JP3601043B2 - 新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法、新規アルカリプロテアーゼからなる製品。 - Google Patents
新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法、新規アルカリプロテアーゼからなる製品。 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼおよびその製造法ならびに該アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規好アルカリ性放線菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリプロテアーゼはタンパク質のペプチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解する酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業において広く利用されている。このようなアルカリプロテアーゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産されることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。
【０００３】
前述された好アルカリ性微生物から生産されるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカリ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平７−６３３６６、特公平７−６３３６７、特公平７−６３３６８等）が多数既に知られており、主に洗剤用として開発が進められている。また、同様な好アルカリ性バチルス属菌から得られる耐熱性酵素として、ＡＨ−１０１株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平２−２５５０８７）およびＢ１８−１株の生産するアルカリプロテアーゼ（特公平７−６３３６８）等が知られている。しかしながら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあまり知られておらず、わずかに好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来の酵素（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８ （１）３７−４４，１９７４）ならびに好アルカリ性サーモアクチノミセス属ＨＳ６８２株のアルカリプロテアーゼ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（２），２４６−２５０，１９９２）等が報告されているにすぎない。
【０００４】
一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：繊消誌、第２６巻，３２２頁，（１９８５））。もちろん、この場合においてもカゼイン等の可溶性タンパク質を強力に分解できなければならないことは当然である。また、プロテアーゼを浴槽や浴床排水溝あるいは洗面化粧台ドレインの洗浄剤に応用する場合では、４０℃前後の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢などのケラチンを強力に分解する能力が要求される。現状の洗剤および洗浄剤は、配合組成の関係からそのｐＨがアルカリ領域にあることから、配合する酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００５】
さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシステインの製造原料として重要である。現状では毛髪等を酸加水分解処理し、化学的反応によりシステインを製造している。しかしながら、過激な反応条件のため著量のシステインが分解されてしまい、収量が極めて悪いため、プロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれていた。この場合においても、ケラチンが高アルカリ領域において膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性質から、加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００６】
このような用途に対して、先述のＡＨ−１０１株および好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来のアルカリプロテアーゼの有用性が提案されている。しかしながら、特にケラチンの分解力において両酵素ともその実用化に対しては不充分であり、さらに強力なケラチン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が望まれていた。
【０００７】
上記のような観点から、発明者らは強力なケラチン分解力を有するアルカリプロテアーゼを生産する微生物を主に好アルカリ性放線菌を中心として検索した結果、好アルカリ性のストレプトミセス属に属する放線菌１株が、好気的培養により目的とする新規アルカリプロテアーゼを効率良く生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、特にケラチンのような不溶性タンパク質をも強力に加水分解できる、新規なアルカリプロテアーゼを提供することを目的としている。
【０００９】
また本発明は、上記アルカリプロテアーゼを生産する新規微生物およびその微生物を利用した上記アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明による新規アルカリプロテアーゼは、以下のような理化学的性質を有するもの、である。
【００１１】
（ａ）作用および基質特異性：各種タンパク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また特に従来のプロテアーゼでは分解が困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質についても高い活性を示す。
（ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場合、１１．０〜１１．５である。
（ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件において、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。
（ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。
（ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件において、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定である。
（ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）である。
（ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）である。
（ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。
（ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーリュリーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）では阻害される。
【００１２】
また、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼの製造法は、好アルカリ性ストレプトミセス属に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該新規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなるもの、である。さらにまた、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）である。
【００１３】
本発明によるアルカリプロテアーゼは比活性が極めて高く、特に従来のプロテアーゼでは分解されにくかったケラチン等の不溶性タンパク質をも、強力に加水分解する。したがって、衣料用洗剤や柔軟剤に洗浄効果を高める目的で配合されたり、浴槽、浴室排水溝、洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加されれば、極めて効果的である。さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛等からのシステインなどのアミノ酸製造にも応用が可能であり、広範囲の工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、上記アルカリプロテアーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる点で有利である。
【００１４】
新規アルカリプロテアーゼ産生菌株
本発明による新規アルカリプロテアーゼは、微生物を用いて生産することができる。特に好ましくは、本発明によるアルカリプロテアーゼは、好アルカリ性ストレプトミセス属、特にストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５株により生産される。この菌株は発明者らにより、北九州市の一般家屋浴室のタイル目地上より分離されたものである。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、次の表１及び表２に示す菌学的性質を有する。なお、本菌株は好アルカリ微生物であり、通常の中性培地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良であるため、表１及び表２の菌学的性質の検討に際しては０．５％Ｎａ２ＣＯ３添加のアルカリ性培地を用いた。
【００１５】
【表１】
【表２】
【００１６】
本菌株ＴＯＴＯ−９３０５株は表１の結果より、形態学的に放線菌、ストレプトミセス属の特徴を有する。また、細胞壁にＬ−Ｌ−ジアミノピメリン酸を含有する等のことから、本菌株はストレプトミセス属に属する一菌種と分類される。
【００１７】
ＴＯＴＯ−９３０５株は、各種寒天培地上での気菌糸の色調から白色シリーズに属すること、胞子表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね直状であること、メラニン色素は生成しないこと等の性質を有する。これらの性質と各種炭素源の同化性試験の結果をもとに、既知菌種の中から本菌株の類似種をバージェーズマニュアル第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ Ｅｄ．）に従って検索を行った。その結果、特に各種炭素源の同化性において本菌株と類似の既知菌種は見いだせないことから、本菌株はストレプトミセス属に属する新菌種である。
【００１８】
なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号第１３６４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）のもと寄託されている。
【００１９】
培養条件
上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養はアルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にするための方法としては格別である必要はなく、通常の培地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源としては、０．５〜２．０％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモニアなどが使用でき、培地のｐＨは８．０〜１１．０程度が望ましい。
【００２０】
培養は、このような培地中で培養温度２０〜４０℃、好ましくは２７〜３８℃で２日〜５日間好気的に撹袢または振とうしながら行う。
【００２１】
本発明による新規なアルカリプロテアーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として培養液中に分泌され、蓄積される。
【００２２】
酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するためには、既知の精製法を単独もしくは併用して利用することができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などによる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製することができる。
【００２３】
好ましい精製法を示せば以下の通りである。まず、培養濾液に８０％飽和硫安を添加して塩析を行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（同社製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、ＳＤＳ電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００２４】
酵素の性質
本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示される通りである。なお、以下において活性測定法とは次の方法をいうものとする。
【００２５】
（活性測定法）
カゼイン０．６％またはケラチン２％を含む５０ｍＭグリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）０．５ｍｌを０．１ｍｌの酵素溶液と混合し、３０℃、１０分間（ケラチンを基質とした場合は振とうしながら２０分間）反応させた後、２．５ｍｌのトリクロロ酢酸混合液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸）を加えて３０℃で３０分間静置した後、アドバンテック社製濾紙Ｎｏ．５Ｃで濾過する。次いで、この濾液の０．５ｍｌを２．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加え、さらに３倍希釈したフェノール試薬を０．５ｍｌ添加撹袢後、さらに室温にて３０分間放置し、６６０ｎｍの吸光度を測定する。上記の測定条件下で１分間に１マイクログラムのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、酵素活性１単位（１Ｕ）と定義する。
【００２６】
（１）作用および基質特異性
カゼイン、ゼラチン、グルテン、ヘモグロビン、インシュリンなどのタンパク質に作用し、そのペプチド結合をエンド的に加水分解することによりオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また、特に従来の酵素では分解の困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質をも強力に加水分解する。
【００２７】
（２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ
上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすｐＨの影響を調べた。なお、緩衝液としてＫＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ１．０−１．５）、グリシンＮａＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ２．０−３．５）、酢酸（ｐＨ４．０−５．５）、リン酸（ｐＨ６．０−７．０）、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５−８．５）、グリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ９．０−１１．５）、ＫＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０−１３．０）を使用した。第１図に活性の最大値を１００とした場合の各ｐＨにおける相対活性を示した。第１図により本酵素の最適ｐＨは３０℃において１１．０−１１．５であることが分かる。
【００２８】
同様に本酵素のｐＨ安定性について第２図に示した。本酵素を各ｐＨの緩衝液中に３０℃で２４時間保持した後、その残存活性を未処理の酵素活性を１００とした相対活性として示した。第２図から、本酵素は上記処理条件下においてｐＨ１．５−１２．０までの極めて広範囲のｐＨ域で安定であることが分かる。
【００２９】
（３）最適温度および安定温度
上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を調べた。第３図に最大活性を１００とした場合の各温度における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温度は７０〜７５℃であることが分かる。
【００３０】
また、本酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加し、４０〜８０℃の範囲の各条件下で１０分間保持した後、その残存活性を測定した。測定は５ｍＭの塩化カルシウムを添加した場合としない場合の二通りについて行った。その結果を第４図に示した。第４図により、カルシウム無添加の場合は５５℃まで、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定であることがわかる。この結果より、本酵素はカルシウムの添加により熱安定性が増加することが判明した。
【００３１】
（４）分子量
本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法により測定したところ、分子量は約５６，０００であった。
【００３２】
（５）等電点
本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したところ、等電点は約１０〜１０．５であった。
【００３３】
（６）比活性
本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、タンパク質濃度はバイオラッド社製のプロテインアッセイキットを使用して測定し、酵素は電気泳動的に均一な精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性は、カゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンに対しては５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）であり、本酵素は極めて強力な加水分解活性を有することが判明した。
【００３４】
（７）阻害
一般的な酵素阻害剤であるＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）について、これらが本酵素の活性に及ぼす影響を調べた。各阻害剤を所定濃度となるように５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、本酵素を添加後３０℃で３０分間処理を行った。次いで処理溶液より一定量を分取して活性測定法に準じて、その残存活性を測定した。残存活性は阻害剤無添加で同様に処理した対照を１００とした相対値で示した。この結果を表３に示した。
【００３５】
【表３】
【００３６】
表３の結果から、本酵素はＤＦＰおよびＰＭＳＦにより阻害され、その他の阻害剤による阻害を受けなかったことより、本アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼであることがわかる。また、本酵素は界面活性剤であるＳＤＳに対しても若干の阻害をうけたものの、まだ十分な活性を保持しており洗剤用として有望である。
【００３７】
上記各特性を示す本酵素と、従来公知の細菌、放線菌由来のアルカリプロテアーゼとの比較を表４に示した。
【００３８】
【表４】
【００３９】
表４に示した諸性質の比較より、本酵素が極めて高い比活性を有する新規なアルカリプロテアーゼであることが分かる。
【００４０】
【発明の実施の態様】
次に本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１ 粗酵素粉末の調製
ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌ（３５℃、４日間振とう培養）を、可溶性デンプン１．５％、スキムミルク１．５％、Ｋ２ＨＣＯ４ ０．３％、酵母エキス０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％および、別殺菌して添加したＮａＨＣＯ３ １．０％を含有する培地（ｐＨ９．０）４５００ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、３５℃で４日間、通気量１ｖ／ｖ／ｍｉｎ、回転数２００ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清液を凍結乾燥して、４０Ｕ／ｍｇの粗酵素粉末９ｇを得た。
【００４２】
実施例２ 精製酵素の調製
実施例１と同様の培地４５００ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに、ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌを植菌した。これを実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上清３８００ｍｌを得た。この上清液のｐＨ１０．５におけるプロテアーゼ活性は９４．５Ｕ／ｍｇであった。
【００４３】
次いで、この上清液に硫安粉末を８０％飽和になるまで加え、１昼夜５℃で暗所に静置後８０００ｒｐｍで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、セルロースチューブを用いて同緩衝液に対し透析を行った。透析後、その透析内液を１ｍＭＣａＣｌ添加の１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて酵素を吸着させ、０〜０．５Ｍ のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。活性画分を透析後、１ｍＭＣａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて活性画分を通過させ、不純タンパク質を吸着させた。上記一連の精製により、１９２０Ｕ／ｍｌのアルカリプロテアーゼを３４ｍｌ得た。本画分はＳＤＳ電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵素タンパク質として均一であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適ｐＨを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定ｐＨを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適温度を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定温度を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアルカリプロテアーゼおよびその製造法ならびに該アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規好アルカリ性放線菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリプロテアーゼはタンパク質のペプチド結合をアルカリ領域において特異的に加水分解する酵素であり、食品、繊維、皮革、洗剤等の工業において広く利用されている。このようなアルカリプロテアーゼは糸状菌、酵母、細菌等の微生物により広く生産されることが知られており、またいわゆる好アルカリ性微生物と呼ばれる一群の微生物によっても生産される。
【０００３】
前述された好アルカリ性微生物から生産されるアルカリプロテアーゼとしては、いわゆる好アルカリ性バチルス属菌から得られる酵素（例えば、特公平７−６３３６６、特公平７−６３３６７、特公平７−６３３６８等）が多数既に知られており、主に洗剤用として開発が進められている。また、同様な好アルカリ性バチルス属菌から得られる耐熱性酵素として、ＡＨ−１０１株の生産するアルカリプロテアーゼ（特開平２−２５５０８７）およびＢ１８−１株の生産するアルカリプロテアーゼ（特公平７−６３３６８）等が知られている。しかしながら、同じ好アルカリ性微生物である好アルカリ性放線菌の産生するプロテアーゼについてはあまり知られておらず、わずかに好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来の酵素（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８ （１）３７−４４，１９７４）ならびに好アルカリ性サーモアクチノミセス属ＨＳ６８２株のアルカリプロテアーゼ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（２），２４６−２５０，１９９２）等が報告されているにすぎない。
【０００４】
一方、洗剤用にプロテアーゼを応用する場合、ケラチン等の不溶性タンパク質に対しても良好に作用する酵素が望ましいことが指摘されている（皆川基：繊消誌、第２６巻，３２２頁，（１９８５））。もちろん、この場合においてもカゼイン等の可溶性タンパク質を強力に分解できなければならないことは当然である。また、プロテアーゼを浴槽や浴床排水溝あるいは洗面化粧台ドレインの洗浄剤に応用する場合では、４０℃前後の中温で充分な活性を保持し、かつ毛髪、垢などのケラチンを強力に分解する能力が要求される。現状の洗剤および洗浄剤は、配合組成の関係からそのｐＨがアルカリ領域にあることから、配合する酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００５】
さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛等は化学合成が不可能なアミノ酸であるシステインの製造原料として重要である。現状では毛髪等を酸加水分解処理し、化学的反応によりシステインを製造している。しかしながら、過激な反応条件のため著量のシステインが分解されてしまい、収量が極めて悪いため、プロテアーゼ処理等の温和な加水分解方法が望まれていた。この場合においても、ケラチンが高アルカリ領域において膨潤し酵素の作用を受けやすくなるという性質から、加水分解剤としての酵素はアルカリプロテアーゼが最適である。
【０００６】
このような用途に対して、先述のＡＨ−１０１株および好アルカリ性ストレプトミセス属菌由来のアルカリプロテアーゼの有用性が提案されている。しかしながら、特にケラチンの分解力において両酵素ともその実用化に対しては不充分であり、さらに強力なケラチン分解力を有する新規なアルカリプロテアーゼの開発が望まれていた。
【０００７】
上記のような観点から、発明者らは強力なケラチン分解力を有するアルカリプロテアーゼを生産する微生物を主に好アルカリ性放線菌を中心として検索した結果、好アルカリ性のストレプトミセス属に属する放線菌１株が、好気的培養により目的とする新規アルカリプロテアーゼを効率良く生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、特にケラチンのような不溶性タンパク質をも強力に加水分解できる、新規なアルカリプロテアーゼを提供することを目的としている。
【０００９】
また本発明は、上記アルカリプロテアーゼを生産する新規微生物およびその微生物を利用した上記アルカリプロテアーゼの製造法を提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明による新規アルカリプロテアーゼは、以下のような理化学的性質を有するもの、である。
【００１１】
（ａ）作用および基質特異性：各種タンパク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また特に従来のプロテアーゼでは分解が困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質についても高い活性を示す。
（ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場合、１１．０〜１１．５である。
（ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件において、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。
（ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。
（ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件において、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定である。
（ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）である。
（ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）である。
（ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。
（ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーリュリーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）では阻害される。
【００１２】
また、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼの製造法は、好アルカリ性ストレプトミセス属に属し、上記アルカリプロテアーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られる培養物より該新規アルカリプロテアーゼを分離する工程を含んでなるもの、である。さらにまた、本発明による上記新規アルカリプロテアーゼ産生能を有する新規菌株は、ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）である。
【００１３】
本発明によるアルカリプロテアーゼは比活性が極めて高く、特に従来のプロテアーゼでは分解されにくかったケラチン等の不溶性タンパク質をも、強力に加水分解する。したがって、衣料用洗剤や柔軟剤に洗浄効果を高める目的で配合されたり、浴槽、浴室排水溝、洗面化粧台ドレインなどの閉塞除去剤に添加されれば、極めて効果的である。さらに、ケラチンを主要タンパク質とする毛髪、羽毛等からのシステインなどのアミノ酸製造にも応用が可能であり、広範囲の工業分野で利用され得る。また、本発明による菌株は、上記アルカリプロテアーゼを効率良く菌体外に分泌するので、簡便な工程で高効率にその生産を行うことができる点で有利である。
【００１４】
新規アルカリプロテアーゼ産生菌株
本発明による新規アルカリプロテアーゼは、微生物を用いて生産することができる。特に好ましくは、本発明によるアルカリプロテアーゼは、好アルカリ性ストレプトミセス属、特にストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５株により生産される。この菌株は発明者らにより、北九州市の一般家屋浴室のタイル目地上より分離されたものである。この菌株は好アルカリ性放線菌であり、次の表１及び表２に示す菌学的性質を有する。なお、本菌株は好アルカリ微生物であり、通常の中性培地では生育しないか、あるいは生育が極めて不良であるため、表１及び表２の菌学的性質の検討に際しては０．５％Ｎａ２ＣＯ３添加のアルカリ性培地を用いた。
【００１５】
【表１】
本菌株ＴＯＴＯ−９３０５株は表１の結果より、形態学的に放線菌、ストレプトミセス属の特徴を有する。また、細胞壁にＬ−Ｌ−ジアミノピメリン酸を含有する等のことから、本菌株はストレプトミセス属に属する一菌種と分類される。
【００１７】
ＴＯＴＯ−９３０５株は、各種寒天培地上での気菌糸の色調から白色シリーズに属すること、胞子表面は平滑であること、胞子の連鎖はおおむね直状であること、メラニン色素は生成しないこと等の性質を有する。これらの性質と各種炭素源の同化性試験の結果をもとに、既知菌種の中から本菌株の類似種をバージェーズマニュアル第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８ｔｈ Ｅｄ．）に従って検索を行った。その結果、特に各種炭素源の同化性において本菌株と類似の既知菌種は見いだせないことから、本菌株はストレプトミセス属に属する新菌種である。
【００１８】
なお、本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号第１３６４０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）のもと寄託されている。
【００１９】
培養条件
上記菌株は好アルカリ性放線菌であるため、その培養はアルカリ領域で行う必要がある。培地をアルカリ性にするための方法としては格別である必要はなく、通常の培地中に例えば炭酸ナトリウムあるいは炭酸水素ナトリウムを添加するだけで良い。炭素源としてはグルコース、可溶性デンプン、セルロース等の単糖、多糖などを用いることができる。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機物をはじめ、尿素、ペプトン、乾燥酵母、酵母エキス、ダイズ粉、コーンスチープリカー、カゼイン、肉エキス、アミノ酸などが用いられる。これらの炭素源や窒素源の他に各種無機塩、例えばマグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などを必要に応じて添加しても良い。培地に加えるアルカリ源としては、０．５〜２．０％程度の炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩あるいは水酸化ナトリウム、アンモニアなどが使用でき、培地のｐＨは８．０〜１１．０程度が望ましい。
【００２０】
培養は、このような培地中で培養温度２０〜４０℃、好ましくは２７〜３８℃で２日〜５日間好気的に撹袢または振とうしながら行う。
【００２１】
本発明による新規なアルカリプロテアーゼは、上記のような培養条件のもとで、主として培養液中に分泌され、蓄積される。
【００２２】
酵素の採取
上記培養液から本発明による酵素を採取、精製するためには、既知の精製法を単独もしくは併用して利用することができる。本酵素は主として菌体外（培養液中）に分泌されるため、例えば濾過あるいは遠心分離で菌体を除去することにより容易に粗酵素液を得ることができる。この粗酵素は、さらに既知の精製法、例えば硫安などによる塩析；メタノール、エタノール、アセトンなどの有機溶媒による沈殿法；ケラチン等による吸着法；限外濾過；ゲル濾過クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；疎水クロマトグラフィー、その他の各種クロマトグラフィーを、単独もしくは併用して、精製することができる。
【００２３】
好ましい精製法を示せば以下の通りである。まず、培養濾液に８０％飽和硫安を添加して塩析を行い、得られた沈殿を緩衝液に溶解する。次いでＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（東ソー社製）、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（同社製）によるイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、ＳＤＳ電気泳動的に均一な精製酵素を得ることができる。
【００２４】
酵素の性質
本発明によるアルカリプロテアーゼの性質は以下に示される通りである。なお、以下において活性測定法とは次の方法をいうものとする。
【００２５】
（活性測定法）
カゼイン０．６％またはケラチン２％を含む５０ｍＭグリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．５）０．５ｍｌを０．１ｍｌの酵素溶液と混合し、３０℃、１０分間（ケラチンを基質とした場合は振とうしながら２０分間）反応させた後、２．５ｍｌのトリクロロ酢酸混合液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸、０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．３３Ｍ酢酸）を加えて３０℃で３０分間静置した後、アドバンテック社製濾紙Ｎｏ．５Ｃで濾過する。次いで、この濾液の０．５ｍｌを２．５ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液に加え、さらに３倍希釈したフェノール試薬を０．５ｍｌ添加撹袢後、さらに室温にて３０分間放置し、６６０ｎｍの吸光度を測定する。上記の測定条件下で１分間に１マイクログラムのチロシンに相当する吸光度を増加させる酵素量を、酵素活性１単位（１Ｕ）と定義する。
【００２６】
（１）作用および基質特異性
カゼイン、ゼラチン、グルテン、ヘモグロビン、インシュリンなどのタンパク質に作用し、そのペプチド結合をエンド的に加水分解することによりオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また、特に従来の酵素では分解の困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質をも強力に加水分解する。
【００２７】
（２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ
上記の活性測定法にもとづき、本酵素に及ぼすｐＨの影響を調べた。なお、緩衝液としてＫＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ１．０−１．５）、グリシンＮａＣｌ／ＨＣｌ（ｐＨ２．０−３．５）、酢酸（ｐＨ４．０−５．５）、リン酸（ｐＨ６．０−７．０）、トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５−８．５）、グリシンＮａＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ９．０−１１．５）、ＫＣｌ／ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０−１３．０）を使用した。第１図に活性の最大値を１００とした場合の各ｐＨにおける相対活性を示した。第１図により本酵素の最適ｐＨは３０℃において１１．０−１１．５であることが分かる。
【００２８】
同様に本酵素のｐＨ安定性について第２図に示した。本酵素を各ｐＨの緩衝液中に３０℃で２４時間保持した後、その残存活性を未処理の酵素活性を１００とした相対活性として示した。第２図から、本酵素は上記処理条件下においてｐＨ１．５−１２．０までの極めて広範囲のｐＨ域で安定であることが分かる。
【００２９】
（３）最適温度および安定温度
上記活性測定法に準じて、本酵素に及ぼす温度の影響を調べた。第３図に最大活性を１００とした場合の各温度における相対活性を示した。第３図から、本酵素の最適温度は７０〜７５℃であることが分かる。
【００３０】
また、本酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加し、４０〜８０℃の範囲の各条件下で１０分間保持した後、その残存活性を測定した。測定は５ｍＭの塩化カルシウムを添加した場合としない場合の二通りについて行った。その結果を第４図に示した。第４図により、カルシウム無添加の場合は５５℃まで、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定であることがわかる。この結果より、本酵素はカルシウムの添加により熱安定性が増加することが判明した。
【００３１】
（４）分子量
本酵素の分子量をＳＤＳ電気泳動法により測定したところ、分子量は約５６，０００であった。
【００３２】
（５）等電点
本酵素の等電点を等電点電気泳動法により測定したところ、等電点は約１０〜１０．５であった。
【００３３】
（６）比活性
本酵素の比活性を活性測定法に準じて測定した。なお、タンパク質濃度はバイオラッド社製のプロテインアッセイキットを使用して測定し、酵素は電気泳動的に均一な精製標品を使用した。その結果、本酵素の比活性は、カゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンに対しては５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）であり、本酵素は極めて強力な加水分解活性を有することが判明した。
【００３４】
（７）阻害
一般的な酵素阻害剤であるＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）、ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）について、これらが本酵素の活性に及ぼす影響を調べた。各阻害剤を所定濃度となるように５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、本酵素を添加後３０℃で３０分間処理を行った。次いで処理溶液より一定量を分取して活性測定法に準じて、その残存活性を測定した。残存活性は阻害剤無添加で同様に処理した対照を１００とした相対値で示した。この結果を表３に示した。
【００３５】
【表３】
表３の結果から、本酵素はＤＦＰおよびＰＭＳＦにより阻害され、その他の阻害剤による阻害を受けなかったことより、本アルカリプロテアーゼはセリンプロテアーゼであることがわかる。また、本酵素は界面活性剤であるＳＤＳに対しても若干の阻害をうけたものの、まだ十分な活性を保持しており洗剤用として有望である。
【００３７】
上記各特性を示す本酵素と、従来公知の細菌、放線菌由来のアルカリプロテアーゼとの比較を表４に示した。
【００３８】
【表４】
表４に示した諸性質の比較より、本酵素が極めて高い比活性を有する新規なアルカリプロテアーゼであることが分かる。
【００４０】
【発明の実施の態様】
次に本発明を以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１ 粗酵素粉末の調製
ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌ（３５℃、４日間振とう培養）を、可溶性デンプン１．５％、スキムミルク１．５％、Ｋ２ＨＣＯ４ ０．３％、酵母エキス０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％および、別殺菌して添加したＮａＨＣＯ３ １．０％を含有する培地（ｐＨ９．０）４５００ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに植菌し、３５℃で４日間、通気量１ｖ／ｖ／ｍｉｎ、回転数２００ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を除去した。得られた上清液を凍結乾燥して、４０Ｕ／ｍｇの粗酵素粉末９ｇを得た。
【００４２】
実施例２ 精製酵素の調製
実施例１と同様の培地４５００ｍｌを入れた小型ジャーファーメンターに、ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５株の前培養液５０ｍｌを植菌した。これを実施例１と同様に培養した後、遠心分離により培養上清３８００ｍｌを得た。この上清液のｐＨ１０．５におけるプロテアーゼ活性は９４．５Ｕ／ｍｇであった。
【００４３】
次いで、この上清液に硫安粉末を８０％飽和になるまで加え、１昼夜５℃で暗所に静置後８０００ｒｐｍで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、セルロースチューブを用いて同緩衝液に対し透析を行った。透析後、その透析内液を１ｍＭＣａＣｌ添加の１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて酵素を吸着させ、０〜０．５Ｍ のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させた。活性画分を透析後、１ｍＭＣａＣｌを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラムに通じて活性画分を通過させ、不純タンパク質を吸着させた。上記一連の精製により、１９２０Ｕ／ｍｌのアルカリプロテアーゼを３４ｍｌ得た。本画分はＳＤＳ電気泳動的にもゲル濾過的にもそれぞれ単一バンドおよび単一ピークを示し、酵素タンパク質として均一であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適ｐＨを示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定ｐＨを示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によるアルカリプロテアーゼの最適温度を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によるアルカリプロテアーゼの安定温度を示すグラフである。
Claims (10)
- 下記の理化学的性質を有するアルカリプロテアーゼ
（ａ）作用および基質特異性：各種タンパク質およびペプチドに特異的に作用し、そのペプチド結合をエンド型の機作により切断して、低分子量のオリゴペプチドおよびアミノ酸を生成する。また特に従来のプロテアーゼでは分解が困難であったケラチンなどの不溶性タンパク質についても高い活性を示す。
（ｂ）最適ｐＨ：最適ｐＨはカゼインを基質とした場合、１１．０〜１１．５である。
（ｃ）安定ｐＨ：３０℃、２４時間の処理条件において、ｐＨ１．５〜１２．０で安定である。
（ｄ）最適温度：最適作用温度は７０〜７５℃である。
（ｅ）安定温度：ｐＨ７．０、１０分間の処理条件において、カルシウム無添加の場合は５５℃、カルシウムを添加した場合は６０℃まで安定である。
（ｆ）分子量：約５６，０００（ＳＤＳ電気泳動法）である。
（ｇ）等電点：約１０〜１０．５（等電点電気泳動法）である。
（ｈ）比活性：カゼインを基質とした場合は２１４，０００（Ｕ／ｍｇタンパク）、ケラチンを基質とした場合は５２，７００（Ｕ／ｍｇタンパク）である。
（ｉ）阻害：ＰＣＭＢ（パラクロロマーキュリーベンゾエイト）、ヨード酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）では活性は阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェート）、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）では阻害される。 - 好アルカリ性放線菌ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属菌から得られる、請求項１記載のプロテアーゼ。
- ストレプトミセス エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＴＯＴＯ−９３０５（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）株から得られる、請求項１記載のプロテアーゼ。
- 好アルカリ性ストレプトミセス属に属し、請求項１記載のアルカリプロテアーゼ産生能を有する微生物を培養する工程と、該工程で得られた培養物より該アルカリプロテアーゼを分離する工程とを含んでなる、アルカリプロテアーゼの製造法。
- 前記微生物の培養がｐＨ８．０〜１３．０のアルカリ性で行なわれる、請求項４記載の製造法。
- 前記微生物がストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）株である請求項４記載のプロテアーゼ製造法。
- 請求項１記載のアルカリプロテアーゼ産生能を有する、ストレプトミセス エスピー ＴＯＴＯ−９３０５（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６４０）株。
- 前記請求項第１項乃至第３項のプロテアーゼ、または請求項第４項乃至第６項の製造法により製造されたプロテアーゼを利用することを特徴とするタンパク質分解剤。
- 前記請求項第１項乃至第３項のプロテアーゼ、または請求項第４項ないし第６項の製造法により製造されたプロテアーゼを利用することを特徴とする衣料用洗剤。
- 前記請求項第１項乃至第３項のプロテアーゼ、または請求項第４項ないし第６項の製造法により製造されたプロテアーゼを利用することを特徴とする閉塞除去剤。
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