JP2644794B2 - 新規な型のコロニー刺激因子―１ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、通常は低濃度において生産されるリンフォ
カインの生産のための組換え技術の利用に関する。より
詳しくは、本発明は、ヒトのコロニー刺激性因子−１
（CSF−１）をコードする新規DNA配列のクローニングお
よび発現に関する。

背景技術 種々の組織においてごく低濃度で生産されるある種の
因子の、骨髄起源の細胞の顆粒球および／またはマクロ
ファージへの成長および発達を刺激する能力は、ここ15
年近くの間に知られてきた。血清、尿試料、および多く
の種からの組織抽出物におけるそのような因子の存在
は、半固体培地に置かれた骨髄細胞によるコロニー形成
の刺激を測定する試験管内の分析を使って証明できる。

周知の確実な生体内分析は存在しない。これらの因子
はそのようなコロニーの形成を引き起こすので、その因
子はひとまとめにしてコロニー刺激性遺伝子（CSF）と
呼ばれている。

より最近になって、ヒトのCSFのタンパク質の、結果
として生ずるコロニーにおいて認められる細胞の形態に
応じて定義され得る少なくとも４つのサブクラスがある
ことがわかった。１つのサブクラスCSF−１は、マクロ
ファージを優勢的に含んでいるコロニーを生じるもので
ある。他のサブクラスは、好中性の顆粒球およびマクロ
ファージの両方を含むコロニー、好中性の顆粒球をもっ
ぱら含むコロニー、そして好中性および好酸性の顆粒球
並びにマクロファージを含むコロニー、を形成するもの
である。

前記ヒトCSFの最初の３つに類似したネズミの因子が
ある。加えて、IL−３と称するネズミの因子は、これら
全ての細胞型に加えて巨核球、赤血球、およびマスト細
胞を種々の組みあわせにおいて含むコロニーをネズミの
骨髄細胞から誘導する。ヒトのIL−３もまた周知であ
る。これらのCSFは、Dexter,T.K.,Nature（1984）309:7
46およびVadas,M.A.ら、J Immunol（1983）130:793およ
びMetcalf,D.,Science（1985）229:16−22およびClark,
S.C.ら、Science（1987）236:1229−1237により論じら
れている。

本発明は、それらのサブクラスの第一の構成員である
タンパク質CSF−１の組換え体の生産に関する。このサ
ブクラスは特殊な放射線免疫検定法（ラジオイムノアッ
セイ）および放射線受容体検定法（ラジオレセプターア
ッセイ）によりさらに特徴づけられ、そして記述され
る。例えば、精製されたCSF−１に対して生じる抗体
は、他のサブクラスの生物学的活性に影響を及ぼすこと
なく、特異的にCSF−１活性を抑制することができ、そ
してマクロファージ細胞系J774はCSF1を特異的に結合す
るレセプターを含む。これらの分析の詳細は、Das,S.K.
ら、Blood（1981）58:630により発表されている。

種々のCSFタンパク質の精製方法はすでに公表されて
いる。

Stanley,E.R.ら、J Biol Chem（1977）252:4305は、
ネズミのL929細胞からのCSFタンパク質を約１×10⁸ユニ
ット/mgの比放射能へ精製し、それが主としてマクロフ
ァージのコロニー形成を刺激することを報告した。Wahe
ad,A.ら、Blood（1982）60:238は、ウサギの抗体カラム
を使った、マウスのＬ細胞のCSF−１の明白な均質性へ
の精製について説明し、そしてネズミの最初の25個のア
ミノ酸配列を報告した〔Ben−Avram,C.Mら、Proc Natl
Acad Sci（USA）（1985）882:4486〕。

Stanley,E.R.ら、J Biol Chem（1977）252:4305−431
2は、ヒトの尿からのCSF−１の精製方法を明らかにし
た。そしてDas,S.K.ら、Blood（1981）58:630;J Biol C
hem（1982）257:13679は、マクロファージコロニーのみ
を形成するヒトの尿のCSF−１を、５×10⁷ユニット/mg
の比放射能で得た。そして、培養されたマウスのＬ細胞
およびヒトの尿から調製したCSF−１タンパク質のグリ
コシル化と該タンパク質の活性との関係を概説した。Wa
nd,F.F.ら、J Cell Biochem（1983）21:263は、ヒトの
尿のCSF−１を比放射能10⁸U/mgで単離した。Wahead,A.
らは、ヒトの尿のCSF−１の比放射能0.7〜2.3×10⁷U/mg
へのウサギの抗体カラムにおける精製を発表した〔Exp.
Hemat.（1984）12:434〕。

Wu,M.ら、J Biol Chem（1979）254:6266は、ネズミの
顆粒球およびマクロファージのコロニーの成長を引き起
こすCSFタンパク質の、培養されたヒト膵臓ガン（MIAPa
Ca）細胞からの調製を報告した。得られたタンパク質
は、約７×10⁷ユニット/mgの比放射能を有した。

ヒトおよびマウスの肺細胞の条件化培地から、〔Foj
o,S.S.ら、Biochemistry（1978）17:3109;Burgess,A.W.
ら、J Biol Chem（1977）252:1998〕、ヒトのリンパ球
のＴ細胞から〔Lusis,A.J.ら、Blood（1981）57:13;U.
S.Patent,4,438,032〕、ヒトの胎盤の条件化培地から明
白な均質性および比放射能７×10⁷U/mgへ〔Wu,M.ら、Bi
ochemistry（1980）19:3846〕、部分的に精製された種
々のCSFの調製もまた報告されている。

一般的にCSFタンパク質、特にCSF−１をいずれかの有
用な機能へ従事させることにおける重大な問題は、実際
に又は可能性としてそれらを療法的に使用するのに十分
な量において個別の且つ特徴付けられる形態において、
それらを入手することができないことであった。本発明
は、組換え技術を通して、十分な量において精製された
ヒトおよびネズミのCSF−１を得るための出発物質を提
供することにより、これらの問題を改善する。

〔異なったサブクラスのCSFタンパク質である、ネズ
ミおよびヒトのGM−CSFは精製され、そしてそのcDNAも
クローン化された。Goughら、Nature（1984）309:763−
767により、このタンパク質は他のCSF、例えばCSF−１
とは異なることが示された。このGM−CSFタンパク質
は、典型的なガン治療の後、白血球を再生させるため
に、そして後天性免疫不全症（AIDS）におけるような、
ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生生物性の感染の
可能性を減少させるために、疾患を治療するのに有用で
あるとして1987年４月９日に公開されたWO87/02060にお
いてさらに記載されている。ネズミのIL−３はFung,M.
C.ら、Nature（1984）307:233によりクローン化され
た、ヒトおよびテナガザル（gibbon）のIL−３はYang,
Y.−C.ら、Cell（1986）47:3−10およびDorssers,L.
ら、Gene（1987）印刷中によりクローン化された。Yoko
ta,T.ら、PNAS（1984）81:1070−1074;Wong,G.G.ら、Sc
ience（1985）228:810−815;Lee,F.ら、PNAS（1985）8
2:4360−4364;およびCantrell,M.A.ら、PNAS（1985）8
2:6250−6254もまた参照されたい。〕 １つの型のヒトCSF−１、特に以後pcCSF−17として表
わされるクローン、をコードするcDNAのクローニングも
また発表されている〔Kawasaki,B.S.ら、Science（198
5）230:292−296;1986年８月14日に公開された国際出願
No.WO86/04607〕。ヒトのCSF−１の“長い型（long for
m）”をコードするクローンの回収は、Wong,G.G.ら、Sc
ience（1987）235:1504−1509およびLandner,M.D.ら、E
MBO J（1987）６:2693−2698により発表されている。

発明の開示 本発明は、以前に未発表の型のヒトCSF−１およびマ
ウスCSF−１に関する。詳しくは、様々な“長い型（lon
g form）”のヒトおよびネズミの該タンパク質、並びに
短い型由来の新規な特定の変異体を開示する。

それゆえ、ある観点においては、本発明はヒトまたは
ネズミのCSF−１タンパクのサブセット、およびこれら
のタンパク質をコードするDNAに関する。本出願におい
て開示される該タンパク質の特定の態様のあるものは、
約522個のアミノ酸を含んでいるか、あるいはこの長さ
の在来配列由来のフラグメントおよび／または変異体で
ある。他の態様は、pcCSF−17にコードされるタンパク
質の単置換または二置換のミューテインである。長い型
に関連するヒトの該タンパク質はLCSFと称され、第２図
において示されるアミノ酸配列を参照して説明される。
そして、短鎖型に関連するそれらはSCSFと称され、第１
図に示されるそれを参照にして説明される。

付加的な観点においては、本発明は、該タンパク質を
生産することにおいて有用の物質および方法、それらの
生産において有用の改良された微生物および細胞系、改
良された生産方法、製薬的および療法的適用において有
用なこれらの物質を含む組成物、そしてこれらの組成物
のための利用方法に関する。

図面の簡単な説明 第１図は“短い型”のヒトCSF−１（SCSF）をコード
するcDNAクローン、pcCSF−17と称される、についての
推定されるアミノ酸配列および該DNAを示す。

第２図は、“長い型”のヒトのCSF−１（LCSF）をコ
ードするcDNAについての推定されるアミノ酸配列および
該cDNAを示す。

第３図は、ヒトCSF−１の長い型および短い型の起源
を示すゲノムのクローンの図である。

第４図は、ネズミのCSF−１（muCSF−１）をコードす
るネズミの4Kbのクローンについての推定されるアミノ
酸配列および該cDNAを示す。

第５図は、同muCSF−１をコードするネズミのcDNAの2
Kbのクローンについて推定されるアミノ酸配列および該
cDNAを示す。

第６図は、大腸菌（E.coli）においてSCSF/CV158をコ
ードする遺伝子の発現により生産される組換えCSF−１
のRP−HPLCを示す。

第７図は、大腸菌（E.coli）においてasp₅₉SCSF/CV15
0をコードする遺伝子から生産される組換えCSF−１のRP
−HPLCを示す。

第８図は、該当するＮ端を切除された形の、asp₅₉SCS
F/NV2CV150のRP−HPLC分析を示す。

第９図は、asp₅₉SCSF/NV3CV150をコードする遺伝子の
発現産物のRP−HPLC分析を示す。

発明の実施様式 A.定 義 “コロニー刺激性因子−１（CSF−１）活性を有する
タンパク質”は、当事者において知られる活性のスペク
トルを表わすタンパク質を指していう。すなわち、Metc
alf,D.,J Cell Physiol（1970）76:89の試験管内におけ
る標準的なコロニー刺激性分析に適用された時に、一次
マクロファージコロニーの形成を起すものである。在来
のCSF−１はグリコシル化された二量体であり、ある場
合において、二量化は活性に必要であると考えられる。
本発明の請求の範囲およびCSF−１の定義の中に意図さ
れたものは、二量体および単量体の両方である。単量体
の形態は、試験管内における適当な条件の用意により二
量体に転換されるかもしれない。そして、その単量体
は、それ自体で抗CSF−１抗体を生成させるための抗原
として有用である。

いくらかの種特異性が存在すると思われる：ヒトのCS
F−１はヒトおよびネズミの両方の骨髄細胞において作
用するが、ネズミのCSF−１はヒトの細胞で活性を示さ
ない。それ故、必ずしも完全な相関性があるわけではな
いけれでも、“ヒト”のCSF−１は、Das,S.K.ら、Blood
（1981）58:630のネズミに特異的なラジオレセプターア
ッセイにおいて陽性であるべきである。該タンパク質の
生物学的活性もまた、一般にヒトの尿のCSF−１に対す
る抗血清を中和することにより阻害される（Das,S.K.
ら、上記）。しかしながら、ある種の環境（例えば、特
定の抗体試料が本来の生物学的機能のためでなくCSF−
１エピトープを認識し、そしてテストされる特定のCSF
−１変異体においてそのエピトープが存在しないような
環境）においては、この規準は合致しないかもしれな
い。

CSF−１の他の特性のあるものは、より最近になっ
て、成熟したマクロファージからのプロスタグランジン
Ｅ群、インターロイキン−１、およびインターフェロン
の分泌を刺激するこのタンパク質の能力を含むことであ
ると認められた〔Moore,R.ら、Science（1984）233:17
8〕。後記の活性に関するメカニズムは現在理解されて
いない。そして、本明細書の定義の目的のため、定義を
満たすのための規準は、適当な種からの骨髄細胞を出発
物質として使用しての単球／マクロファージコロニーの
形成を刺激する能力；ほとんどの場合における（上
記）、精製されたヒト尿CSF−１に対する中和抗血清に
よるこの活性の阻害；及び種タイプについて適当な場合
には、ラジオリセプターアッセイに対する陽性反応に存
する。CSF−１の増殖作用は単核の食細胞に限定され、
〔Stanley,E.R.,The lymphokines（1981）;Stewart,W.
E.IIら監修、HumanaPress.Clifton,NJ.pp.102−132〕、
そして、CSF−１に対するレセプターは前記細胞系〔Byr
ne,P.V.ら、Cell Biol（1981）91:848〕および胎盤のト
ロポブラスト関連細胞に限定されているということが知
られている。

いずれのタンパク質についても、その正確な化学的構
造は官能基の数に依存する。イオン性のアミノ基および
カルボキシル基が分子内に存在するので、特殊なタンパ
ク質は酸性もしくは塩基性の塩としてまたは中和された
形で得られるかもしれない。適切な環境条件に置かれる
ときにそれらの活性を保持したそのような試料はすべて
定義に含まれる。さらに、該アミノ酸一次配列は、もし
活性をそこなうことなしに実施できるならば、酸化もし
くは還元により修飾されてもよく、または糖成分を使っ
た誘導化（グリコシル化）もしくは脂質、ホスフェー
ト、アセチル基、そしてより一般的な糖類の結合による
擬似物ような他の補足分子により拡大されてもよい。

本明細書中で開示される該遺伝子によりコードされる
該タンパク質はまた、タンパク質加水分解により生成さ
れてもよい。CSF−１は自然にＣ端を１個または複数個
除去された形で存在するかもしれないことは予想され
る。該アミノ酸一次配列（Ｃ端で切りおとされたものま
たはそうでないもののどちらか）は、会合して複合体、
より頻繁には二量体を形成してもよい。ヒトの尿の在来
CSF−１は、測定方法およびレセプターの同定による
と、45〜90Kdの高度にグルコシル化された二量体として
単離される。単球、HL−60、およびPanCの細胞系のよう
な他の起源からの在来のヒトCSF−１タンパク質は、同
様な特徴を有する。MIAPaCa起源のCSF−１は、SDS−PAG
Eのイムノブロットにより検出される場合、70,48,40,30
および26Kdの分子量のグリコシル化された単量体と二量
体の複雑な混合物であると思われる。そのような拡大さ
れたある状態は、産生宿主の翻訳後のプロセッシングを
通して完成され、他のそのような修飾は試験管内で誘導
されるかもしれない。いずれの場合においても、そのよ
うな修飾は、前述されたようなタンパク質の活性が消失
させられない限り、定義に含まれる。もちろん、そのよ
うな修飾が、種々の分析において該タンパク質の活性を
増加させるかまたは減少させるかのどちらかにより、定
量的または定性的に活性に影響を及ぼすかもしれないと
いうことは予想されることである。いくつかの分析にお
いて、非グリコシル化単量体が活性を有するかもしれな
いということは出願人により示されている。

脱グリコシル化された単量体の分子量が検討された
が、醗酵、精製そして脱グリコシル化における反応の間
に、タンパク質加水分解を確実になくすことの難しさの
ために、確定的な結論を記すことはできなかった。それ
にもかかわらず、Das,S.K.ら、J Biol Chem（1982）25
7:13679−13684により、わずか14−17Kdであると記載さ
れた。Wong,G.G.ら（1987）（上記）により報告された
組換え的に生産されたCSF−１は、約21Kdの分子量を有
すると思われる。他方、224個のアミノ酸の“短い”型
（SCSF）について推定されるアミノ酸配列に基づいて計
算された分子量は、26Kdのようになる。一方、“長い”
型（LCSF）は55Kdのようであると計算される。該遺伝子
の欠落された構造物が大腸菌（E.Coli）において発現さ
れる（グリコシル化は起こらない）。もちろそれらはSC
SF/CV150について17〜18KdおよびLCSF/CV221について30
Kdという明らかに低分子量のタンパク質のもとである。
哺乳類または昆虫の細胞においてLCSFまたはSCSFが発現
されると高分子量が得られるが、どの程度までがグリコ
シル化のためであるか、そしてどの程度までがアミノ酸
の一次配列それ自体のためであるかを教示することは困
難である。上記にあるように、在来に生産される該タン
パク質は、実際にＣ端の切断を含むように思われる。

もちろん、おそらくATGの開始コドンに直ちに続いて
細菌的に生産される成熟タンパク質は、生産および回収
される時の形態においてＮ端のメチオニンを含むかもし
れないし、また含まれないかもしれない。したがって、
両方の形態が含まれる。加えて、Ｎ端の配列のわずかな
修飾がＮ端のメチオニンのプロセッシングにおいて手助
けするかもしれない。そして１位および２位の残基（共
にグルタミン酸）または１〜３位の残基（glu−glu−va
l）の欠落がこの方法において手助けするかもしれな
い。従って、明らかにこれらの形態もまた定義に含まれ
る。

Ｎ端でより有効的にプロセッシングされた発現産物を
提供することに加えて、NV2およびNV3変異体をコードす
る遺伝子から、大腸菌（E.coli）において生産されるタ
ンパク質は、RP−HPLCにより分析すると、Ｎ端グルタミ
ン酸の２残基を保持している形態をコードする遺伝子か
らの発現産物に比較して、均質である。この均質性は、
これらのタンパク質の細菌性の発現に関連する現象であ
る。なぜなら該遺伝子がCV−１細胞のような哺乳類の細
胞において発現される時はその現象が起こらないからで
ある。

Ｎ端メチオニンのプロセッシングにおけるＮ端の修飾
の効果について：該成熟タンパク質をコードする構成物
が大腸菌（E.coli）において細胞内に発現される時、生
産される該タンパク質のいずれも本質的にＮ端メチオニ
ンを切除するようなプロセッシングは生じなかったこと
がわかる。すなわち、該タンパク質の精製後に回収され
た配列分析可能な物質全てメチオニン（met）で始まっ
ている。しかしながら、NV2由来のCSF−１変異体をコー
ドする該当の構成物が同条件下に発現されるならば、該
タンパク質の23％がＮ端のメチオニンを欠く形態であ
る。NV3構成物においては、メチオニンを切除するため
にＮ端でプロセッシングされるタンパク質の比は、約95
％に増加する。

不均一性に関して：大腸菌（E.coli）において種々の
組換え構成物から生産される縮小されたCSF−１タンパ
ク質について逆相HPLC分析を実施すると完全なＮ端をコ
ードする構成物は２つのレベルで不均一性を示した。は
じめに、ほぼ等しい分子量およびほぼ等しい同アミノ酸
組成を有する２つのピークがあり、それは約70:30の面
積比で生じる。付加的なピークは、第６図において示さ
れるように、59位の残基のチロシンをコードするクロー
ンにおいて生じた内因性の再開始の結果として生じるも
のである。この混乱は、以下に記載されるように、65位
の上流の遺伝子の再構成により除かれる。NV2およびNV3
をコードし、そして好ましくはGATコドンによって59残
基めのアスパラギン酸（asp）をコードする構成物は、
内因性の再開始のフラグメントを与えず、そして該成熟
タンパク質の70％のピークの溶出時間を有するタンパク
質のみを含む。

要約すれば、Ｎ端およびＣ端の切除並びに会合に加え
て、鎖内の個々のアミノ酸残基が酸化、還元、または他
の誘導化により修飾されてもよく、該タンパク質はまた
活性を保存しているフラグメントを得るために開裂およ
び／または会合されてもよい。活性を失わないそのよう
な変更は該タンパク質配列を定義から除去するものでは
なく、そして特定的に包含されるものである。他の種由
来のCSF−１は、ヒトの基質に関して前記したような活
性の必須なパターンを示すことにより、“ヒトの"CSF−
１の活性を有するタンパク質の定義に適合する。

第１図は、組換えcDNAクローンpcCSF−17によりコー
ドされる特定な形態のヒトのCSF−１のアミノ酸配列で
ある。このタンパク質は、成熟配列中の224個のアミノ
酸および32個のアミノ酸のリーダー配列を含む。ここに
説明されるように、このクローンの発現産物として生産
されるタンパク質は、主として骨髄増殖分析（その活性
は抗CFS−１抗体の添加により失われる）、コロニー刺
激性分析、およびラジオレセプターアッセイのような、
CSF−１に特異的な分析において活性である。

第１図に示されるアミノ酸配列の成熟タンパク質は、
同図において概略されるcDNAクローンから推定され、短
鎖のCSF−１（SCSF）と称される。第１図はおそらく哺
乳類の細胞からの分泌時に切断される32残基の推定のシ
グナル配列の存在を示す。SCSFは同図において示される
１〜224のアミノ酸によって表わされる。特に本発明
は、SCSFからの相違によってここに考案されるSCSFのあ
る関連性の単量体および二量体である変異体を含む。

便宜上、SCSFのアミノ酸配列が参照として使用され、
そしてCSF−１活性を有する密接に関連した他の配列
は、第１図に示される配列を参照することにより呼称さ
れるであろう。Ｎ端のメチオニンはあってもなくてもよ
いので、細胞において生産されるCSF−１におけるいか
なる場合にも両方の型を含む。特定のアミノ酸の置換は
それが置換するアミノ酸残基に言及することにより指示
されるであろう。例えば、ser₉₀SCSFは、90位のアミノ
酸システインではなくむしろセリンであるということの
ほかは第１図に示される配列を有するタンパク質を指
す。末端からの切除は、NVのあとのＮ端配列から切除さ
れるアミノ酸の数により、または残基がＣ端配列から切
除される時には、CVおよび残存している最後のアミノ酸
の位置により指示されるであろう。例えば“SCSF/NV4"
また“SCSFのNV4型”は、在来のＮ端から最初の４個の
アミノ酸が切除された第１図のCSF−１を指す。“SCF/C
V130"または“SCSFのCV130型”は、130位のアミノ酸の
後ろの最後の94個のアミノ酸が切除された第１図のCSF
−１を指す。例えば、asp₅₉SCSF（cDNAによりコードさ
れるチロシン残基よりもむしろ、該遺伝子によりコード
されるアスパラギン酸を59位に含む）およびSCSFの１−
158位のアミノ酸のみを有するSCSF/CV158が下記に例示
される。

該CSF−１タンパク質は、長い型のcDNAから推定され
る関連したアミノ酸配列を含有する。すなわちそれは、
コードされるpcCSF−17によりコードされる蛋白質の150
位の残基において挿入された“余分の"298個のアミノ酸
のセグメントを含み、第２図において１−522として示
されるアミノ酸配列が便宜上LCSFと称される。やはり、
このものは、大腸菌において生産される場合メチオニン
に先行される場合もあり、されない場合もある。LCSFの
ミューテインに関する表示はSCSFについて記載したそれ
と類似している。

たとえば、pcDBhuCSF−４およびそれに対応するクロ
ーンにおいてコードされる522個のアミノ酸配列はLCSF
のそれであり、そしてhuCSF−１と表示することができ
る。ネズミの該配列に対しては、回収されたクローンは
共に520個のアミノ酸を含む“長い型”をコードする。
これら２つの密接した相同性のある配列は、ひとまとめ
にしてmuLCSF−１称する。本明細書において使用される
略語は、ヒトのあらゆる型のタンパク質に対する“huCS
F−1"およびネズミのそれに対する“muCSF−1"もまた含
む。

ここにおいて使われるような“別個のペプチド”また
は“ミューテイン”は、長い配列の一部ではない特定の
アミノ酸配列を示す。これらの用語は、Ｎ側およびＣ側
のアミノ酸配列の追加の伸長をまたないペプチド分子を
示す。本明細書にクレームされるCSF−１活性を有する
タンパク質調製物は、単量体、二量体、または別のペプ
チドもしくは変異体の他の集合体であってもよい。

“作用可能に連結された”は、構成要素の正常な機能
が行なわれ得るような配置を指す。例えば、制御配列へ
の“作用可能に連結された”コード配列は、そのコード
する配列がその配列の支配下で発現され得る配置にある
ことを意味する。

“制御配列”は、特定の宿主器官において作用可能に
連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。
原核生物に適する制御配列は、例えばプロモーター、任
意のオペレーター配列、リボゾーム結合部位、および多
分まだあまり知られない他の配列を含む。真核細胞には
プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハ
ンサーを利用することは知られている。

“発現系”は、所望のコード配列および制御配列を作
用可能な連結において含んでおり、そのためそれらの配
列を使って形質転換された宿主がコードされるタンパク
質を生産する能力を有するようなDNA配列を指す。形質
転換をもたらすために、発現系はベクター上に含まれる
のが好ましい。しかしながら、適切なDNAはまた宿主の
クロモソーム中へ挿入されてもよい。

ここで使用される“細胞”、“細胞系”、および“細
胞培養物”は、交換できるように使用され、そのような
呼称すべて子孫を含む。“形質転換体”または“形質転
換細胞”は最初の一次細胞、および継代の数に関係なく
それらから由来する培養物を含む。故意のまたは偶然の
突然変異のために、子孫の全てがDNA含量において全く
等しいわけではない。もとの形質転換細胞においてスク
リーニングされたのと同じ機能性を有する変異体の子孫
が誘導される。別の呼称が意図される場合、状況から明
らかであろう。

“有効量”は、腫瘍を消滅させる、または腫瘍の負担
を減少させる、または感染症を予防するかもしくは治療
するような特定された作用を達成するのに有効な量を意
味する。

B.製薬利用のためのCSF−１の生産：該遺伝子の探索 CSF−１と称される活性の様式の存在は、近年に知ら
れてきたけれども、応答性のタンパク質は配列決定を可
能にするのに十分な純度および十分な量の両方において
そして有用な療法作用を与えるのに十分な純度および量
において得られていない、なぜなら、該タンパク質およ
びそれをコードするDNAの完全に純粋な実験量がどちら
も得られなかったので、ミューテインを提示することに
よる構造物への最適な修飾ができず、またこのタンパク
質を療法状況において利用できなかった。

組換え技術の利用は、これらの欠点を克服した。PCT
WO86/04607（前記）において明らかにされたように、単
離されたヒトの尿のCSF−１のＮ端配列に基づくプロー
ブは、十分な長さの遺伝子を得るためのヒトのゲノムラ
イブラリーのプローブに使用された。ヒトのゲノムのク
ローン化された配列は、それ自身の制御配列を使って、
またはイントロンをプロセッシングする能力のある哺乳
類機構に適した構成物において、直接に発現され得る。
該ゲノム配列はまた、CSF−１活性をもつタンパク質を
コードするpcCSF−17cDNAを得るために、CSF−１を産生
する細胞系から得たヒトのcDNAライブラリーに対するプ
ローブとして使用され得る。このcDNAは、適切に調製す
ると、COSまたはCV−１細胞において直接に発現され得
る。そして広範囲の宿主において、発現に適するベクタ
ー中に構成され得る。上記の適用において明らかにされ
るように、一次構造物へのある修飾もまたCSF−１活性
を示す。

ここで記載されるように、該タンパク質の224個のア
ミノ酸型をコードするヒトのcDNAは、CSF−１産生能の
増大されたＬ−929mRNAからλgt10中に調製されたcDNA
バンクから、ネズミのCSF−１をコードする配列を回収
するためのプローブとして使用された。同じ525個のア
ミノ酸のタンパク質をコードする２つのクローンが回収
された。該クローンは３′側の非翻訳部位において極度
に多様化している。長い方の4Kbのネズミのクローンに
おいては、３′非翻訳部位は2Kbよりも長く、そして該
当するヒトの配列に対する類似性をほとんどもたない。
もう一方の短い方の2Kbのクローンは、非翻訳部位に約5
00bpを含み、そして該当するヒトのDNAに対して明らか
に相同性を示す。

ネズミのライブラリーから得られるCSF−１の“長い
型”は、該当する長さのヒトの配列を回収するためのプ
ローブを調製する基準として使用され、その一次構造物
はゲノムにおいてコードされる。ヒトのゲノム配列に対
するネズミのcDNAの比較に基づき、時々イントロン部位
として挙動する該遺伝子部位は、ネズミの配列において
含まれる“外来の"298個のアミノ酸セグメントに対し明
らかに相同性を示すアミノ酸配列をコードすることがわ
かった。このことは、ネズミの系においてタンパク質に
翻訳された“外来の"DNAに基づくオリゴヌクレオチドプ
ローブの構成を可能にした。ヒトのゲノム配列が得られ
たので、該プローブは正確なヒトの配列を適合させるよ
うに考案された。

pcCSF−17は、CSF−１をコードする物質について濃縮
されたMIAPaCa mRNAからのOkayama−Bergベクターとし
て調製した。しかしながら、長い型をコードするcDNAが
得られるcDNAライブラリーは、MIAPaCa細胞から抽出さ
れた全mRNAから調製され、そしてλgt10ヘクローニング
された。λgt10ライブラリーは、最初pcCSF−17配列を
プローブとして使ってスクリーニングされ、そして選別
されたプローブ陽性候補は、ネズミのcDNAの“余分の”
翻訳された配列に基づくけれどもヒトのゲノムにおける
関連部位に一致させるために修飾されたオリゴヌクレオ
チドプローブを使ってスクリーニングされた。

“長い型”は、第３図において示されるように、mRNA
スプラインシングの相違から生成されるらしい。該mRNA
における“余分の”コード配列は、エキソン６の上流末
端に存在するDNAから生じる。それは短い形にスプライ
スされる。LCSF_Sにコードされる種々のmRNAもまた３′
端（但し蛋白質配列中ではない）において多様である。

ネズミおよびヒトの系からの該タンパク質の“長い
型”をコードするcDNAは、上記の短い型に対して論じら
れたそれと同じ方法において発現され得る。適当な宿主
は、最初のタンパク産物のより有効なプロセッシングを
得られるような哺乳類の細胞、およびウイルスによる発
現ベクターの中へのライゲーションが得られるような細
胞、酵母、昆虫細胞、または他の宿主を包含する。

もちろん、該配列の各々をコードするDNAの利用は、C
SF−１活性を有するミューテインを発生させるようにコ
ドンの配列を修飾する機会を提供する。

このように、これらの手段は、ヒト又はネズミCSP−
１のための完全なコード配列を提供し、これらの配列か
ら種々の宿主系に適用できる発現ベクターを構成するこ
とができ、そして該コード配列が発現される。利用でき
る宿主の多様性及びこの様な宿主に適する発現ベクター
は、翻訳後プロセシング系における、及びこうして生産
されたタンパク質の配置制御を提供する環境因子の選択
を可能にする。

前記のことから、CSF−１をコードしている配列の部
分が、様々な種における他のSCF−１をコードしている
配列を回収するためのプローブとして利用できることが
明らかである。また、少なくとも６つのアミノ酸をコー
ドするcDNAまたはゲノムDNAの部分は、大腸菌（E.col
i）において複製されることができ、そして変性された
形は、CSF−１をコードする付加のDNAを回収するための
プローブとして利用され得る。ヒトの該型の中のヌクレ
オチド配列と他の種の該当部分のそれとの間に厳密に正
確な符号はないかもしれないので、約18ヌクレオチドを
含むオリゴマーが、誤った陽性を減少させるのに十分な
ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションを
得るためにおそらく必要である。６つのアミノ酸をコー
ドする配列が、そのようなプローブに対して十分な情報
を提供するであろう。

C.適当な宿主、制御機構、および方法 一般的に、CSF−１の組換え型の生産は以下を含む。

最初に成熟（ここでは常にすべてのミューテインを含
む）タンパク質をコードするDNA、プレタンパク質、ま
たはその活性を消失させない付加的な配列へのもしくは
活性なタンパク質を与えるように調節された条件下（ペ
プチダーゼを使った処理のような）で切断可能な配列へ
のCSF−１タパク質の融合物、が得られる。該配列はイ
ントロンにより中断されていないとすれば、いずれの宿
主における発現も適する。イントロンが存在するとすれ
ば、それらをプロセッシングする能力のある哺乳類か他
の真核生物の系において発現が得られる。この配列は切
除可能および回復可能な形であるべきである。切除また
は回復されたコード配列は、次いで好ましくは複製でき
る発現ベクター内の適切な制御配列との作用可能な結合
において位置させる。該ベクターは、適当な宿主を形質
転換するために使用され、形質転換された該宿主は組換
えCSF−１の生産をもたらすのに好ましい条件下で培養
される。所望により、CSF−１は培地または細胞から単
離される。該タンパク質の回収および精製は、いくらか
の不純物が黙認されてもよいようなある場合おいては、
必要でないかもしれない。たとえば、リンフォカイン因
子が被検体への投与のために単離されるであろう細胞の
試験管内の培養に対しては、完全な純化はたまに要求さ
れない。しかしながら被検体への投与による療法におけ
る直接の使用は、もちろん生産されたCSF−１の精製を
必要とする。

前述の段階の各々は種々の方法において実施され得
る。例えば、所望のコード配列は、細胞性のメッセンジ
ャーからの適切なcDNAを調製することおよび完全な配列
を得るために該cDNAを細工することにより得ることがで
きる。また、ゲノムのフラグメントは直接適当な宿主に
おいて得られ、そして使用されてもよい。種々の宿主に
おいて実施できる発現ベクターのための構成は、以後に
掲示するような適切なレプリコンおよび支配配列を使っ
て行なわれる。もし、普通に利用できないならば、ベク
ターへ挿入するのに適当な制限サイトが、切除可能な遺
伝子を与えるように該コード配列の末端に付加され得
る。

制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、該遺
伝子を発現させるために使用される宿主細胞の種類に依
存する。通常、真核生物、酵母、昆虫または哺乳類の細
胞が現在宿主として有用である。在来のCSF−１はグリ
コシル化された二量体として分泌されるので、正しい翻
訳後プロセッシング能のある宿主機構がむしろ好ましい
と思われた。原核生物宿主はグリコシル化または調節さ
れた二量体をもたらす能力がないので、グリコシル化さ
れない形が精製されて、そして、活性型へ処置され得る
場合にのみ、その宿主は便利であろう。CSF−１は大腸
菌（E.coli）において単量体として有効的に生産され、
そして種々の技法を利用して活性の非グリコシル化二量
体の形におりたたまれ得る。

しかしながら、真核細胞もまた使用され得る。特に、
昆虫または哺乳類の細胞が好ましい。もし、分泌が所望
されるなら、在来のシグナル配列が宿主の昆虫または哺
乳類細胞により認識されて、そのような分泌を可能に
し、そしてそのために精製をより容易にするであろう。
CSF−１は、CHO細胞において安定して生産され、そして
形質転換されたCV−１細胞およびウイルスに感染された
昆虫細胞において安定して生産され得る。

ヒトCSF−１の特殊な場合においては、今も累積して
いる証拠が、組換えのおよび本来の条件下で該タンパク
質のＣ端に明らかな切除が起こるかもしれないこと、そ
して該タンパク質の試験管内の活性がまだ保持されてい
ることを示した。単離された在来のタンパク質は、Ｃ端
を切り取られた形のある種類またはそれ自身の混合物で
あり、そして様々なＣ端のプロセッシングが起こるらし
い。これらの“先端を切り取られた”形は、それらの計
画的な生成によりはっきりと証明される。SCSF/CV150を
コードしているDNAから生産される変異体は、例えば、L
CSF/CV190をコードするcDNAから生産されるそれがそう
であるようにCSF−１の分析において十分に活性であ
る。該遺伝子の長い型および短い型の両方の組換え体の
発現産物は、完全な長さの配列から期待されるよりも低
分子量のサブユニットを表わすと思われる。“自然な”
プロセッシングが、例えば長い型において含有している
223位のarg残基、238位のlys残基、249位のarg残基、ま
たは411位のarg残基といった種々のタンパク質加水分解
部位で起こるかもしれないということはもっともであ
る。Ｃ端を短縮されたある型が活性であることは明らか
なので、使用される該構成物もまた、該コード配列の相
当する短縮された型を含むことができる。

C.1.制御配列および該当する宿主 原核生物は、より頻繁には大腸菌（E.coli）の種々の
株に代表される。しかし、例えば枯草菌（Bacillus sup
tills）といったバシラス菌、シュードモナス菌（Pseud
omonas）の様々な種、または他の細菌株のような他の微
生物株もまた使用されてよい。そのような原核生物系に
おいて、該宿主に適合する種由来の複製開始点および制
御配列を含むプラスミドベクターが使われる。例えば、
大腸菌（E.coli）は、Bolivarら、Gene（1977）２:95に
よる大腸菌（E.coli）種由来のプラスミドpBR322の誘導
体を使って典型的に形質転換される。pBR322は、アンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そし
て希望するベクターを構成する場合に維持されるかまた
は消去されるかどちらか一方が可能である付加的なマー
カーを提供する。場合によってはオペレーターを伴う転
写開始のプロモーター及びリボゾーム結合部位の配列転
写開始のプロモーターを含むようにここに定義される通
常使用される原核生物の支配配列は、β−ラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモー
ター系〔Changら、Nature（1977）198:1056〕およびト
リプトファン（trp）プロモーター系〔Goeddelら、Nucl
eic Acids Res（1980）８:4057〕およびλ由来のP_Lプロ
モーターおよびＮ−遺伝子のリボゾーム結合部位〔Shim
akakeら、Nature（1981）292:128〕のような通常使用さ
れるプロモーターを含む。

特にCSF−１の場合に、グロコシル化および二量体を
含む翻訳後の高度のプロセッシングのために細菌の機構
を利用することは、初めはいくらか不本意であった。加
えて特に該タンパク質のＮ端部位には多数のシステイン
残基がある。実際、LCSFサブユニットにおいては全部で
10個のシステイン残基があり、その最後は225位であ
る。SCSFには７個ある。両方とも7,31,49,90,102,139,1
46位にシステイン残基を含み、長い形のものは加えて15
7,159、および225位にシステインを有する。二量体形成
のためのプロセッシングは、多くの鎖内結合および少な
くとも１つの鎖間結合の生成を含む。しかしながら、該
技術は、細菌的に生産されるこのタイプのタンパク質を
再生（refolding）するのに利用できる。そして精製さ
れた生物学的に活性なCSF−１を細菌から調製すること
において有用な特定のプロトコールが開発された。

バクテリアに加えて、酵母のような真核の微生物もま
た宿主として使用されてよい。通常多くの株が利用され
るが、、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）の実験
株が最も使用される。２ミクロンの複製の開始点を使っ
たベクターが例証されている〔Broach,J.R.,Meth Enz
（1983）101:307〕一方、酵母の発現に適する他のプラ
スミドベクターが知られている〔例えば、Stinchcomb
ら、Nature（1979）282:39およびTschempeら、Gene（19
80）10:157およびClark,L.ら、Meth Enz（1983）101:30
0を参照〕。酵母ベクターのための支配配列は、解糖酵
素の合成に関するプロモーター〔Hessら、J Adv Enzyme
Req（1968）7:149;Hollandら、Biochemistry（1978）1
7:4900〕を含む。当業者に知られる付加的なプロモータ
ーは、グリセリン酸−３−リン酸キナーゼ〔Hitzeman
ら、J Biol Chem（1980）255:2073〕に関するプロモー
ター、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ
ーゼ、フルクトースリン酸キナーゼ、グルコース−６−
リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコースキ
ナーゼのような、他の解糖酵素に関するプロモーターを
含む。増殖条件に支配される転写の付加的な利点を有す
る他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゲ
２、チトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関
係する分解用酵素そしてマルトースおよびガラクトース
利用をまねく酵素に関するプロモーター部位である。タ
ーミネーター配列は、該コード配列の３′端にあるのが
望ましい。そのようなターミネーターは、酵母由来の遺
伝子中の該コード配列に続く３′非翻訳部位において見
出される。説明されるベクターの多くはプラスミドのpe
no46〔Holland,M.J.ら、J Biol Chem（1981）256:138
5〕を含むエノラーゼ遺伝子、およびYEp13〔Broach,J.
らGene（1978）８:121〕から得られるLEUZ遺伝子から由
来の、制御配列を含む。しかしながら、酵母に適合する
プロモーター、複製起点および他の支配配列を含むいか
なるベクターも適している。

もちろん、多細胞微生物由来の真核宿主細胞の培養物
において、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることもまた可能である。例えば、Tissue Culture,Aca
demic Press,CruzおよびPaterson監修（1973）を参照さ
れたい。有用な宿主細胞系は、ネズミのミエローマ細胞
N51,VEROおよびHeLa細胞、そしてチャイニーズハムスタ
ー卵巣（CHO）細胞を包含する。そのような細胞のため
の発現ベクターは、シミアンウイルス40（SV40）からの
通常利用される初期および後期プロモーター〔Fiers
ら、Nature（1978）273:113〕、またはポリオーマ、ア
デノウイルス２、牛乳頭腫ウイルス、もしくは鳥肉腫ウ
イルス由来のプロモーターのようなウイルス性プロモー
ター、または免疫グロブリンプロモーターおよびヒート
ショックプロモーターのような、哺乳類に適合できるプ
ロモーターおよび制御配列を所望により含む。哺乳類の
宿主細胞の形質転換機構の一般的外観は、Axelにより説
明されている;U.S.Patent No.4,399,216,1983年８月16
日発行。“エンハンサー”部位が最適な発現において重
要であるということが今まさに明らかになった。それら
は、通常、プロモーター部位の上流に見出される。複製
起点は、必要であればウイルス源から得られるだろう。
しかしながら、クロモソームへの組み込みは、真核生物
における通常のDNA複製機構である。植物細胞もまさに
宿主として利用でき、そしてノバリンシンセターゼプロ
モーターおよびポリアデニル化シグナル配列〔Depicke
r,A.ら、J Mol Appl Gen（1982）１:561〕のような、植
物細胞に適合できる支配配列が利用できる。

加えて、最近、細菌のベクターにより提供される支配
機構を利用する昆虫細胞を使った発現機構が説明された
〔Miller,D.W.ら、Genetic Engineering（1986）Setlo
u,J.K.ら監修、Plenum Publishing,Vol.8,pp.277−29
7〕。これらの機構もまたCSF−１の産生に成功する。

C.2.形質転換 利用される宿主細胞に依存している形質転換は、その
ような細胞に適した標準的な技術を使って実施される。
塩化カルシウムを使ったカルシウム処理は、Cohen,S.
N.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1982）69:2110により
説明されるように、原核生物および強固な細胞壁の障壁
を含む多の細胞に対して使用される。アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacies）で
の感染〔Shaw,C.H.ら、Gene（1983）23:315〕は、ある
種の植物細胞に使用される。そのような細胞壁のない哺
乳類の細胞には、Grahamおよびvan der Eb,Virology（1
978）52:546のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。酵
母への形質転換は、Van Salingen,P.ら、J Bact（197
7）130:946およびHsiao,C.L.ら、Proc Nat Acad Sci（U
SA）（1979）76:3829の方法に従って実施される。

C.3.ノザン法によるmRNA探査;cDNAまたはゲノムライブ
ラリーのプローブ RNAは、ホルムアルデヒド〔Maniatis,T.ら、Molecula
r Cloning（1982）Cold Spring Harbor Press,pp202−2
03〕または10mMのメチル水銀（CH₃HgOH）〔Bailey,J.M.
ら、Anal Biochem（1976）70:75−85;およびSehgal,P.
B.ら、Nature（1980）288:95−97〕を変性剤として使用
した十分な変性条件下のアガローススラブゲル電気泳動
によりノザン法用に分画される。メチル水銀ゲルについ
ては、泳動緩衝液（100mMホウ酸、6mMホウ酸ナトリウ
ム、10mM硫酸ナトリウム、1mM EDTA,pH8.2）内にアガロ
ースを融解して、60℃に冷却し、そして1/100容量の1M
CH₃HgOHを添加することにより1.5％ゲルが作成される。
該RNAは、0.5×泳動緩衝液中に溶解され、そして10mMメ
チル水銀中、室温で10分間インキュベーションすること
により変性される。グリセロール（20％）およびブロモ
フェノールブルー（0.05％）が試料を染色するために添
加される。試料は、該緩衝液を循環させながら、500−6
00volt−hrで電気泳動される。泳動後そのゲルはメチル
水銀を無毒化するために100mMの２−メルカプトエタノ
ール中で40分間洗浄され、そしてノザンブロットは該RN
Aをゲルからメンブランフィルターへ転写することによ
り調製される。

cDNAまたはゲノムライブラリーは、該コロニーまたは
プラークのハイブリダイゼーション法を使ってスクリー
ニングされる。細菌のコロニーまたはファージの該プラ
ークは、二重のニトロセルロースフィルター（S ＆ S B
A−85型）の上に置かれる。該プラークまたはコロニー
は溶解され、そして500mM NaOH,1.5M NaClでの継続的な
５分間の処理により、DNAがそのフィルターに固定され
る。該フィルターは５×クエン酸ナトリウム標準液（SS
C）で２回、各５分間洗浄され、そして空気乾燥され、
そして80℃で２時間焼成される。

ノザン法用のゲルまたはcDNA用の二重のフィルターま
たはゲノムのスクリーニングは、プローブのないハイブ
リダイゼーション緩衝液〔０−50％ホルムアルデヒド、
５−６×SSC,pH7.0,5×Dehardt溶液（ポリビニルプロリ
ジン＋フィコールおよび牛血清アルブミン；各々１×＝
0.02％）、20−50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0,0.2
％ SDS,20μg/mlポリＵ（cDNAを探査する時）、および5
0μg/mlのサケ精子の変性DNA〕のフィルターごとに10ml
で25−42℃,6−８時間プレハイブリダイゼーションされ
る。次いで試料は、リン酸化されたプローブ（オリゴマ
ーのために）を含む該ハイブリダイゼーション溶液を使
って適切な温度で24−36時間インキュベーションするこ
とによりハイブリダイズされる。長い方のcDNAまたはゲ
ノムフラグメントのプローブが、ニックトランスレーシ
ョンにより、またプライマーの伸長によりラベルされ
た。

プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼー
ションの条件は希望するストリンジェンシに依存し、例
えばプローブの長さで異なる。比較的長い（例えば30−
50ヌクレオチドより長い）プローブに対する典型的な条
件は、42゜−55℃の温度および約20％−50％のホルムア
ミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を使用する。
約15ヌクレオチドのオリゴマープローブに必要なより低
い堅固度に対しては、約25゜−42℃の低温度および低ホ
ルムアミド濃度（０％−20％）が使われる。長いプロー
ブに対しては、該フィルターは、例えば２×SSC,0.2％
SDS、および50mMリン酸ナトリウム緩衝液をpH7で30分間
４回、各時40゜−55℃で洗浄され、次いで0.2×SSCおよ
び0.2％ SDSで洗浄され、空気乾燥され、そして−70℃
で２〜３日間オードラジオグラフされる。洗浄条件は、
より短いプローブに対しては幾分苛酷さが少ない。

C.4.ベクターの構成 目的のコード配列及び制御配列を含む適切なベクター
の構成は、当業界で十分に理解されている標準の連結及
び制限技法を用いる。単離されたプラスミド、DNA配列
又は合成されたオリゴヌクレオチドを、所望の形に切断
し、仕立て、そして連結する。

部位特異的DNA切断を、当業界において一般的に理解
されている条件下で適切な制限酵素（又は複数の酵素）
により処理することによって行ない、そしてこの詳細
は、これらの商業上入手できる制限酵素の製造業者によ
り記されている。たとえば、New England Biolabsの製
品カタログを参照のこと。一般的に、約１μｇのプラス
ミド又はDNA配列を、緩衝溶液約20μ中で酵素１単位
により切断し；本明細書の例においては、典型的には過
剰の制限酵素を用いて、DNA基質の完全な消化を確保す
る。いくらかの変動は受け入れられるが、約37℃で約１
〜２時間のインキュベーション時間が実施できる。それ
ぞれのインキュベーションの後、タンパク質をフェノー
ル／クロロホルムによる抽出により取り出し、そして次
にエーテル抽出にゆだね、そして核酸をエタノールによ
る沈殿により水性画分から回収する。所望により、切断
されたフラグメントのサイズ分離を、標準技法を用いて
ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動に
より行なうことができる。サイズ分離の一般的な説明
は、Methods in Enzymology（1980）65:499〜560に見出
される。

50mMのトリス（pH7.6）、50mMのNaCl,6mMのMgCl₂,6mM
のdTT及び５〜10μＭのdNTP中における20〜25℃で約15
〜25分のインキュベーション時間を用いて、制限切断フ
ラグメントを、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸
（dNTP）の存在下でE.コリDNAポリメラーゼＩの大フラ
グメント（クレノウ）により処理することによって平滑
末端化することができる。そのクレノウフラグメント
は、５′付着端でフィルインするが、しかし４種のdNTP
が存在したとしても、突出する３′一本鎖をチューバッ
クする。所望により、選択的修復を、付着端の性質によ
り指示される制限内でただ１種のdNTP又は選択されたdN
TPを供給することによって行なうことができる。クレノ
ウによる処理の後、その混合物をフェノール／クロロホ
ルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。適
切な条件下でのSIヌクレアーゼによる処理は、いずれか
の一本鎖タンパク質の加水分解をもたらす。

合成オリゴヌクレオチドを、Matteucci、など（J Am
Chem Soc（1981）103:3185〜3191）のトリエステル法に
より又は自動合成法を用いて調製することができる。ア
ニーリング又はラベリングの前、一本鎖のキナゼ処理
を、50mMのトリス（pH7.6）、10mMのMgCl₂,5mMのジチオ
トレイトール、１〜2mMのATPの存在下で、1nMの基質に
過剰の、たとえば約10単位のポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて行なう。キナーゼ処理がプローブのラベリング
のために存在する場合、ATPは高い比活性の³²γＰを含
むであろう。

連結を、次の標準条件及び温度下で15〜30μの体積
で行なう:20mMのトリス−Cl（pH7.5）,10mMのMgCl₂,10m
MのdTT,33μg/mlのBSA,10mM〜50mMのNaCl及び40μＭのA
TP,0.01〜0.02（Weiss）単位のT4 DNAリガーゼ、０℃
（“付着端”の連結のために）又は1mMのATP,0.3〜0.6
（Weiss）単位のT4 DNAリガーゼ、14℃（“平滑端”の
連結のために）。分子間“付着端”の連結は、通常、33
〜100μg/mlの合計DNA濃度（５〜100nMの合計末端濃
度）で行なわれる。分子間平滑端連結（通常、10〜30倍
の過剰モルのリンカを用いて）は、１μＭの合計末端濃
度で行なわれる。

“ベクターフラグメント”を用いるベククター構成に
おいては、一般的に、５′リ酸を除去し、そしてそのベ
クターの再連結を妨げるために、そのベクターフラグメ
ントが細菌性アルカリホスファターゼ（BAP）により処
理される。BAP消化は、60℃で約１時間、ベクター１μ
ｇ当りBAP約１単位を用いて、Na⁺及びMg²⁺の存在下で約
150mMのトリス中においてpH8で行なわれる。核酸フラグ
メントを回収するために、その調製物を、フェノール／
クロロホルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿せし
める。他方、所望しないフラグメントの追加の制限酵素
消化により二重消化されたベクターにおいて再連結が妨
げられ得る。

C.5.DNA配列の変形 配列の変形を必要とするcDNA又はゲノムDNAに由来す
るベクターの一部のために、部位特異的プライマー指示
突然変異誘発を用いる。この技法は当業界において現
在、標準的であり、そして突然変異誘発させるべき一本
鎖ファージDNAに相補的な（但し、所望する突然変異を
表わす制限ミスマッチングを除く）プライマー合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて行なわれる。簡単に言えば、合
成オリゴヌクレオチドがファージに相補的な鎖の合成に
向けるためにプライマーとして使用され、そしてその得
られた二本鎖DNAは、ファージ支持の宿主細菌中に形質
転換される。形質転換された細菌の培養物を、上層寒天
にプレートし、ファージを含む単一の細胞からプラーク
形成を可能にする。

理論的には、新しいプラークの50％は、突然変異形を
一本鎖として有するファージを含み;50％は元の配列を
有するであろう。そのプラークは、正確な対合のハイブ
リダイゼーションを可能にする温度で（但し、この温度
で、元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを
妨げるために十分である）、キナーゼ処理された合成プ
ライマーとハイブリダイズされる。次に、プローブとハ
イブリダイズするプラークを選択し、培養し、そしてそ
のDNAを回収する。部位特異的突然変異の詳細は、下記
の特定の例に記載される。

C.6.構成の確認 下記に示された構成法において、プラスミド構成のた
めの正しい連結を、まず連結混合物によりE.コリ株MM29
4又は他の適切な宿主を形質転換することによって確認
する。好結果を表わす形質転換体を、当業界において理
解されているようにして、プラスミド構成の態様に依存
して、アンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の耐
抗生物質により、又は他のマーカーを用いて選択する。
次に、形質転換耐からのプラスミドを、場合によっては
クロラムフェニコール増幅〔Clewell,D.B.,J Bacteriol
（1972）110:667〕の後、Clewell,D.B.,など、Proc Nat
l Acad Sci（USA）（1969）62:1159の方法に従って調製
する。単離されたDNAを、制限酵素により分析し、そし
て／又はSanger,F.,など、Proc Natl Acad Sci（USA）
（1977）74:5463のジデオキシ方法〔Messing,など、Nuc
leic Acids Res（1981）９:309によりさらに記載され
る〕、又はMaxam,など、Methods in Enzymology（198
0）65:499の方法により配列決定する。

C.7.例示される宿主 本発明のクローニング及び発現に使用される宿主株は
次の通りである： クローニング及び配列決定のためには、及びほとんど
の細菌プロモーターの制御下での構成体の発現のために
は、E.コリから得られたE.コリ株MM294（Genetic Stock
Center GCSC ＃6135）を、宿主として使用した。P_LN
_RBSプロモーター−制御下での発現のためには、E.コリ
株K12 MC1000λ溶原菌、すなわちN₇N₅₃cI875 SusP₈₀（A
TCC39531）を使用する。

M13ファージ組換え体のためには、ファージ感染を受
けやすいE.コリ株、たとえばE.コリK12株DG98を使用す
る。DG98株は、1984年７月13日にATCCに寄託され、そし
てアクセッション番号39768を有する。

哺乳類の発現は、COS−7,COS−A2,CV−１及びCHO細胞
中で達成された。

D.好ましい態様 本発明の組換えCSF−１タンパク質は、２対の“基本
的”タンパク質、すなわちLCSF及びそのムテイン並びに
SCSFのある特定のムテインとして考慮され得る。これら
のタンパク質は類似するが、しかし同一ではない一次ア
ミノ酸配列及び種々の長さのアミノ酸配列を有し、これ
らのすべてはCSF−１の活性パターン特性を示し、又はC
SF−１の活性パターン特性を示すムテインに特異的に切
断され得る。すなわち、それらは骨髄細胞が単球に分化
するのを卓越的に刺激することができ、そして上記定義
の部で示された限界内で、生来のCSF−１に対して生ぜ
しめられた抗体及びCSF−１活性に関連する受容体と免
疫反応する。SCSFに関するムテインのある種の態様は、
これに関するいくつかの特許出願の優先権に基づかれる
PCT出願公表番号WO86/04607に明確に開示されなかっ
た。前記EPO出願において、ヒト及びネズミCSF−１の長
い形、特にLCSF及びその関連するムテインもまた開示さ
れていない。一定のＮ−及びＣ−末端を欠失するLCSFの
形が特に好ましい。

Ｎ−末端の２又は３個の残基を欠き、そして従ってVa
l−ser−glu−tyr−cys−ser及びser−glu−tyr−cys−
serから成る群から選択されたＮ−末端配列を有するSCS
F及びLCSFのムテインのクラスが本明細書に開示され
る。これらのNV₂又はNV₃ムテインは、SCSF及びLCSFムテ
イン形の対応するNV₂,NV₃ムテイン、すなわちSCSF/NV₂,
SCSF/NV₃,LCSF/NV₂及びLCSF/NV₃を代表するものであろ
う。しかしながら、さらに、これらのNV₂及びNV₃ムテイ
ンのＣ−末端を切断された形及び位置的に置換されたム
テインが、さらに下記に記載されるように含まれる。

また、種々のＣ−末端欠失ムテインが特に興味の対象
である。上記に引用されたEPO出願は、SCSFのためにの
み短くされた形並びにCV158及びそれより長い形を開示
した。生来のタンパク質がイン ビボでＣ−末端からど
れぐらいプロセスされるかは従来技術から明確でない。
SCSFのアミノ酸150の後ろのＣ−末端領域が少なくとも
欠失された得、そしてそのタンパク質が骨髄増殖アッセ
イにおいてCSF−１活性をインビトロで保持するであろ
うことが現在確立されている。さらに、短い形において
は、位置166〜188及び長い形において464〜486に及ぶ23
個の疎水性アミノ酸配列が膜アンカー機能を有し、そし
て、それが膜を通して輸送され、そして分泌される場
合、そのタンパク質から分離され得ると思われる。この
部分はまた、それ自体膜結合も相当し、そして細胞膜に
結合される場合、その結合部位でCSF−１と他の細胞と
の相互作用を可能にすることもできる。これらの配列
は、全体的に又は部分的に自由に分散され得る。いずれ
にせよ、コードされたいずれかのSCSF又はLCSFよりも著
しく短いCSF−１形は、生来のタンパク質を単離するこ
とにおいて、及び組換え生成法から得られた、分泌され
たタンパク質に見出されると思われる。本発明のデータ
は、CV−１細胞中でのSCSFをコードする構成体の発現が
上清液中にSCSF/CV158をもたらすことができることを指
摘する。

従って、上記のように、SCSF又はLCSFの初めの150個
のアミノ酸のみを含むアミノ酸配列あるいはそれらの位
置59のtyr又はaspムテイン（従って、これらは最後のア
ミノ酸を除いて同一である）、あるいはそれ以上の配列
において任意の数のアミノ酸により任意に延張された、
そのNV₂又はNV₃変異体を含有するCSF−１タンパク質が
本発明内に含まれる。これらのグループの中において
は、SCSF/CV150,SCSF/CV158,LCSF/CV150,LCSF/CV190,LC
SF/CV191,CSF/CV221,LCSF/CV223,LCSF/CV236,LCSF/CV23
8,LCSF/CV249,LCSF/CV258及びLCSF/CV411並びにそれら
の対応するNV2及びNV3形に相当するＣ−末端欠失体が特
に好ましい。

上記Ｃ−末端欠失体（ここで“基本的”配列からの配
列中の１又はそれよりも多くのアルミ酸、好ましくは１
〜５個のアミノ酸そしてより好ましくは１〜２個のアミ
ノ酸の変更が行なわれている）をコードする構成体もま
た好ましい。

従って、種々のCSF−１形はまた、種間に高く保持さ
れない領域において機能性を破壊しない突然変異体も含
むことができる。１〜５個のアミノ酸欠失及び／又は位
置15〜20,51〜52及び／又は75〜84での置換が存在す
る。SCSFにおける191〜193及びLCSFにおける489〜491の
追加の領域が存在する。上記に引用されたEPO刊行物
は、SCSFの突然変異体及びCV158に欠失されるそのＣ−
末端ムテインのみを開示し；従って、これらのムテイン
は、それらが長い形のLCSF及びそのムテインの両者又は
さらに短くされたSCSF/CV150−158に関係する場合、新
規なものである。明確には、SCSF及びLCSF両者及びそれ
らのムテインのglu₅₂形は活性を有することが見出され
た。

１又はそれよりも多くのグリコシル化部位の変更は、
活性タンパク質をもたらすことができることもまた、本
発明において示された。LCSFは、122〜124,140〜142,34
9〜351及び383〜385で４個のグリコシル化部位を有し;S
CSFは初めの２種の部位でのみグリコシル化部位を有す
る。従って、これらの部位の１又はそれよりも多くで不
活性化突然変異体を含むいずれかのムテインもまた含ま
れる。

さらに、位置90でのシステインが免疫反応性に無くて
も済むことが示された。従って、意図される目的が抗原
性にのみ依存する場合、ala₉₀又ser₉₀であるムテイン
が、含まれる。LCSF及びSCSFの推定上の膜アンカー領域
は、いくつかのタイプのCSF−１活性のために無くても
よい。

本発明のさらに好ましい形は、第５及び６図に示され
るネズミのアミノ酸配列に対応するムテイン及びヒトLC
SFのために示されたアミノ酸配列に対応するムテインを
含む。

CSF−１をコードするDNAの好ましい態様 アミノ酸配列を変形する他に、そのタンパク質をコー
ドするDNA配列が、特定のシステムでの発現を助けるた
めに変形され得る。たとえばE.コリにおいて、細菌に好
ましいコドンへの生来の配列の初めの６個のアミノ酸の
ためのコドンの変更はLCSF及びSCSFの両者のための及び
それらの切断された形のための高いレベルの生成をもた
らす。従って、ベクター（“オーバーエクスプレシン
グ”のために下記にO/Eと命名される）は、Ｎ−末端コ
ード配列GAＡGAＡGTＴTCＴGAＡTAＴ又はそのNVもしくは
NV₃切断物のDNAを含む。これは合成Hind III/Bat XIフ
ラグメントとして供給され、そして示された下線位置で
生来のGAＧGAＧGTＧTCＧGAＧTAＣと異なる。本発明の１
つの観点は、CSF−１をコードするDNAが細菌の細胞内に
発現される場合、Ｎ−末端で適切な数のコドンが細菌が
好むコドンのための規定に従って選択される形で、その
CSF−１をコードするDNAを提供することを含む。

また細菌の発現に関しては、位置65でのATGの上流のD
NA配列が、内部の開始部位としてこのATGの使用を妨げ
るために変形され得る。これは、asp₅₉構成体のために
よりもtyr₅₉のためにより重大である。配列５′−
３′、すなわち のプライマーが、生来の遺伝子中星印を付けられた変更
を行なうために、部位特異的突然誘発に使用される。コ
ードされたアミノ酸の変化はもたらされない。

E.実用性及び投与法 本発明のCSF−１タンパク質は、前駆骨髄細胞から単
球−前駆体／マクロファージ細胞産生を刺激し、従って
免疫系の有効性を高めることができ、そして成熟マクロ
ファージにおけるリンフォカインの分泌のようなこれら
の分化された細胞の機能を刺激することができる。それ
らはまた、抗感染剤、特に抗ウィルス及び抗細菌剤とし
ても有用である。

１つの用途においては、これらのタンパク質は、化学
療法への補助物として有用である。化学療法処理が免疫
系の抑制をもたらすことは良く理解されている。しばし
ば、それらが向けられた腫瘍細胞を破壊することに好結
果をもたらすが、化学療法処置は、免疫系の細胞上の化
学毒素剤の副作用のために対象物の死をもたらす。その
ような患者へのCSF−１の投与は、骨髄由来の前駆体の
マクロファージ中への増殖及び分化を仲介し、そして増
強するCSF−１の能力のために、この副作用を妨げ、そ
して従って二次感染を受ける患者の傾向を妨げるために
免疫系の再刺激をもたらす。そのような処置により助け
られる他の患者は、骨髄の移植を通して白血病のために
処置されるものを含み、それらはしばしば、拒絶反応を
防ぐために免疫抑制状態にある。またこれらの患者に関
しては、免疫抑制がCSF−１の投与によりに逆にされ
る。

一般的に、化学療法のための骨髄移植又は他の偶然の
形の免疫抑制、たとえば疾病（たとえば後天性免疫不全
症候群）のいずれかの免疫抑制を有する対象物は、薬理
学的使用のために有用なCSF−１を受けるであろう。さ
らに、対象物が生来のシステムのマクロファージを補う
ために前もって分化された多量のマクロファージ（該マ
クロファージは骨髄のインビトロ培養物又はCSF−１に
より処理された他の適切な調製物により産生される）を
供給される。これらの長生物は、患者自身の単球の調製
物であり、そしてこれは実際に培養され、そして局所又
は全身治療のために戻される。

マクロファージによるリンフォカインの産生を刺激
し、そして標的細胞を殺すそれらの能力を高めるCSF−
１の能力はまた、CSF−１を、新生物及び感染の治療に
直接的に有用なものにする。

CSF−１はネズミ由来のマクロファージによりインタ
ーフェロンの産生を刺激し〔Fleit,H.H.,など、J Cell
Physiol（1981）108:347〕、そしてMIAPaCa細胞からの
一部精製されたヒトCSF−１は、ヒト単球からのインタ
ーフェロン及びTNFのポリIC−誘導された産生を刺激す
る。さらに、CSF−１は、ヒト血液単球により骨髄性CSF
の産生を刺激する。

AIDSを有する患者のCSF−１（単独で又はエリトロポ
リエチン及び／又は抗ウィルス剤及び／又はIL−２と一
緒に）による処置が、1987年６月４日に公表されたWO87
/03204に報告されている。1984年11月13日に発行された
アメリカ特許第4,482,485号は、CSF−１が癌の治療にお
いて援助の役割で使用され得ることを記載する。さらに
1984年９月19日に公表されたEP第118,915号は、癌治療
を受けている患者の顆粒球減少症及びマクロファージ減
少症を防ぎ且つ治療するために、感染を防ぐために及び
移植された骨髄を有する患者を治療するためにCSF−１
の使用を報告する。Ralphなど、Cell Immunol（1987）1
05;270〜279は、ネズミ肉腫TU5標的上にCSF−１及びリ
ンフォカインの組合せの増強された殺腫瘍効果を報告す
る。

〔ネズミCSF−１は、P818腫瘍細胞に対する細胞増殖
抑制効果を有するネズミマクロファージを刺激し（Win
g,E.J.,など、J Clin Invest（1982）69:270）又は他の
白血病標的を殺さない（Ralph,P.など、Cell Immunol
（1983）76:10）ことを報告した。Nogawa,R.T.,などCel
l Immunol（1980）53:116は、CSF−１が酵母を摂取し、
そして殺すためにマクロファージを刺激することができ
ることを報告する。〕 従って、免疫抑制自体を克服する他に、CSF−１は、
マクロファージ分泌及び活性の刺激により、侵入生物体
又は新生物細胞を間接的に破壊するために使用され得
る。

CSF−１は、他のリンフォカイン又はシトキン、例え
ばα−IFN,β−IFN,γ−IFN,IL−1,IL−2,IL−3,IL−４
又はTNFと一緒に腫瘍を治療するために使用され得る。

本発明のCSF−１は、タンパク質物質の投与のために
当業界において標準の従来の方法で配合され得る。注射
による投与が好ましい：製剤は、溶液もしくは懸濁液、
エマルジョン又は注射できるものに再構成するための固
形組成物を含む。適切な賦形剤、たとえばリンゲル溶
液、ハンクス溶液、水、生理的食塩水、グリセロール、
デキストロース用溶液及び同様のものを含む。さらに、
本発明のCSF−１は、適切な応答を刺激するために細胞
の調製物と共にプレインキュベートされ得、そして全調
製物又はそれから上清液が対象物に導入される。下記に
示されるように、種々のタイプの血液細胞によるCSF−
１の刺激に応じて産生された物質は、所望の標的物に対
して効果的であり、そして侵入ウィルス又は新生物を攻
撃するためのこれらの血液細胞自体の特性が増強され
る。対象物自体の細胞又は、たとえばインキュベーショ
ンに使用される他の適合する個人からの単球又はリンパ
球がこの方法で採取され、そして使用され得る。

“ヒト”形のCSF−１が医薬組成物に使用されること
が好ましい；しかしながら、ネズミ形のこのタンパク質
はCSF−１活性の複雑なパターンを決定するために、マ
ウスの便利なモデルシステムに特に有用である。

F.ヒトCSF−１のクローニング及び発現 次のことは、ヒトCSF−１のためのコード配列を得る
ために、この配列を発現ベクターに配列するために及び
所望するタンパク質の発現を得るために使用される方法
を例示する。もちろん、DNAの検索はくり返えられる必
要はない；開示された配列は、合成により部分的に又は
全体的に得られる。

F.1.生来のヒトCSF−１の精製及びプローブ設計 ヒト尿CSF−１を、DAS,S.K.,などBlood（1981）58:63
0により記載されている標準方法により部分的に精製
し、次に、セファロース4Bカラムに結合されたネズミCS
F−１（YYG106と命名された）に対するラットモノクロ
ーナル抗体を用いるアフィニティー精製段階〔Stanley,
E.R.,Methods Enzymol（1985）116:564〕により精製し
た。精製の最終段階は、0.1％TFA/30％アセトニトリル
〜0.1％TFA/60％アセトニトリル緩衝液系中における逆
相HPLCであった。精製及びプローブ設計の詳細及び結果
は、PCT出願WO86/04607（前記）に記載される。

F.2.ヒトゲノム配列の調製 CSF−１をコードするヒトゲノム配列を、PCT出願WO86
/04607（前記）に記載しているようにして、ヒトタンパ
ク質のＮ−末端配列をコードするように企画されたプロ
ーブを用いて、λ−ファージシャロン４中のManiatisヒ
トゲノムライブラリィから得た。下記のようにプローブ
とのハイブリダイゼーションにより判定され、そしてph
CSF−１と命名された、CSF−１配列を含むカロン4Aファ
ージを、1985年４月２日にAmerican Type Culture Coll
ection（ATCC）に寄託し、そしてアクセッション番号40
177を得た。このファージの後での研究によれば、再配
列及び／又は欠失が生じ、そして正しい配列は保持され
なかったことが見出された。従って、同じ態様でゲノム
ライブラリィから得られ、そして複製を通して安定性を
確保するために増殖された他のコロニィを、phCSF−1a
と命名し、そして1985年５月21日にATCCに寄託し、そし
てアクセッション番号40185を得た。phCSF−1aは18Kbの
挿入部を含み、そしてプローブにハイブリダイズする制
限酵素消化物を生成することができ、そしてそれを配列
の決定及び追加のプローブ構成のために使用した。

pbCSF−1a中に含まれる18Kbの全体の遺伝子を配列決
定した。その遺伝子は、第１図のpcCFS−17と比較し
て、８個のイントロンにより分離された９個のエキソン
を含む。成熟タンパク質cDNAの領域は、ゲノムエキソン
のコドン（但しコドン59を除く）に正確に対応し；ヒト
CSF−１タンパク質の“長い形”は、下記にさらに記載
されるように、エキソン６の５′末端で延長されたコー
ド領域を示す。

第３図は、ヒトCSF−１のためのゲノム構造の図を表
わす。初めのエキソンは、翻訳されていない５′配列及
びシグナル配列の初めの13個のアミノ酸残基を含む。シ
グナル配列の残る19個のアミノ酸及び成熟CSFタンパク
質の初めの22個のアミノ酸が第２エキソン中にコードさ
れる。停止コドンはエキソン８に現われ、これはまた9b
pの翻訳されない３′配列を含む。その遺伝子は約18Kb
にわたり、そして少なくとも９個のエキソン、最っとも
好ましくは10個のエキソンを含み、これは63bp〜２〜3K
b（推定される最大）の大きさに及ぶ。翻訳されない
３′配列は、エキソン９又はエキソン10のいづれかによ
り完全にされ得ると思われる。２種の別々のエキソンが
示されているけれども、それは９番目のイントロン及び
10番目のエキソンが存在するか、又は他のスプライス部
位がエキソン９内に存在するかどうかは明確でない。さ
らに下記に説明されるであろうように、CSF−１の短い
形は、エキソン６の３′末端側でのスプライス部位の使
用に起因し；その長い形は、そのエキソンの起点として
第３図に示されるスプライス部位に起因する。

第３図に例示されるエキソン及びイントロンのサイズ
は次の通りである：エクソン サイズ（bp） イントロン サイズ（Kb） １ 217 Ｉ 3.1 ２ 123 II 1.3 ３ 63 III 1.3 ４ 171 IV 4.6 ５ 148 Ｖ 1.2 or 2.1 ６ 1025 or 131 VI 0.6 ７ 49 VII 0.3 ８ 60 VIII 0.8 ９ 1400（？） （IX） ? （10） ? スプライス部位に依存して、ゲノムクローンが多くの
RNA転写物に転写されることが、ノザン法により確めら
れる。MIAPaCa細胞を、血清を欠く条件下で３日間、50n
g/mlのPMA及び10μＭのレチノイン酸による３回の連続
した誘導により誘導し、そして３回目の誘発の後、下記
の一般方法に従って、mRNAを単離した。mRNA単離物を、
2.5Mのホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で
電気泳動し、ニトロセルロース上にブロットし、そして
適切なオリゴヌクレオチドによりプローブした。16S,18
S,26S,28S及び22〜25SでのプールのmRNAに対応する多く
のバンドが得られる。

ゲノムのエキソン８のコード配列に対応する20−マー
のML06は、これらのすべての転写物にハイブリダイズす
る：従って、すべてはCSF−１をコードすることが確証
された。もちろん、エキソン８の配列は、長い形及び短
い形の両者に共通する。（ヒトクローンとの相同性を示
さない翻訳されないムリン３′配列の１つとマッチする
21−マーの追加のプローブ、GM15は、MIAPaCa転写物の
いずれともハイブリダイズしない。） 長いエキソ６の５′末端で存在し、そして従って長い
形の配列において897bpの“余分”な挿入体に対応する4
0−マーのGM11は、28Sでの転写物及び22〜25Sでのクラ
スターにハイブリダイズするが、しかし残る３種に対し
てはハイブリダイズしない。

ゲノムのエキソン９の５′末端でマッチする20−マー
のJV30は、22〜25Sのクラスター及び16S及び18SのmRNA
にハイブリダイズするが、しかし26S又は28Sに対しては
ハイブリダイズしない。従って、26S及び28Sは、第３図
における推定上のエキソン10を含むことを示すプロセシ
ングに起因するように思われる。エキソン９中に1500bp
を生ぜしめるヒトCSF−１ゲノムフラグメントから製造
された4.2Kbの追加のプローブは、26S及び28Sの転写物
にのみハイブリダイズする。

CSF−１をコードするゲノムフラグメントを、イント
ロンをプロセッシングすることができる真核細胞中にお
いて発現するために使用することができる。ゲノムフラ
グメントを発現するために、挿入体を、適切なプロモー
ター、たとえばネズミ又はヒトメタロチオネインプロモ
ーターのすぐ下流の適切な宿主ベクター、たとえばウシ
乳頭腫ウィルス又は他の哺乳類ウィルスベクター中に連
結する。

F.3.ヒトCSF−１をコードするcDNAの検索;pcCSF−17（S
CSF） ヒト由来の脾臓癌細胞系MIAPaCa−２をプローブを確
認するために、及びヒトCSF−１コード配列のイントロ
ン欠失形を含むcDNAライブラリィの形成のために、mRRN
Aの源として使用した。MIAPaCa細胞系は、ネズミＬ−92
9細胞のレベルよりも約10倍低いレベルでCSF−１を発生
する。pcCSF−17は、PCT出願WO86/04607に記載のように
して、このライブラリィーから得られた。

簡単に言えば、Okayama及びBergの方法により富化さ
れたMIAPaCa mRNAから得られた300,000個のクローンラ
イブラリィを、ゲノムDNAにYURXSLRLエキソンIIプロー
ブを用いて、高ストリンジェンシー条件下でプローブし
た。そのプローブにハイブリダイズする10個のコロニィ
ーを取り、そしてそれらのコロニィーを精製した。これ
らのクローンを、COS−７細胞中における過渡発現によ
り、CSF−１をコードする配列の存在についてアッセィ
した。SV40プロモーターを含むクローニングベクター
を、COS−７細胞の形質転換に使用した。

プラスミドDNAを、CsClグラジェントを用いて10個の
陽性のクローンから精製し、そしてCOS−７細胞を、リ
ン酸カルシウム同時沈殿技法の変法〔Wang,A.M.,など、
Science（1985）228:149〕を用いてトランスフェクトせ
しめた。３日間のインキュベーションの後、Das,S.K.,
など、Blood（1981）58:630により開示されているよう
にして実質的に行なわれる放射性受容体アッセイ及びPr
ystowsky,M.B.,などAm J Pathol（1984）114;149により
開示されているようにして実質的に行なわれるコロニィ
ー刺激（骨髄増殖）アッセイに、培養上清液をゆだねる
ことによって、CSF−１生成物をアッセイした。取られ
た10個のクローンのうち９個が、COS−７細胞中で過渡C
SF−１産生を示すことに失敗した。発現を示した１つの
クローンを培養し、そのプラスミドを単離し、そして挿
入体を配列決定した。推定上のアミノ酸配列と共にDNA
配列が第１図に示される。完全な長さのcDNAは1.64Kbで
あり、そして第１図に示されるように、224個のアミノ
酸の成熟CSF−１タンパク質（SCSF）をコードする。そ
のクローンをCSF−17（シータスの寄託番号CMCC2347）
と命名し、そしてアクセッション番号53149として、198
5年６月14日にAmerican Type Culture Collectionに寄
託した。CSF−１をコードするDNAを担持するプラスミド
をpcCSF−17と命名した。

LCSFをコードするクローン 上記のようにして調製されたpcCSF−17を、プローブ
として用いて、ヒトcDNAライブラリィから追加のCSF−
１をコードするクローンを得た。全mRNAを、PCT出願WO8
6/04607（前記）に記載しているようにして、MIPaCa細
胞から調製し、そしてHuynh,T.V.,など、DNA Cloning T
echniques:A Practical Approach,IRL Press,Oxford,19
84,D.Glover版により記載されているようにして、前記m
RNAを用いて、EcoR Iリンカーに逆転写物を連結し、そ
してλgt10のEcoR I部位中にこのようにして供給された
cDNAのEcoR I消化物を挿入することによってλgt10ファ
ージベクター中のcDNAライブラリィを得た。

100万個以上のファージが、次のように簡単に要約さ
れている標準方法を用いて、CSF−17に由来する高くラ
ベルされた一本鎖のプローブによりスクリーニングされ
た。

CSF−１のための全コード配列を含む、pcCSF−17のDN
AのEcoR Iフラグメント（pcCSF−17におけるコード配列
の停止コドンのすぐ後に、EcoR I部位が存在する）を、
M13中に挿入し、そしてラベルされた第２鎖を次のよう
にして合成した：一本鎖のEcoR I消化されたpcCSF−17
を含むM13約1pモルを、20mMのトリス（pH7.9）、20mMの
MgCl₂,100mMのNaCl及び20mMのβ−メルカプトエタノー
ル中において、67℃で５分間、配列決定プライマー10p
モルによりアニーニし、そして次に42℃で45分間、同じ
ようにアニールした。そのアニールされた調製物は、そ
れぞれ100μモルdATP,dCTP及びdTTP、及びp³²によりラ
ベルされた（α）dGTP 2.5μモル並びに５単位のクレノ
ウフラグメントを供給された。その反応物を37℃で20分
間インキュベートし、そしてDNAをＰ−6dG（Bio−Rad）
回転カラム上で回収し、そして10分間煮沸し、それらの
鎖を分離した。

このようにして得られたプローブは、42℃で18時間、
高ストリンジェンシー条件（50％ホルムアミド、５×SS
C,5×Denhardt′ｓ）下でのハイブリダイゼーションに
よりプラーク（ニトロセルロースに移された）をスクリ
ーンするために使用された。

約150個のファージプラークが陽性であった。これら
の150個のプローブ陽性プラークのうち５個を、14−マ
ーのオリゴヌクレオチドJD11を用いて、さらにプローブ
陽性であり、ここで前記JD11は、５×SSC,5×Denhard
t′ｓ中において一晩45℃でハイブリダイズされる場
合、エキソン２及び３スプライスの連結の領域の塩基に
相補的である。

次に５個のJD11陽性クローンを、第２図におけるヌク
レオチド506〜545に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドGM11へのハイブリダイズにゆだねた。上記のよう
に、この配列は、ネズミCSF−１タンパク質の“長い
形”の“余分”な29８個のアミノ酸セグメントをコード
する、下記に記載のネズミcDNAの“余分”な部分に対応
するヒトゲノム配列のその部分に正確にマッチする。ハ
イブリダイゼーションは、20％ホルムアミド、５×SSC,
5×Denhardt′ｓ中において18時間45℃で行なわれた。
適切なクローン４及び25を含む３個のクローンが陽性で
あった。

クローン４及び25におけるcDNA挿入部の適切なコード
領域のための完全なDNA配列及びその推定上のアミノ酸
配列が第２図に示される。その配列は、示されている完
全な配列を推定するためのガイドとして、下記に記載さ
れているネズミ配列の298個のアミノ酸の“余分”な挿
入体を用いて、上記のゲノムクローン、phCSF−1aの既
知配列を組込むことによって誘導された。描かれた配列
は、残存するCSF−17配列と読み枠を合してアミノ酸位
置150でのGly残基のためのコドンの初めのヌクレオチド
間のpcCSF−17の配列への、エキソン６の５′側で遺伝
子に含まれる298個の“余分”なアミノ酸をコードする
のに十分な“余分”なセグメントのスプライシングを示
す。その挿入体は150位でのコドンをアスパラギン酸の
ためのコドンに変え、その挿入体の末端での続くコドン
はGlyに再構成され、そしてＣ−末端のVal残基へHis−G
lu−Arg等により連続する残基の残りの配列は、pcCSF−
17におけると同じままである。他方、LCSFは、残基150
までSCSFの配列と同一である（但し、それは位置59でTy
rではなくむしろAspを有する）。

２種のクローン４及び25が、配列決定するためにEcoR
I制限部位を用いてM13mp18又はM13mp19中にクローン化
され、第２図に示される結果を確認した。これらの２種
のクローンは、制限酵素分析から同一であるように思え
る。クローン４の完全な配列を決定し、そして第２図に
示される：クローン25の部分的配列決定は矛盾しない結
果を与える。次に、それらを、変性されたOkayama−Ber
gベクターpcDB中にサブクローニングし、このベクター
は、公表されたOkayama−BergベクターpcDV1及びpL1（O
kayama,H.,など、Mol Cell Biol（1983）３:280〜289）
から次のようにして調製された： pCDV1をHind III及びKpn Iにより消化し、そしてAm
p^R、複製のpBR322起点及びポリアデニル化部位を付与す
る大フラグメントを単離した。pL1をHind III及びPst I
により消化し、そしてSV40プロモーター及び複製の起点
を付与する小フラグメントを単離した。これらのフラグ
メントを、合成のKpn I/Pst Iにより消化されたオリゴ
ヌクレオチドフラグメント、CTGCAGGAGCTCAGATCTTCTAGA
GAATTCTCGAGCGGCCGCATCGATGGTACCGACGTCCTCGAGTCTAGAAG
ATCTCTTAAGAGCTCGCCGGCGTAGCTACCATGGと、三元連結法で
再連結し、参照に示されたpcD−Ｘ〔ここで“X"はポリ
リンカーより交換される〕に相当するプラスミド、pcDB
を得る。従って、pcDBは、SV40初期プロモーター及びす
ぐ下流のリンカー、続いてポリアデニル化部位を含むポ
リリンカー領域中に連係された配列は、前記SV40初期プ
ロモーターの制御下で発現されるべきである。

クローン４及び25はCSF−17と比べて、いくつかの
５′末端配列がないように思われるので、発現を試験す
る前、pcCSF−17からの上流の部分をクローン４及び25
の部分と置換した。

この置換の方法は次の通りであった:pcCSF−asp59−B
amBc1（下記を参照のこと）をSma Iで消化し〔これは非
翻訳配列（第１図を参照のこと）の５′最末端で切断す
る）、そして線状化されたプラスミドを、EcoR Iリンカ
ーに連結し、そして再定着した。次にその再連結された
プラスミドをEcoR Iにより消化し、ここでそれは終止コ
ドンのすぐ下流のEcoR I部位に５′最末端でのSma I部
位からの全コード配列を移す。これを、EcoR I部位での
pcDBのポリリンカー中に連結した。Bst XI部位〔該部位
は、CSF−17成熟タンパク質配列（第１図を参照のこ
と）のアミノ酸８のためのコドン付近に位置する〕を、
Bst X I及びKpn Iによる消化により除去した。（Kpn I
は終止コドンの後のEcoR I部位のわずかに下流を切断す
る。）この欠失された下流の配列は、pM13−４及びpM13
−25からの類似するBst I/Kpn Iフラグメントにより置
換された。その得られたクローン、pcDBhuCSF−４及びp
cDBhuCSF−25は、それぞれクローン４及び25からのおお
よそのアミノ酸８のためのコドンの下流のコード配列及
びpCSF−17からの上流の配列を含んだ。その連結された
配列は、SV40初期プロモーターと読み枠を整合し、そし
てその制御下にある。

ムテインをコードする配列／真核生物の発現ベクター SCSFタンパク質のムテインをコードする対応するプラ
スミドを供給するために、pcCSF−17挿入体を変性せし
めた。部位特異的突然変異誘発のために、pcCSF−17及
びM13mp18を、同じ制限酵素により消化し、CSF−１コー
ド列の適切な領域を切り出し、そしてその切り出された
配列をM13ベクター中に連結した。第二鎖の合成及び所
望する突然変異化されたDNAの回収は次のオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用した： pro₅₂SCSFのためには、５′−TACCTTAAACCGGCATTTCTC−
３′、（これはコドン52〜53で新しいHpa II部位を創造
する）； gln₅₂SCSFのためには、５′−TACCTTAAACAGGCCTTTCTC−
３′、（これはコドン52〜53で新しいStu I部位を創造
する）； asp₅₉SCSFのためには、５′−GGTACAAGATATCATGGAG−
３′、（これはコドン59−60で新しいEcoR V部位を創造
する）。

クレノウを用いての第二鎖の延長の後、そのファージ
をE.コリDG98中に形質転換し、そしてその得られたプラ
ークをキナーゼ処理されたラベル化プローブによりスク
リーンした。プラークの精製の後、pcCSF−１中におい
て突然変異化されていない挿入体を置換するために、所
望する突然変異化された挿入体それに戻し、それぞれpC
SF−pro52,pCSF−gln52及びpCSF−asp59を得た。

Ｃ−末端欠失のSCSF/CV158をコードする３種の欠失突
然変異体を含むプラスミドもまた調製した:pCSF−Bam,p
CSF−BamBcl、及びpCSF−BamTGA。pCSF−Bamのために
は、pcCSF−17をBamH Iより消化し、そしてコード領域
の上流のBamH I/BamH Iフラグメントを単離し、そして
ベクターフラグメントに連結した。その連結混合物をE.
コリMM294中で形質転換し、そして正しい配向を有する
プラスミドを単離した。その得られたpCSF−Bamは、Ｃ
−末端でベクター由来の６個の残基:arg−his−asp−ly
s−ile−hisに有されるCSF−１タンパク質の158個のア
ミノ酸をコードする。

全CSF−１をコードする配列を含むpCSF−BamBcl（但
し、位置159でのセリンが終止コドンに変異されてい
る）のために、そのコード配列をpcCSF−17から切り出
し、そしてプライマー:5′−GAGGGATCCTGATCACCGCAGCTC
C−３′を用いての部位特異的突然変異誘発のためにM13
中に連結した。これはコドン159〜160で新しいBcl I部
位をもたらす。変異したDNAをBst XI/EcoR Iにより切り
出し、そしてBst XI/EcoR Iにより消化されたpcCSF−17
中に連結し、その連結混合物をE.コリDG105、すなわちd
am^-宿主中で形質転換し、そしてプラスミドDNAを単離し
た。

pCFS−BamTGA（ここで159での終止コドンの下流のコ
ドンが欠失している）のために、pCSF−BamBclをXho I
及びBcl Iにより消化、そしてその挿入体をXho I/BamH
Iにより消化されたpcCSF−17中に連結した。

さらに、位置151でヒスチジンの代わりにTGA終止コド
ンを含むpCSF−Gly150を、上記のようにして適切なプラ
イマーを用いて部位特異的突然変異誘発によりpcCSF−1
7挿入体から調製した。適切なプライマーは、５′−AGC
CAAGGCTGATCAAGGCAGTCC−３′である。従って、そのコ
ード配列の下流の部分を、Bst XI/EcoR IによりpcCSF−
17から切り出し、突然変異誘発のためにM13ベクター中
に挿入し、そしてプラーク精製の後、Bst XI/EcoR I挿
入体として戻した。

“二重”ムテインを類似する方法で調製した。従っ
て、たとえばasp₅₉SCSF/CV150をコードするpCSF−asp59
−gly150のためには、pcCSF−asp59をBst XI/EcoR Iに
より消化し、pCSF−gly150を生成するために上記と同じ
プライマーによる部位特異的突然変異のためにM13中に
そのＣ−末端フラグメントを配置した。次に変異したフ
ラグメントをそのベクター中に戻し、pCSF−１−asp59
−gly150を得た。

同様に、pCSF−BamBclの調製のためにその方法をくり
返した（但し、pCSF−asp59が出発プラスミドとしてpcC
SFの代わりに使用された）。

pCSF−gln52及びpCSF−asp59のために上記の技法に類
似する技法を用いて、その対応するムテインの長い形、
pLCSF−gln52及びpLCSF−tyr59を含むその対応するプラ
スミドを調製した。その方法は上記の通りである。但し
pcCSF−17がその方法に使用される場合、pcDBhuCSF−４
又はその同等のプラスミドが置換され、そしてtyr₅₉ム
テインのためにプライマーの適切な変化が行なわれる。

部位特異的突然変異誘発がまた、両タンパク質のグリ
コシル化部位で所望する突然変異を得るためにも及び位
置90でのシステインの置換のためにも使用され；それは
また、LCSFをコードするDNAの種々のＣ−末端欠失を得
るためにも使用され得る。

F.4.CSF−１の一過性の発現 pcCSF−17の発現 CSF−17に由来するプラスミドDNA（pcCSF−17）のCOS
−７細胞中での発現を、骨髄増殖アッセイ、コロニー刺
激アッセイおよびラジオレセプターアッセイを使用して
確認および定量した。CSF−１の骨髄増殖アッセイの特
異性は、活性を低下させるCSF−１抗血清の能力のみに
依存し；コロニー刺激アッセイでは、得られるコロニー
の性質によることを思い起こせるだろう。両アッセイと
も、ml当たり数1,000単位のオーダーでのCSF−１産生を
示した。

骨髄増殖 タンパクの生理活性を測定する骨髄刺激アッセイで
は、Balb/Cマウス由来の骨髄細胞を72時間上澄の一連の
希釈物で処理し、そして細胞の増殖を本質的にはMoore,
R.N.等によりJ.Immunol.（1983）131:2374、またはPrys
towsky,M.B.等によりAm.J.Pathol.（1984）114:149に記
載されているような、標識したチミジンの取り込みによ
り測定した。誘導されたMIAPaCa細胞からの培地を対照
として使用した。CSF−１の特異性は、チミジンの取り
込みを抑制するヒト尿CSF−１に対して生したラビット
抗血清の能力により確認した。1:16希釈における、pcCS
F−17でトランスフェクトされたCOS−17細胞の上澄（CS
F−17上澄）の結果を第１表に示す。

MIAPaCaの上澄（前記で使用した1:16希釈において）
は、希釈していない上澄の2000U/mlに対応する125U/ml
のCSF活性を含有していて、ここで１単位のコロニー刺
激活性は、Stanley,E.R.等（J.Lab.Clin.Med.（1972）7
9:657,）のアッセイにおける10⁵個の骨髄細胞/mlから１
コロニーを産生するために要するCSFの量として示し
た。

これらのデータは、チミジンの取り込みが抗−CSF−
１血清により阻害されることから、骨髄刺激活性は、CS
F−１に関連することを示す。1:8〜1:64の４種の希釈範
囲において得られるこの骨髄増殖アッセイにおける結果
の回帰は、CSF−17の上澄中CSF−１の2358U/mlの推定活
性を与え、そしてそれは抗血清の存在下で424U/mlまで
減少するが、しかし免疫されていない血清の存在下では
3693U/mlまで外見上の上昇を示した。これは、以下のラ
ジオレセプターアッセイで示されるレベルと同等であっ
た。

コロニー刺激 コロニー刺激についてのCSF−17の上澄の直接アッセ
イ（Stanley,E.R.等、前記のJ.Lab.Clin.Med.）は、428
7U/mlを示し、そしてこのものは免疫されていない血清
の存在では、実質的に影響されないが、しかしラビット
抗ヒトCSF−１の存在下で0U/mlまで減少した。これはMI
APaCaの上澄における2562U/mlと対照的である。pcCSF−
17で形質転換されたCOS−７の上澄が誘導するコロニー
の85％は、単核の形態を有し、MIAPaCaの上澄が誘導す
るコロニーは、94％のマクロファージー６％の顆粒球の
比率を示す。

ラジアレセプターアッセイ ラジオレセプターアッセイは、J774.2マウスマクロフ
ァージ細胞上の特異的レセプターに対する¹²⁵I標識CSF
−１と試験化合物との間の競合を測定する。前記でコロ
ニー刺激活性についてアッセイされているMIAPaCaの上
澄を標準（2000U/ml）として使用した。pcCSF−17で形
質転換されたCOS−７の上澄のCSF−１濃度は、1:10希釈
により2470U/mlであり、そして1:5希釈により3239U/ml
であることが見い出された。

従って、pcCSF−17で形質転換されたCOS−７細胞の培
養物中のCSF−１濃度についての匹敵する値が、すべて
のアッセイにおいて認められた。

SCSFの発現 pcCSF−17について前述したのと同様に、ミューテイ
ンをコードするプラスミドをCOS−A2細胞中にトランス
フェクションし、そしてCSF−１活性の一過性の発現
を、骨髄増殖アッセイおよび抗−CSF抗体を用いるラジ
オイムノアッセイによりアッセイした。pCSF−pro52を
発現生成物は、不活性であり、予期したようにプロリン
による置換は保存的でないことを示した。他のすべての
ミューテインは、両アッセイとも以下の結果により示さ
れるように活性を示した。

pcDBhuCSF−４およびpcDBhuCSF−25の発現 ヒトCSF−１をコードするDNAの長い形を含有する岡山
（Okayama）／バーグ（Berg）型ベクター（pcDBhuCSF−
４およびpcDBhuCSF−25）を、COS−A2細胞に、前記pCSF
−17によるCOS−７細胞のトランスフェクションについ
て記載したのと全く同様の方法でトランスフェクトし
た。トランスフェクトした細胞の上澄を、Das等により
記載される（前述）のように調製した、CSF−１に対し
て生じた抗血清を用いるラジオイムノアッセイを使用し
てCSF−１についてアッセイし、そしてさらに前記の骨
髄増殖アッセイをも行った。ml当たりのCSF−１の単位
についての結果を第４表に示す。

示されるように、それぞれのベクターでトランスフェ
クトされた細胞の上澄は、CSF−１活性を有するタンパ
クを含んでいる。同様の方法で、ミューテイン形のこれ
らの特異的LCSFの長い形のタンパクを得た。

F.5 安定な形質転換細胞におけるCSF−１の真核性発現 COS−７またはCOS−A2系は、Okayama−Berg型のベク
ター配列の複製および発現を可能にすることにより組換
えCSF−１を提供する。これは一過性の発現系である。
また、ヒトまたはネズミCSF−１配列は、原核性または
真核性系においても安定に発現することができる。一般
に、原核性宿主は製造の簡便さを提供し、他方、真核生
物は効果的な分泌のための本来のシグナル配列の使用を
可能にし、そしてかなり望ましい翻訳後プロセッシング
を行う。これは、本来のタンパクが二量体であるので、
CSF−１においては重要であろう。単量体としての細菌
産生CSF−１は、その後必要があれば抽出後に二量化条
件下で処理することができる。

Okayama−BergプラスミドpcCSF−17、またはミューテ
インをコードするDNAを含有する類似のベクター、例え
ばpCSF−asp₅₉−gly₁₅₀およびpCSF−asp₅₉−BamBcl、ま
たは類似ベクターpcDBhuCSF−4,pcDBhuCSF−25,pcDBmuC
SF−ＬおよびpcDBmuCSF、またはSV40のプロモーターの
制御の下にCSF−１をコードするcDNAを含有するLCSFの
ミューテインをコードする他のベクターを使用して、CO
S−７株がそれに由来する親細胞株であるサルCV−１細
胞において安定な発現をもたらすことができる。宿主サ
ルCV−１細胞は、コンフルエンスに増殖せしめ、そして
さらに発現ベクター10μｇおよび細胞500,000当たり、
種々の量（1,2,5、および10μｇ）のpRSV−NEO2（Gorma
n,C.等、Science（1983）221:551−553）を使用して同
時形質転換を行った。形質転換体を、pRSV−NEO2プラス
ミドがそれに対して耐性を付与するG418抗生物質100μg
/mlを含有する10％ FBS培地を用いてDMEM中で増殖せし
めた。CV−１細胞株は、10⁶細胞当りμg DNA当たり約10
^−5.12コロニーのG418形質転換頻度を示した。

CV−１細胞を前記のように同時形質転換し、そしてG4
18含有培地で選択した。耐性クローンを、G418−除去培
地で増殖させて、G418−耐性表現型の安定性について試
験し、次いでG418−含有培地にもどした。抗生物質含有
培地にもどした場合に、生き残るこれらの培養物の能力
は、pRSV−NEO2のDNAが細胞のゲノム中に永久に組み込
まれていることを示唆する。標識プラスミドで安定に形
質転換されている細胞は、約50％の確率で、同時トラン
スフェクションプラスミドDNAを組み込んでいるので、
さらにこれらの細胞の約半分が、それらの染色体DNA中
にCSF−１タンパクのための発現系含むであろう。

前記のごとく安定に形質転換されることが示されてい
るCV−１細胞のG418耐性プールのいくつかのクローンを
取り出し、そして二系列のフラスコでコンフルエンス近
くまで増殖させた。それぞれの系列の１つのフラスコを
感染多重度５においてSV40ウイルスで感染し、そして感
染後６日で採取した培地をラジオイムノアッセイを使用
してCSF−１についてアッセイした。該アッセイは、精
製したヒト尿CSF−１に対して産生された“ラビット（R
abbit）52′ポリクローナル抗血清に対する¹²⁵I標識MIA
PaCa CSF−１の競合を基礎とする。

pcCSF−17のトランスフェクションに由来する選択さ
れるCV−１クローンの１つは、このアッセイにより2335
U/mlのCSF−１産生を示すが、一方、SV40で感染してい
ない細胞は、20U/ml以下を示した。対照として用いる10
μｇのpcCSF−17で形質転換したCOS−７細胞は、SV40感
染を伴うことなく2400U/mlのCFS−１産生を示した。

CSF−１産生性CV−１細胞株はゲノム中に取り込まれ
たCSF−１発現系を含有し、それ故にSV40の感染の後CSF
−１の製造に使用することができる。感染は、ゲノムに
由来する発現系を“レスキュー（rescure）”し、そし
てレスキューされたDNAの複製のために必要なSV40 T−
抗原を供給することが推測される。SV40の感染なくして
は、CSF−１をコードしている取り込まれた遺伝子は、
効果的に発現されない。

CV−１（CSF−17）細胞系によるCSF−１をコードする
配列の発現の最適なものは、少なくとも１の感染多重
度、および10％のFBS培地を使用するSV40感染後の６日
目にラジオイムノアッセイにより測定した場合に、6500
〜8000U/mlを示した。10の感染多重度における発現レベ
ルの実験は、ほぼ同等の産生を示したが、しかし感染後
２日目で培地からのFBSの除去により産生が減少した。

別法として、適当な制御系および他の真核性宿主で発
現を可能にする宿主ベクターを使用して、CSF−１をコ
ードする挿入部を取り込むことができる。例えばCHO細
胞及び適当なベクターを使用することができる。さら
に、Miller,D.W.等のGenetic Engineering（1986）,277
〜297頁に記載されているように、これらの配列を含有
するバキュロウイルス・ベクターを使用して、タンパク
の産生のために昆虫細胞を感染することができる。

F.6 原核性発現 原核性発現では、cDNAクローンまたはゲノム配列を、
例えば部位特異的変異によるイントロンの切除で改変
し、Ｎ−末端グルタミン酸のすぐ上流にATG開始コドン
を配置し、そして下記の標準的な宿主発現ベクター中に
挿入するのに適する部位を与えるために、ATGのすぐ上
流にHind III部位を配置した。これは、本来のリーダー
おおびＮ−末端をコードする配列に相補適なヌクレオチ
ド配列により挟まれた所望のAAGCTTATGに相補適な新規
配列を含有する合成オリゴマーを用い、挿入部位特異的
変異を使用して直接的に行うことができる。

全体をコードする配列を含有するDNA断片を、EcoR I
による消化でpcCSF−17、またはpcDBhuCSF−４から切り
取り、アガロース電気泳動により単離し、そして電気溶
出（electroelution）により回収した。変異を行うため
には、宿主バクテリオファージM13mp18 DNAをもEcoR I
で処理し、標準的な条件下で精製断片と連結し、そして
連結コンピテントE.コリー（Ｅ．coli）K12株DG98中に
導入した。この細胞を５×10^-4Mのイソプロピルチオガ
ラクトシド（IPTG）〔Sigma Chem.（St.Louis,MO）から
入手〕およびＸ−ゲル40μg/mlを含有する培地に接種し
た。補完しない（noncomplementing）白色のプラークを
新鮮な培地中に採集した。少量の培養細胞を、予期した
サイズの組換え一重鎖ファージDNAについて選抜し、そ
して所望の組換えファージの構造を制限分析を使用して
確認した。

CSF−１配列のＮ−末端及びリーダーコード部分に対
して相補的であるがしかし所望のAAGCTTATGに対する相
補対を含有する34−merを合成し、そして精製した。

あるいは、負鎖（negative sense strand）M13を使用
する場合には、正鎖（positive sense）34−merを用い
た。この34−mer長製品の一部を後にプローブとして用
いるために、先に示したようなMaxamおよびGilbert（Ma
xam,A.等、Methods in Enzymology（1980）68:521,Acad
mic Press）の改良方法により放射線標識した。

変異を遂行するために、前記の組換えバクテリオファ
ージをE.コリーK12株DB98中で調製し、そして一重鎖フ
ァージDNAを精製した。1pmolの１重鎖ファージDNAおよ
び前記の合成ヌクレオチドプライマー（キナーゼ処理し
ていない）10pmolを、67℃で１分間加熱することにより
アニーリングし、次いで20mMのTris−Cl（pH8）15μ,
20mMのMgCl₂,100mMのNaClおよび20mMの２−メルカプト
エタノール中に、37℃において30分間放置した。アニー
リングしたDNAをDNAポリメラーゼＩ（Klenow）およびdN
TP_S 500μmolと共に０℃にて30分間そしてさらに37℃に
してインキュベートした。一定量（0.05または0.25pmo
l）を、５分、20分、および45分後に取り出し、E.コリ
ーK12株DG98に導入し、そしてプレートした。増殖させ
た後、プレートを４℃に冷却し、そしてBiodyneまたはS
＆ S Filtersから得られるPal I膜でプラークを取り出
した（第１の濾過は１〜２分、第２の濾過に10分以上か
けた）。フィルターを2.5M NaCl,0.5M NaOHで変性した
（５分）。変性培地を、3M酢酸ナトリウムでpH5.5まで
中和するか、または1M NaClを含有する1M Tris−Cl（pH
7.5）で処理し、このフィルターを減圧下で１時間、80
℃に加熱し、次いで高度なストリンジェンシイ（high s
tringency）下で前ハイブリダイゼーションを行った。
次に、高度なストリンジェンシイ下で、フィルターを前
記で調製されるキナーゼ処理合成34−merを用いてプロ
ーブし、洗浄し、そして−70℃にて一夜オートラジオグ
ラフ処理した。

それぞれ所望の変異ファージのRF形をEcoR I処理し、
次にクレノウ（Klenow）で平滑末端化し、そしてさらに
Hind IIIで消化してHind III/平滑断片として遺伝子を
切り取った。

P_Lプロモーターおよびバシリス・スリンジェンシス
（Bacillis thuringiensis）陽性のレトロレギュラト
リー配列（1985年３月29日）に公表された、EPO出願公
開第717,331号に記載されているような）を含有するプ
ラスミドpFC54.t（ATCC39789）を宿主ベクターとして使
用した。pFC54.tをHind III/BamH I（平滑）で消化し、
そして所望のコードを有する配列を、pcCSF−17またはp
cDBhuCSF−４に由来する変異したM13からのHind III/Ec
oR I（平滑）切断した断片を使用して、前記ベクターに
連結した。E.コリーMC1000（ラムダ溶原株）への形質転
換及び誘導の後、それぞれ推定上のSCSFおよびLCSFのCS
F−１産生を得、前記したように確認した。

従って、例えばpcCSF−17から変異したM13基材に由来
するHind III/EcoR I平滑断片を、前述のようにpFC54.t
に連結してpP_LCSF−17を得た。次に、pP_LCSF−17をBamH
Iで消化し、そして再連結してpP_LCSF−17/CV158を得
た。このものは、ATG開始コドンの次に変異SCSFをコー
ドする配列を含有し、SCSF配列の最初の158個のアミノ
酸を有するタンパクをコードするように端が切り取られ
ており、そしてpFC54.tのレトロレギュラトリー配列に
由来するプロリンおよび終止コドンが読み枠中（in−re
ading−frame）で後に続く。pP_LCSF−17/CV158は、さら
に部位特異的変異により変性した。Hind III/BamH Iコ
ード配列を切り取り、そしてM13に連結した。適当なプ
ライマーを使用してアミノ酸158をコードするコドンの
直後に終止コドンを配置し、そしてそれにTGAが続くよ
うにした。これがさらに操作するためのBamH I/Bcl I部
位を形成する。次に変異断片をM13から切り取り、そし
てHind III/BamH Iで消化したpP_LCSF−17/CV158に再連
結してpP_LCSF−17/CV158TGAを得た。

他の構成物は、SCSF中の52位のlysをglnもしくはpro
で、そして／または59位のtyrをaspで置換した変性体を
包含する置換アミノ酸のためのコドンを有している。こ
れらの構成物は、もとのpP_LCSF−17に由来するHind III
/EcoR I（平滑）断片を含有するM13挿入部の部位特異性
変異により同様に調製した。その後、これらの変異ファ
ージに由来するHind III/EcoR I断片をもとのHind III/
EcoR Iの代わりに使用して、対応するベクターの構成を
行った。一般に、選ばれた位置における所望の変異を、
この標準的な技術の変法により調製することができる。

Ｎ−末端の最初の６個のコドンの各々の第３番目のヌ
クレオチドを変えることにより、前述の構成物のいずれ
かからのCSF−１の産生レベルを改良することができ
る。いずれかのミューテインのCSF−１コード断片を含
有するpFC54.tを、Hind III/BstX Iで消化し、そして切
り取った断片（このものは、ATGおよびこれに続くコー
ドする配列の短い部分を含有する）を、最初の６個のコ
ドンが次の配列:GAAGAAGTTTCTGAATATを有する合成Hind
III/BstX Iセグメントによって置き換えた。得られた類
似の発現ベクターは、コードされるアミノ酸配列におい
て何等の変化も示さないが、しかしながら、この変性ベ
クターを使用した場合には、発現レベルが上昇した。対
応するベクターを、O/E（重複−発現）と称する。かく
して、例えば、O/E pP_LCSF−17,O/E pP_LCSF−17/CV15
8、およびO/E pP_LCSF−17/CV158TGAが形成される。

対応するベクター、O/E pP_LCSF−17asp₅₉/CV158TGA
を、前述と同様に合成した。但し、本来のEcor I挿入部
を含有するM13を二重変異して、成熟タンパクの１位の
アミノ酸の直前に、Hind III部位およびATG開始コドン
を配置し、そして残基59位のチロシンコドンをアスパラ
ギン酸コドンにより置換した。さらに、対応するベクタ
ーO/E pP_LCSF−17asp₅₉/CV158、およびO/E pP_LCSF−17a
sp₅₉/CV158TGAが、対応して形成される。前述したすべ
ての場合において、中間体ベクターの各々は、Hind III
およびBstX Iにより消化することができ、そして好まし
いコドンを含有する合成DNA断片で、最初の６個のアミ
ノ酸をコードする本来の配列を置換することができる。

さらに、前述のベクターのすべては、切除したHind I
II/BstX I DNAに対する適当な合成断片の置換によりＮ
−末端が欠失したタンパクをコードするために変性され
る。このようにして、glu−gluおよびglu−glu−valが
欠失しているCSF/NV2およびCSF/NV3をコードする対応す
るベクターを構成した。

また、SCSFタンパクの150位におけるグルシン残基の
直後に終止コドンを含有する類似のベクターを構成し
た。これらのベクターは、pP_LCSF−17もしくはpP_LCSF−
17asp₅₉またはこれらの対応するミューテインからのHin
d III/EcoR I断片のHind III/Sma I消化M13への変異に
より得られた。従って、得られたベクター、例えばpP_LC
SF−17/CV150およびpP_LCSF−17asp₅₉/CV150は、成熟SCS
Fタンパクの最初の150個のアミノ酸残基をコードする。

前述のベクターは、E.コリーλ溶原性宿主、例えばDG
116に形質転換し、そして高温（約42℃）で誘導した場
合には、CSF−およびそれらのミューテインを単量体ま
たは凝集した脱グリコシル化状で産生する。このタンパ
クの産生は、標準的なラジオイムノアッセイまたは他の
CSF−１特異的アッセイを用いて検出することができ
る。タンパクの活性は、再生（refolding）処理の使用
によりかなり改善することができる。

また、構成物をP_Lプロモーターの代わりに、ホスファ
ターゼＡのプロモーターおよび分泌リーダー配列を用い
て調製した。pFC54.tのものに対応する３′レトロレギ
ュラトリー配列を含む制御配列は、これらの制御配列を
含む宿主ベクターであるpSYC1089をNar I/BamH Iで消化
したものに所望のコードを有する配列を挿入することに
より提供される。

このベクターを利用する目的で、適切なCSFコード配
列をM13中に再連結し、ATG直前のHind III部位をCla I
部位に変える。次に、変異した配列をCla I/Bcl I断片
として切り取り、そして前述のように消化されたpSYC10
89に連結する。この構成物の産生物は、P_Lベクター系列
におけるP_Lプロモーターの制御下で産生される短い形成
物に対応し、そしてE.コリー中で発現させた場合には、
ペリプラズム空間に分泌され、そしてP_L制御下で発現さ
れる遺伝子の産生物に比べて比較的可溶性である。ここ
に記載されるphoA系を使用して構成できるベクターは、
pPhoA/LCSF/CV₁₅₈およびpPhoA/NV_3CV₁₅₀を包含する。こ
れらのベクターで、発現のために非λ溶原宿主、例えば
E.コリー（Ｅ．coil）MM294を形質転換する。

また、長い形のクローンに由来するDNAを使用してベ
クターが構成された。前述したO/E pP_LCSF−17asp₅₉/CV
150を、長い形および長い形についてコードする配列の
種々の−末端トランケーション（truncation）の構成物
のための宿主ベクターとして使用した。BstX I部位から
上流の配列は、通常短い形と長い形の双立に共通である
ので、短い形及びそのミューテインを含有するベクター
を、TGA終止コドンまでの下流部分の配列を切除するこ
のベクターのBstX I−BamH− I断片をクローン４からの
長い形のコード配列又はそのＣ−末端切除形を含有する
M13のBstX I−BamH I断片と交換することにより、長い
形のベクターに転換することができる。

従って、クローン４の挿入部を含有するM13クローン
が、適当なオリゴマーで変異され、150,190,191,221,22
3,236,238,249,258および411の後の位置における残基の
後に、終止コドンが挿入された。例えば、191位のスレ
オニン残基の後に終止コドンを配置し、そしてそれらの
直後にユニークなBcl I部位を与えるために、クローン
４の挿入部を含有する逆鎖M13が、オリゴヌクレオチドG
GCTTGACCTGATCAGACTCTGAGGでプライムされた。ファージ
の変異したRF形をBstX IおよびBamH Iで消化し、そして
BstX I/BamH Iで消化したO/E pP_LCSF−17asp₅₉/CV150に
連結して、O/E pP_LCSFasp₅₉/CV150を得た。

Ｎ−末端欠失を有するCSF−１をコードするベクター
から、及びphoAで制御さるベクターからの対応する短形
の断片を置換するために変異した長形の断片を使用する
ことができる。例えば、pPHoA−LCSF/NV3CV221及びpPho
A−LCSF/CV221を作製しそしてE.コリMM294に形質転換し
た。言うまでもなく、長形の断片の１個より多くの変異
を行うことができ、さらにアミノ酸置換、例えばgly₅₂
又はlyr₅₉を行うことができる。

SCSF,LCSF、およびこれらのミューテイン（両蛋白質
に共通な位置122−124及び140−142のグリコシル化部位
がグリコシル化にかからないアミノ酸により置換されて
いる）をコードするミューテインのために追加の構成物
が作られた。これらの構成物の細菌発現から生産される
CSF蛋白質は生物学的アッセイにおいて活性であり、こ
のことはグリコシル化が活性のために必要でないことを
実証する。しかしながら、位置１〜150間のシステイン
残基のいずれかのセリン又はアラニンによる置換は不活
性蛋白質をもたらす。但し位置90に置換を有するミュー
テインは活性を有する。明らかに、これらのシステイン
の７個すべてが適切な再生（refolding）のために必要
である。

上記のベクターのいずれかからこの発明のNV2及びNV3
ミューテインの構成は非常に簡単であり、そして単にHi
nd III/BstX I断片を除去しそしてそれを、場合に応じ
て最初の２個又は３個のアミノ酸のコドンを含まない合
成断片で置き代えることを含む。従って、上記のベクタ
ーの各々を変形して、この簡単な置換方によりこの発明
のミューテインをコードするベクターを得ることができ
る。

次のプラスミドにより形質転換されたE.コリPG116λ
溶原株が調製された組換生物に含まれる。この構成物は
下記の短い形に由来するCSF−１ミューテイン形の発現
のための構成物である。

長い形の変形体をコードする下記の類似の組換生物体
が構成されている。

O/E pP_LLCSF/CV150 LCSF/UV1/CV150 O/E pP_LLCSFgln₅₂/CV150 gln₅₂LCSF/CV150 O/E pP_LLCSFtyr₅₉/CV190 try₅₉LCSF/CV190 O/E pP_LLCSF/CV191 LCSF/CV191 O/E pP_LLCSF/NV2CV191 LCSF/NV2CV190 O/E pP_LLCSF/CV221 LCSF/CV221 O/E pP_LLCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 O/E pP_LLCSF/CV223 LCSF/CV223 O/E pP_LLCSF/CV236 LCSF/CV236 O/E pP_LLCSF/CV238 LCSF/CV238 O/E pP_LLCSF/CV249 LCSF/CV249 O/E pP_LLCSF/CV250 LCSF/CV250 O/E pP_LLCSF/CV411 LCSF/CV411 phoA−LCSF/CV221 LCSF/CV221 phoA−LCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 O/E phoA−LCSF/CV221 LCSF/CV221 O/E phoA−LCSF/NV3CV221 LCSF/NV3CV221 構成物の発現のため、適当に形質転換されたE.コリ
（λ溶原株、例えばP_L構成物のためのDG116、非溶原
株、例えばPhoAのためのMM294）を所望の細胞密度に増
殖せしめ、そして次にコードされた蛋白質の生産を誘導
する。P_Lプロモーターの制御のもとで発現される場合、
37℃又は42℃への温度の上昇が発現を誘導する。培地へ
の約0.2〜２％のカザミノ酸の添加もまた発現を増加せ
しめるために助けとなる。前記の構成物は不溶性細胞内
蛋白質としてCSF−１の生成をもたらし、この蛋白質は
溶解した細胞から回収し、精製し、そして再生（refol
d）することができる。phoAに制御される遺伝子により
形質転換されたE.コリのペリプラズム空間に分泌された
CSF−１を類似の方法を用いて精製しそして再生するこ
とができる。

一般に、再生（refolding）は、還元条件下に維持さ
れるチャオトロピック（chaotropic）環環境中で可溶化
されたモノマーをもって始まる。この様な維持はβ−メ
ルカプトエタノール又はジチオスレイトール（DTT）の
ごとき適当な還元剤の使用を含むことができるが、しか
しCSF−１はすでに還元されており、そして酸化剤の排
除で十分である。可溶化された蛋白質は典型的には、例
えば、約25〜100mMチオール化合物中約７〜8.5のpHにお
いて8M尿素又は7Mグラニジン塩酸塩中に維持される。こ
の可溶化された形から出発して、モノマーは直接再生さ
れるか、又は再生に先立って吸着クロマトグラフィー又
はゲル−浸透モノクロトグラフィーのごとき適当な精製
法により残りの蛋白質から精製される。ゲル浸透クロマ
トグラフィーは異る分子量の不純物から一般にあらかじ
め知られている所望のモノマー長さを容易にサイブ分離
することを可能にするから、このクロマトグラフィーが
好ましい。ジスルフィド連結された凝集体の形成を回避
するため、精製を還元条件下で行うことが要求される。
従って、使用されるクロマトグラス法には関係なく、ク
ロマトグラフ用カラム又はバッチに負荷するために使用
される溶液中、及び溶出溶液中に適当な還元剤が含まれ
ることが好ましい。低pHは還元剤の非存在下でも幾つか
のクロマトグラフ系においてジスルフィド結合を防止す
るので、幾つかの場合には還元剤に代えて低いpHが使用
される。

部分精製されたモノマーは次にダイマーの形成のため
の再生条件にかけられる。この段階における蛋白質濃度
はかなり重要である。一般に、蛋白質濃度が2mg/ml未満
のCSF−１蛋白質であれば収量が増加し、0.03〜0.3mg/m
lの濃度範囲が好ましい。再生条件は、適切な期間、通
常数時間にわたってチャロトロピック環境を徐々に除去
することを含む。１つの簡単な方法はチャオトロピック
剤の濃度が所望の値になるまでサンプルを稀釈すること
であるが、蛋白質も稀釈されることになるため、この方
法はある場合には好ましくない。一定の蛋白質濃度をも
たらす方法、例えば透析又は中空繊維ダイアフィルトレ
ーションが一層好ましい。工程の終りにおいて、チャオ
トロピック環境が凅渇した場合、非変性レベルが達成さ
れる。例えば、チャオトロピック剤としてグアニジン塩
酸塩が使用される場合、約2M未満、そして好ましくは0.
5〜1Mの最終濃度が達成される。

チャオロロピック環境の除去の間の再生（refoldin
g）は結果としての生物学的に活性なダイマー配置を達
成するためにスルヒドリル基をジスルフィドに酸化する
ことを可能にする態様で行われ、CSF−１の場合このダ
イマー配置はジスルフィドの形成により安定化され、そ
の１個又は複数個が２本の鎖を連結するであろう。鎖内
ジスルフィドも形成される。このダイマーの形成を推進
する適当な酸化還元条件は、SH/ジスルフィド試薬の組
み合わせ、例えば酸化型グルタチオンと還元型グルタチ
オンとの組合わせを含む。還元型グルタチオンと酸化型
グルタチオン又は他のスルフィドリル／ジスルフィド組
合せの比率は典型的には約2mM/0.1mM〜0.5mM/1.0mMであ
る。この酸化を提供する他の方法もまた許容される。幾
つかの正しいジスルフィド結合の形成を行うために、空
気及び金属イオンを排除するための予防措置を伴わない
還元剤の単なる除去で十分であるが、これはあまり好ま
しくない。ともかく、再生過程中の溶液のpHは約pH7.5
〜9.0に維持されるべきである。再生の過程において、
最初の精製が行われた時の還元条件はもはや用いられる
ことは明らかである。

再生過程において、モノマー不溶性凝集体が形成され
る場合がある。これは温度の調節によって最少にされ、
この場合25〜37℃の高い温度より約０〜４℃の低い温度
が好ましい。再生が完了した後、標準的方法を用いてダ
イマーが他の蛋白質から精製される。

Ｎ−末端欠失ミューテインをコードする構成物が前記
の様にE.コリにおいて発現される場合、Ｎ−末端のメチ
オニンは対応する成熟配列の場合より効果的にプロセス
される。特に、pP_LCSF−17/CV150の発現はすべてではな
いにしてもほとんどの配列決定可能な分子がＮ−末端メ
チオニンを含有し;pP_LCSF−17/NV2CV150の対応する発現
は分子の78％のみがＮ−末端メチオニンを保持する蛋白
質をもたらす。pP_LCSF−17/NV3CV150の発現は、生成物
の約５％のみがＮ−末端にメチオニンを含有する蛋白質
を与える。

第６〜９図は、生ずる蛋白質の不均一性に対するＮ−
末端除去の効果を示す。第６図及び第７図は、それぞれ
pP_LCSF−17/CV158（tyr₅₉）及びpP_LCSF−17/CV150（asp
₅₉）を用いてE.コリ中で発現された精製されたCSF−１
のRP−HPLC分析を示す。両図中に示されるように、これ
らの分析が行われた還元条件下で約18kdに２個の主ピー
クが存在する。第６図中、18K−Ａと標示される先導ピ
ーク（及び第７図中の対応するピーク）は18kd蛋白質の
全体の約70％を構成し、そして接続ピーク（18K−Ｂと
標示される）と同一のアミノ酸組成及びSDS−PAGEサブ
ユニット分子量を有する。さらに、158コドン構成物は1
5kd蛋白質の形の主不純物をもたらし、これは明らかに
内部的再開始（internal restart）の結果である。この
ピークは、第７図に示される150コドン（asp₅₉）構成物
の生成物には欠けているようである。

第７図中の結果は、それぞれpP_LCSF−17/NV2CV150及
びpP_LCSF−17/NV3CV150の発現からのRP−HPLC分析を示
す第８図及び第９図のそれと適切に比較されるべきであ
る。両者の場合、RH−HPLC上に見られる有意な不均一性
が消失し、そして第７図の先導70％ピークに相当する単
一ピークが得られる。

G.ネズミCSF−１ ネズミCSF−１をコードするイントロン不含有DNA配列
を、多量のCSF−１を生産するネズミ繊維芽細胞系を用
いて調製した。ATCCから得られるＬ−929細胞系をmRNA
源として用いてcDNAライブラリーを作った。ヒト“短い
形”のcDNAをプローブとして用いて“長い形”のCSF−
１をコードする２個のクローンを回収した。ネズミCSF
−１はヒトの物質に対して約80％相同であると信じら
れ、これはＮ−末端配列の相同性、骨髄細胞からのマク
ロファージコロニーを刺激するヒト及びネズミのCSF−
１調製物の両者の能力、並びにラジオレセプター及びラ
ジオイムノアッセイ〔Das,S.K.,等、Blood（1981）58:6
30〕についての限定された交差反応性のためである。

ネズミCSF−１蛋白質はCSF−１の活性プロフィールを
説明するモデル系において特に有用である。

G.1.ネズミCSF−1 cDNAの調製 CSF−17プローブの使用 ネズミＬ−929細胞から全メッセンジャーRNAを抽出
し、そして精製した。ネズミＬ−929細胞をDME培地上で
８日間培養し、そして次に遠心分離により収集した。MI
APaCa mRNAについて前記したのと同じ方法により細胞か
ら全細胞質メッセンジャーRNAを単離した。

MIAPaCa細胞からのmRNAの調製に関してPCT出願WO86/0
4607（前掲）に記載されている様にして、全mRNA調製物
をシュークロース勾配にかけた。

勾配中の各画分からのアリコートをアフリカツメガエ
ル（Xenopus laevis）卵母細胞に注射し、そして生成
物を、Das等（前掲）に従って調製された抗−CSF−１抗
体に対するラジオイムノアッセイにより測定した。画分
17−20及び23−26に、CSF−１と免疫反応性である翻訳
生成物を示す２個のmRNAピークが存在した。

画分19−20及び24−25をプールし、そしてHuynh等
（前掲）により記載された様にして、λgt10中のcDNAラ
イブラリーを作製するために使用した挿入の前、粗cDNA
調製物をEcoR Iリンカーに連結し、EcoR Iで消化し、そ
して二本鎖DNAを５％アクリルアミドゲル上で電気泳動
した。800bpより多くを含有するDNAのみを溶出し、そし
てλgt10アームと連結し、そしてベクター・クローニン
グ・システムス（Vector Cloning System）（ストラテ
ジーン）ギブパックを用いてパッケージした。

長い形のヒトCSF−１の単離に関連して前記した様に
して調製した³²P−ラベル化単鎖CSF−17 DNAにより約百
万個のファージプラークをプローブした。

プローブにハイブリダイズする多数のファージプラー
クを精製し、そして２個のクローン（１個は2kbの挿入
部を有し他方は4kbの挿入部を有する）をさらに検討す
るために選択した。制限地図はこれらのクローンが共通
の大きな領域を有することを示した。両クローンを、ジ
デオキシ配列決定のためにM13mp18及びM13mp19にサブク
ローニングした。両クローンのヌクレオチド配列及びこ
れらによりコードされた推定アミノ酸配列を第４図及び
第５図に示す。

第４図に示されるように、長い方の4kbのクローンは
第１図中に示されるヒトCSF−17に関してヌクレオチド2
4から始まり、そして159bpの非翻訳５′配列を有し、リ
ーダーをコードする96bpのDNAが続く。成熟蛋白質のた
めのコード配列このクローンのヌクレオチド256で始ま
り、そして他の1560ヌクレオチドにわたって続き、従っ
て520アミノ酸の蛋白質をコードする。ヒト“長い形”
のCSF−１コード配列とのかなりの配列相同性を有す
る。しかしながら、ヌクレオチド1816の終止コドンの
後、ヌクレオチド配列はpcCSF−17中及び“長い形”の
クローン中のヒト３′非翻訳配列と大幅に異る。

短い方の2kbクローンは約500bpの３′非翻訳配列を有
し、これはCSF−17中に見出される３′非翻訳配列にか
なり一層相同である。短い方の2kbクローンのDNA配列を
第５図に示す。これは５′末端において90bp短いが、し
かし、いずれもアミノ酸配列の変化をもたらす２個のヌ
クレオチドの変化を除き4kbクローンと同じコード配列
を含有する。関連する位置は長い方のクローン中1034
（短い方のクローン中944）、及び長い方のクローン中1
192（短い方のクローン中1102）である。短い方のクロ
ーンの位置944のＧは成熟蛋白質の位置259のGlyをもた
らし、長い方のクローンの対応するＡはこの位置にAsp
をもたらす。長い方のクローン中のＴから短い方のクロ
ーン中のＣへの第二の変化は位置312のセリンから短い
方のクローン中のプロリンへの変化をもたらす。

従って、第４図及び第５図に示される様に、ネズミCS
F蛋白質はヒト蛋白質の長い形におよそ相同であり、そ
してCSF−17 DNAによりコードされたペプチドに“挿入
された”“余分の”ペプチド配列に対応する296アミノ
酸のセグメントを含有するようである。

上記のそして第５図及び第６図に記載するネズミCSF
−１をコードする長い方のクローン及び短い方のクロー
ンをEcoR I消化によりλgt10から切り出し、そしてこれ
らをSV40初期プロモーターの制御のもとに置き、そして
それぞれpcDBmuCSF−１及びpcDBmuCSF−Ｓを得た。

ミューテイン形 ヒト配列に関連して前記したのと正確に類似する方法
で、単離されたDNAによりネズミ配列の変異形が得られ
る。特に、pcCSF−17について前記したのと正確に類似
する方法においてpcDBmuCSF−１及びpcDBmuCSF−ＳのDN
A挿入部を変形することにより、tyr₅₉及びgln₅₂並びにt
yr₅₉gln₅₂を得ることができる。従って、変形されたベ
クターは、それぞれasp₅₉−muLCSF,gln₅₂−muLCSF、及
びtyr₅₉gln₅₂−muLCSFと称する蛋白質のミューテイン形
をコードする。

G.2.ネズミCSF−1 DNAの発現 発現ベクターpcDBmuCSF−Ｌ及びpcDBmuCSF−Ｓを、前
記のようにして、クロロキンの添加を伴ってDEAEギキス
トランを用いてCSA−A2細胞にトランスフェクトした。

72時間後に上清を集め、そして前記の骨髄増殖アッセ
イを用いてCSF−１活性について試験した。第５表の結
果により示されるように、このアッセイに従えば上清は
いずれもCSF−１活性を含有していた。

H.CSF−１の製剤化 組換生産されたヒトCSF−１の短い形及び長い形は標
準的な製薬法を用いて投与のために製造化され得る。通
常、CSF−１は注射可能な形で調製され、そして唯一の
活性成分として、又は補完的なもしくは類似の活性を有
する他の蛋白質もしくは他の化合物と組み合わせて使用
することができる。この様な他の化合物には他の抗主要
薬、例えばアドリアマイシン、又はリンホカイン類、例
えばIL−1,−２及び−3,α−，β−及びγ−インターフ
ェロン並びに腫瘍壊死因子が含まれる。CSF−１活性成
分の効果はこの様な追加の成分の存在により増強され又
は改良されるであろう。前記のように、CSF−１は適切
な血球と有利な態様で相互作用し、そしてそれ故にこの
発明の組成物は、場合によっては追加のリンホカインの
存在下でのその様な細胞とCSF−１とのインキュベーシ
ョン混合物を包含するであろう。この様なインキュベー
ション混合物の上清画分、又は細胞を含有する全体混合
物が同様に使用されよう。

寄 託 1985年４月２日に、出願人はアメリカン・タイプ・カ
ルチュア・コレクション（American Type Culture Coll
ection），ロックビル,MD,米国（ATCC）に、E.コリdG98
中ファージphCSF−１、アクセションNo.40177を寄託し
た。1985年５月21日に、シタスコレクションにおいてCM
CC2312と称され、そして寄託のためにphCSF−1a/λシャ
ロン4Aと称されるphCSF−1aがATCCに寄託され、そして
アクセションNo.40185を有する。1985年６月14日に、CM
CC2347と称される、E.コリMM294中pcCSF−17がATCCに寄
託され、そしてアクセションNo.53149を有する。

さらに、ここでpcdBhuCSF−４（CMCC2894）と称するp
cDBCSF4がATCCに1986年10月24日に寄託され、そしてATC
CアクセションNo.67250を有する。1987年４月７日に、D
G116中pP_LCSF−17asp₅₉/CV150（CMCC2946）がATCCに寄
託され、そしてアクセションNo.67,383を有する。ここ
でそれぞれpcDBmuCSF−Ｓ及びpcDBmuCSF−Ｌと称するネ
ズミ配列プラスミドpcDBmuCSF53及びpcDBmuCSF10がATCC
にやはりこの日に寄託され、そしてCMCC番号2892及び28
93、並びにATCC番号67,248及び67,249を有する。

追加の寄託が1987年４月14日に次の様に行われた これらの寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するプタペスト条約及びその規則（プダペスト条
約）の規定のもとに行われた。これは寄託の日から30年
間にわたる生存培養物の維持を保証する。寄託物は、プ
タペスト条約の規定のもとで、及び関連する米国特許の
発行の後の永久的且つ無制限の入手可能性を保証する。
本承継人は、寄託中の培養物が適当な条件下で培養され
た場合に失われ又は破壊された場合に、通知の後速やか
に同一の培養物の生存検体でそれが置き換えられことに
同意する。寄託物の入手可能性は、いずれかの政府によ
りその特許法に従って認められた権利に反して本発明を
実施する許諾であると解してはならない。

これらの寄託は関連ある公衆の便宜のため行われたも
のであり、そして明細書の記載が発明の実施を可能にす
るのに十分でないとする自白、又は発明をこれらの特定
の構成物に限定するという意図を構成するものではな
い。前記の様に、完全な記載は当業者が寄託された構成
物を複製し、そして請求の範囲に記載された発明の実施
を可能にするDNAの他の形態又はそれを含有する生物を
構成することを可能にする。

この発明の範囲は本明細書に記載された例示的な態様
により限定されると解されるべきではなく、添付された
請求の範囲に従って決定されるべきである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３９０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３８９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３９１ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３８３ (72)発明者 カワサキ，アーネスト セイゴ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94804，リッチモンド，サン マテオ ストリート 2601 (72)発明者 ラドナー，マーサ バリー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94619，オークランド，レインハート ドライブ 4204 (72)発明者 コイン，メイジー イー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94566，プレズントン，コート セリト ス 5967 (72)発明者 バン アースデル，ジャネル ノーベル アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618，オークランド，イー，クレアモ ント アベニュ 6060 (72)発明者 マーティン，ジョージ アーサー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94705，バークリー，ウルジー ストリ ート 2206 (56)参考文献 特開 平１−104176（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／4607（ＷＯ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．235（1987. Ｍａｒ．20）Ｐ．1504−1508

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列（Ｉ）： （上記配列中、 A01は存在しないか又はValを表わし； A02はTyr又はAspを表わし； A03は存在しないか、又は次のアミノ酸配列（II）： を表わし；そして 配列のＣ−末端は、A03が存在しない場合には少なくと
   も150位のGlyまで伸びており、そしてA03が存在する場
   合には少なくとも150位のAspまで伸びている） から成るポリペプチドをコードするか、あるいは上記ア
   ミノ酸配列においてＮ−末端のMet以外の１〜５個のア
   ミノ酸が除去されておりそして／又は１〜５個のアミノ
   酸が他のアミノ酸により置換されており、且つヒトCSF
   −１の生物学的活性を維持しているアミノ酸配列から成
   るポリペプチドをコードするDNA。
2. 【請求項２】前記DNA配列が、SCSF,gln₅₂SCSF,pro₅₂SCS
   F,SCSF/C▽158−pro,gln₅₂SCSF/C▽158−pro,pro₅₂SCSF
   /C▽158−pro,SCSF/C▽158,pro₅₂SCSF/C▽158,SCSF/C▽
   150,LCSF/C▽150,gln₅₂LCSF/C▽150,tyr₅₉LCSF/C▽190,
   LCSF/C▽191,LCSF/C▽221,LCSF/C▽223,LCSF/C▽236,LC
   SF/C▽238,LCSF/C▽249,LCSF/C▽250、及びLCSF/C▽411
   のいずれか１つのＮ▽３ミューテインである（ここで、
   「SCSF」なる記号はA03にアミノ酸配列（II）が存在し
   ないことを意味し、「LCSF」なる記号はA03にアミノ酸
   配列（II）が存在することを意味し、「Ｎ▽」なる記号
   はそれに続く数字の数だけＮ−末端におけるアミノ酸が
   欠失していることを意味し、「Ｃ▽」なる記号とそれに
   続く数値はＣ−末端側が欠失していることを示し、且つ
   該数値はＣ−末端のアミノ酸位置を示し、小文字のみの
   ３文字から成るアミノ酸記号とそれに続く数値は、該数
   値で示す位置の生来のアミノ酸が該アミノ酸記号により
   示されるアミノ酸により置換されていることを意味し、
   そして「Ｃ▽158」なる記号に続く「−Pro」は159位にP
   roが存在することを意味する）ポリペプチドをコードし
   ている、請求項１に記載のDNA。
3. 【請求項３】前記DNA配列が、 （ａ）LCSF,SCSF,LCSF/C▽150,tyr₅₉LCSF/C▽150及びSC
   SF/C▽150のＮ▽３ミューテイン並びにそれらのgln₅₂ミ
   ューテイン； （ｂ）LCSF/C▽149〜LCSF/C▽521からの可能なＣ−末端
   除去ポリペプチドの各々のＮ▽３ミューテイン、並びに
   それらのtyr₅₆,gln₅₂及びtyr₅₉Gln₅₂ミューテイン； （ｃ）LCSF/C▽190,LCSF/C▽191,LCSF/C▽221,LCSF/C▽
   223,LCSF/C▽236,LCSF/C▽238,LCSF/C▽249,LCSF/C▽25
   8及びLCSF/C▽411のＮ▽３ミューテイン、並びにそれら
   のtyr₅₉,gln₅₂,tyr₅₉gln₅₂,ser₁₅₇,ser₁₅₉、及びser₁₅₇
   ser₁₅₉ミューテイン； （ｄ）SCSF/C▽158のＮ▽３ミューテイン及びそのgln₅₂
   ミューテイン； から選択されたポリペプチド（記号は前記の意味を有す
   る）をコードする、請求項１に記載のDNA。
4. 【請求項４】前記DNA配列が、LCSF/N▽3C▽221、LCSFse
   r₁₅₇ser₁₅₉N▽3C▽221及びSCSF/N▽3C▽158ミューテイ
   ンから選択されたポリペプチド（記号は前記の意味を有
   する）をコードする請求項１に記載のDNA。
5. 【請求項５】アミノ酸位置52,59及び150のアミノ酸の１
   個又は複数個が他のアミノ酸により置換されており、且
   つ、ヒトCSF−１の生物学的活性を維持している、請求
   項１又は２に記載のDNA。
6. 【請求項６】アミノ酸位置52,59及び150のアミノ酸の１
   個又は複数個がそれぞれGln,Asp又はTyr、及びGlyによ
   り置換されている請求項５に記載のDNA。
7. 【請求項７】A03が存在し、かつグリコシル化部位の１
   〜４個のアミノ酸が除去されているか又は他のアミノ酸
   により置換されてその位置でのグリコシル化排除されて
   おり、且つヒトCSF−１の生物学的活性が維持されてい
   るか、あるいはA03が存在せず、グリコシル化部位の１
   又は２個のアミノ酸が除去されているか又は他のアミノ
   酸により置換されてその位置でのグリコシル他の排除さ
   れており、且つヒトCSF−１の生物学的活性が維持され
   ていることを特徴とする、請求項１に記載のDNA。
8. 【請求項８】次のアミノ酸配列（Ｉ）： （上記配列中、 A01は存在しないか又はValを表わし； A02はTyr又はAspを表わし； A03は存在しないか、又は次のアミノ酸配列（II）： を表わし；そして 配列のＣ−末端は、A03が存在しない場合には少なくと
   も150位のGlyまで伸びており、そしてA03が存在する場
   合には少なくとも150位のAspまで伸びている） から成るポリペプチドをコードするか、あるいは上記ア
   ミノ酸配列においてＮ−末端のMet以外の１〜５個のア
   ミノ酸が除去されておりそして／又は１〜５個のアミノ
   酸が他のアミノ酸により置換されており、且つヒトCSF
   −１の生物学的活性を維持しているアミノ酸配列から成
   るポリペプチドをコードするDNA、並びに単細胞生物中
   で作用するレプリコンを含んで成るベクター。
9. 【請求項９】ATCC67390から得られるO/E_PP_LLCSF/N▽3C
   ▽221を含んで成る請求項８に記載のベクター。
10. 【請求項１０】前記DNAに適切な制御配列が連結されて
    いる発現ベクターである、請求項８又は９に記載のベク
    ター。
11. 【請求項１１】次のアミノ酸配列（Ｉ）： （上記配列中、 A01は存在しないか又はValを表わし； A02はTyr又はAspを表わし； A03は存在しないか、又は次のアミノ酸配列（II）： を表わし；そして 配列のＣ−末端は、A03が存在しない場合には少なくと
    も150位のGlyまで伸びており、そしてA03が存在する場
    合には少なくとも150位のAspまで伸びている） から成るポリペプチドをコードするか、あるいは上記ア
    ミノ酸配列においてＮ−末端のMet以外の１〜５個のア
    ミノ酸が除去されておりそして／又は１〜５個のアミノ
    酸が他のアミノ酸により置換されており、且つヒトCSF
    −１の生物学的活性を維持しているアミノ酸配列から成
    るポリペプチドをコードするDNAを含んで成るベクター
    により形質転換された宿主細胞。