JP2020005662A - 腫瘍を診断および処置するためのウイルス様粒子結合体 - Google Patents

Abstract

【課題】腫瘍を診断および処置するためのウイルス様粒子結合体の提供。
【解決手段】本開示は、光感受性分子に結合体化されたウイルス様粒子を使用する、腫瘍（例えば、眼腫瘍）の診断および／もしくは処置のための方法および組成物に関する。いくつかの場合には、本明細書で提供される方法および組成物は、健康な細胞に損傷を与えることなく癌性の腫瘍細胞を選択的に死滅させるために使用され得る。例えば、光感受性分子を含む（例えば、光感受性分子に結合体化される）ウイルス様ナノ粒子は、腫瘍細胞へと選択的に送達され得、光に曝すことによって光活性化され得る。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１３年９月１８日に出願された米国仮出願第６１／８７９，６２７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

（発明の分野）
この開示は、腫瘍診断および治療剤の分野に関する。

（発明の背景）
多くの処置が癌に関して利用可能であるが、癌の多くの形態は、不治のままであるか、処置不能のままであるか、または標準治療に対して抵抗性になり、多くの癌に関する有効な処置は望ましくない副作用を有する。眼の癌（例えば、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫）は、処置するのが特に困難である。眼内黒色腫と診断された患者は、その腫瘍のサイズに依存して、以下を含むわずかな処置選択肢を有する：（１）外科的処置（例えば、切除、摘出もしくは内容除去）。これらは全て、非常に侵襲性であり、かつ主に眼および視神経の一部の除去を伴い得る（術後に、上記患者は通常、義眼を合わせて調整する）；および（２）プラーク小線源療法（ｐｌａｑｕｅ ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）。放射線療法の１タイプであり、ここで放射性シードが片側を覆っている金属薄片（例えば、金）は、上記シードを上記腫瘍に向けて、眼の外壁に縫い付けられる。上記金属薄片は、処置（これは通常数日間続く）の最後に除去される。重篤な放射能関連合併症としては、白内障の発生（これは、最も一般的であり、硝子体出血が後に起こる）が挙げられる。他の合併症としては、ドライアイ、角膜炎、放射線誘発性虹彩新生血管形成、血管新生緑内障、放射線誘発性網膜症、放射線誘発性視神経障、上強膜沈着（ｅｐｉｓｃｌｅｒａｌ ｄｅｐｏｓｉｔｓ）、強膜壊死および／もしくは外眼筋変性（ｅｘｔｒａｏｃｕｌａｒ ｍｕｓｃｌｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。放射線網膜症は、プラーク小線源療法で処置した患者のうちの１０〜６３％において起こると報告されており、処置から黄斑症発生までの平均時間は、約２５．６ヶ月である。

（発明の要旨）
本開示は、少なくとも一部分は、腫瘍細胞を検出および／もしくは選択的に標的化するための、例えば、癌（例えば、眼の癌）の診断および／もしくは処置のための、方法および組成物を提供する。いくつかの場合には、本明細書で提供される方法および組成物は、健康な細胞に損傷を与えることなく癌性の腫瘍細胞を選択的に死滅させるために使用され得る。例えば、光感受性分子を含む（例えば、光感受性分子に結合体化される）ウイルス様ナノ粒子は、腫瘍細胞へと選択的に送達され得、光に曝すことによって光活性化され得る。光活性化された場合、光感受性分子は光子を吸収し、その吸収されたエネルギーは、毒性（例えば、細胞傷害性）を引き起こす分子変化を生じる。「光感受性ウイルス様ナノ粒子」（本明細書では「光感受性ウイルス様粒子」ともいわれる）とは、光感受性分子に結合体化されたウイルス様ナノ粒子をいう。驚くべきことに、ウイルス様ナノ粒子への光感受性分子の結合体化は、上記ナノ粒子の組織／腫瘍向性（例えば、特定の宿主腫瘍組織もしくは腫瘍細胞に対する上記ウイルス様ナノ粒子の特異性）に干渉しない。

本開示のウイルス様ナノ粒子（ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ともいわれる）は、一般に、
Ｌ１キャプシドタンパク質、またはＬ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせからアセンブリされ、そして上記光感受性分子は、いくつかの実施形態において、上記ウイルス様ナノ粒子を形成するキャプシドタンパク質に結合体化される。従って、本開示の種々の局面は、キャプシドタンパク質に結合体化された光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様ナノ粒子を提供する。

本開示のいくつかの局面はまた、１粒子あたり、約５０〜約５００個、約５０〜約６００個、約５０〜約７００個、約５０〜約８００個、約５０〜約９００個、もしくは約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を提供する。いくつかの実施形態において、腫瘍標的化ウイルス様粒子は、１粒子あたり、約４００個、約５００個、約６００個、約７００個、約８００個、約９００個もしくは約１０００個の光感受性分子を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍標的化ウイルス様粒子は、１粒子あたり、５００個の光感受性分子もしくは１０００個の光感受性分子を含む。

いくつかの実施形態において、上記キャプシドタンパク質は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、上記パピローマウイルスキャプシドタンパク質は、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質（例えば、ウシパピローマウイルスキャプシドタンパク質）である。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含み、かつヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６、ＨＰＶ １８、もしくはＨＰＶに対して特異的な既存の抗体と交差反応しない。

いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、パピローマＬ１もしくはＬ１／Ｌ２タンパク質（例えば、ヒト、ウシ、もしくは他の種の）を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｌ１もしくはＬ１／Ｌ２ ＶＬＰは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
１６、ＨＰＶ １８に対する中和抗体、または他のＨＰＶに対して特異的な既存の抗体と交差反応しない。しかし、いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、ＨＰＶ１６のヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、キャプシドタンパク質の表面露出ペプチドに結合体化される。

いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、Ｌ１キャプシドタンパク質、またはＬ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、Ｌ１キャプシドタンパク質からなる。

いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、ＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質（例えば、配列番号２）、ＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質とＢＰＶ Ｌ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、ＨＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質、またはＨＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質とＨＰＶ Ｌ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質は、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号１）である。従って、いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子は、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１キャプシドタンパク質、または改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１キャプシドタンパク質（例えば、配列番号１）とＨＰＶ Ｌ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含むか、または上記からなる。

いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子の上記キャプシドタンパク質は、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する。このようなキャプシドタンパク質の非限
定的例は、ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１キャプシドタンパク質（例えば、配列番号１）である。改変されたキャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子は、野生型ウイルス様粒子と比較して、本明細書では、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を含むウイルス様粒子といわれ得る。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、キャプシドタンパク質に共有結合的に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記キャプシドタンパク質のアミノ酸に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記キャプシドタンパク質のアミノ酸のアミン基（例えば、一級脂肪族アミン）に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記キャプシドタンパク質のリジン残基のアミン基（例えば、リジンの側鎖アミン）に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記キャプシドタンパク質のアルギニンおよび／もしくはヒスチジン残基のアミン基に結合体化される。本開示は、光感受性分子を、アミン基を含むリジンおよび他のアミノ酸に結合体化するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面への上記ウイルス様粒子の結合を損なわない（例えば、妨害も干渉も阻害もしない）。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンもしくは他のポリサッカリドへの上記ウイルス様粒子の結合を損なわない（例えば、妨害も干渉も阻害もしない）。

いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、約１０〜約１０００個の光感受性分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、約１００〜約１０００個の光感受性分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、約１００〜約５００個の光感受性分子を含む。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、約５００〜約１０００個の光感受性分子、またはより多くを含む。

いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、Ｌ１キャプシドタンパク質、Ｌ２キャプシドタンパク質、またはＬ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせのリジン残基もしくは他のアミノ酸残基に結合体化される約１０〜約１０００個の光感受性分子を含む。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、赤外線、近赤外線もしくは紫外線によって活性化される。光感受性分子は、上記分子が光子を吸収し、その吸収されたエネルギーが毒性を引き起こす分子変化を生じる場合に、「活性化」されると考えられる（本明細書中、他の箇所で記載されるとおり）。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ポルフィリン分子、クロロフィル分子、もしくは上記のうちのいずれか２種以上の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、ポルフィリン分子である。本開示に従って使用するためのポルフィリン分子の例としては、ＨｐＤ（ヘマトポルフィリン誘導体）、ＨｐＤベースのＢＰＤ（ベンゾポルフィリン誘導体）、ＡＬＡ（５−アミノレブリン酸）およびテキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記ポルフィリン分子は、ベルテポルフィン（ビスダイン（登録商標））である。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、クロロフィル分子である。本開示に従って使用するためのクロロフィル分子の例としては、クロリン、プルプリンおよびバクテリオクロリン（ｂａｃｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、色素である。本開示に従って使用するための色素の例としては、フタロシアニンおよびおよびナフタロシアニン（ｎａｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記フタロシアニン色素は、蛍光分子でありかつ近赤外線分子である。例えば、いくつかの実施形態において、上記フタロシアニン色素は、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ、ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標））である。ＩＲ７００色素は、代表的には６８０ｎｍ〜８００ｎｍの間の近赤外線（ＮＩＲ）スペクトルにある吸収波長および発光波長を有する蛍光色素である。ＮＩＲスペクトルにある吸収波長および発光波長を有する他の蛍光色素は、本明細書で提供される。

いくつかの実施形態において、光感受性分子は、フタロシアニン色素（例えば、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ））、ポルフィリン分子（例えば、ベルテポルフィン（例えば、ビスダイン（登録商標）））およびフタロシアニン色素とポルフィリン分子との組み合わせから選択される。

本開示のいくつかの局面は、腫瘍を有する被験体に、上記ウイルス様粒子、もしくは本明細書で提供される光感受性ウイルス様粒子のいずれか一方を投与する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、ウイルス様粒子の上記光感受性分子を、上記光感受性分子の可視化を可能にする光の波長で活性化する工程を包含する。従って、いくつかの実施形態において、本開示の光感受性分子は、画像化薬剤および／もしくは診断薬剤として使用される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記光感受性分子を、上記分子を細胞傷害性にする光の波長で活性化する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記光感受性分子を、直接的かつ不可逆的な細胞損傷を引き起こして、壊死をもたらす、上記腫瘍細胞内でエネルギー移動を生じる光の波長で活性化する工程を包含する。従って、いくつかの実施形態において、本開示の光感受性分子は、治療剤および／もしくは予防剤として使用される。

本開示のいくつかの局面は、腫瘍を有する被験体に、キャプシドタンパク質に結合体化された光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ウイルス様粒子の光感受性分子を、上記分子を可視にする波長で活性化する工程を包含する。すなわち、上記光感受性分子は、光で励起させた際に再発光する。いくつかの実施形態において、上記方法は、光感受性分子を、上記分子を細胞傷害性にし、それによって上記腫瘍の細胞を死滅させる波長で活性化する工程を包含する。すなわち、上記光感受性分子は、光で励起させた際に分子変化を受けて、細胞に対して毒性になる上記光感受性分子を生じる。

本開示のいくつかの局面は、腫瘍を有する被験体に、約５０〜約１０００個、約５０〜５００個、もしくは約５００〜１０００個の光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、腫瘍を有する被験体に、約１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個もしくはより多くの光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、光感受性分子を、上記分子を可視にする波長で活性化する工程を包含する。いく
つかの実施形態において、上記方法は、光感受性分子を、上記分子を細胞傷害性にし、それによって上記腫瘍の細胞を死滅させる波長で活性化する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、レーザー活性化される。いくつかの実施形態において、上記レーザーは、赤外線レーザー、近赤外線レーザーもしくは紫外線レーザーである。いくつかの実施形態において、上記赤外線レーザーは、５ジュール（Ｊ）〜１００Ｊ（もしくはＪ／ｃｍ^２）（例えば、５Ｊ、６Ｊ、７Ｊ、８Ｊ、９Ｊ、１０Ｊ、１１Ｊ、１２Ｊ、１３Ｊ、１４Ｊ、１５Ｊ、１６Ｊ、１７Ｊ、１８Ｊ、１９Ｊ、２０Ｊ、２１Ｊ、２２Ｊ、２３Ｊ、２４Ｊ、２５Ｊ、２６Ｊ、２７Ｊ、２８Ｊ、２９Ｊ、３０Ｊ、３１Ｊ、３２Ｊ、３３Ｊ、３４Ｊ、３５Ｊ、３６Ｊ、３７Ｊ、３８Ｊ、３９Ｊ、４０Ｊ、４１Ｊ、４２Ｊ、４３Ｊ、４４Ｊ、４５Ｊ、４６Ｊ、４７Ｊ、４８Ｊ、４９Ｊ、５０Ｊ、５１Ｊ、５２Ｊ、５３Ｊ、５４Ｊ、５５Ｊ、５６Ｊ、５７Ｊ、５８Ｊ、５９Ｊ、６０Ｊ、６１Ｊ、６２Ｊ、６３Ｊ、６４Ｊ、６５Ｊ、６６Ｊ、６７Ｊ、６８Ｊ、６９Ｊ、７０Ｊ、７１Ｊ、７２Ｊ、７３Ｊ、７４Ｊ、７５Ｊ、７６Ｊ、７７Ｊ、７８Ｊ、７９Ｊ、８０Ｊ、８１Ｊ、８２Ｊ、８３Ｊ、８４Ｊ、８５Ｊ、８６Ｊ、８７Ｊ、８８Ｊ、８９Ｊ、９０Ｊ、９１Ｊ、９２Ｊ、９３Ｊ、９４Ｊ、９５Ｊ、９６Ｊ、９７Ｊ、９８Ｊ、９９Ｊもしくは１００Ｊ（もしくはＪ／ｃｍ^２））である。いくつかの実施形態において、上記レーザーは、約５秒〜約５分にわたって印加される。

いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ウイルス様粒子を被験体に投与してから約３０分〜約４８時間後に活性化される。例えば、上記光感受性分子は、上記ウイルス様粒子を被験体に投与してから３０分後に活性化され得る。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ウイルス様粒子を被験体に投与してから１時間、２時間（ｈ）、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ、１１ｈ、１２ｈ、１３ｈ、１４ｈ、１５ｈ、１６ｈ、１７ｈ、１８ｈ、１９ｈ、２０ｈ、２１ｈ、２２ｈ、２３ｈもしくは２４ｈ後に活性化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ウイルス様粒子を被験体に投与してから１日、２日もしくは３日後に活性化される。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、眼腫瘍もしくは眼へと転移した腫瘍である。例えば、いくつかの実施形態において、上記眼腫瘍は、硝子体、脈絡膜腔（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｓｐａｃｅ）、虹彩、毛様体、強膜、中心窩、網膜、視神経円板もしくは視神経に位置する。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、肺、胸膜、肝臓、膵臓、胃、食道、結腸、乳房、卵巣、前立腺、脳、髄膜、精巣、消化管、腎臓もしくは膀胱に位置する。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、手術介入なしで接近可能である。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、頭部、頸部、子宮頸部、喉頭もしくは皮膚に位置する。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、希少疾患（ｏｒｐｈａｎ ｏｒ ｒａｒｅ
ｄｉｓｅａｓｅ）である。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、癌性である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、転移性である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、前癌性もしくは異形成性である。

いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、注射によって投与される。例え
ば、上記ウイルス様粒子は、眼内に、硝子体の中に、もしくは静脈内に注射によって投与され得る。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、中空もしくは被覆済みのニードル、ミニニードルもしくはマイクロニードルで投与される。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、局所投与される。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、移植によって投与される。

いくつかの実施形態において、上記キャプシドタンパク質は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、上記パピローマウイルスキャプシドタンパク質は、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質（例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）キャプシドタンパク質）である。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含み、かつヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６ともＨＰＶ １８ともＨＰＶに対して特異的な既存の抗体とも交差反応しない。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様粒子は、ヒトパピローマウイルス タイプ１６キャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記ＶＬＰは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６、ＨＰＶ １８ ＶＬＰに対して特異的な抗体もしくはＨＰＶ感染によって特異的に誘発される既存の抗体を結合しない。

本開示のいくつかの局面は、被験体において、腫瘍（例えば、眼腫瘍および悪性母斑（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｎｅｖｉ））を検出するための方法を提供し、上記方法は、上記被験体に（例えば、上記被験体の眼に）、本明細書で提供されるウイルス様粒子（例えば、光感受性分子（例えば、蛍光色素もしくは赤外色素）を含むウイルス様粒子）のうちのいずれか１種を投与する工程、および上記腫瘍の位置を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体（例えば、上記被験体の眼）をレーザー（例えば、紫外線レーザーもしくは赤外線レーザー）で照明することによって、上記腫瘍の位置を検出する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ウイルス様粒子を投与する前に、腫瘍を有すると疑われる被験体を同定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、光感受性ウイルス様粒子を上記被験体の腫瘍に、または腫瘍を有するかもしくは有すると疑われる被験体に投与することによって、上記腫瘍を診断および／もしくは処置する工程を包含する。

本開示の他の局面は、非癌性の（例えば、正常な、健康な）細胞の増殖もしくは生存性を阻害することなく、癌性細胞の増殖を選択的に阻害するかもしくは死滅させるための方法を提供し、上記方法は、被験体の腫瘍に（例えば、上記被験体の眼腫瘍に）、本明細書で提供される腫瘍標的化ウイルス様粒子のうちのいずれか１種（例えば、光感受性分子（例えば、赤外色素）を含むウイルス様粒子）を投与する工程、および上記腫瘍の癌性細胞を、上記腫瘍を赤外線レーザーに（例えば、約６６０ｎｍ〜７４０ｎｍの波長および少なくとも８Ｊの線量で）、有効に供することによって照射する工程を包含する。

いくつかの実施形態において、本開示は、パピローマウイルスＬ１タンパク質（例えば、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質）に結合体化された光感受性分子を含むウイルス様ナノ粒子（ウイルス様粒子ともいわれる）を提供する。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様ナノ粒子は、直径２０〜６０ナノメートル（例えば、１０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍもしくは６０ｎｍ）である。いくつかの実施形態において、ウイルス様ナノ粒子は、３００〜５００のＬ１（例えば、ＢＰＶ Ｌ１）キャプシドタンパク質、例えば、３６０のＬ１キャプシドタンパク質（例えば、正二十面体対称性に基づいて）を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス様ナノ粒子は各々、約３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０もしくは５００のＬ１（例えば、ＢＰＶ Ｌ１）キャプシドタ
ンパク質を含むことは、認識されるべきである。しかし、いくつかの実施形態において、ウイルス様ナノ粒子は、３００未満のＬ１（例えば、ＢＰＶ Ｌ１）キャプシドタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、１００〜１０００個の光感受性分子（例えば、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個もしくは１０００個の分子）に共有結合的に結合体化されたウシパピローマウイルスウイルス様ナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、上記ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ウイルス様ナノ粒子のキャプシドタンパク質は、ＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質、またはＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質とＢＰＶ Ｌ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ウイルス様ナノ粒子に（もしくは上記ウイルス様ナノ粒子のキャプシドタンパク質に）、上記光感受性分子の中のエステル基と、上記キャプシドタンパク質の中のアミン基とを反応させ、それによってアミド結合を形成することによって形成される共有結合を通じて結合体化される。従って、いくつかの実施形態において、本開示のウイルス様ナノ粒子のキャプシドタンパク質は、光感受性分子にアミド結合によって結合体化される。

いくつかの実施形態において、本開示は、３００〜５００のＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質および／もしくは直径２０ ６０ｎｍを含むウイルス様ナノ粒子を提供し、そのうちの少なくとも一部（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％）は、（例えば、アミド結合を通じて）１〜５個の（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個の）光感受性分子（例えば、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ））に共有結合的に結合体化される。本開示はまた、ウイルス様ナノ粒子を生成するための方法および診断剤、治療剤もしくは予防剤としてウイルス様ナノ粒子を被験体に投与するための方法を提供する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
キャプシドタンパク質に結合体化された光感受性分子を含む、腫瘍標的化ウイルス様粒子。
（項目２）
前記キャプシドタンパク質は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目１に記載のウイルス様粒子。
（項目３）
前記パピローマウイルスキャプシドタンパク質は、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目２に記載のウイルス様粒子。
（項目４）
前記非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質は、ウシパピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目３に記載のウイルス様粒子。
（項目５）
前記ウイルス様は、ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含み、かつヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６ともＨＰＶ １８ともＨＰＶに特異的な既存の抗体とも交差反応しない、項目２に記載のウイルス様粒子。
（項目６）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目７）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む、項目１〜５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目８）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質からなる、項目７に記載のウイルス様粒子。
（項目９）
前記ウイルス様粒子は、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する、項目１〜８のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１０）
前記光感受性分子は、前記キャプシドタンパク質に共有結合的に結合体化される、項目１〜９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１１）
前記光感受性分子は、前記キャプシドタンパク質のリジン残基に結合体化される、項目１〜１０のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１２）
前記光感受性分子は、共有結合的アミド結合によって前記キャプシドタンパク質に結合体化される、項目１０または１１に記載のウイルス様粒子。
（項目１３）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面への前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目１〜１２のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１４）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目１３に記載のウイルス様粒子。
（項目１５）
前記ウイルス様粒子は、約１０〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目１〜１４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１６）
前記ウイルス様粒子は、約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目１５に記載のウイルス様粒子。
（項目１７）
前記ウイルス様粒子は、約１００〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目１６に記載のウイルス様粒子。
（項目１８）
前記光感受性分子は、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ポルフィリン分子、クロロフィル分子、もしくは上記のうちのいずれか２種以上の組み合わせを含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目１９）
前記光感受性分子は、赤外線、近赤外線もしくは紫外線によって活性化される、項目１〜１８のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目２０）
前記光感受性分子は、フタロシアニン色素、ベルテポルフィン分子、およびフタロシアニン色素とベルテポルフィン分子との組み合わせから選択される、項目１〜１９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目２１）
約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む、腫瘍標的化ウイルス様粒子。
（項目２２）
前記光感受性分子は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質であるキャプシドタンパク質に結合体化される、項目２１に記載のウイルス様粒子。
（項目２３）
前記パピローマウイルスキャプシドタンパク質は、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目２２に記載のウイルス様粒子。
（項目２４）
前記非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質は、ウシパピローマウイルスキャ
プシドタンパク質である、項目２３に記載のウイルス様粒子。
（項目２５）
前記ウイルス様粒子は、ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含み、かつヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６ともＨＰＶ １８ともＨＰＶに特異的な既存の抗体とも交差反応しない、項目２２に記載のウイルス様粒子。
（項目２６）
前記光感受性分子は、前記ウイルス様粒子のキャプシドタンパク質に結合体化される、項目２１〜２５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目２７）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質を含む、項目２６に記載のウイルス様粒子。
（項目２８）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む、項目２６または２７に記載のウイルス様粒子。
（項目２９）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質からなる、項目２８に記載のウイルス様粒子。
（項目３０）
前記ウイルス様粒子は、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する、項目２１〜２９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３１）
前記光感受性分子は、キャプシドタンパク質に共有結合的に結合体化される、項目２２〜３０のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３２）
前記光感受性分子は、前記キャプシドタンパク質のリジン残基に結合体化される、項目２２〜３１のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３３）
前記光感受性分子は、共有結合的アミド結合によって前記キャプシドタンパク質に結合体化される、項目３１または３２に記載のウイルス様粒子。
（項目３４）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面への前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目２１〜３３のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３５）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目３４に記載のウイルス様粒子。
（項目３６）
前記ウイルス様粒子は、約１００〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目２１〜３５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３７）
前記光感受性分子は、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ポルフィリン分子、クロロフィル分子、もしくは上記のうちのいずれか２種以上の組み合わせを含む、項目２１〜３６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３８）
前記光感受性分子は、赤外線、近赤外線もしくは紫外線によって活性化される、項目２１〜３７のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目３９）
前記光感受性分子は、フタロシアニン色素、ベルテポルフィン分子およびフタロシアニン色素とベルテポルフィン分子との組み合わせから選択される、項目２１〜３８のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目４０）
腫瘍を有する被験体に、項目１〜３９のいずれか１項に記載のウイルス様粒子を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
光感受性分子を活性化する工程をさらに包含する、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
酸素との項間交差を可能にし、それによって細胞傷害性分子を生成するか、またはエネルギー移動を誘導して細胞膜を損傷する光の波長で、前記光感受性分子を活性化する工程をさらに包含する、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
腫瘍を有する被験体に、キャプシドタンパク質に結合体化した光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目４４）
腫瘍を有する被験体に、約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与する工程、
を包含する、方法。
（項目４５）
光感受性分子を、前記分子を可視にする波長で活性化する工程をさらに包含する、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
光感受性分子を、前記分子を細胞傷害性にする波長で活性化し、それによって、前記腫瘍の細胞を死滅させる工程をさらに包含する、項目４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記光感受性分子は、レーザー活性化される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記レーザーは、赤外線レーザー、近赤外線レーザーもしくは紫外線レーザーである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記赤外線レーザーによって送達されるエネルギーは、５Ｊ〜１００Ｊである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記赤外線レーザーによって送達されるエネルギーは、５０Ｊである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記レーザーは、約５秒間〜約５分間印加される、項目４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記光感受性分子は、前記ウイルス様粒子を投与してから約３０分〜約４８時間後に活性化される、項目４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記腫瘍は、眼腫瘍である、項目４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記眼腫瘍は、硝子体、脈絡膜腔、虹彩、毛様体、強膜、中心窩、網膜、視神経円板もしくは視神経に位置する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記腫瘍は、肺、胸膜、肝臓、膵臓、胃、食道、結腸、乳房、卵巣、前立腺、脳、髄膜、精巣、腎臓もしくは膀胱に位置する、項目４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記腫瘍は、手術介入なしで接近可能である、項目４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記腫瘍は、頭部、頸部、子宮頸部、喉頭もしくは皮膚に位置する、項目５２に記載の方法。
（項目５８）
前記腫瘍は、希少疾患である、項目４３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記腫瘍は、癌性もしくは悪性である、項目４３〜５８のいずれか１項に記載の方法。（項目６０）
前記腫瘍は、転移性、前癌性、異形成性であるか、または悪性転換を示す増殖中の疑わしい細胞を有する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ウイルス様粒子は、注射によって投与される、項目４３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記ウイルス様粒子は、中空もしくは被覆済みニードル、ミニニードルもしくはマイクロニードルで投与される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ウイルス様粒子は、局所的に、眼内に、硝子体内に、上脈絡膜に投与される、項目４３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記ウイルス様粒子は、移植によって投与される、項目４３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記キャプシドタンパク質は、パピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目４３〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記パピローマウイルスキャプシドタンパク質は、非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記非ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質は、ウシパピローマウイルスキャプシドタンパク質である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ウイルス様粒子は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） １６、ＨＰＶ １８ ＶＬＰによって誘発される抗体と、もしくはＨＰＶ感染によって誘発される既存の抗体と交差反応しないヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質を含む、項目４３〜６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６９）
前記光感受性分子は、前記ウイルス様粒子のキャプシドタンパク質に結合体化される、項目４３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との組み合わせを含む、項目６９または７０に記載の方法。
（項目７２）
前記キャプシドタンパク質は、Ｌ１キャプシドタンパク質からなる、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記ウイルス様粒子は、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する、項目４３〜７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記光感受性分子は、キャプシドタンパク質に共有結合的に結合体化される、項目４３〜７３のいずれか１項に記載の方法。
（項目７５）
前記光感受性分子は、前記キャプシドタンパク質のリジン残基に結合体化される、項目４３〜７４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目７６）
前記光感受性分子は、共有結合的アミド結合によって前記キャプシドタンパク質に結合体化される、項目７４または７５に記載のウイルス様粒子。
（項目７７）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面への前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目４３〜７６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
（項目７８）
前記光感受性分子は、腫瘍細胞の表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカンへの前記ウイルス様粒子の結合を損なわない、項目７７に記載のウイルス様粒子。
（項目７９）
前記ウイルス様粒子は、約１０〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目４３、４６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
前記ウイルス様粒子は、約５０〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目４３、４６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
前記ウイルス様粒子は、約１００〜約１０００個の光感受性分子を含む、項目４３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
（項目８２）
前記光感受性分子は、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ポルフィリン分子、クロロフィル分子、もしくは上記のうちのいずれか２種以上の組み合わせを含む、項目４３〜８１のいずれか１項に記載の方法。
（項目８３）
前記光感受性分子は、フタロシアニン色素、ベルテポルフィン分子およびフタロシアニン色素とベルテポルフィン分子との組み合わせから選択される、項目４３〜８２のいずれか１項に記載の方法。

図１は、光感受性分子に結合体化されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を使用して細胞死を誘発するための機構を示す。 図２は、二価の標的化（例えば、抗体によって）、および多価の標的化（例えば、ＶＬＰによって）の比較を示す。 図３は、細胞へのＶＬＰ結合の特異性がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）相互作用によって媒介され、ヘパリンによって阻害されることを実証するグラフを示す。それはさらに、上記光感受性ＶＬＰが腫瘍細胞に結合され、上記細胞が赤外線照射に供される場合にのみ腫瘍細胞の特異的死滅を示す。 図４は、細胞死が赤外線の線量および送達される上記ＶＬＰおよび光感受性分子（例えば、色素）の量に依存することを実証するグラフを示す。 図５は、ＩＲ７００に結合体化されたＶＬＰ（図中ではＰｓＶと称される）を用いての照射の際に、インビトロ卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ−３）死を実証するグラフを示す。 図６Ａは、コントロールＶＬＰのエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）分析を示す。図６Ｂは、ＩＲ７００の１０００分子に結合体化されたＶＬＰ（図中ではＰｓＶと称される）のＥＳＩ−ＴＯＦ分析を示す。 図６Ａは、コントロールＶＬＰのエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）分析を示す。図６Ｂは、ＩＲ７００の１０００分子に結合体化されたＶＬＰ（図中ではＰｓＶと称される）のＥＳＩ−ＴＯＦ分析を示す。 図７Ａ〜７Ｃは、二価薬剤（例えば、抗体）および多価薬剤（例えば、光感受性ＶＬＰ（ＶＬＰ結合体ともいわれ、図中ではＰｓＶと称される）の有効性を比較する、ヒト上皮増殖因子レセプター２陰性（ＨＥＲ２⁻）眼内黒色腫細胞株（９２．１）の細胞死のグラフを示す。 図８Ａ〜８Ｃは、二価薬剤（例えば、抗体）および多価薬剤（例えば、光感受性ＶＬＰ（ＶＬＰ結合体ともいわれ、図中ではＰｓＶと称される）の有効性を比較する、ヒト上皮増殖因子レセプター２陽性（ＨＥＲ２^＋）卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ−３）の細胞死のグラフを示す。 図９は、ワクチン誘発性抗ＨＰＶ１６中和抗体が、上記眼内黒色腫細胞株９２．１へのＢＰＶ＊ＩＲ７００ ＶＬＰの結合をブロックしないことを実証するグラフを示す。 図１０Ａは、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ ＮＨＳエステルの化学構造を示す。図１０Ｂは、反応性カルボキシル基を丸で囲って、ビスダイン（登録商標）の化学構造を示す。 図１０Ａは、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ ＮＨＳエステルの化学構造を示す。図１０Ｂは、反応性カルボキシル基を丸で囲って、ビスダイン（登録商標）の化学構造を示す。 図１１は、ビスダイン（登録商標）およびＶＬＰの（１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）（ＥＤＣ）およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）媒介性の連結を伴う反応スキームを示す。このスキームにおいて、まる１はビスダイン（登録商標）を表し、まる２はＶＬＰを表す。所望の最終生成物に対して２経路があることに注意のこと。スルホ−ＮＨＳの存在は、上記反応を安定化する傾向があり、所望の生成物の生成を増強する。 図１２は、癌細胞の種々のタイプに結合するＨＰＶ１６キャプシドタンパク質、改変体ＨＰＶ１６／３１キャプシドタンパク質およびＢＰＶ１キャプシドタンパク質（Ｌ１、もしくはＬ１およびＬ２タンパク質）を含むウイルス様ナノ粒子のＨＳＰＧ依存性結合の代表的サンプルのヒストグラムを示す。 図１３Ａおよび図１３Ｂは、注射後、１２時間でのＰＢＳを注射した陰性コントロールマウス、１２時間での光感受性ウイルス様ナノ粒子を注射したマウス（＃３および＃４）、および２４時間での光感受性ウイルス様ナノ粒子を注射したマウス（＃１および＃２）の明視野（図１３Ａ）および蛍光（図１３Ｂ）での切除した腫瘍組織の画像を示す。 図１４は、ＶＬＰの静脈内注射の１２時間後および２４時間後に切除したエキソビボＴＣ−１腫瘍サンプル（図１３と同じ腫瘍）における全腫瘍会合ウイルス様ナノ粒子関連蛍光の定量的表示を示す。 図１５は、実施例１４の実験デザインの模式図を示す。 図１６Ａおよび図１６Ｂは、光感受性ウイルス様ナノ粒子（図中ではＮＰｓと称される）のインビボ投与および皮下の９２．１眼内黒色腫（ＯＭ）細胞に対する光線量設定（ｌｉｇｈｔ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（細胞生存性を光処理後２４時間で測定した）の後の細胞死のパーセンテージのグラフを示す。 図１７Ａ〜１７Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるデータの生のヒストグラムを示す。 図１７Ａ〜１７Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるデータの生のヒストグラムを示す。 図１７Ａ〜１７Ｃは、図１６Ａおよび図１６Ｂに示されるデータの生のヒストグラムを示す。 図１８（上パネル）は、１００μｌのＰＢＳ中の２×１０^５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下接種し、以下を投与した動物から得られた組織サンプルを示す：（１）処置なし、（２）改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質およびＨＰＶ Ｌ２タンパク質からアセンブリし、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸで標識した、１００μｇ ウイルス様ナノ粒子（図中ではＮＰｓと称される）［光なし］、（３）５０Ｊ／ｃｍ^２ 光ありでのＰＢＳ、（４）５０Ｊ／ｃｍ^２ 光ありでの２００μｇ ウイルス様ナノ粒子、（５）５０Ｊ／ｃｍ^２ 光ありでの１００μｇ ウイルス様ナノ粒子、および（６）５０Ｊ／ｃｍ^２ 光ありでの５０μｇ ウイルス様ナノ粒子。図１８（下パネル）は、６つの試験条件の各々に対する死細胞のパーセンテージを示す。 図１９Ａは、実施例１５に記載される実験の模式図を示す。図１９Ｂは、ウイルス様ナノ粒子（図中ではナノ粒子と称される）対コントロール（光あり）を注射した動物における％生存性のグラフを示す。図１９Ｃは、個々のマウスにおいて腫瘍容積（上パネル）、「Ｅ７テトラマー^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞」および「ＩＮＦγ分泌ＣＤ８^＋細胞」を示す。 図１９Ａは、実施例１５に記載される実験の模式図を示す。図１９Ｂは、ウイルス様ナノ粒子（図中ではナノ粒子と称される）対コントロール（光あり）を注射した動物における％生存性のグラフを示す。図１９Ｃは、個々のマウスにおいて腫瘍容積（上パネル）、「Ｅ７テトラマー^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞」および「ＩＮＦγ分泌ＣＤ８^＋細胞」を示す。 図１９Ａは、実施例１５に記載される実験の模式図を示す。図１９Ｂは、ウイルス様ナノ粒子（図中ではナノ粒子と称される）対コントロール（光あり）を注射した動物における％生存性のグラフを示す。図１９Ｃは、個々のマウスにおいて腫瘍容積（上パネル）、「Ｅ７テトラマー^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞」および「ＩＮＦγ分泌ＣＤ８^＋細胞」を示す。 図２０は、細胞生存性に対する光感受性ＢＰＶウイルス様ナノ粒子および光感受性ＨＰＶウイルス様ナノ粒子の効果を比較する、有効性アッセイの結果のグラフを示す。 図２１は、細胞への光感受性ＢＰＶウイルス様ナノ粒子および光感受性ＨＰＶウイルス様ナノ粒子の結合を比較する、結合アッセイの結果のグラフを示す。 図２２は、光感受性ウイルス様ナノ粒子（図中ではＰｓＶと称される）での処置後の頭頚部癌細胞の腫瘍増殖曲線のグラフを示す。 図２３Ａおよび図２３Ｂは、本開示の光感受性ウイルス様ナノ粒子生成プロセス（例えば、実施例２０に記載されるとおり）の例を示す。 図２３Ａおよび図２３Ｂは、本開示の光感受性ウイルス様ナノ粒子生成プロセス（例えば、実施例２０に記載されるとおり）の例を示す。

（発明の詳細な説明）
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、選択的に光に曝された場合に毒性になり、悪性および他の病的細胞を標的化および／もしくは死滅させる非毒性光感受性分子を使用する光線療法の一形態である。癌の処置においてＰＤＴに提起される難題は、高濃度の光感受性分子をもっぱら腫瘍細胞に送達することである。標的化された送達を達成するために、抗体が使用され得るが、それらはその送達能力が制限されている（これは、１抗体あたり２〜８個の光感受性分子の範囲にある）。さらに、同定された腫瘍レセプター分子を欠いており、従って、抗体で標的化できない重要な腫瘍がある。結果として、複数の腫瘍は、未処置のままである（例えば、眼内黒色腫）。さらに、抗体／色素結合体によって標的化される分子の多く（例えば、ＥＧＦＲ）はまた、非腫瘍細胞の表面に見出され、望ましくないオフターゲット効果をもたらす。

本開示は、一部分は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（例えば、パピローマＶＬＰ）（本明細書ではウイルス様ナノ粒子ともいわれる）がそれらの腫瘍標的化能力も構造安定性も失うことなく、多くの光感受性分子（例えば、ＩＲ７００）を運ぶように化学的に改変され得るという予測外の発見に基づく。例えば、いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、５０分子より多く、１００分子より多く、もしくは１０００分子より多く（もしくは約１０００個の光感受性分子）を運ぶように化学的に改変され得る。Ｌ１、もしくはＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質からアセンブリされたウイルス様粒子は、非癌性細胞に影響を及ぼすことなく癌細胞に選択的に結合および感染し得、それによって、処置の細胞傷害性を最小限にし得る（米国特許出願公開番号ＵＳ２０１００１３５９０２Ａ１（その全体は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。さらに、いくつかの場合には、１粒子あたり多量の光感受性分子の送達は、極めて少量の薬物（例えば、ピコモル濃度）での光照射の際に、腫瘍細胞の選択的死滅を可能にする。

ＶＬＰの重要な細胞結合特性は、キャプシドタンパク質（例えば、Ｌ１）上の多数のヘパリン結合部位の存在である。表面アミノ酸への光感受性分子の結合体化（例えば、表面アミノ酸（例えば、表面のリジン残基、アルギニン残基およびヒスチジン残基）へのアミド結合を介した結合体化）は、驚くべきことに、腫瘍細胞の表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への上記ＶＬＰの結合を損なわない。本開示は、キャプシドタンパク質の表面露出ペプチドへの光感受性分子の結合体化を記載するものの、光感受性分子がキャプシドタンパク質の任意のペプチドに結合体化され得ることは、理解されるべきである。すなわち、光感受性分子は、Ｌ１タンパク質のみに、またはＬ１タンパク質とＬ２タンパク質との組み合わせに、結合体化され得る。光感受性分子が結合体化される上記タンパク質およびアミノ酸残基は、上記ウイルス様粒子の組成に依存し得る。

上記の発見は、新規の標的化癌処置の開発の重要な含意を有する。例えば、本開示の光感受性ＶＬＰ（ＶＬＰ結合体ともいわれる）は、非常に制限された送達能力を有する他の標的化分子（例えば、抗体）に対して利点を提供する。さらに、本開示の光感受性ＶＬＰは、適切な腫瘍表面特異的決定基が同定されていないことから、別の方法では抗体もしくは他の標的化分子によって標的化できない広い範囲の腫瘍（例えば、眼腫瘍）を標的化するために有用である。さらに、上記光感受性ＶＬＰは、遠隔の転移を処置するために有用である。さらに、上記光感受性ＶＬＰは、初期の悪性もしくは前癌性病変（例えば、形質転換を起こしているか、前悪性かもしくは悪性である眼の母斑）の診断および処置に有用である。

「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、本明細書で使用される場合、Ｌ１もしくはＬ１およびＬ２カプソマーの自己アセンブリする規則正しいアレイを含み、ウイルスゲノムを含まない、組織化されたキャプシド様構造（例えば、ほぼ球形もしくは円筒形の形状）をいう。ウイルス様粒子は、形態学的にかつ抗原性として真正のビリオンと類似するが、それらは、ウイルス遺伝物質（例えば、ウイルス核酸）を欠いており、粒子を非感染性にしている。ＶＬＰは、レシピエント細胞に薬剤（例えば、予防剤、治療剤もしくは診断剤）または封入された環状もしくは直線状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を送達するために使用され得る。用語「ウイルス様粒子」もしくは「ＶＬＰ」および「シュードウイルス」もしくは「ＰｓＶ」が、本明細書では交換可能に使用され得、用語「ウイルス様ナノ粒子」とも交換可能に使用され得ることは理解されるべきである。

「腫瘍標的化ウイルス様粒子」とは、本明細書で使用される場合、（例えば、無傷の組織中の）非腫瘍（例えば、非癌性の、さもなければ正常な、健康な）細胞を標的化することなく、腫瘍（例えば、癌性の）細胞を標的化するＶＬＰをいう。

本開示に従うＶＬＰは、野生型パピローマウイルスＶＬＰに対して、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有し得る。上記ＶＬＰは、例えば、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有する改変体キャプシドタンパク質を有するカプソマーからアセンブリされ得る。「改変された免疫原性および／もしくは抗原性」を有する改変体キャプシドタンパク質は、既存の（例えば、内因性の）ウイルス血清型特異的抗体による上記キャプシドタンパク質の認識を低減もしくは妨げるために、あるアミノ酸において天然にもしくは合成によって改変されている（例えば、変異されるか、置換されるか、欠失されるか、ｐｅｇ化されるかもしくは挿入される）ものである。改変体キャプシドタンパク質は、種々のＨＰＶ血清型に由来するアミノ酸の組み合わせに基づいて、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１改変体、非ヒトパピローマウイルスＬ１改変体、もしくはパピローマウイルスＬ１改変体であり得る。例えば、改変された免疫原性および／もしくは抗原性を有するＬ１改変体は、国際公開番号ＷＯ／２０１０／１２０２６６（その全体は、本明細書に参考として援用される）に記載される、ＨＰＶ血清型１６およびＨＰＶ血清型３１（本明細書では「改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質」−配列番号１といわれる）に基づく組換えタンパク質であり得る。

いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、パピローマウイルスＶＬＰである。上記ＶＬＰは、ヒトパピローマウイルスＶＬＰ（例えば、ヒトに感染し得るウイルスに由来する）であり得る一方で、他の実施形態では、上記ＶＬＰは、非ヒトパピローマウイルスＶＬＰである。非ヒトＶＬＰの例としては、ウシパピローマウイルス、マウスパピローマウイルス、ワタオウサギ（ｃｏｔｔｏｎ−ｒａｂｂｉｔ）パピローマウイルスおよびマカークもしくはアカゲザルパピローマウイルスの粒子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記ＶＬＰは、ウシパピローマウイルスウイルス様ナノ粒子（例えば、タイプ１ウイルス様ナノ粒子）（例えば、ＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質もしくはＢＰＶ Ｌ１キャプシドタンパク質とＢＰＶ Ｌ２キャプシドタンパク質との組み合わせからアセンブリされる）である。

「キャプシドタンパク質」とは、本明細書で使用される場合、タンパク質モノマーであって、そのうちのいくつかがカプソマーオリゴマーを形成するものをいう。「カプソマー」とは、本明細書で使用される場合、ウイルスキャプシドの基本的オリゴマー構造ユニットをいい、これは、ウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））の遺伝物質を保護するタンパク質の外側の覆いである。本開示のキャプシドタンパク質は、パピローマウイルスＬ１メジャーキャプシドタンパク質およびパピローマウイルスＬ２マイナーキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＶＬＰは、Ｌ１キャプシドタンパク質のみを含む一方で、他の実施形態では、上記ＶＬＰは、Ｌ１キャプシドタンパク質とＬ２キャプシドタンパク質との混合物（もしくは組み合わせ）を含む。

いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子中のＬ１キャプシドタンパク質のパーセンテージは、上記ウイルス様粒子中のＬ２キャプシドタンパク質のパーセンテージより高い。例えば、いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子中のＬ１キャプシドタンパク質のパーセンテージは、８０％〜１００％（上記ウイルス様粒子中のキャプシドタンパク質の総数のうちの）である。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子中のＬ１キャプシドタンパク質のパーセンテージは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である。いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子中のＬ２キャプシドタンパク質のパーセンテージは、１％〜２５％（上記ウイルス様粒子中のキャプシドタンパク質の総数のうちの）である。例えば、いくつかの実施形態において、ウイルス様粒子中のＬ２キャプシドタンパク質のパーセンテージは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％である。

ある実施形態において、ウイルス様粒子は、１２〜７２のＬ２タンパク質を含む。ある実施形態において、ウイルス様粒子は、３６０のＬ１タンパク質および１２〜７２のＬ２タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質は、２０〜６０ｎｍの直径を有するウイルス様ナノ粒子へとアセンブリする。例えば、キャプシドタンパク質は、直径２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍもしくは６０ｎｍを有するウイルス様ナノ粒子へとアセンブリし得る。

「外部キャプシドタンパク質」とは、本明細書で使用される場合、ＶＬＰの表面で露出されるキャプシドタンパク質をいう。いくつかの実施形態において、外部キャプシドタンパク質（例えば、Ｌ１タンパク質）は、（例えば、少なくとも１個の）光感受性分子に結合体化される。

「光感受性分子」とは、本明細書で使用される場合、光に選択的に曝された場合に、「活性化された」（「光活性化された」ともいわれる）状態になる非毒性分子をいう。いくつかの実施形態において、活性化された光感受性分子は、光の励起の際に再発光する（例えば、フルオロフォア）。いくつかの実施形態において、活性化光感受性分子は、光の励起の際に、毒性になり得るかまたは毒性の分子を生じ得る。例えば、光感受性分子（光増感剤といわれる）のあるクラスは、光の吸収の際に励起状態へと促進され得、酸素との項間交差を受けて、一重項酸素を生じ得る。この一重項酸素は、これが遭遇する任意の有機化合物を迅速に攻撃し、従って、非常に細胞傷害性である。

本開示の種々の局面によれば、光感受性分子は、上記ＶＬＰのキャプシドタンパク質（例えば、Ｌ１キャプシドタンパク質および／もしくはＬ２キャプシドタンパク質）に結合体化され得る。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ＶＬＰのキャプシドタンパク質に共有結合的に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、上記ＶＬＰのキャプシドタンパク質のリジン残基に共有結合的に結合体化される。光感受性分子に結合体化されるＶＬＰは、本明細書では「ＶＬＰ結合体」もしくは「光感受性ＶＬＰ」といわれ得る。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、キャプシドタンパク質のアミン基（例えば、リジンもしくは他のアミノ酸のアミン基）と反応して、共有結合的アミド結合を形成するＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル基を含む。

ＶＬＰに対する光感受性分子（ＰＭ）の比は変動し得る。

いくつかの実施形態において、ＶＬＰ：ＰＭの比は、約１：１０〜約１：１０００、約１：１０〜約１：５００、約１：５０〜約１：５００、もしくは約１：５０〜約１：１０００である。すなわち、いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、約１０〜約１０００個の光感受性分子を含み得る。いくつかの実施形態において、ＶＬＰ：ＰＭの比は、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：５０、１：７５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０もしくは１：１０００である。いくつかの実施形態において、上記ＶＬＰは、１０個、１５個、２０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個もしくは１０００個の光感受性分子を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ＶＬＰは、１０００個より多くの光感受性分子もしくは１０個未満の光感受性分子を含み得る。

１個より多くの光感受性分子が、単一のキャプシドタンパク質に結合体化され得る。例
えば、単一のキャプシドタンパク質（例えば、Ｌ１キャプシドタンパク質もしくはＬ２キャプシドタンパク質）は、１〜５個の（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個の）光感受性分子に結合体化され得る。従って、キャプシドタンパク質うちの１個より多くのアミノ酸は、光感受性分子に結合体化され得る。いくつかの実施形態において、単一のキャプシドタンパク質は、１〜２個、１〜３個、もしくは２〜３個の光感受性分子に結合体化され得る。従って、光感受性分子は、単一のキャプシドタンパク質のうちの１個、２個、３個、４個もしくは５個の異なるアミノ酸（例えば、リジン、アルギニンおよび／もしくはヒスチジン、または他のアミノ酸）に結合体化され得る。

本開示に従って使用するための光感受性分子の例としては、蛍光色素、赤外色素、近赤外色素、ポルフィリン分子およびクロロフィル分子が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示に従って使用するための蛍光色素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、７−アミノアクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、ＡＴＴＯ色素、オーラミン−ローダミン染料、ベンズアントロン（ｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ）、ビマン（ｂｉｍａｎｅ）、９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、ビスベンズイミド、ブラックライト塗料（ｂｌａｃｋｌｉｇｈｔ ｐａｉｎｔ）、カルセイン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、２−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、２−クロロ−９，１０−ジフェニルアントラセン、クマリン、ＤＡＰＩ、ダーククエンチャー（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、蛍光画像ガイド下手術（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｅ−ｇｕｉｄｅｄ ｓｕｒｇｅｒｙ）、ｆｌｕｏｒｏ−ｊａｄｅ染料、ｆｕｒａ−２、ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル、ＧｅｌＧｒｅｅｎ、ＧｅｌＲｅｄ、緑色蛍光タンパク質、ヘプタメチン（ｈｅｐｔａｍｅｔｈｉｎｅ）色素、インディアンイエロー、Ｉｎｄｏ−１、ルシファーイエロー、ルシフェリン、ＭＣｈｅｒｒｙ、メロシアニン、ナイルブルー、ナイルレッド、蛍光染料（ｏｐｔｉｃａｌ ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ）、ペリレン、フロキシン、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコエリトロビリン、ヨウ化プロピジウム、ピラニン、ローダミン、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、（Ｅ）−スチルベン、（Ｚ）−スチルベン、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、シナプスフルオリン（ｓｙｎａｐｔｏ−ｐＨｌｕｏｒｉｎ）、テトラフェニルブタジエン、トリス（バソフェナントロリンジスルホン酸）ルテニウム（ＩＩ）四ナトリウム、テキサスレッド、チタンイエロー、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、黄色蛍光タンパク質およびＹＯＹＯ−１。

本開示に従って使用するための感光色素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨｐＤ、ポルフィマーナトリウム（Ｐｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍ）（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）、Ｐｈｏｔｏｇｅｍ（登録商標）、Ｐｈｏｔｏｓａｎ Ｈｅｍｐｏｒｆｉｎ（登録商標））、ｍ−ＴＨＰＣ、テモポルフィン（Ｆｏｓｃａｎ（登録商標））、ベルテポルフィン（ビスダイン（登録商標））、ＨＰＰＨ（Ｐｈｏｔｏｃｈｌｏｒ（登録商標））、パラジウム細菌フェオホルビド（Ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｂａｃｔｅｒｉａ−ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）（Ｔｏｏｋａｄ（登録商標））、５−ＡＬＡ、５
アミノレブリン酸（Ｌｅｖｕｌａｎ（登録商標））、５−ＡＬＡメチルエステル（Ｍｅｔｖｉｘ（登録商標））、５−ＡＬＡベンジルエステル（Ｂｅｎｚｖｉｘ（登録商標））、５−ＡＬＡヘキシルエステル（Ｈｅｘｖｉｘ（登録商標））、ルテニウム（ＩＩＩ）−
テキサフィリンもしくはモテキサフィン−ルテチウム（Ｌｕｔｅｘ（登録商標）、Ｌｕｔｒｉｎ（登録商標）、Ａｎｇｒｉｎ（登録商標）、Ｏｐｔｒｉｎ（登録商標））、ＳｎＥＴ２、エチルエチオプルプリンスズ（ＩＶ）（Ｔｉｎ （ＩＶ） ｅｔｈｙｌ ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）（Ｐｕｒｌｙｔｉｎ（登録商標）、Ｐｈｏｔｒｅｘ（登録商標））、ＮＰｅ６、モノ−Ｌ−アスパルチルクロリンｅ６、タラポルフィンナトリウム（Ｔａｌｐｏｒｆｉｎ（登録商標）、Ｌａｓｅｒｐｈｙｒｉｎ（登録商標））、ＢＯＰＰ、ホウ素化プロトポルフィリン（ＢＯＰＰ（登録商標））、フタロシアニン亜鉛（ＣＧＰ５５８４７（登録商標））、フタロシアニンケイ素（Ｐｃ４（登録商標））、スルホン酸化アルミニウムフタロシアニン誘導体（Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓ（登録商標））の混合物、ＡＴＭＰｎ、アセトキシ−テトラキス（β−メトキシエチル−）ポルフィセン）、ＴＨ９４０２およびジブロモローダミンメチルエステル。

本開示に従って使用するための感光色素の例としては、蛍光画像化において使用され得るもの（例えば、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素）（例えば、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ（登録商標）およびＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）が挙げられる。

本開示はまた、腫瘍を有する被験体に、キャプシドタンパク質に結合体化された光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与するための方法、または腫瘍を有する被験体に、約５０〜約１０００個の（例えば、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個、もしくは１０００個の）光感受性分子を含む腫瘍標的化ウイルス様粒子を投与するための方法を提供する。

いくつかの実施形態において、上記被験体は、哺乳動物、例えば、ヒトである。

投与様式は、ウイルス様粒子を送達するために代表的には使用される、注射、注入、移植、局所投与によるか、もしくは任意の他の手段によるものであり得る。いくつかの実施形態において、注射の領域に依存して、中空ニードル、被覆済みニードル、ミニニードルもしくはマイクロニードルが使用される。いくつかの実施形態において、投与様式は、眼内の空間へともしくは眼の硝子体へと（例えば、眼腫瘍もしくは眼に転移した腫瘍を標的化するために）注射によるものである。

本開示のウイルス様粒子を送達するために使用され得る試薬の例としては、生理食塩水、ＭｇＣｌ_２、トレハロース、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０もしくは上記の試薬のうちの２種以上の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の光感受性分子は、適切な波長で活性化され得る。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子の活性化は、これらを細胞傷害性にするかまたは細胞傷害性分子を生じさせ得る。適切な波長としては、紫外線波長、可視光線波長、赤外線波長および近赤外線波長が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、６００ｎｍ〜８００ｎｍもしくは６６０ｎｍ〜７４０ｎｍの波長で活性化され、かつ細胞傷害性になる。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、約６００ｎｍ、６１０ｎｍ、６２０ｎｍ、６３０ｎｍ、６４０ｎｍ、６５０ｎｍ、６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、７４０ｎｍ、７５０ｎｍ、７６０ｎｍ、７７０ｎｍ、７８０ｎｍ、７９０ｎｍもしくは８００ｎｍの波長で活性化されかつ細胞傷害性になる。いくつかの実施形態において、上記光感受性分子は、６００ｎｍより短いもしくは８００ｎｍより長い波長で活性化される。光感受性分子活性化に適切な波長は、使用される特定の分子に依存する。

本開示の光感受性分子は、分子のタイプに依存して、赤外線、近赤外線もしくは紫外線によって活性化され得る。例えば、赤外線レーザー、近赤外線レーザーもしくは紫外線レーザーは、いくつかの実施形態において、ＶＬＰ結合体の上記光感受性分子を活性化するために使用され得る。上記レーザーによって送達されるエネルギーは、約５Ｊ〜約１００Ｊ、約５ジュール（Ｊ）〜約５０Ｊ、もしくは約８Ｊ〜約３６Ｊの範囲に及び得る。いくつかの実施形態において、上記レーザーによって送達されるエネルギーは、８Ｊ、９Ｊ、１０Ｊ、１１Ｊ、１２Ｊ、１３Ｊ、１４Ｊ、１５Ｊ、１６Ｊ、１７Ｊ、１８Ｊ、１９Ｊ、２０Ｊ、２１Ｊ、２２Ｊ、２３Ｊ、２４Ｊ、２５Ｊ、２６Ｊ、２７Ｊ、２８Ｊ、２９Ｊ、３０Ｊ、３１Ｊ、３２Ｊ、３３Ｊ、３４Ｊ、３５Ｊ、３６Ｊ、３７Ｊ、３８Ｊ、３９Ｊ、４０Ｊ、４１Ｊ、４２Ｊ、４３Ｊ、４４Ｊ、４５Ｊ、４６Ｊ、４７Ｊ、４８Ｊ、４９Ｊ、５０Ｊ、５１Ｊ、５２Ｊ、５３Ｊ、５４Ｊ、５５Ｊ、５６Ｊ、５７Ｊ、５８Ｊ、５９Ｊ、６０Ｊ、６１Ｊ、６２Ｊ、６３Ｊ、６４Ｊ、６５Ｊ、６６Ｊ、６７Ｊ、６８Ｊ、６９Ｊ、７０Ｊ、７１Ｊ、７２Ｊ、７３Ｊ、７４Ｊもしくは７５Ｊである。いくつかの実施形態において、上記レーザーによって送達されるエネルギーは、１０Ｊ、２０Ｊ、３０Ｊ、４０Ｊ、５０Ｊ、６０Ｊ、７０Ｊ、８０Ｊ、９０Ｊもしくは１００Ｊである。

光もしくはレーザーは、約５秒間〜約５分間、上記光感受性分子（もしくは光感受性ＶＬＰ）に印加され得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記光もしくはレーザーは、上記分子を活性化するために、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、２５秒間、３０秒間、３５秒間、４０秒間、４５秒間、５０秒間もしくは５５秒間にわたって上記光感受性分子に印加される。いくつかの実施形態において、上記レーザーは、１分間、１．５分間、２分間、２．５分間、３分間、３．５分間、４分間、４．５分間もしくは５分間にわたって、またはより長く、上記光感受性分子に印加される。光もしくはレーザーが光感受性分子に印加される時間の長さが例えば、上記レーザーのエネルギー（例えば、ワット数）に依存して変動し得ることは、理解されるべきである。例えば、より低いワット数を有するレーザーは、上記分子を活性化するためにより長期間にわたって光感受性分子に印加され得る。

光もしくはレーザーは、上記光感受性分子（もしくはＶＬＰ結合体）に、ＶＬＰ結合体を投与してから約３０分間〜約４８時間後に、印加され得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記光もしくはレーザーは、上記光感受性分子に、上記ＶＬＰ結合体を投与してから３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間もしくは５５分間後に、印加される。いくつかの実施形態において、上記光もしくはレーザーは、上記光感受性分子に、上記ＶＬＰ結合体を投与してから１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、もしくは２４時間後に印加される。いくつかの実施形態において、上記光もしくはレーザーは、上記光感受性分子に、上記ＶＬＰ結合体を投与してから３６時間もしくは４８時間後に印加される。

上記光もしくはレーザーは、上記腫瘍部位に直接印加され得る。例えば、眼腫瘍を標的化するＶＬＰ結合体は、眼を照明することによって活性化され得る。

腫瘍の任意のタイプが、本開示に従って標的化され得る。腫瘍の例としては、眼、肺、胸膜、肝臓、膵臓、胃、食道、結腸、乳房、卵巣、前立腺、脳、髄膜、精巣、腎臓、膀胱、頭部、頸部、子宮頸部、喉頭および／もしくは皮膚に位置するものが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、眼腫瘍である。上記眼腫瘍は、硝子体、脈
絡膜腔、虹彩、毛様体、強膜、中心窩、網膜、視神経円板もしくは視神経に位置し得る。

上記腫瘍は、いくつかの実施形態において、癌性もしくは悪性である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、転移性である。他の腫瘍もまた、標的化され得る。例えば、本願は、子宮頸癌細胞、卵巣癌細胞、黒色腫の癌細胞、肺癌細胞、頭部および／もしくは頸部癌細胞、ならびに膀胱癌細胞を標的化するための方法および組成物を提供する。

（組成物）
本開示のウイルス様粒子（ウイルス様ナノ粒子）は、いくつかの実施形態において、光感受性分子結合体化ウイルス様ナノ粒子である。上記ウイルス様ナノ粒子は、パピローマウイルス由来の１もしくは２タイプのキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、上記キャプシドタンパク質は、改変される。キャプシドタンパク質は、代表的には、直径約５５ｎｍの「空の」プロトキャプシド（例えば、中空のコアを含む球状の粒子）へと自己アセンブリする。上記プロトキャプシドが成熟して、ウイルス様ナノ粒子（ウイルス様粒子）を形成した後、ウイルス様ナノ粒子は、光感受性分子（例えば、ＩＲ７００色素、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ、ＬＩ−ＣＯＲ（登録商標）によって製造される赤外色素）と化学的に結合体化される。

いくつかの実施形態において、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子は、単回使用バイアル（例えば、ホウケイ酸ガラスバイアル）の中の滅菌溶液（例えば、１もしくは２ｍｌ）の中で提供される。いくつかの実施形態において、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、ＫＨ_２ＰＯ_４もしくは上記のうちの２種以上の任意の組み合わせを必要に応じて含む水の滅菌溶液中で提供される。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌは、４００〜６００ｍＭｏｌ（例えば、５００ｍＭｏｌ）の濃度で上記溶液中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ＫＣｌは、２〜６ｍＭｏｌ（例えば、２．７ｍＭｏｌ）の濃度で上記溶液中に存在し得る。いくつかの実施形態において、Ｎａ_２ＨＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏは、５〜１５ｍＭｏｌ（例えば、１０ｍＭｏｌ）の濃度で上記溶液中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ＫＨ_２ＰＯ_４は、１〜３ｍＭｏｌ（例えば、２ｍＭｏｌ）の濃度で上記溶液中に存在し得る。

いくつかの実施形態において、光感受性ウイルス様ナノ粒子は、希釈され、眼科的手順において一般に使用される滅菌シリンジもしくはニードルを使用して、眼内に投与される。本開示はまた、本明細書中の他の箇所で記載されるように、他の投与経路ならびに他の腫瘍および／もしくは転移への投与を提供する。

いくつかの実施形態において、各ウイルス様ナノ粒子は、１２〜７２のカプソマーを含み、各カプソマーは、５分子のＬ１キャプシドタンパク質（例えば、各５５〜５６ｋＤ）および１分子のＬ２キャプシドタンパク質（例えば、各５２ｋＤ）を含む。いくつかの実施形態において、各ウイルス様ナノ粒子は、１２〜７２のカプソマーを含み、各カプソマーは、Ｌ１キャプシドタンパク質のみ（例えば、カプソマーあたり５分子のＬ１タンパク質）を含む。

いくつかの実施形態において、各ウイルス様ナノ粒子は、上記タンパク質のうちの少なくとも１個のアミノ酸（例えば、リジンアミノ酸）に、１０〜１０００分子（例えば、５００分子）の光感受性分子（ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ））と化学的に（例えば、アミド結合を介して）結合体化される。

（ウイルス様粒子を生成するための方法）
本開示の光感受性ウイルス様ナノ粒子を生成するために、哺乳動物細胞（例えば、２９３Ｔ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））が増殖させられ得（例えば、懸濁培養におい
て）、そしてＢＰＶもしくはＨＰＶ Ｌ１（もしくはＬ１およびＬ２）キャプシドタンパク質をコードする核酸（例えば、バイシストロン性プラスミドＤＮＡ）で一過性にトランスフェクトされ得る。これは、プロトキャプシドの形成を誘発する（例えば、Ｂｕｃｋ ｅｔ． ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６．１．１−２６．１．１９， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７に記載されるとおり）。細胞塊の回収および破壊の後に、上記プロトキャプシドは、ベンゾナーゼ処理で宿主ＤＮＡクリアランスに、およびその後、インビトロでの成熟プロセスに供されて、安定なウイルス様ナノ粒子を形成し得る。精製後、上記ウイルス様ナノ粒子は、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子を生成するために、光感受性分子（例えば、ＩＲ７００ ＮＨＳエステル）と化学的に結合体化され得る。図２３は、本明細書で提供される生成プロセスの一例の模式図を示す。

従って、いくつかの局面において、光感受性分子を生成するための方法が本明細書で提供され、上記方法は、（ａ）細胞を、１以上のキャプシドタンパク質をコードする核酸で一過性にトランスフェクトし、それによって、プロトキャプシドを形成する工程、（ｂ）上記プロトキャプシドを集め、上記プロトキャプシドをインビトロで成熟プロセスに供し、それによって、安定なウイルス様ナノ粒子を形成する工程、および（ｃ）上記ウイルス様ナノ粒子を５０〜１０００個の光感受性分子に化学的に結合体化する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様ナノ粒子は、５００個の光感受性分子に結合体化される。いくつかの実施形態において、上記ウイルス様ナノ粒子は、アミド結合によって（例えば、光感受性分子のエステル基と、ウイルス様ナノ粒子のキャプシドタンパク質のうちのアミノ酸のアミン基とを反応させることによって）光感受性分子に結合体化される。

（実施例１−ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸの結合体化）
光感受性分子（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）へのＶＬＰ（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）の化学的結合体化の手順は、以下のとおりである。代表的には、ＶＬＰの溶液を、ＰＢＳ，ｐＨ＝７．２および０．３〜０．５Ｍ ＮａＣｌ中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で維持した。上記ＩＲ７００（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）分子を、乾燥ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルとして製造業者から得た（ＮＨＳ−エステルは、タンパク質上のアミン基と反応して、共有結合的アミド結合を形成する）（図１０Ａ）。タンパク質上の利用可能なアミン基は、タンパク質のアミノ末端もしくはアミノ酸（例えば、リジン）上のε−アミノ基である。上記乾燥固体ＩＲ７００−ＮＨＳエステルを、５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解し、凍結して貯蔵した。代表的には、ＶＬＰ：色素の種々の比を、種々の量のＩＲ７００−ＮＨＳを固定量（通常は、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌ）のＶＬＰに対して混合することによって達成した。代表的な比およびＩＲ７００−ＮＨＳの量は、以下の表に列挙される：

２００：１比を作製するために、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌのＶＬＰ １ｍｌを、３．２μｌの上記ＩＲ７００−ＮＨＳエステル溶液と混合した。これら反応を、２〜４時間にわた
って室温で実施した。上記反応の完了後に、上記ＶＬＰを、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製して、結合しなかったＩＲ７００−ＮＨＳを、新たに形成されたＶＬＰ−ＩＲ７００結合体（光感受性ＶＬＰともいわれる）から分離した。

（実施例２−ビスダイン（登録商標）の結合体化）
上記ＶＬＰへのビスダイン（登録商標）の結合体化は、上記ＩＲ７００−ＮＨＳに対して僅かに異なるプロトコルにしたがった。ビスダイン（登録商標）分子は、ＶＬＰへの結合体化の前に、ＮＨＳへの官能化を必要とした。この官能化を、ＥＤＣ（１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド）の使用によって達成した。ＥＤＣを使用して、遊離カルボン酸分子を有する分子（例えば、ビスダイン（登録商標）（図１０Ｂを参照のこと；丸で囲った）を官能化し、スルホ−ＮＨＳの存在下で、ＮＨＳ部分をこの薬剤に効率的に移す。この反応スキームは、図１１に概説される。簡潔には、約２ｍＭのＥＤＣおよび２×モル過剰のスルホ−ＮＨＳを、種々の量のビスダイン（登録商標）と反応させた。室温で１５分後に、上記反応を、２−メルカプトエタノールを終濃度２０ｍＭになるように添加して停止させた。この反応混合物を、１ｍｇのＶＬＰに、ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２＋０．３〜０．５Ｍ ＮａＣｌ中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、２〜４時間室温でインキュベートした。最後に、反応しなかった成分を、ＶＬＰ−結合体からヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離した。

（実施例３−ＶＬＰ結合特異性は、ＨＳＰＧによって媒介され、ヘパリンによって阻害される）
懸濁物中のＳＫ−ＯＶ−３細胞を、以下の条件下で処理した：ＶＬＰ（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）なし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８（図３，「ＡＦ４８８＊ＰｓＶ」）もしくはＩＲ７００（図３，「ＩＲ７００＊ＰｓＶ」）のいずれかに結合体化したＶＬＰ結合体、またはＨＳＰＧの存在下でインキュベートした同じＶＬＰ結合体。インキュベーション後、これら培養物を、４ジュールの６９０ｍｍ近赤外線に供した。光を照射しなかった細胞の相当するセットを、コントロールとして機能をはたした。照射後、上記培養物を、細胞死の程度について評価した。図３は、実質的な細胞死滅があった唯一の条件は、ＩＲ７００＊ＰｓＶおよび４ジュールの光への細胞曝露であったことを示す。類似の細胞死は、ＡＦ４８８＊ＰｓＶへの曝露では観察されなかった。このことは、細胞死がＩＲ７００色素結合体に特異的であることを明らかにする。さらに、細胞死は、ＨＳＰＧの存在下でほぼ完全に排除され、このことは、上記細胞へのＶＬＰ結合がＩＲ７００媒介性細胞死に重要であることを明らかにする。

（実施例４−細胞死は、赤外線照射、ならびにＶＬＰおよびＩＲ７００の量に依存する）
ＶＬＰ（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）の種々の濃度で処理した懸濁物中のＳＫ−ＯＶ−３細胞を、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）の種々の量と結合体化した。ＩＲ７００色素への結合体化なしのＶＬＰをコントロールとして使用した。インキュベーション後、これら培養物を、０ジュールもしくは１６ジュールの６９０ｎｍ近赤外線に供した。光処理の後、細胞死の程度を評価した。図４は、細胞死がＩＲ７００色素の存在および光処理の両方に依存することを示す。これは、細胞死がＶＬＰ濃度および上記ＩＲ７００色素結合体化比の両方に依存するという観察によって裏付けられる。

（実施例５−ＩＲ７００に結合体化したＶＬＰでの処置後に照射した際のＳＫＯＶ−３細胞のインビトロ細胞死）
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、２４ウェルプレートにプレートし、光感受性ＶＬＰ粒子（
例えば、ＩＲ７００色素に結合体化された、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）の２種の異なる濃度、２．５μｇ（赤）および０．２５μｇ（青）で、１時間、３７℃において処理した。結合したら、上記細胞を洗浄し、続いて、４Ｊの光での処理を行った。細胞死を、ＬＤＨ放出（４９０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定される）の酵素的な評価で決定した。ＶＬＰ：ＩＲ７００結合体化の３種の異なるモル比、それぞれ、１：５００、１：１０００および１：２０００を試験した。図５は、細胞死の最大効力が、試験した両方の濃度に関してＶＬＰ：ＩＲ７００（「ＰｓＶ：ＩＲ７００」）の１：１０００比で観察された。洗剤媒介性細胞溶解を、陽性コントロールとして使用した。

（実施例６−ＩＲ７００−ＰｓＶ複合体の構造評価）
図６は、コントロールＶＬＰ（ＰｓＶ）（Ａ）およびＩＲ７００結合体化ＶＬＰ（ＰｓＶｓ）（Ｂ）のＥＳＩ−ＴＯＦ分析を示す。図６Ｂにおいて、その反応を、各ＶＬＰ（ＰｓＶ）分子の、１０００分子のＩＲ７００との結合体化を達成するように設定した。ＥＳＩ−ＴＯＦスキャンにおけるシグナルスパイクは、ＶＬＰ Ｌ１タンパク質に相当する。５５１７ａｍｕのシフトは、コントロールサンプルに対して結合体化サンプルで認められ、ここで結合体化サンプルがＬ１タンパク質あたり平均３結合体化ＩＲ７００分子（１８４０ａｍｕ）もしくはＶＬＰあたり約１０００分子のＩＲ７００に相当する（代表的には、ＶＬＰあたり３６０のＬ１がある）。

（実施例７−薬剤結合は、眼内黒色腫細胞株における細胞死の程度を決定する）
懸濁物中の眼内黒色腫細胞株（９２．１； ＨＥＲ２⁻）を、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）に結合体化したハーセプチン（登録商標）抗体もしくはＩＲ７００色素に結合体化したＶＬＰ（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）のいずれかの種々の希釈物に曝した。次いで、匹敵する培養物を、薬剤結合（図７Ｃ）、または１６ジュールの６９０ｎｍ近赤外線の非存在下（図７Ｂ）もしくは存在下（図７Ａ）での細胞死について評価した。図７Ｃは、上記９２．１眼内黒色腫細胞への濃度依存性ＶＬＰ結合を示す一方で、ハーセプチン（登録商標）抗体結合は、本質的にない。図７Ｂは、光の非存在下では、細胞死はないことを示す。図７Ａは、上記光感受性ＶＬＰ処理細胞においてのみ濃度依存性細胞死を示す。

（実施例８−薬剤結合は、卵巣癌細胞株における細胞死の程度を決定する）
懸濁中のＳＫ−ＯＶ−３細胞（ＨＥＲ２⁻）を、ハーセプチン（登録商標）抗体もしくはＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）に結合体化したＶＬＰ粒子（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）のいずれかの種々の希釈物に曝した。次いで、匹敵する培養物を、ハーセプチン（登録商標）またはＶＬＰ結合（図８Ｃ）、または１６ジュールの６９０ｎｍ近赤外線の非存在下（図８Ｂ）もしくは存在下（図８Ａ）での細胞死について評価した。図８Ｃは、ＶＬＰ結合がＳＫ−ＯＶ−３細胞において飽和していることを示す。ハーセプチン（登録商標）結合はまた、濃度依存性であるが、上記ＶＬＰに関してはより小さい程度である。図８Ｂは、光の非存在下では、細胞死はないことを示す。図８Ａは、両方の条件下で濃度依存性細胞死を示すが、結合に類似して、その応答は、ＶＬＰで飽和している一方で、ハーセプチン（登録商標）での細胞死では、濃度依存性増大があるようである。これらデータは、ＩＲ７００に結合体化したＶＬＰ（ＰｓＶ−ＩＲ７００）が、ＩＲ７００に結合体化したハーセプチン（登録商標）（ハーセプチン−ＩＲ７００）より強力であることを意味する。

（実施例９−ワクチン誘発性抗ＨＰＶ１６中和抗体は、眼内黒色腫細胞株９２．１へのＢＰＶ＊ＩＲ７００ ＶＬＰの結合をブロックしない）
種々の抗体を含む血清サンプルを、９２．１眼内黒色腫細胞株への光感受性ＶＬＰ粒子（例えば、ＨＰＶ１６ ＶＬＰもしくはＢＰＶ ＶＬＰ）の結合を阻害する能力について試験した。図９は、「血清なし」もしくは「ナイーブ血清」条件が、ＶＬＰ結合を中和する活性を含まないことを示す。さらに、観察されたブロッキング活性は、ウイルス血清型に対して特異的であった。すなわち、ＩＲ７００色素に結合体化したヒトパピローマウイルス様粒子（ＨＰＶ１６−ＩＲ７００）のみが、ＨＰＶ１６抗体を含む血清で中和された。ＩＲ７００に結合体化したウシパピローマウイルス様粒子（ＢＰＶ−ＩＲ７００）は、ＨＰＶ１６特異的抗体を含む血清によって中和されなかった。

（実施例１０−免疫原性評価）
実施例９に記載されるものに類似の研究において、中和力価を、ＨＰＶ１６もしくはＢＰＶのいずれかに対する抗体を含む血清の段階希釈によって決定した。表２に記載される結果は、ＨＰＶ１６に対する抗体がＨＰＶ１６のみを中和することを示す。さらに、ＢＰＶに対する抗体は、ＢＰＶのみを中和する。従って、ＢＰＶに対するＨＶＰ１６抗体もＨＰＶ１６に対するＢＰＶ抗体も、いずれも交差反応はない。

（実施例１１−結合研究）
この実施例の目的は、種々のタイプの癌細胞へのヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）キャプシドタンパク質、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１キャプシドタンパク質、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）キャプシドタンパク質を含むウイルス様ナノ粒子の結合を評価することであった。さらに、Ｌ１キャプシドタンパク質およびＬ２キャプシドタンパク質、またはＬ１キャプシドタンパク質のみを含むウイルス様ナノ粒子を試験して、癌細胞へのウイルス様ナノ粒子結合に関して、Ｌ２の依存性があるか否かを決定した。この研究の結果は、ＢＰＶウイルス様ナノ粒子およびＨＰＶウイルス様ナノ粒子の結合が匹敵することを示す。

以下を含む細胞株の大きなパネルをスクリーニングした：多岐にわたる細胞株（例えば、２９３ＴＴ、ＨａＣａＴ、ＰＡＭ−２１２およびＴＣ−１）、子宮頸部細胞株（例えば、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉおよびＣ−３３Ａ）、卵巣細胞株（例えば、ＭＯＳＥＣ、ＳＨＩＮ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＷＦ−３、ＥＳ−２、Ａ２７８０、ＯＶＣＡＲ−３およびＯＶＣＡＲ−４）、黒色腫細胞株（例えば、Ｂ１６Ｆ１０、ＳＫＭＥＬ−２、ＳＫＭＥＬ−５、ＳＫＭＥＬ−２８およびＵＡＣＣ）、眼内黒色腫細胞株（例えば、９２．１、ＭＫＴ−ＢＲ、ＯＣＭ−１およびＵＷ−１）、肺細胞株（例えば、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０およびＮＣＩ−Ｈ５２２）、頭頸部細胞株（例えば、ＣＡＬ−３３（ＨＰＶ⁻）、ＦａＤｕ（ＨＰＶ⁻）、ＨＳＣ−３（ＨＰＶ⁻）、ＳＮＵ−１０７６（ＨＰＶ⁻）、ＵＭ−ＳＣＣ−４７（ＨＰＶ^＋）、ＵＰＣＩ−ＳＳＣ−９０（ＨＰＶ^＋）およびＵＰＣＩ−ＳＣＣ−１５４（ＨＰＶ^＋））、ならびに膀胱細胞株（例えば、５６３７、Ｊ８２、ＲＴ１１２、ＳＣａＢＥＲ、ＳＶＨＵＣ、Ｔ２４、ＵＭＵＣ−３、ＵＭＵＣ−５）。

実験前に、ウイルス様ナノ粒子をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合体化して、細胞表面へのウイルス様ナノ粒子結合の容易かつ直接的分析を可能にした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏ
ｒ４８８を、結合に干渉しないＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−エステル化学を使用して上記ウイルス様ナノ粒子に付着させた。上記ウイルス様ナノ粒子の各々を、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび０．１μ／ｍｌの濃度で試験した。

細胞をトリプシン処理して、それらを組織培養プレートのプラスチック表面から剥がし、洗浄し、振盪プラットフォーム上で４時間、３７℃で増殖培地の中で回復させた。次いで、上記細胞を洗浄し、計数し、９６ウェル丸底プレートの中へと、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／２％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中１×１０^５細胞／ウェルで配置した。上記ウイルス様ナノ粒子を、最終容積１００μｌ ＰＢＳ／２％ ＦＢＳで上記細胞に添加した。ヘパリンと予めインキュベートした（１ｍｇ／ｍｌ、１時間、４℃）ウイルス様ナノ粒子もまた、コントロールとしてウェルに添加した。次いで、上記細胞およびウイルス様ナノ粒子を１時間、４℃で（暗所で）インキュベートし、ＰＢＳ／２％ ＦＢＳで２回洗浄し、４％ パラホルムアルデヒドで１５分間、室温において固定した。細胞を最後に再び洗浄し、２００μｌ ＰＢＳ／２％ ＦＢＳ中で再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ^ＴＭ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）で、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡ^ＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。

上記ＴＣ−１、ＨｅＬａ、ＳＫ−ＯＶ−３、ＳＫＭＥＬ−２８、９２．１、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＨＳＣ−３、ＵＰＣＩ−ＳＣＣ−１５４およびＴ２４の細胞株を使用した結果を、図１２にヒストグラムとして示す。図１２から明らかなように、全てのウイルス様ナノ粒子は、それらの血清型にも構成（Ｌ１ 対 Ｌ１／Ｌ２）にも拘わらず、結合アッセイにおいて癌細胞に結合する。さらに、ヘパリンは、結合に関して競合する。このことは、ウイルス様ナノ粒子結合が特異的であり、ＨＳＰＧ依存性であることを実証する。

（実施例１２−生体分布の時間経過）
この実施例の目的は、腫瘍を有する動物への静脈内注射の後に、ウイルス様ナノ粒子の腫瘍局在化およびクリアランスの時間経過を評価することであった。

精製ウイルス様ナノ粒子を、ウイルス様ナノ粒子（例えば、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）をＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）により、ウイルス様ナノ粒子：色素比１：５００で標識することによって調製した。上記光感受性ウイルス様ナノ粒子を、ＯＰＴＩＰＲＥＰ^ＴＭ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍを使用する密度勾配超遠心分離によって精製した。

腫瘍を、１００μｌのＰＢＳ中２×１０^５ ＴＣ−１癌細胞の皮下注射によって、アルビノＣ５７Ｂｌ／６マウスの中に作製した。約２週間後、動物を処置群に無作為化した。腫瘍を有する動物に、容積１００μｌにおいて、ＰＢＳもしくは２００μｇの上記光感受性ウイルス様ナノ粒子のいずれかを静脈内注射によって与えた。注射の１２時間後もしくは２４時間後に、上記動物を安楽死させた。安楽死の後、腫瘍組織を採取し、ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）の蛍光に対して画像化した。これは、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子の存在を示す。

図１３Ｂは、１２時間および２４時間の両方の時点で得られた腫瘍組織において検出可能なＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）蛍光を示すが、ＰＢＳコントロールの蛍光（１２時間の時点）は検出されなかった。腫瘍組織における定量的な総蛍光は、図１４に示されるグラフにプロットされる。

（実施例１３−生体分布の時間経過）
この実施例の目的は、腫瘍を有する動物への静脈内注射後に、ウイルス様ナノ粒子の腫瘍局在化およびクリアランスの時間経過を評価することであった。

精製ウイルス様ナノ粒子を、溶解物中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で標識し、ＯＰＴＩＰＲＥＰ^ＴＭ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍを使用する密度勾配超遠心分離によって精製した。

腫瘍を、１００μｌのＰＢＳ中２×１０^５ ＴＣ−１癌細胞の皮下注射によって、アルビノＣ５７Ｂｌ／６マウスの中に作製した。約２週間後、２００μｇの上記光感受性ウイルス様ナノ粒子を、容積１００μｌにおいて静脈内注射によって送達した。腫瘍を、光感受性ウイルス様ナノ粒子注射後に以下の時点で採取した：Ｔ＝１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間。採取したら、腫瘍の断片を顕微鏡検査のために凍結した。この顕微鏡検査のために、組織切片をさらに染色した。ＨＰＶ１６に対するウサギポリクローナル抗血清を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８二次抗体とともに使用した。ラット抗ＣＤ３１抗体および抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５９４二次抗体で血管を共染色した。核をＤＡＰＩで強調した。

データ（インサイチュ画像は示さない）は、１時間の時点での上記光感受性ウイルス様ナノ粒子の存在を示す。シグナルの局在化は、血管内に関連づけられているようであった。染色の最大レベルは、８時間の時点で起こったようであり、その８時間の時点で、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子は、上記血管内から上記腫瘍細胞へ拡散しているようであった。最後に、２４時間および４８時間の時点では、腫瘍におけるウイルス様ナノ粒子のシグナルはほとんどないようであった。

（実施例１４−全身投与後のインビボ効力）
この実施例で示される研究を、単一の処置の２４時間後に腫瘍生存性を測定するために設計した。この研究は、長期間のインビボ研究に関するガイドラインを確立する。

完全な研究デザインを、図１５に図示する。腫瘍サイズの範囲に起因して、大きい腫瘍および小さい腫瘍の一様な分布が各群内で生理食塩水処置群においてｎ＝３およびＩＲ７００（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）−光感受性ウイルス様ナノ粒子処置群においてｎ＝５となるように、動物を無作為化した。ウイルス様ナノ粒子を、光処置の１２時間前に静脈内投与した。１００マイクログラム（１００μｇ）および２００μｇの用量を試験した。光処置は、２５Ｊ（４００ｍＷで６２．３ｓ）もしくは５０Ｊ（４００ｍＷで１２５ｓ）を含んだ。２４時間後に、腫瘍を採取し、コラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを使用して加工処理して、単一細胞懸濁物を生成した。次いで、ＢＤ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）黄色染色を適用し、細胞を、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ^ＴＭ ＩＩによって配置した。データを、パシフィックオレンジチャネルにおける蛍光のシフトによって示されるように死細胞のパーセンテージとして報告する（図１６Ａ）。

２００μｇのＩＲ７００（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）光感受性ウイルス様ナノ粒子（ＮＰ）という単一用量は、５０Ｊの光（図１６Ｂおよび図１７Ｃ）での処置後に腫瘍細胞の大部分を死滅させることができた。２００μｇのＮＰでの死滅レベルは、上記腫瘍を２５Ｊの光で処置した場合に約半分低減した（図１６Ｂおよび図１７Ｂ）。１００μｇのＮＰは、２５Ｊの光での死滅を誘発するには十分でなかった（図１６Ｂおよび図１７Ｂ）；しかし、５０Ｊ線量でいくらかの腫瘍の死滅は観察された（図１６Ｂおよび図１７Ｃ）。この研究は、インビボ研究に関して必要なＩＲ７００（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）光感受性ウイルス様ナノ粒子および光線量の情報を提供した。

（実施例１５−免疫系活性化研究）
上記ＴＣ−１腫瘍モデルは、免疫応答性動物におけるウイルス様ナノ粒子での処置に際して、抗腫瘍免疫誘発を試験する能力を提供する。上記ＴＣ−１腫瘍株は、ＨＰＶ１６癌遺伝子Ｅ６およびＥ７、ならびにｃ−Ｈａ−Ｒａｓを発現する変異遺伝子で不死化したＣ５７Ｂｌ／６肺上皮細胞から発生した（Ｌｉｎ ＫＹ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ５６（１）：２１−６， １９９６）。これら細胞は、皮下に移植され得るか、または転移性モデルを研究するために、肺に細胞を播種するために静脈内注射され得る。約２０年間にわたって、これら細胞は、Ｅ６およびＥ７治療用ワクチンの効力を試験するために使用されてきた。Ｅ７は、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドに特徴的なＭＨＣクラスＩエピトープを有し、これは、ＣＤ８ Ｔ細胞応答がそれに対して惹起され得る場合には防御的であることが示された（Ｈ−２Ｄ^ｂ， ａａ ４９−５７ ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（Ｆｅｌｔｋａｍｐ ＭＣ， ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２３（９）：２２４２−９， １９９３）。これら応答は、上記ペプチドでの細胞のテトラマー染色および再刺激の両方、続いて、細胞内サイトカイン染色によって検出される。

用量応答研究：動物に、１００μｌのＰＢＳ中２×１０^５ ＴＣ−１細胞を皮下接種した。接種の約２週間後に、動物を６群に無作為化した：（１）処置なしコントロール、（２）１００μｇ ウイルス様ナノ粒子（ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸで標識した、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含む）、光コントロールなし、（３）ＰＢＳと５０Ｊ／ｃｍ^２ 光コントロール、（４）２００μｇ ウイルス様ナノ粒子と５０Ｊ／ｃｍ^２光、（５）１００μｇ ｎ ウイルス様ナノ粒子と５０Ｊ／ｃｍ^２光、および（６）５０μｇ ウイルス様ナノ粒子と５０Ｊ／ｃｍ^２光。マウスに、１００μｌ容積の静脈内注射によってＰＢＳもしくはウイルス様ナノ粒子を与え、６９０ｎｍレーザーを使用して、１２時間後に光を上記腫瘍に印加した。腫瘍を２４時間後に採取し、単一細胞懸濁物を生じるように消化し、生存性染色で染色して、死細胞のパーセンテージを測定した（図１８，上）。

高用量群におけるいくらかの動物は、広範に及びかつ急速な腫瘍壊死、および上記動物の系への細胞内成分の放出におそらく起因して、腫瘍溶解症候群に関連した症状を経験した。上記「１００μｇナノ粒子と５０Ｊ／ｃｍ^２光」群のいずれも死亡しなかったが、上記群のマウスは、いくらかの病気の徴候を示した（図１８，上）。上記「１００μｇナノ粒子、光なし」群および上記「ＰＢＳと５０Ｊ／ｃｍ^２光」群は、病気の徴候を示さなかった。このことは、観察された応答が上記ウイルス様ナノ粒子と光との組み合わせに起因したことを示す。全体的に、壊死は、上記ウイルス様ナノ粒子および光を受容した全ての群において明らかであった。最大の死滅は全ての群で起こり、用量応答は観察されなかった（図１８，下）。

生存研究：動物に、１００μｌのＰＢＳ中２×１０^５ ＴＣ−１細胞を皮下接種した。接種の約２週間後に、動物を処置群（２５μｇ ウイルス様ナノ粒子）およびプラセボ群（ＰＢＳのみ）に無作為化した。マウスには、３日間の間隔を空けて２回処置を受けさせた。処置は、２５μｇのウイルス様ナノ粒子もしくは滅菌ＰＢＳのいずれかの１００μｌの単回静脈内注射を、続いて、１２時間後に、６９０ｎｍレーザーを使用して５０Ｊ／ｃｍ^２での光処置を考えた。腫瘍容積を３〜４日ごとに測定し、動物を、それらの腫瘍が＞１５００ｍｍ^３のサイズに達したときに安楽死させた（図１９Ａ）。

ウイルス様ナノ粒子での処置は、５００ｍｍ^３未満の腫瘍を有する動物において、増殖を遅らせるかもしくは腫瘍を根絶することができた（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。プラセボ群では腫瘍増殖動力学に対して何ら効果はなかった。最小の腫瘍で開始した２匹の動物は、第１の処置の７日以内に腫瘍の証拠を全く示さず、上記動物のうちの３匹は、腫瘍縮小
の徴候を示した（図１９Ｃ）。

免疫学的研究：免疫学的情報を読み出すために、０日目（第１の処置前）、１０日目および１７日目に血液を集めた。赤血球を溶解し、残りの細胞を２つの分け、一方の半分を細胞表面マーカー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１０３、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｈ２−Ｄ^ｂＥ７（４９−５７）テトラマー）で染色した。他方の半分を、４．５時間にわたってＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド４９−５７で再刺激し、続いて、ＣＤ４、ＣＤ８およびＩＦＮγに対する抗体で、同様に生細胞を区別するための生存性色素で染色した。

腫瘍増殖を制御した２匹の動物の血液において、「Ｅ７テトラマー＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞」および「ＩＮＦγ分泌ＣＤ８＋細胞」（Ｅ７ペプチドで再刺激後）の両方が検出できた。このことは、潜在的な抗腫瘍応答が惹起されたことを示す（図１９Ｃ）。

（実施例１６−組織学的分析）
組織学的レベルでの光感受性ウイルス様ナノ粒子（例えば、ＩＲ７００色素に結合体化した、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）の効果を、マウス異種移植片モデルを使用して評価した。簡潔には、１．５×１０^６ ９２．１ぶどう膜黒色腫細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの後方側腹部の皮下空間に移植した。上記腫瘍を約２００ｍｍ^３に到達させ、その時点で、上記動物を、２００μｇの光感受性ウイルス様ナノ粒子の静脈内注射で処置した。光感受性ウイルス様ナノ粒子の注射の１２時間後、その腫瘍部位を５０Ｊ／ｃｍ^２の６９０ｎｍ近赤外線で照射した。さらに２４時間後、上記動物を安楽死させ、その腫瘍組織を摘出し、ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、標準的な組織学検査のために加工処理した。

ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）の画像から、未処置コントロール（画像は示さず）と比較した場合、大きな壊死の程度が明らかになった。光感受性ウイルス様ナノ粒子およびレーザーで処置した腫瘍は、そのコントロール腫瘍と比較した場合、淡い外見を有した。より高倍率で検査した際には、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子で処置した腫瘍の細胞は、上記コントロール処置腫瘍と比較して、細胞質の劇的な喪失を示した。さらに、壊死の程度は、腫瘍全体を網羅し、ＮＩＲ光が腫瘍組織の深さ全体を貫通するという結論をもたらした。

（実施例１７−ぶどう膜黒色腫の同所異種移植片モデルにおけるウイルス様ナノ粒子活性）
眼の最も一般的な原発性悪性疾患は、ぶどう膜黒色腫（ＵＭ）である。米国では１年に約２，０００名の患者が存在し、欧州ではより頻度が高く出現する。ＵＭにはいくつかの処置選択肢があるとはいえ、腫瘍増殖を信頼性高く制御し、視力を保ち、照射関連の副作用の出現を最小限にする処置はない。

ウイルス様ナノ粒子光線療法（ＰＴ）は、薬物および光活性化の両方の投与を要する２段階プロセスを伴う新規な分子標的化癌治療である。ウイルス様ナノ粒子ＰＴの薬物部分は、光増感剤として作用する近赤外線（ＮＩＲ）フタロシアニン色素であるＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ ＤＸに結合体化した光感受性ウイルス様ナノ粒子 （ＮＰ）であり、続いて、原発性ぶどう膜黒色腫を有する成体を処置するために設計された非熱性のＮＩＲ光が印加される。

最新の研究では、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子の抗癌活性を、ぶどう膜黒色腫の同所異種移植片モデルにおいて評価した。このモデルにおいて、ヒトぶどう膜黒色腫細胞を、免疫抑制したウサギの脈絡膜腔へと移植し、増殖させた。眼底検査によって腫瘍が観察
可能になった場合、上記動物を、処置群もしくはコントロール群に割り当てた。両方の場合に、進行性の腫瘍増殖もしくは処置への応答に関して、上記動物を眼底検査および超音波で追跡した。研究の終了後、腫瘍を有する眼もまた、肉眼でおよび組織病理学によって検査した。

この研究を、９２．１ぶどう膜黒色腫細胞株を移植した計２０匹のウサギを使用して行った。全体で、２０匹の動物のうち１１匹が腫瘍を発生させた。２匹の動物は、処置前の追跡期間の間に予測外にも死亡した；これら動物を未処置コントロールとして使用した。いくらかの動物は、レーザー照射されない眼外腫瘍（ｅｘｔｒａ−ｏｃｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ）を有した；これらは、内部コントロールとして使用した。前眼房に腫瘍を有する動物を、研究から排除した。

全ての処置した腫瘍は、コントロール動物と比較して、眼底検査、肉眼での病理学および組織病理評価によって実証される大きな腫瘍応答を示した。腫瘍に隣接する網膜組織は、上記処置によって影響を受けなかった。

結論として、光感受性ウイルス様ナノ粒子投与およびレーザー投与の後に認められる腫瘍応答および壊死の程度に基づいて、本明細書で提供される処置方法論は、ぶどう膜黒色腫腫瘍の処置のために使用され得る。

研究スケジュール：２つの処置群：１）完全腫瘍処置；２）処置なし。

（方法および実験デザイン）
（試験システム）

（モデル）
（細胞培養）
ヒトぶどう膜黒色腫細胞株９２．１（Ｄｒ． Ｊｅｒｒｙ Ｙ． Ｎｉｅｄｅｒｋｏｒ
ｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ， ＴＸの厚意による）を、完全培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０と１０％ ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリンＧ、２５０ｎｇ／ｍＬ アンホテリシンＢ、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン溶液）中で、３７℃、５％ ＣＯ_２中で培養した。

（動物および免疫抑制の誘発）
平均初期体重約３ｋｇのニュージーランドアルビノウサギを、この研究に使用した。上記ウサギを、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ；Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ ５０ｍｇ／ｍＬ； Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ， ＵＳＡ）を毎日皮下注射することで免疫抑制した。ＣｓＡ投与を実験の間中維持して、自発的腫瘍退縮を防止した。投薬スケジュールは、１５ｍｇ／ｋｇ／日を細胞接種前に３日間およびその後４週間、続いて、実験が終了するまで１０ｍｇ／ｋｇ／日であった。投与量を、獣医師の裁量でさらに減らした。ＣｓＡ用量を、各動物の体重に従って毎日調節した。その体重を毎日測定し、ウサギが飼育されている部屋に掲示しておいた。

追跡の間に、上記動物を、ＣｓＡ毒性の徴候（例えば、歯肉肥大、流涎、下痢、および体重減少）に関して毎日モニターした。上記動物がＣｓＡ毒性の初期徴候（例えば、食欲不振）を示した場合、支持管理（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）（例えば、食欲刺激薬および消化管運動促進剤（ＧＩ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）のために直ぐに動物スタッフに相談した。注射用量の調節もまた、獣医の推奨に従って考慮した。

（細胞移植）
ＣｓＡ処置後３日目に、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射することで、上記動物を麻酔した。麻酔後、１〜３滴の０．５％ 塩酸プロパラカインを右眼に適用し、容積１００μｌ懸濁物中で１．０×１０^６ ９２．１ヒトぶどう膜黒色腫細胞を、ベントカニューレを使用して、上記ウサギの右眼の上脈絡膜腔に注射した。簡潔には、滅菌布を眼の上にかけて、毛もしくは睫毛でのいかなる汚染をも回避し、結膜を１０％ ベタジン溶液できれいにした。次に、眼筋の下で縫合糸を使用して、眼を前方に回転させ、結膜切開後に、強膜切開を縁から約１０ｍｍのところで行った。次いで、カニューレを、強膜切開へ挿入し（その長さの１／３〜１／２）、上記細胞（１．０×１０^６ 細胞を含む１００μＬ）を、上脈絡膜腔に注射した。ニードルをゆっくりと引っ込め、強膜切開を閉じる縫合糸を締めて、注射部位での最小限の灌流を保証した。抗生物質点眼液（エリスロマイシン軟膏剤）を一滴、手術創に塗布して感染を防止した。

（飼育、飼料、水、および環境条件、馴化）
上記動物を、６つの群で集団で飼育し、新しく、口当たりのよく、かつ栄養的に適した飼料を自由摂取させた。きれいで飲用に適した、かつ汚染されていない水を自由に摂取させた。環境制御を、温度２２±４℃（６８±５^ｏＦ）、相対湿度５０％±２０％を維持するように設定した。１２時間の明／暗サイクルを維持した。上記動物を、施設に到着後少なくとも５日間馴化させ、その後、ベースライン評価を行った。動物を、ベースライン眼底検査の評価後に、試験群に割り当てた。

（試験およびコントロール物品）

（投与製剤の調製）
試験物品を、滅菌注射用水で１：１希釈した。

（試験／コントロール物品の投与）
投与：光感受性ウイルス様ナノ粒子もしくは生理食塩水を、硝子体の中に眼内注射によって投与した。

レーザー投与：レーザー処置を、６９０ｎｍの光を出力６００ｍＷで、５０Ｊ／ｃｍ^２の総フルエンスに関して８３秒の持続時間にわたって送達するＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｏｐａｌ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｏｒ（登録商標）レーザーで、細隙灯システムを使用して適用した。上記レーザースポットサイズを、直径５ｍｍに設定したので、このサイズより大きい腫瘍は、スポットを重複させてレーザーをあてた。腫瘍境界の明確な区別が、眼の合併症（例えば、硝子体炎、網膜剥離）に起因して線引きできなかった場合には、疑わしい領域全体にレーザーをあてた。

死亡率／罹患率のチェック：２匹の動物がＣｓＡ合併症（以下を参照のこと）に起因して死亡したことを除けば、全ての動物は、研究の間中ずっと良好な健康状態のままであった。

臨床観察：全ての動物を、動物施設職員が毎日観察した；観察を記録した。大部分の動物は、ある程度の体重減少および食欲不振を経験し、これは、ＣｓＡに帰因した。

（眼科学）
頻度：眼底検査および超音波による眼科検査を、毎週行った。

手順：上記動物を鎮静させ、それらの右眼を、眼用の塩酸フェニレフリンおよびトロピカミド点眼を使用して拡張した。次に、眼の眼底検査を、双眼間接検眼鏡を使用して行っ
た。眼科医は、いかなる眼の合併症でも記録した。腫瘍が同定された場合、そのサイズを、視神経円板（円板直径［ＤＤ］； １ＤＤ＝約１．７５ｍｍ）と比較することによって推定した。超音波読み取りに関しては、眼底検査直後に、超音波プローブを眼に適用して、眼底検査によって決定されるように上記腫瘍の位置を可視化した。超音波測定は技術的に困難であることが判明した。主な理由は、上記腫瘍のうちのいくらかは、余りに周縁に位置することから、適切に可視化できないことにあった。結果として、最大の腫瘍寸法を測定することが常に可能なわけではなかった；大部分の場合には、高さのみが定量可能であった。

（終末手順および解剖病理学）
予定外の死亡：この研究で使用した２０匹の動物のうち、１匹を、プロトコルガイドラインに従って、体重減少（到着時体重の＞２０％）に起因して安楽死させた。１匹の動物は、ＣｓＡ毒性によって引き起こされた消化管うっ滞に起因して予測外にも死亡した。

予定された安楽死：上記研究の終了時に、動物を、容認されたＡｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＶＭＡ）ガイドラインに従って安楽死させた。ケタミン−キシラジン−アセプロマジン（それぞれ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および２０〜３５ ｍｇ／ｋｇ）とブプレノルフィン（０．２ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせを使用して麻酔をかけて上記動物から失血させた。

（結果）
全体としては、１１匹の動物が組織病理学的に明らかな腫瘍を発生させた。先に述べられたように、予測外に死亡した２匹の動物は、未処置コントロールとして使用した。種々の腫瘍サイズを有する９匹の動物には、光感受性ウイルス様ナノ粒子での処置を与えた。１匹の動物は、レーザーを当てられなかった赤道の前眼部の中に腫瘍の拡がりがあったことから、評価に含めなかった。

眼の後ろ側に腫瘍を有し、完全処置（光感受性ウイルス様ナノ粒子＋レーザー）を受けた動物に関しては、顕著な腫瘍応答が観察され、これは、３つの要素によって特徴付けられた：１）広範な腫瘍壊死の誘発；２）びまん性から「スリーブ様パターン」への増殖パターンの変化；および３）隣接する網膜の温存。

（未処置コントロール）
ウサギ＃１４を、受容不能な体重減少（初期体重の＞２０％）に起因して４週目に安楽死させた。腫瘍の存在に関する眼底検査は、広範な出血および網膜剥離に起因して結論に達しなかった。この動物は、処置を受けなかった。

超音波：このウサギは、死亡のタイミングに起因して、超音波検査を受けなかった。

肉眼／組織病理学：肉眼での病理学では、高さ（Ｈ）が３ｍｍ×最大腫瘍寸法（ＬＴＤ）８ｍｍの寸法の眼内腫瘍、および組織病理学では２．２ｍｍ（Ｈ）および９．５（最大腫瘍寸法）の寸法の眼内腫瘍に注目した。肉眼での病理学では、１．４ｍｍ（高さ）および９．４ｍｍ（最大腫瘍寸法）の寸法の眼外腫瘍に注目した。眼内腫瘍および眼外腫瘍の両方のうちの約１０％は、壊死していた。スリーブパターンは検出されなかった。

（完全処置）
（ウサギ９）
ウサギ＃９は、４週目に、眼底に約１ＤＤサイズの臨床的に検出可能な腫瘍を有し、これを直ぐに処置した。翌週、上記腫瘍は、０．５ＤＤと推定された。６週目には、上記腫瘍は、＜０．５ＤＤで推定され、最終週では、検出されなかった。

超音波：超音波は、３週目に腫瘍を識別しなかったが、４週目には、１．０４ｍｍ（高
さ）の寸法の塊が同定された。その後の数週間で、超音波での測定値は、６週目以降にはもはや見えなくなるまでに退縮した。

肉眼／組織病理学：組織病理学によれば、腫瘍も細胞も明らかにならなかった。しかし、眼全体の連続切片および免疫組織化学結果は、この結果をさらに確認するために保留されている。

（ウサギ６）
４週目に、腫瘍の臨床上の疑義があった（網膜の下に増大した塊）が、網膜下出血、流体、および網膜剥離は、実験の継続時間にわたって臨床サイズ推定を妨げた。

超音波：超音波によって、３週目に、４．８８ｍｍの大きな塊が検出され、これは、４週目には５．２９ｍｍにまで増殖し、この時点で、本発明者らは処置を開始した。５週目には、上記腫瘍は４．８８ｍｍの寸法になったが、６週目および７週目には、上記腫瘍はそれぞれ、４．０２ｍｍおよび４．９８ｍｍの寸法になった。

肉眼／組織病理学：肉眼での病理学では、２つの明確な腫瘍が同定された：眼内腫瘍および結膜腫瘍（後者は、細胞移植の間の灌流の結果であると疑われた）。結膜腫瘍の位置のせいで、それは処置されなかったので、本発明者らは、それを内部コントロールとみなす。上記眼内腫瘍はばらばらに分かれ、７ｍｍ（Ｈ）×１１ｍｍ（ＬＴＤ）の寸法であった。６ｍｍ（Ｈ）×９ｍｍ（ＬＴＤ）の寸法の眼外への拡がりもまた、同定され、これは、特徴的なテクスチャを有した。組織病理学では、上記眼内腫瘍は、４．９ｍｍ（Ｈ）×８．３ｍｍ（ＬＴＤ）の寸法であり、＞７０％ 壊死であり、残りの生細胞の大部分は、前述のスリーブ様パターンを形成した。処置されなかった結膜腫瘍は、遙かに少ない壊死（約１５％）を示し、上記スリーブパターンは明らかでなかった。

この研究の目的は、ウサギの眼におけるぶどう膜黒色腫の同所異種移植片モデルで、光感受性ウイルス様ナノ粒子＋ＮＩＲ光の活性を調査することであった。光感受性ウイルス様ナノ粒子＋レーザー処置を受けた全ての腫瘍は、上記処置に好都合に応答した。これは、処置に対する応答および完全な組織病理学的応答として、明らかな腫瘍収縮を有した小〜中程度の腫瘍に関して特に明らかである。例えば、４週目に小さな腫瘍を示したウサギ９では、その腫瘍は、上記処置の最初の２用量によって完全に根絶され、上記第２の処置の２週間後には、臨床的にも組織病理学的にももはや検出可能でなかった。より大きな腫瘍、例えば、ウサギ４では、その腫瘍の大部分は壊死しており、これは、腫瘍容積のうちの約１０％において壊死を示したに過ぎなかった未処置コントロール（ウサギ１４）とは全く対照的である（上記処置の効力の明らかな指標）。さらに、眼内腫瘍を有し、完全処置を受けたいくつかの動物は、眼外への拡がりを有したが、レーザーを当てられなかった；これらの部分は、処置された腫瘍の部分より実質的に少ない壊死を示した。このことは、ぶどう膜黒色腫の処置に関するレーザー活性化光感受性ウイルス様ナノ粒子の効力を裏付けるさらなる証拠である。腫瘍に隣接する網膜領域は、上記処置によって影響を受けなかった。

処置後の眼内腫瘍応答に基づいて、特に、コントロール（未処置、眼外部分）と比較すると、本明細書で提供されるデータは、眼内黒色腫の処置に関して、腫瘍の存在下で光感受性ウイルス様ナノ粒子の選択的かつ強力な抗癌活性を裏付ける。

（実施例１８−ＨＰＶＬ１ 対 ＢＰＶ Ｌ１を比較するインビトロ有効性アッセイ）
光感受性ウイルス様ナノ粒子（例えば、ＩＲ７００色素に結合体化した、改変体ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１タンパク質とＨＰＶ Ｌ２タンパク質との組み合わせを含むウイルス様ナノ粒子）の有効性を、インビトロ細胞死滅アッセイによってアッセイした。ぶどう膜黒
色腫細胞（例えば、細胞株ＯＣＭ−１もしくは９２．１）を、ＥＤＴＡおよびトリプシンの溶液を使用して慣用的な方法によって採取した。組織培養プラスチックからいったん除去されたら、上記細胞を完全増殖培地中に懸濁し、約３０分間、３７℃で回復させた。この回復期間の間に、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子の段階希釈を、ＰＢＳ＋２％ ウシ胎仔血清中、約１／２ ｌｏｇ増分（２０００ｐＭ、６００ｐＭ、２００ｐＭ、６０ｐＭ、２０ｐＭ、６ｐＭ、２ｐＭおよび０．６ｐＭ）で行った。回復期間の後に、上記細胞を計数し、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中に細胞密度３×１０^６／ｍｌになるように懸濁した。等容積の細胞懸濁物を、上記ウイルス様ナノ粒子希釈物に添加して、適切な濃度（１０００ｐＭ、３００ｐＭ、１００ｐＭ、３０ｐＭ、１０ｐＭ、３ｐＭ、１ｐＭおよび０．３ｐＭ）のウイルス様ナノ粒子の中に１．５×１０^６ 細胞／ｍｌを得た。これら条件（例えば、３６０μｌ）を、約１．５〜２時間にわたって氷上でインキュベートした。

このインキュベーション後、チューブを遠心分離して、上記細胞を集め、その細胞をその後、光感受性ウイルス様ナノ粒子なしで、ＰＢＳ＋２％ ＦＢＳで２回洗浄した。最後の遠心分離後に、上記細胞を、２００μｌのＰＢＳ＋２％ ＦＢＳ中で懸濁した。１００μｌの各サンプルを取り出し、９６ウェル、１／２面積プレート（１／２ ａｒｅａ ｐｌａｔｅ）のウェルに移した。次いで、各サンプルを、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｏｐａｌ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｏｒ眼科用レーザーを使用して２５Ｊ／ｃｍ^２（６００ｍＷ， ４３秒）の近赤外線（６８９ｎｍ）で照射した。照射後、次いで、上記細胞サンプルを新しいチューブに移した。光を照射したサンプルおよび照射しなかったサンプルの両方とも、３７℃でさらに１〜２時間置いた。

このインキュベーションの後に、最終２０μｌの細胞サンプルを、１：１でＡＯＰＩ染色（アクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム）と混合し、上記細胞の生存性を、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００を使用して評価した。図２０は、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）（ＢＰＶＬ１＝８８ｐｍ； ＨＰＶＬ１＝６０．５ｐｍ）で、細胞生存性に対するＢＰＶＬ１およびＨＰＶＬ１の匹敵する効果を示す。このことは、上記光感受性分子の有効性が互いに匹敵することを示す。

図２１は、光感受性ウイルス様ナノ粒子結合に関して分析した図２０に記載される死滅アッセイの細胞のサンプルを示す。死滅アッセイの細胞を、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｃｌｘゲル／プレートスキャナーでスキャンした。上記Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｃｌｘは、一連の赤外色素（ＩＲ７００色素（例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標） ７００ＤＸ）が挙げられる）の検出および定量のために特有に設計されている。従って、このアッセイにおいて、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子の異なる濃度で処理された細胞は、上記細胞と関連した蛍光の濃度依存的な量を示す。このことは、上記細胞がＢＰＶ−Ｌ１−ＩＲ７００およびＨＰＶ−Ｌ１−ＩＲ７００の両方に結合したことを示す。

（実施例１９−頭頸部癌の異種移植片モデルにおける光感受性ウイルス様ナノ粒子の活性）
頭頚部癌細胞を、ｎｕ／ｎｕマウスの背側側腹部に移植した。腫瘍を２週間増殖させた。上記腫瘍がいったん平均サイズ１５０ｍｍ^３に達したら、上記動物を、以下のように６つの研究群に無作為化した（７匹の動物／群）：生理食塩水；光感受性ウイルス様ナノ粒子（ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１／Ｌ２； ２００μｇ用量）；生理食塩水＋ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ^２）；光感受性ウイルス様ナノ粒子（２００μｇ用量）＋ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ^２）；光感受性ウイルス様ナノ粒子（１００μｇ用量）＋ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ^２）；および光感受性ウイルス様ナノ粒子（５０μｇ用量）＋ＮＩＲ光（５０Ｊ／ｃｍ^２）。投与およびＮＩＲ光処置を３日ごとに行った。腫瘍測定値を、３〜５日ごとに記録した。

上記コントロールは全てそれらそれぞれの処置に対して実質的効果を何ら示さなかった一方で、有意な腫瘍増殖阻害が、投与群の全てにおいて観察された（図２２）。観察された腫瘍増殖阻害は、用量依存性であった。高用量群では、腫瘍応答があった。２００μｇ処置群において２匹の動物が死亡し、これは、広範に及ぶ細胞死および潜在的には腫瘍溶解症候群関連毒性と関連した。

（実施例２０−光感受性ウイルス様ナノ粒子の生成）
本開示の光感受性ウイルス様ナノ粒子を生成するために、ＨＥＫ２９３Ｆを懸濁培養で増殖させ、Ｌ１（もしくはＬ１およびＬ２）キャプシドタンパク質をコードするバイシストロン性プラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。これは、プロトキャプシド（ｐｒｏｔｏ−ｃａｐｓｉｄ）（Ｂｕｃｋ ｅｔ． ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６．１．１−２６．１．１９， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７で記載されるとおり）の形成を誘発する。細胞塊回収および破壊の後に、プロトキャプシドにベンゾナーゼ処置を行って、宿主ＤＮＡ夾雑物を排除し、その後、インビトロでの成熟プロセスを行って、結合体化に安定なウイルス様ナノ粒子を形成した。精製後に、上記ウイルス様ナノ粒子を、ＩＲ７００ ＮＨＳエステルと化学的に結合体化させて、上記光感受性ウイルス様ナノ粒子を生成した。図２３は、生成プロセスの模式図を示す。

この実施例で記載されるプロセスから生成された光感受性ウイルス様ナノ粒子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＤＬＳを使用して特徴付けたところ、純度９０〜９５％を示す。ＨＥＫ２９３細胞由来のヒストンは、上記ウイルス様ナノ粒子組成の一部として存在し、上記ウイルス様ナノ粒子の総タンパク質のうちの１０〜１５％を構成する。

Claims (1)

1. 腫瘍を診断および処置するためのウイルス様粒子結合体など。