (Тибох Дво Ран) (Ru) Высокоактивная бактериальная щелочная фосфатаза и фрагмент днк, кодирующий щелочную фосфатазу
US20070280922A1 (en) 2006-06-06 2007-12-06 Zoltan Kiss Consulting Combinations of human proteins to enhance viability of stem cells and progenitor cells
US7718170B2 (en) 2006-08-21 2010-05-18 Essential Skincare, Llc Alkaline phosphatase compositions to reduce skin cancer
EP1952823A1 (en) 2007-01-30 2008-08-06 AM-Pharma B.V. The use of alkaline phosphatase in the treatment of reduced renal function
WO2008104199A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Gelato Corporation N.V. Use of ecto-phosphatases for the treatment of (acute) myocardial infarction
EP1985697A1 (en) 2007-04-27 2008-10-29 AM-Pharma B.V. Modified phosphatases
HUE031655T2 (hu) * 2007-05-11 2017-07-28 Alexion Pharma Inc Csontot targetáló alkálikus foszfatáz, készletek és eljárások alkalmazásukra
EP2030980A1 (en) 2007-08-28 2009-03-04 AM-Pharma B.V. Mutants of lactoferrin
WO2009106368A1 (en) 2008-02-29 2009-09-03 Gelato Corporation N.V. Method for increasing the activity of the immune system of a mammal at risk of inflammatory diseases
JP2011521916A (ja) 2008-05-19 2011-07-28 バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ 腸アルカリホスファターゼモジュレーターおよびそれの使用
WO2010025267A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 The General Hospital Corporation Methods of modulating gastrointestinal tract flora levels with alkaline phosphatase
BR112012027765A2 (pt) * 2010-04-30 2019-09-24 Enobia Pharma Inc. métodos, composições e kits para tratamento de distúrbios de mineralização da matriz.
EP3222286B1 (en) 2011-06-08 2020-10-21 AM-Pharma B.V. The use of alkaline phosphatase for preserving renal function
ES2810813T3 (es) 2014-01-24 2021-03-09 Am Pharma Bv Procesamiento para recuperación y purificación de una fosfatasa alcalina
CA2937328C (en) 2014-01-24 2022-09-27 Am-Pharma B.V. Chimeric alkaline phosphatase-like proteins

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015112017A1 (en) 2015-07-30
MX2016009625A (es) 2017-05-01
RU2016131879A3 (ar) 2018-08-16
CN106164262B (zh) 2020-08-07
CN106164262A (zh) 2016-11-23
US20240174994A1 (en) 2024-05-30
JP2022160503A (ja) 2022-10-19
US12534713B2 (en) 2026-01-27
PH12016501441A1 (en) 2016-08-22
MX369041B (es) 2019-10-25
ZA201605028B (en) 2020-02-26
KR102166110B1 (ko) 2020-10-16
JP6940949B2 (ja) 2021-09-29
IL246898A0 (en) 2016-09-29
EP3097189B1 (en) 2018-07-11
SG11201606060WA (en) 2016-08-30
US20170009216A1 (en) 2017-01-12
BR112016017041A2 (pt) 2017-10-03
PL3097189T3 (pl) 2018-11-30
JP2020058375A (ja) 2020-04-16
DK3097189T3 (en) 2018-09-03
SI3097189T1 (sl) 2018-10-30
KR20160117487A (ko) 2016-10-10
AU2015209783B2 (en) 2020-10-01
ES2684639T3 (es) 2018-10-03
HUE039784T2 (hu) 2019-02-28
AU2015209783A1 (en) 2016-08-04
EP3097189A1 (en) 2016-11-30
CN111778228A (zh) 2020-10-16
CA2937328C (en) 2022-09-27
RU2683635C2 (ru) 2019-03-29
US11746340B2 (en) 2023-09-05
PE20161442A1 (es) 2017-01-12
NZ722253A (en) 2021-11-26
JP2017505128A (ja) 2017-02-16
RU2016131879A (ru) 2018-03-01
US20190024062A1 (en) 2019-01-24
US20210163905A1 (en) 2021-06-03
US9926544B2 (en) 2018-03-27
IL246898B (en) 2019-09-26
CA2937328A1 (en) 2015-07-30
BR112016017041B1 (pt) 2023-09-26
EP3425048A1 (en) 2019-01-09
US10822597B2 (en) 2020-11-03
JP7408734B2 (ja) 2024-01-05
PH12016501441B1 (en) 2023-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA516371532B1 (ar) بروتينات خيمرية قلوية شبيهة بإنزيم فوسفاتاز
Li The biochemistry and physiology of metallic fluoride: action, mechanism, and implications
SA520420880B1 (ar) ببتيد ذو نشاط مضاد للسمنة ومضاد للسكري واستخدامه
KR20190137786A (ko) 뇌 오스테오칼신 수용체 및 인지 장애
EA016083B1 (ru) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ С ПОМОЩЬЮ СЛИТОЙ МОЛЕКУЛЫ TACI-Ig
TW201446261A (zh) 索脊瘤之以酵母菌爲基礎之免疫療法
Zhang et al. The restoration of Wnt/β-catenin signalling activity by a tuna backbone-derived peptide ameliorates hypoxia-induced cardiomyocyte injury
NZ722253B2 (en) Chimeric alkaline phosphatase-like proteins
HK1227925B (en) Chimeric alkaline phosphatase-like proteins
HK1227925A1 (en) Chimeric alkaline phosphatase-like proteins
Strandberg et al. TRAIL agonists rescue mice from radiation-induced lung injury
Chik Traversing epithelial barriers as a cause and treatment avenue for kidney stones
Starbuck et al. Epigallocatechin-3-gallate improves facial dysmorphology associated with down syndrome
HK40032209A (en) Cytocide
LLLLLLLLLS LLGGLGLGGGL GLL GGGGL GL GLLLLSGGGGG
Fund Medical and Dental
Britton Craniofacial effects of alendronate treatment in growing osteogenesis imperfecta mice