JP3011987B2 - 固相化プライマーを用いる逆転写酵素の測定法 - Google Patents

固相化プライマーを用いる逆転写酵素の測定法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、被検液中の逆転写酵素の決定方法および体
液中の逆転写酵素中和抗体測定による被検者のレトロウ
イルス感染の確認法に関する。
［従来の技術］ 従来、逆転写酵素の活性測定としては、天然型RNA又
はアデニンリボポリヌクレオチド（以下、ポリＡと略す
ことがある）とオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以
下、オリゴdTと略すことがある）とを用い、基質として
トリチウム化デオキシチミジン５′−トリホスフェート
（以下、〔3H〕dTTPと略称することがある）を用い、反
応液中の逆転写酵素活性を利用してオリゴdTを伸長さ
せ、これをフィルターで濾過し、フィルター中の放射活
性を測定する方法が報告されている〔David Baltimore
Nature,226,1209−1211,（1970）;Howard M.Temin ＆
Satoshi Mizutani,Nature,226,1211−1213,（197
0）〕。
そして更に、上述の逆転写酵素活性の測定方法を利用
したレトロウイルスの一種であるエイズウイルスの感染
を診断する方法が報告されている〔特開昭63−252253号
公報〕。
従来、一般にバイオ医薬的研究及び組換えDNAテクノ
ロジーに用いられる多くの操作は、通常同位体水素
（3H）、リン（32P）、炭素（14C）、ヨウ素（125I）等
で放射標識されたポリヌクレオチドの使用に大きく依存
している。そして、このような放射性化合物は、たとえ
核酸又は他の科学的に又は臨床上興味ある分子が極めて
微量で存在していても、それらを検出し、監視し、局在
化し、又は単離することが可能であるので、有用な指示
プローブとして使用されている。
しかしながら、放射性物質の使用には厳しい制約があ
り重大な欠点が伴っている。すなわち、まず第一に、放
射性物質を取り扱う人は、潜在的に高レベルの放射線に
曝されかねない危険があるので、放射性同位体の製造、
使用、後処理の間、念入りな安全策を講じ維持しなけれ
ばならないという問題点があった。第二に、放射性ヌク
レオチドは高価なものであり、一般の使用においては経
費が高くなるという問題がある。第三に、必要な感度を
得るには、高い被放射能の放射性物質を用いなければな
らないが、比放射能の高い放射性物質はそれに対応して
半減期が短く、貯蔵寿命が限られており使用に制約が加
えられるという問題があった。
そこで、放射性物質に替えて非放射性の標識物質を用
いる方法が検討されているが、例えば、鳥型ミエローマ
由来の逆転写酵素を用い、鋳型として天然型mRNA、プラ
イマーとしてオイゴdT及び基質としてビオチン化デオキ
シウリジン５′−トリホスフェート（以下、ビオチン化
dUTPと略すことがある）を用いて反応せしめたところ、
ビオチン化dUTPは何ら基質として利用されず、オリゴdT
の伸長は見られず、逆転写酵素の活性測定に利用し得な
いことが報告されており［Pennina R.Langer,Alex A.Wa
ldrop ＆ David C.Ward Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,66
33−6637,（1981）］、ビオチン化ヌクレオチドは逆転
写合成酵素の活性測定には適用できないとされていた。
本発明者らは先に、放射性同位体を用いない逆転写酵
素活性の測定系を得べく、鋭意研究を行なった結果、特
定の鋳型DNAおよびプライマーを用いれば逆転写酵素の
存在下においてビオチン化dUTPは基質として利用され、
逆転写酵素活性が容易に測定しうることを見出した。
［発明が解決しようとする課題］ しかし、上記の方法にもまだいくつか問題があり、そ
の改善が求められていた。すなわち、上記方法では操作
手順に煩雑な点があり、また、反応開始後、測定が可能
となるまでに若干の時間がかかるという問題があり、操
作手順が簡便で、短時間で測定可能な方法の確立が求め
られていた。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑み更に研究を行なった
結果、固相化プライマーを使用すれば上記の問題点を解
消することができ、簡便かつ迅速に逆転写酵素活性が測
定しうることを見出し本発明を完成した。
即ち、本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的
に調製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNA、
該アデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNAに相補的な固
相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビ
オチン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検液
の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物と未反応のビ
オチン化デオキシウリジントリホスフェートを分離した
後、反応生成物もしくは未反応のビオチン化デオキシウ
リジントリホスフェートの量を測定することを特徴とす
る被検液中の逆転写酵素の決定方法である。
また本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的に
調製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNA、該
アデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNAに相補的な固相
化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビオ
チン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検体液
および逆転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反応生
成物と未反応のビオチン化デオキシウリジントリホスフ
ェートを分離した後、反応生成物もしくは未反応のビオ
チン化デオキシウリジントリホスフェートの量を測定
し、この量から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を求
めることを特徴とする被検者のレトロウイルスの感染確
認法である。
本発明において、鋳型として用いられるRNAは、人為
的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチドである
（以下、このようなRNAをポリＡと略称することがあ
る）。ポリＡは、例えば、遺伝子操作技術若しくは化学
合成技術を用いて合成することにより人為的に調製さ
れ、特に好ましい態様としては100〜500塩基からなるポ
リＡを挙げることができ、通常有利に利用できるものと
しては、平均鎖長255塩基程度のポリＡが例示される。
固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以
下、固相化オリゴdTと略すことがある）はプライマーと
して作用するもので、好ましい態様としては、11塩基以
下のデオキシチミジンのオリゴマーであり、長いものほ
ど好ましいが、通常有利に利用できるものとして例示さ
れるものは、平均鎖長15塩基ないし21塩基程度の固相化
オリゴdTである。
この固相化オリゴdTは、オリゴデオキシチミンヌクレ
オチド（オリゴdT）を固相に固定化したものである。
固相としては、特に限定はされないが、ガラス粒子、
セルロース、ポリスチレン等の天然または合成高分子の
担体等が用いられる。
このうち合成高分子担体の例としては、例えば、スチ
レンや置換基としてスルホン酸基、カルボキシル基、ア
ミノ基を有するスチレン（以下、スチレン誘導体モノマ
ーという）の単一重合物もしくは共重合物であるポリス
チレンや、スチレンまたはスチレン誘導体モノマーとメ
チルスチレン、エチルスチレン、クロルスチレン、エチ
レン、プロピレン、アクリル酸、アクリル酸メチルエス
テル、アクリル酸エチルエステル、メタクリル酸、メタ
クリル酸メチルエステル、メタクリル酸エチルエステ
ル、アクリロニトリル、アクリルアミド、マレイン酸、
フマル酸、ブタジエン、クロルプレン、イソプレン、塩
化ビニル、塩化ビニリデン、酢酸ビニル、ビニルトルエ
ン、ジビニルベンゼンなどの共重合体、ポリビニルトル
エン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル
酸、ポリアクリロニトリル、ポリビニルピロリドン、ポ
リ酢酸ビニルアクリレート、塩化ビニル−アクリレート
などとの共重合体などが挙げられる。また、この合成高
分子担体は、その表面を非イオン界面活性剤で前処理し
たものであっても良い。
特に好ましいものとしては、スチレン、クロルスチレ
ン、アクリル酸、ビニルトルエン、メタクリル酸メチル
エステルの重合または共重合体が例示される。
これらの固相にオリゴdTを固定化する方法としては、
吸着法および化学結合法のいずれをも利用することがで
きるが、より高い感度を得られる点で化学結合法が好ま
しい。
特に、オリゴdTの５′末端側で固相に化学結合せしめ
る方法が好ましく、例えば、アミノ基を有するポリスチ
レンやポリペプチド等のアミノ基を有するかこれを導入
した固相のアミノ基にオリゴdTの５′末端に存在するリ
ン酸残基を縮合剤等の存在下活性化し、アミノ基とリン
酸基を縮合する方法、例えば１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の縮合
剤の存在下、好ましくは１−メチルイミダゾールを添加
して縮合せしめれば良い。
また、他の方法として、例えば、カルボキシル基を有
するスチレン等のカルボキシル基を有しまたはこれを導
入した固相のカルボキシル基に対し、オリゴdTの５′末
端のリン酸残基に上記縮合剤により予めアミノ基を結合
導入せしめ、次いで、カルボキシル基とアミノ基を脱水
縮合せしめる方法が挙げられる。
さらに、スルホン酸基や水酸基、ジメチルアミノ基等
の官能基を有するかまたはこれを導入した固相とオリゴ
dTまたはオリゴdTの５′末端を適当な官能基となし、適
当なスペーサーを用いて両者を結合しても良い。
形状としても特に限定されず、ボールや粒子状、繊維
状の表面や、プレート、容器等の壁面に固相化したもの
であっても良い。
固相化オリゴdTの単位面積当たりの固相への結合量
は、通常は、5.0pmol/cm2の結合量までには最高の吸光
度を与え、それ以上の結合量においても測定可能である
が結合量が多すぎると感度の面および経済性の面から好
ましくなく、好ましくは0.15〜5.0pmol/cm2の範囲が例
示される。
基質として用いられるビオチン化デオキシヌクレオシ
ドトリホスフェート（以下、ビオチン化dUTPあるいは標
識基質と略称することがある）は、例えば、ビオチン基
とウラシルデオキシヌクレオシド基がアリールアミン等
の適当なスペーサーを介して結合した化合物があげら
れ、具体的な化合物例としては、例えば、５−〔Ｎ−
（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミ
ノアリール〕−デオキシウリジントリフォスフェート
（ビオチン化−11−dUTP）、５−〔Ｎ−〔Ｎ−（ビオチ
ニル−ε−アミノカプロイル）−γ−アミノブチリル〕
−３−アミノアリール〕−デオキシウリジントリフォス
フェート（ビオチン化−16−dUTP）等のようにビオチニ
ル基が適当なスペーサーを介してdUTPと結合された化合
物である。ビオチン化−11−dUTP及びビオチン化−16−
dUTPは、市販されている化合物であり、また、それ以外
の化合物も特開昭57−209297号公報等の公知文献に記載
の方法に準じて容易に調製される。
ビオチン量測定のために用いられる試薬およびその組
成物としては、一般にビオチン量を測定するために用い
られるものを採用することができ、例えばFITC（フルオ
レッセンイソチオシアネート）蛍光検出用組成物、パー
オキシダーゼ検出用組成物、酸性ホスファターゼ検出用
組成物、アルカリホスファターゼ検出用組成物、β−ガ
ラクトシダーゼ検出用組成物等が挙げられる。
FITC蛍光検出用組成物としては、例えば、兎IgGビオ
チン抗体およびFITC結合山羊抗兎IgG抗体からなる組成
物並びにFITC結合アビジン等が挙げられ、また、パーオ
キシターゼ検出用組成物としては、例えばストレプトア
ビジン−ビオチン化西洋わさびパーオキシダーゼ複合
体、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液およびオルトフェニ
レンジアミンおよび過酸化水素からなる組成物が挙げら
れる。更に、酸性ホスファターゼ検出用組成物として
は、例えばストレプトアビジン−ビオチン化酸性ホスフ
ァターゼ複合体、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、パラ
ニトロフェニルホスフェート等の発色基質あるいは４−
メチルウンベリフェリルホスフェート等の蛍光基質から
なる組成物等が、アルカリホスファターゼ検出用組成物
としては、例えばストレプトアビジン−ビオチン化アル
カリホスファターゼ複合体、トリス塩酸緩衝液等の適当
な緩衝液およびパラニトロフェニルホスフェート等の発
色基質あるいは４−メチルウンベリフェリルホスフェー
ト等の蛍光基質からなる組成物、ストレプトアビジン化
アルカリホスファターゼ、トリス−塩酸緩衝液等の適当
な緩衝液およびパラニトロフェニルホスフェート等の発
色基質あるいは４−メチルウンベリフェリルホスフェー
ト等の蛍光基質からなる組成物が、また、β−ガラクト
シダーゼ検出用組成物としては、例えば、ストレプトア
ビジン−β−ガラクトシダーゼ結合体、リン酸緩衝液等
の適当な緩衝液および２−ニトロフェニル−β−ガラク
トシド等の発色基質あるいは４−メチルウンベリフェニ
ル−β−ガラクトシド等の蛍光基質からなる組成物等が
挙げられる。
これらの組成物は、既に市販されているものを利用し
てもよく、また、公知文献を参考にして、種々調製し、
ビオチン量測定用試薬組成物としても良い。
本発明の被検液中の逆転写酵素を決定する方法を実施
するには、ポリＡ、固相化オリゴdTおよびビオチン化dU
TPを任意の順序で反応させ、未反応のビオチン化dUTPを
除去した後、ビオチン化dUTP量を測定すればよい。
ポリＡ（平均鎖長:255塩基）と固相化オリゴdT（平均
鎖長:21.5塩基）の量的関係は、固相化オリゴdTを１
（モル比）としたときに、ポリＡを1150〜0.3の比とす
ることが好ましく、適宜、固相化オリゴdTの単位表面積
当たりの結合量において好ましいポリＡの量とすれば良
い。
反応は、被検液、ポリＡ、固相化オリゴdTおよび標識
基質としてのビオチン化dUTPを、pH6.5〜８に調整した
トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液中、37℃
付近で0.5〜24時間インキュベートし、系中に存在する
逆転写酵素の作用により、前記ビオチン化dUTPをポリＡ
−固相化オリゴdTのプライマー部に結合せしめる。
被検液としては、逆転写酵素の存在、非存在または逆
転写酵素の酵素活性を測定しようとする検液であれば良
く、例えば、レトロウイルス感染細胞の培養液を挙げる
ことができる。
更に、ポリＡ−固相化オリゴdTと結合したビオチン化
dUTP（以下、反応生成物ということがある）と未反応の
ビオチン化dUTPとの分離は、固相化オリゴdTを用いてい
るので、濾過、遠心分離、デカンテーション等により容
易に実施することができる。
基質として利用されたビオチン化デオキシウリジンの
量、すなわち反応ビチオン化dUTP量は、伸長工程を経て
プライマーに結合したビオチン化デオキシウリジンのビ
オチン量をビオチンの測定用試薬を用いて測定すれば良
く、例えば、ビオチン含量の測定用試薬として、ストレ
プトアビジン化アルカリホスファターゼ、トリス−塩酸
緩衝液、パラニトロフェニルホスフェートからなる組成
物を用いた場合には、次の様にして実施される。
すなわち、0.15〜0.5MのNaClを含むpH7.5〜9.5に調整
したトリス塩酸緩衝液に0.05〜10μg/ml濃度のストレプ
トアビジン化アルカリフォスファターゼを含有させて得
た溶液に、ビオチン化dUTPの反応した固相担体を10〜60
分間浸漬させる。十分量の上述緩衝液で少なくとも３回
以上固相担体を洗浄し、次に例えば1mM MgCl2を含む50m
Mジエタノールアミン−塩酸緩衝液（pH9.5〜10）に1mg/
mlのパラニトロフェニルホスフェートを溶解させて得た
溶液に、固相担体を0.1〜２時間浸漬させて発色せしめ
る。発色量の定量は、波長405nmの吸光度を測定すれば
良い。
かくして測定されたビオチン化dUTPの総合量は、系中
の逆転写酵素量、すなわち被検液中の逆転写酵素量を反
映するものであるので、これから逆転写酵素量等を決定
することができる。
さらに、より検出感度を上げるために標識基質の他
に、基質としてデオキシチミジントリホスフェート（以
下、dTTPと略すこともある）を加えることができる。こ
のような目的のために使用されるdTTPの量は、通常、標
識基質であるビオチン化dUTP量に比して、モル比で２〜
20倍、好ましくは３〜４倍である。
本願方法による逆転写酵素量の決定は、通常0.0001〜
１ユニット程度の逆転写酵素が決定しうる感度の良いも
のである。
また、本発明の体液中の逆転写酵素中和抗体検出によ
る被検者のレトロウイルス感染の確認法を行なうに際し
ては、被検体液および逆転写酵素存在下、基質として少
なくともビオチン化dUTPを用い、これをポリＡおよびオ
リゴdTと反応させる。この工程は、予め酵素活性を測定
した逆転写酵素含有溶液を通常0.001〜１ユニット、好
ましくは0.001〜0.01ユニットに調製し、これと被検体
液とを混合し、約４℃で通常0.1〜２時間、好ましくは1
0〜60分間プレインキュベートした後、更にポリＡと基
質としてのビオチン化dUTPを通常0.5〜100μＭ、好まし
くは１〜５μＭ含有する、pH6.5〜８に調整したトリス
−塩酸緩衝液等の緩衝溶液が存在する固相化オリゴdTへ
加え、約37℃で0.5〜24時間程度インキュベートする。
逆転写酵素としては、ヒト免疫不全ウイルス１型（HI
V）、ヒト免疫不全ウイルス２型、アカゲザル免疫不全
ウイルス、マウス乳腺腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウ
イルスＩ型、ウラス株トリ肉腫ウイルス、ラウス関連ウ
イルス２型、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）などのレトロウ
イルス等のウイルス粒子を非イオン性界面活性剤、例え
ば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（ト
リトンＸ−100、NP−40）で溶解処理して得たものを使
用することができる。
また、被検体液としては、逆転写酵素に対する抗体を
もつ人体に含有されまたは産生される任意の体液であれ
ばよく、好ましくは血清である。
血清は、30〜50％飽和硫安で沈澱させたもの、あるい
はDEAE、QAE−セファデックス等陽イオン交換樹脂を通
過させたものが通常用いられる。
反応および未反応ビオチン化dUTPの分離およびそれら
の量を測定する方法も、前述の逆転写酵素の決定方法に
準じれば良い。
かくして測定系中の反応または未反応ビオチン化dUTP
量が求められるのであるが、系中の逆転写酵素は被検体
液由来の抗体により失活され、この結果、反応ビオチン
化dUTP量が減少する。従って、陽性体液コントロールお
よび陰性体液コントロールを指標とすることにより体液
中の逆転写酵素中和抗体価を測定することができ、この
抗体価は、その被検体液を持つ被検者のレトロウイルス
感染の有無の確認の指標となる。
本発明においても、ポリＡ（平均鎖長:255塩基）と固
相化オリゴdT（平均鎖長:21.5塩基）の量的関係は、固
相化オリゴdTを１（モル比）としたときに、ポリＡを11
50〜0.3の比とすることが好ましく、適宜、固相化オリ
ゴdTの単位表面積当たりの結合量において好ましいポリ
Ａの量とすれば良い。
また、より検出感度を上げるために標識基質のほか更
に基質としてdTTPを加えることができる。このような目
的のために使用されるdTTPの量は、通常標識基質である
ビオチン化dUTP量に比しモル比で２倍〜20倍、好ましく
は３〜４倍である。
本発明方法を有利に実施するためには、例えば 人為的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチド
鋳型RNA、 鋳型RNAに相補的な固相化オリゴデオキシチミンヌ
クレオチド、 ビオチン化デオキシウリジントリホスフェート、お
よび ビオチン量測定用試薬、 を含有してなる逆転写酵素測定用キットを利用すること
ができる。
これらキットは、溶液状態のものであっても良いが、
使用時に脱イオン水、生理食塩水、各種緩衝液等で溶解
するような凍結乾燥試薬とすることもできる。
［発明の効果］ 本発明方法により、例えばHIVの保持者のリンパ球培
養上清中の逆転写酵素活性を放射性標識を使わずに検出
することが可能となった。また、AIDS発症と密接に関連
のある抗逆転写酵素中和抗体量も放射性物質を使用せず
測定できるようになったので、HIVキャリヤーの発症の
可能性等を容易に監視することができる。
特に本発明方法は、固相化オリゴdTを用いているの
で、反応時間が短くてすみ、また、反応生成物と未反応
物の分離が極めて容易であるので、測定時間の短縮、多
数のサンプル数を処理すること等が可能となり、機械化
に好都合である。
また、オリゴdTを１（モル比）としてポリＡを0.3〜1
150の比とした場合には感度良く、さらにポリＡを７〜7
0とした場合には更に好ましく測定することが可能とな
った。
［実施例］ 以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は何らこれに限定されるものではない。
実施例 １ 固相化プライマーを利用した固液相系による逆転写酵素
反応と液相系逆転写酵素反応との反応速度の比較： （１）オリゴdT12-18のアミノ化プレートへの固定 100mM １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩（CDIと略す；ペプチド研
究所製）と100mM １−メチル−イミダゾール−塩酸緩
衝液（pH7.0;IMDと略す;SIGMA社製）を含む水溶液に、
オリゴdT12-18（平均鎖長:15塩基、平均分子量:4,950ダ
ルトン；ファルマシア社製）を200ng/50μｌとなるよう
に溶解し、その50μｌずつをアミノプレート（底面積:
0.32cm2;住友ベークライト社製）のウェルに分注（反応
液が接触するウエルの表面積は0.63cm2）し、室温で24
時間反応させた。反応後、この溶液を捨て、0.15M NaCl
を含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5;以下、TBSと呼
ぶ）の200μｌでウェルを洗浄し、同じく２回、緩衝液2
00μｌで洗浄し、これを固相化プライマー（オリゴdT
12-18固定プレート）とした。
（２）固相化プライマーを用いた逆転写酵素反応 逆転写酵素によるDNA鎖伸長反応を行なわせるのに、
２倍濃度の反応緩衝液（100mM トリス−塩酸緩衝液（p
H7.8）、24mMジチオスレイトール、2.4mM還元型グルタ
チオン、20mM MgCl2、320mM KCl、2mMエチレングリコー
ル四酢酸、0.4％トリトンＸ−100、４％エチレングリコ
ールからなる緩衝液）の50μｌに１μｇのポリＡ（平均
鎖長:255塩基、平均分子量:86,700ダルトン；ファルマ
シア社製）、0.4nmolのビオチン化−11−dUTP（エンゾ
社製）を添加し、これを上記（１）に記載の如くして得
られた固相化プライマーのウェルに分取した。次にリン
酸緩衝生理食塩水（pH7.4;以下、PBSと呼ぶ）にて15mU/
50μｌに調製した逆転写酵素（ウラス関連ウイルス２型
（RAV−２）由来、宝酒造製）を50μｌウェルに加え、
混合した後、37℃で１、２、３および24時間作用せしめ
た。
（３）酵素反応生成物（ビオチン化DNA）の定量 上記（２）に記載の如くして得られたそれぞれの反応
液に10μｌの5M NaClを添加し、５分間放置後、0.5M Na
Clと0.05M MgCl2を含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH9.
5;以下、洗浄液と呼ぶ）の200μｌにてウェルを洗浄
し、同じく２回から４回、洗浄液200μｌで洗浄した。
次いで、洗浄液に溶解した３％牛血清アルブミンの10
0μｌをウェルに分取し、37℃で１時間インキュベート
した。３％牛血清アルブミン液を捨てた後、洗浄液で10
00倍に希釈したアルカルホスフェターゼ標識ストレプト
アビジン（最終濃度0.088μg/ml、BRL社製）の50μｌを
ウェルに分取し、室温で１時間インキュベートした。
200μｌの洗浄液にて同様にウェルを３回から５回洗
浄して余分なアルカリホスファターゼ標識ストレプトア
ビジンを除去した後、ウェルに残っているアルカリホス
ファターゼの酵素活性を測定することにより、ビオチン
化DNAの定量とした。
アルカリホスファターゼの酵素活性の測定は、パラニ
トロフェニルホスフェートを1mM MgCl2を含む50mMジエ
タノールアミン−塩酸緩衝液（pH9.5）にて1mg/mlにな
るよう溶解し、その50μｌを各ウェルに加え、37℃で30
分インキュベートし、次いで、0.5規定NaOHの50μｌを
その反応液へ添加することにより酵素反応を終了させ、
アルカリホスファターゼ活性により呈色した吸収波長40
5nmの吸光度をプレートリーダー（Ｊ−2000型、インタ
ーメット社製）にて測定することによって行なった。
15mUの逆転写酵素を使用して１時間、２時間、３時
間、及び24時間反応せしめた時に得られた吸光度を第１
表に示す。
上記結果が示すように、伸長鎖反応には時間依存性が
あった。そして、この測定法においては、吸光度0.1以
上にて信頼できる測定値が得られることが知られている
ので、本発明方法によれば、反応開始後１時間で既に定
量を行なうことができることが理解される。これに対
し、以下に示す参考例１の比較方法（液相系での反応）
では反応開始後２時間においてやっと測定できた。
この様に固相化プライマーを使用して逆転写酵素反応
させる本発明方法は、液相系での反応の時よりも短い時
間で逆転写酵素の活性を測定することが出来、より優れ
たものであることが明らかである。
参考例 １ 液相系に於ける逆転写酵素反応生成物の経時変化 実施例１（２）に記載した２倍濃度の逆転写酵素反応
緩衝液50μｌに、１μｇのオリゴdT12-18、0.1μｇのポ
リＡ、0.4nmolのビオチン化−11−dUTPを添加し、そこ
へ15mUのRAV−２由来逆転写酵素を加えて全量を100μｌ
とし、37℃で１、２、３および24時間の各時間作用せし
めた。
この反応液に10倍量の1N塩酸と0.1Mピロリン酸ナトリ
ウム塩を含む溶液を添加し、攪拌混合した後、10分間氷
冷した。この溶液を、ナイロン膜100cm2（日本ポール社
製；商品名バイオダイン）を装着した96穴マニホールド
（BRL社製）で吸引、濾過し、伸長操作をせしめたビオ
チン化DNA鎖をナイロン膜へと吸着せしめた。
ここで得られたビオチン化DNAを吸着したナイロン膜
に、緩衝液１（0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、0.1
5M NaClとからなる緩衝液）に３％BSAを添加し、65℃で
１時間インキュベートした。該溶液からビオチン化DNA
を吸着したナイロン膜を取りだし、次に緩衝液１で1000
倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識ストレプトア
ビジン溶液中に、ナイロン膜100cm2当り該溶液7mlの割
合で10分間置いた。続いて、ナイロン膜を緩衝液1100ml
に15分間曝し、同じく後２回ビオチン化DNA鎖を吸着し
たナイロン膜を緩衝液１ 100mlに15分間曝し洗浄し
た。
更に、ビオチン化DNA鎖を吸着したナイロン膜を取り
だし、緩衝液２（0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH9.5）、
0.1M NaCl及び50mM MgCl2からなる緩衝液）100mlで10分
間洗浄した。
発色は、0.33mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム（N
BT）と0.17mg/mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドール−リン酸塩（BCIP）を含む緩衝液２（ナイロン膜
100cm2当り7.5mlの割合で使用する）中に30分間置い
た。ナイロン膜上に出現した発色スポットを、デンシト
メーター（CS−930、島津製作所製）を用い、波長550nm
で測定した。
液相系に於ける逆転写酵素反応の１、２、３および24
時間に於ける反応生成物の面積強度を第２表に示す。
この測定条件においては、面積強度が７×103以上で
信頼できる測定が可能である。
従って、液相系の逆転写酵素反応では、反応開始後１
時間ではまだ定量性のある十分な面積強度は得られず、
開始後２時間から定量可能な面積強度が得られた。
実施例 ２ ポリＡならびにポリdAを鋳型とした時の逆転写酵素反応 実施例１（２）に記載した２倍の濃度の反応緩衝液の
50μｌに、0.24nmolのビオチン化−11−dUTPおよび0.96
nmolのdTTP（ベーリンガーマンハイム社製）と、鋳型と
して１μｇのポリＡまたはポリdAとを添加し、これを実
施例１（１）の記載に準じて調製したオリゴdT
19-24（平均鎖長:21.5塩基、平均分子量:7,095ダルト
ン；ファルマシア社製）固相化プレートのウェルに分取
した。次にPBSにて1mU/50μｌに調製したRAV−２由来逆
転写酵素50μｌを該ウェルに加え、混合した後、37℃で
18時間インキュベートして逆転写酵素を作用せしめた。
その後、実施例１（３）に記載した手法で、伸長したビ
オチン化DNAを測定した。鋳型にポリＡおよびポリdAを
使用して逆転写酵素を作用せしめた時に得られた吸光度
を第３表に示す。
この様に、ポリdAでは逆転写酵素は作用せず、鋳型を
ポリＡにすることで逆転写酵素を特異的に測定すること
が出来た。
実施例 ３ アミノ化プレート上のオリゴdT19-24とポリＡの至適量
の検討： （１）オリゴdT19-24の標識 逆転写酵素反応にとって最も効率の良いプライマーと
鋳型の量比を決定する為に、アミノプレートのウェルに
実際に結合したオリゴdT19-24量を以下の方法により調
べた。まず、10μｇのオリゴdT19-24を20μｌの水に溶
解し、これに10倍の濃度のカイネーション緩衝液（500m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）、100mM MgCl2、100mM2
−メルカプトエタノール）を２μｌ、10μCi/μｌの
［γ−32P］ATPを１μｌ、20ユニット／μl T4ポリヌク
レオチドキナーゼを１μｌ添加し、37℃で30分インキュ
ベートすることにより、オリゴdT19-24の５′末端を
［γ−32P］標識した。30分後、反応生成物のうち2ngを
ペーパークロマトグラフ法により展開し（展開液は350m
Mギ酸アンモニウム）、濾紙を乾燥後５等分して原点に
放射活性があること、即ちオリゴdTが［γ−32P］標識
されていることを確認した。展開し、５等分した濾紙を
原点から１、２、３、４、５と番号をつけ、測定したそ
れぞれの放射活性を第４表に示した。
放射活性の91％は原点、即ちオリゴdT19-24の局在す
る画分にあり、オリゴdT19-24は［γ−32P］標識された
ことが確認された。
また第４表から、 ラベル率:91％ 比活性 :2.3×106cpm/μｇ と計算された。
残った反応液に更に30μｌの水を加えて全量を50μｌ
とし、これに等量のフェノール（予め1mM EDTAを含む10
mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で飽和させたもの）を
加えて攪拌した後、水層を回収した。これに５μｌの3M
酢酸ナトリウムならびに150μｌの冷エタノールを加
え、−80℃で15分間冷却した。遠心分離後、上清を除
き、残ったペレットを冷75％エタノールで２回洗浄し
た。
（２）オリゴdT19-24のアミノ化プレートへの固定と結
合したオリゴdT19-24の定量残ったペレット（標識オリ
ゴdT）を真空乾燥し、水で0.1μg/μｌになる様に溶解
し、これを2,000ng/50μｌ、200ng/50μｌ、20ng/50μ
ｌ、2ng/50μｌおよび0.2ng/μｌとなるように実施例１
（１）記載のCDIとIMDを含む水溶液で希釈し、その50μ
ｌをひとつのウェルずつに分断したアミノプレートに分
注し、室温で24時間反応させた。反応後、実施例１
（１）の記載通りに洗浄し、ウェルに残った放射活性を
測定した。
各標識オリゴdT量を使用した時にアミノプレートのウ
ェルに残った放射活性と標識オリゴdTの比活性（2.3×1
06cpm/μｇ）ならびに平均分子量（7.095ダルトン）か
ら計算されるアミノプレートへ結合したオリゴdT19-24
実質量ならびにオリゴdT反応液が接触するウェルの表面
積（0.63cm2）から計算される単位面積当りのオリゴdT
19-24の結合モル数を第５表に示す。
以上の結果から、アミノプレートの１ウェルに結合し
たオリゴdT19-24量は、添加したオリゴdT19-24量に比例
して増加し、オリゴdT19-24を2,000ng添加した場合に、
20ng/1ウェル結合した。
アミノプレートの１ウェルは、底面積0.32cm2の円柱
型であって、オリゴdT19-24の結合反応の総液量が50μ
ｌであることから、オリゴdT19-24が結合し得るウェル
上の表面積は0.63cm2となり、オリゴdT19-24（平均鎖
長:21.5塩基）の平均分子量が7,095ダルトンであるか
ら、ウェル単位表面積当りの結合オリゴdT量は、4.655p
mol/cm2程度までであった。
（３）逆転写酵素によるDNA鎖伸長反応に於ける鋳型と
固相化プライマーの至適量の検討 実施例１（２）で記載した２倍濃度の反応緩衝液の50
μｌに、0.24nmolのビオチン化−11−dUTPおよび0.96nm
olのdTTPと、10μｇ、１μｇ、100ng、10ngおよび1ngの
各量のポリＡ（平均鎖長:255塩基、平均分子量86,700ダ
ルトン）とを添加し、これを実施例３（２）で判明した
各種のオリゴdT19-24が結合した固相化プレートのウェ
ルに分取した。次にPBSにて0.1mU/50μｌに調製したRAV
−２由来逆転写酵素50μｌを該ウェルに加え、混合した
後、37℃で18時間インキュベートして逆転写酵素を作用
せしめた。その後、実施例１（３）に記載した手法で、
伸長したビオチン化DNAを測定した。
各ポリＡ量と固相化オリゴdT19-24量の組み合わせに
ついて0.1mUのRAV−２由来逆転写酵素を37℃で18時間作
用せしめた時に得られた吸光度を第６表に示した。
以上の結果から、信頼し得る最低の吸光度（約0.1程
度）を得る為のアミノプレートに結合しているオリゴdT
19-24（平均鎖長:21.5塩基、平均分子量7,095ダルト
ン）の量は、0.7ng（即ち0.15pmol/cm2）以上、好まし
くは10ng（即ち2.6pmol/cm2）程度であればよく、それ
以上のオリゴdTを結合させても吸光度にはあまり差が見
られなかった。
また、この範囲の量の固相化オリゴdT19-24で0.1程度
の吸光度を得る為のポリＡ（平均鎖長:255塩基、平均分
子量:86,700ダルトン）の量は100ng（即ち1.83pmol/c
m2）以上、好ましくは１μｇ（即ち18.3pmol/cm2）から
10μｇ（即ち183pmol/cm2）であった。これらの事か
ら、逆転写酵素反応に最も好ましい固相化オリゴdT
19-24:ポリＡの組み合わせは、固相化されたオリゴdT
19-24を１としてモル比で1150〜0.3であり、更に好まし
くは、70〜７であった。
実施例 ４ 上記実施例の結果より得られた至適な条件のひとつで
ある10ngの固相化オリゴdT19-24と１μｇのポリＡの組
み合わせに於て、実施例２に従って、37℃で18時間逆転
酵素反応を行なった。
この時、RAV−２由来逆転酵素の存在量を０、0.01、
0.1、１および10mU（以上、溶液量は各々50μｇ）とし
て各々実施し、その後実施例１（３）に従って吸光度を
測定した時に第７表に示す吸光度が得られた。この表か
ら明らかなように吸光度は酵素量に依存していた。
実施例 ５ 逆転写酵素活性阻止抗体の定量 Molt−４細胞（大日本製薬（株）より購入）をヒト免
疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus;HIV）
に感染させ、この細胞を10％牛胎児血清を添加したRPMI
−1640培地（ギブコ社製）中、炭酸ガス濃度５％、37℃
で２週間前後培養した。
培養上清を30,000rpmで１時間遠心してウイルス粒子
ペレット（106個）を取得し、これを0.5％トリトンＸ−
100、0.8mM NaCl、0.5mMフェニルメチルスルフォニルフ
ロライド、20％グリセリン及び50mMトリス−塩酸（pH7.
8）とからなる緩衝液に懸濁し、酵素液とした。
一方、HIV感染者から得た血清を50mMエチレンジアミ
ン−酢酸緩衝液（pH7.0）にて20倍に希釈し、その1mlを
QAE−セファデックスＡ−50カラム（ゲルベット1ml）へ
通し、その素通り画分4mlを、部分精製した抗逆転写酵
素抗体として使用した。
最初に、25μｌの上述した酵素液と25μｌの抗体原
液、1/10及び1/100希釈液あるいはPBSをそれぞれ混合
し、４℃で30分間インキュベートした。実施例２で記述
した手法に従って、この混合液中に残存している逆転写
酵素活性を測定した。その結果第８表に示すような吸光
度が得られ、血清中に存在する抗逆転写酵素抗体が定量
された。
実施例 ６ オリゴdT鎖長の違いによる逆転写酵素反応 鎖長がそれぞれ、８、10、12、15、12〜18、19〜24、
25〜30および272のオリゴdT（すべてファルマシア社
製）の200ngずつを実施例１（１）に記載した方法でア
ミノプレートに固定し、実施例２の条件で１μｇのポリ
Ａを用いて0.1mUの逆転写酵素を作用せしめ、実施例１
（３）に記載の方法に準じて伸長したビオチン化DNAを
測定した。
オリゴdTの長さと吸光度の程度の関係を第９表に示し
た。オリゴdT鎖の長さに応じて吸光度は上昇した。鎖の
長さは、10以下においては好ましくなく、12以上におい
て好ましい結果であり、従って通常、鎖の長さは11以上
で用いられることが確認された。
実施例 ７ dTTP添加量によるビオチン化DNAの検出感度の変化 実施例１（１）の記載に準じて固定したオリゴdT
19-24固定プレートに、実施例１（２）で記載した２倍
濃度の反応緩衝液45μｌを分取し、１μg/μｌのポリＡ
を１μｌ加えた。一方、ビオチン化−11−dUTPとdTTPを
その混合モル比でそれぞれ1:0、1:3、1:4、1:5.7、1:
9、1:12.3、1:19、1:24、1:29、1:39、1:49および1:99
となるように混合し、これらの混合液をビオチン化−11
−dUTPとdTTPを併せて最終農度が0.3mMになる様に調製
した。これらの0.3mMビオチン化−11−dUTPとdTTPの混
合液をそれぞれ４μｌ（1.2nmol）ずつ、前述のオリゴd
T19-24固定プレートに加え、反応緩衝液と１μｇポリＡ
からなる溶液と混合した。更にPBSで1mU/50μｌとなる
様に調製したRAV−２由来逆転写酵素の50μｌを各ウェ
ルに加え、混合した後に37℃で18時間インキュベート
し、実施例１（３）の記述に準じてビオチン化DNAを定
量した。ビオチン化−11−dUTPとdTTPの各混合モル比に
於ける吸光度を第10表に示した。
この結果から明らかなように、ビオチン化−11−dUTP
とdTTPの混合モル比が1:4の時に最も良い感度が得られ
た。
実施例 ８ オリゴdTプライマーを固定したカルボキシル化プレート
上での逆転写酵素反応 DNA合成機（サイクロン、バイオサーチ社製）により
合成した、５′末端のリン酸基にアミノ基を修飾したオ
リゴdT20200ngを25μｌの水に溶解した。これをカルボ
プレート（住友ベークライト社製）のウェルに入れた。
次に200mM CDIを含む200mM IMD、25μｌをウェルに分取
し、液を混合した後、室温で24時間インキュベートし
た。反応後、この液を捨て、TBS200μｌにてウェルを３
回洗浄し、固相化プライマーとした。
0.1mU、0.5mU、1mUおよび10mUのRAV−２由来逆転写酵
素を用い、実施例２に記載の方法に準じて測定した。逆
転写酵素量0.1mU、0.5mU、1mUおよび10mUで伸長鎖反応
を行なった時に得られた吸光度は第11表に示した通りで
あり、測定が可能であった。
実施例 ９ オリゴdT19-24を紫外線照射により固相化したマイクロ
プレート上での逆転写酵素反応 200ngのオリゴdT19-24を、0.1M MgCl2を含むPBS 50
μｌ中に溶解し、これをマイクロタイタープレート（住
友ベークライト社製）に分取し、室温で24時間放置し
た。次いで、この容器を捨て、波長254nmの紫外線を３
分間、プレートに照射してオリゴdT19-24をプレート上
に固定し、TBS200μｌにてウェルを３回洗浄し、これを
使用して実施例８と同じ条件で逆転写酵素反応を行なっ
た。逆転写酵素量0.1mU、0.5mU、1mUおよび10mUで伸長
反応を行なった時に得られた吸光度を第12表に示す。
フロントページの続き (56)参考文献 国際公開90／6373（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，78（1981）ｐ．6633−6637 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12Q 1/70 G03N 33/573

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも、水性媒体中で、人為的に調製
    されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNA、該アデ
    ニンリボポリヌクレオチド鋳型RNAに相補的な固相化さ
    れたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビオチン
    化デオキシウリジントリホスフェートとを被検液の存在
    下反応せしめ、該反応の反応生成物と未反応のビオチン
    化デオキシウリジントリホスフェートを分離した後、反
    応生成物もしくは未反応のビオチン化デオキシウリジン
    トリホスフェートの量を測定することを特徴とする被検
    液中の逆転写酵素の決定方法。
  2. 【請求項２】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末
    端と固相とが化学結合している固相化されたオリゴデオ
    キシチミンヌクレオチドである請求項第１項記載の決定
    方法。
  3. 【請求項３】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、11塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求
    項第１項記載の決定方法。
  4. 【請求項４】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、0.15pmol/cm2〜5.0pmol/cm2であり、アデニ
    ンリボポリヌクレオチド鋳型RNAが、固相化されたオリ
    ゴデオキシチミンヌクレオチドを１としてモル比で1150
    〜0.3の比でハイブリダイズせしめたものである請求項
    第１項記載の決定方法。
  5. 【請求項５】反応に際し、さらにデオキシチミジントリ
    ホスフェートを含有せしめることを特徴とする請求項第
    １項記載の決定方法。
  6. 【請求項６】少なくとも、水性媒体中で、人為的に調製
    されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型RNA、該アデ
    ニンリボポリヌクレオチド鋳型RNAに相補的な固相化さ
    れたオリゴデオキシチミンヌクレオチドおよびビオチン
    化デオキシウリジントリホスフェートとを被検体液およ
    び逆転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物
    と未反応のビオチン化デオキシウリジントリホスフェー
    トを分離した後、反応生成物もしくは未反応のビオチン
    化デオキシウリジントリホスフェートの量を測定し、こ
    の量から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を求めるこ
    とを特徴とする被検者のレトロウイルスの感染確認法。
  7. 【請求項７】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末
    端と固相とが化学結合している固相化されたオリゴデオ
    キシチミンヌクレオチドである請求項第６項記載の感染
    確認法。
  8. 【請求項８】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、11塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求
    項第６項記載の感染確認法。
  9. 【請求項９】固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレ
    オチドが、0.15pmol/cm2〜5.0pmol/cm2であり、アデニ
    ンリボポリヌクレオチド鋳型RNAが、固相化されたオリ
    ゴデオキシチミンヌクレオチドを１としてモル比で1150
    〜0.3の比で混合してハイブリダイズせしめた請求項第
    ６項記載の感染確認法。
  10. 【請求項１０】反応に際し、さらにデオキシチミジント
    リホスフェートを含有せしめることを特徴とする請求項
    第６項記載の感染確認法。
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