JP3366978B2 - 特異的結合性アッセイ試薬の固定化 - Google Patents
特異的結合性アッセイ試薬の固定化Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、一般的には、固相支持体上への特異的結合
性アッセイ試薬の固定化のための方法の分野に関する。
特に、本発明は、水溶性ポリマーを用いて試薬を固相支
持体上へ固定化する方法に関する。本発明はまた、診断
試験において有用な試薬を固定化してある固相支持体に
も関する。
性アッセイ試薬の固定化のための方法の分野に関する。
特に、本発明は、水溶性ポリマーを用いて試薬を固相支
持体上へ固定化する方法に関する。本発明はまた、診断
試験において有用な試薬を固定化してある固相支持体に
も関する。
発明の背景
in vitro診断アッセイは、体液サンプル又は組織サン
プル中に見出される被分析物の量を測定するために使用
できる。被分析物は、該サンプル中に見出される他の成
分から識別されなければならない。被分析物は、その被
分析物に対する特異的レセプターと該被分析物とを反応
させることによって、他のサンプル成分から識別するこ
とができる。被分析物を識別しそして定量するための特
異的レセプターを利用するアッセイは、しばしば特異的
結合アッセイと呼ばれる。
プル中に見出される被分析物の量を測定するために使用
できる。被分析物は、該サンプル中に見出される他の成
分から識別されなければならない。被分析物は、その被
分析物に対する特異的レセプターと該被分析物とを反応
させることによって、他のサンプル成分から識別するこ
とができる。被分析物を識別しそして定量するための特
異的レセプターを利用するアッセイは、しばしば特異的
結合アッセイと呼ばれる。
最も普通のレセプターは、抗体及び、内因子又は葉酸
結合性タンパク質のような特異的結合性タンパク質であ
る。レセプターは、被分析物又は該被分析物の類縁体に
対して可逆的な特異的結合親和性を有することによって
特徴づけられる。該類縁体は、一般的に被分析物の、酵
素、蛍光性分子その他の既知の標識を担持した誘導体で
あって、しかも該被分析物とほぼ同一の特異性及び親和
性を以てレセプターと結合するものである。
結合性タンパク質のような特異的結合性タンパク質であ
る。レセプターは、被分析物又は該被分析物の類縁体に
対して可逆的な特異的結合親和性を有することによって
特徴づけられる。該類縁体は、一般的に被分析物の、酵
素、蛍光性分子その他の既知の標識を担持した誘導体で
あって、しかも該被分析物とほぼ同一の特異性及び親和
性を以てレセプターと結合するものである。
技術的及び特許文献に記述されている不均質の特異的
結合アッセイにおいては、特異的結合反応のレセプター
又は他のアッセイ試薬は、しばしば固相上に固定化され
る。これらの試薬の固定化は、結合した成分（例えばレ
セプターを介して該固相に結合した被分析物）を未結合
の成分から分離するために必要とされる。
結合アッセイにおいては、特異的結合反応のレセプター
又は他のアッセイ試薬は、しばしば固相上に固定化され
る。これらの試薬の固定化は、結合した成分（例えばレ
セプターを介して該固相に結合した被分析物）を未結合
の成分から分離するために必要とされる。
レセプター又は他の試薬を固相上に固定化することの
できる種々の方法には、吸着、吸収又は共有結合による
結合が含まれる。しかしながら、そのようなアッセイに
おいて使用される固相支持体の多くは、不活性ではな
く、タンパク質及び他の物質を非特異的結合によってサ
ンプルから隠蔽し得る。ガラスは比較的不活性な基質で
はあるが、一般に、固相結合アッセイにおいて使用する
ためには不満足であることが見出されている。ガラス基
質の不十分性についての議論に関しては、例えば米国特
許第3,790,653号を参照。
できる種々の方法には、吸着、吸収又は共有結合による
結合が含まれる。しかしながら、そのようなアッセイに
おいて使用される固相支持体の多くは、不活性ではな
く、タンパク質及び他の物質を非特異的結合によってサ
ンプルから隠蔽し得る。ガラスは比較的不活性な基質で
はあるが、一般に、固相結合アッセイにおいて使用する
ためには不満足であることが見出されている。ガラス基
質の不十分性についての議論に関しては、例えば米国特
許第3,790,653号を参照。
しかしながら最近、試薬の、本質的に水溶性の免疫複
合体と該試薬に対する抗血清とを、不活性のガラス繊維
固相支持体上に固定化するための手順が記述されてい
る。これらの手順は、参照によりここに導入される米国
特許第4,517,288号に開示されている。
合体と該試薬に対する抗血清とを、不活性のガラス繊維
固相支持体上に固定化するための手順が記述されてい
る。これらの手順は、参照によりここに導入される米国
特許第4,517,288号に開示されている。
これらの免疫学的固定化手順においては、少なくと２
種の免疫化学的に反応性の物質を互いに溶液中において
組み合わせることによって、可溶性の免疫複合体が調製
される。そのような免疫化学的に反応性の材料の少なく
とも１つは、関係被分析物に対するその免疫化学的特異
性のために選択される。例えば、もし該可溶性の免疫複
合体を、TSHの検出のためにイムノアッセイにおいて使
用しようとするならば、該免疫複合体の一の構成要素
は、TSHに対するその免疫化学的特異性のために選択さ
れる。典型的な一例は、TSHに対し特異性を有する抗
体、すなわち、抗TSH抗体であろう。該免疫複合体の第
２の構成要素は、該抗TSH抗体に対して向けられた抗体
調製物を含んでなることができよう。抗被分析物抗体
（例えばマウス抗TSH抗体）に対する抗血清は、精製さ
れたマウスIgGをホスト動物（すなわち、ヤギ）に注射
し、その後該マウスIgGに対する抗血清を収穫すること
により調製することができる。該マウス抗TSH抗体及び
マウスIgGに対するヤギ抗血清は、その後標準原液とし
て構成される。
種の免疫化学的に反応性の物質を互いに溶液中において
組み合わせることによって、可溶性の免疫複合体が調製
される。そのような免疫化学的に反応性の材料の少なく
とも１つは、関係被分析物に対するその免疫化学的特異
性のために選択される。例えば、もし該可溶性の免疫複
合体を、TSHの検出のためにイムノアッセイにおいて使
用しようとするならば、該免疫複合体の一の構成要素
は、TSHに対するその免疫化学的特異性のために選択さ
れる。典型的な一例は、TSHに対し特異性を有する抗
体、すなわち、抗TSH抗体であろう。該免疫複合体の第
２の構成要素は、該抗TSH抗体に対して向けられた抗体
調製物を含んでなることができよう。抗被分析物抗体
（例えばマウス抗TSH抗体）に対する抗血清は、精製さ
れたマウスIgGをホスト動物（すなわち、ヤギ）に注射
し、その後該マウスIgGに対する抗血清を収穫すること
により調製することができる。該マウス抗TSH抗体及び
マウスIgGに対するヤギ抗血清は、その後標準原液とし
て構成される。
これらの原液を一旦調製すると、緩衝された媒質に添
加することによって、各々の一部が他と組み合わされ
る。得られた免疫複合体は、緩衝剤の適当な液量中に入
れて、ガラス繊維フィルターの境界の定まった領域上に
スポットされる。代わりとしては、この免疫複合体の２
つの構成要素が、別々の緩衝溶液として該フィルターに
適用され、その場所で反応することが許容されてもよ
い。両方の例において、該免疫複合体を適用する点は、
該固相内の反応区域を規定する。適用された免疫複合体
は、該ガラス繊維フィルター内の繊維床の間隙中に吸着
されそして捕捉される。適用の方法には、手動の若しく
は自動化されたピペットによる、又は他の、アッセイ分
析装置を含む自動化された装置による該免疫複合体溶液
の分配が含まれ得る。該固相への該免疫複合体の適用及
び適当なインキュベーション時間の経過に続き、該固相
は、制御された条件下において乾燥され、多くの固相特
異的結合アッセイプロトコールの何れにおいても使用で
きる、安定な反応性試薬を与える。
加することによって、各々の一部が他と組み合わされ
る。得られた免疫複合体は、緩衝剤の適当な液量中に入
れて、ガラス繊維フィルターの境界の定まった領域上に
スポットされる。代わりとしては、この免疫複合体の２
つの構成要素が、別々の緩衝溶液として該フィルターに
適用され、その場所で反応することが許容されてもよ
い。両方の例において、該免疫複合体を適用する点は、
該固相内の反応区域を規定する。適用された免疫複合体
は、該ガラス繊維フィルター内の繊維床の間隙中に吸着
されそして捕捉される。適用の方法には、手動の若しく
は自動化されたピペットによる、又は他の、アッセイ分
析装置を含む自動化された装置による該免疫複合体溶液
の分配が含まれ得る。該固相への該免疫複合体の適用及
び適当なインキュベーション時間の経過に続き、該固相
は、制御された条件下において乾燥され、多くの固相特
異的結合アッセイプロトコールの何れにおいても使用で
きる、安定な反応性試薬を与える。
免疫学的固定化は、種々のアッセイ方式において有用
ではあるが、多くの固有の欠点を含むことが認識されて
いる。フィルター上の追加の免疫グロブリン（例えば、
抗被分析物抗体に対する抗血清）の存在は、タンパク質
性の及び他の生物学的材料の、非特異的結合をもたらし
得る。これは、アッセイの感度を有意に低下させ得る。
更に、同一の又は異なったホスト動物の別々の免疫から
得られるIgG調製物に固有の変動性があることから、製
造手順において、IgG調製物の力価、純度、特異性及び
親和性におけるロット間変動に対処しなければならな
い。同様に、原液中において免疫複合体が不均質に分布
する傾向によって、固相試薬の生産における変動に遭遇
し得る。すなわち、そのような免疫複合体は、実質的に
可溶性である一方、完全には可溶性を維持しないことも
あり得、経時的に溶液からいくらかの沈降を起こし得
る。原液の定期的な混合を以てしても、重力の影響、温
度勾配及び他の物理的影響が、該固相試薬に適用される
溶液内に微妙な不均質性を引き起こし得る。
ではあるが、多くの固有の欠点を含むことが認識されて
いる。フィルター上の追加の免疫グロブリン（例えば、
抗被分析物抗体に対する抗血清）の存在は、タンパク質
性の及び他の生物学的材料の、非特異的結合をもたらし
得る。これは、アッセイの感度を有意に低下させ得る。
更に、同一の又は異なったホスト動物の別々の免疫から
得られるIgG調製物に固有の変動性があることから、製
造手順において、IgG調製物の力価、純度、特異性及び
親和性におけるロット間変動に対処しなければならな
い。同様に、原液中において免疫複合体が不均質に分布
する傾向によって、固相試薬の生産における変動に遭遇
し得る。すなわち、そのような免疫複合体は、実質的に
可溶性である一方、完全には可溶性を維持しないことも
あり得、経時的に溶液からいくらかの沈降を起こし得
る。原液の定期的な混合を以てしても、重力の影響、温
度勾配及び他の物理的影響が、該固相試薬に適用される
溶液内に微妙な不均質性を引き起こし得る。
スターバースト・デンドリマー（starburst dendrime
rs）（The Dow Chemical Companyによって製造されてい
る）は、正確に規定された組成を有し且つ正確に規定さ
れた分子量を有する、球状の又は他の３次元形状のポリ
マーである。そのようなデンドリマーは、内部の及び外
部の部分を適当に選択することによって、水溶性高分子
として合成することが可能である。参照によりここに導
入される米国特許第4,507,466号及び第4,568,737号を参
照のこと。デンドリマーは、種々の薬剤的材料に並び
に、診断又は治療適用のために選ばれた身体部位へ接合
体を導くよう機能し得る、種々の標的分子に接合される
ことができる。参照によりここに導入するWO 8801178を
参照のこと。スターバースト・デンドリマーは、腫瘍の
治療及び診断のための放射性標識した抗体の比活性を高
めるための手段として、合成ポルフィリン（例えば、ヘ
ム、クロロフィル）を抗体分子に共有結合により連結す
るために使用されてきた。Roberts,J.C.et.al.,Using S
tarburst dendrimers as Linker Molecules to Radiola
bel Antibodies,Bioconjug.Chemistry 1:305−308（199
0）。
rs）（The Dow Chemical Companyによって製造されてい
る）は、正確に規定された組成を有し且つ正確に規定さ
れた分子量を有する、球状の又は他の３次元形状のポリ
マーである。そのようなデンドリマーは、内部の及び外
部の部分を適当に選択することによって、水溶性高分子
として合成することが可能である。参照によりここに導
入される米国特許第4,507,466号及び第4,568,737号を参
照のこと。デンドリマーは、種々の薬剤的材料に並び
に、診断又は治療適用のために選ばれた身体部位へ接合
体を導くよう機能し得る、種々の標的分子に接合される
ことができる。参照によりここに導入するWO 8801178を
参照のこと。スターバースト・デンドリマーは、腫瘍の
治療及び診断のための放射性標識した抗体の比活性を高
めるための手段として、合成ポルフィリン（例えば、ヘ
ム、クロロフィル）を抗体分子に共有結合により連結す
るために使用されてきた。Roberts,J.C.et.al.,Using S
tarburst dendrimers as Linker Molecules to Radiola
bel Antibodies,Bioconjug.Chemistry 1:305−308（199
0）。
発明の要約
本発明は、デンドリマーに特異的結合性アッセイ試薬
を共有結合によって連結しそして該デンドリマー−試薬
複合体を固相支持体の境界の定まった領域内に固定化す
ることによる、固相支持体の調製方法に関する。レセプ
ターのような試薬が、炭素−窒素（Ｃ−Ｎ）結合の形成
を含む（が限定はされない）結合方法によって、デンド
リマーに共有結合によって結合される。そのようなＣ−
Ｎ結合は、例えば、レセプターの炭水化物部分を酸化さ
せてアルデヒドし、該レセプターを該デンドリマーと組
み合わせ、次いで、得られたシッフ塩基を還元すること
によって形成することができる。該デンドリマーに該レ
セプターを結合させるための他の方法には、炭素−イオ
ウ（Ｃ−Ｓ）及び炭素−酸素（Ｃ−Ｏ）の結合の形成が
含まれる（限定はされない）。該Ｃ−Ｓ結合は、例え
ば、スルホスクシンイミジル−（４−イオドアセチル）
アミノベゾエート（SIAB）標識デンドリマーをスルフヒ
ドリル含有レセプターと組み合わせることにより、形成
することができる。Ｃ−Ｏ結合は、例えば、臭化シアン
活性化デンドリマーとレセプターのアミノ基との反応に
よって形成することができる。
を共有結合によって連結しそして該デンドリマー−試薬
複合体を固相支持体の境界の定まった領域内に固定化す
ることによる、固相支持体の調製方法に関する。レセプ
ターのような試薬が、炭素−窒素（Ｃ−Ｎ）結合の形成
を含む（が限定はされない）結合方法によって、デンド
リマーに共有結合によって結合される。そのようなＣ−
Ｎ結合は、例えば、レセプターの炭水化物部分を酸化さ
せてアルデヒドし、該レセプターを該デンドリマーと組
み合わせ、次いで、得られたシッフ塩基を還元すること
によって形成することができる。該デンドリマーに該レ
セプターを結合させるための他の方法には、炭素−イオ
ウ（Ｃ−Ｓ）及び炭素−酸素（Ｃ−Ｏ）の結合の形成が
含まれる（限定はされない）。該Ｃ−Ｓ結合は、例え
ば、スルホスクシンイミジル−（４−イオドアセチル）
アミノベゾエート（SIAB）標識デンドリマーをスルフヒ
ドリル含有レセプターと組み合わせることにより、形成
することができる。Ｃ−Ｏ結合は、例えば、臭化シアン
活性化デンドリマーとレセプターのアミノ基との反応に
よって形成することができる。
該試薬は、抗体又は抗体フラグメント、結合性タンパ
ク質、他のポリペプチド又は種々の生物活性非蛋白性分
子であることができる（限定はされない）。本発明にお
いて有用なデンドリマーには、反応性の官能性末端基を
有する水溶性デンドリマーが含まれる（限定はされな
い）。そのような反応性の官能基には、アミノ、カルボ
キシル及びスルフヒドリル官能基が含まれる（限定はさ
れない）。該デンドリマーは、22オングストローム
（Å）、54Å、95Å、及びより大きな、定まった直径を
含む（限定はされない）、種々の定まった直径を有する
ことができる。好ましい定まった直径は、54Å及び95Å
であり、最も好ましい定まった直径は54Åである。
ク質、他のポリペプチド又は種々の生物活性非蛋白性分
子であることができる（限定はされない）。本発明にお
いて有用なデンドリマーには、反応性の官能性末端基を
有する水溶性デンドリマーが含まれる（限定はされな
い）。そのような反応性の官能基には、アミノ、カルボ
キシル及びスルフヒドリル官能基が含まれる（限定はさ
れない）。該デンドリマーは、22オングストローム
（Å）、54Å、95Å、及びより大きな、定まった直径を
含む（限定はされない）、種々の定まった直径を有する
ことができる。好ましい定まった直径は、54Å及び95Å
であり、最も好ましい定まった直径は54Åである。
本発明はまた、デンドリマー−試薬複合体を吸着した
固相を含んでなる特異的結合アッセイ複合体をも含む。
該好ましい固相は、多孔性の不活性な固相である。該デ
ンドリマー−試薬複合体は、該試薬を該デンドリマーに
共有結合によって取り付けることにより調製される。
固相を含んでなる特異的結合アッセイ複合体をも含む。
該好ましい固相は、多孔性の不活性な固相である。該デ
ンドリマー−試薬複合体は、該試薬を該デンドリマーに
共有結合によって取り付けることにより調製される。
本発明はまた、サンプル中の被分析物の濃度又は存在
を測定するための、デンドリマー−試薬複合体を用いる
固相結合アッセイを実施するための方法を含んでなる。
を測定するための、デンドリマー−試薬複合体を用いる
固相結合アッセイを実施するための方法を含んでなる。
図面の簡単な説明
図１は、例として抗体（IgG）試薬を使用した、デン
ドリマー−試薬複合体中のＣ−Ｎ結合の産生のための、
シッフ塩基化学の概要的な表現である。
ドリマー−試薬複合体中のＣ−Ｎ結合の産生のための、
シッフ塩基化学の概要的な表現である。
図２は、例として抗体（IgG）試薬を使用した、デン
ドリマー−試薬複合体中におけるＣ−Ｓ結合の産生のた
めの、スルホスクシンイミジル−（４−イオドアセチ
ル）アミノベンゾエート（SIAB）に基づく化学の概要的
な表現である。
ドリマー−試薬複合体中におけるＣ−Ｓ結合の産生のた
めの、スルホスクシンイミジル−（４−イオドアセチ
ル）アミノベンゾエート（SIAB）に基づく化学の概要的
な表現である。
図３は、モノクローナル抗体CA2−デンドリマー複合
体との直接的特異的結合アッセイ方式による、hTSHの種
々の濃度についての較正曲線を描く。
体との直接的特異的結合アッセイ方式による、hTSHの種
々の濃度についての較正曲線を描く。
図４は、CA2−デンドリマー複合体（「CA2−DEND」）
と、免疫学的に固定化したモノクローナル抗体MAB−２
−ヤギ抗IgG（「現行タブ」）複合体とによる、hTSHの
直接的特異的結合アッセイについての較正曲線を描く。
と、免疫学的に固定化したモノクローナル抗体MAB−２
−ヤギ抗IgG（「現行タブ」）複合体とによる、hTSHの
直接的特異的結合アッセイについての較正曲線を描く。
図５は、CA−２デンドリマー複合体（「CA2−DEN
D」）と、免疫学的に固定化したモノクローナル抗体CA
−２ヒツジ抗IgG（「超高感度TSHタブ」）複合体とによ
る、hTSHの直接的特異的結合アッセイのための較正曲線
を描く。
D」）と、免疫学的に固定化したモノクローナル抗体CA
−２ヒツジ抗IgG（「超高感度TSHタブ」）複合体とによ
る、hTSHの直接的特異的結合アッセイのための較正曲線
を描く。
図６は、図５に描かれた下側末端データの拡大図であ
る。
る。
図７は、抗コルチゾルポリクローナル抗体−デンドリ
マー複合体（「コルチゾル−デンドリマー」）と、及び
免疫学的に固定化た抗コルチゾル抗体（「現行タブ」）
とによる、コルチゾールの競合的イムノアッセイのため
の較正曲線を描く。
マー複合体（「コルチゾル−デンドリマー」）と、及び
免疫学的に固定化た抗コルチゾル抗体（「現行タブ」）
とによる、コルチゾールの競合的イムノアッセイのため
の較正曲線を描く。
図８は、葉酸−デンドリマー複合体による競合的アッ
セイ方式を用いて、種々の濃度の葉酸についての較正曲
線を描く。
セイ方式を用いて、種々の濃度の葉酸についての較正曲
線を描く。
詳細な記述
本発明の固相支持体を調製するのに最も有用なデンド
リマーは、一般に、米国特許第4,507,466号に開示され
ているように「星」形を有する、球状の分枝したポリマ
ーである。該星形は、個々の枝が核又はコア領域から放
射しているものである組織立てられた分枝に由来する。
この多価のコアは、少なくとも２つの段、又は世代を経
て延びている少なくとも２つの規則正しい樹木状の（木
のような）枝に、共有結合により結合されている。最外
部の段又は世代は、種々の他の分子と化学的反応できる
官能基に終わるように誘導されることができる。こうし
て、スター・デンドリマーは、３つの顕著な建築的特
徴、すなわち（ａ）開始剤コア、（ｂ）該開始剤コアに
放射状に取り付けられた反復単位より構成された開始剤
層（各世代）、及び（ｃ）該最外世代に取り付けられた
末端官能性の外部表面を有する、単一分子構築物であ
る。
リマーは、一般に、米国特許第4,507,466号に開示され
ているように「星」形を有する、球状の分枝したポリマ
ーである。該星形は、個々の枝が核又はコア領域から放
射しているものである組織立てられた分枝に由来する。
この多価のコアは、少なくとも２つの段、又は世代を経
て延びている少なくとも２つの規則正しい樹木状の（木
のような）枝に、共有結合により結合されている。最外
部の段又は世代は、種々の他の分子と化学的反応できる
官能基に終わるように誘導されることができる。こうし
て、スター・デンドリマーは、３つの顕著な建築的特
徴、すなわち（ａ）開始剤コア、（ｂ）該開始剤コアに
放射状に取り付けられた反復単位より構成された開始剤
層（各世代）、及び（ｃ）該最外世代に取り付けられた
末端官能性の外部表面を有する、単一分子構築物であ
る。
デンドリマーのサイズ、形状及び反応性は、開始剤コ
アの選択、該デンドリマーを創り出す際に用いられる世
代数、そして各世代において用いられる反復単位の選択
によって、制御できる。用いる世代の数に応じて、個々
のサイズのデンドリマーが容易に得られる。加えて、表
面部分の全部又は一部の化学的修飾が、特定の診断的又
は治療的操作に適した新しい表面官能性を創り出し得
る。本発明において使用するのに適した全体として球状
のデンドリマーが、米国特許第4,507,466号及び米国特
許第4,568,737号に開示されている。代わりとしては、
米国特許第4,694,064に開示されているような非球形の
デンドリマーが、本発明において使用するために採用で
きる。好ましくは、該デンドリマーは、アミノ末端官能
基を有する官能性の付与された外部表面を有する。
アの選択、該デンドリマーを創り出す際に用いられる世
代数、そして各世代において用いられる反復単位の選択
によって、制御できる。用いる世代の数に応じて、個々
のサイズのデンドリマーが容易に得られる。加えて、表
面部分の全部又は一部の化学的修飾が、特定の診断的又
は治療的操作に適した新しい表面官能性を創り出し得
る。本発明において使用するのに適した全体として球状
のデンドリマーが、米国特許第4,507,466号及び米国特
許第4,568,737号に開示されている。代わりとしては、
米国特許第4,694,064に開示されているような非球形の
デンドリマーが、本発明において使用するために採用で
きる。好ましくは、該デンドリマーは、アミノ末端官能
基を有する官能性の付与された外部表面を有する。
信頼性のあるそして再現性のある種々の化学が、デン
ドリマーの官能性の付与された外部表面への特異的結合
性アッセイ試薬の取付けのために利用できる。例えば、
過ヨウ素酸酸化抗体は、デンドリマーと結合させること
ができ、次いで得られたシッフ塩基の水素化ホウ素還元
を行うことができる。Ｃ−Ｎ結合を形成するためのこの
方法は、図１に概要的に描かれている。好ましくは、54
Åのデンドリマーが、適当なアッセイ剤と結合させるた
めに使用される。このデンドリマーは、96個のアミンに
終わる末端（表面）基を有し分子量21590を有する第５
世代粒子である。該アミンに終わる末端基は、通常のア
ッセイ条件下においてそのようなデンドリマーの表面に
正味の正電荷を付与する。
ドリマーの官能性の付与された外部表面への特異的結合
性アッセイ試薬の取付けのために利用できる。例えば、
過ヨウ素酸酸化抗体は、デンドリマーと結合させること
ができ、次いで得られたシッフ塩基の水素化ホウ素還元
を行うことができる。Ｃ−Ｎ結合を形成するためのこの
方法は、図１に概要的に描かれている。好ましくは、54
Åのデンドリマーが、適当なアッセイ剤と結合させるた
めに使用される。このデンドリマーは、96個のアミンに
終わる末端（表面）基を有し分子量21590を有する第５
世代粒子である。該アミンに終わる末端基は、通常のア
ッセイ条件下においてそのようなデンドリマーの表面に
正味の正電荷を付与する。
代わりとしては、特異的結合性アッセイ試薬は、SIAB
で誘導体としたデンドリマーをスルフヒドリル含有アッ
セイ試薬と合わせることによるＣ−Ｓ結合の形勢によっ
てデンドリマーに取り付けることができる。SIAB化学の
使用によるデンドリマー−試薬複合体の調製は、図２に
概要的に描かれている。
で誘導体としたデンドリマーをスルフヒドリル含有アッ
セイ試薬と合わせることによるＣ−Ｓ結合の形勢によっ
てデンドリマーに取り付けることができる。SIAB化学の
使用によるデンドリマー−試薬複合体の調製は、図２に
概要的に描かれている。
デンドリマー表面官能基には、アミノ末端基の他に、
ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、
アリル、ビニル、アミド、ハロ、尿素、オキシラニル、
アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スル
ホナート、ホスホナート、イソシアナート、及びイソチ
オシアナートが含まれる。種々の既知の化学が、この広
範な表面官能基と共に使用でき、そのような官能基にア
ッセイ試薬を取り付けるのに有用である。
ヒドロキシ、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、
アリル、ビニル、アミド、ハロ、尿素、オキシラニル、
アジリジニル、オキサゾリニル、イミダゾリニル、スル
ホナート、ホスホナート、イソシアナート、及びイソチ
オシアナートが含まれる。種々の既知の化学が、この広
範な表面官能基と共に使用でき、そのような官能基にア
ッセイ試薬を取り付けるのに有用である。
出願人は、デンドリマー−試薬複合体が、特異的結合
アッセイ固相上への試薬の固定化のために使用できるこ
とを発見した。そのような複合体が、イムノアッセイそ
の他のアッセイにおいて種々の固相試薬の調製に有用で
ある一方、出願人は、ガラス繊維フィルター基質及び放
射状分配アッセイと共に使用するのに際した、そのよう
な複合体の特に有用な適用を見出した。Giegel et al.,
Clin.Chem.28:1894−98（1982）及び米国特許第4,517,2
88号に開示されている放射状分配アッセイは、全段階が
直接に固相上で行われるアッセイ手順である。抗体又は
他の試薬が、ガラス繊維濾紙の小さな領域上に固定化さ
れる。検出すべき既知量の被分析物を含有する種々の較
正標準又はそのような被分析物を含有し得る種々の未知
のサンプルが、次いでこの固定化されたレセプターと反
応させられる。標識された類縁体その他の標識試薬の適
当な添加に続いて、洗浄液の適用により濾紙の中心領域
から過剰の試薬が除去される。エンザイムイムノアッセ
イの場合においては、該洗浄液は該酵素のための基質を
含んでよく、こうして該洗浄段階と同時に酵素反応を開
始する。好ましくは、該基質に対する該酵素の作用は、
蛍光信号を発生させる。該中心領域の一部における該酵
素活性が、次いで全面蛍光光度法によって定量される。
アッセイ方式、すなわち直接的結合アッセイ又は競合ア
ッセイに依存して、蛍光率は、該サンプル中の被分析物
の濃度に正比例又は反比例する。
アッセイ固相上への試薬の固定化のために使用できるこ
とを発見した。そのような複合体が、イムノアッセイそ
の他のアッセイにおいて種々の固相試薬の調製に有用で
ある一方、出願人は、ガラス繊維フィルター基質及び放
射状分配アッセイと共に使用するのに際した、そのよう
な複合体の特に有用な適用を見出した。Giegel et al.,
Clin.Chem.28:1894−98（1982）及び米国特許第4,517,2
88号に開示されている放射状分配アッセイは、全段階が
直接に固相上で行われるアッセイ手順である。抗体又は
他の試薬が、ガラス繊維濾紙の小さな領域上に固定化さ
れる。検出すべき既知量の被分析物を含有する種々の較
正標準又はそのような被分析物を含有し得る種々の未知
のサンプルが、次いでこの固定化されたレセプターと反
応させられる。標識された類縁体その他の標識試薬の適
当な添加に続いて、洗浄液の適用により濾紙の中心領域
から過剰の試薬が除去される。エンザイムイムノアッセ
イの場合においては、該洗浄液は該酵素のための基質を
含んでよく、こうして該洗浄段階と同時に酵素反応を開
始する。好ましくは、該基質に対する該酵素の作用は、
蛍光信号を発生させる。該中心領域の一部における該酵
素活性が、次いで全面蛍光光度法によって定量される。
アッセイ方式、すなわち直接的結合アッセイ又は競合ア
ッセイに依存して、蛍光率は、該サンプル中の被分析物
の濃度に正比例又は反比例する。
上述のように、該固相は比較的「不活性」な表面を提
供することが好ましい。すなわち、該表面は、特にタン
パク性の材料の無差別な吸着に関して、生物学的材料と
比較的無反応性でなければならない。本発明の好ましい
具体例においては、該固相の物理的形態は、該固相の間
隙又は孔が、反応液が保持されそして毛細管作用により
輸送されるよう十分に小さいようなものである。他方、
該固相孔又は間隙は、偽の陽性信号を生じるかも知れな
いような望ましくない成分を保持する程に小さくてはな
らない。
供することが好ましい。すなわち、該表面は、特にタン
パク性の材料の無差別な吸着に関して、生物学的材料と
比較的無反応性でなければならない。本発明の好ましい
具体例においては、該固相の物理的形態は、該固相の間
隙又は孔が、反応液が保持されそして毛細管作用により
輸送されるよう十分に小さいようなものである。他方、
該固相孔又は間隙は、偽の陽性信号を生じるかも知れな
いような望ましくない成分を保持する程に小さくてはな
らない。
該固相は、圧縮された、例えばガラス又は合成繊維又
は比較的不活性のセルロース性材料のような圧縮された
繊維のマットよりなるのが有利である。該固相は、焼結
ガラス、セラミックス及び合成ポリマー性材料のような
他の多孔性構造よりなっていてもよい。ガラス繊維濾紙
は、その不活性であるという特性の故に及び本発明の水
溶性複合体を、アッセイ試薬の保持の定量的評価に十分
な量吸着する能力の故に、本発明の好ましい固相支持体
である。ガラス繊維の表面は、正味の負の電荷を担持で
き、それはアッセイ条件下において実質的に正に荷電し
た表面を有するデンドリマー、すなわちアミン末端表面
基を有するデンドリマーの吸着を容易にする。
は比較的不活性のセルロース性材料のような圧縮された
繊維のマットよりなるのが有利である。該固相は、焼結
ガラス、セラミックス及び合成ポリマー性材料のような
他の多孔性構造よりなっていてもよい。ガラス繊維濾紙
は、その不活性であるという特性の故に及び本発明の水
溶性複合体を、アッセイ試薬の保持の定量的評価に十分
な量吸着する能力の故に、本発明の好ましい固相支持体
である。ガラス繊維の表面は、正味の負の電荷を担持で
き、それはアッセイ条件下において実質的に正に荷電し
た表面を有するデンドリマー、すなわちアミン末端表面
基を有するデンドリマーの吸着を容易にする。
本発明のデンドリマー−試薬複合体は、適当な固相上
に一旦吸着されると、種々の生物学的材料の分析のため
の種々の分析プロトコールにおいて、使用することがで
きる。例えば、デンドリマー−レセプター複合体は、治
療薬、天然の又は合成のステロイド、ホルモン、酵素、
抗体その他の関係被分析物の存在についての、血液又は
尿のイムノアッセイのために有用であろう。
に一旦吸着されると、種々の生物学的材料の分析のため
の種々の分析プロトコールにおいて、使用することがで
きる。例えば、デンドリマー−レセプター複合体は、治
療薬、天然の又は合成のステロイド、ホルモン、酵素、
抗体その他の関係被分析物の存在についての、血液又は
尿のイムノアッセイのために有用であろう。
そのようなプロトコールにおいて分析されることので
きる治療剤には、ジゴキシン、ジランチン（dilanti
n）、フェノバルビタール、テオフィリン、ゲンタマイ
シン、キニジンその他が含まれる（限定はされない）。
前記の仕方で調製された固相はまた、コルチゾル、アル
ドステロン、テトステロン、ピロゲステロン、及びエス
トリオールのようなステロイド又はフェリチンのような
血清タンパク質の検出のためのイムノアッセイにおいて
使用することもできる。本発明の固相複合体の使用によ
って、ホルモンのレベルもまた測定可能である。これら
のホルモンには、テトラヨードサイロニン及びトリヨー
ドサイロニンのような甲状腺ホルモン、及び甲状腺刺激
ホルモン（TSH）、インスリン、コルチコトロピン、ガ
ストリン、アンジオテンシン、及びプロアンジオテンシ
ンのようなペプチドホルモン、及びサイロトロピン、レ
ブテオトロピン、ソマトトロピン及びヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン（HCG）のようなポリペプチドホルモンが含
まれる（限定はされない）。本発明の複合体の他の適用
には、代謝に関連する比較的小さい分子、すなわち葉酸
のアッセイ、感染性疾患に関連したポリペプチド抗原及
び抗体すなわちHIV、肝炎、CMV、梅毒、ライム病因子そ
の他多くの感染性因子に関連した抗原及び抗体のアッセ
イが含まれる。
きる治療剤には、ジゴキシン、ジランチン（dilanti
n）、フェノバルビタール、テオフィリン、ゲンタマイ
シン、キニジンその他が含まれる（限定はされない）。
前記の仕方で調製された固相はまた、コルチゾル、アル
ドステロン、テトステロン、ピロゲステロン、及びエス
トリオールのようなステロイド又はフェリチンのような
血清タンパク質の検出のためのイムノアッセイにおいて
使用することもできる。本発明の固相複合体の使用によ
って、ホルモンのレベルもまた測定可能である。これら
のホルモンには、テトラヨードサイロニン及びトリヨー
ドサイロニンのような甲状腺ホルモン、及び甲状腺刺激
ホルモン（TSH）、インスリン、コルチコトロピン、ガ
ストリン、アンジオテンシン、及びプロアンジオテンシ
ンのようなペプチドホルモン、及びサイロトロピン、レ
ブテオトロピン、ソマトトロピン及びヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン（HCG）のようなポリペプチドホルモンが含
まれる（限定はされない）。本発明の複合体の他の適用
には、代謝に関連する比較的小さい分子、すなわち葉酸
のアッセイ、感染性疾患に関連したポリペプチド抗原及
び抗体すなわちHIV、肝炎、CMV、梅毒、ライム病因子そ
の他多くの感染性因子に関連した抗原及び抗体のアッセ
イが含まれる。
出願人は、固相上へのアッセイ試薬の固定化を促進す
るために、抗血清に代えてデンドリマーが使用できるこ
とを発見した。すなわち、デンドリマーは、抗体のよう
なアッセイ試薬に又は比較的小さい分子にさえ結合させ
て、ついでガラス繊維フィルター上に固定化することが
できる。免疫学的固定化との比較において、デンドリマ
ー複合体を利用した固定化は、多くの明確な利点を提供
する。第１に、デンドリマーは、精密なポリマー化学に
よって生産され、精密な分子サイズ、分子量及び表面組
成を与える精密な数の世代を有するように設計すること
ができる。均一な且つ特徴付けられた化学のために、そ
のようなパラメーターは異なった製造ロットにわたって
均一性を維持する。第２に、デンドリマーは、内部及び
表面組成に依存して、該デンドリマー−試薬接合体が溶
液中に留まり溶液の均質性を経時的に維持するよう、水
溶性であるように製造することができる。これは、溶液
中における免疫学的接合体の不均質な分布によるロット
間不均一性を排除する。第３に、デンドリマーに試薬を
取り付けるための化学は、十分に特徴付けられており、
抗血清及び抗体結合性物質の関連に固有の変動の影響を
受けない。抗血清は、親和性、特異性、及びイムノグロ
ブリン純度の変動の影響を受けるが、デンドリマー−試
薬接合体の生産に際してはそれらの何れも問題とならな
い。
るために、抗血清に代えてデンドリマーが使用できるこ
とを発見した。すなわち、デンドリマーは、抗体のよう
なアッセイ試薬に又は比較的小さい分子にさえ結合させ
て、ついでガラス繊維フィルター上に固定化することが
できる。免疫学的固定化との比較において、デンドリマ
ー複合体を利用した固定化は、多くの明確な利点を提供
する。第１に、デンドリマーは、精密なポリマー化学に
よって生産され、精密な分子サイズ、分子量及び表面組
成を与える精密な数の世代を有するように設計すること
ができる。均一な且つ特徴付けられた化学のために、そ
のようなパラメーターは異なった製造ロットにわたって
均一性を維持する。第２に、デンドリマーは、内部及び
表面組成に依存して、該デンドリマー−試薬接合体が溶
液中に留まり溶液の均質性を経時的に維持するよう、水
溶性であるように製造することができる。これは、溶液
中における免疫学的接合体の不均質な分布によるロット
間不均一性を排除する。第３に、デンドリマーに試薬を
取り付けるための化学は、十分に特徴付けられており、
抗血清及び抗体結合性物質の関連に固有の変動の影響を
受けない。抗血清は、親和性、特異性、及びイムノグロ
ブリン純度の変動の影響を受けるが、デンドリマー−試
薬接合体の生産に際してはそれらの何れも問題とならな
い。
これらの理由により、デンドリマーに基づく固相試薬
は、実質的なロット間均一性をもって容易に調製でき
る。更には、デンドリマーの原液又は市販の溶液が実質
的な期間にわたり均質性を維持することから、市販のア
ッセイ機器の使用者がこれらの固相試薬を現場で調製す
ることが可能である。新たに調製された固相試薬の使用
は、更に、長期貯蔵、貯蔵温度その他の貯蔵変数による
変化のような、調製済固相試薬の出荷及び商業的使用に
入り込んでくるかも知れない追加の変数を排除する。
は、実質的なロット間均一性をもって容易に調製でき
る。更には、デンドリマーの原液又は市販の溶液が実質
的な期間にわたり均質性を維持することから、市販のア
ッセイ機器の使用者がこれらの固相試薬を現場で調製す
ることが可能である。新たに調製された固相試薬の使用
は、更に、長期貯蔵、貯蔵温度その他の貯蔵変数による
変化のような、調製済固相試薬の出荷及び商業的使用に
入り込んでくるかも知れない追加の変数を排除する。
レセプターのようなアッセイ試薬は、シッフ塩基結
合、SIAB結合その他の方法を介してデンドリマーに結合
させ、次いでガラス繊維フィルターのような固相材料に
提供することができる。好ましい一具体例においては、
Baxter Diagnostics Inc.によって販売されているもの
としての「タブ」が、Whatman Inc.によって販売されて
いるGF/Fガラス濾紙から組み上げられ、以下に述べるよ
うにプラスチックのタブ部品にはめ込まれる。一般に、
デンドリマー−試薬複合体は、適当な緩衝溶液に入れて
そのようなタブの中心領域に適用される。一般に、その
ような緩衝剤は、界面活性剤、被分析物不含血清アルブ
ミン及びアジ化ナトリウムのような保存剤を含有する。
デンドリマー複合体の溶液の部分量が、ブランクタブの
中心上にスポットされ、ついでオーブンで加熱乾燥され
る。冷却後、該タブは冷蔵下に保存することができる。
合、SIAB結合その他の方法を介してデンドリマーに結合
させ、次いでガラス繊維フィルターのような固相材料に
提供することができる。好ましい一具体例においては、
Baxter Diagnostics Inc.によって販売されているもの
としての「タブ」が、Whatman Inc.によって販売されて
いるGF/Fガラス濾紙から組み上げられ、以下に述べるよ
うにプラスチックのタブ部品にはめ込まれる。一般に、
デンドリマー−試薬複合体は、適当な緩衝溶液に入れて
そのようなタブの中心領域に適用される。一般に、その
ような緩衝剤は、界面活性剤、被分析物不含血清アルブ
ミン及びアジ化ナトリウムのような保存剤を含有する。
デンドリマー複合体の溶液の部分量が、ブランクタブの
中心上にスポットされ、ついでオーブンで加熱乾燥され
る。冷却後、該タブは冷蔵下に保存することができる。
代わりの具体例においては、デンドリマーそれ自体
が、固相へと形成される。デンドリマーは、適当な溶媒
に溶解して適当な固体表面に噴霧又は他の方法で適用す
ることができる。溶媒の蒸発により、該デンドリマー
は、薄いフィルム又はフィラメントへと凝結され、そし
てそのように単離することができる。代わりとしては、
凝結されたデンドリマーはそのような薄いフィルムは、
特異的結合アッセイにおいて使用されるチューブ又は他
の容器の内表面を被覆するのに使用することができる。
抗体のようなアッセイ試薬は、そのようなデンドリマー
凝結物に、該噴霧された材料の適用及び続く乾燥期間の
前又は後の何れかに、共有結合により連結することがで
きる。
が、固相へと形成される。デンドリマーは、適当な溶媒
に溶解して適当な固体表面に噴霧又は他の方法で適用す
ることができる。溶媒の蒸発により、該デンドリマー
は、薄いフィルム又はフィラメントへと凝結され、そし
てそのように単離することができる。代わりとしては、
凝結されたデンドリマーはそのような薄いフィルムは、
特異的結合アッセイにおいて使用されるチューブ又は他
の容器の内表面を被覆するのに使用することができる。
抗体のようなアッセイ試薬は、そのようなデンドリマー
凝結物に、該噴霧された材料の適用及び続く乾燥期間の
前又は後の何れかに、共有結合により連結することがで
きる。
本発明のデンドリマー−試薬複合体／固相調製物は、
種々の特異的結合アッセイ方式に適用できる。例えば、
種々の直接結合アッセイがこれらの試薬と共に採用でき
る。そのようなアッセイにおいては、抗体又は結合性タ
ンパク質のようなレセプターは、デンドリマーに共有結
合により連結されて、該固相上に固定化される。該固定
化されたデンドリマー−試薬複合体は、関係被分析物を
含有するサンプルと接触させられる。該固定化されたレ
セプターによる該被分析物の結合に続き、該固相は洗浄
され次いで指示薬と接触させられる。本発明の文脈にお
いて術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。
該接合体は、アッセイ方式に依存して、抗体、抗体フラ
グメント、結合性タンパク質又は被分析物を含んでな
り、該標識は、直接的に又は間接的に該接合体と関連す
る、蛍光的、酵素的、比色法的、放射線測定的、又はそ
の他の標識分子である。該標識は、基質と接触したとき
蛍光を発する酵素的物質よりなることができる。例えば
Tijssen,P.,Laboratory Techniques in Biochemistry a
nd Molecular Biology,Practice and Theory of Enzyme
Immunoassay,pp.173−219（第10章）及びpp.329−384
（第14章）,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,T
he Netherlands,1985に開示されているように、指示薬
が固相支持体上に存在する程度は、未知の被分析物の量
と相関させることができる。
種々の特異的結合アッセイ方式に適用できる。例えば、
種々の直接結合アッセイがこれらの試薬と共に採用でき
る。そのようなアッセイにおいては、抗体又は結合性タ
ンパク質のようなレセプターは、デンドリマーに共有結
合により連結されて、該固相上に固定化される。該固定
化されたデンドリマー−試薬複合体は、関係被分析物を
含有するサンプルと接触させられる。該固定化されたレ
セプターによる該被分析物の結合に続き、該固相は洗浄
され次いで指示薬と接触させられる。本発明の文脈にお
いて術語「指示薬」は、標識された接合体を意味する。
該接合体は、アッセイ方式に依存して、抗体、抗体フラ
グメント、結合性タンパク質又は被分析物を含んでな
り、該標識は、直接的に又は間接的に該接合体と関連す
る、蛍光的、酵素的、比色法的、放射線測定的、又はそ
の他の標識分子である。該標識は、基質と接触したとき
蛍光を発する酵素的物質よりなることができる。例えば
Tijssen,P.,Laboratory Techniques in Biochemistry a
nd Molecular Biology,Practice and Theory of Enzyme
Immunoassay,pp.173−219（第10章）及びpp.329−384
（第14章）,Elsevier Science Publishers,Amsterdam,T
he Netherlands,1985に開示されているように、指示薬
が固相支持体上に存在する程度は、未知の被分析物の量
と相関させることができる。
本発明の組成物はまた、競合的アッセイ方式において
も使用できる。そのような方式においては、選ばれた被
分析物に対する特異性を有する固定化レセプター又は他
の分子が、そのような被分析物を含有していそうなサン
プル及び特異的な競合試薬と接触させられる。該特異的
競合試薬は、該被分析物の、標識された類縁体であるこ
とができる。この具体例においては、該標識された類縁
体は、該固相に固定化されたレセプターへの結合を求め
て該被分析物と競合する。代わりの一具体例において
は、被分析物が、固相に結合され、そしてサンプル及び
特異的競合試薬、例えば該被分析物に対する標識された
レセプターと接触させられる。この方式においては、サ
ンプルの被分析物は、可溶性の標識されたレセプターと
の結合を求めて固相の被分析物と競合する。両具体例に
おいて、洗浄後に該固相に結合している標識量が、該サ
ンプル中の被分析物のレベルの指標を提供する。すなわ
ち、該相に結合した標識量は、該サンプル中の被分析物
の量に反比例する。
も使用できる。そのような方式においては、選ばれた被
分析物に対する特異性を有する固定化レセプター又は他
の分子が、そのような被分析物を含有していそうなサン
プル及び特異的な競合試薬と接触させられる。該特異的
競合試薬は、該被分析物の、標識された類縁体であるこ
とができる。この具体例においては、該標識された類縁
体は、該固相に固定化されたレセプターへの結合を求め
て該被分析物と競合する。代わりの一具体例において
は、被分析物が、固相に結合され、そしてサンプル及び
特異的競合試薬、例えば該被分析物に対する標識された
レセプターと接触させられる。この方式においては、サ
ンプルの被分析物は、可溶性の標識されたレセプターと
の結合を求めて固相の被分析物と競合する。両具体例に
おいて、洗浄後に該固相に結合している標識量が、該サ
ンプル中の被分析物のレベルの指標を提供する。すなわ
ち、該相に結合した標識量は、該サンプル中の被分析物
の量に反比例する。
デンドリマー−試薬接合体及び種々の他の結合性アッ
セイ試薬を固相に適用し、洗浄し、該固相に結合した指
示薬の量を読み取るのに、種々の機器が利用できる。好
ましい一具体例においては、固相は上述のようなガラス
繊維フィルタータブを含んでなり、そして該機器は、Ba
xter Diagnostics Inc.より入手できるStratus Immu
noassay Systemを含んでなる。この機器は、Giegel et
al.,Clin.Chem.28:1894−98（1982）に記述されている
バッチ処理式卓上機器である。該機器は、放射状分配イ
ムノアッセイ方式における処理タブに適合させてあり、
該方式もまた、Giegel et al.に記述されている。該機
器は、サンプル、接合体及び基質洗浄液のための液体分
配装置を含む。マイクロプロセッサー制御のステッパモ
ーターが、試薬の必要部分を吸引し分配する。該分配装
置の全てのタイミング及び操作の面は、該分析装置内の
プログラムルーチンによって予め定められている。該機
器はまた、タブ輸送システム、温度モニタリングを伴っ
た加熱板、サンプル及び試薬液ポンプ、読み取りステー
ション、データ処理、及びタブ廃液のための手段をも含
む。
セイ試薬を固相に適用し、洗浄し、該固相に結合した指
示薬の量を読み取るのに、種々の機器が利用できる。好
ましい一具体例においては、固相は上述のようなガラス
繊維フィルタータブを含んでなり、そして該機器は、Ba
xter Diagnostics Inc.より入手できるStratus Immu
noassay Systemを含んでなる。この機器は、Giegel et
al.,Clin.Chem.28:1894−98（1982）に記述されている
バッチ処理式卓上機器である。該機器は、放射状分配イ
ムノアッセイ方式における処理タブに適合させてあり、
該方式もまた、Giegel et al.に記述されている。該機
器は、サンプル、接合体及び基質洗浄液のための液体分
配装置を含む。マイクロプロセッサー制御のステッパモ
ーターが、試薬の必要部分を吸引し分配する。該分配装
置の全てのタイミング及び操作の面は、該分析装置内の
プログラムルーチンによって予め定められている。該機
器はまた、タブ輸送システム、温度モニタリングを伴っ
た加熱板、サンプル及び試薬液ポンプ、読み取りステー
ション、データ処理、及びタブ廃液のための手段をも含
む。
品質管理のために、該機器のマイクロプロセッサーの
制御プログラムは、参照電圧、温度、及び分配位置のよ
うな重要な操作条件を定期的に検証し、範囲外の値につ
いてフラッグを立てる。
制御プログラムは、参照電圧、温度、及び分配位置のよ
うな重要な操作条件を定期的に検証し、範囲外の値につ
いてフラッグを立てる。
本発明は、以下の説明的具体例を参照することにより
一層理解されようが、該具体例は純粋に典型例であり、
請求の範囲に記述されたものとしての本発明の真の範囲
を限定するものと解してはならない。
一層理解されようが、該具体例は純粋に典型例であり、
請求の範囲に記述されたものとしての本発明の真の範囲
を限定するものと解してはならない。
実施例１
シッフ塩基結合を介したIgG−デンドリマーの調製
pH4.5の酢酸緩衝液（0.1M NaOAc/0.1M NaCl）中の４
〜5mgIgG/mよりなるIgG濃縮溶液を調製し、氷上で冷
却する。冷却された、pH4.5の酢酸緩衝液中の0.1M NaIO
4の2/3体積を、該IgG溶液に加え、この合わせられたIgG
/NaIO4溶液を暗所で２時間２゜〜８℃にてインキュベー
トする。エチレングリコールを元のIgG濃縮溶液1m当
たり10μ加え、インキュベーションを更な1/2時間２
゜〜８℃にて継続する。得られたIgG−アルデヒド誘導
体（IgG−CHO）の溶液を、pH4.5の酢酸緩衝液で平衡化
した適当なサイズのSephadex G−25カラムに通すことに
より脱塩した。タンパク質画分を集めてプールし、吸光
係数1.48m・mg-1・cm-1を用いて280nmにて分光光度法
によりIgG−CHOの濃度を測定した。過ヨウ素酸酸化IgG
のアルデヒド含量は、較正標準としてホルムアルデヒド
の適当な濃度を用い、アルデヒド変性試薬Purpald（Ald
rich,Cat.No.16−289−２）を用いて定量できる。
〜5mgIgG/mよりなるIgG濃縮溶液を調製し、氷上で冷
却する。冷却された、pH4.5の酢酸緩衝液中の0.1M NaIO
4の2/3体積を、該IgG溶液に加え、この合わせられたIgG
/NaIO4溶液を暗所で２時間２゜〜８℃にてインキュベー
トする。エチレングリコールを元のIgG濃縮溶液1m当
たり10μ加え、インキュベーションを更な1/2時間２
゜〜８℃にて継続する。得られたIgG−アルデヒド誘導
体（IgG−CHO）の溶液を、pH4.5の酢酸緩衝液で平衡化
した適当なサイズのSephadex G−25カラムに通すことに
より脱塩した。タンパク質画分を集めてプールし、吸光
係数1.48m・mg-1・cm-1を用いて280nmにて分光光度法
によりIgG−CHOの濃度を測定した。過ヨウ素酸酸化IgG
のアルデヒド含量は、較正標準としてホルムアルデヒド
の適当な濃度を用い、アルデヒド変性試薬Purpald（Ald
rich,Cat.No.16−289−２）を用いて定量できる。
水性溶液中のデンドリマー（粒子サイズ54Å）（Poly
sciences,Cat.No.21152）が、脱塩したIgG−CHO溶液
に、デンドリマー:IgG−CHOのモル比3:1で加えられる。
合わせられたデンドリマー/IgG−CHOは、0.1M炭酸ナト
リウム緩衝液、pH9.4中へ緩衝液交換し、そして、IgGの
最終濃度が約1.0mg IgG/mとなるように該溶液の体積
が調節される。該溶液は、次いで、２゜〜８℃にて16〜
24時間インキュベートされる。次いで、新たに調製した
NaBH4溶液（4mg/m水）の、該デンドリマー/IgG−CHO
反応混合物の体積の1/20に等しい量を徐々に加えて２゜
〜８℃にて更に２時間インキュベートする。得られる溶
液は、必要ならば、0.22μｍフィルターを通して濾過す
ることにより澄明化される。適当なサイズのポリアクリ
ルアミド−アガロースゲルマトリックス（AaA−44 Ultr
ogel,IBF,Cat.No.230161）が準備され、そしてリン酸緩
衝化食塩水（PBS）/0.1％NaN3中に平衡化される。最終
のデンドリマー/IgG−CHO反応混合物は、AcA−44の床体
積の３％未満の体積にまで濃縮され、次いでカラム上に
載せて、適当な流速で溶出させる。第１のタンパク質ピ
ークを含む画分（それは結合したIgG−デンドリマー調
製物（IgG−DEND）を含んでなる）をプールする。IgG−
DEND調製物中のIgGの濃度は、280における吸光係数1.48
m・mg-1・cm-1を用いて分光光度法により測定され
る。
sciences,Cat.No.21152）が、脱塩したIgG−CHO溶液
に、デンドリマー:IgG−CHOのモル比3:1で加えられる。
合わせられたデンドリマー/IgG−CHOは、0.1M炭酸ナト
リウム緩衝液、pH9.4中へ緩衝液交換し、そして、IgGの
最終濃度が約1.0mg IgG/mとなるように該溶液の体積
が調節される。該溶液は、次いで、２゜〜８℃にて16〜
24時間インキュベートされる。次いで、新たに調製した
NaBH4溶液（4mg/m水）の、該デンドリマー/IgG−CHO
反応混合物の体積の1/20に等しい量を徐々に加えて２゜
〜８℃にて更に２時間インキュベートする。得られる溶
液は、必要ならば、0.22μｍフィルターを通して濾過す
ることにより澄明化される。適当なサイズのポリアクリ
ルアミド−アガロースゲルマトリックス（AaA−44 Ultr
ogel,IBF,Cat.No.230161）が準備され、そしてリン酸緩
衝化食塩水（PBS）/0.1％NaN3中に平衡化される。最終
のデンドリマー/IgG−CHO反応混合物は、AcA−44の床体
積の３％未満の体積にまで濃縮され、次いでカラム上に
載せて、適当な流速で溶出させる。第１のタンパク質ピ
ークを含む画分（それは結合したIgG−デンドリマー調
製物（IgG−DEND）を含んでなる）をプールする。IgG−
DEND調製物中のIgGの濃度は、280における吸光係数1.48
m・mg-1・cm-1を用いて分光光度法により測定され
る。
実施例２
SIAB結合を介したIgG−デンドリマーの調製
1/5液量のリン酸ナトリウム緩衝液（0.5M NaH2PO4、p
H7.1）を54Åのデンドリマー（Polysciences,Cat.No.21
152）の業者供給の水性溶液に加える。得られる水性溶
液を、1N塩酸又は1N水酸化ナトリウムでpH7.6に調整す
る。水中の15mg/mスルホ−SIABの適当量が、スルホ−
SIAB:デンドリマーのモル比が20:1に等しくなるよう
に、該デンドリマー溶液に加えられ、次いで30℃にて１
時間インキュベートされる。得られるSIAB−デンドリマ
ー誘導体（SIAB−DEND）の溶液を、0.1M NaH2PO4（pH7.
6）で予め平衡化したSephadex G−25の適当なサイズの
カラム上に負荷する。約0.5m／分の流速での溶出に続
いて、該SIAB−DEND画分がプールされ、そしてSIAB−DE
NDの濃度が、Weigele et al.,J.Am.Chem.Soc.94:5972
（1972）に及びUdenfriend et al.,Science 178:871（1
972）に記述されているようにして、フルオレスカミン
（第１級アミンのアッセイのために用いられる蛍光原試
薬）によって測定される。適当な濃度の、誘導体化され
ていない54Åのデンドリマーが、較正標準として使用さ
れる。
H7.1）を54Åのデンドリマー（Polysciences,Cat.No.21
152）の業者供給の水性溶液に加える。得られる水性溶
液を、1N塩酸又は1N水酸化ナトリウムでpH7.6に調整す
る。水中の15mg/mスルホ−SIABの適当量が、スルホ−
SIAB:デンドリマーのモル比が20:1に等しくなるよう
に、該デンドリマー溶液に加えられ、次いで30℃にて１
時間インキュベートされる。得られるSIAB−デンドリマ
ー誘導体（SIAB−DEND）の溶液を、0.1M NaH2PO4（pH7.
6）で予め平衡化したSephadex G−25の適当なサイズの
カラム上に負荷する。約0.5m／分の流速での溶出に続
いて、該SIAB−DEND画分がプールされ、そしてSIAB−DE
NDの濃度が、Weigele et al.,J.Am.Chem.Soc.94:5972
（1972）に及びUdenfriend et al.,Science 178:871（1
972）に記述されているようにして、フルオレスカミン
（第１級アミンのアッセイのために用いられる蛍光原試
薬）によって測定される。適当な濃度の、誘導体化され
ていない54Åのデンドリマーが、較正標準として使用さ
れる。
スルフヒドリル−IgG誘導体（IgG−SH）の調製のため
には、還元性緩衝液（0.1M NaH2PO4,5mM EDTA,pH6.0）
中の5mgIgG/mの溶液が調製される。ジチオエリスリト
ール（DTE）が還元性緩衝液に、11.4mg/mの濃度に溶
解される。このDTE溶液を、該IgGの5mg/m溶液の液量
の1/9に等しい液量該IgG溶液に加え、次いで37℃にて１
時間インキュベートする。得られるIgG−SH溶液を次い
で、適当なサイズのSephadex G−25カラムを通過させる
ことにより脱塩し、そして該IgG−SH濃度及びSH含量
を、標準的な方法により測定する。
には、還元性緩衝液（0.1M NaH2PO4,5mM EDTA,pH6.0）
中の5mgIgG/mの溶液が調製される。ジチオエリスリト
ール（DTE）が還元性緩衝液に、11.4mg/mの濃度に溶
解される。このDTE溶液を、該IgGの5mg/m溶液の液量
の1/9に等しい液量該IgG溶液に加え、次いで37℃にて１
時間インキュベートする。得られるIgG−SH溶液を次い
で、適当なサイズのSephadex G−25カラムを通過させる
ことにより脱塩し、そして該IgG−SH濃度及びSH含量
を、標準的な方法により測定する。
最後に、IgG−DENDの調製のために、SIAB−DEND溶液
がIgG−SH溶液と、SIAB−DEND:IgG−SH比3:1にて合わせ
られ、次いでリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M NaH2PO4、
pH7.6）へと緩衝液交換される。該溶液は、最終IgG濃度
が約5mg/mとなるよう液量調整され、次いで２゜〜８
℃にて16〜24時間インキュベートされる。該反応は、N,
N−ジメチルホルムアミド（DMF）中の10mg/mのＮ−エ
チルマレイミド（NEM）の1/50体積の停止溶液の添加に
よって停止され、室温（23゜〜25℃）にて２時間、更に
インキュベートされる。停止された反応混合物は、必要
ならば、0.22μｍフィルターを通すことにより澄明化さ
せ、次いで上の実施例１に記述したようにAcA−44 Ultr
ogelカラムを通過させることにより精製される。
がIgG−SH溶液と、SIAB−DEND:IgG−SH比3:1にて合わせ
られ、次いでリン酸ナトリウム緩衝液（0.1M NaH2PO4、
pH7.6）へと緩衝液交換される。該溶液は、最終IgG濃度
が約5mg/mとなるよう液量調整され、次いで２゜〜８
℃にて16〜24時間インキュベートされる。該反応は、N,
N−ジメチルホルムアミド（DMF）中の10mg/mのＮ−エ
チルマレイミド（NEM）の1/50体積の停止溶液の添加に
よって停止され、室温（23゜〜25℃）にて２時間、更に
インキュベートされる。停止された反応混合物は、必要
ならば、0.22μｍフィルターを通すことにより澄明化さ
せ、次いで上の実施例１に記述したようにAcA−44 Ultr
ogelカラムを通過させることにより精製される。
実施例３
固相支持体（タブ）の調製
この実験において使用される固相支持体は、双方とも
Baxter Diagnostics Inc.によって販売されているもの
であるStratus 分析装置又はStratus II分析装置と
共に使用されるものとしての「タブ」を含んでなる。こ
れらのタブは、Giegel et al.,Radial Partition immun
oassay,Clin.Chem.28:1894−98（1982）に記述されてい
るように、GF/Fガラス濾紙（Whatman Inc.）の１インチ
（2.5cm）幅のロール及び、スナップ嵌合式プラスチッ
クタブ部品から組み立てられる。適当な濃度の、デンド
リマー溶液、抗体若しくは他のタンパク質溶液又は対照
溶液が、スポット用緩衝液中に形成される。該スポット
用緩衝組成物は、特定の実験的又は製造のパラメーター
に適するよう変えることができる。一般には、該スポッ
ト用緩衝液は、例えば、20mM〜200mMのトリス（pH7.0〜
9.0）、0.1％〜1.0％の範囲の濃度のZonyl FSN（E.I.
DuPont DeNemours ＆ Co.,Cat.No.CH 7152S）のような
非イオン性界面活性剤、0.5％〜4.0％の牛血清アルブミ
ン（BSA）及び0.1％のアジ化ナトリウムを含むが、これ
に限定されない。好ましくは、該スポット用緩衝液は、
30〜100mMのトリス（pH7.0〜8.5）、0.1％〜0.5％のZon
yl FSN、1.0％〜3.0％のBSA及び0.1％のアジ化ナトリ
ウムを含んでなる。最も好ましくは、該スポット用緩衝
液は、50mMのトリス（pH8.0）、0.1％のZonyl FSN、
2.0％のBSA及び0.1％のアジ化ナトリウムを含んでな
る。フッ素化された界面活性剤（例えば3M Cat.No.FC 1
71及びFC 170C）及び当業者に既知の他の適当な界面活
性剤を、Zonyl FSNに置き換えてもよい。
Baxter Diagnostics Inc.によって販売されているもの
であるStratus 分析装置又はStratus II分析装置と
共に使用されるものとしての「タブ」を含んでなる。こ
れらのタブは、Giegel et al.,Radial Partition immun
oassay,Clin.Chem.28:1894−98（1982）に記述されてい
るように、GF/Fガラス濾紙（Whatman Inc.）の１インチ
（2.5cm）幅のロール及び、スナップ嵌合式プラスチッ
クタブ部品から組み立てられる。適当な濃度の、デンド
リマー溶液、抗体若しくは他のタンパク質溶液又は対照
溶液が、スポット用緩衝液中に形成される。該スポット
用緩衝組成物は、特定の実験的又は製造のパラメーター
に適するよう変えることができる。一般には、該スポッ
ト用緩衝液は、例えば、20mM〜200mMのトリス（pH7.0〜
9.0）、0.1％〜1.0％の範囲の濃度のZonyl FSN（E.I.
DuPont DeNemours ＆ Co.,Cat.No.CH 7152S）のような
非イオン性界面活性剤、0.5％〜4.0％の牛血清アルブミ
ン（BSA）及び0.1％のアジ化ナトリウムを含むが、これ
に限定されない。好ましくは、該スポット用緩衝液は、
30〜100mMのトリス（pH7.0〜8.5）、0.1％〜0.5％のZon
yl FSN、1.0％〜3.0％のBSA及び0.1％のアジ化ナトリ
ウムを含んでなる。最も好ましくは、該スポット用緩衝
液は、50mMのトリス（pH8.0）、0.1％のZonyl FSN、
2.0％のBSA及び0.1％のアジ化ナトリウムを含んでな
る。フッ素化された界面活性剤（例えば3M Cat.No.FC 1
71及びFC 170C）及び当業者に既知の他の適当な界面活
性剤を、Zonyl FSNに置き換えてもよい。
選ばれた溶液の76μの部分を、ブランクタブの中心
上にスポットし、次いで80゜〜90℃にてオーブン乾燥す
る。冷却後、使用時まで該タブを２℃〜８℃にて貯蔵す
ることができる。タブ上への溶液のスポットは、ピペッ
ティング器具を用いて手動で行ってもよく又は自動化さ
れた製造手順によって行ってもよい。代わりとしては、
該タブは、原液の選ばれた部分量をタブの中心に適用す
るための機器パラメーターの適当なプログラミングの後
に、Stratum II装置自身によってスポットされて処理
されることができる。
上にスポットし、次いで80゜〜90℃にてオーブン乾燥す
る。冷却後、使用時まで該タブを２℃〜８℃にて貯蔵す
ることができる。タブ上への溶液のスポットは、ピペッ
ティング器具を用いて手動で行ってもよく又は自動化さ
れた製造手順によって行ってもよい。代わりとしては、
該タブは、原液の選ばれた部分量をタブの中心に適用す
るための機器パラメーターの適当なプログラミングの後
に、Stratum II装置自身によってスポットされて処理
されることができる。
実施例４
予備的実験において、３つの異なったサイズ（22Å、
54Å及び95Å）のデンドリマーが、以下に記述するよう
にして試験された。54Å又は95Åの粒子が固定化に用い
られた場合には、性能にほんの僅かな差しかなかった
が、22Å粒子では、性能が比較的劣っていた。出願人
は、特定の理論又は機構に捕らわれるつもりはないが、
固定化された抗体／デンドリマー複合体のある最小のサ
イズが、濾紙の表面への最適な吸着のためには必要であ
るという可能性がある。固定化のために二次的な抗体
（デンドリマーでなく）を用いた現行のタブ処方に関し
て、同様な、サイズに関連した現象が観察されている。
ある条件下においては許容できる結果を提供するが、比
較的大きい（95Å）デンドリマー粒子の使用は、通常、
高分子量凝集体の形成を伴った。こうして、54Åのデン
ドリマーが、ここに報告した他の全ての実験において使
用された。22Åのものを含む他の粒子サイズのデンドリ
マーは、緩衝液、試薬濃度及び他のパラメーターがここ
に報告されている値から変動する実験条件については、
適当かも知れない。
54Å及び95Å）のデンドリマーが、以下に記述するよう
にして試験された。54Å又は95Åの粒子が固定化に用い
られた場合には、性能にほんの僅かな差しかなかった
が、22Å粒子では、性能が比較的劣っていた。出願人
は、特定の理論又は機構に捕らわれるつもりはないが、
固定化された抗体／デンドリマー複合体のある最小のサ
イズが、濾紙の表面への最適な吸着のためには必要であ
るという可能性がある。固定化のために二次的な抗体
（デンドリマーでなく）を用いた現行のタブ処方に関し
て、同様な、サイズに関連した現象が観察されている。
ある条件下においては許容できる結果を提供するが、比
較的大きい（95Å）デンドリマー粒子の使用は、通常、
高分子量凝集体の形成を伴った。こうして、54Åのデン
ドリマーが、ここに報告した他の全ての実験において使
用された。22Åのものを含む他の粒子サイズのデンドリ
マーは、緩衝液、試薬濃度及び他のパラメーターがここ
に報告されている値から変動する実験条件については、
適当かも知れない。
更なる実験においては、モノクローナル抗体CA2−2f
（CA2）が、54Åのデンドリマー粒子に、実施例１にお
いて上記したように結合された。CA2は、American Type
Culture Collection（ATCC）に受託番号第1437号とし
て寄託してある。この抗体及びBaxter Diagnostics In
c.によって現在販売されている、hTSHアッセイにおいて
用いられる第２のモノクローナル抗体（MAB−２）は、
ヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）のβ鎖に対して向けら
れている。これらの抗体は、類似の（同じではないにし
ても）エピトープに向けられていると信じられており、
108乃至1010M-1の範囲に近似の親和性係数を有する。こ
のCA2−デンドリマー複合体（CA2−DEND）は、実施例３
において上記したようにタブ上へスポットされ（スポッ
ト用緩衝液:50mMトリス、pH8.0,0.1％Zonyl FSN,2.0
％BSA及び0.1％アジ化ナトリウム）、そしてhTSHについ
ての特異的結合アッセイ方式において使用された。タブ
上にスポットされたCA2−DENDの量は、選ばれた実験条
件に依存して、3.75μg/タブ乃至37.5μg/タブの範囲内
にあった。
（CA2）が、54Åのデンドリマー粒子に、実施例１にお
いて上記したように結合された。CA2は、American Type
Culture Collection（ATCC）に受託番号第1437号とし
て寄託してある。この抗体及びBaxter Diagnostics In
c.によって現在販売されている、hTSHアッセイにおいて
用いられる第２のモノクローナル抗体（MAB−２）は、
ヒト甲状腺刺激ホルモン（hTSH）のβ鎖に対して向けら
れている。これらの抗体は、類似の（同じではないにし
ても）エピトープに向けられていると信じられており、
108乃至1010M-1の範囲に近似の親和性係数を有する。こ
のCA2−デンドリマー複合体（CA2−DEND）は、実施例３
において上記したようにタブ上へスポットされ（スポッ
ト用緩衝液:50mMトリス、pH8.0,0.1％Zonyl FSN,2.0
％BSA及び0.1％アジ化ナトリウム）、そしてhTSHについ
ての特異的結合アッセイ方式において使用された。タブ
上にスポットされたCA2−DENDの量は、選ばれた実験条
件に依存して、3.75μg/タブ乃至37.5μg/タブの範囲内
にあった。
直接的特異的結合アッセイが行われ、それにおいて
は、Giegel et al.,Chin.Chem 28:1894−98（1982）に
記述されているようにして、較正された量のhTSHがCA2
−DENDタブ上にスポットされ、デンドリマーと複合体形
成され、洗浄され、そして結合したhTSHの量が、Stratu
s 機器において前面蛍光光度法によって測定された。
これらの実験においては、検出装置は、子牛腸アルカリ
性ホスファターゼと接合させた抗hTSHモノクローナル二
重抗体（カルフォルニア州、Foster CityのMedixから、
及びペンシルバニア州AllentownのSerono Diagnostics
より商業的に入手できる）と、安定化剤と、赤色色素
と、界面活性剤とそして0.1％のアジ化ナトリウムとを
含んでなるトリス緩衝溶液として適用された酵素標識抗
hTSH抗体接合体を含んでなる。Giegel et al.に記述さ
れた放射状分配アッセイ方式が、以下の実験の全てにお
いて用いられた。較正標準A,B,C,D,E及びＦは、BSA、安
定化剤及び保存剤として0.1％アジ化ナトリウムを含む
トリス緩衝液（pH7.5）中に調製された。較正標準溶液
A,B,C,D,E及びＦは、ｍ当たりそれぞれ０、0.025、0.
75、３、12及び50μIUのhTSHを含有した。
は、Giegel et al.,Chin.Chem 28:1894−98（1982）に
記述されているようにして、較正された量のhTSHがCA2
−DENDタブ上にスポットされ、デンドリマーと複合体形
成され、洗浄され、そして結合したhTSHの量が、Stratu
s 機器において前面蛍光光度法によって測定された。
これらの実験においては、検出装置は、子牛腸アルカリ
性ホスファターゼと接合させた抗hTSHモノクローナル二
重抗体（カルフォルニア州、Foster CityのMedixから、
及びペンシルバニア州AllentownのSerono Diagnostics
より商業的に入手できる）と、安定化剤と、赤色色素
と、界面活性剤とそして0.1％のアジ化ナトリウムとを
含んでなるトリス緩衝溶液として適用された酵素標識抗
hTSH抗体接合体を含んでなる。Giegel et al.に記述さ
れた放射状分配アッセイ方式が、以下の実験の全てにお
いて用いられた。較正標準A,B,C,D,E及びＦは、BSA、安
定化剤及び保存剤として0.1％アジ化ナトリウムを含む
トリス緩衝液（pH7.5）中に調製された。較正標準溶液
A,B,C,D,E及びＦは、ｍ当たりそれぞれ０、0.025、0.
75、３、12及び50μIUのhTSHを含有した。
アッセイは、選ばれた較正標準（又はサンプル）の60
μを吸引しタブ上に放出することによってStratus
II機器によって行われる。抗hTSHアルカリ性ホスファタ
ーゼ接合体（0.75μg/m）の20μが、次いで各タブ
に放出される。Stratus 機器の基質プローブは、次い
で70μの基質洗浄液（1.0mMの４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート、アリカリ性ホスファターゼ阻害
剤、安定化剤、青色色素、界面活性剤及び0.1％のアジ
化ナトリウムを含有するpH9.0トリス緩衝液）を吸引
し、20μ乃至50μを逐次的にタブに放出する。第２
の基質洗浄液が放出されるや否や、当初の蛍光率が読み
取られそして機器の記憶装置に記録される。
μを吸引しタブ上に放出することによってStratus
II機器によって行われる。抗hTSHアルカリ性ホスファタ
ーゼ接合体（0.75μg/m）の20μが、次いで各タブ
に放出される。Stratus 機器の基質プローブは、次い
で70μの基質洗浄液（1.0mMの４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート、アリカリ性ホスファターゼ阻害
剤、安定化剤、青色色素、界面活性剤及び0.1％のアジ
化ナトリウムを含有するpH9.0トリス緩衝液）を吸引
し、20μ乃至50μを逐次的にタブに放出する。第２
の基質洗浄液が放出されるや否や、当初の蛍光率が読み
取られそして機器の記憶装置に記録される。
メチルウンベリフェリルホスフェート基質に対するホ
スファターゼの作用により発生した蛍光の量は、Stratu
s 機器により検出され、分当たりのボルト数で表され
た率へと変換され、それは表及び図にmV/分（「Stratus
率」）として提示されている。該Stratus率は、蛍光の
強度の一尺度であり、それは、今度は、該タブの反応部
分に結合されたhTSHの量の一尺度である。
スファターゼの作用により発生した蛍光の量は、Stratu
s 機器により検出され、分当たりのボルト数で表され
た率へと変換され、それは表及び図にmV/分（「Stratus
率」）として提示されている。該Stratus率は、蛍光の
強度の一尺度であり、それは、今度は、該タブの反応部
分に結合されたhTSHの量の一尺度である。
Stratsu 機器の作動の間、個々の較正標準の蛍光率
が測定され、そして値がマイクロプロセッサーの記憶装
置の記憶位置に導かれる。全ての較正標準が測定されて
しまった後、測定されたデータ諸点に、次の方程式に示
された形に数学的関係を適合させるマルチパス線形回帰
ルーチンを用いて、プログラムが“Rodbard"パラメータ
ーA,B,C及びＤを計算する（Davis,S.E.et al.,J.Immuno
assay 1:15−25（1980））。
が測定され、そして値がマイクロプロセッサーの記憶装
置の記憶位置に導かれる。全ての較正標準が測定されて
しまった後、測定されたデータ諸点に、次の方程式に示
された形に数学的関係を適合させるマルチパス線形回帰
ルーチンを用いて、プログラムが“Rodbard"パラメータ
ーA,B,C及びＤを計算する（Davis,S.E.et al.,J.Immuno
assay 1:15−25（1980））。
Ｒ＝｛（Ａ−Ｄ）／［１＋Ｂ（Ｘ−Ｃ）］＋Ｄ｝
（式中、Ｒは蛍光率であり、Ｘは対応する濃度であ
る。） 該方程式は、種々のイムノアッセイ系において卓越した
適合を与えることが報告されている一般化されたシグモ
イド曲線である。記憶装置に記憶されている得られたA,
B,C及びＤパラメーターに基づいて、該機器は、アッセ
イされたサンプルについての濃度の読みを与える。
る。） 該方程式は、種々のイムノアッセイ系において卓越した
適合を与えることが報告されている一般化されたシグモ
イド曲線である。記憶装置に記憶されている得られたA,
B,C及びＤパラメーターに基づいて、該機器は、アッセ
イされたサンプルについての濃度の読みを与える。
５つの複製についての作動の結果が、表１に提示さ
れ、図３にグラフの形で描かれている。
れ、図３にグラフの形で描かれている。
これらの実験のためには、CA2−DENDタブは、Strasus
II機器中で調製した。すなわち、ブランクタブが、
該機器内に入れられ、76μのCA2−DEND溶液が約35μ
／秒の流速でサンプルプローブから各タブに適用され
るように選ばれた機器パラメーターを用いて、CA2−DEN
D溶液でスポットされた。
II機器中で調製した。すなわち、ブランクタブが、
該機器内に入れられ、76μのCA2−DEND溶液が約35μ
／秒の流速でサンプルプローブから各タブに適用され
るように選ばれた機器パラメーターを用いて、CA2−DEN
D溶液でスポットされた。
別の実験において、CA2−DENDタブの性能が、Baxter
Diagnostics Inc.によって現在販売されており、そして
Giegel et al.への米国特許第4,517,288号（「'288特
許」）に一般的に記述されている方法を用いて調製され
たタブの性能と比較された。すなわち、CA2−DEND又はM
AB−２は、免疫複合体として免疫学的に固定化された。
CA2及びMAB−２の双方とも、マウス抗hTSHモノクローナ
ル抗体であり、各々は、マウスIgGに対するヤギ抗血清
を含んでなる二次抗体に複合化された。得られた免疫学
的複合体は、'288特許に記述されているように、ブラン
クタブに吸収させた。この仕方で調製されたタブが、上
記のように実施されたアッセイにおいて、CA2−DENDタ
ブと比較された。これらの実験において、全てのタブ
（CA2−DEND含む）は、Stratus II機器からオフ−ラ
インの、自動化された製造システム中において調製され
た。図４においては、2.8μｇタンパク質／タブの濃度
にCA2−DENDを含有するタブが、1.87μｇタンパク質／
タブの濃度にMAB−２−ヤギ抗IgGを含有する免疫学的に
固定化されたタブと比較されている。図５においては、
11.3μｇタンパク質／タブの濃度にCA2−DENDを含有す
るタブが、3.8μｇタンパク質／タブの濃度にCA2−ヤギ
抗IgGを含有する免疫学的に固定化されたタブと比較さ
れている。
Diagnostics Inc.によって現在販売されており、そして
Giegel et al.への米国特許第4,517,288号（「'288特
許」）に一般的に記述されている方法を用いて調製され
たタブの性能と比較された。すなわち、CA2−DEND又はM
AB−２は、免疫複合体として免疫学的に固定化された。
CA2及びMAB−２の双方とも、マウス抗hTSHモノクローナ
ル抗体であり、各々は、マウスIgGに対するヤギ抗血清
を含んでなる二次抗体に複合化された。得られた免疫学
的複合体は、'288特許に記述されているように、ブラン
クタブに吸収させた。この仕方で調製されたタブが、上
記のように実施されたアッセイにおいて、CA2−DENDタ
ブと比較された。これらの実験において、全てのタブ
（CA2−DEND含む）は、Stratus II機器からオフ−ラ
インの、自動化された製造システム中において調製され
た。図４においては、2.8μｇタンパク質／タブの濃度
にCA2−DENDを含有するタブが、1.87μｇタンパク質／
タブの濃度にMAB−２−ヤギ抗IgGを含有する免疫学的に
固定化されたタブと比較されている。図５においては、
11.3μｇタンパク質／タブの濃度にCA2−DENDを含有す
るタブが、3.8μｇタンパク質／タブの濃度にCA2−ヤギ
抗IgGを含有する免疫学的に固定化されたタブと比較さ
れている。
これらの結果は、免疫学的な固定化によって調製され
たタブで得られるのと同等な較正曲線をCA2−DENDタブ
が与えることができる、ということを実証している。図
６は、図５に示されたデータの低い末端の拡大である。
CA2−DENDタブについてのＹ切片（較正標準Ａ、ゼロ単
位のhTSH）である55mV/分は、免疫学的な固定化によっ
て調製されたCA2タブについてのＹ切片である146mV/分
に比して、有意に低く、デンドリマーに基づくタブにつ
いての非常に低い非特異的結合を反映している。これ
は、アッセイ較正範囲の低い端における、一層高い感度
による、低い値の較正標準の一層正確な読みを許容す
る。
たタブで得られるのと同等な較正曲線をCA2−DENDタブ
が与えることができる、ということを実証している。図
６は、図５に示されたデータの低い末端の拡大である。
CA2−DENDタブについてのＹ切片（較正標準Ａ、ゼロ単
位のhTSH）である55mV/分は、免疫学的な固定化によっ
て調製されたCA2タブについてのＹ切片である146mV/分
に比して、有意に低く、デンドリマーに基づくタブにつ
いての非常に低い非特異的結合を反映している。これ
は、アッセイ較正範囲の低い端における、一層高い感度
による、低い値の較正標準の一層正確な読みを許容す
る。
実施例５
コルチゾルアッセイ
競合的イムノアッセイ方式、薬物アッセイ及びポリク
ローナル抗体の使用への、本発明の適用を実証するため
に、コルチゾルについてのイムノアッセイが選ばれた。
ローナル抗体の使用への、本発明の適用を実証するため
に、コルチゾルについてのイムノアッセイが選ばれた。
コルチゾルに対する家兎抗血清（マサチューセッツ州
のVentrexより入手。Cat.No.4017100）を、室温にて100
％飽和（NH4）2SO4と1:1（v/v）で混合し、そして２゜
〜８℃における高速遠心によって沈殿を回収した。ペレ
ットをBio−Rad protein A結合性緩衝液（pH9.0）（Ca
t.No.1530−6161）中に溶解し、そしてBio−Rad protei
n A親和性ゲルカラム（Cat.No.153−6154）に適用し
た。該カラムを、貫流のUV吸収がベースラインに落ちる
まで、該結合性緩衝液で洗浄した。これに続き、結合し
たIgGをBio−Rad溶出緩衝液（pH3.0）（Cat.No.153−61
62）で溶出させ、次いで、直ちにPBS/0.1％NaN3へと緩
衝液交換した。
のVentrexより入手。Cat.No.4017100）を、室温にて100
％飽和（NH4）2SO4と1:1（v/v）で混合し、そして２゜
〜８℃における高速遠心によって沈殿を回収した。ペレ
ットをBio−Rad protein A結合性緩衝液（pH9.0）（Ca
t.No.1530−6161）中に溶解し、そしてBio−Rad protei
n A親和性ゲルカラム（Cat.No.153−6154）に適用し
た。該カラムを、貫流のUV吸収がベースラインに落ちる
まで、該結合性緩衝液で洗浄した。これに続き、結合し
たIgGをBio−Rad溶出緩衝液（pH3.0）（Cat.No.153−61
62）で溶出させ、次いで、直ちにPBS/0.1％NaN3へと緩
衝液交換した。
精製された抗コルチゾルポリクローナル抗体を、実施
例１に記載したようにして54Åデンドリマーに結合させ
た。この54Åデンドリマー／抗コルチゾルポリクローナ
ル抗体複合体（抗コルチゾルDEND）は、今度は、実施例
３に記載したようにしてスポット用緩衝液に入れてブラ
ンクタブ上へスポットした。一般的に、該タブは、スポ
ット用緩衝液（50mMトリス、pH8.0、0.1％Zonyl FS
N、2.0％BSA及び0.1％アジ化ナトリウム）中の76μの
50μg/mの抗コルチゾル−DENDを、ブランクタブにス
ポットする（すなわち、3.75μg/タブ）して乾燥させる
ことによって調製された。競合的コルチゾルアッセイに
おいて使用された較正標準A,B,C,D,E及びＦは、保存剤
として0.1％のアジ化ナトリウムを含有する処理したヒ
ト血清中に作り、それぞれｄ当たり０、2.5、5.0、1
0.0、25及び50μｇのコルチゾルを含有した。
例１に記載したようにして54Åデンドリマーに結合させ
た。この54Åデンドリマー／抗コルチゾルポリクローナ
ル抗体複合体（抗コルチゾルDEND）は、今度は、実施例
３に記載したようにしてスポット用緩衝液に入れてブラ
ンクタブ上へスポットした。一般的に、該タブは、スポ
ット用緩衝液（50mMトリス、pH8.0、0.1％Zonyl FS
N、2.0％BSA及び0.1％アジ化ナトリウム）中の76μの
50μg/mの抗コルチゾル−DENDを、ブランクタブにス
ポットする（すなわち、3.75μg/タブ）して乾燥させる
ことによって調製された。競合的コルチゾルアッセイに
おいて使用された較正標準A,B,C,D,E及びＦは、保存剤
として0.1％のアジ化ナトリウムを含有する処理したヒ
ト血清中に作り、それぞれｄ当たり０、2.5、5.0、1
0.0、25及び50μｇのコルチゾルを含有した。
このコルチゾルアッセイにおいては、選ばれた較正標
準中のコルチゾルは、タブ上に固定化された抗コルチゾ
ル−DENDとの結合を求めて、標識されたコルチゾル類縁
体と競合する。このアッセイは、20μの較正標準（又
はサンプル）をサンプルカップ中において類縁体溶液
（pH8.0のトリス緩衝液、安定化剤、赤色色素、界面活
性剤及び0.1％のNaN3中の、0.5μg/mコルチゾル−子
牛腸アルカリ性ホスファターゼ接合体）の40μ及びコ
ルチゾルアッセイ緩衝液（30mMのリン酸ナトリウム、８
−アニリノ−１−ナフタリンスルホンサン及び0.1％の
アジ化ナトリウム、pH5.5）の220μと、Stratus A
utomated Sample Handler（SASH）を用いて混合するこ
とによって行われる。該カップを含んだトレーが、次い
でStratus 機器へ移される。各カップ中の70μの溶
液が吸引され、抗コルチゾル−DENDを含有するタブへ放
出される。Stratus 機器基質プローブは、次いで70μ
の基質洗浄液（1.0mMの４−メチルウンベリフェリル
ホスフェート、アルカリ性ホスファターゼ阻害剤、安定
化剤、青色色素、界面活性剤及び0.1％のアジ化ナトリ
ウムを含有する。pH9.0のトリス緩衝液）を吸引し、そ
して20μを及び50μをタブに逐次放出する。第２の
基質洗浄液が放出されるや否や、当初蛍光率が読み取ら
れ、機器の記憶装置に記録される。較正曲線が作られRo
dbardのパラメーターが得られた後、各サンプルの濃度
がプリントアウトされる。
準中のコルチゾルは、タブ上に固定化された抗コルチゾ
ル−DENDとの結合を求めて、標識されたコルチゾル類縁
体と競合する。このアッセイは、20μの較正標準（又
はサンプル）をサンプルカップ中において類縁体溶液
（pH8.0のトリス緩衝液、安定化剤、赤色色素、界面活
性剤及び0.1％のNaN3中の、0.5μg/mコルチゾル−子
牛腸アルカリ性ホスファターゼ接合体）の40μ及びコ
ルチゾルアッセイ緩衝液（30mMのリン酸ナトリウム、８
−アニリノ−１−ナフタリンスルホンサン及び0.1％の
アジ化ナトリウム、pH5.5）の220μと、Stratus A
utomated Sample Handler（SASH）を用いて混合するこ
とによって行われる。該カップを含んだトレーが、次い
でStratus 機器へ移される。各カップ中の70μの溶
液が吸引され、抗コルチゾル−DENDを含有するタブへ放
出される。Stratus 機器基質プローブは、次いで70μ
の基質洗浄液（1.0mMの４−メチルウンベリフェリル
ホスフェート、アルカリ性ホスファターゼ阻害剤、安定
化剤、青色色素、界面活性剤及び0.1％のアジ化ナトリ
ウムを含有する。pH9.0のトリス緩衝液）を吸引し、そ
して20μを及び50μをタブに逐次放出する。第２の
基質洗浄液が放出されるや否や、当初蛍光率が読み取ら
れ、機器の記憶装置に記録される。較正曲線が作られRo
dbardのパラメーターが得られた後、各サンプルの濃度
がプリントアウトされる。
図７においては、抗コルチゾル−DENDタブを用いた競
合的アッセイの作動の結果が、免疫学的固定化によって
調製された抗コルチゾルについての類似のアッセイの結
果と比較されている。免疫学的固定化によって調製され
たタブ（図７における「現行タブ」）は、家兎IgGに対
するヤギ抗血清と複合体形成させた家兎抗コルチゾル血
清、界面活性剤、安定化剤、青色／緑色色素及び0.1％
のアジ化ナトリウムを含有する溶液でブランクタブをス
ポットすることによって製造された。図７においては、
抗コルチゾル−DENDを3.75μｇタンパク質／タブの濃度
に含有するタブが、抗コルチゾルポリクローナル抗体を
858ngタンパク質／タブの濃度に含み免疫学的に固定化
されたタブと比較されている。較正曲線の形は、これら
２つのタイプのタブにつき類似である。
合的アッセイの作動の結果が、免疫学的固定化によって
調製された抗コルチゾルについての類似のアッセイの結
果と比較されている。免疫学的固定化によって調製され
たタブ（図７における「現行タブ」）は、家兎IgGに対
するヤギ抗血清と複合体形成させた家兎抗コルチゾル血
清、界面活性剤、安定化剤、青色／緑色色素及び0.1％
のアジ化ナトリウムを含有する溶液でブランクタブをス
ポットすることによって製造された。図７においては、
抗コルチゾル−DENDを3.75μｇタンパク質／タブの濃度
に含有するタブが、抗コルチゾルポリクローナル抗体を
858ngタンパク質／タブの濃度に含み免疫学的に固定化
されたタブと比較されている。較正曲線の形は、これら
２つのタイプのタブにつき類似である。
実施例６
葉酸アッセイ
次のアッセイは、ポリペプリド以外の分子に結合させ
たデンドリマー、すなわち葉酸のような小さな分子に結
合させたデンドリマーの有用性を実証している。
たデンドリマー、すなわち葉酸のような小さな分子に結
合させたデンドリマーの有用性を実証している。
葉酸に結合させたデンドリマー（葉酸−DEND）の製造
のために、業者によって供給された状態の1.5mの54Å
デンドリマー（粒子数約4.0×1016個/m）が、0.3m
の0.5Mリン酸ナトリウム（pH7.1）に添加される。該溶
液のpHを、1N塩酸又は1N水酸化ナトリウムを用いて約7.
6に調節する。次いで、1.2mgのＮ−ヒドロキシスクシン
イミド活性化葉酸を、0.12mのジメチルスルホキシド
に溶解し、該pH7.6のデンドリマー溶液に加える。合わ
せられた溶液は、活性化葉酸：デンドリマーの20:1とい
うモル比を示す。該反応混合物は、室温にて２時間イン
キュベートされる。該反応は、0.14mの1M塩酸エタノ
ールアミンを加えることにより停止される。この反応混
合物を、室温にて更に1/2時間インキュベートし、次い
で、PBS/0.1％NaN3（pH7.4）で平衡化したSephadex G−
25カラムを通すことにより脱塩する。葉酸の分子濃度
は、350nmにおけるモル吸光係数7400cm-1M-1を用いて評
価される。
のために、業者によって供給された状態の1.5mの54Å
デンドリマー（粒子数約4.0×1016個/m）が、0.3m
の0.5Mリン酸ナトリウム（pH7.1）に添加される。該溶
液のpHを、1N塩酸又は1N水酸化ナトリウムを用いて約7.
6に調節する。次いで、1.2mgのＮ−ヒドロキシスクシン
イミド活性化葉酸を、0.12mのジメチルスルホキシド
に溶解し、該pH7.6のデンドリマー溶液に加える。合わ
せられた溶液は、活性化葉酸：デンドリマーの20:1とい
うモル比を示す。該反応混合物は、室温にて２時間イン
キュベートされる。該反応は、0.14mの1M塩酸エタノ
ールアミンを加えることにより停止される。この反応混
合物を、室温にて更に1/2時間インキュベートし、次い
で、PBS/0.1％NaN3（pH7.4）で平衡化したSephadex G−
25カラムを通すことにより脱塩する。葉酸の分子濃度
は、350nmにおけるモル吸光係数7400cm-1M-1を用いて評
価される。
酵素標識された葉酸結合性タンパク質（FBP−ALP）の
製造のためには、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（AL
P）が、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++（pH7.6）中
に調製される。該ALP溶液の液量は、最終濃度2.6mgALP/
mになるよう調節される。該ALP溶液はスルホ−SIABの
2mg/m溶液と、スルホ−SIAB:ALPのモル比20:1にて合
わせられる。該反応混合物は30℃にて１時間インキュベ
ートされ、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++
（pH7.6）で平衡化したSephadex G−25カラムを通過さ
せることによって脱塩される。タンパク質画分をプール
し、SIAB標識ALP（ALP−SIAB）の濃度が、BCAタンパク
質アッセイ（Pierce,Cat.No.23225G）によって測定され
る。ALP分子当たりのSIAB基の数は、当業者に知られた
標準的方法で測定できる。
製造のためには、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（AL
P）が、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++（pH7.6）中
に調製される。該ALP溶液の液量は、最終濃度2.6mgALP/
mになるよう調節される。該ALP溶液はスルホ−SIABの
2mg/m溶液と、スルホ−SIAB:ALPのモル比20:1にて合
わせられる。該反応混合物は30℃にて１時間インキュベ
ートされ、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++
（pH7.6）で平衡化したSephadex G−25カラムを通過さ
せることによって脱塩される。タンパク質画分をプール
し、SIAB標識ALP（ALP−SIAB）の濃度が、BCAタンパク
質アッセイ（Pierce,Cat.No.23225G）によって測定され
る。ALP分子当たりのSIAB基の数は、当業者に知られた
標準的方法で測定できる。
2.13mの0.12Mリン酸ナトリウム（pH7.5）中のFBPの
5mgに、174mgのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
含有する85μのジメチルホルムアミドを加える。該溶
液を30℃にて１時間インキュベートし、続いて0.1Mリン
酸ナトリウム（pH7.6）中の1Mヒドロキシルアミン22μ
を添加し、30℃にて更に1/2時間インキュベートす
る。該溶液を、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム、5mMのE
DTA（pH6.0）で平衡化したSephadex G−25カラムを通過
させることにより脱塩する。タンパク質画分をプール
し、FBPスルフヒドリル誘導体（FBP−SH）濃度を、280n
mにおける吸光係数約3.57m・mg-1・cm-1を用いて測定
する。FBP分子当たりのスルフヒドリル基の数は、当業
者に知られた標準的方法で測定できる。
5mgに、174mgのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
含有する85μのジメチルホルムアミドを加える。該溶
液を30℃にて１時間インキュベートし、続いて0.1Mリン
酸ナトリウム（pH7.6）中の1Mヒドロキシルアミン22μ
を添加し、30℃にて更に1/2時間インキュベートす
る。該溶液を、次いで、0.1Mリン酸ナトリウム、5mMのE
DTA（pH6.0）で平衡化したSephadex G−25カラムを通過
させることにより脱塩する。タンパク質画分をプール
し、FBPスルフヒドリル誘導体（FBP−SH）濃度を、280n
mにおける吸光係数約3.57m・mg-1・cm-1を用いて測定
する。FBP分子当たりのスルフヒドリル基の数は、当業
者に知られた標準的方法で測定できる。
このALP−SIAB（分子量140000ダルトン）及びFBP−SH
（分子量30000ダルトン）溶液は、それぞれモル比1:6に
て合わされ、該合わされた溶液の液量が、総タンパク質
濃度が４〜5mg/mになるよう調節される。この合わさ
れた溶液は、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++（pH7.
6）中へ緩衝液交換され、次いで２゜〜８℃にて24時間
インキュベートされる。該反応は、該反応液量の1/50に
等しいジメチルホルムアミド中の10mg/mのＮ−エチル
マレイミドの添加によって停止され、室温にて更に２時
間インキュベートされる。得られた接合体は、10mMのト
リス、1mMのMg++、0.1mMのZn++、及び0.1％のアジ化ナ
トリウム（pH7.0）で平衡化したAcA−35 Ultrogelカラ
ムを通過させることにより精製される。プールされた画
分中におけるFBP−ALP接合体の濃度はPierce BCAタンパ
ク質アッセイで測定できる。
（分子量30000ダルトン）溶液は、それぞれモル比1:6に
て合わされ、該合わされた溶液の液量が、総タンパク質
濃度が４〜5mg/mになるよう調節される。この合わさ
れた溶液は、0.1Mリン酸ナトリウム、1mMのMg++（pH7.
6）中へ緩衝液交換され、次いで２゜〜８℃にて24時間
インキュベートされる。該反応は、該反応液量の1/50に
等しいジメチルホルムアミド中の10mg/mのＮ−エチル
マレイミドの添加によって停止され、室温にて更に２時
間インキュベートされる。得られた接合体は、10mMのト
リス、1mMのMg++、0.1mMのZn++、及び0.1％のアジ化ナ
トリウム（pH7.0）で平衡化したAcA−35 Ultrogelカラ
ムを通過させることにより精製される。プールされた画
分中におけるFBP−ALP接合体の濃度はPierce BCAタンパ
ク質アッセイで測定できる。
該葉酸アッセイはStratus 機器及びコルチゾル競合
アッセイについて上に報告されているものと類似の条件
を用いて、競合方式にで実施された。該葉酸アッセイに
おいては、選ばれた較正標準（又はサンプル）中の葉酸
は、FBP−ALP接合体への結合を求めて葉酸−DEND粒子上
の葉酸部分と競合する。すなわち、較正標準又はサンプ
ルにおける漸増的に高めた葉酸濃度は、対応して低いレ
ベルのFBP−ALPしか固相（タブ）上の葉酸−DENDに結合
させない。血清中の葉酸は、特異的結合性アッセイ試薬
に基づく葉酸測定を妨害する葉酸結合性タンパク質と関
連して存在している。他の血清タンパク質もまた、葉酸
及び他のアッセイ試薬との特異的又は非特異的相互作用
を通じて妨害し得る。そのようなものとして、測定され
るべき葉酸は、葉酸結合性タンパク質からそして他の血
清タンパク質との妨害的関連から自由にされなければな
らない。この目的のため、25％エタノール中1N水酸化ナ
トリウムを含有する葉酸抽出剤、及び、ジチオスレイト
ール（DTT）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、塩化
ナトリウム及びリン酸ナトリウム（pH6.3）含有する葉
酸還元剤が、アッセイに含まれる。該葉酸抽出剤及び還
元剤をアッセイの適当な時点で中和するために、ホウ酸
塩を含有する葉酸中和剤（pH7.2）及び0.5％葉酸不含BS
Aが添加される。
アッセイについて上に報告されているものと類似の条件
を用いて、競合方式にで実施された。該葉酸アッセイに
おいては、選ばれた較正標準（又はサンプル）中の葉酸
は、FBP−ALP接合体への結合を求めて葉酸−DEND粒子上
の葉酸部分と競合する。すなわち、較正標準又はサンプ
ルにおける漸増的に高めた葉酸濃度は、対応して低いレ
ベルのFBP−ALPしか固相（タブ）上の葉酸−DENDに結合
させない。血清中の葉酸は、特異的結合性アッセイ試薬
に基づく葉酸測定を妨害する葉酸結合性タンパク質と関
連して存在している。他の血清タンパク質もまた、葉酸
及び他のアッセイ試薬との特異的又は非特異的相互作用
を通じて妨害し得る。そのようなものとして、測定され
るべき葉酸は、葉酸結合性タンパク質からそして他の血
清タンパク質との妨害的関連から自由にされなければな
らない。この目的のため、25％エタノール中1N水酸化ナ
トリウムを含有する葉酸抽出剤、及び、ジチオスレイト
ール（DTT）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、塩化
ナトリウム及びリン酸ナトリウム（pH6.3）含有する葉
酸還元剤が、アッセイに含まれる。該葉酸抽出剤及び還
元剤をアッセイの適当な時点で中和するために、ホウ酸
塩を含有する葉酸中和剤（pH7.2）及び0.5％葉酸不含BS
Aが添加される。
各アッセイタブは、上記実施例３に記述したように、
５％葉酸不含BSAを含むスポット緩衝液中の76μの6.5
μg/m葉酸−DENDを、タブの中心領域上にスポットす
ることによって構成された。競合的葉酸アッセイにおい
て用いられた較正標準A,B,C,D,E及びＦは、処理済ヒト
血清中それぞれ、０、0.90、2.20、5.40、9.90及び19.6
0ng葉酸/mを含有した。アッセイは、サンプルカップ
中の70μの選ばれた較正標準を、20μの葉酸還元剤
と混合し、続いて20μの葉酸抽出剤を添加し、続いて
葉酸中和剤中の0.625μg/mのFBP−ALPを160μ添加
することによって、実施される。20分間のインキュベー
ションの後、該混合物が葉酸−DENDタブ上にスポットさ
れ、コルチゾルアッセイ（実施例５）に上記した通りに
基質洗浄液で洗浄され、そして蛍光率が読まれ記録され
る。これらの実験の結果は、図８に与えられている。
５％葉酸不含BSAを含むスポット緩衝液中の76μの6.5
μg/m葉酸−DENDを、タブの中心領域上にスポットす
ることによって構成された。競合的葉酸アッセイにおい
て用いられた較正標準A,B,C,D,E及びＦは、処理済ヒト
血清中それぞれ、０、0.90、2.20、5.40、9.90及び19.6
0ng葉酸/mを含有した。アッセイは、サンプルカップ
中の70μの選ばれた較正標準を、20μの葉酸還元剤
と混合し、続いて20μの葉酸抽出剤を添加し、続いて
葉酸中和剤中の0.625μg/mのFBP−ALPを160μ添加
することによって、実施される。20分間のインキュベー
ションの後、該混合物が葉酸−DENDタブ上にスポットさ
れ、コルチゾルアッセイ（実施例５）に上記した通りに
基質洗浄液で洗浄され、そして蛍光率が読まれ記録され
る。これらの実験の結果は、図８に与えられている。
上記の詳細な記述は、本発明のよりよい理解のために
提供されたに過ぎない。そして、添付の請求の範囲の精
神及び範囲から逸脱することなしに、何らかの修正が当
業者に明らかであろうから、そこから不必要な限定を読
み取ってはならない。
提供されたに過ぎない。そして、添付の請求の範囲の精
神及び範囲から逸脱することなしに、何らかの修正が当
業者に明らかであろうから、そこから不必要な限定を読
み取ってはならない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ユー，クウォク，サム
アメリカ合衆国32708フロリダ、ウイン
タースプリングス、ベンチウッドドライ
ブ 879
(72)発明者 シン，プラタップ
アメリカ合衆国33193フロリダ、マイア
ミ、サウスウエスト 69 ストリート
15111
(72)発明者 ダイアモンド，スティーブン，イー
アメリカ合衆国46530インディアナ、グ
レインジャー、クエイルバレードライブ
51868
(56)参考文献 特開 平２−138870（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−102388（ＪＰ，Ａ)
特表 昭63−501876（ＪＰ，Ａ)
国際公開91／12886（ＷＯ，Ａ１)
Claims (25)
- 【請求項１】（ａ）固相と、 （ｂ）外側の官能化された表面を有するデンドリマーお
よび該デンドリマーの外側の官能化された表面へ共有結
合により連結された特異的結合アッセイ試薬よりなるデ
ンドリマー／試薬複合体を含み、 該デンドリマー／試薬複合体は前記固相へ固定化されて
いる特異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項２】固相は間隙を含んでいる請求項１の特異的
結合アッセイ複合体。 - 【請求項３】固相は網の目に絡ませた複数のガラス繊維
よりなるガラスフィルターである請求項２の特異的結合
アッセイ複合体。 - 【請求項４】ガラスフィルターは実質上負に帯電した表
面を有し、かつデンドリマーは実質上正に帯電した表面
を有する請求項３の特異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項５】デンドリマーは、開始剤コアと、少なくと
も一つの内層と、そして前記外側の官能化された表面を
含んでいる請求項１ないし４のいずれかの特異的結合ア
ッセイ複合体。 - 【請求項６】デンドリマーは54オングストームデンドリ
マーであり、外側の官能化された表面は複数のアミノ基
を含んでいる請求項１ないし５のいずれかの特異的結合
アッセイ複合体。 - 【請求項７】前記特異的結合アッセイ試薬はポリペプチ
ドである請求項１ないし６のいずれかの特異的結合アッ
セイ複合体。 - 【請求項８】ポリペプチドは抗体、抗体フラグメントお
よび特異的結合タンパクよりなる群から選ばれる請求項
７の特異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項９】ポリペプチドは抗hTSH抗体、抗コルチゾル
抗体および葉酸結合タンパクよりなる群から選ばれる請
求項７の特異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項１０】前記特異的結合アッセイ試薬は被分析物
である請求項１ないし９のいずれかの特異的結合アッセ
イ複合体。 - 【請求項１１】前記被分析物は葉酸である請求項10の特
異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項１２】（ａ）本質的にデンドリマーの凝結物を
含む固相であって、該凝結物は特異的結合アッセイ条件
において実質上不溶である固相と、 （ｂ）前記凝結物へ共有結合により連結された特異的結
合アッセイ試薬 を含んでいる特異的結合アッセイ複合体。 - 【請求項１３】（ａ）特異的結合アッセイ試薬をデンド
リマーへデンドリマー／試薬複合体を形成するように共
有結合して連結し、 （ｂ）該デンドリマー／試薬複合体の固相への固定化を
実現する条件下で該デンドリマーを該固相と接触させる
ことを含む、特異的結合アッセイ試薬を固相に固定化す
る方法。 - 【請求項１４】該試薬のデンドリマーへの共有結合連結
はデンドリマーを固相と接触させる前に実施される請求
項13の方法。 - 【請求項１５】該試薬は抗体、抗体フラグメント、特異
的結合タンパクおよび被分析物の一つから選ばれる請求
項13または14の方法。 - 【請求項１６】該試薬のデンドリマーへの共有結合連結
はシッフ塩基の還元によって行われるＣ−Ｎ結合による
ものである請求項13ないし15のいずれかの方法。 - 【請求項１７】該試薬のデンドリマーへの共有結合連結
はSIAB標識基をスルフヒドリル含有基と結合することに
よって行われるＣ−Ｓ結合によるものである請求項13な
いし15のいずれかの方法。 - 【請求項１８】該試薬のデンドリマーへの共有結合連結
は臭化シアン活性化デンドリマーを試薬のアミノ基と反
応させることによって行われるＣ−Ｏ結合によるもので
ある請求項13ないし15のいずれかの方法。 - 【請求項１９】サンプル中の被分析物もしくは被分析物
に対するレセプターの濃度または存在を決定するための
特異的結合アッセイを実施する方法であって、 （ａ）被分析物もしくは被分析物のレセプターに対して
特異性を有する特異的結合アッセイ試薬をデンドリマー
へ共有結合により連結することによって形成した固定化
デンドリマー／試薬複合体の有効量を有する固相へ、被
分析物もしくは被分析物に対するレセプターの該試薬へ
の結合を実現する条件下でサンプルを適用し、 （ｂ）標識した接合体の選択した量を接合体の被分析物
もしくは被分析物に対するレセプターへの結合を実現す
る条件下で該固相へ適用し、 （ｃ）該固相上の被分析物もしくは被分析物に対するレ
セプターへ結合した標識した接合体の量を決定し、 （ｄ）標識した接合体の前記量をサンプル中の被分析物
もしくは被分析物に対するレセプターの濃度または存在
に相関させる、 ことを含む方法。 - 【請求項２０】該試薬は抗体、抗体フラグメント、特異
的結合タンパクおよび被分析物の一つから選ばれる請求
項19の方法。 - 【請求項２１】サンプルおよび標識した接合体は固相に
対して同時に適用される請求項19または20の方法。 - 【請求項２２】サンプル中の被分析物もしくは被分析物
に対するレセプターの濃度または存在を決定するための
特異的結合アッセイを実施する方法であって、 （ａ）被分析物もしくは被分析物に対するレセプターに
対して特異性を有する特異的結合アッセイ試薬をデンド
リマーへ共有結合により連結することによって形成した
固定化デンドリマー／試薬の有効量を有する固相へ、被
分析物もしくは被分析物に対するレセプターの該試薬へ
の結合を実現する条件下でサンプルを適用し、 （ｂ）標識した特異的競合試薬の選択した量を該競合試
薬の被分析物もしくは被分析物に対するレセプターへの
結合を実現する条件下で該固相へ適用し、 （ｃ）該固相上の前記複合体へ結合した標識の量を決定
し、 （ｄ）標識の前記量をサンプル中の被分析物もしくは被
分析物に対するレセプターの濃度または存在に相関させ
る、 ことを含む方法。 - 【請求項２３】該特異的競合試薬は被分析物の標識した
類縁体である請求項22の方法。 - 【請求項２４】該特異的競合試薬は被分析物に対する標
識したレセプターである請求項22の方法。 - 【請求項２５】該特異的結合アッセイ試薬は抗体、抗体
フラグメント、特異的結合タンパクおよび被分析物の一
つから選ばれる請求項22ないし24のいずれかの方法。
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|---|---|---|---|
| US2192893A | 1993-02-24 | 1993-02-24 | |
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|---|---|
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| JP3366978B2 true JP3366978B2 (ja) | 2003-01-14 |
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|---|---|---|---|
| JP51904894A Expired - Fee Related JP3366978B2 (ja) | 1993-02-24 | 1994-02-09 | 特異的結合性アッセイ試薬の固定化 |
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| AU (1) | AU6267794A (ja) |
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