JP2719785B2 - ミルベマイシン誘導体の微生物利用による製造方法 - Google Patents
ミルベマイシン誘導体の微生物利用による製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は液相中に溶解した次式III: （式中、R3はR1を、またR4はＡを表わし、そしてR1及び
Ａは下記式Ｉで定義する意味を表わす）で表わされるミ
ルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反応を行うこと
のできるストレプトマイセス種の微生物を該13β−ヒド
ロキシル化反応を行うのに十分な時間接触させることを
特徴とする次式I: 〔式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わすか、又は基 （Ｘはメチル基、エチル基又はイソプロピル基を表わ
す）を を表わし、 Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O-C(O)-CH2CH2−COOH
又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす〕 で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による一段階製造方法に関する。
Ａは下記式Ｉで定義する意味を表わす）で表わされるミ
ルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反応を行うこと
のできるストレプトマイセス種の微生物を該13β−ヒド
ロキシル化反応を行うのに十分な時間接触させることを
特徴とする次式I: 〔式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わすか、又は基 （Ｘはメチル基、エチル基又はイソプロピル基を表わ
す）を を表わし、 Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O-C(O)-CH2CH2−COOH
又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす〕 で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による一段階製造方法に関する。
本発明の範囲内における特に好ましいものは、液相中
に溶解した次式III: （式中、 R3はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、 R4は基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす） で表されるミルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反
応を行うことのできるストレプトマイセス種の微生物を
該13β−ヒドロキシル化反応を行うのに十分な時間接触
させることを特徴とする次式I: （式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす） で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による一段階製造方法である。
に溶解した次式III: （式中、 R3はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、 R4は基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす） で表されるミルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反
応を行うことのできるストレプトマイセス種の微生物を
該13β−ヒドロキシル化反応を行うのに十分な時間接触
させることを特徴とする次式I: （式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす）又は を表わす） で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による一段階製造方法である。
上記式IIIで表されるミルベマイシンと生体触媒であ
るストレプトマイセス種の微生物（Streptomyces speci
es）との液相での接触により次式ＩまたはII: （式中、R1，R1′、ＡおよびＡ′は上で定義されたもの
と同じ意味を表す）で表される13β−ヒドロキシ−又は
14,15−エポキシ−ミルベマイシンが通常得られる。
るストレプトマイセス種の微生物（Streptomyces speci
es）との液相での接触により次式ＩまたはII: （式中、R1，R1′、ＡおよびＡ′は上で定義されたもの
と同じ意味を表す）で表される13β−ヒドロキシ−又は
14,15−エポキシ−ミルベマイシンが通常得られる。
R1及びR1′は基 を表し、基Ｘ、Ａ、Ａ′及びR2が前記式Ｉ及びIIで定義
した意味を表す式Ｉ及びIIで表される化合物は、13β−
ヒドロキシ基又は14,15−エポキシ基を含み、５位に遊
離OH基又はオキシム基を有する天然の抗生物質S541の23
−デオキシ誘導体に相当する。
した意味を表す式Ｉ及びIIで表される化合物は、13β−
ヒドロキシ基又は14,15−エポキシ基を含み、５位に遊
離OH基又はオキシム基を有する天然の抗生物質S541の23
−デオキシ誘導体に相当する。
この微生物を応用した製法においては一般的に両生成
物（Ｉ）及び（II）が生成するが、通常は（Ｉ）が過剰
に生成し、生成物（Ｉ）と（II）は通常約4:1の割合で
得られる。
物（Ｉ）及び（II）が生成するが、通常は（Ｉ）が過剰
に生成し、生成物（Ｉ）と（II）は通常約4:1の割合で
得られる。
本方法によって得られる式Ｉ及びIIで表わされる化合
物は、慣用分離方法により、例えば分別結晶又はクロマ
トグラフィーにより、多大な技術的浪費を伴なうことな
く互に分離することができる。クロマトグラフィーには
例えばシリカゲルのような鉱物性担体材料又は有機交換
樹脂を用いる、カラムクロマトグラフィー、厚層クロマ
トグラフィー又は薄層クロマトグラフィーが含まれる。
物は、慣用分離方法により、例えば分別結晶又はクロマ
トグラフィーにより、多大な技術的浪費を伴なうことな
く互に分離することができる。クロマトグラフィーには
例えばシリカゲルのような鉱物性担体材料又は有機交換
樹脂を用いる、カラムクロマトグラフィー、厚層クロマ
トグラフィー又は薄層クロマトグラフィーが含まれる。
もし式Ｉで表わされる化合物（13β−ヒドロキシミル
ベマイシン）にのみ興味があるなら、ヨーロッパ特許公
報EP−180,539号に従って式IIで表わされる14,15−エポ
キシドを式Ｉで表わされる13β−ヒドロキシミルベマイ
シンに変換できるので、生成物（Ｉ）と（II）の分離は
必要ない。
ベマイシン）にのみ興味があるなら、ヨーロッパ特許公
報EP−180,539号に従って式IIで表わされる14,15−エポ
キシドを式Ｉで表わされる13β−ヒドロキシミルベマイ
シンに変換できるので、生成物（Ｉ）と（II）の分離は
必要ない。
本発明の範囲内における「微生物」及び「その活性成
分」という語句は以下のものを含んでいる： ａ）生長細胞（vegetative cells）の形態の生きた微生
物、 ｂ）死んだ微生物、好ましくは崩壊状態の、すなわち細
胞壁／細胞膜を機械的に又は化学的に分裂又は除去した
微生物、 ｃ）上記微生物の細胞内容物の粗抽出物、 ｄ）式IIIで表わされる化合物を、式II及び／又はＩで
表わされる化合物に変換する酵素及びｅ）上記微生物の
胞子。
分」という語句は以下のものを含んでいる： ａ）生長細胞（vegetative cells）の形態の生きた微生
物、 ｂ）死んだ微生物、好ましくは崩壊状態の、すなわち細
胞壁／細胞膜を機械的に又は化学的に分裂又は除去した
微生物、 ｃ）上記微生物の細胞内容物の粗抽出物、 ｄ）式IIIで表わされる化合物を、式II及び／又はＩで
表わされる化合物に変換する酵素及びｅ）上記微生物の
胞子。
本発明において使用することのできる、ａ）ないし
ｅ）で述べた活性系は、簡素化のためにこれより以降、
生体触媒（biocatalysts）という語句で総括することと
し、該語句はこれら系のいかなるものも表わすために使
用する。
ｅ）で述べた活性系は、簡素化のためにこれより以降、
生体触媒（biocatalysts）という語句で総括することと
し、該語句はこれら系のいかなるものも表わすために使
用する。
バクテリア類及び高等真菌類（heigher fungi）は本
発明方法にとって特に適した微生物である。適当なバク
テリアは特にはアクチノマイセテス（Actinomycetes）
の代表種、殊にストレプトマイセス（Streptomyces）属
である；ストレプトマイセス ジアスタトクロモゲネス
（Streptomyces diastatochromogenes）ATCC31561株、
及び特にストレプトマイセス ヴィオラセンス（Strept
omyces violascens）ATCC31560は、式IIIで表わされる
化合物の13−位に立体特異的にヒドロキシ基を導入する
ために及び／又は14,15−エポキシ化のために特に適し
ていることが証明されている。
発明方法にとって特に適した微生物である。適当なバク
テリアは特にはアクチノマイセテス（Actinomycetes）
の代表種、殊にストレプトマイセス（Streptomyces）属
である；ストレプトマイセス ジアスタトクロモゲネス
（Streptomyces diastatochromogenes）ATCC31561株、
及び特にストレプトマイセス ヴィオラセンス（Strept
omyces violascens）ATCC31560は、式IIIで表わされる
化合物の13−位に立体特異的にヒドロキシ基を導入する
ために及び／又は14,15−エポキシ化のために特に適し
ていることが証明されている。
高等真菌類の中で特に適しているのは不完全真菌類
（Fungi imperfectri）、特にモニリアル目（Moniliale
s）の代表種である。式Ｉ又はIIで表わされる生産物に
関してはアスペルギルス（Aspergillus）属の代表種、
特にはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）s
p.KS−101 ATCC20567株を用いて、特に良い結果を得る
ことができる。
（Fungi imperfectri）、特にモニリアル目（Moniliale
s）の代表種である。式Ｉ又はIIで表わされる生産物に
関してはアスペルギルス（Aspergillus）属の代表種、
特にはアスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）s
p.KS−101 ATCC20567株を用いて、特に良い結果を得る
ことができる。
本発明の範囲内において使用される微生物、すなわち
ストレプトマイセス菌株：ストレプトマイセス ジアス
タトクロモゲネスATCC31561及びストレプトマイセス
ヴィオラセンスATCC31560及びまたアスペルギルス菌
株：アスペルギルス ニガーsp.KS−101ATCC20567は米
国特許第4,226,941号明細書に開示されている。
ストレプトマイセス菌株：ストレプトマイセス ジアス
タトクロモゲネスATCC31561及びストレプトマイセス
ヴィオラセンスATCC31560及びまたアスペルギルス菌
株：アスペルギルス ニガーsp.KS−101ATCC20567は米
国特許第4,226,941号明細書に開示されている。
上記米国特許明細書の第３ないし６欄にまたがる記載
は参照文献という形で本発明の一部を構成する。
は参照文献という形で本発明の一部を構成する。
遊離した又はアシル化された５−ヒドロキシ基を有す
る式Ｉで表わされる13β−ミルベマイシンは、ヨーロッ
パ特許公報EP−180,539号に、生産性家畜の体内及び体
外に寄生する害虫を防除するための高活性駆虫薬として
開示されている。
る式Ｉで表わされる13β−ミルベマイシンは、ヨーロッ
パ特許公報EP−180,539号に、生産性家畜の体内及び体
外に寄生する害虫を防除するための高活性駆虫薬として
開示されている。
式Ｉで表わされる化合物の公知製造方法（EP−180,53
9号）においては、本発明に係る微生物を応用した製造
方法においてもそうであるように、出発物質として式II
Iで表わされる化合物が使用されている。公知方法にお
いては、第一段階として式IIIで表わされる化合物を過
酸によって式IIで表わされる14,15−エポキシドに変換
し、 次いで式IIで表わされる14,15−エポキシドを特別な錯
体試薬によって式IVで表わされる15−ヒドロキシ化合物
に変え、 更に別の段階で、式IVで表わされる15−ヒドロキシ化合
物を、クロム酸、ハロクロム酸又は重クロム酸イオン、
特には重クロム酸ピリジニウムと反応させ、 所望する式Ｉで表わされる13β−ヒドロキシミルベマイ
シンとともに、除去しなければならない13−オキソ化合
物もまた生成させていた。
9号）においては、本発明に係る微生物を応用した製造
方法においてもそうであるように、出発物質として式II
Iで表わされる化合物が使用されている。公知方法にお
いては、第一段階として式IIIで表わされる化合物を過
酸によって式IIで表わされる14,15−エポキシドに変換
し、 次いで式IIで表わされる14,15−エポキシドを特別な錯
体試薬によって式IVで表わされる15−ヒドロキシ化合物
に変え、 更に別の段階で、式IVで表わされる15−ヒドロキシ化合
物を、クロム酸、ハロクロム酸又は重クロム酸イオン、
特には重クロム酸ピリジニウムと反応させ、 所望する式Ｉで表わされる13β−ヒドロキシミルベマイ
シンとともに、除去しなければならない13−オキソ化合
物もまた生成させていた。
公知方法と比べると、本発明の微生物を利用したヒド
ロキシル化方法は、一段階のみからなる、全収率が高く
なる。及び使用しなければならない化学薬品がより少な
いので生体学的に安全であるという決定的な利点を有し
ており、副生成物としては生物体（biomass）が形成さ
れるのみである。
ロキシル化方法は、一段階のみからなる、全収率が高く
なる。及び使用しなければならない化学薬品がより少な
いので生体学的に安全であるという決定的な利点を有し
ており、副生成物としては生物体（biomass）が形成さ
れるのみである。
本発明の微生物を利用した製法から得られる14,15−
エポキシドは、ヨーロッパ公開特許明細書:EP−180,53
9、EP−147,852、EP−184,989及びEP−184,173号によ
り、種々の置換ミルベマイシンを製造するための価値あ
る構成単位（building block）として知られている。
エポキシドは、ヨーロッパ公開特許明細書:EP−180,53
9、EP−147,852、EP−184,989及びEP−184,173号によ
り、種々の置換ミルベマイシンを製造するための価値あ
る構成単位（building block）として知られている。
Ａ及びＡ′がオキシム基である式Ｉ及びIIで表わされ
る化合物は新規であり、またそれら自体が高活性の体外
−及び体内駆虫薬であるか或は高活性の体外−及び体内
−駆虫薬を製造するための中間体である。
る化合物は新規であり、またそれら自体が高活性の体外
−及び体内駆虫薬であるか或は高活性の体外−及び体内
−駆虫薬を製造するための中間体である。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物の次に示す小群は、そ
れらの著しい殺寄生中及び殺昆虫活性からして特に好ま
しいものである。
れらの著しい殺寄生中及び殺昆虫活性からして特に好ま
しいものである。
Ia,IIa群： 式Ｉ又はIIにおいて、R1及びR1′がメチル基、エチル
基、イソプロピル基又は第二ブチル基を表わすか或は基 （Ｘはメチル基、エチル基又はイソプロピル基を表わ
す）を表わし、Ａ及びＡ′が基 を表わす化合物。
基、イソプロピル基又は第二ブチル基を表わすか或は基 （Ｘはメチル基、エチル基又はイソプロピル基を表わ
す）を表わし、Ａ及びＡ′が基 を表わす化合物。
Ib,IIb類： 式Ｉ及びIIにおいて、R1及びR1′がメチル基、エチル
基、イソプロピル基又は第二ブチル基を表わし、Ａ及び
Ａ′が基 を表わす化合物。
基、イソプロピル基又は第二ブチル基を表わし、Ａ及び
Ａ′が基 を表わす化合物。
Ic,IIc群： 式Ｉ及びIIにおいて、R1及びR1′がメチル基又はエチ
ル基を表わし、Ａ及びＡ′が基 を表わす化合物。
ル基を表わし、Ａ及びＡ′が基 を表わす化合物。
特に最も好ましい個々の化合物は下記に掲げるもので
ある： 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンA4、 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンA3、 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンＤ。
ある： 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンA4、 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンA3、 14,15−エポキシ−５−オキシイミノ−ミルベマイシ
ンＤ。
高活性の体外−及び体内−駆虫薬として、文献から公
知となっているミルベマイシンは、例えば下記式Ｍで表
わされるようなものである： Ｒが第二ブチル基を表わす化合物は、常用の分類に従
えばアベルメクチン誘導体から誘導されるものであるけ
れども、ここでは、及びこれより以降はミルベマイシン
誘導体としても考えられるべきである。とはいえ、アベ
ルメクチン−アグリコン（13−位にOH基を伴うもの）は
米国特許第4,173,571号に従って、ミルベマイシン同族
体に変換することができる。
知となっているミルベマイシンは、例えば下記式Ｍで表
わされるようなものである： Ｒが第二ブチル基を表わす化合物は、常用の分類に従
えばアベルメクチン誘導体から誘導されるものであるけ
れども、ここでは、及びこれより以降はミルベマイシン
誘導体としても考えられるべきである。とはいえ、アベ
ルメクチン−アグリコン（13−位にOH基を伴うもの）は
米国特許第4,173,571号に従って、ミルベマイシン同族
体に変換することができる。
天然の抗生物質S541の構造は西独公開特許公報（DE−
OS）第3532794号で知られており、下記の如くである： 以下、名称を簡単にするために、抗生物質S541の誘導
体を、これらファクターに従ってS541A、S541B、S541
C、S541D、S541E、S541Fの誘導体として分類する。
OS）第3532794号で知られており、下記の如くである： 以下、名称を簡単にするために、抗生物質S541の誘導
体を、これらファクターに従ってS541A、S541B、S541
C、S541D、S541E、S541Fの誘導体として分類する。
R3が基 を表わし、Ｘ及びR4が式IIIで定義された意味を表わ
し、そして本発明方法において出発物質として使用する
ことのできる式IIIで表わされる化合物は、天然の抗生
物質S541からそれ自体公知の方法によって製造すること
ができる。
し、そして本発明方法において出発物質として使用する
ことのできる式IIIで表わされる化合物は、天然の抗生
物質S541からそれ自体公知の方法によって製造すること
ができる。
抗生物質S541の23−位のヒドロキシ基は米国特許第4,
328,335号明細書に記載されている方法と同様の方法に
よって除去することができ、こうして抗生物質S541は相
応する23−デオキシ誘導体に変換することができる。５
−ヒドロキシ基を有するような化合物（R1 ＊＝Ｈ）は、
後述するシリル化剤Ｙ−Si（R5）（R6）（R7）の一種又
は第三ブチルジメチルシリルオキシアセチルクロライド
との反応によって最初に選択的に保護されなければなら
ない。R1 ＊がSi（R5）（R6）（R7）又はC(=O)CH2OSi(CH
3)2t−C4H9によって置換され、23−Ｃ原子がOHによって
置換されたこれら保護化合物とｐ−メチルフェニル−ク
ロロチオノホルメートとの反応は、23−位が−Ｏ−Ｃ
（＝Ｓ）−OC6H4−CH3−ｐに置換されている抗生物質S5
41誘導体を生成する。抗生物質541のこれら23−Ｏ−
（４−メチル−フェノキシ）−チオカルボニル誘導体は
次いで出発物質として使用され、トルエン中、アゾビス
イソブチロニトリルの存在下、80ないし120℃の温度で
トリブチル錫ハイドライドで還元され、相当する（23−
位が置換された）23−デオキシ誘導体を生じる。
328,335号明細書に記載されている方法と同様の方法に
よって除去することができ、こうして抗生物質S541は相
応する23−デオキシ誘導体に変換することができる。５
−ヒドロキシ基を有するような化合物（R1 ＊＝Ｈ）は、
後述するシリル化剤Ｙ−Si（R5）（R6）（R7）の一種又
は第三ブチルジメチルシリルオキシアセチルクロライド
との反応によって最初に選択的に保護されなければなら
ない。R1 ＊がSi（R5）（R6）（R7）又はC(=O)CH2OSi(CH
3)2t−C4H9によって置換され、23−Ｃ原子がOHによって
置換されたこれら保護化合物とｐ−メチルフェニル−ク
ロロチオノホルメートとの反応は、23−位が−Ｏ−Ｃ
（＝Ｓ）−OC6H4−CH3−ｐに置換されている抗生物質S5
41誘導体を生成する。抗生物質541のこれら23−Ｏ−
（４−メチル−フェノキシ）−チオカルボニル誘導体は
次いで出発物質として使用され、トルエン中、アゾビス
イソブチロニトリルの存在下、80ないし120℃の温度で
トリブチル錫ハイドライドで還元され、相当する（23−
位が置換された）23−デオキシ誘導体を生じる。
シリル化に際し、式Ｙ−Si（R5）（R6）（R7）〔式
中、R5，R6及びR7は、好ましくは互に独立して炭素原子
数１ないし４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基
を表わし、そして基−Si（R5）（R6）（R7）は例えば次
の基：トリメチルシリル基、トリス（第三ブチル）シリ
ル基、ジメチル（2,3−ジメチル−２−ブチル）−シリ
ル基、ジフェニル−第三ブチルシリル基、ビス（イソプ
ロピル）メチルシリル基、トリフェニルシリル基等の一
種を表わし、特には第三ブチルジメチルシリル基を表わ
す〕で表わされるシランを用いるのが好都合である。Ｙ
は、例えばプロミド、クロリド、シアニド、アジド、ア
セタミド、トリフルオロアセテート又はトリフルオロメ
タンスルホネートのようなシリル脱離基である。この記
述は限定するものではなく、他の典型的なシリル脱離基
は当業者に知られている。
中、R5，R6及びR7は、好ましくは互に独立して炭素原子
数１ないし４のアルキル基、ベンジル基又はフェニル基
を表わし、そして基−Si（R5）（R6）（R7）は例えば次
の基：トリメチルシリル基、トリス（第三ブチル）シリ
ル基、ジメチル（2,3−ジメチル−２−ブチル）−シリ
ル基、ジフェニル−第三ブチルシリル基、ビス（イソプ
ロピル）メチルシリル基、トリフェニルシリル基等の一
種を表わし、特には第三ブチルジメチルシリル基を表わ
す〕で表わされるシランを用いるのが好都合である。Ｙ
は、例えばプロミド、クロリド、シアニド、アジド、ア
セタミド、トリフルオロアセテート又はトリフルオロメ
タンスルホネートのようなシリル脱離基である。この記
述は限定するものではなく、他の典型的なシリル脱離基
は当業者に知られている。
５−Ｏ−シリル化は無水媒体、好ましくは不活性溶
媒、そして最も好ましくは非プロトン性溶媒中で行われ
る。反応は０℃ないし＋80℃、好ましくは＋10℃ないし
＋40℃、の温度範囲で便利に起きる。有機塩基を加える
のが好ましい。適した塩基の例は、トリエチルアミン、
トリエチレンジアミン、トリアゾール、および好ましく
はピリジン、イミダゾール又は1,8−ジアザビシクロ
〔5.4.0〕−ウンデセ−７−エン（DBU）のような第三級
アミンである。
媒、そして最も好ましくは非プロトン性溶媒中で行われ
る。反応は０℃ないし＋80℃、好ましくは＋10℃ないし
＋40℃、の温度範囲で便利に起きる。有機塩基を加える
のが好ましい。適した塩基の例は、トリエチルアミン、
トリエチレンジアミン、トリアゾール、および好ましく
はピリジン、イミダゾール又は1,8−ジアザビシクロ
〔5.4.0〕−ウンデセ−７−エン（DBU）のような第三級
アミンである。
５−位のこれらのシリル基の除去は、例えばアリール
スルホン酸のアルコール溶液を用いた選択的なゆるい加
水分解によるそれ自体公知の方法によって、又は熟練者
に知られた他の方法に従って行われる。
スルホン酸のアルコール溶液を用いた選択的なゆるい加
水分解によるそれ自体公知の方法によって、又は熟練者
に知られた他の方法に従って行われる。
式IIIで表わされる範囲内のオキシム〔R4＝−Ｃ（＝
Ｎ−OH）−〕は、R4が−Ｃ（＝Ｏ）−によって置換され
ている式IIIで表わされる誘導体をヒドロキシルアミン
またはその塩、好ましくはその鉱酸塩、最も好ましくは
塩酸塩と反応させることにより製造される。反応は適当
な溶媒、例えばメタノール、エタノールもしくはプロパ
ノールのような低級アルカノール、テトラヒドロフラン
もしくはジオキサンのようなエーテル性化合物、酢酸も
しくはプロピオン酸のような脂肪族カルボン酸、水、ま
たはこれらの溶媒同志もしくは他の慣用の溶媒との混合
物中で有利に行なわれる。反応温度は広い範囲内で変化
させうる。約＋10℃ないし＋100℃の範囲で反応を行う
のが有利である。ヒドロキシルアミンをその塩の形態
で、例えば塩酸塩の形態で使用する場合には、酸（例え
ばHCl）を中和するために、通常そのような目的に使用
される塩基を添加し、親水性剤、例えばモレキュラーシ
ーブ（molecularsieve）の存在下で反応を行なうのが有
利である。適する塩基は有機塩基でも無機塩基でもよ
く、例えばトリアルキルアミン（トリメチルアミン、ト
リエチルアミン、トリプロピルアミン等）、ピリジン、
ピリジン塩基（４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロ
リジルアミノピリジン等）のような第三アミン、アルカ
リ金属及びアルカリ土類金属の酸化物、水素化物及び水
酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩（CaO,BaO,NaOH,KOH,NaH,C
a(OH)2，KHCO3，NaHCO3，Ca(HCO3)2，K2CO3，Na2C
O3）、並びにCH3COONaもしくはCH3COOKのようなアルカ
リ金属アセテートである。C2H5ONa及びｎ−C3H7ONaのよ
うなアルカリ金属のアルコラートもまた適する塩基であ
る。トリエチルアミンが好ましい。
Ｎ−OH）−〕は、R4が−Ｃ（＝Ｏ）−によって置換され
ている式IIIで表わされる誘導体をヒドロキシルアミン
またはその塩、好ましくはその鉱酸塩、最も好ましくは
塩酸塩と反応させることにより製造される。反応は適当
な溶媒、例えばメタノール、エタノールもしくはプロパ
ノールのような低級アルカノール、テトラヒドロフラン
もしくはジオキサンのようなエーテル性化合物、酢酸も
しくはプロピオン酸のような脂肪族カルボン酸、水、ま
たはこれらの溶媒同志もしくは他の慣用の溶媒との混合
物中で有利に行なわれる。反応温度は広い範囲内で変化
させうる。約＋10℃ないし＋100℃の範囲で反応を行う
のが有利である。ヒドロキシルアミンをその塩の形態
で、例えば塩酸塩の形態で使用する場合には、酸（例え
ばHCl）を中和するために、通常そのような目的に使用
される塩基を添加し、親水性剤、例えばモレキュラーシ
ーブ（molecularsieve）の存在下で反応を行なうのが有
利である。適する塩基は有機塩基でも無機塩基でもよ
く、例えばトリアルキルアミン（トリメチルアミン、ト
リエチルアミン、トリプロピルアミン等）、ピリジン、
ピリジン塩基（４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロ
リジルアミノピリジン等）のような第三アミン、アルカ
リ金属及びアルカリ土類金属の酸化物、水素化物及び水
酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩（CaO,BaO,NaOH,KOH,NaH,C
a(OH)2，KHCO3，NaHCO3，Ca(HCO3)2，K2CO3，Na2C
O3）、並びにCH3COONaもしくはCH3COOKのようなアルカ
リ金属アセテートである。C2H5ONa及びｎ−C3H7ONaのよ
うなアルカリ金属のアルコラートもまた適する塩基であ
る。トリエチルアミンが好ましい。
R4が−Ｃ（Ｏ）−を表わす式IIIで表わされる誘導体
は、相当する天然の抗生物質S541（S541A、S541C、S541
D）から及び式Ｍで表わされるミルベマイシンから、例
えば褐石（brown stone:MnO2）、CrO3／ピリジンによる
温和な酸化により又はオッペナウアー酸化（Oppenauer
oxidation）により製造することができる。
は、相当する天然の抗生物質S541（S541A、S541C、S541
D）から及び式Ｍで表わされるミルベマイシンから、例
えば褐石（brown stone:MnO2）、CrO3／ピリジンによる
温和な酸化により又はオッペナウアー酸化（Oppenauer
oxidation）により製造することができる。
R4が−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2COOH又は−
Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす式IIIで表わされる化
合物は、相当するミルベマイシンから及び天然の抗生物
質S541から、公知方法と同様な方法でエステル化によっ
て製造することができる。
Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす式IIIで表わされる化
合物は、相当するミルベマイシンから及び天然の抗生物
質S541から、公知方法と同様な方法でエステル化によっ
て製造することができる。
本発明方法は、詳述すると以下のように行なわれる。
式Ｉで表わされる化合物又は式IIで表わされる化合物
或はその二つの混合物を製造するため、式IIIで表わさ
れる化合物と、式IIIで表わされる化合物の13位への立
体特異的ヒドロキシ基導入及び／又は14,15−エポキシ
化、又は両反応に適する生体触媒とを互に直接接触さ
せ、そしてこの接触を、ヒドロキシル化及び／又はエポ
キシ化のために十分な時間維持する。
或はその二つの混合物を製造するため、式IIIで表わさ
れる化合物と、式IIIで表わされる化合物の13位への立
体特異的ヒドロキシ基導入及び／又は14,15−エポキシ
化、又は両反応に適する生体触媒とを互に直接接触さ
せ、そしてこの接触を、ヒドロキシル化及び／又はエポ
キシ化のために十分な時間維持する。
最も都合よくは、本発明方法は、式IIIで表わされる
化合物が存在するコントロールされた条件下で、ヒドロ
キシル化／エポキシ化を行なうことのできる微生物を培
養し、加えた式IIIで表わされる化合物の大部分、好ま
しくは80ないし99.9％が式Ｉ又はIIで表わされる化合物
或はこれら化合物の混合に変換されるまで、上記微生物
とその基質の合同培養を維持することにより行なわれ
る。
化合物が存在するコントロールされた条件下で、ヒドロ
キシル化／エポキシ化を行なうことのできる微生物を培
養し、加えた式IIIで表わされる化合物の大部分、好ま
しくは80ないし99.9％が式Ｉ又はIIで表わされる化合物
或はこれら化合物の混合に変換されるまで、上記微生物
とその基質の合同培養を維持することにより行なわれ
る。
得られた式Ｉ又はIIで表わされる化合物或はその両化
合物を含む混合物の単離は、それ自体公知の方法、例え
ばシリカゲルクロマトグラフィーにより行なうことがで
きる。
合物を含む混合物の単離は、それ自体公知の方法、例え
ばシリカゲルクロマトグラフィーにより行なうことがで
きる。
本発明では式IIIで表わされる化合物がヒドロキシル
化反応のための基質として使用される。これら化合物は
公知であるか（例えば式Ｍ参照）又は公知方法と同様な
方法で公知化合物から製造することができる。それらは
動物及び植物の体内及び体外における有害生物を防除す
るのに適しており、更にまた、式Ｉで表わされる化合物
の製造における価値ある出発物質又は中間体である。
化反応のための基質として使用される。これら化合物は
公知であるか（例えば式Ｍ参照）又は公知方法と同様な
方法で公知化合物から製造することができる。それらは
動物及び植物の体内及び体外における有害生物を防除す
るのに適しており、更にまた、式Ｉで表わされる化合物
の製造における価値ある出発物質又は中間体である。
式IIIで表わされる化合物のヒドロキシル化のために
微生物を用いずに、該微生物から作り出されるヒドロキ
シル化に適する活性成分（上記ｂないしｄで定義したも
の）を使用することによっても、式Ｉで表わされる化合
物を製造することができる。またこの方法により式IIで
表わされるエポキシ化合物及び上記二化合物の混合物を
製造することもできる。
微生物を用いずに、該微生物から作り出されるヒドロキ
シル化に適する活性成分（上記ｂないしｄで定義したも
の）を使用することによっても、式Ｉで表わされる化合
物を製造することができる。またこの方法により式IIで
表わされるエポキシ化合物及び上記二化合物の混合物を
製造することもできる。
発育細胞体の代わりに微生物の胞子を用いる場合、該
胞子は、式IIIで表わされる化合物の立体特異的13β−
ヒドロキシル化又は14,15−エポキシ化或はその両反応
に適する微生物から収穫され、次いで相当する反応が起
こるのに充分な時間、式IIIで表わされる化合物ととも
に培養される。胞子と基質の培養は、胞子が発芽するこ
とを防ぐために培地の不在下で行なうのが好ましい。
胞子は、式IIIで表わされる化合物の立体特異的13β−
ヒドロキシル化又は14,15−エポキシ化或はその両反応
に適する微生物から収穫され、次いで相当する反応が起
こるのに充分な時間、式IIIで表わされる化合物ととも
に培養される。胞子と基質の培養は、胞子が発芽するこ
とを防ぐために培地の不在下で行なうのが好ましい。
本発明の別の態様では、式IIIで表わされる化合物の
立体特異的13β−ヒドロキシル化又は14,15−エポキシ
化或は両反応に適する成長微生物細胞、該微生物の細胞
除去抽出物、胞子、酵素及び酵素混合物を固定化した形
で使用する。
立体特異的13β−ヒドロキシル化又は14,15−エポキシ
化或は両反応に適する成長微生物細胞、該微生物の細胞
除去抽出物、胞子、酵素及び酵素混合物を固定化した形
で使用する。
上記生体触媒の固定化はそれ自体公知の方法に準じて
行なわれる。
行なわれる。
本発明の範囲内において、特にプロセスは上記生体触
媒の固体で、概して非水溶性担体物質への吸着結合又は
イオン性若しくは共有結合、二価若しくは多価官能性試
薬による生体触媒の架橋、マトリックスの封入（encaps
ulation）、膜分離（membrance separation）、又は上
記プロセスの二又はそれ以上の組み合せに基づいている
と言える。
媒の固体で、概して非水溶性担体物質への吸着結合又は
イオン性若しくは共有結合、二価若しくは多価官能性試
薬による生体触媒の架橋、マトリックスの封入（encaps
ulation）、膜分離（membrance separation）、又は上
記プロセスの二又はそれ以上の組み合せに基づいている
と言える。
非水溶性担体（吸着剤）への吸着結合は特にファンデ
ルワールス力（van der waals forces）による。多数の
無機及び有機化合物及びまた合成ポリマーが吸着剤とし
て適している。
ルワールス力（van der waals forces）による。多数の
無機及び有機化合物及びまた合成ポリマーが吸着剤とし
て適している。
そのような微生物の固定化のための方法は、ファンヘ
ヒトら（van Haecht et al.）1985年（酵母細胞／ガラ
ス）；ブラックら（Black et al.）1984年（酵母細胞／
精製鋼，ポリエステル）；ウィーゲル及びディクストラ
（Wiegel and Dykstra）1984年（クロストリディア＜cl
ostridia＞／セルロース，ヘミセルロース）；フェルベ
ルク及びヘッグストレム（Ｆrberg and Hggstr
ｍ）1984年（クロストリディア／経木）及びまたエール
ハルト及びレームEhrhardt and Rehm）1985年（シュー
ドモナス／活性炭）により記載されている。吸着結合に
よる固定化酵素の使用のための相当する詳述は、クラコ
ウィアクら（Krakowiak et al.）1984年（グルコァミラ
ーゼ／アルミニウムオキシド）、カブラルら（Cabral e
t al.）1984年（グルコアミラーゼ／チタニウム−活性
ガラス）、ミヤワキ及びウィンガード（Miyawaki and W
ingard）1984年（グルコースオキシダーゼ／活性炭）、
カトー及びホリコシ（Kato and Horikoshi）1984年（グ
ルコーストランスフェラーゼ／合成樹脂）中に特に見ら
れる。
ヒトら（van Haecht et al.）1985年（酵母細胞／ガラ
ス）；ブラックら（Black et al.）1984年（酵母細胞／
精製鋼，ポリエステル）；ウィーゲル及びディクストラ
（Wiegel and Dykstra）1984年（クロストリディア＜cl
ostridia＞／セルロース，ヘミセルロース）；フェルベ
ルク及びヘッグストレム（Ｆrberg and Hggstr
ｍ）1984年（クロストリディア／経木）及びまたエール
ハルト及びレームEhrhardt and Rehm）1985年（シュー
ドモナス／活性炭）により記載されている。吸着結合に
よる固定化酵素の使用のための相当する詳述は、クラコ
ウィアクら（Krakowiak et al.）1984年（グルコァミラ
ーゼ／アルミニウムオキシド）、カブラルら（Cabral e
t al.）1984年（グルコアミラーゼ／チタニウム−活性
ガラス）、ミヤワキ及びウィンガード（Miyawaki and W
ingard）1984年（グルコースオキシダーゼ／活性炭）、
カトー及びホリコシ（Kato and Horikoshi）1984年（グ
ルコーストランスフェラーゼ／合成樹脂）中に特に見ら
れる。
イオン性結合は、担体物質（例えば、ポリサッカライ
ドや合成樹脂等をベースとする市販のイオン交換樹脂の
ようなもの）と結合される生体触媒の正反対の荷電基間
の静電的誘引に基ずいている。
ドや合成樹脂等をベースとする市販のイオン交換樹脂の
ようなもの）と結合される生体触媒の正反対の荷電基間
の静電的誘引に基ずいている。
イオン性結合に基づく微生物の固定化方法は、ディル
ッチオ及びキルワン（DiLuccio and Kirwan）1984年
（アゾトバクター種＜Azotobacter spec.＞／セレック
スＥ＜Ccllex E:セルロース＞）及びギアードら（Giard
et al.）1977年（動物細胞/DEAE−セファデックス）に
より開示されている。
ッチオ及びキルワン（DiLuccio and Kirwan）1984年
（アゾトバクター種＜Azotobacter spec.＞／セレック
スＥ＜Ccllex E:セルロース＞）及びギアードら（Giard
et al.）1977年（動物細胞/DEAE−セファデックス）に
より開示されている。
相当する酵素の固定化は、アンゲリノら（Angelino e
t al.）1985年（アルデヒドオキシダーゼ／オクチルア
ミノーセファデックス）、キューンら（Ｋhn et a
l.）1980年（グルコースオキシダーゼ/DEAE−セファデ
ックス,DEAE−セルロース）及びその他によって詳述さ
れているように行なうことができる。
t al.）1985年（アルデヒドオキシダーゼ／オクチルア
ミノーセファデックス）、キューンら（Ｋhn et a
l.）1980年（グルコースオキシダーゼ/DEAE−セファデ
ックス,DEAE−セルロース）及びその他によって詳述さ
れているように行なうことができる。
固定化の他の方法は、共有結合力の利用に基づいてお
り、該方法は一般的に生体触媒どうしを或は生体触媒と
担体材料を固定結合させ、担体材料としては多孔性材
料、例えばガラス、シリカ又は他の不溶性無機材料を用
いることができる。
り、該方法は一般的に生体触媒どうしを或は生体触媒と
担体材料を固定結合させ、担体材料としては多孔性材
料、例えばガラス、シリカ又は他の不溶性無機材料を用
いることができる。
本発明方法の範囲内で、微生物は例えばメッシング及
びオッペルマン（Messing and Oppermann）1979年（エ
ンテロバクテリア／ボロシリケートガラス；酵素細胞／
ジルコニウムオキシド）、ロマノフスカヤら（Romanovs
kaya et al.）1981年（メタンバクテリア／シロクロ
ム）、ナバロ及びデュランド（Navaro and Durand）197
7年（酵母細胞／多孔性シリカ）らの方法に準じて固定
され得る。
びオッペルマン（Messing and Oppermann）1979年（エ
ンテロバクテリア／ボロシリケートガラス；酵素細胞／
ジルコニウムオキシド）、ロマノフスカヤら（Romanovs
kaya et al.）1981年（メタンバクテリア／シロクロ
ム）、ナバロ及びデュランド（Navaro and Durand）197
7年（酵母細胞／多孔性シリカ）らの方法に準じて固定
され得る。
酵素の固定化は、ウィータール及びメイソン（Weetal
l and Mason）1973年（パパイン／多孔性ガラス）及び
モンサンら（Monsan et al.）1984年（インッヴェルタ
ーゼ／多孔性シリカ）により開示された方法に従って行
なうことができる。
l and Mason）1973年（パパイン／多孔性ガラス）及び
モンサンら（Monsan et al.）1984年（インッヴェルタ
ーゼ／多孔性シリカ）により開示された方法に従って行
なうことができる。
本発明方法において、担体材料としては、固定化に適
するものとして既述したもののみならず、全シリーズの
天然又は合成ポリマー、例えばセルロース、デキストラ
ン、澱粉、アガロース等、又は例えば通常は反応性共重
合体の製造に使用されているアクリル酸若しくはメタク
リル酸の誘導体をベースとするポリマーが挙げられる。
生体触媒との結合が形成されることで適当である反応性
基は、反応性ジニトロフルオロフェニル基又はイソチオ
シアネート基、特にはオキシラン及び酸無水物基であ
る。更に可能性としては塩素活性化されたカルボキシ基
含有樹脂もあり、それらは例えばアンバーライト（Ambe
rlite） XE−64及びアンバーライト IRC−50という商
品名で市販されている。
するものとして既述したもののみならず、全シリーズの
天然又は合成ポリマー、例えばセルロース、デキストラ
ン、澱粉、アガロース等、又は例えば通常は反応性共重
合体の製造に使用されているアクリル酸若しくはメタク
リル酸の誘導体をベースとするポリマーが挙げられる。
生体触媒との結合が形成されることで適当である反応性
基は、反応性ジニトロフルオロフェニル基又はイソチオ
シアネート基、特にはオキシラン及び酸無水物基であ
る。更に可能性としては塩素活性化されたカルボキシ基
含有樹脂もあり、それらは例えばアンバーライト（Ambe
rlite） XE−64及びアンバーライト IRC−50という商
品名で市販されている。
天然又は合成担体材料を用いる微生物の固定化は、チ
プレイ（Chipley）1974年（バチルスサブチリス／アガ
ロース）、ガイナーら（Gainer et al.）1980年（アゾ
トバクター種／セルロース）、ジヤック及びザジック
（Jack及びZajic）1977年（ミクロコッカス ル テウ
ス＜Mierococcus luteus＞／カルボキシメチルセルロー
ス）、ジルクら（Jirku et al.）1980年（酵母細胞／ヒ
ドロキシアルキルメタクリレート）及びまたシミズら
（Shimizu et al.）1975（バクテリア細胞／エチレン−
無水マレイン酸共重合体）らにより記述されたようにし
て行なうことができる。酵素の固定化は、特にキャノン
ら（Cannon et al.）1984年（ラクテートオキシダーゼ
／セルロース）、クラーク及びバイレイ（Clark and Ba
iley）1984年（キモトリプシン／セファロース）、イブ
ラヒムら（Ibrahim et al.）1985年（エポキシヒドロラ
ーゼ／デキストラン）、ベドウズら（Beddows et al.）
1981年（α−ガラクトシダーゼ／ナイロン−アクリレー
ト共重合体）、ラグナスら（Raghunath et al.）1984年
（ウレアーゼ／メタクリレート−アクリレート）らの方
法に準じて行なうことができる。
プレイ（Chipley）1974年（バチルスサブチリス／アガ
ロース）、ガイナーら（Gainer et al.）1980年（アゾ
トバクター種／セルロース）、ジヤック及びザジック
（Jack及びZajic）1977年（ミクロコッカス ル テウ
ス＜Mierococcus luteus＞／カルボキシメチルセルロー
ス）、ジルクら（Jirku et al.）1980年（酵母細胞／ヒ
ドロキシアルキルメタクリレート）及びまたシミズら
（Shimizu et al.）1975（バクテリア細胞／エチレン−
無水マレイン酸共重合体）らにより記述されたようにし
て行なうことができる。酵素の固定化は、特にキャノン
ら（Cannon et al.）1984年（ラクテートオキシダーゼ
／セルロース）、クラーク及びバイレイ（Clark and Ba
iley）1984年（キモトリプシン／セファロース）、イブ
ラヒムら（Ibrahim et al.）1985年（エポキシヒドロラ
ーゼ／デキストラン）、ベドウズら（Beddows et al.）
1981年（α−ガラクトシダーゼ／ナイロン−アクリレー
ト共重合体）、ラグナスら（Raghunath et al.）1984年
（ウレアーゼ／メタクリレート−アクリレート）らの方
法に準じて行なうことができる。
架橋プロセスにおいて、生体触媒は特には二−又は多
−官能性試薬、例えばグルタルジアルデヒド、ジイソシ
アネートにより互に結合し、特徴として不溶性の通常ゼ
ラチン状の高分子量の集合体を形成する。
−官能性試薬、例えばグルタルジアルデヒド、ジイソシ
アネートにより互に結合し、特徴として不溶性の通常ゼ
ラチン状の高分子量の集合体を形成する。
そのような微生物の固定化は、デ ロサら（De Rosa
et al.）1981年（バクテリア細胞／グルタルジアルデヒ
ドにより卵アルブミンとヘテロ架橋）と同様にして行な
うことができる。
et al.）1981年（バクテリア細胞／グルタルジアルデヒ
ドにより卵アルブミンとヘテロ架橋）と同様にして行な
うことができる。
本発明の範囲内において使用することのできる酵素固
定化方法は、バルバリックら（Barbaric et al.）1984
年（インヴェルターゼ／アジピン酸ジヒドラジドで架
橋）、タルスキー及びギアニツオポウロス（Talsky and
Gianitsopoulos）1984年（キモトリプシン／架橋剤の
無い酵素分子間のペプチド結合）、ワークマン及びデイ
（Workman and Day）1984年（イヌリナーゼ／グルタル
ジアルデヒドによる酵素含有細胞の架橋）、ハン及びシ
ジキ（Khan及びSiddiki）1985年（ペプシン／グルタル
ジアルデヒドと架橋）、ハッハマンら（Bachmann et a
l.）1981年（グルコースイソメラーゼ／グルタルジアル
デヒドによりゼラチンとヘテロ架橋）、カウルら（Kaul
et al.）1984年（α−ガラクトシダーゼ／グルタルジ
アルデヒドにより卵アルブミンとヘテロ架橋）によって
記述されている。
定化方法は、バルバリックら（Barbaric et al.）1984
年（インヴェルターゼ／アジピン酸ジヒドラジドで架
橋）、タルスキー及びギアニツオポウロス（Talsky and
Gianitsopoulos）1984年（キモトリプシン／架橋剤の
無い酵素分子間のペプチド結合）、ワークマン及びデイ
（Workman and Day）1984年（イヌリナーゼ／グルタル
ジアルデヒドによる酵素含有細胞の架橋）、ハン及びシ
ジキ（Khan及びSiddiki）1985年（ペプシン／グルタル
ジアルデヒドと架橋）、ハッハマンら（Bachmann et a
l.）1981年（グルコースイソメラーゼ／グルタルジアル
デヒドによりゼラチンとヘテロ架橋）、カウルら（Kaul
et al.）1984年（α−ガラクトシダーゼ／グルタルジ
アルデヒドにより卵アルブミンとヘテロ架橋）によって
記述されている。
マトリックス封入は天然又は合成ポリマー中に生体触
媒を包含させることからなり、それは通常ゼラチン状構
造である。細胞、オルガネラ及び胞子を包含させるのに
特に適しているマトリックス材料は天然ポリマー、例え
ばアルギネート、カラゲーナン、ペクチン、寒天、アガ
ロース又はゼラチンであり、これら化合物は毒性が無
く、取扱い中の細胞を保護するからである。
媒を包含させることからなり、それは通常ゼラチン状構
造である。細胞、オルガネラ及び胞子を包含させるのに
特に適しているマトリックス材料は天然ポリマー、例え
ばアルギネート、カラゲーナン、ペクチン、寒天、アガ
ロース又はゼラチンであり、これら化合物は毒性が無
く、取扱い中の細胞を保護するからである。
また、合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、特
には光架橋樹脂のようなものも適当である。マトリック
ス封入の形状は広い範囲で変更することができ、例えば
球状、円筒状、繊維状及びシート状のものを含んでよ
い。
には光架橋樹脂のようなものも適当である。マトリック
ス封入の形状は広い範囲で変更することができ、例えば
球状、円筒状、繊維状及びシート状のものを含んでよ
い。
天然又は合成マトリックス材料による微生物の固定化
は、マズムダーら（Mazumder et al.）1985年（バクテ
リア細胞／光架橋樹脂）、ベットマン及びレーム（Bett
mann and Rehm）1984年（バクテリア細胞／ポリアクリ
ルアミドヒドラジド）、ウメムラら（Umemura et al.）
1984年（バクテリア細胞／カラゲーナン）、カルベら
（Karube et al.）1985年（バクテリア原形質／寒天−
アセチルセルロース）、カンタレラら（Cantarella et
al.）1984年（酵母細胞／ヒドロキシエチルメタクリレ
ート）、クェレシ及びタムハン（Qureshi and Tamhan
e）1985年（酵母細胞／アルギネート）、デオ及びガウ
ハー（Deo and Gaucher）1984年（叢生菌／カラゲーナ
ン）、アイクマイアー及びレーム（Eikmeier and Reh
m）1984年（叢生菌／アルギネート）、ビハリら（Bihar
i et al.）1984年（ハイフオマイセテス コニディア＜
Hyphomycetes conidia＞／ポリアクリルアミド）、フォ
ーゲル及びブロデリウス（Vogel and Brodelius）1984
年（植物細胞／アルギネート、アガロース）、ナカジマ
ら（NaKajima et al.）1985年（植物細胞／寒天、アル
ギネート、カラゲーナン）に記述されているように行な
うことができる。
は、マズムダーら（Mazumder et al.）1985年（バクテ
リア細胞／光架橋樹脂）、ベットマン及びレーム（Bett
mann and Rehm）1984年（バクテリア細胞／ポリアクリ
ルアミドヒドラジド）、ウメムラら（Umemura et al.）
1984年（バクテリア細胞／カラゲーナン）、カルベら
（Karube et al.）1985年（バクテリア原形質／寒天−
アセチルセルロース）、カンタレラら（Cantarella et
al.）1984年（酵母細胞／ヒドロキシエチルメタクリレ
ート）、クェレシ及びタムハン（Qureshi and Tamhan
e）1985年（酵母細胞／アルギネート）、デオ及びガウ
ハー（Deo and Gaucher）1984年（叢生菌／カラゲーナ
ン）、アイクマイアー及びレーム（Eikmeier and Reh
m）1984年（叢生菌／アルギネート）、ビハリら（Bihar
i et al.）1984年（ハイフオマイセテス コニディア＜
Hyphomycetes conidia＞／ポリアクリルアミド）、フォ
ーゲル及びブロデリウス（Vogel and Brodelius）1984
年（植物細胞／アルギネート、アガロース）、ナカジマ
ら（NaKajima et al.）1985年（植物細胞／寒天、アル
ギネート、カラゲーナン）に記述されているように行な
うことができる。
酵素の固定化は、モリら（Mori et al.）1972年（ア
ミノアシラーゼ／ポリアクリルアミド）と同様にして行
なうことができる。
ミノアシラーゼ／ポリアクリルアミド）と同様にして行
なうことができる。
膜分離（membrane separation）は、反応が進行する
特に限定された領域を作り出すことを含んでいる。膜分
離は基本変形は次の如く区別される： ａ）マイクロカプセル化、 ｂ）リポゾーム法、 ｃ）膜反応器中での生体触媒の使用。
特に限定された領域を作り出すことを含んでいる。膜分
離は基本変形は次の如く区別される： ａ）マイクロカプセル化、 ｂ）リポゾーム法、 ｃ）膜反応器中での生体触媒の使用。
上記固定化方法は、例えば吸着と架橋というように互
に組合わせることができる。その場合、酵素は最初に全
て担体に吸着され、次いで二官能性試薬によって互に架
橋される。
に組合わせることができる。その場合、酵素は最初に全
て担体に吸着され、次いで二官能性試薬によって互に架
橋される。
13β−位にヒドロキシ基を導入するため及び／又は1
4,15−エポキシ化のための式IIIで表わされる化合物と
一緒に本発明の範囲内で使用される生体触媒の培養は応
用微生物学上慣用されているような方法によって行なう
ことができる。
4,15−エポキシ化のための式IIIで表わされる化合物と
一緒に本発明の範囲内で使用される生体触媒の培養は応
用微生物学上慣用されているような方法によって行なう
ことができる。
振盪培養のほかに、微生物学的研究及び工業的生産に
よって長い間に亘って確立されてきた種々の醗酵システ
ムを挙げることができる。
よって長い間に亘って確立されてきた種々の醗酵システ
ムを挙げることができる。
生体反応器の主要課題は、明白なミハエリス定数（Mi
chaelis constants）を減少させるため及び反応速度を
高めるために最適の流体力学状態を作りだすことであ
る。
chaelis constants）を減少させるため及び反応速度を
高めるために最適の流体力学状態を作りだすことであ
る。
これは本質的には生体触媒と周囲媒体との間の適正な
相対移動を維持することで達成され、それは、実際上も
はや妨害物が無い程度まで外部物質移動を増加させる。
相対移動を維持することで達成され、それは、実際上も
はや妨害物が無い程度まで外部物質移動を増加させる。
関連プロセスのために適当な反応器のタイプとして
は、例えば攪拌槽反応器（stirred vessel reactor
s）、ループ型反応器（looptype reactors）、ベッド反
応器（bed reactors）、流動床反応器（fluidised bed
reactors）、膜反応器（membrance reactors）及びまた
多くの特定形状の反応器、例えば篩攪拌反応器（sieve
−stirred reactors）、ロムボイド反応器（rhomboid r
eactors）、チューブ反応器（tubereactors）が特に挙
げられる〔ヴェー．ハートマイヤー（W.Hartmeier）
“イムモービリジールテ ビオカタリザートレン（Immo
bilisierte Biokatalysatoren"1986年；ヴェー．クルー
ガー及びアー．クルーガー（W.Crueger and A.Cruege
r）“ビオテクノロジー−レールブッフ デル アンゲ
ヴァンテン ミクロビオロジー（Biotechnologie−Lehr
buch der angewandten Mikrobiologie"1984年；ペー．
プレーブら（P.Prve et al.）“ハントブック デル
ビオテクノロジー（Handbuch der Biotechnologie）"
1984年〕。
は、例えば攪拌槽反応器（stirred vessel reactor
s）、ループ型反応器（looptype reactors）、ベッド反
応器（bed reactors）、流動床反応器（fluidised bed
reactors）、膜反応器（membrance reactors）及びまた
多くの特定形状の反応器、例えば篩攪拌反応器（sieve
−stirred reactors）、ロムボイド反応器（rhomboid r
eactors）、チューブ反応器（tubereactors）が特に挙
げられる〔ヴェー．ハートマイヤー（W.Hartmeier）
“イムモービリジールテ ビオカタリザートレン（Immo
bilisierte Biokatalysatoren"1986年；ヴェー．クルー
ガー及びアー．クルーガー（W.Crueger and A.Cruege
r）“ビオテクノロジー−レールブッフ デル アンゲ
ヴァンテン ミクロビオロジー（Biotechnologie−Lehr
buch der angewandten Mikrobiologie"1984年；ペー．
プレーブら（P.Prve et al.）“ハントブック デル
ビオテクノロジー（Handbuch der Biotechnologie）"
1984年〕。
本発明の範囲内においては攪拌槽反応器を使用するの
が好ましい。
が好ましい。
種々の反応器の中でも、攪拌槽反応器は醗酵生物工学
の分野で最も多く使用されている。このタイプの反応器
は、基質と生体触媒の迅速かつ充分な混合を確実にし、
結果として高攪拌性能力及び高酸素転移能力が得られ
る。
の分野で最も多く使用されている。このタイプの反応器
は、基質と生体触媒の迅速かつ充分な混合を確実にし、
結果として高攪拌性能力及び高酸素転移能力が得られ
る。
攪拌槽反応器の長所は、その簡単で経済的な構造に、
及びその良く研究された特質に存在する。
及びその良く研究された特質に存在する。
原則的に、攪拌槽反応器が使用される時には二種類の
操作が可能であり、その第一は一括処理タイプの操作プ
ロセス、いわゆるバッチプロセスで、そして第二は連続
プロセスである。
操作が可能であり、その第一は一括処理タイプの操作プ
ロセス、いわゆるバッチプロセスで、そして第二は連続
プロセスである。
バッチプロセスにおいては、ひとたびそのプロセスが
完了すれば、生体触媒は分離又は濾過により除去され、
廃棄（栄養細胞）するかまたは第二バッチで再び使用
（固定化生体触媒）される。
完了すれば、生体触媒は分離又は濾過により除去され、
廃棄（栄養細胞）するかまたは第二バッチで再び使用
（固定化生体触媒）される。
連続プロセスが用いられる場合は、最終反応生成物用
の新たな基質が永続的に交換される。生体触媒は適当な
手段（篩、フィルター、返送装置）によって反応器から
去ることを防がなければならない。
の新たな基質が永続的に交換される。生体触媒は適当な
手段（篩、フィルター、返送装置）によって反応器から
去ることを防がなければならない。
本発明の範囲内における生長微生物細胞の培養は公知
の一般的慣用方法に従って行なわれ、実用性から液体培
地が好ましく用いられる。
の一般的慣用方法に従って行なわれ、実用性から液体培
地が好ましく用いられる。
培地組成物は、使用する微生物に依って変わる。一般
的に僅かに限定された、容易に同化しえる炭素源と窒素
源を有する複合培地が好ましく、例えば抗生物質の生産
にも慣用的に使用されているようなものである。
的に僅かに限定された、容易に同化しえる炭素源と窒素
源を有する複合培地が好ましく、例えば抗生物質の生産
にも慣用的に使用されているようなものである。
加えて、ビタミン及び必須金属イオンが必要である
が、概して使用する複合培地中に成分又は不純物として
適当な濃度で含まれていることが必要である。
が、概して使用する複合培地中に成分又は不純物として
適当な濃度で含まれていることが必要である。
所望により、上記成分、例えば必須ビタミン及びまた
Na+，K+，Ca2+，Mg2+，NH4 ，PO4 3-，SO4 2-，Cl-，CO3
2-イオン及び微量元素のコバルトとマンガン及び亜鉛が
それらの塩の形態で加えられてもよい。
Na+，K+，Ca2+，Mg2+，NH4 ，PO4 3-，SO4 2-，Cl-，CO3
2-イオン及び微量元素のコバルトとマンガン及び亜鉛が
それらの塩の形態で加えられてもよい。
特に、酵母エキス、酵母水解物（yeast hydrolysat
e）、酵母自己分解物（yeast autolysate）及び酵母細
胞以外の適当な窒素源は、大豆粥（soya meal）、モロ
コシ粥（maiz emeal）、オートミール、エダミン（酵素
的に消化させたラクトアルブミン）、ペプトン、カゼイ
ン水解物、コーンスチープリカー及び肉エキスが特に挙
げられる。
e）、酵母自己分解物（yeast autolysate）及び酵母細
胞以外の適当な窒素源は、大豆粥（soya meal）、モロ
コシ粥（maiz emeal）、オートミール、エダミン（酵素
的に消化させたラクトアルブミン）、ペプトン、カゼイ
ン水解物、コーンスチープリカー及び肉エキスが特に挙
げられる。
適当な炭素源は特にはグルコース、ラクトース、スク
ロース、デキストロース、マルトース、澱粉、セレロー
ス、セルロース及び麦芽エキスである。好ましい濃度範
囲は1.0ないし25g/lである。炭素源としてのＤ−グルコ
ース又は溶解性澱粉及びまたセレロースの使用は、後記
ヒドロキシル化／エポキシ化プロセスにとって、特に使
用する微生物がストレプトマイセス属の代表種である場
合に有利である。このように、例えば次の培地がストレ
プトマイセス属の代表種にとってすばらしく適してい
る。
ロース、デキストロース、マルトース、澱粉、セレロー
ス、セルロース及び麦芽エキスである。好ましい濃度範
囲は1.0ないし25g/lである。炭素源としてのＤ−グルコ
ース又は溶解性澱粉及びまたセレロースの使用は、後記
ヒドロキシル化／エポキシ化プロセスにとって、特に使
用する微生物がストレプトマイセス属の代表種である場
合に有利である。このように、例えば次の培地がストレ
プトマイセス属の代表種にとってすばらしく適してい
る。
培地１ 溶解性澱粉 1.0g ペプトン 0.2g 酵母エキス 0.2g 蒸留水を加えて１、NaOHでpH7に調整、 オートクレーブ 培地２ Ｄ−グルコース 5.0g ペプトン 1.0g 酵母エキス 0.1g 蒸留水を加えて１、NaOHでpH7に調整、 オートクレーブ 培地３ セレロース 22.0g オキソ・ラブ・レムコ（Oxo Lab Lemco）（注１） 4.0g ペプトンＣ 5.0g 酵母エキス 0.5g カシトーン（casitone）（注２） 3.0g 塩化ナトリウム 1.5g 蒸留水を加えて１、NaOHでpH7入力調整、 オートクレーブ 注１）オキソイド−ハンドブック（Oxoid Handbuch）、
第２版、1972年。
第２版、1972年。
注２）ディフコ マニュアル（Difco Manual）、第９
版、デトロイト、ディフコ ラボラトリーズ（Difco La
boratories）、1969年。
版、デトロイト、ディフコ ラボラトリーズ（Difco La
boratories）、1969年。
上記培地はまたアスペルギルス属の代表種の培養に、
及びヒドロキシル化及び／又はエポキシ化反応にすばら
しく適している。
及びヒドロキシル化及び／又はエポキシ化反応にすばら
しく適している。
培地組成物についての上記一般的記述、及びまたここ
で詳しく掲げた培地は、両方とも単に本発明を例示する
もので、本質を限定するものではない。
で詳しく掲げた培地は、両方とも単に本発明を例示する
もので、本質を限定するものではない。
培地の組成は別として、培地製造に使用される操作、
例えば特に、溶解又は懸濁順序、栄養液全体の滅菌又は
個々の成分の滅菌、汚染防止等も重要な役目をはたし、
したがって関連する生産プロセスのために最適に活用さ
れるべきである。
例えば特に、溶解又は懸濁順序、栄養液全体の滅菌又は
個々の成分の滅菌、汚染防止等も重要な役目をはたし、
したがって関連する生産プロセスのために最適に活用さ
れるべきである。
滅菌は、培地のpH値の変化及びまた沈殿の原因にもな
りえることに留意すべきである。
りえることに留意すべきである。
その他の培養法もまた微生物培養に慣用されているプ
ロセスと同様である。
ロセスと同様である。
小規模では、本発明の範囲内で行なわれる醗酵は通常
震盪培養の形を取り、その場合は、0.5ないし5l容量の
ガラス製フラスコを使用するのが有利であり、それには
0.1ないし2lの栄養培地を含む。オートクレーブを圧熱
し、pH値をpH4ないしpH8に、特にpH7.0ないしpH7.4（バ
クテリア）に、又はpH6ないしpH7.5（真菌）に調整した
後、相当する培養微生物を無菌条件下でフラスコに接種
する。使用される接種物は、一般的に以下の記述に示さ
れているように保存した接種物から生産された予備培養
菌である。
震盪培養の形を取り、その場合は、0.5ないし5l容量の
ガラス製フラスコを使用するのが有利であり、それには
0.1ないし2lの栄養培地を含む。オートクレーブを圧熱
し、pH値をpH4ないしpH8に、特にpH7.0ないしpH7.4（バ
クテリア）に、又はpH6ないしpH7.5（真菌）に調整した
後、相当する培養微生物を無菌条件下でフラスコに接種
する。使用される接種物は、一般的に以下の記述に示さ
れているように保存した接種物から生産された予備培養
菌である。
培養菌は、好気性条件下、25ないし37℃の温度、特に
28℃の温度で、ロータリー震盪機上、250rpm（回転数／
分）で震盪し続けることで有利に成長する。24時間後、
基質（式IIIで表わされる化合物）を加えるが、微生物
とヒドロキシル化／エポキシ化される物質を互に接触さ
せるためにはどのような方法であってもよい。操作にお
ける実際的な理由のために基質すなわち式IIIで表わさ
れる化合物を培養液中の微生物に加えるのが有利という
ことが証明されている。ヒドロキシル化／エポキシ化さ
れる物質は、例えば粉末形で或は、溶媒例えばジメチル
ホルムアミド、アセトン又はジメチルスルホキシド又は
メタノール、エタノール、第三ブタノールのようなアル
コール性溶媒等に溶けた溶液形（0.5ないし15体積％、
好ましくは２体積％）で使用することができる。
28℃の温度で、ロータリー震盪機上、250rpm（回転数／
分）で震盪し続けることで有利に成長する。24時間後、
基質（式IIIで表わされる化合物）を加えるが、微生物
とヒドロキシル化／エポキシ化される物質を互に接触さ
せるためにはどのような方法であってもよい。操作にお
ける実際的な理由のために基質すなわち式IIIで表わさ
れる化合物を培養液中の微生物に加えるのが有利という
ことが証明されている。ヒドロキシル化／エポキシ化さ
れる物質は、例えば粉末形で或は、溶媒例えばジメチル
ホルムアミド、アセトン又はジメチルスルホキシド又は
メタノール、エタノール、第三ブタノールのようなアル
コール性溶媒等に溶けた溶液形（0.5ないし15体積％、
好ましくは２体積％）で使用することができる。
反応の過程は、微生物学的研究において一般的に使用
されているクロマトグラフィー法によって連続的にモニ
ターされる。
されているクロマトグラフィー法によって連続的にモニ
ターされる。
上記条件下、ストレプトマイセスでは、最適のヒドロ
キシル化又はエポキシ化活性は一般的に２ないし６日培
養後に得られる。微生物のための最適成長条件は、最適
ヒドロキシル化及びエポキシ化条件でもあることが示さ
れている。
キシル化又はエポキシ化活性は一般的に２ないし６日培
養後に得られる。微生物のための最適成長条件は、最適
ヒドロキシル化及びエポキシ化条件でもあることが示さ
れている。
本発明はまた、式IIIで表わされる化合物の13β−位
への立体特異的ヒドロキシ基導入又は14,15−エポキシ
化、或はその両反応を行なうことのできる微生物の培養
に関し、また生体反応器、特に攪拌槽反応器タイプの生
体反応器中での前記化合物を共にしたその培養にも関す
る。
への立体特異的ヒドロキシ基導入又は14,15−エポキシ
化、或はその両反応を行なうことのできる微生物の培養
に関し、また生体反応器、特に攪拌槽反応器タイプの生
体反応器中での前記化合物を共にしたその培養にも関す
る。
現実の製造醗酵槽中での生成物形成の最適比率を確か
めるために、先ず第一に予備培養で微生物を繁殖させる
ことが推奨される。醗酵槽予備培養の数は、おのおのの
特定のケースにおいて最適となる接種物濃度に依存す
る。都合よくは、使用する微生物に依り、醗酵槽段階と
して次の接種物濃度が作られる：バクテリア0.1〜３
％、真菌類５〜10％、アクチノマイセタレス（Actinomy
cetales）５〜10％、胞子懸濁液１〜５×105l/培養液。
めるために、先ず第一に予備培養で微生物を繁殖させる
ことが推奨される。醗酵槽予備培養の数は、おのおのの
特定のケースにおいて最適となる接種物濃度に依存す
る。都合よくは、使用する微生物に依り、醗酵槽段階と
して次の接種物濃度が作られる：バクテリア0.1〜３
％、真菌類５〜10％、アクチノマイセタレス（Actinomy
cetales）５〜10％、胞子懸濁液１〜５×105l/培養液。
小さな醗酵槽（20lまで）の接種は通常、震盪フラス
コ予備培養で行なわれる。この場合、全フラスコ内容物
が醗酵槽に接種するために用いられる。
コ予備培養で行なわれる。この場合、全フラスコ内容物
が醗酵槽に接種するために用いられる。
予備培養菌の生産のために使用される出発物は通常、
例えば凍結乾燥物又は冷凍した若しくは冷却貯蔵された
物の形であってもよい保存接種物である。本発明の範囲
内において使用される保存接種物は凍結乾燥物であるの
が好ましい。
例えば凍結乾燥物又は冷凍した若しくは冷却貯蔵された
物の形であってもよい保存接種物である。本発明の範囲
内において使用される保存接種物は凍結乾燥物であるの
が好ましい。
接種物はロータリー震盪機上のガラス製フラスコ中の
液体培地で、或は、胞子を用いる場合、固体栄養基質上
で繁殖させるのが好ましい。
液体培地で、或は、胞子を用いる場合、固体栄養基質上
で繁殖させるのが好ましい。
栄養基質の条件及び培養パラメータ、例えば特に温
度、pH、酸度導入等は、使用する微生物やプロセスに従
って最適にされていなければならない。保存された接種
物にとっての培養時間は使用する出発物に依って、2,3
時間から数日に変化する 凍結乾燥物 ３〜10日 冷凍保存 バクテリア ４〜18日 アクチノマイセタレス １〜５日 真菌類 １〜７日 冷却貯蔵培養 バクテリア ４〜24日 アクチノマイセタレス １〜３日 真菌類 １〜５日 接種物として、もし胞子が使用されるのなら、先ず第
一にその胞子は標準化状態下（無菌通気、気候室）、固
体栄養基質上で繁殖される。もし、ピート、ぬか、米又
は大麦をベースとした多孔性栄養基質が用いられる場
合、高胞子密度となるように培養物は日ごと徹底して震
盪される。他に、寒天又は他の慣用ゲル化剤により固体
化された栄養培地上で、保護接種物を培養する可能性も
あるが、胞子形成のきっかけとなる栄養培地を使用する
のが好ましい。
度、pH、酸度導入等は、使用する微生物やプロセスに従
って最適にされていなければならない。保存された接種
物にとっての培養時間は使用する出発物に依って、2,3
時間から数日に変化する 凍結乾燥物 ３〜10日 冷凍保存 バクテリア ４〜18日 アクチノマイセタレス １〜５日 真菌類 １〜７日 冷却貯蔵培養 バクテリア ４〜24日 アクチノマイセタレス １〜３日 真菌類 １〜５日 接種物として、もし胞子が使用されるのなら、先ず第
一にその胞子は標準化状態下（無菌通気、気候室）、固
体栄養基質上で繁殖される。もし、ピート、ぬか、米又
は大麦をベースとした多孔性栄養基質が用いられる場
合、高胞子密度となるように培養物は日ごと徹底して震
盪される。他に、寒天又は他の慣用ゲル化剤により固体
化された栄養培地上で、保護接種物を培養する可能性も
あるが、胞子形成のきっかけとなる栄養培地を使用する
のが好ましい。
胞子形成時間は使用する微生物及び使用する栄養培地
に依存し、７ないし30日である。
に依存し、７ないし30日である。
予備培養醗酵槽又は製造醗酵槽に接種するに際し、胞
子は表面活性剤、例えばツイーン80と懸濁され、そして
栄養培地と一緒に醗酵槽に移されるか、又は、もし固体
栄養培地が用いられる場合、同様に上記表面活性剤を用
いて固体栄養基質を洗い落とすかする。この方法によっ
て得られた胞子含有液は次いで醗酵槽へ接種するのに使
用される。好ましくは、胞子の回収及び醗酵槽の接種は
無菌条件下で行なわれる。
子は表面活性剤、例えばツイーン80と懸濁され、そして
栄養培地と一緒に醗酵槽に移されるか、又は、もし固体
栄養培地が用いられる場合、同様に上記表面活性剤を用
いて固体栄養基質を洗い落とすかする。この方法によっ
て得られた胞子含有液は次いで醗酵槽へ接種するのに使
用される。好ましくは、胞子の回収及び醗酵槽の接種は
無菌条件下で行なわれる。
本発明の範囲内では式Ｉ及びIIで表わされる化合物を
製造するために、約0.001m3ないし450m3の容量を有する
種々の寸法の生体反応器が、必要な生産量に依って使用
されてよい。
製造するために、約0.001m3ないし450m3の容量を有する
種々の寸法の生体反応器が、必要な生産量に依って使用
されてよい。
もし攪拌槽生体反応器が使用される場合、反応過程を
最適にするための限界として、以下の醗酵パラメータが
考慮されるべきである。
最適にするための限界として、以下の醗酵パラメータが
考慮されるべきである。
1.温度：本発明の範囲内での微生物によるヒドロキシル
化及び／又はエポキシ化反応は、中温性の温度範囲（20
ないし45℃の温度範囲）で行なうのが好ましい。成育及
び生成物形成のための最適温度範囲は20ないし32℃、特
に24ないし30℃である。
化及び／又はエポキシ化反応は、中温性の温度範囲（20
ないし45℃の温度範囲）で行なうのが好ましい。成育及
び生成物形成のための最適温度範囲は20ないし32℃、特
に24ないし30℃である。
2.通気：通気割合は0.1ないし1.0vvm（空気体積／液体
積・分）、好ましくは0.3ないし0.6vvmである。必要に
より、通気割合は、醗酵過程中の後天的O2要求量に適合
させなければならない。
積・分）、好ましくは0.3ないし0.6vvmである。必要に
より、通気割合は、醗酵過程中の後天的O2要求量に適合
させなければならない。
3.圧力：攪拌槽反応器は一般的に汚染の危険を少なくす
るために、0.2ないし0.5barの僅かに過剰の圧力下で操
作される。
るために、0.2ないし0.5barの僅かに過剰の圧力下で操
作される。
4.pH値:pH値は使用する微生物に依って或る範囲内で変
化してもよい。アクチノマイセテスから選ばれる微生物
を用いる場合、初期pH値はpH6ないしpH8であり、pH7な
いしpH7.4が好ましい。
化してもよい。アクチノマイセテスから選ばれる微生物
を用いる場合、初期pH値はpH6ないしpH8であり、pH7な
いしpH7.4が好ましい。
もし真菌類、特にモニリアレス（Moniliales）群から
選ばれる真菌を使用する場合、培養液の初期pH値はpH4
ないしpH8が好ましく、特にpH6ないしpH7.5が好まし
い。
選ばれる真菌を使用する場合、培養液の初期pH値はpH4
ないしpH8が好ましく、特にpH6ないしpH7.5が好まし
い。
5.攪拌：攪拌速度は、使用する攪拌機のタイプ及び醗酵
槽の大きさに依存する。本発明の範囲内においては、デ
ィスク型の羽根を備えた攪拌機が好ましく、該攪拌機
は、0.002m3の攪拌槽反応器であれば250rpmないし450rp
m、特には350rpmないし400rpmの速度で操作される。
槽の大きさに依存する。本発明の範囲内においては、デ
ィスク型の羽根を備えた攪拌機が好ましく、該攪拌機
は、0.002m3の攪拌槽反応器であれば250rpmないし450rp
m、特には350rpmないし400rpmの速度で操作される。
本発明の範囲内において、醗酵期間は使用する微生物
に依って５ないし10日と変わる。初めに加えられた基質
（式IIIで表わされる化合物）の大部分（80〜99％）
が、式Ｉ又はIIで表わされる化合物またはこの２化合物
の混合物に変換されたとき、醗酵は中止される。
に依って５ないし10日と変わる。初めに加えられた基質
（式IIIで表わされる化合物）の大部分（80〜99％）
が、式Ｉ又はIIで表わされる化合物またはこの２化合物
の混合物に変換されたとき、醗酵は中止される。
ヒドロキシル化及び／又はエポキシ化反応の終了最適
時を確かめるため、醗酵全体を通じて反応過程が慣用分
析法、特に例えばHPLC又は薄層クロマトグラフィー法の
ようなクロマトグラフィー法によってモニターされる。
時を確かめるため、醗酵全体を通じて反応過程が慣用分
析法、特に例えばHPLC又は薄層クロマトグラフィー法の
ようなクロマトグラフィー法によってモニターされる。
ヒドロキシル化又はエポキシ化生成物、或はその両化
合物の混合物を回収するために、醗酵ブロスの処置は、
醗酵技術分野で慣用されている方法〔ヴェー．クルーガ
ー及びアー．クルーガー（W.Crueger and A.Crueger）1
984年；ペー．プレーベ（P.Prve）1984年〕によって
行なうことができる。
合物の混合物を回収するために、醗酵ブロスの処置は、
醗酵技術分野で慣用されている方法〔ヴェー．クルーガ
ー及びアー．クルーガー（W.Crueger and A.Crueger）1
984年；ペー．プレーベ（P.Prve）1984年〕によって
行なうことができる。
先ず第一に、粒子成分がフィルター、遠心分離機又は
セパレータを用いて醗酵ブロスから除去される。
セパレータを用いて醗酵ブロスから除去される。
もし生長細胞が使用されるなら、細胞内に存在する生
成物の部分を回収しなければならない。この目的のため
機械的、熱的、化学的又は酵素的方法に基づく様々な細
胞崩壊方法が役に立つ。
成物の部分を回収しなければならない。この目的のため
機械的、熱的、化学的又は酵素的方法に基づく様々な細
胞崩壊方法が役に立つ。
本発明方法において使用に適する機械的方法は、例え
ば攪拌ボールミル又はコロイドミル中での粉砕、ホモジ
ナイザー中での圧力及び緩和の利用、及び超音波の作用
による細胞の崩壊である。非機械的方法には、乾燥によ
る細胞崩壊、浸透性ショックによる細胞分解、化学的自
己分解及び細胞の酵素分解が含まれる。
ば攪拌ボールミル又はコロイドミル中での粉砕、ホモジ
ナイザー中での圧力及び緩和の利用、及び超音波の作用
による細胞の崩壊である。非機械的方法には、乾燥によ
る細胞崩壊、浸透性ショックによる細胞分解、化学的自
己分解及び細胞の酵素分解が含まれる。
ひとたび粒子成分が除去されると、反応生成物は培養
液及び分離された細胞質状成分を抽出することにより濃
縮される。抽出するためにも、例えば特に混合沈殿器、
向流カラム、抽出遠心機のような醗酵技術分野で慣用さ
れている多くの補助器具が利用できる。
液及び分離された細胞質状成分を抽出することにより濃
縮される。抽出するためにも、例えば特に混合沈殿器、
向流カラム、抽出遠心機のような醗酵技術分野で慣用さ
れている多くの補助器具が利用できる。
また例えば特に膜濾過、限外濾過、凍結濃縮、イオン
交換方法によって反応生成物を濃縮することも可能であ
る。
交換方法によって反応生成物を濃縮することも可能であ
る。
抽出後に得られた粗成生物の次の処置は、微生物学的
及び化学的研究により及び工業的応用により十分に確立
された方法によって行なうことができる。
及び化学的研究により及び工業的応用により十分に確立
された方法によって行なうことができる。
これらの方法には、例えば吸着クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフ
ィー、親和力クロマトグラフィー（affinity chromatog
raphy）、疎水クロマトグラフィー（hydrophobic chrom
atography）、分配クロマトグラフィー、共有クロマト
グラフィー（covalent chromatography）等のようなク
ロマトグラフィー法が含まれるが、これらに加えて種々
の結晶化法も含まれる。
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフ
ィー、親和力クロマトグラフィー（affinity chromatog
raphy）、疎水クロマトグラフィー（hydrophobic chrom
atography）、分配クロマトグラフィー、共有クロマト
グラフィー（covalent chromatography）等のようなク
ロマトグラフィー法が含まれるが、これらに加えて種々
の結晶化法も含まれる。
既に初めの方で記したように、本発明方法は式Ｉで表
わされる化合物と式IIで表わされる化合物の両方の化合
物を生成する。一般的にヒドロキシル化された化合物と
エポキシ化された化合物の混合物が得られ、そのヒドロ
キシ化合物とエポキシ化合物の比は、微生物、出発物質
及び反応条件（培養液、有機溶媒、基質の添加割合、通
気）の選択によって影響されえる。混合物中に存在する
化合物はＣ−13,C−14及びＣ−15原子領域でのみ異な
り： そして、その他に分子構造に違いは無い。ヒドロキシル
化された化合物（Ｉ）及びエポキシ化された化合物（I
I）は既述したように容易に互に単離及び分離すること
ができ、または（II）を（Ｉ）に変換することもでき
る。
わされる化合物と式IIで表わされる化合物の両方の化合
物を生成する。一般的にヒドロキシル化された化合物と
エポキシ化された化合物の混合物が得られ、そのヒドロ
キシ化合物とエポキシ化合物の比は、微生物、出発物質
及び反応条件（培養液、有機溶媒、基質の添加割合、通
気）の選択によって影響されえる。混合物中に存在する
化合物はＣ−13,C−14及びＣ−15原子領域でのみ異な
り： そして、その他に分子構造に違いは無い。ヒドロキシル
化された化合物（Ｉ）及びエポキシ化された化合物（I
I）は既述したように容易に互に単離及び分離すること
ができ、または（II）を（Ｉ）に変換することもでき
る。
式Ｉ及びIIの範囲内の新規オキシムを含む式Ｉ及びII
で表わされる化合物は、動物の外部寄生生物を含む動物
及び植物の有害生物を防除するのに非常に適している。
これらの後述した有害生物とは、ダニ目の生物、特にマ
ダニ科（Ixodidae）、ワクモ科（Dermanyssidae）、ヒ
ゼンダニ科（Sarcoptidae）、ブソロプチド科（Psoropt
idae）に属する有害生物；マロフアガ（Mallophaga）、
シフオナプテラ（Siphonaptera）、アノプルラ（Anoplu
ra）目（例えばヘマトピニド科（Haematopinidae）のも
の）及び双翅目（Diptera）、特にイエバエ科（Muscida
e）、クロバエ科（Calliphoridae）、ヒツジバエ科（Oe
sterridae）、アブ科（Tabanidae）、シラミバエ科（Hi
ppoboscidae）及びウマバエ科（Gastrophilidae）に属
する有害生物を包含する。
で表わされる化合物は、動物の外部寄生生物を含む動物
及び植物の有害生物を防除するのに非常に適している。
これらの後述した有害生物とは、ダニ目の生物、特にマ
ダニ科（Ixodidae）、ワクモ科（Dermanyssidae）、ヒ
ゼンダニ科（Sarcoptidae）、ブソロプチド科（Psoropt
idae）に属する有害生物；マロフアガ（Mallophaga）、
シフオナプテラ（Siphonaptera）、アノプルラ（Anoplu
ra）目（例えばヘマトピニド科（Haematopinidae）のも
の）及び双翅目（Diptera）、特にイエバエ科（Muscida
e）、クロバエ科（Calliphoridae）、ヒツジバエ科（Oe
sterridae）、アブ科（Tabanidae）、シラミバエ科（Hi
ppoboscidae）及びウマバエ科（Gastrophilidae）に属
する有害生物を包含する。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物は衛生害虫、特に双翅
目（ニクバエ科（Sarcophagidae）、イノフイリダエ科
（Anophilidae）及びクリシダエ科（Culicidae）に属す
るもの）の害虫、直翅目（Orthoptera）、網翅目（Dict
yoptera）（例えばゴキブリ科（Blattidae）のもの）及
び膜翅目（Hymenoptera）（例えばアリ科（Formicida
e）のもの）の害虫に対しても使用することができる。
目（ニクバエ科（Sarcophagidae）、イノフイリダエ科
（Anophilidae）及びクリシダエ科（Culicidae）に属す
るもの）の害虫、直翅目（Orthoptera）、網翅目（Dict
yoptera）（例えばゴキブリ科（Blattidae）のもの）及
び膜翅目（Hymenoptera）（例えばアリ科（Formicida
e）のもの）の害虫に対しても使用することができる。
式Ｉ及びIIの化合物はまた植物に寄生するダニ及び昆
虫に対し永続する効力をもっている。ダニ目のハダニ類
を防除する為に使用すると、ハダニ科〔テトラニクス
（Tetranichs spp）類及びパノニクス（Panonychus sp
p.）類の卵、さなぎ及び成虫に対して有効である。
虫に対し永続する効力をもっている。ダニ目のハダニ類
を防除する為に使用すると、ハダニ科〔テトラニクス
（Tetranichs spp）類及びパノニクス（Panonychus sp
p.）類の卵、さなぎ及び成虫に対して有効である。
これら化合物は同翅目（Homoptera）の吸液昆虫、特
にアブラムシ科（Aphididae）ウンカ科（Delphacida
e）、ヒメヨコバイ科（Cicadellidae）、キジラミ科（P
syllidae）、ロシダエ（Loccidae）、マルカイガラムシ
科（Diaspididae）及びエリオフイダエ（Eriophyidae）
（例えばレモン果実上のサビマイト）の有害生物に対
し、また半翅目（Hemiptera）、異翅亜目（Heteropter
a）及びアザミウマ目（Thysanoptera）の有害生物に対
しても良好な効果を示し鱗翅目（Lepidptera）鞘翅目
（Coleoptera）、双翅目（Diptera）及び直翅目（Ortho
ptera）の植物食害昆虫に対しても良好な効果を有す
る。
にアブラムシ科（Aphididae）ウンカ科（Delphacida
e）、ヒメヨコバイ科（Cicadellidae）、キジラミ科（P
syllidae）、ロシダエ（Loccidae）、マルカイガラムシ
科（Diaspididae）及びエリオフイダエ（Eriophyidae）
（例えばレモン果実上のサビマイト）の有害生物に対
し、また半翅目（Hemiptera）、異翅亜目（Heteropter
a）及びアザミウマ目（Thysanoptera）の有害生物に対
しても良好な効果を示し鱗翅目（Lepidptera）鞘翅目
（Coleoptera）、双翅目（Diptera）及び直翅目（Ortho
ptera）の植物食害昆虫に対しても良好な効果を有す
る。
それらはまた土中の有害生物に対して使用する為にも
適している。
適している。
従って式Ｉ及びIIの化合物は、穀物、棉、稲、とうも
ろこし、大豆、じゃがいも、野菜、果物、タバコ、ホッ
プ、ミカン類、アボガド及びその他のような作物中の吸
液害虫及び食害昆虫のすべての発達段階に対して有効で
ある。
ろこし、大豆、じゃがいも、野菜、果物、タバコ、ホッ
プ、ミカン類、アボガド及びその他のような作物中の吸
液害虫及び食害昆虫のすべての発達段階に対して有効で
ある。
式Ｉ及びIIの化合物はまた植物線虫類、メロイドギネ
科（Meloidogyne）、ヘテロデラ科（Heterodera）、プ
ラチレンクス科（Pratylenchus）、ジチレンクス科（Di
tylenchus）、ラドルフアス科（Radolphus）、リゾグリ
フアス科（Rhizoglyphus）及びその他の科に属する種の
線虫に対しても有効である。
科（Meloidogyne）、ヘテロデラ科（Heterodera）、プ
ラチレンクス科（Pratylenchus）、ジチレンクス科（Di
tylenchus）、ラドルフアス科（Radolphus）、リゾグリ
フアス科（Rhizoglyphus）及びその他の科に属する種の
線虫に対しても有効である。
しかしながら、特にそれら化合物は、寄生虫、特に哺
乳動物及び鳥、例えばヒツジ、豚、山羊、ウシ、ウマ、
ロバ、犬、猫、モルモット、飼育小鳥などの病気を起す
原因となりうる内部寄生線虫に対して作用を有する。こ
のような線虫の代表的なものを上げると、ヘモンクス
（Haemonchus）、トリコストロンギルス（Trichostrong
ylus）、オステルタギア（Ostertagia）、ネマトデイル
ス（Nematodirus）、コーペリア（Cooperia）、アスカ
リス（Ascaris）、ブノストマム（Bunostomum）、エス
フアゴストマム（Oesphagostomum）、チヤベルテイア
（Chabertia）、トリクリス（Trichuris）、ストロンギ
リス（Strongylus）、トリコネア（Trichonema）ジクチ
オカウルス（Dictyocaulus）、カピラリア（Cappillari
a）、ヘテラキス（Heterakis）、トクソカラ（Toxocar
a）、アスカリデイア（Ascaridia）、オキシウリス（Ox
yuris）、アンシロストマ（Ancylnstoma）、ウンシナリ
ア（Uncinaria）、トキサスカリス（Toxascaris）及び
パラスカリス（Parascaris）である。式Ｉ及びIIの化合
物の特に有利な点は、ベンズイミダゾール系殺寄生虫剤
に対して耐性である寄生虫に対しても有効であることで
ある。
乳動物及び鳥、例えばヒツジ、豚、山羊、ウシ、ウマ、
ロバ、犬、猫、モルモット、飼育小鳥などの病気を起す
原因となりうる内部寄生線虫に対して作用を有する。こ
のような線虫の代表的なものを上げると、ヘモンクス
（Haemonchus）、トリコストロンギルス（Trichostrong
ylus）、オステルタギア（Ostertagia）、ネマトデイル
ス（Nematodirus）、コーペリア（Cooperia）、アスカ
リス（Ascaris）、ブノストマム（Bunostomum）、エス
フアゴストマム（Oesphagostomum）、チヤベルテイア
（Chabertia）、トリクリス（Trichuris）、ストロンギ
リス（Strongylus）、トリコネア（Trichonema）ジクチ
オカウルス（Dictyocaulus）、カピラリア（Cappillari
a）、ヘテラキス（Heterakis）、トクソカラ（Toxocar
a）、アスカリデイア（Ascaridia）、オキシウリス（Ox
yuris）、アンシロストマ（Ancylnstoma）、ウンシナリ
ア（Uncinaria）、トキサスカリス（Toxascaris）及び
パラスカリス（Parascaris）である。式Ｉ及びIIの化合
物の特に有利な点は、ベンズイミダゾール系殺寄生虫剤
に対して耐性である寄生虫に対しても有効であることで
ある。
ネマトディルス、コーペリアおよびエスファゴストマ
ム属のある種は宿主動物の腸管を攻撃し、一方ヘモンク
スおよびオステルタギア属のある種は胃に、そしてジク
チオカウルス属のある種は肺組織に寄生する。フィラリ
イダエ（Filariidae）およびセタリイダエ（Setariida
e）属の寄生体は内部細胞組織および内部器官、例えば
心臓、血管、リンパ管内および皮下組織内に見られる。
これに関連して、イヌの心臓寄生虫、ジロフィラリア・
イミチス（Dirofilaria immitis）を特に記載する。式
ＩおよびIIの化合物はこれらの寄生体に対して非常に有
効である。
ム属のある種は宿主動物の腸管を攻撃し、一方ヘモンク
スおよびオステルタギア属のある種は胃に、そしてジク
チオカウルス属のある種は肺組織に寄生する。フィラリ
イダエ（Filariidae）およびセタリイダエ（Setariida
e）属の寄生体は内部細胞組織および内部器官、例えば
心臓、血管、リンパ管内および皮下組織内に見られる。
これに関連して、イヌの心臓寄生虫、ジロフィラリア・
イミチス（Dirofilaria immitis）を特に記載する。式
ＩおよびIIの化合物はこれらの寄生体に対して非常に有
効である。
それらはまた、ヒトの病因性寄生体の防除にも適して
おり、それらの寄生体の中で消化管に発生する典型例と
して、アンシロストマ（Ancylostoma）、ネカトール（N
ecator）、アスカリス（Ascaris）、ストロンギイロイ
デス（Strongyloides）、トリチネラ（Trichinella）、
カピラリア（Capillaria）、トリクリス（Trichuris）
およびエンテロピウス（Enterobius）種の寄生体を挙げ
ることができる。本発明の化合物は血液、組織および種
々の器官に存在するフィラリイダエ属のウチエレリア
（Wuchereria）、ブルギア（Brugia）、オンコセルカ
（Onchocerca）およびロア（Loa）種の寄生体に対して
も有効であり、そしてさらに、ドラクンクルス（Dracun
culus）、そして特に胃腸管にはびこるストロンギロイ
デスおよびトリチネラ種の寄生体に対して有効である。
おり、それらの寄生体の中で消化管に発生する典型例と
して、アンシロストマ（Ancylostoma）、ネカトール（N
ecator）、アスカリス（Ascaris）、ストロンギイロイ
デス（Strongyloides）、トリチネラ（Trichinella）、
カピラリア（Capillaria）、トリクリス（Trichuris）
およびエンテロピウス（Enterobius）種の寄生体を挙げ
ることができる。本発明の化合物は血液、組織および種
々の器官に存在するフィラリイダエ属のウチエレリア
（Wuchereria）、ブルギア（Brugia）、オンコセルカ
（Onchocerca）およびロア（Loa）種の寄生体に対して
も有効であり、そしてさらに、ドラクンクルス（Dracun
culus）、そして特に胃腸管にはびこるストロンギロイ
デスおよびトリチネラ種の寄生体に対して有効である。
式Ｉ及びIIの化合物はそのままの形態で、或いは好ま
しくは製剤技術で慣用の補助剤と共に組成物として使用
され、公知の方法により乳剤原液、直接噴霧可能なまた
は希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、粉剤、
粒剤、および例えばポリマー物質によるカプセル化剤に
製剤化される。組成物の性質と同様、噴霧、散布、散水
または注水のような適用法は、目的とする対象および使
用環境に依存して選ばれる。
しくは製剤技術で慣用の補助剤と共に組成物として使用
され、公知の方法により乳剤原液、直接噴霧可能なまた
は希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、粉剤、
粒剤、および例えばポリマー物質によるカプセル化剤に
製剤化される。組成物の性質と同様、噴霧、散布、散水
または注水のような適用法は、目的とする対象および使
用環境に依存して選ばれる。
式Ｉ及びIIの化合物は温血動物に対し体重1kg当り0.0
1ないし10mgの割合で投与し、閉鎖された作付地域、囲
い、家畜小屋または他の建物に対し１ヘクタール当り10
gないし1000gの割合で施用する。
1ないし10mgの割合で投与し、閉鎖された作付地域、囲
い、家畜小屋または他の建物に対し１ヘクタール当り10
gないし1000gの割合で施用する。
製剤、即ち式Ｉ又はIIで表わされる有効成分を含む或
はその両成分を含む組成物、配合物または混合物は、公
知の方法により、例えば有効成分を溶媒、固体担体およ
び適当な場合には表面活性化合物（界面活性剤）のよう
な増量剤と均一に混合および／または摩砕することによ
り、製造される。
はその両成分を含む組成物、配合物または混合物は、公
知の方法により、例えば有効成分を溶媒、固体担体およ
び適当な場合には表面活性化合物（界面活性剤）のよう
な増量剤と均一に混合および／または摩砕することによ
り、製造される。
適当な溶媒は次のものである：芳香族炭化水素、好ま
しくは炭素原子数８ないし12の部分、例えばキシレン混
合物または置換ナフタレン；ジブチルフタレートまたは
ジオクチルフタレートのようなフタレート；シクロヘキ
サンまたはパラフインのような脂肪族炭化水素；エタノ
ール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメ
チルまたはモノエチルエーテルのようなアルコールおよ
びグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステル；
シクロヘキサノンのようなケトン;N−メチル−２−ピロ
リドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムア
ミドのような強極性溶媒；並びにエポキシ化ココナッツ
油または大豆油のようなエポキシ化植物油；または水。
しくは炭素原子数８ないし12の部分、例えばキシレン混
合物または置換ナフタレン；ジブチルフタレートまたは
ジオクチルフタレートのようなフタレート；シクロヘキ
サンまたはパラフインのような脂肪族炭化水素；エタノ
ール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメ
チルまたはモノエチルエーテルのようなアルコールおよ
びグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステル；
シクロヘキサノンのようなケトン;N−メチル−２−ピロ
リドン、ジメチルスルホキシドまたはジメチルホルムア
ミドのような強極性溶媒；並びにエポキシ化ココナッツ
油または大豆油のようなエポキシ化植物油；または水。
例えば粉剤および分散性粉末に使用できる固体担体は
通常、方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトま
たはアタパルジャイトのような天然鉱物充填剤である。
物性を改良するために、高分散ケイ酸また高分散吸収性
ポリマーを加えることも可能である。適当な粒状化吸収
性担体は多孔性型のもので、例えば軽石、破砕レンガ、
カピオライトまたはベントナイトであり；そして適当な
非吸収性担体は方解石または砂のような物質である。更
に非常に多くの予備粒状化した無機質および有機質の物
質、特にドロマイトまたは粉状化植物残骸、が使用し得
る。
通常、方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイトま
たはアタパルジャイトのような天然鉱物充填剤である。
物性を改良するために、高分散ケイ酸また高分散吸収性
ポリマーを加えることも可能である。適当な粒状化吸収
性担体は多孔性型のもので、例えば軽石、破砕レンガ、
カピオライトまたはベントナイトであり；そして適当な
非吸収性担体は方解石または砂のような物質である。更
に非常に多くの予備粒状化した無機質および有機質の物
質、特にドロマイトまたは粉状化植物残骸、が使用し得
る。
製剤化すべき有効成分の性質によるが、適当な表面活
性化合物は良好な乳化性、分散性および湿潤性を有する
非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面
活性剤である。
性化合物は良好な乳化性、分散性および湿潤性を有する
非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面
活性剤である。
“界面活性剤”の用語は界面活性剤の混合物をも含むも
のと理解されたい。
のと理解されたい。
適当なアニオン性界面活性剤は、水溶性石ケンおよび
水溶性合成表面活性化合物の両者であり得る。
水溶性合成表面活性化合物の両者であり得る。
適当な石鹸は高級脂肪酸（C10〜C22）のアルカリ金属
塩、アルカリ土類金属塩、または非置換または置換のア
ンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステアリン酸、
或いは例えばココナッツ油または獣脂から得られる天然
脂肪酸混合物のナトリウムまたはカリウム塩である。脂
肪酸メチルタウリン塩もまた用い得る。
塩、アルカリ土類金属塩、または非置換または置換のア
ンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステアリン酸、
或いは例えばココナッツ油または獣脂から得られる天然
脂肪酸混合物のナトリウムまたはカリウム塩である。脂
肪酸メチルタウリン塩もまた用い得る。
しかしながら、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪族
スルホネート、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズ
イミダゾール誘導体またはアルキルアリールスルホネー
ト、が更に頻繁に使用される。
スルホネート、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズ
イミダゾール誘導体またはアルキルアリールスルホネー
ト、が更に頻繁に使用される。
脂肪族スルホネートまたはサルフェートは通常アルカ
リ金属塩、アルカリ土類金属塩或いは非置換または置換
のアンモニウム塩の形態にあり、そしてアシル基のアル
キル部分をも含む炭素原子数８ないし22のアルキル基を
含み、例えばリグノスルホン酸、ドデシルサルフェート
または天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフ
ェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩であ
る。これらの化合物には硫酸エステルの塩および脂肪族
アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の塩
も含まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、
好ましくは二つのスルホン酸基と８ないし22個の炭素原
子を含み一つの脂肪酸基とを含む。アルキルアリールス
ルホネートの例は、ナフタレンスルホン酸／ホルムアル
デヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはトリ
エタノールアミン塩である。対応するホスフェート、例
えば４ないし14モルのエチレン オキシドを含むｐ−ノ
ニルフェノール付加物のリン酸エステルの塩、またはリ
ン脂質もまた適当である。
リ金属塩、アルカリ土類金属塩或いは非置換または置換
のアンモニウム塩の形態にあり、そしてアシル基のアル
キル部分をも含む炭素原子数８ないし22のアルキル基を
含み、例えばリグノスルホン酸、ドデシルサルフェート
または天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフ
ェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩であ
る。これらの化合物には硫酸エステルの塩および脂肪族
アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の塩
も含まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、
好ましくは二つのスルホン酸基と８ないし22個の炭素原
子を含み一つの脂肪酸基とを含む。アルキルアリールス
ルホネートの例は、ナフタレンスルホン酸／ホルムアル
デヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはトリ
エタノールアミン塩である。対応するホスフェート、例
えば４ないし14モルのエチレン オキシドを含むｐ−ノ
ニルフェノール付加物のリン酸エステルの塩、またはリ
ン脂質もまた適当である。
製剤業界で慣用の界面活性剤は例えば下記の刊行物に
記載されている：“マクカツチヤンズデタージエンツ
アンド エマルジフアイアーズ アニュアル（Mc Cutch
eon′s Detergents and Emulsifiers Annual）".マニュ
ファクチュアリング コンフェクショナー出版社（Manu
facturing Confectioner Pub.Co.）、グレン ロック
（Glen Rock）、ニュージャージー州、1986年。
記載されている：“マクカツチヤンズデタージエンツ
アンド エマルジフアイアーズ アニュアル（Mc Cutch
eon′s Detergents and Emulsifiers Annual）".マニュ
ファクチュアリング コンフェクショナー出版社（Manu
facturing Confectioner Pub.Co.）、グレン ロック
（Glen Rock）、ニュージャージー州、1986年。
殺虫剤組成物は通常、式Ｉ又はIIの化合物、或はその
両者の混合物0.01ないし95％、好ましくは0.1ないし80
％、固体または液体補助剤５ないし99.99％、および界
面活性剤０ないし25％、好ましくは0.1ないし25％を含
む。もし化合物Ｉと化合物IIの混合物が使用される場
合、それらI:IIの比は通常99.9:0.1ないし0.1:99.9であ
る。
両者の混合物0.01ないし95％、好ましくは0.1ないし80
％、固体または液体補助剤５ないし99.99％、および界
面活性剤０ないし25％、好ましくは0.1ないし25％を含
む。もし化合物Ｉと化合物IIの混合物が使用される場
合、それらI:IIの比は通常99.9:0.1ないし0.1:99.9であ
る。
商業製品は濃厚物として製剤化されるのが好ましい
が、最終使用者は通常１ないし10,000ppmの濃度の希釈
剤として使用する。
が、最終使用者は通常１ないし10,000ppmの濃度の希釈
剤として使用する。
従って本発明は、有効成分として式Ｉ又はIIの化合物
の少なくとも一つ或は両化合物の混合物を通常の担体お
よび／又は分散剤と共に含む有害生物防除用組成物にも
関する。
の少なくとも一つ或は両化合物の混合物を通常の担体お
よび／又は分散剤と共に含む有害生物防除用組成物にも
関する。
該組成物は、特別の効果を得るために安定剤、消泡
剤、粘度調整剤、結合剤、粘着付与剤並びに肥料又は他
の活性成分のような別の成分をも含み得る。
剤、粘度調整剤、結合剤、粘着付与剤並びに肥料又は他
の活性成分のような別の成分をも含み得る。
製造実施例 実施例H1.ストレプトマイセス ヴィオラセンス予備
培養菌の製造 ストレプトマイセス ヴィオラセンス（ATCC31560）
の凍結乾燥サンプルを、50ml震盪フラスコ中の培地20ml
に加え、全体を28℃及び250rpmで72時間培養する。続い
てこの最初の予備培養物2mlを、500ml震盪フラスコ中、
200mlの栄養液体培地１とともに28℃及び250rpmで48時
間培養する。
培養菌の製造 ストレプトマイセス ヴィオラセンス（ATCC31560）
の凍結乾燥サンプルを、50ml震盪フラスコ中の培地20ml
に加え、全体を28℃及び250rpmで72時間培養する。続い
てこの最初の予備培養物2mlを、500ml震盪フラスコ中、
200mlの栄養液体培地１とともに28℃及び250rpmで48時
間培養する。
同様の方法により、培地1,2及び３を用いてストレプ
トマイセス ビオラセンス（ATCC31560）、ストレプト
マイセス ジアスタトクロモゲネス（S.diastatochromo
genes）（ATCC31561）及びアクチノマイセテスニガー
（A.niger）（ATCC20567）の予備培養菌を製造すること
もできる。
トマイセス ビオラセンス（ATCC31560）、ストレプト
マイセス ジアスタトクロモゲネス（S.diastatochromo
genes）（ATCC31561）及びアクチノマイセテスニガー
（A.niger）（ATCC20567）の予備培養菌を製造すること
もできる。
実施例H2:震盪フラスコ中でのミルベマイシンA4のヒド
ロキシル化のための培養条件 450mlの培地２中の、実施例H1で製造された２日齢の
ストレプトマイセス ヴィオラセンス予備培養菌にミル
ベマイシンA40.2gを加え、全体を28℃、250rpmで震盪す
る。反応の過程をHPLC（高圧液体クロマトグラフィー）
（カラム25cm/0.5cm、溶離剤ヘキサン／ジメトキシエタ
ン3:1、1ml/分、UV検出器220nm）によりモニターする。
４日間震盪後及び転化率37％で、70％の13β−ヒドロキ
シミルベマイシンA4及び30％の14,15−エポキシミルベ
マイシンA4が得られる。
ロキシル化のための培養条件 450mlの培地２中の、実施例H1で製造された２日齢の
ストレプトマイセス ヴィオラセンス予備培養菌にミル
ベマイシンA40.2gを加え、全体を28℃、250rpmで震盪す
る。反応の過程をHPLC（高圧液体クロマトグラフィー）
（カラム25cm/0.5cm、溶離剤ヘキサン／ジメトキシエタ
ン3:1、1ml/分、UV検出器220nm）によりモニターする。
４日間震盪後及び転化率37％で、70％の13β−ヒドロキ
シミルベマイシンA4及び30％の14,15−エポキシミルベ
マイシンA4が得られる。
後処理のため、ジエチルエーテル（Et2O）200mlを反
応混合物に加え、全体をHyflo Supercel 〔スーパーセ
ル（Super Cel）；珪藻土、精製及び燬焼物；主要粒子
サイズ２〜25μ;Flvka Katalog No.56678〕に通して濾
過する。濾過残渣を注意深くEt2O100mlで洗浄する。水
相を各々Et2O200mlで２度抽出する。合わせたエーテル
相をMgSO4で乾燥し減圧濃縮する。得られた粗生成物
（0.21g）をSiO2（シリカゲル60,0.040〜0.063mm）上に
ヘキサン／酢酸エチル1:1でクロマトグラフィーにかけ
〔ダブリュ．クラーク・スチルら（W.Clark−Still et
al.）、ジャーナル オブ オルガニック ケミストリ
ー（J.Org.Chem.）第43巻、第2923頁、1978年〕個々の
生成物を300MHz 1H−NMRで確認する。
応混合物に加え、全体をHyflo Supercel 〔スーパーセ
ル（Super Cel）；珪藻土、精製及び燬焼物；主要粒子
サイズ２〜25μ;Flvka Katalog No.56678〕に通して濾
過する。濾過残渣を注意深くEt2O100mlで洗浄する。水
相を各々Et2O200mlで２度抽出する。合わせたエーテル
相をMgSO4で乾燥し減圧濃縮する。得られた粗生成物
（0.21g）をSiO2（シリカゲル60,0.040〜0.063mm）上に
ヘキサン／酢酸エチル1:1でクロマトグラフィーにかけ
〔ダブリュ．クラーク・スチルら（W.Clark−Still et
al.）、ジャーナル オブ オルガニック ケミストリ
ー（J.Org.Chem.）第43巻、第2923頁、1978年〕個々の
生成物を300MHz 1H−NMRで確認する。
ミルベマイシンA4を用い転化率43％の別の試験におい
て、該方法では13β−ヒドロキシミルベマイシンA478
％、14,15−エポキシミルベマイシンA422％の割合で生
じる（HPLC分析）。
て、該方法では13β−ヒドロキシミルベマイシンA478
％、14,15−エポキシミルベマイシンA422％の割合で生
じる（HPLC分析）。
実施例H3.2.5％DMSOによる培地３中のミルベマイシンA4
のヒドロキシル化 或るパラメータ〔例えばDMSO（ジメチルスルホキシ
ド）の濃度〕を変えることにより、反応生成物どうし
（13β−ヒドロキシ−及び14,15−エポキシ−ミルベマ
イシン）のバランスを変え、ヒドロキシ化合物に有利に
することは可能である。
のヒドロキシル化 或るパラメータ〔例えばDMSO（ジメチルスルホキシ
ド）の濃度〕を変えることにより、反応生成物どうし
（13β−ヒドロキシ−及び14,15−エポキシ−ミルベマ
イシン）のバランスを変え、ヒドロキシ化合物に有利に
することは可能である。
培地３（200ml）中のストレプトマイセスヴィオラセ
ンスの１日齢培養菌に、ミルベマイシンA40.25g及びDMS
O5mlを加え、全体を28℃、250rpmで震盪する。３日後、
培地３を更に50mlを加える。反応の過程をHPLC（カラム
Kontron LiSi 60、25cm/0.5cm、溶離剤ヘキサン／ジメ
トキシエタン3:1、1ml/分、UV検出器220nm）でモニター
する。７日間の震盪し、91％の転化率となった後に、92
％の13β−ヒドロキシミルベマイシンA4と８％の14,15
−エポキシミルベマイシンA4が得られる。
ンスの１日齢培養菌に、ミルベマイシンA40.25g及びDMS
O5mlを加え、全体を28℃、250rpmで震盪する。３日後、
培地３を更に50mlを加える。反応の過程をHPLC（カラム
Kontron LiSi 60、25cm/0.5cm、溶離剤ヘキサン／ジメ
トキシエタン3:1、1ml/分、UV検出器220nm）でモニター
する。７日間の震盪し、91％の転化率となった後に、92
％の13β−ヒドロキシミルベマイシンA4と８％の14,15
−エポキシミルベマイシンA4が得られる。
実施例H.4 ミルベマイシンA3及びミルベマイシンＤの
ヒドロキシル化 同様の方法で、ミルベマイシンA3又はミルベマイシン
Ｄが反応する場合、例えば転化率10％では13β−ミルベ
マイシンA340％及び14,15−エポキシミルベマイシンA36
0％の割合で得られ、また転化率13％では13β−ヒドロ
キシミルベマイシンD29％、及び14,15−エポキシミルベ
マイシンD71％の割合で得られる（HPLC分析）。
ヒドロキシル化 同様の方法で、ミルベマイシンA3又はミルベマイシン
Ｄが反応する場合、例えば転化率10％では13β−ミルベ
マイシンA340％及び14,15−エポキシミルベマイシンA36
0％の割合で得られ、また転化率13％では13β−ヒドロ
キシミルベマイシンD29％、及び14,15−エポキシミルベ
マイシンD71％の割合で得られる（HPLC分析）。
実施例H5.ミルベマイシンA4−５−オキシムのヒドロキ
シル化 上記と同様の方法で、13−デオキシ−22,23−ジヒド
ロ−Ｃ−076−Bla−アグリコン及びＡが である式Ｉの化合物を相当 する13β−ヒドロキシ化合物に変えることも可能であ
る。
シル化 上記と同様の方法で、13−デオキシ−22,23−ジヒド
ロ−Ｃ−076−Bla−アグリコン及びＡが である式Ｉの化合物を相当 する13β−ヒドロキシ化合物に変えることも可能であ
る。
培地３（200ml）中のストレプトマイセスヴィオラセ
ンス１日齢培養菌に、ミルベマイシンA4−５−オキシム
0.25g及びジメチルスルホキシド5mlを加え、全体を28
℃、250rpmで震盪する。反応過程を薄膜クロマトグラフ
ィー（前コートされたプレート状シリカゲル60F Merk、
溶離剤ヘキサン／酢酸エチル1:1）によりモニターす
る。９日間震盪後は、それ以上の反応を検出することは
できない。処理のために、反応混合物にジクロロメタン
（CH2Cl2）100mlを加え、全体をHyfro Supercel に通
して濾過する。濾過残渣をCH2Cl250mlで洗浄する。水性
相を各回CH2Cl2100mlで３回抽出する。有機相を合わ
せ、MgSO4で乾燥し、減圧濃縮する。得られた粗生成物
をSiO2（Silicagel 60 Merck0.040〜0.063mm）上にヘキ
サン／酢酸エチル1:1でクロマトグラフィーに処する。1
3β−ヒドロキシミルベマイシンA4−５−オキシムが26
％の収率で得られる。
ンス１日齢培養菌に、ミルベマイシンA4−５−オキシム
0.25g及びジメチルスルホキシド5mlを加え、全体を28
℃、250rpmで震盪する。反応過程を薄膜クロマトグラフ
ィー（前コートされたプレート状シリカゲル60F Merk、
溶離剤ヘキサン／酢酸エチル1:1）によりモニターす
る。９日間震盪後は、それ以上の反応を検出することは
できない。処理のために、反応混合物にジクロロメタン
（CH2Cl2）100mlを加え、全体をHyfro Supercel に通
して濾過する。濾過残渣をCH2Cl250mlで洗浄する。水性
相を各回CH2Cl2100mlで３回抽出する。有機相を合わ
せ、MgSO4で乾燥し、減圧濃縮する。得られた粗生成物
をSiO2（Silicagel 60 Merck0.040〜0.063mm）上にヘキ
サン／酢酸エチル1:1でクロマトグラフィーに処する。1
3β−ヒドロキシミルベマイシンA4−５−オキシムが26
％の収率で得られる。
実施例H.6 攪拌槽反応器中でのミルベマイシンA4のヒ
ドロキシル化用培養条件 式IIIで表わされる化合物のヒドロキシル化反応を行
なうために、MBR（スイス国）により市販されている攪
拌槽反応器型の生体反応器（Modell Mini）を使用す
る。これら反応器は2lの容量を持ち、ディスク型の攪拌
機を備えている。通気は、無菌濾過圧縮空気により行な
う。
ドロキシル化用培養条件 式IIIで表わされる化合物のヒドロキシル化反応を行
なうために、MBR（スイス国）により市販されている攪
拌槽反応器型の生体反応器（Modell Mini）を使用す
る。これら反応器は2lの容量を持ち、ディスク型の攪拌
機を備えている。通気は、無菌濾過圧縮空気により行な
う。
醗酵開始前、反応器と培地を別々にオートクレーブ処
理する。次いで無菌条件下、無菌の2N NaOH溶液を加え
てpH値をpH7ないしpH7.4に調整する。醗酵培地を冷却し
た後、ストレプトマイセス ヴィオラセンスの３日齢予
備培養菌200mlを加え、またDMSO 10ml中に溶解したミ
ルベマイシンA41.5gを加えて醗酵を開始させる。製造醗
酵槽への接触もまた無菌条件下で行なう。
理する。次いで無菌条件下、無菌の2N NaOH溶液を加え
てpH値をpH7ないしpH7.4に調整する。醗酵培地を冷却し
た後、ストレプトマイセス ヴィオラセンスの３日齢予
備培養菌200mlを加え、またDMSO 10ml中に溶解したミ
ルベマイシンA41.5gを加えて醗酵を開始させる。製造醗
酵槽への接触もまた無菌条件下で行なう。
醗酵は温度28℃及び通気割合0.44vvmで行なう。攪拌
速度は400rpmである。全培養期間を通じて、日々100ml
の新鮮培地３を無菌条件下で醗酵槽に入れる。
速度は400rpmである。全培養期間を通じて、日々100ml
の新鮮培地３を無菌条件下で醗酵槽に入れる。
全醗酵期間中、反応過程をクロマトグラフィー分析
（HPLC）で追従する。総９日間の培養後、醗酵の開始時
に加えたミルベマイシンA4の86％が反応していた。反応
したミルベマイシンA4の61％は13β−ヒドロキシミルベ
マイシンとして確認され、14,15−エポキシミルベマイ
シンとしては８％であった。
（HPLC）で追従する。総９日間の培養後、醗酵の開始時
に加えたミルベマイシンA4の86％が反応していた。反応
したミルベマイシンA4の61％は13β−ヒドロキシミルベ
マイシンとして確認され、14,15−エポキシミルベマイ
シンとしては８％であった。
反応が完了した時、反応混合物にメチレンクロライド
（CH2Cl2）400mlを加え、全体をHyfro Supercel に通
して濾過する。この方法によって得られた濾液を続いて
メチレンクロライドで抽出する。48時間後、有機層を分
離し、MgSO4で乾燥し、減圧濃縮する。
（CH2Cl2）400mlを加え、全体をHyfro Supercel に通
して濾過する。この方法によって得られた濾液を続いて
メチレンクロライドで抽出する。48時間後、有機層を分
離し、MgSO4で乾燥し、減圧濃縮する。
得られた粗生成物を次いで実施例H2に記した方法に従
い、クロマトグラフィー法によって精製する。
い、クロマトグラフィー法によって精製する。
製剤例 （パーセントは重量基準である。） 有効成分を助剤とともに十分に混合した後、該混合物
を適当なミルで良く磨砕すると、水で希釈して所望の濃
度の懸濁液を得ることのできる水和剤が得られる。
を適当なミルで良く磨砕すると、水で希釈して所望の濃
度の懸濁液を得ることのできる水和剤が得られる。
実施例F2 乳剤原液 各表の化合物 10％ オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル
（エチレンオキシド４〜５モル） ３％ ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム ３％ ヒマシ油ポリグリコールエーテル（エチレンオキシド36
モル） ４％ シクロヘキサノン 30％ キシレン混合物 50％ この乳剤原液を水で希釈することにより、所望の濃度
のエマルジョンを得ることができる。
（エチレンオキシド４〜５モル） ３％ ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム ３％ ヒマシ油ポリグリコールエーテル（エチレンオキシド36
モル） ４％ シクロヘキサノン 30％ キシレン混合物 50％ この乳剤原液を水で希釈することにより、所望の濃度
のエマルジョンを得ることができる。
有効成分を担体とともに混合し、適当なミル中でこの
混合物を磨砕することにより、そのまま使用することの
できる粉末を得る。
混合物を磨砕することにより、そのまま使用することの
できる粉末を得る。
実施例F4.押出し粒剤 各表の化合物 10％ リグノスルホン酸ナトリウム ２％ カルボキシメチルセルローズ １％ カオリン 87％ 有効成分を助剤とともに混合・磨砕し、続いてこの混
合物を水で温め湿めらす。混合物を押出し、空気流中で
乾燥させる。
合物を水で温め湿めらす。混合物を押出し、空気流中で
乾燥させる。
実施例F.5錠剤または丸薬 Ｉ 各表の化合物 33.00％ メチルセルロース 0.80％ 高分散ケイ酸 0.80％ トウモロコシ澱粉 8.40％ メチルセルロースを水中で攪拌しそして膨潤させる。
その後ケイ酸を入れて均質懸濁液を与えるように攪拌す
る。式Ｉで表わされる化合物およびトウモロコシ澱粉を
混合しそして水性懸濁液を混合物に添加し、ペースト状
になるように混練する。このペーストを12Mシープに通
して造粒しそして該粒状物を乾燥させる。
その後ケイ酸を入れて均質懸濁液を与えるように攪拌す
る。式Ｉで表わされる化合物およびトウモロコシ澱粉を
混合しそして水性懸濁液を混合物に添加し、ペースト状
になるように混練する。このペーストを12Mシープに通
して造粒しそして該粒状物を乾燥させる。
II 結晶質ラクトース 22.50％ トウモロコシ澱粉 17.00％ 微結晶質セルロース 16.50％ ステアリン酸マグネシウム 1.00％ ４補助薬全てを完全に混合する。相Ｉ及びIIを混
合しそして圧縮して錠剤または丸薬とする。
合しそして圧縮して錠剤または丸薬とする。
活性化合物、またはそれを含有する組成物を飼育動物
及び生産性家畜、例えば畜牛、ヒツジ、山羊、猫及び犬
などの内部寄生線虫、条虫類及び吸虫類を防除する為に
使用するならば、これらは動物に対して一回またはくり
かえし投与することができる。動物の種類によって各回
の投与量は体重1kgに対し0.1ないし10mgの範囲内の量が
好ましい。長時間の投与によってより良好な効果が得ら
れる事が多いが、より少い総投与量でも充分である。こ
の化合物またはそれを含有する組成物は飼料または飲物
に添加することもできる。調製された飼料に0.005ない
し0.1重量％の濃度で有効成分を含有するのが好まし
い。組成物は溶液、乳剤、懸濁液、粉剤、錠剤、丸薬、
またはカプセル剤の形で動物に経口投与することができ
る。
及び生産性家畜、例えば畜牛、ヒツジ、山羊、猫及び犬
などの内部寄生線虫、条虫類及び吸虫類を防除する為に
使用するならば、これらは動物に対して一回またはくり
かえし投与することができる。動物の種類によって各回
の投与量は体重1kgに対し0.1ないし10mgの範囲内の量が
好ましい。長時間の投与によってより良好な効果が得ら
れる事が多いが、より少い総投与量でも充分である。こ
の化合物またはそれを含有する組成物は飼料または飲物
に添加することもできる。調製された飼料に0.005ない
し0.1重量％の濃度で有効成分を含有するのが好まし
い。組成物は溶液、乳剤、懸濁液、粉剤、錠剤、丸薬、
またはカプセル剤の形で動物に経口投与することができ
る。
もし溶液または乳剤の物理的及び薬理学的性質が注射
を許容するならば、式Ｉの化合物またはそれを含有する
組成物を動物に、例えば皮下注射することもできるし、
反趨胃内に投薬することもできるしまたは動物の体内に
注入方法によって施用することもできる。なめる塩また
は糖蜜ブロックの方法で投与することも可能である。
を許容するならば、式Ｉの化合物またはそれを含有する
組成物を動物に、例えば皮下注射することもできるし、
反趨胃内に投薬することもできるしまたは動物の体内に
注入方法によって施用することもできる。なめる塩また
は糖蜜ブロックの方法で投与することも可能である。
生物学的実施例 実施例B.1 スポドプテラ リトラリス（Spodoptera li
ttoralis）に対する 胃毒殺虫作用 鉢植えの綿植物が第５葉期の時に試験化合物を3,12.5
または50ppm含有するアセトン／水溶液を噴霧する。塗
膜が乾燥した後、スポドブテラリトラリスの幼虫（L1段
階）約30匹をこの植物に移す。各試験化合物及び試験種
について２本の植物を使用する。試験は約24℃、相対湿
度60％で実施する。死にかけの昆虫、幼虫の成長及び食
事阻害などの評価及び中間評価は24時間、48時間及び72
時間後に行う。
ttoralis）に対する 胃毒殺虫作用 鉢植えの綿植物が第５葉期の時に試験化合物を3,12.5
または50ppm含有するアセトン／水溶液を噴霧する。塗
膜が乾燥した後、スポドブテラリトラリスの幼虫（L1段
階）約30匹をこの植物に移す。各試験化合物及び試験種
について２本の植物を使用する。試験は約24℃、相対湿
度60％で実施する。死にかけの昆虫、幼虫の成長及び食
事阻害などの評価及び中間評価は24時間、48時間及び72
時間後に行う。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物（表１及び２）、特に
本発明の新規オキシム化合物は12.5ppmの施用濃度100％
効果的であった。
本発明の新規オキシム化合物は12.5ppmの施用濃度100％
効果的であった。
実施例B2.植物損傷ダニ:OP−感受性ナミハダニ（Tetran
ychus urticae）に対する作用 試験開始16時間前にマメ植物（Phaseolus vulgaris）
の第１葉にナミハダニを大量に発生させた葉片によって
感染させる。この葉片をとり除き、あらゆる成長段階の
ナミハダニが蔓延している植物に試験化合物を0.8ppm含
有する溶液を滴が落ちる点まで噴霧する。温室内の温度
は約25℃である。
ychus urticae）に対する作用 試験開始16時間前にマメ植物（Phaseolus vulgaris）
の第１葉にナミハダニを大量に発生させた葉片によって
感染させる。この葉片をとり除き、あらゆる成長段階の
ナミハダニが蔓延している植物に試験化合物を0.8ppm含
有する溶液を滴が落ちる点まで噴霧する。温室内の温度
は約25℃である。
移動状態（成虫及び蛹）及び卵のパーセンテージを７
日後に立体顕微鏡下で評価する。
日後に立体顕微鏡下で評価する。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物、特に本発明の新規オ
キシム化合物は使用した活性成分濃度で60％ないし100
％死亡に到らしめた。
キシム化合物は使用した活性成分濃度で60％ないし100
％死亡に到らしめた。
実施例B3.ルシリア セリカータ（Lucilia sericata）
のL1段階幼虫に対する作用 試験化合物の水性懸濁液1mlを特別の幼虫培養液3mlと
約50℃で混合して有効成分250ppmまたは125ppm含有する
均一な組成物を得る。約30匹のルシリア セリカータ幼
虫（L1）を各有効成分含有試験管に入れる。４日後に死
虫率をしらべる。式Ｉ及びIIで表わされる化合物にはル
シリア セリカータのL1段階幼虫に対して良好な作用を
示した。本発明の新規オキシム化合物はたった250ppmの
施用濃度で100％の効果を示した。
のL1段階幼虫に対する作用 試験化合物の水性懸濁液1mlを特別の幼虫培養液3mlと
約50℃で混合して有効成分250ppmまたは125ppm含有する
均一な組成物を得る。約30匹のルシリア セリカータ幼
虫（L1）を各有効成分含有試験管に入れる。４日後に死
虫率をしらべる。式Ｉ及びIIで表わされる化合物にはル
シリア セリカータのL1段階幼虫に対して良好な作用を
示した。本発明の新規オキシム化合物はたった250ppmの
施用濃度で100％の効果を示した。
実施例B4.ボーフィルス ミクロプルス（Boophilus mic
roplus:Biarra strain）に対する殺ダニ作用 PVC板に接着剤テープを垂直に張り付け充分に飽食し
たメスのボーフィルス ミクロブルスダニ（Biarra種）
10匹をその背位で板上に一列に次々と固定する。試験化
合物をダニ１匹当り1.0.5または0.1μｇの量で溶解した
ポリエチレングリコールとアセトンの1:1混合物を含有
する液体１μｌを注射針から各々のダニに注射する。対
照ダニには試験化合物を含有しない液体を注射する。こ
の処置の後、ダニを支持台から放し正常な条件下約28℃
で相対湿度80％の昆虫飼育箱の中で産卵するまで、そし
て対照ダニの卵から幼虫が孵化するまで保持する。試験
化合物の活性はIR90、即ち10匹のメスダニの中９匹（90
％）が30日後でも幼虫が孵化し得ない卵を産むのに有効
な投与量について測定する。
roplus:Biarra strain）に対する殺ダニ作用 PVC板に接着剤テープを垂直に張り付け充分に飽食し
たメスのボーフィルス ミクロブルスダニ（Biarra種）
10匹をその背位で板上に一列に次々と固定する。試験化
合物をダニ１匹当り1.0.5または0.1μｇの量で溶解した
ポリエチレングリコールとアセトンの1:1混合物を含有
する液体１μｌを注射針から各々のダニに注射する。対
照ダニには試験化合物を含有しない液体を注射する。こ
の処置の後、ダニを支持台から放し正常な条件下約28℃
で相対湿度80％の昆虫飼育箱の中で産卵するまで、そし
て対照ダニの卵から幼虫が孵化するまで保持する。試験
化合物の活性はIR90、即ち10匹のメスダニの中９匹（90
％）が30日後でも幼虫が孵化し得ない卵を産むのに有効
な投与量について測定する。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物（表１及び２）は、ボ
ーフィルス ミクロプルスに対するIR90が１μｇで、良
好な活性を示す。本発明の新規オキシム化合物は、それ
らのIR90値に非常に低い施用濃度（0.5μｇ）で達す
る。
ーフィルス ミクロプルスに対するIR90が１μｇで、良
好な活性を示す。本発明の新規オキシム化合物は、それ
らのIR90値に非常に低い施用濃度（0.5μｇ）で達す
る。
実施例B5.線虫に感染した羊についての試験〔ヘモンク
ス コンコルトウス（Haemonchus concortus）及びトコ
ストロンギルス コルブリホルミス（Trichostronglus
colubriformis）〕 人工的にヘモンクス コンコルトウス及びトリコスト
ロンギルスコルブリホルミスに感染させた羊に懸濁液の
形で胃ゾンデまたは第１胃内注射によって試験化合物を
投与する。各投与について１ないし３匹の羊を使用す
る。各羊は体重1kg当り1mgまたは0.5mgの単独投与量で
１回だけ処置する。排泄物中に排泄された線虫の卵の数
を処置前と処置後について比較することによって評価す
る。
ス コンコルトウス（Haemonchus concortus）及びトコ
ストロンギルス コルブリホルミス（Trichostronglus
colubriformis）〕 人工的にヘモンクス コンコルトウス及びトリコスト
ロンギルスコルブリホルミスに感染させた羊に懸濁液の
形で胃ゾンデまたは第１胃内注射によって試験化合物を
投与する。各投与について１ないし３匹の羊を使用す
る。各羊は体重1kg当り1mgまたは0.5mgの単独投与量で
１回だけ処置する。排泄物中に排泄された線虫の卵の数
を処置前と処置後について比較することによって評価す
る。
対照として、同時に、同じ方法で感染させた未処置の
羊を使用する。未処置で感染させた羊の群と比較して、
表１又は２の化合物のうちの１種によって1mg/kgで処置
した羊では線虫の蔓延が60ないし100％（100％＝排泄物
中の線虫卵の完全な減少）減少した。
羊を使用する。未処置で感染させた羊の群と比較して、
表１又は２の化合物のうちの１種によって1mg/kgで処置
した羊では線虫の蔓延が60ないし100％（100％＝排泄物
中の線虫卵の完全な減少）減少した。
実施例B6.マメアブラムシ（Aphis craccivora）に対す
る接触作用 全ての成長段階の当該アブラムシがはびこった若いえ
んどう植物に、供試化合物の乳化性濃縮物より製造さ
れ、そして50ppm、25ppmまたは12.5ppmの有効成分を含
有する溶液を噴霧する。３日後に、少くとも80％のアブ
ラムシが死亡または植物より落下したことに達したか
で、評価を行なう。組成物はこの活性のレベルでのみ有
効であると評価される。
る接触作用 全ての成長段階の当該アブラムシがはびこった若いえ
んどう植物に、供試化合物の乳化性濃縮物より製造さ
れ、そして50ppm、25ppmまたは12.5ppmの有効成分を含
有する溶液を噴霧する。３日後に、少くとも80％のアブ
ラムシが死亡または植物より落下したことに達したか
で、評価を行なう。組成物はこの活性のレベルでのみ有
効であると評価される。
各表の式Ｉ及びIIで表わされる化合物、特にまた本発
明の新規オキシム化合物は12.5ppmないし25ppmの低濃度
で完全な殺虫（＝100％）を示した。
明の新規オキシム化合物は12.5ppmないし25ppmの低濃度
で完全な殺虫（＝100％）を示した。
実施例B7.エジプトヤブ蚊（Ａdes aegypti）に対する
殺幼虫作用 試験化合物の0.1重量％アセトン溶液をピペットでビ
ーカー中の水150mlの表面に、10ppm、3.3ppm及び1.6ppm
の濃度を与えるのに十分な量添加する。アセトンが蒸発
した後、３日齢のエジプトヤブ蚊30ないし40匹を各ビー
カー中に入れる。1,2及び５日後の死虫数を数える。
殺幼虫作用 試験化合物の0.1重量％アセトン溶液をピペットでビ
ーカー中の水150mlの表面に、10ppm、3.3ppm及び1.6ppm
の濃度を与えるのに十分な量添加する。アセトンが蒸発
した後、３日齢のエジプトヤブ蚊30ないし40匹を各ビー
カー中に入れる。1,2及び５日後の死虫数を数える。
この試験において各表中の式Ｉ及びIIで表わされる化
合物は、3.3ないし10ppmの低濃度でさえ、１日後に全て
の幼虫を完全な死亡に到らしめた。
合物は、3.3ないし10ppmの低濃度でさえ、１日後に全て
の幼虫を完全な死亡に到らしめた。
実施例B8.デルマニッシュスガリネー（Dermanyssus gal
linae）に対する殺ダニ作用 試験溶液２ないし3ml（試験化合物100,10,1及び0.1pp
m）を上部のあいたガラス容器中に入れ、異なった発育
段階にある約200匹のダニをこの容器中に入れる。その
後、該容器を綿ウールでふたをして、ダニが完全にしめ
るまで10分間一様に振盪する。次いで過剰の試験溶液が
綿ウールによって吸収されるまで容器を逆にする。再度
容器を逆にして、処理したダニを試験化合物の効果を評
価するため実験室条件下で３日間観察しつづける。死虫
率は効果に対する基準である。
linae）に対する殺ダニ作用 試験溶液２ないし3ml（試験化合物100,10,1及び0.1pp
m）を上部のあいたガラス容器中に入れ、異なった発育
段階にある約200匹のダニをこの容器中に入れる。その
後、該容器を綿ウールでふたをして、ダニが完全にしめ
るまで10分間一様に振盪する。次いで過剰の試験溶液が
綿ウールによって吸収されるまで容器を逆にする。再度
容器を逆にして、処理したダニを試験化合物の効果を評
価するため実験室条件下で３日間観察しつづける。死虫
率は効果に対する基準である。
式Ｉ及びIIで表わされる化合物は100ppmの濃度で100
％の殺虫効果を示した。
％の殺虫効果を示した。
〔参考文献〕 アンゲリノ エス．アー．ゲー．エフ．（Angelino
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es in Biotechnology）」第３巻、ペルガモン（pergamo
n），トロント（Toronto），第367−372頁 シミズ エス．（Shimizu S.），モリオカ エイ
チ．（Morioka H.），タニ ワイ．（Tani Y.），オガ
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によるコエンザイムＡの合成（Synthesis of coenzyme
A by immobilized microbial cells）”「ジェイ．フェ
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−83頁 タルスキー ジー．（Talsky G.），ギァニツォポ
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素の分子内架橋（Intermolecular crosslinking of enz
ymes）”イン（In）：「サード ヨーロ．コングル．バ
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巻、ヒェミー出版（Verlag Chemie），ヴァインハイム
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T.），トサ ティー．（Tosa T.），チバタ アイ．（C
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−アスパラギン酸の改良製法（Improvement of product
ion of L−aspartic acid using immobilized microbia
l cells）”「アブル．ミクロバイオル．バイオテクノ
ル．（Appl.Microbiol.Biotechnol.）」第20巻：第291
−295頁 ヴァン ハエヒト ジェイ．エル．（Van Haecht
J.L.），ポリポムボ エム．（Bolipombo M.），ルーヘ
ット ピー．ジー．（Rouxhet P.G.）（1985年）“付着
によるサッカロミセス セルビシアエの固定化:AIイオ
ンによる細胞処理（Immobilization of Saccaromyces c
erevisiae by adhesion:treatment of the cells by AI
ions）”「バイオテクノル バイオエング（Biotechno
l.Bioeng.）」第27巻：第217−224頁 ヴォーゲル エイチ ジェイ．（Vogel H.J.），プ
ロデリウス ビー．（Brodelius P.）（1984年）“自由
に懸濁及び固定化したキャサランツスロセウス植物細胞
の生体内における31P NMR 比較（an in vivo 31P NMR c
omparison of freely suspended and immobilized Cath
aranthus plant cells）”「ジェイ．バイオテクノル．
（J.Biotechnol.）」第１巻：第159−170頁 ウィータール エイチ．エイチ．（Weetall H.
H.），メイソン アール．ディー．（Mason R.D.）（19
73年）“固定化パパインの研究（Studies on immobiliz
ed papain）”「バイオテクノル．バイオエング（Biote
chnol.Bioeng.）」第15巻：第455−466頁 ウィーゲル ジェイ．（Wiegel J.），ディクスト
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付着ならびに付着中の胞子形成（Clostridium thermoce
llum:adhesion and sporulation while sdhered to cel
lulose and hemicellulose）”「アプル．ミクロバイア
ル．バイオテクノル．（Appl.Microbiol.Biotechno
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t liver aldehyde oxidase）”「バイオテクノル．バイ
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ースイソメラーゼの固定化（Immobilization of glucos
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tek I.），パブロビック ビー．（Pavlovic B.），セ
シ ヴェー．（Cesi V.），ミルドナー ビー．（Mildn
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Congr.Biotechnol.）」第１巻、ヒェミー出版（Verlag
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分解したナイロン−コアクリロニトル系上へ蛋白及び酵
素を酵素支持固定化するようなグラフトコポリマーの使
用（The use of graft copolymers as enzyme supports
immobilization of proteins and enzymes on a hydro
lyzed nylon−coacrylonitrile system）”「バイオテ
クノル．バイオエング（Biotechnol.Bioeng）」第23
巻：第2885−2889頁 ベットマン ハー．（Bettmann H.），レーム ハ
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トラップド微生物によるフェノールの分解（Degradatio
n of phenol by polymer entrapped microorganism
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mmobilized fungal spores of microbial transformati
on of steroids）：ポリアクルアミドゲル及び他のマト
リックス上のアスペルギルス オクラセウス G8の固定
化された胞子によるプロゲステロンの11α−ヒドロキシ
ル化（11a−hydroxylation of progesterone with immo
bilized spores of Aspergillus ochraceus G8 on poly
acrylamide gel and other matrices）“「バイオテク
ノル．バイオエング（Biotechnol.Bioeng）」第26巻：
第1403−1408頁 ブラック ジー．エム．（Black G.M.），ウェブ
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たチタニウムアルキルアミン誘導体上へのグルコアミラ
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kylamine derivative of titanium（IV）activated con
trolled pore glass with tannic acid）”「バイオテ
クノル バイオエング（Biotechnol.Bioeng）」第26
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−295頁 ヴァン ハエヒト ジェイ．エル．（Van Haecht
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によるサッカロミセス セルビシアエの固定化:AIイオ
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chnol.Bioeng.）」第15巻：第455−466頁 ウィーゲル ジェイ．（Wiegel J.），ディクスト
ラ エム（Dykstra M.）（1984年）“クロストリディウ
ム サーモセルム：セルロース及びヘミセルロースへの
付着ならびに付着中の胞子形成（Clostridium thermoce
llum:adhesion and sporulation while sdhered to cel
lulose and hemicellulose）”「アプル．ミクロバイア
ル．バイオテクノル．（Appl.Microbiol.Biotechno
l）」第20巻：第59−65頁 ワークマン ダブリュ．イー．（Workman W.E.），
デイ デー．エフ．（Day D.F.）（1984年）“グルタラ
ルデヒド固定酵母細胞によるイヌリンのフルクトースへ
の酵素的加水分解（Enzymatic hydrolysis of inulin t
o fructose by glutaraldehyde fixed yeast cells）”
「バイオテクノル．バイオエング．（Biotechnol.Bioen
g.）」第26巻：第905−910頁
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:525） (72)発明者 ブルーノ フライ スイス国，4410 リースタル，ビュンテ ンストラーセ 16 (72)発明者 ペーター マイエンフイッシュ スイス国，4147 エッシュ，トラウゴッ ト マイヤー‐ストラーセ ５ (72)発明者 アンソニー コルネリウス オーサリバ ン スイス国，4055 バーゼル，ハプスブル ガーストラーセ 38
Claims (17)
- 【請求項１】液相中に溶解した次式III: （式中、R3はR1を、またR4はＡを表わし、そしてR1及び
Ａは下記式Ｉで定義する意味を表わす）で表わされるミ
ルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反応を行うこと
のできるストレプトマイセス種の微生物を該13β−ヒド
ロキシル化反応を行うのに十分な時間接触させることを
特徴とする次式I: 〔式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わすか、又は基 （Ｘはメチル基、エチル基又はイソプロピル基を表わ
す）を表わし、 Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす） 又は を表わす〕 で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による一段階製造方法。 - 【請求項２】液相中に溶解した次式III: （式中、 R3はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、R4は基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす） 又は を表わす） で表されるミルベマイシンに、13β−ヒドロキシル化反
応を行うことのできるストレプトマイセス種の微生物を
該13β−ヒドロキシル化反応を行うのに十分な時間接触
させることを特徴とする次式I: （式中、 R1はメチル基、エチル基、イソプロピル基又は第二ブチ
ル基を表わし、 Ａは基 （R2は水素原子、−Ｃ（Ｏ）−CH2O−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2
−COOH又は−Ｃ（Ｏ）−CH2CH2−COOHを表わす） 又は を表わす） で表わされる13β−ヒドロキシ−ミルベマイシンの微生
物利用による請求項１記載の一段階製造方法。 - 【請求項３】上記ストレプトマイセス種の微生物がスト
レプトマイセス ジアスタトクロモゲネス（Streptomyc
es diastatochromogenes）である請求項２記載の製造方
法。 - 【請求項４】上記ストレプトマイセス種の微生物がスト
レプトマイセス ジアスタトクロモゲネスATCC 31561で
ある請求項３記載の製造方法。 - 【請求項５】上記ストレプトマイセス種の微生物がスト
レプトマイセス ヴィオラセンス（Streptomyces viola
scens）である請求項２記載の製造方法。 - 【請求項６】上記ストレプトマイセス種の微生物がスト
レプトマイセス ヴィオラセンスATCC 31560である請求
項５記載の製造方法。 - 【請求項７】上記ストレプトマイセス種の微生物が崩壊
形態の死菌である請求項１記載の製造方法。 - 【請求項８】上記ストレプトマイセス種の微生物の胞子
が使用される請求項１記載の製造方法。 - 【請求項９】上記ストレプトマイセス種の微生物が固定
化された形態にある請求項１記載の製造方法。 - 【請求項１０】上記ヒドロキシル化反応が生体反応器中
で行われる請求項１記載の製造方法。 - 【請求項１１】上記生体反応器が攪拌槽反応器である請
求項10記載の製造方法。 - 【請求項１２】ａ）僅少に限定された容易に同化しえる
炭素源と窒素源及び、他の必須成分として、ビタミン、
金属イオン及び微量元素を含む複合栄養培地中で上記微
生物を培養し、 （ｂ）細胞濃度がヒドロキシル化反応のために最適とな
ることを保証する適当な時間を経てから式IIIで表わさ
れる化合物を加え、 ｃ）ヒドロキシル化反応が遂行されるのに十分な時間、
ストレプトマイセス種の微生物及びその基質（式IIIで
表わされる化合物）を一緒に培養し、そして ｄ）それ自体公知である方法によって反応生成物を単離
する ことからなる請求項１記載の製造方法。 - 【請求項１３】プロセス温度が20ないし32℃である請求
項12記載の製造方法。 - 【請求項１４】培地のpH値がpH4ないしpH8である請求項
12記載の製造方法。 - 【請求項１５】上記複合栄養培地が、 ａ）窒素源として：酵母エキス、酵母水解物、酵母自己
分解物、酵母細胞、ダイズミール、トウモロコシミー
ル、オートミール、エダミン、ペプトン、カゼイン水解
物、コーンスチープリカー、肉エキス又は他の容易に同
化しえる窒素源、 ｂ）炭素源として：グルコース、ラクトース、スクロー
ス、デキストロース、マルトース、デンプン、セレロー
ス、セルロース、麦芽エキス又はあらゆる他の容易に同
化しえる炭素源、 ｃ）ビタミンとして：チアミン、ビオチン、ニコチン
酸、リン酸ピリドキサール及び他の必須ビタミン、 ｄ）無機金属イオンとして：Na+，K+，Ca2+，Mg2+，NH4
，PO4 3-，SO4 2-，Cl-，CO3 2-及び塩を形成している他
の必須金属イオン、 ｅ）及び微量元素として：Mn2+，Co2+，Zn2+及び塩を形
成している他の必須微量金属元素を、個々に又は組み合
わせて、最適な細胞成長のために及び最適な反応条件を
用意するために必要な濃度で含む請求項12記載の製造方
法。 - 【請求項１６】窒素源の濃度が0.1g/1ないし6g/1の範囲
内である請求項11記載の製造方法。 - 【請求項１７】炭素源の濃度が1.0g/1ないし25g/1の範
囲内である請求項11記載の製造方法。
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