JP4171071B2 - α４β７インテグリンと反応するヒト化免疫グロブリン - Google Patents

Description

発明の背景
インテグリンレセプターは、リンパ球の再循環とリンパ球の炎症部位への補給の両方の制御に重要である（カルロス（Carlos,T.M.）とハーラン（Harlan,J.M.）、Blood,84:2068-2101（1994））。ヒトα４β７インテグリンは、いくつかのリガンドを有し、そのうちの１つは、腸間膜リンパ節やパイエル斑の高内皮性小静脈で発現している（ストリーター（Streeter,P.R.）ら、Nature 331:41-46（1988））粘膜血管アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１である（ベルリン（Berlin,C.）ら、Cell 74:185-195（1993）;アール（Erle,D.J.）ら、J.Immunol.153:517-528（1994））。このように、α４β７インテグリンは、腸の粘膜リンパ組織へのリンパ球の移動を仲介するホーミングレセプターとして作用する（シュバイクホッファー（Schweighoffer,T.）ら、J.Immunol.151:717-729（1993））。さらに、α４β７インテグリンは、フィブロネクチンおよび血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）と相互作用する。
例えば、潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管の炎症を伴う衰弱性及び進行性の疾患でありうる。米国だけでも推定２００万人の人々を冒している症状には、腹痛、痙攣、下痢および直腸出血などがある。ＩＢＤ治療には、抗炎症剤（コルチコステロイドおよびスルファサラジンなど）、免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、シクロスポリンおよびアザチオプリンなど）および外科手術（結腸切除など）などが用いられている。ポドルスキー（Podolsky）、New Engl.J.Med.,325:928-937（1991）およびポドルスキー（Podolsky）、New Engl.J.Med.,325:1008-1016（1991）。
ネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ Ａｃｔ−１）のようなヒトα４β７インテグリンに対する抗体は、粘膜リンパ節の高内皮性小静脈に存在する粘膜アドレシン細胞接着分子−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）へのα４β７インテグリン結合を妨害する。Ａｃｔ−１は、ラザロビッツ（Lazarovits,A.I.）ら、J.Immunol.133:1857-1862（1984）により、ヒト破傷風毒素特異的Ｔリンパ球で免疫したマウスから最初に単離され、マウスＩｇＧ１／κ抗体であると報告された。シュバイクホッファー（Schweighoffer,T.）ら、J.Immunol.151:717-729（1993）による該抗体のさらに最近の分析により、該抗体はα４β７インテグリンを選択的に発現するヒトＣＤ４＋記憶Ｔリンパ球のある種のサブセットに結合できることが示唆された。しかしながら、ヒトにおける治療上の適用にネズミ抗体を使用することに関する重大な問題は、それらはヒトにおいて高い免疫原性があり、患者におけるマウス抗体の効力を低下させ、持続投与を妨げうるヒト抗ネズミ抗体応答（ＨＡＭＡ）を迅速に誘導することである。ＨＡＭＡ応答は、マウス抗体の迅速なクリアランスを生じ、いかなる治療の恩恵をも厳密に制限してしまう。
したがって、炎症性腸疾患に対する改良された治療アプローチに関する要求がある。
発明の要約
本発明は、免疫グロブリンが非ヒト起源（例えば、齧歯類）の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、ヒト枠組み領域、ガンマ型のヒト定常領域）を含有する、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、本明細書に記載されるヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンへの結合に関して、ネズミＡｃｔ−１またはＬＤＰ−０２（実施例４等を参照のこと）と競合することができる。好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、Ａｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する（例えば、ＬＤＰ−０２、図１１（配列番号：１９）および図１２（配列番号：２１）それぞれに示された軽鎖および重鎖の可変領域を含有する免疫グロブリン）。
例えば、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒト起源の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト枠組み領域に由来する枠組み領域（ＦＲ）を含む抗原結合領域を含有することができる。１つの側面において、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンは、α４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲおよびヒト起源（例えば、ＧＭ６０７’ＣＬ）の軽鎖に由来するＦＲを含む軽鎖、ならびにα４β７を結合する非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲおよびヒト起源（例えば、２１／２８’ＣＬ）の重鎖に由来するＦＲを含む重鎖を含有する。別の側面において、軽鎖は、Ａｃｔ−１抗体の軽鎖に由来する３つのＣＤＲを含有し、重鎖は、Ａｃｔ−１抗体の重鎖に由来する３つのＣＤＲを含有する。
また、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖（例えば、Ａｃｔ−１抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにヒト軽鎖ＦＲを含有する）、ならびにヒト化免疫グロブリン重鎖（例えば、Ａｃｔ−１抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにヒト重鎖ＦＲを含有する）に関する。好ましい態様において、本発明は、本明細書に記載されたヒト化重鎖および軽鎖（例えば、図７（配列番号：１２）に示された軽鎖の可変領域を含有するヒト化軽鎖、図９（配列番号：１５）に示された重鎖の可変領域を含有するヒト化重鎖、図１２（配列番号：２１）に示された軽鎖の可変領域を含有するヒト化軽鎖、図１１（配列番号：１９）に示された重鎖の可変領域を含有するヒト化重鎖）に関する。また、１以上のヒト化軽鎖および／または重鎖を含有するヒト化免疫グロブリンも含まれる。
さらに、本発明は、本発明のヒト化免疫グロブリン（例えば、単鎖抗体）をコードする配列を含有する単離された核酸、ならびに本発明のヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする配列（例えば、配列番号：２０）または重鎖をコードする配列（例えば、配列番号：１８）を含有する単離された核酸に関する。例えば、本発明は、ネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する抗原結合領域をコードする第１の核酸配列と、ヒト起源の免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部をコードする第２の核酸配列とを含有する、ヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードする融合遺伝子を提供する。
さらに、本発明は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはかかる免疫グロブリンの鎖をコードする核酸を含有する構築物に関する。例えば、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を含有する発現ベクターが提供される。かかる構築物の別の例は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト化抗体の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含むヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする融合遺伝子を含有する発現ベクターである。
また、本発明は、本発明の核酸を含有する構築物の１以上を含む、本発明の核酸を含有する宿主細胞に関する。１つの態様において、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする第１の組換え核酸およびヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする第２の組換え核酸を含有し、前記第１の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体の軽鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含み；前記第２の核酸はネズミＡｃｔ−１抗体の重鎖に由来するＣＤＲおよびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含む、宿主細胞に関する。
また、本発明は、本発明の宿主細胞をヒト化免疫グロブリンの発現に適した条件下で維持し、それにより１または複数のヒト化免疫グロブリン鎖を発現させ、ヒト化免疫グロブリンを産生する工程を含むヒト化免疫グロブリンの調製方法を提供する。該方法は、ヒト化免疫グロブリンの単離工程をさらに含むことが可能である。
本発明のヒト化免疫グロブリンは、それらのネズミまたは他の非ヒトカウンターパートよりも免疫原性が弱くなりうる。したがって、本明細書に記載されたヒト化免疫グロブリンは、例えば、粘膜リンパ組織へのリンパ球ホーミングを制御し、それによって腸での炎症応答を低減するために、ヒトにおける治療剤として使用することができる。
さらに、本発明は、診断または（予防を含む）治療における使用のための本発明のヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、本発明は、胃腸管（腸に関連する内皮を含む）、他の粘膜組織またはＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織の白血球浸潤に関連する疾患を含む炎症性疾患の治療等における、組織の白血球浸潤に関連する疾患の治療での使用のための本発明のヒト化免疫グロブリンに関する。特に好ましい態様において、本発明は、潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療における使用のための本発明のヒト化免疫グロブリンに関する。
別の側面において、本発明は、胃腸管、他の粘膜組織またはＭＡｄＣＡＭ−１分子を発現する組織の白血球浸潤に関連する疾患を含む炎症性疾患の治療等における組織の白血球浸潤に関連する疾患の治療用の医薬の製造のための本発明のヒト化免疫グロブリンの使用に関する。特に好ましい態様において、本発明は、潰瘍性結腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療用の医薬の製造のための本発明のヒト化免疫グロブリンの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、いくつかの独立したマウス重鎖可変領域クローンから決定した可変領域を含有するコンセンサスＤＮＡ配列（配列番号：１）および予想されるアミノ酸配列（配列番号：２）の図である。
図２は、Ｈ２Ｂ＃３４と称する独立したマウス重鎖可変領域クローンから決定した可変領域配列の一部を含有するヌクレオチド配列（配列番号：３）および予想されるアミノ酸配列（配列番号：４）の図である。
図３は、いくつかの独立したマウス軽鎖可変領域クローンの可変領域を含有するヌクレオチド配列（配列番号：５）および予想されるアミノ酸配列（配列番号：６）の図である。クローニング用のＫａｓＩ部位を導入するために作製した２つの変異の位置が示される。
図４Ａは、ネズミＡｃｔ−１ ｍＡｂおよびマウスアイソタイプ適合無関係対照抗体（ＭＯＰＣ ２１；ＩｇＧ１、カッパ）の、α４β７インテグリンを発現するＨｕＴ７８細胞を染色する能力を示す蛍光プロットである。
図４Ｂは、（ｉ）キメラＡｃｔ−１抗体、（ii）ヒトアイソタイプ適合無関係対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）および（iii）ＣＯＳ−７細胞上清の、α４β７インテグリンを発現するＨｕＴ７８細胞を染色する能力を示す蛍光プロットである。
図５は、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域（「Ａｃｔ−１．ｖｌ」）のアミノ酸配列（配列番号：７）およびヒトＧＭ ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：８）のアラインメントである。同一のアミノ酸を垂直線で示し、類似のアミノ酸を類似性の程度により４個または２個の点で示す。ＣＤＲを括弧で標示し、残基に連続番号を付す。
図６は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域（「Ａｃｔ−１．ｖｈ」）のアミノ酸配列（配列番号：９）およびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１０）のアラインメントである。同一のアミノ酸を垂直線で示し、類似のアミノ酸を類似性の程度により４個または２個の点で示す。ＣＤＲを括弧で標示し、残基に連続番号を付す。
図７は、マウスＡｃｔ−１軽鎖シグナルペプチド配列に結合したマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１１）および予想されるアミノ酸配列（配列番号：１２）の図である。
図８は、成熟ヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体カッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：１３）およびアミノ酸配列（配列番号：８）の図である。
図９は、マウスＡｃｔ−１抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の図である。可変領域のヌクレオチド配列を、予想されるマウスＡｃｔ−１重鎖シグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に結合させ、混成配列（配列番号：１４および１５）を得る。（重鎖領域を増幅させるプライマーの同一性は、縮重配列から予想され、シグナルペプチドに対するアミノ酸配列は、プライマー、下流の配列および他のシグナルペプチドの配列に由来した。示されたシグナルペプチドは、Ａｃｔ−１ハイブリドーマのものとは同一ではない。）
図１０は、ヒト２１／２８’ＣＬ抗体重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の図である。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、ヒト抗体ＨＧ３’ＣＬ（レシャビ（Rechavi,G.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 80:855-859（1983））のＶ_Hに由来するシグナルペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に結合させ、混成配列（配列番号：１６および１７）を得る。
図１１は、重鎖シグナルペプチドを有するヒト化Ａｃｔ−１抗体（ＬＤＰ−０２）の重鎖の一部のヌクレオチド配列（配列番号：１８）およびアミノ酸配列（配列番号：１９）の図である。
図１２は、軽鎖シグナルペプチドを有するヒト化Ａｃｔ−１抗体（ＬＤＰ−０２）の軽鎖の一部のヌクレオチド配列（配列番号：２０）およびアミノ酸配列（配列番号：２１）の図である。
図１３は、ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（ＬＤＰ−０２）の軽鎖を作製するために使用したＬ１〜Ｌ６と称する重複相補的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号：２２〜２７）、およびヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの重鎖を作製するために使用したＨ１〜Ｈ１０と称する重複相補的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列番号：２８〜３７）の図である。
図１４は、マウス−ヒトＡｃｔ−１キメラ免疫グロブリン、ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンまたは無関係なヒトアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）を用いるＨｕＴ７８細胞の染色を示す蛍光プロットである。
図１５は、ＨｕＴ−７８細胞におけるフローサイトメトリーにより行なったビオチニル化ネズミＡｃｔ−１およびヒト化Ａｃｔ−１（ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃１、実施例４）の滴定の結果を示すグラフである。
図１６は、対照ネズミＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１と比較した、ネズミＡｃｔ−１またはヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃１、実施例４）によるビオチニル化ネズミＡｃｔ−１の結合の競合阻害を示すグラフである。
図１７は、（ａ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ、（ｂ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇ、（ｃ）ヒトＩｇＧ１、（ｄ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃１（実施例４）、または（ｅ）ＬＤＰ−０１（ヒト化抗ＣＤ１８、Ｆｃ変異）の、５０、２５、５、２．５および０．５μｇ／ｍｌの濃度での存在下で、ヒト末梢血単核細胞の補体介在細胞溶解に関する⁵¹クロム放出アッセイの結果を示すグラフである。
図１８Ａ〜１８Ｂは、α４β７産生細胞（ＲＰＭＩ８８６６）のネズミＡｃｔ−１（図１８Ａ）、ネズミＩｇＧ１（図１８Ａ）、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１（図１８Ｂ）またはヒトＩｇＧ１（図１８Ｂ）およびヒトＭＡｄＣＡＭ−１−Ｉｇキメラ（免疫接着）による接着阻害をモニターする接着アッセイの結果を示すグラフである。
図１９は、（ａ）ＬＤＰ−０２（Ｆｃ変異した）、（ｂ）軽鎖に１つの変異（ＭＶ４）と重鎖に二重変異（Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ）を有するＬＤＰ−０２（Ｆｃ変異した）の誘導体、または（ｃ）無関係なヒトアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）を用いるＨｕＴ７８細胞の染色を比較したグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、非ヒト起源の抗原結合領域およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部を含有する、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンに関する。ヒト化免疫グロブリンは、少なくとも約１０⁷Ｍ^-1のアフィニティーでα４β７インテグリンを結合しうることが好ましく、好ましくは少なくとも約１０⁸Ｍ^-1、さらに好ましくは少なくとも約１０⁹Ｍ^-1である。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンを結合する非ヒト起源の抗原結合領域およびヒト定常領域に由来する定常領域を含む。別の態様において、α４β７インテグリンを結合するヒト化免疫グロブリンは、非ヒト起源の相補性決定領域およびヒト起源の可変枠組み領域、ならびに任意にヒト起源の定常領域を含有する。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、軽鎖がα４β７インテグリンを結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域およびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域を含み、重鎖がα４β７インテグリンを結合する非ヒト起源の抗体に由来する相補性決定領域およびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域を含む、重鎖ならびに軽鎖を含有しうる。
また、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはヒト化免疫グロブリン重鎖に関する。１つの態様において、本発明は、非ヒト起源の軽鎖ＣＤＲ（即ち、１以上のＣＤＲ）およびヒト軽鎖枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリン軽鎖に関する。別の態様において、本発明は、非ヒト起源の重鎖ＣＤＲ（即ち、１以上のＣＤＲ）およびヒト重鎖枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリン重鎖に関する。ＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリンに由来することができる。
天然の免疫グロブリンは、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）と２つの同一の重鎖（約５５または７０ｋＤ）が四量体を形成する共通のコア構造を有する。各鎖のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として知られ、各鎖の残りの部分のより保存された定常（Ｃ）領域から区別されうる。Ｊ領域として知られるＣ末端部分は、軽鎖の可変領域内にある。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加え、Ｄ領域が存在する。免疫グロブリンにおけるアミノ酸配列の変化の大部分は、抗原結合に直接関与する超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域中の３つの分離した位置に限られる。アミノ末端から進んで、これらの領域は、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。ＣＤＲは、より保存された枠組み領域（ＦＲ）により適切に保持される。アミノ末端から進んで、これらの領域は、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と称される。ＣＤＲおよびＦＲ領域の位置とナンバリングシステムは、カバット（Kabat）らにより定義されている（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）；表３および４も参照のこと）。
ヒト免疫グロブリンは、重鎖のアイソタイプによりクラスおよびサブクラスに分けることができる。クラスは、重鎖がそれぞれ、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）型のものであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む。サブクラスは、重鎖がそれぞれ、γ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２型のものであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む。選択されたクラスまたはサブクラスのヒト免疫グロブリン分子は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかを含んでもよい。例えば、Cellular and Molecular Immunology、ウォンジーヴィクス（Wonsiewicz,M.J.）編、45章、41-50頁、W.B.Saunders Co、フィラデルフィア、PA（1991）;ニソノフ（Nisonoff,A.）、Introduction to Molecular Immunology、第２版、４章、45-65頁、Sinauer Associates,Inc.、サンダーランド、MA（1984）を参照のこと。
本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、抗体全体およびその生物学的に機能しうる断片を含むものである。かかる生物学的に機能しうる断片は、対応する全長の抗体の少なくとも１つの抗原結合機能（例えば、Ａｃｔ−１抗体のα４β７に対する特異性）を保持し、好ましくはα４β７とその１以上のリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１、フィブロネクチン）との相互作用を阻害する能力を保持する。特に好ましい態様において、生物学的に機能しうる断片は、α４β７の粘膜アドレシン（ＭＡｄＣＡＭ−１）への結合を阻害することができる。使用されうる生物学的に機能しうる抗体断片の例は、単鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂断片等のα４β７インテグリンに結合可能な断片を含む。かかる断片は、酵素的切断または組換え技術により生成することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断を用い、それぞれ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂断片を作製することができる。また、１以上の停止コドンを天然の停止部位の上流に導入した抗体遺伝子を用いて、種々の切断型の抗体も生成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片の重鎖をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ₁ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
本明細書で用いる「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、少なくとも一部分がヒト起源のものである、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含有する免疫グロブリンをいう。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を有するマウス等の非ヒト起源の免疫グロブリンおよびヒト起源の免疫グロブリン配列に由来し（例えば、キメラ免疫グロブリン）、通常の技術により化学的に共に連結されるか遺伝子工学技術を用いて連続的なポリペプチドとして調製された（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて連続的なポリペプチド鎖を生成することができる）部分を含有することができる。本発明のヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲとヒト起源の軽鎖および／または重鎖に由来する枠組み領域とを含有する免疫グロブリン（例えば、枠組み変化を有するまたは有さないＣＤＲを接ぎ合わせた抗体）である。また、キメラまたはＣＤＲを接ぎ合わせた単鎖抗体は、ヒト化免疫グロブリンという用語に含まれるものである。例えば、キャビリー（Cabilly）ら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；キャビリーら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号明細書；ボス（Boss）ら、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；ボスら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号明細書；ニューバーガー（Neuberger,M.S.）ら、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；ニューバーガーら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号明細書；ウインター（Winter）、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ウインター、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号明細書；パドラン（Padlan,E.A.）ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号明細書を参照のこと。また、単鎖抗体に関しては、ラドナー（Ladner）ら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書；ハストン（Huston）ら、米国特許第５，４７６，７８６号明細書；およびバード（Bird,R.E.）ら、Science,242:423-426（1988））を参照のこと。
ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域（非ヒト部分）は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリンと称する）に由来することができる。例えば、適する抗原結合領域は、ネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来することができる（ラザロビッツ（Lazarovits,A.I.）ら、J.Immunol.,133（4）:1857-1862（1984））;例えば、実施例１〜３を参照のこと）。他の供給源は、齧歯類（マウス、ラット等）、ウサギ、ブタ、ヤギまたは非ヒト霊長類（サル等）のような非ヒト供給源から得られたα４β７インテグリン特異的抗体を含む。Ａｃｔ−１抗体と同一または類似のエピトープに結合する抗体のような他のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製することができる（例えば、コーラーら、Nature,256:495-497（1975）;ハーローら、1988、Antibodies:A Laboratory Manual,（Cold Spring Harbor,NY）;およびCurrent Protocols in Molecular Biology，第２巻、（補遺27、94年夏）、アウスベルら編、（John Wiley & Sons:New York,NY）、第11章（1991））。
例えば、抗体は、適切な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒツジ）において適した免疫原に対して惹起することができる。α４β７を産生する細胞、α４β７を含む膜画分、α４β７の免疫原断片、適当な担体に結合させたβ７ペプチドが適当な免疫原の例である。抗体産生細胞（例えば、リンパ球）は、例えば、免疫した動物のリンパ節または脾臓から単離することができる。次いで、該細胞を適当な不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞株）に融合し、それによりハイブリドーマを生成することができる。融合細胞は、選択培養技術を用いて単離することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適当なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択することができる。また、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリンは、抗体ライブラリー（例えば、非ヒトＦａｂ分子を含有するファージライブラリー）から得ることもできる。
１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、非ヒト化起源のＣＤＲを含有する。この態様において、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンは、少なくとも１つの非ヒト起源のＣＤＲを含有する。例えば、ＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンが非ヒト起源の１以上の免疫グロブリン由来の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３；および／または軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を実質的に含み、生じたヒト化免疫グロブリンがα４β７インテグリンに結合特異性を有するように、非ヒト起源の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域から派生させることができる。好ましくは、選択された鎖の３つのＣＤＲすべてがドナーの対応する鎖のＣＤＲと実質的に同じであり、さらに好ましくは、軽鎖および重鎖の３つのＣＤＲすべてが対応するドナー鎖のＣＤＲと実質的に同じである。
ヒト化免疫グロブリンまたはヒト起源の免疫グロブリン鎖の部分（ヒトの部分）は、いかなる適当なヒト免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖に由来することができる。もし存在するならば、例えば、ヒト定常領域またはその一部は、アレル変異体を含むヒト抗体のκもしくはλ軽鎖、および／またはγ（例えば、γ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えば、α１、α２）、δもしくはε重鎖に由来することができる。特定の定常領域（例えば、ＩｇＧ１）、変異体またはその一部は、エフェクター機能を調整するために選択することができる。例えば、変異した定常領域（変異体）は、Ｆｃレセプターへの結合および／または補体を固定する能力を最小にするために融合タンパク質に取り込まれうる（例えば、実施例３を参照のこと；ウインター（Winter）ら、英国特許第２，２０９，７５７ Ｂ号明細書；モリソン（Morrison）ら、国際公開第８９／０７１４２号パンフレット；モーガン（Morgan）ら、国際公開第９４／２９３５１号パンフレット、１９９４年１２月２２日も参照のこと）。
もし存在するならば、ヒト枠組み領域（例えば、軽鎖可変領域のもの）は、抗原結合領域ドナーの類似体または均等の領域（例えば、軽鎖可変領域）に配列類似性を有するヒト抗体可変領域に由来することが好ましい。ヒト化免疫グロブリンのヒト起源の部分に関する枠組み領域の他の供給源は、ヒト可変コンセンサス配列を含む（例えば、実施例２を参照のこと；ケトルボロー（Kettleborough,C.A.）ら、Protein Engineering 4:773-783（1991）;カーター（Carter）ら、国際公開第９４／０４６７９号パンフレット、１９９４年３月３日発行も参照のこと））。例えば、非ヒト部分を得るために用いた抗体または可変領域の配列は、カバットら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）に記載のヒト配列と比較することができる。特に好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリン鎖の枠組み領域は、非ヒトドナー（例えば、マウスＡｃｔ−１抗体）の可変領域と少なくとも全体の約６５％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも全体の約７０％の配列同一性を有するヒト可変領域に由来する。また、ヒト部分は、非ヒトドナーの均等な部分（例えば、ＦＲ）と比較したとき、用いた特定の部分（例えば、ＦＲ）内で、少なくとも約６５％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒト抗体に由来することもできる。例えば、実施例２に記載されるように、マウスＡｃｔ−１およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域間の全体の配列同一性は、７１．４％であり、マウスＡｃｔ−１およびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域間の全体の配列同一性は、６８．１％であった。
１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト起源の抗体の１以上の鎖に由来する少なくとも１つの枠組み領域（ＦＲ）を含有する。したがって、ＦＲは、ヒト起源の１以上の抗体に由来するＦＲ１および／またはＦＲ２および／またはＦＲ３および／またはＦＲ４を含むことができる。好ましくは、選択されたヒト化鎖のヒト部分は、ヒト起源の可変領域に由来（例えば、ヒト免疫グロブリン鎖由来、ヒトコンセンサス配列由来）するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。
本発明に用いられる非ヒト起源およびヒト起源の免疫グロブリン部分は、それらが由来する免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン部分またはそれらの変異体と同一の配列を有する。かかる変異体は、１以上の残基の付加、欠失または置換により異なる突然変異体を含む。前に示したように、非ヒト起源のＣＤＲは、非ヒトドナーにおいて実質的に同じであり、好ましくは非ヒトドナーのＣＤＲと同一である。実施例２に記載されるように、ヒト起源の枠組み領域の残基をドナーの対応する部分由来の残基と置換するもの等の枠組み領域における変化をなすことができる。１以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含む枠組み領域における１以上の突然変異をなすことができる。いくつかのかかる置換は、実施例２においてヒト化Ａｃｔ−１抗体の設計に記載されている。選択されたヒト化抗体または鎖に関して、枠組み突然変異を本明細書に記載のように設計することができる。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒトドナーのものと類似かまたはよりよいアフィニティーで、α４β７インテグリンを結合することができる。変異体は、非ヒトドナーまたはアクセプターのヒト鎖の突然変異導入を含む種々の適当な方法で生成することができる。
本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒトα４β７インテグリンに対する結合特異性を有し、ヘテロダイマーのα４および／またはβ７鎖の決定基を結合可能な（断片を含む）ヒト化免疫グロブリンを含む。好ましい態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、結合機能（例えば、α４β７インテグリンに対する特異性を有する、同一または類似のエピトープ特異性を有する）および／または阻害機能（例えば、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボでＭＡｄＣＡＭ−１に結合するα４β７インテグリンを阻害する能力、またはα４β７インテグリンを産生する細胞のそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１を産生する細胞）への結合を阻害する能力のようなイン・ビトロおよび／またはイン・ビボでα４β７依存性接着を阻害する能力）のようなネズミＡｃｔ−１抗体の少なくとも１つの機能特性を有する。したがって、好ましいヒト化免疫グロブリンは、ネズミＡｃｔ−１抗体の結合特異性、ネズミＡｃｔ−１抗体のエピトープ特異性（例えば、α４β７（例えば、α４β７インテグリン産生細胞上）への結合に関して、ネズミＡｃｔ−１、キメラＡｃｔ−１抗体（例えば、実施例１を参照のこと）またはヒト化Ａｃｔ−１（例えば、ＬＤＰ−０２）と競合できる）および／または阻害機能を有することができる。
α４β７インテグリンに結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの結合機能は、例えば、ヒト化免疫グロブリンとα４β７インテグリン（例えば、α４β７インテグリンを含有する膜画分、ヒトリンパ球（例えば、ＣＤ４＋α４^hi，β１^loサブセットのリンパ球）、ヒトリンパ球細胞株、またはα４β７インテグリンを発現するα４および／またはβ７をコードする核酸を含有する組換え宿主細胞）のようなα４β７インテグリンを産生する細胞上で）との間の複合体の形成をモニターするアッセイを用いる標準的な免疫学的方法により検出することができる。
また、結合および／または接着アッセイまたは他の適当な方法を、所望の特異性で、ヒト化免疫グロブリン（例えば、ライブラリー由来）の同定および／または単離のための手法（例えば、α４β７インテグリンを産生する細胞とそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭを発現する第２の細胞、ＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇキメラとの接着をモニターするアッセイ（実施例４等を参照のこと）、または他の適当な方法に用いることもできる。
本発明に用いられる非ヒトおよびヒト起源の免疫グロブリン部分は、軽鎖、重鎖ならびに軽鎖および重鎖の一部を含む。これらの免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンから（例えば、ある部分のドゥノボの合成により）得ることができるし、免疫グロブリンに由来することができ、または、免疫グロブリンまたは所望の性質（例えば、α４β７インテグリンを結合する、配列類似性）を有するその鎖をコードする核酸を生成して発現することができる。ヒトおよび非ヒト起源の所望の部分（例えば、抗原結合領域、ＣＤＲ、ＦＲ、Ｃ領域）を含有するヒト化免疫グロブリンは、所望のヒト化鎖をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調製するための合成および／または組換え核酸を用いて生成することができる。鎖の一部を調製するためには、１以上の停止コドンを所望の位置に導入することができる。例えば、新規に設計したヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、存在するＤＮＡ配列を変化させるためのＰＣＲ突然変異導入方法を用いて構築することができる（例えば、カマン（Kamman,M.）ら、Nucl.Acids Res.17:5404（1989）を参照のこと）。新規ＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーは、同一または非常に類似したヒト可変領域に基づいて前もってヒト化した可変領域のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることができる（サトー（Sato,K.）ら、Cancer Research 53:851-856（1993））。類似のＤＮＡ配列が鋳型として利用できないならば、可変領域配列をコードする配列を含有する核酸を合成オリゴヌクレオチドから構築することができる（例えば、コルビンガー（Kolbinger,F.）、Protein Engineering 8:971-980（1993））。また、シグナルペプチドをコードする配列を核酸に組み込む（例えば、合成で、ベクターへの挿入により）こともできる。天然のシグナルペプチド配列を利用できないならば、他の抗体由来のシグナルペプチド配列を用いることができる（例えば、ケトルボロー（Kettleborough,C.A.）ら、Protein Engineering 4:773-783（1991）を参照のこと）。これらの方法、本明細書に記載された方法または他の好適な方法を用いて、変異体を容易に生成することができる（例えば、実施例５を参照のこと）。１つの態様において、クローニングした可変領域（例えば、ＬＤＰ−０２のもの）は、突然変異を導入することができ、所望の特異性を有する変異体をコードする配列を（例えば、ファージライブラリーから；例えば、クレバー（Krobber）ら、米国特許第５，５１４，５４８号明細書；フーゲンブーム（Hoogenboom）ら、国際公開第９３／０６２１３号パンフレット、１９９３年４月１日公開）選択することができる。
核酸および該核酸を含有する構築物
また、本発明は、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖をコードする配列を含有する、単離されたおよび／または組換え（例えば、本質的に純粋を含む）核酸に関する。
本明細書における「単離された」核酸とは、その供給源のゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡの核酸（例えば、細胞中またはライブラリーのような核酸の混合物中に存在するもの）から分離された核酸であり、本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的方法と化学的方法との組合せにより生成された核酸ならびに単離された組換え核酸を含む、本明細書に記載された方法または他の好適な方法により得られた核酸を含む（例えば、ドウガティ（Daugherty,B.L.）ら、Nucleic Acids Res.,19（9）:2471-2476（1991）；ルイス（Lewis,A.P.）とクローエ（J.S.Crowe）、Gene,101:297-302（1991））。
本明細書における「組換え」と言及された核酸とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクターへのクローニングのような人工的な組換え方法に依存する手法により生成する核酸を含む、組換えＤＮＡ方法論により生成された核酸である。また、「組換え」核酸は、細胞の天然のメカニズムを通じて発生する組換え事象からも生じるものであるが、所望の組換え事象を起こさせ、おそらく起こすように設計した核酸の細胞への導入後選択されるものでもある。
また、本発明は、より具体的にはヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリン（即ち、非ヒト部分がネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体に由来する本発明のヒト化免疫グロブリン）またはその鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する単離されたおよび／または組換え核酸に関する。１つの態様において、軽鎖は、Ａｃｔ−１抗体の軽鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有し、重鎖は、Ａｃｔ−１抗体の重鎖に由来する３つの相補性決定領域を含有する。かかる核酸は、例えば、（ａ）ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、図１１の重鎖可変領域（配列番号：１９）、図９の重鎖可変領域（配列番号：１５））を含むポリペプチドをコードする配列を含有する核酸、（ｂ）ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、図１２の軽鎖可変領域（配列番号：２１）、図７の軽鎖可変領域（配列番号：１２））を含むポリペプチドをコードする配列を含有する核酸、（ｃ）ヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域の少なくとも機能性部分（例えば、前記鎖を含有するヒト化免疫グロブリンの抗原結合に充分な部分）をコードする配列を含有する核酸、を含む。遺伝コードの縮重性により、選択されたポリペプチドをコードする種々の核酸を作製することができる。１つの態様において、核酸は、二本鎖または一本鎖のポリヌクレオチドを含む、前記もしくは実質的に前記図１１（配列番号：１８）、または前記もしくは実質的に前記図１２（配列番号：２０）の可変領域のヌクレオチド配列を含有する。（種々の図面が可変領域よりも大きいポリペプチド（即ち、シグナルペプチドコーディング配列または定常領域コーディング配列の一部を含む）を図示してもよいが、特定の図面の可変領域への参照は、示された配列の可変領域の部分を含むことを意味する。）これらの基準に適合する単離されたおよび／または組換え核酸は、前記したヒト化Ａｃｔ−１抗体またはその変異体の配列と同一の配列をコードする核酸を含有することができる。
本発明の核酸は、α４β７インテグリンに結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの生成に使用することができる。例えば、本発明のヒト化免疫グロブリンをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を、さらなる配列の操作または適当な宿主細胞におけるコード化ポリペプチドの生成のために、適当な構築物（例えば、ベクター）に組み込むことができる。
α４β７インテグリンに対する特異性を有するヒト化免疫グロブリンの製造方法
本発明の別の側面は、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの調製方法に関する。例えば、ヒト化免疫グロブリンは、例えば、適当な宿主細胞でのα４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンをコードする１以上の組換え核酸の発現により得ることができる。
また、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの発現に適する構築物または発現ベクターも提供される。構築物は、適当な宿主細胞に導入することができ、本発明のヒト化免疫グロブリンを発現する細胞を製造して培養で維持することができる。好適な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌（Ｂ．スブチリス）およびまたは他の適当な細菌等の細菌細胞を含む原核細胞、真核細胞、例えばカビ細胞や酵母細胞（例えば、ピチア パストリス、アスペルギルス スピーシーズ、サッカロミセス セレビジエ、シゾサッカロミセス ポンベ、ニューロスポラ クラッサ）または他の下等真核細胞、ならびに昆虫由来の細胞（例えば、Ｓｆ９昆虫細胞（国際公開第９４／２６０８７号パンフレット、オコンノー（O’Connor）、１９９４年１１月２４日公開）または哺乳動物由来の細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｕＴ７８細胞、２９３細胞）等の高等真核細胞を挙げることができる（例えば、アウスベル（Ausubel,F.M.）ら編、Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.,（1993）を参照のこと）。
α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンを産生する宿主細胞は、以下のように製造できる。例えば、所望のヒト化免疫グロブリンのコーディング配列の全部または一部をコードする核酸を、核酸ベクター、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レプリコン等のＤＮＡベクターに挿入することができる。種々のベクターを利用することができ、それらには単一コピーもしくは多コピーで維持されるベクターまたは宿主細胞染色体に組込まれるベクターが含まれる。
好適な発現ベクターはいくつかの成分を含有でき、限定されないが、下記の１以上：複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１以上の翻訳シグナル；膜標的化または分泌のシグナル配列またはリーダー配列が挙げられる。構築物中、シグナル配列を、該ベクターまたは他の供給源により提供することができる。例えば、免疫グロブリンの転写および／または翻訳シグナルを用いて発現を指示することができる。
プロモーターは、適当な宿主細胞での発現用に提供されうる。プロモーターは構成的であってもよいし、誘導性であってもよい。例えば、プロモーターがコードされているポリペプチドの発現を指示するように、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖をコードする核酸に操作可能に連結することができる。原核生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば、大腸菌にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主に適した種々のプロモーター（例えば、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ）を、利用できる。
さらに、発現ベクターは通例、該ベクターを保有する宿主細胞を選択するための選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合、起点または複製（ａｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を含有する。抗生物質耐性または薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、一般的な選択可能マーカーであり、原核細胞（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性用のＴｅｔ遺伝子）中および真核細胞（例えばネオマイシン（Ｇ４１８またはゼネティシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）中で、使用してもよい。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、メトトレキセートによる選択を、種々の宿主で可能にする。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）は、酵母における選択可能マーカーとしてしばしば使用される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクターおよび宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルスベクターなどのベクターの使用も予想される。また本発明は、これらの発現ベクターを保有する細胞にも関する。
例えば、α４β７インテグリンに対する結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸（即ち、１以上の核酸）またはかかる１もしくは複数の核酸を含有する構築物（即ち、１以上の構築物）は、１もしくは複数の核酸が１以上の発現制御エレメントに操作可能に（例えば、ベクター中で、細胞中でプロセッシングにより生成された構築物中で、宿主細胞ゲノムに組み込まれて）結合されるように、選択した宿主細胞に適した方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）で適当な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、発現に適した条件下で（例えば、誘導剤、適切な塩類、成長因子、抗生物質、栄養補給物等を補足した好適な培地の存在下で）維持され、それによりコードされている１もしくは複数のポリペプチドを生成することができる。所望ならば、コードされた蛋白質（例えば、ヒト化Ａｃｔ−１抗体）は、（例えば、宿主細胞、培地、ミルク）から単離できる。この過程は、トランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含する（例えば、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、ゲンファーム インターナショナル、１９９２年３月１９日公開を参照のこと）。
ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、融合蛋白質のＮ末端位置、Ｃ末端位置または中間で非免疫グロブリン部分（即ち、天然に見出されるような免疫グロブリンには存在しない部分）に結合している融合蛋白質を生成することができる。例えば、いくつかの態様は、免疫グロブリン配列をコードする核酸の適当な発現ベクター、例えば、ｐＥＴベクター（ｐＥＴ−１５ｂ、ノバ−ジェン等）、ファージベクター（ｐＣＡＮＴＡＢ ５ Ｅ、ファルマシア等）または他のベクター（ｐＲＩＴ２Ｔ プロテインＡ融合ベクター、ファルマシア等）への挿入により生成されうる。得られた構築物を、発現に適した宿主細胞に導入することができる。発現後、適当なアフィニティーマトリックスを利用して、細胞溶解液からいくつかの融合蛋白質を単離または精製できる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（アウスベル（Ausubel,F.M.）ら編、第２巻、補遺26、16.4.1-16.7.8（1991）を参照のこと）。
治療法と組成物
本発明は、（１）α４β７インテグリンをイン・ビトロおよび／またはイン・ビボで結合でき；および／または、（２）α４β７インテグリンの活性または機能、例えば、（ａ）結合機能（例えば、α４β７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ−１、フィブロネクチンおよび／またはＶＣＡＭ−１に結合する能力）および／または（ｂ）組織における白血球の補給および／または蓄積を含む白血球浸潤機能（例えば、腸粘膜組織へのリンパ球移動を阻害する能力）を調節することができるヒト化免疫グロブリンを提供する。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボで選択的にα４β７を結合し、α４β７媒介相互作用を阻害することが可能である。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンを結合し、α４β７インテグリンの１以上のそのリガンド（例えば、ＭＡｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、フィブロネクチン）への結合を阻害することができ、それにより（組織における白血球の補給および／または蓄積を含む）組織の白血球浸潤を好ましくは選択的に阻害する。かかるヒト化免疫グロブリンは、腸関連組織、リンパ節器官または白血球（特にＴ細胞またはＢ細胞のようなリンパ球）を含む粘膜組織で、α４β７インテグリンを産生する細胞の血管内皮細胞への細胞接着をイン・ビトロおよび／またはイン・ビボで阻害することができる。特に好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリン（例えば、Ａｃｔ−１）は、α４β７のＭＡｄＣＡＭ−１および／またはフィブロネクチンとの相互作用を阻害することができる。
本発明のヒト化免疫グロブリンは、研究、診断および治療法における適用を有する様々な過程で有用である。例えば、それらは、α４β７インテグリンまたはその変異体を（例えば、アフィニティー精製または他の好適な方法により）検出、単離および／または精製するため、ならびにα４β７インテグリン構造（例えば、コンフォメーション）および機能を研究するために用いることができる。
また、本発明のヒト化免疫グロブリンは、診断適用（例えば、イン・ビトロ、エクス・ビボ）または治療（予防を含む）適用におけるα４β７インテグリン機能の調節にも使用されうる。
例えば、本発明のヒト化免疫グロブリンは、試料（例えば、炎症滲出物、血液、血清、腸液、α４β７インテグリンを産生する細胞上などの組織または体液）中のα４β７インテグリンのレベルを検出および／または測定するために使用することができる。例えば、試料（例えば、組織および／または体液）は、個体から得ることが可能であり、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織学を含む酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の方法を含む適当な免疫学的方法を用いて、α４β７インテグリン発現を検出および／または測定することができる。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンのα４β７インテグリンへの特異的結合に適した条件下で、試料を本発明のヒト化免疫グロブリンと接触させる工程および形成された抗体−α４β７インテグリン複合体を検出する工程を含む、試料中の選択されたα４β７インテグリンの検出方法が提供される。当該方法の適用において、ヒト化免疫グロブリンは、正常組織と炎症組織（例えば、ヒト由来）とのα４β７インテグリン反応性および／または発現について（例えば、免疫組織学的に）分析し、ＩＢＤまたは他の状態とα４β７の発現増加（例えば、冒された組織において）との関連を検出するために用いることができる。本発明のヒト化免疫グロブリンは、正常組織と炎症組織とでα４β７インテグリンの存在の免疫学的評価方法を可能にし、それを通じて、疾患の存在、疾患の進行および／または抗α４β７インテグリン療法の炎症性疾患における効力を評価できる。
また、本発明のヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンの結合機能および／または白血球（例えば、リンパ球、単球）浸潤機能を調節するために用いられうる。例えば、α４β７インテグリンのリガンド（即ち、１以上のリガンド）への結合を阻害するヒト化免疫グロブリンは、組織、特にＭＡｄＣＡＭ分子を発現する組織の白血球（例えば、リンパ球、単球）浸潤（組織における白血球の補給および／または蓄積を含む）に関連した疾患の治療における方法に従って投与することができる。本発明のヒト化免疫グロブリン（即ち、１以上）の有効量を、かかる疾患を治療するために個体（例えば、ヒトまたは他の霊長類のような哺乳動物）に投与する。例えば、胃腸管（腸関連内皮を含む）、他の粘膜組織、またはＭＡｄＣＡＭ分子を発現する組織（例えば、小腸および大腸の固有層の細静脈のような腸関連組織；ならびに乳腺（例えば、泌乳性乳腺））の白血球浸潤に関連する疾患を含む炎症性疾患は、本発明の方法に従って治療することができる。同様に、ＭＡｄＣＡＭ分子を発現する細胞（例えば、内皮細胞）への白血球の結合の結果としての組織の白血球浸潤に関連した疾患を有する個体を、本発明の方法に従って治療することができる。
特に好ましい態様において、そのように治療できる疾患として、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎、腹腔疾患、非熱帯性スプルー、セロネガティブ関節症に関連する腸疾患、微細もしくはコラーゲン性大腸炎、好酸球性胃腸炎または直腸結腸切除術や回腸肛門吻合術後に起こる嚢炎が含まれる。
膵炎とインシュリン依存性真性糖尿病は、本発明の方法を用いて治療できるその他の病気である。ＭＡｄＣＡＭ−１は、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）マウスならびにＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＪＬマウスの外分泌膵臓のいくつかの血管によって発現されると報告されている。ＭＡｄＣＡＭ−１の発現は、ＮＯＤマウスの膵臓の炎症を起こした島の内皮上で誘導されると報告されており、ＭＡｄＣＡＭ−１は、インスリン炎の初期段階にＮＯＤ島内皮によって発現される主要アドレシンであった（ハンニネン（Hanninen,A.）ら，J.Clin.Invest.,92:2509-2515（1993））。さらに、島内にはα４β７を発現するリンパ球の蓄積が観察され、ＭＡｄＣＡＭ−１は、炎症を起こした島由来の血管へのα４β７を介したリンパ腫細胞の結合に関与していた（ハンニネンら，J.Clin.Invest.,92:2509-2515（1993））。
本発明の方法に従って治療できる粘膜組織関連炎症性疾患の例は、乳腺炎（乳腺）、胆嚢炎、胆管炎または胆管周辺炎（胆管と肝臓周辺の組織）、慢性気管支炎、慢性副鼻腔炎、喘息および（例えば、胃腸管における）対宿主性移植片病を含む。クローン病に見られるように、炎症はしばしば粘膜表面を超えて広がるので、間質性繊維症をもたらす肺の慢性炎症性疾患、例えば過敏性肺炎、コラーゲン病、類肉腫症および他の突発性疾患も治療できる。
ヒト化免疫グロブリンは、α４β７インテグリンのそのリガンドへの結合を阻害する有効量で投与される。治療の場合、有効量とは、所望の治療（予防を含む）効果を達成するに足る量（例えば、α４β７インテグリンが介在する結合および／またはシグナル伝達を軽減または妨げ、そうすることによって、白血球の接着および浸潤および／または関連する細胞応答を阻害するに足る量）になるだろう。ヒト化免疫グロブリンは、１回量または多数回量で投与することができる。用量は、当該技術分野で公知の方法によって決定でき、例えば患者の年齢、感受性、耐性および総合的健康状態などに依存することができる。抗体の好適な用量としては、１処置あたり約０．１〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。
本発明の方法に従って、ヒト化免疫グロブリンは、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて個体（例えばヒト）に投与できる。ヒト化免疫グロブリンは、その助剤投与の前、助剤投与と同時または助剤投与後に投与できる。１つの態様において、α４β７インテグリンのそのリガンドへの結合を阻害する１を越えるヒト化免疫グロブリンを投与する。別の態様において、内皮リガンドへの白血球の結合を阻害するモノクローナル抗体、例えば、抗ＭＡｄＣＡＭ−１、抗ＶＣＡＭ−１または抗ＩＣＡＭ−１抗体を、本発明のヒト化免疫グロブリンに追加して投与する。さらに別の態様において、追加の薬学的に活性な成分（例えば、スルファサラジン、他の非ステロイド系抗炎症性化合物またはステロイド系抗炎症性化合物のような抗炎症性化合物）を、本発明のヒト化免疫グロブリンと組み合わせて投与することができる。
様々な投与経路が可能であり、治療対象の疾患または状態に応じて、非経口（静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射など）、経口（食餌法など）、局所、吸入（気管支内吸入、鼻孔内吸入または経口吸入、鼻孔内滴剤など）または直腸投与などが挙げられるが、必ずしもこれらに限られるわけではない。非経口投与が好ましい投与法である。
処方は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例えば液剤、乳剤）。投与対象のヒト化免疫グロブリンを含有する適当な組成物を、生理学的に許容されうる賦形剤または担体中で調製することができる。液剤や乳剤の場合は、適当な担体には、例えば塩水や緩衝媒体を含む水溶液、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液が含まれる。非経口用の賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは不揮発性油が含まれうる。静脈内用の賦形剤には、種々の添加物、保存剤、または液体、栄養または電解物質補充剤が含まれうる（一般的には、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版、Mack Publishing Co.,PA,1985を参照のこと）。吸入法の場合は、化合物を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾールディスペンサー）に充填することができる。
実施例
以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１に記載されるように、ネズミＡｃｔ−１抗体を精製し、該抗体の配列分析を行なった。マウスＡｃｔ−１抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲクローニングし、シーケンスした。また、Ａｃｔ−１カッパ軽鎖可変領域（Ｖ_L）のアミノ酸配列は、蛋白質のシーケンスにより決定し、Ｖ_L遺伝子のＤＮＡ配列に由来したアミノ酸配列と正確に適合することがわかった。重鎖可変領域（Ｖ_H）のアミノ酸配列の大部分は、蛋白質のシーケンスにより決定され、この配列もＶ_H遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸と適合する。これらの結果により、ハイブリドーマ細胞株から正しいマウスＡｃｔ−１可変領域がクローニングされたことが示される。正しい配列がクローニングされたことを確認した機能的なキメラＡｃｔ−１抗体が生成された。特に、マウスＡｃｔ−１軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒトカッパ軽鎖およびヒトガンマ−１もしくはガンマ−４重鎖定常領域それぞれに結合させた。また、キメラ抗体を、ヒト化Ａｃｔ−１ ｍＡｂ（再形成Ａｃｔ−１ ｍＡｂ ＬＤＰ−０２）との比較分析に用いた。
α４β７インテグリンとよく結合するヒト化Ａｃｔ−１抗体を作製するために、再形成ヒト可変領域を設計した（実施例２）。設計過程において補助するために、マウスＡｃｔ−１可変領域の分子モデルを作った。ネズミＡｃｔ−１抗体の領域は、抗原への結合に直接関与し、相補性決定領域すなわちＣＤＲは、選択された可変領域内に接ぎ合わされた。ヒト可変領域の枠組み領域（ＦＲ）内の位置でのいくつかのアミノ酸変化がなされた。再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域は、元のヒト残基が対応するネズミ残基にそれぞれ変化している、選択されたヒト軽鎖可変領域のＦＲ中の１つのアミノ酸変化および選択されたヒト重鎖可変領域のＦＲ中の５つのアミノ酸変化を含んでいた。
実施例３に記載されるように、これらの再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域をコードするＤＮＡ配列を構築し、ヒト定常領域をコードするＤＮＡ配列に結合させ、得られた核酸を用いてヒト化Ａｃｔ−１免疫グロブリンを生成させた。ヒト化Ａｃｔ−１抗体を、哺乳動物細胞で発現させ（実施例３）、マウスＡｃｔ−１抗体と比較してヒトα４β７インテグリンへの結合を試験した（実施例４）。表５に示すように、ヒト化Ａｃｔ−１抗体は、ネズミＡｃｔ−１により認識されるエピトープに対する特異性を保持し、天然のネズミ抗体と比較して予期しない改良された結合アフィニティーを示した。
ヒト化Ａｃｔ−１抗体のいくつかの変異体は、設計過程で同定された（実施例２および５）。例えば、以下の位置の１以上での追加の変化がなされうる：軽鎖変異体Ｍ４Ｖ（４位でのＭｅｔ→Ｖａｌ変異）、重鎖変異体Ｒ３８Ｋ（３８位でのＡｒｇ→Ｌｙｓ変異）、重鎖変異体Ａ４０Ｒ（４０位でのＡｌａ→Ａｒｇ変異）。さらに、７３位をヒトスレオニン残基に復帰させる重鎖変異体Ｉ７３Ｔ（７３位でのＩｌｅ→Ｔｈｒ復帰突然変異）がヒト枠組み領域中のこの位置で見られた。一本鎖でのこれらの変化の１以上の導入または１を越える鎖でのこれらの変化の種々の組合せがなされうる。
実施例１ Ａｃｔ−１ Ｖ _H およびＶ _L 領域のクローニングならびにネズミ−ヒトＡｃｔ−１キメラ免疫グロブリンの構築と発現
Ａｃｔ−１ Ｖ_HおよびＶ_L領域のクローニング
ＲＮＡは、製造業者の示したプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Gibco/BRL）を用いて、Ａｃｔ−１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得た（ラザロビッツら、J.Immunol.133（4）:1857-1862（1984）;ラザロビッツとコルビン（R.B.Colvin）により供与された）。
転写された重鎖および軽鎖可変領域は、製造業者の示したプロトコールに従ってＩｇ−Ｐｒｉｍｅキット（Novagen）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。要約すると、１．５μｇの全ＲＮＡを、２．０μｌの５Ｘ ＭＭＬＶ緩衝液（５Ｘ＝２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．３、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、１．０μｌの１００ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、０．５μｌのオリゴｄＴ（１μｇ／μｌ）、０．２５μｌのアセチル化ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）、１．０μｌの適当なＩｇ−３’プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（２００ユニット／μｌ）および１０μｌの全容量まで添加したＲＮアーゼ不含有水を含む反応で、ｃＤＮＡに逆転写した。混合物を３７℃で５分間、４２℃で３０分間および９９℃で５分間インキュベートした。各Ｉｇ−３’プライマーを別々の反応に用いた。
可変領域は、製造業者のプロトコールに従って、逆転写した材料から増幅した。要約すると、８μｌの逆転写した材料を、４μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５μｌの１０Ｘ反応緩衝液（１０Ｘ＝１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨ８．８、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、２．５μｌのＩｇ−５’リーダープライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）（各Ｉｇ−５’プライマーを別々のＰＣＲ反応に用いた）、０．２５μｌ（１．２５ユニット）のＡｍｐｌｉＴａｑ^▲Ｒ▼ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）および５０μｌの全容量までの水と混合した。
５’プライマーＭｕＩｇＶ_H５’−Ａ、ＭｕＩｇＶ_H５’−Ｂ、ＭｕＩｇκＶ_L５’−ＡおよびＭｕＩｇκＶ_L５’−Ｂとの増幅に関して、サイクルパラメーターは、１分、９４℃；１分、５０℃；２分、７２℃の３５サイクル後７２℃で最後の６分の伸長であった。アニーリング温度を６０℃に上げたことを除いて、他のすべての５’プライマーについて同じ反応条件を用いた。
重鎖可変領域は、３’プライマーとしてＭｕＩｇＧＶ_H３’−２またはＭｕＩｇＭＶ_H３’−１のいずれか、および５’プライマーとしてＭｕＩｇＶ_H５’−ＢまたはＭｕＩｇＶ_H５’−Ｅのいずれかを用いて増幅が成功した。軽鎖可変領域は、３’プライマーとしてＭｕＩｇκＶ_L３’−１および５’プライマーとしてＭｕＩｇκＶ_L５’−Ｇを用いて増幅が成功した。
これらのプライマーの配列は、以下のようであった：

増幅した断片をアガロースゲルで精製し、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅキットとともに提供されたｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクター（Novagen）にライゲートし、ライゲーション混合物を用いて、製造業者のプロトコールに従って、該キットとともに提供されたＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞を形質転換した。
適当なサイズのインサートを含む白色コロニーを、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターのポリクローニングサイトのすぐ外側のインサートの反対側でアニールするＴ７プロモータープライマーおよびＵ−１９マープライマーを用いてシーケンスした。シーケンスは、製造業者の推奨したプロトコールに従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼキット（USB/Amersham Life Science）を用いてミニプレップＤＮＡで行なった。
いくつかの独立した重鎖可変領域クローン由来のコンセンサスＤＮＡ配列（配列番号：１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。縮重プライマーは、配列においてある縮重へ導いた。開始コドンは、ヌクレオチド１３〜１５によりコードされるＭｅｔであり、予想されるリーダーペプチダーゼ切断部位は、ヌクレオチド６７〜６９によりコードされるＳｅｒとヌクレオチド７０〜７２によりコードされるＧｌｎとの間（ヌクレオチド１３〜６９はリーダーペプチドをコードする）である。残基４３３〜４３５によりコードされるアラニンで始まるネズミ定常領域の部分を示す。
いくつかの独立した軽鎖可変領域クローンのＤＮＡ配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を図３に示す。重鎖可変領域とは異なり、増幅した配列は縮重していなく、おそらく、使用したプライマーがあまり縮重していなく、可変領域が単一のプライマー対のみから増幅されたためであろう。
キメラ重鎖遺伝子の構築
キメラマウス−ヒト重鎖遺伝子をコードする遺伝子を作製した。ヒト重鎖定常領域の供給源は、野生型ヒトガンマ１（γ１）定常領域を含むクローン（ヘルマン ウォルトマン（Herman Waldman）博士（オックスフォード大学）から得た）であり；構築物は、ｐＥＥ６発現ベクター（Celltech）中にヒト化抗ＣＤ１８重鎖遺伝子を含有する３８１８と称した。定常領域は、その教示がそのまま参照により本明細書に取り込まれる、シムズ（Sims,M.J.）ら、J.Immunol.,151（4）:2296-2308（1993）および１９９３年２月４日に公開された国際公開第９３／０２１９１号パンフレットに記載のようにｐＥＥ６．ｈＣＭＶにクローニングされたヒト化ＣＤ１８重鎖遺伝子の定常領域と一致する。ヒト化抗ＣＤ１８抗体の重鎖可変領域および定常領域（野生型ガンマ１）をコードする配列は、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩとの消化により発現ベクターから放出された。重鎖遺伝子を含む１．４２１ｂｐ断片を回収し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM（Stratagene）のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＲ−ＣＤ１８Ｈと称するプラスミドを得た。ＳｐｅＩ制限部位は、抗ＣＤ１８重鎖遺伝子の可変領域と定常領域との間のジャンクションに位置する。ｐＣＲ−ＣＤ１８ＨをＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩで消化して、重鎖可変領域を放出させた。この可変領域を、以下のように、縮重したマウスＡｃｔ−１可変領域と置換した。
新規な制限部位を取り込むために２つのプライマーを合成した。これらのプライマーは：

であった。太字の活字は、鋳型配列と異なるプライマー中のヌクレオチドを示す。図２に示したヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を有するＨ２Ｂ＃３４と称する独立したマウスＡｃｔ−１重鎖クローンを鋳型として、前記５’および３’プライマーとともに用いて、開始コドンの５’側ＨｉｎｄIII部位とＪ領域のちょうど３’側のＳｐｅＩ部位を同時に導入するマウス可変領域を増幅させた。ＰＣＲ断片をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMに直接サブクローニングしてプラスミドｐＣＲ−ｍＡＣＴ１ＨＶを生じさせ、正しい配列を確認した。次いで、ＨｉｎｄIIIとＳｐｅＩとの消化によりｐＣＲ−ｍＡＣＴ１ＨＶから断片を放出させて、抗ＣＤ１８可変領域の代わりにｐＣＲ−ＣＤ１８ＨのＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩ部位に挿入し、ｐＣＲ−ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉを得た。次いで、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩでｐＣＲ−ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉからキメラ重鎖（マウスＡｃｔ−１可変＋ヒトガンマ１定常）遺伝子を放出させ、ｈＣＭＶプロモーターを含有するｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂベクターに戻しクローニングし、ｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉと称する構築物を得た。
キメラ軽鎖遺伝子の構築
キメラマウス−ヒト軽鎖遺伝子は、重鎖に関するものと同様な様式で構築した。しかしながら、キメラ軽鎖の場合、新規な制限部位ＫａｓＩは、ＫＧ＃８７と称するマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域クローンの１つを鋳型として用いる可変領域断片のＰＣＲ増幅、およびヒト化抗ＣＤ１８カッパ軽鎖遺伝子を含む構築物（ヘルマン ウォルトマン博士（オックスフォード大学）から得た；ｐＥＥ１２発現ベクター中にヒト化抗ＣＤ１８軽鎖を含む３８１９と称する構築物）を鋳型として用いるカッパ軽鎖定常領域のＰＣＲ増幅により構築物内で工作した。定常領域は、シムズ（Sims,M.J.）ら、J.Immunol.,151（4）:2296-2308（1993）および１９９３年２月４日に公開された国際公開第９３／０２１９１号パンフレットに記載のようにｐＥＥ１２にクローニングされたヒト化ＣＤ１８軽鎖遺伝子の定常領域と一致する。
可変領域に対するプライマーは：

であった。太字の活字は、鋳型中のヌクレオチドとは異なるプライマー中のヌクレオチドを示す。ＫａｓＩ部位を創出させるためのコーディング領域内の２個のヌクレオチドの変化、図３の４２３位でＴ→Ｇおよび４２６位でＡ→Ｇはサイレントであり、アミノ酸配列は変化しなかった。
カッパ定常領域に対するプライマーは：

であった。
軽鎖可変領域および定常領域を、それぞれの鋳型とプライマーを用いて別々に増幅し、ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMに別々にサブクローニングして配列を確認した。次いで、各断片をＨｉｎｄIIIとＫａｓＩとの消化により該ベクターから放出させ、ゲルで精製して、ＨｉｎｄIII消化によりヒト化抗ＣＤ１８軽鎖遺伝子をすでに除去しておいた３８１９ ｐＥＥ１２発現ベクターのＨｉｎｄIII部位にトリプルライゲートした。得られた構築物をＰＥＥ１２ｍｈＡＣＴ１Ｌｃｈｉと称する。
キメラ免疫グロブリンの発現
キメラ重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現ベクターの構築のために、全重鎖遺伝子とＣＭＶプロモーターを、ＢｇｌIIとＢａｍＨＩとの消化によりｐＥＥ６発現ベクター（ｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉ）から放出させた。次いで、この断片を、ｐＥＥ１２軽鎖遺伝子発現ベクター（ｐＥＥ１２ｍｈＡＣＴ１Ｌｃｈｉ）のＢａｍＨＩ部位にライゲートし、それぞれが別のＣＭＶプロモーターの転写制御下にあるキメラ軽鎖遺伝子およびキメラ重鎖遺伝子を両方とも含むｐＥＥ１２ｍｈＬＨｃｈｉと称する１つのプラスミドが生成した。
ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２発現ベクターならびにＣｅｌｌｔｅｃｈ グルタミン シンセターゼ ジーン アンプリフィケーション システムは、以前に記載されている（例えば、その教示がそれぞれ、そのまま参照により本明細書に取り込まれる国際公開第８６／０５８０７号パンフレット（Celltech）、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット（Celltech）、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット（Celltech）、欧州特許第０ ３２３ ９９７ Ｂ１号明細書（Celltech）および国際公開第８９／１０４０４号パンフレット（Celltech）を参照のこと）。
キメラ抗体の一過性の発現のために、２０μｇのｐＥＥ１２ｍｈＬＨｃｈｉを、以下のようにエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、パークローンドライブ１２３０１、ロックビル、ＭＤ、２０８５２）にトランスフェクトした。対数増殖期で生育しているＣＯＳ−７細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡでの処理により組織培養フラスコから採集した。該細胞をリン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）で１回、ハンクのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）で１回洗浄し、１ｍｌのＨＢＳＳ当たり１．５ｘ１０⁷個の細胞濃度で再懸濁させた。０．８ｍｌのＨＢＳＳ中１．２ｘ１０⁷個の細胞を２０μｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１０分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ／細胞混合物を０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いて２５０Ｖ、９６０μＦで電流を適応した。エレクトロポレーション後室温で１０分間のインキュベーション後、該細胞を２０ｍｌの培養培地（ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ＦＣＳ）に移し、１６２ｃｍ²の組織培養フラスコ（Costar）で培養した。５日後、細胞培養上清を集め、α４β７インテグリンを発現するＨｕＴ７８細胞を染色する能力を試験した。ＨｕＴ７８細胞（ヒトＴリンパ腫細胞株）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、パークローンドライブ１２３０１、ロックビル、ＭＤ、２０８５２のアクセッション番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ １６１から利用することができる。
１００μｌの一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞培養上清、モックトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞上清、精製したネズミＡｃｔ−１抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはそれぞれマウスに対する精製した無関係アイソタイプ適合対照抗体（マウスＩｇＧ１、カッパ（ＭＯＰＣ２１）、Sigma製の１０μｇ／ｍｌ）およびヒトに対する精製した無関係アイソタイプ適合対照抗体（ヒトＩｇＧ１、カッパ、Sigma製の１０μｇ／ｍｌ）を、１ｘ１０⁵個のＨｕＴ７８細胞と氷上で３０分間インキュベートした。該細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳからなる緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液）を氷冷したもので２回洗浄した。次いで、該細胞を適切な蛍光二次抗体（フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）またはフルオレッセイン（ＦＩＴＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch）のいずれか）とともに氷上で３０分間インキュベートした。氷上で３０分後、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、３００ｍｌの同じ緩衝液に再懸濁し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣｓｃａｎでフローサイトメトリーにより分析した。図４Ａは、マウスアイソタイプ適合無関係対照抗体、ＭＯＰＣ２１（ＩｇＧ１、カッパ）と比較したネズミＡｃｔ−１ ｍＡｂの染色を示す。図４Ｂは、ヒトアイソタイプ適合無関係対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）およびモックトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞上清と比較したＨｕＴ７８細胞のキメラＡｃｔ−１抗体の染色を示す。したがって、ネズミＡｃｔ−１抗体により生じた染色と比較して、キメラ抗体は同様にＨｕＴ７８細胞を染色した。まとめると、これらのデータは、マウスＡｃｔ−１可変領域に関して適切な配列をうまくクローン化し、かつ、発現したことを示す。
アミノ酸配列分析
アミノ酸配列分析を、精製したネズミＡｃｔ−１重鎖および軽鎖で行ない、ハイブリドーマから単離された軽鎖および重鎖可変領域のｃＤＮＡの同一性を確認した。これは、軽鎖に関しては以下のように達成された：
ネズミＡｃｔ−１（５ｍｇ／ｍｌ）を、窒素雰囲気下、０．３Ｍ ホウ酸ナトリウム、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム中、３７℃で２時間、２ｍＭ ＤＴＴで還元した。次いで、該溶液をヨードアセトアミドで１０ｍＭにし、室温で４時間インキュベートした。非変性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、蛋白質が定量的に還元されていることを確認した。次いで、該蛋白質溶液をＰＢＳで大量に透析し、アリコートをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（１６／６０、Pharmacia）に適用した（操作１）。重鎖および軽鎖は、排除容量のそれに対応する溶出容量でこのカラムから共溶出し、このことは、２つの鎖がまだ共に保持されていることを示唆する。次いで、新たなアリコートを８Ｍ尿素処理し、変性条件下（６Ｍ尿素）でｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムにかけた（操作２）。両鎖は、おそらくフォールディングされないことにより、ボイドボリュームに再び共溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、２つのゲル濾過操作から溶出された２つの試料に両鎖が存在することを確認した。これらの試料を、Ｎ末端配列分析（Commonwealth Biotechnologies,Inc.）に供し、以下の結果を得た：

得られた配列は、ＤＮＡ配列から推定された成熟軽鎖のＮ末端に対応するものである。重鎖の配列を得るためのこの試行および他の試行により、そのＮ末端がブロックされているようであることが示唆された。したがって、内部ペプチド断片のアミノ酸配列分析を重鎖について行なった。
内部アミノ酸シーケンスを単純化するために、ペプシンでの切断により抗体からＦ（ａｂ）’２断片を生成させた。ネズミＡｃｔ−１を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０中、抗体：ペプシンが１：２００の割合でペプシンにより３７℃で２時間切断した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で評価したように、反応は完全であった。次いで、蛋白質をプロテインＧおよびプロテインＡカラムを通して精製した。次いで、前記したように、試料を還元してアルキル化し、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％）により重鎖断片を軽鎖断片から分離した。重鎖断片を切り出し、ランニング緩衝液を有する１ｍｌの０．１％ＳＤＳに２時間電気溶出させた。この試料を、２ｎｇのＡｓｐ−Ｎエンドプロテイナーゼで３０分間切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１７．５％）により断片を分離した。消化産物は、０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＳに一晩受動溶出させ、Ｎ末端配列分析（Commonwealth Biotechnologies,Inc.）に供した。
１７Ｋｄａ断片から得られた配列は、ＤＹＡＩＤＹＷＧ（配列番号：４９）であり、これは、重鎖のクローンに存在していた（図１；配列ＡＩＤＹはＪＨ４領域の開始部位に対応する）。
実施例２ マウスＡｃｔ−１可変領域の分子モデル化
ＣＤＲを接ぎ合わせた可変領域の設計を補助するために、マウスＡｃｔ−１可変領域の分子モデルを作製した。よくキャラクタライズされた蛋白質ファミリーの構造を免疫グロブリンでモデル化することは、ホモロジーによるモデル化に関して確立された方法を用いて行なった。分子モデル化は、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡ（Polygen Corp.,Waltham,MA）および解明された蛋白質構造のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ結晶学データベース下で稼働するＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ＩＲＩＳ ４Ｄワークステーションを用いて行なった。第１工程として、新規可変領域の枠組み領域（ＦＲ）を、類似の構造的に解明された免疫グロブリン可変領域由来のＦＲでモデル化した。同一のアミノ酸側鎖は、それらの元の方向で保持されていたが、変異した側鎖は、元のマウスＡｃｔ−１抗体と同様なカイ（ｃｈｉ）アングルを維持するように最大重複法を用いて置換された。新規可変領域のＣＤＲの大部分は、ＣＤＲに関する標準構造に基づいてモデル化された（ショチア（Chothia,C.）とレスク（A.M.Lesk）、J.Mol.Biol.196:901-917（1987）;ショチアら、Nature 342:877-883（1989）;トラモンタノ（Tramontano,A.）ら、J.Mol.Biol.215:175-182（1990）;ショチアら、J.Mol.Biol.227:799-817（1992））。公知の標準構造がない重鎖可変領域のＣＤＲ３のような場合、ＣＤＲループは、いかなる構造的に解明された蛋白質にも存在する類似のループ構造に基づいてモデル化した。最後に、好ましくない原子の接触を軽減し、ファンデルワールスおよび静電的相互作用を最適化させるために、該モデルをＱＵＡＮＴＡで実行したようなＣＨＡＲＭｍポテンシャル（ブルックス（Brooks,B.R.）、J.Comp.Chem.4:187-217（1983））を用いるエネルギー極小化に供した。
マウスＡｃｔ−１可変領域に関して、軽鎖可変領域由来のＦＲは、マウスモノクローナル抗体４−４−２０（ヘロン（Herron,J.N.）ら、Proteins.Structure,Function and Genetics 5:271-280（1989））のＦａｂ断片由来のＦＲでモデル化した。重鎖可変領域由来のＦＲは、マウスモノクローナル抗体Ｄ１１．１５（キターラ（Chitarra,V.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 90:7711-7715（1993））のＦａｂ断片由来のＦＲでモデル化した。マウスＡｃｔ−１抗体とモデルの基礎となった可変領域との間で異なるこれらのアミノ酸側鎖を置換した。次いで、２つの異質可変領域（即ち、４−４−２０に基づくカッパ軽鎖可変領域およびＤ１１．１５に基づく重鎖可変領域）を互いの観点から正しい方向に置換するために、Ｆａｂ４−４−２０抗体の軽鎖を、（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）により規定されたように）残基３５〜３９、４３〜４７、８４〜８８および９８〜１０２の空間で整列させることによりＤ１１．１５の軽鎖上に重ね合わせた。
ｍＡｂ Ａｃｔ−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｌ１）は、ショチアら、Nature 342:877-883（1989）により提唱されたように、Ｌ１標準サブグループ４に適合した。マウスＦａｂ４−４−２０（前記参照のこと）のＬ１ループは、アミノ酸の長さが同一であり、アミノ酸配列が類似し、さらに標準サブグループ４にも適合した。その結果として、該Ｌ１ループは、Ｆａｂ４−４−２０のＬ１ループでモデル化された。同様に、ｍＡｂ Ａｃｔ−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｌ２）およびＣＤＲ３（Ｌ３）は、それぞれの標準サブグループ１ループ構造およびＦａｂ４−４−２０の対応するＣＤＲの両方に適合した。したがって、Ａｃｔ−１カッパ軽鎖可変領域のＬ２およびＬ３ループは、Ｆａｂ４−４−２０のＣＤＲ Ｌ２およびＬ３でモデル化された。
ｍＡｂ Ａｃｔ−１の重鎖可変領域のＣＤＲ１（Ｈ１）は、マウス ｍＡｂ Ｄ１１．１５（前記を参照のこと）の対応するＨ１ループと同様に、ショチアら、Nature 342:877-883（1989）により規定されたように、Ｈ１標準サブグループ１に適合した。さらに、ｍＡｂ Ｄ１１．１５ ＣＤＲ１ループは、ｍＡｂ Ａｃｔ−１のＨ１と長さが同一であり、アミノ酸配列が非常に類似していた。その結果として、軽鎖と同様に、このループは、該モデルの基礎となった重鎖可変領域のＣＤＲ１ループでモデル化された。重鎖可変領域のＣＤＲ２（Ｈ２）を規定するのはより困難であったが、Ｈ２標準サブグループ２に対応するように思われた。また、Ｄ１１．１５抗体のＨ２ループも同一の標準サブグループに適合し、アミノ酸配列が非常に類似していたので、ｍＡｂ Ａｃｔ−１のＨ２ループは、Ｄ１１．１５のＨ２ループでモデル化された。
前記考察したように、重鎖可変領域のＣＤＲ３は、高度に変化しており、同定可能な構造グループに分類することができない。Ｈ３ループをモデル化するためには、同一の長さと類似のアミノ酸配列のループ−好ましくは別の抗体由来−が同定され、ループのモデル化の基礎として用いられる。ループサイズに関してＡｃｔ−１のＣＤＲ３に適合する、３種の抗体由来のすべてがＨ３ループである３つのループが存在した。立体的不一致についてすべての３つのループ構造をモデルで試験した後、ヒト抗体Ｐｏｔ（ファン（Fan,Z.C.）ら、J.Mol.Biol.228:188-207（1992））由来のＨ３ループが選ばれ、ｍＡｂ Ａｃｔ−１のＨ３ループをモデル化した。自明な立体的不一致についてモデルの全体を調整した後、該モデルをＱＵＡＮＴＡで実行したように、エネルギー極小化に供した。
ＣＤＲ接合可変領域の設計
ＣＤＲを接ぎ合わせた可変領域の設計における第１工程は、ヒト化可変領域の基礎として役立つヒト軽鎖および重鎖可変領域の選択である。ヒト可変領域の選択に関する２つのアプローチを試験して比較した。１つのアプローチでは、ヒト可変領域をヒト可変領域の異なるサブグループに対するコンセンサス配列から選択した（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））。齧歯類軽鎖および重鎖可変領域を、ヒトコンセンサス配列と比較し、最も類似したヒト軽鎖および重鎖コンセンサス配列を、ヒトラムダ軽鎖可変領域の６つのサブグループ、ヒトカッパ軽鎖可変領域の４つのサブグループおよびヒト重鎖可変領域の３つのサブグループの中から選択した（ケトルボロー、Protein Engineering 4:773-783（1991）を参照のこと）。別のアプローチでは、ヒト可変領域をヒト可変領域に関するすべての公開された配列から選択した（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））。齧歯類軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸配列を、ヒト配列と比較し、齧歯類可変領域と高い程度の類似性を有するヒト可変領域を選択した。同一のヒト抗体に由来するヒト軽鎖および重鎖可変領域は、２つの可変領域が適切に集合するということを確実にするために用いることができる（クィーン（Queen,C.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86:10029-10033（1989））。しかしながら、本明細書に記載されるように、鋳型として選択されたヒト軽鎖および重鎖可変領域は、２つの異なるヒト抗体に由来するものであった。このようにして、齧歯類可変領域に高い程度の類似性を有するヒト可変領域を選択することが可能であった。２つの異なるヒト抗体に由来する可変領域に基づくＣＤＲを接ぎ合わせた抗体の多くの成功例がある。最もよく研究された例の１つは、再形成されたヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体である（リーヒマン（Riechmann,L.）ら、Nature 322:323-327（1988））。
再形成ヒトＡＣＴ−１可変領域を設計するために、マウスＡＣＴ−１可変領域を、マウスおよびヒト可変領域のすべてのサブグループに関するコンセンサス配列と比較した（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））。その結果を表１および２に要約する。
マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、全体で８３．９％の同一性およびＦＲのみ内で８７．５％の同一性を有し、マウスカッパ軽鎖サブグループIIのコンセンサス配列と最も類似していた（表１）。ヒト抗体配列の観点から、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、全体で７２．３％の同一性およびＦＲのみ内で７８．８％の同一性を有し、ヒトカッパ軽鎖サブグループIIのコンセンサス配列と最も類似していた（表１）。

マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域は、全体で８３．５％の同一性およびＦＲのみ内で９４．３％の同一性を有し、マウス重鎖サブグループIIＢのコンセンサス配列と最も類似していた（表２）。ヒト抗体配列の観点から、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域は、全体で６８．６％の同一性およびＦＲのみ内で７５．９％の同一性を有し、ヒト重鎖サブグループＩのコンセンサス配列と最も類似していた（表２）。これらの結果により、マウスＡｃｔ−１可変領域がマウス可変領域の典型例のようであることが確認される。また、この結果は、ヒト可変領域鋳型またはＣＤＲ接合用受容体のよい供給源として役立ちうるヒト可変領域のサブグループを示唆する。

また、マウスＡｃｔ−１可変領域は、マウスおよびヒト可変領域の記録されたすべての例の個々の配列とも比較した（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）；UW GCGパッケージ（ウイスコンシン大学））。ヒト抗体配列に関して、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、ヒト抗体ＧＭ６０７’ＣＬ（クロベック（Klobeck,H.-G.）ら、Nature 309:73-76（1984））由来のヒトカッパ軽鎖可変領域の配列と非常に類似していた。図５は、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：７）およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：８）のアラインメントを示す。予想されたように、ヒトＧＭ６０７’ＣＬの軽鎖可変領域は、ヒトカッパ軽鎖可変領域のサブグループIIのメンバーである。マウスＡｃｔ−１およびヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域間の全体の配列同一性は、７１．４％であると計算された。マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬ（デルシモニアン（Dersimonian,H.）ら、J.Immunol.139:2496-2501（1987））由来のヒト重鎖可変領域の配列と非常に類似していた。図６は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：９）およびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１０）のアラインメントを示す。予想されたように、ヒト２１／２８’ＣＬの重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域のサブグループＩのメンバーである。マウスＡｃｔ−１およびヒト２１／２８’ＣＬ重鎖可変領域間の全体の配列同一性は、６８．１％であると計算された。これらの比較に基づき、ヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域を、再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域の設計に関するヒト鋳型として選択し、ヒト２１／２８’ＣＬの重鎖可変領域を、再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域の設計に関するヒト鋳型として選択した。
設計過程の第２の工程は、選択されたヒト軽鎖および重鎖可変領域に齧歯類ＣＤＲを挿入することであった。カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））により規定されたように、齧歯類ＣＤＲ全体をヒトＦＲに結合して単純なＣＤＲ接合部を作製した。いくつかの場合において、単純なＣＤＲ接合でヒト化される齧歯類抗体は、抗原に対してほとんどまたは全く結合を示さないであろう。これらのアミノ酸残基のいずれが、抗原との相互作用を介して直接的にまたはＣＤＲループの配置を変化させることにより間接的に、抗原への結合に反する影響を及ぼすと考えられるかどうかを決定するために、ヒトＦＲのアミノ酸配列を研究することが重要である。
第３の工程において、ヒトＦＲのアミノ酸残基を抗原への良好な結合を達成するために変えるべきかに関する決定がされた。この段階で、齧歯類可変領域のモデルが設計過程において最も有用になる。また、ショチアら、Nature 342:877-883（1989）により規定されたように、ＣＤＲの標準構造も有用である。該標準構造の一部である齧歯類アミノ酸残基のいずれかをヒト化可変領域中に保存することが重要である。ある位置のアミノ酸が異常であるかまれであるかを決定するためには、ヒト化対象の齧歯類抗体の配列を他の齧歯類抗体由来の類似の配列と比較することが役に立つ。これは、その位置での齧歯類アミノ酸が抗原結合に重要な役割を有することを示唆するであろう。齧歯類可変領域のモデルを研究することにより、特定の位置のアミノ酸が抗原結合に影響を及ぼしうるか否かを予想することが可能である。個々のヒト抗体由来のヒト可変領域を設計の基礎として用いられつつあるとき、そのときは、個々のヒト配列をヒト可変領域のそのサブグループのコンセンサス配列と比較することが望ましい。特に異常なアミノ酸はいずれも注意すべきである。ほとんどの場合、ヒト可変領域中のその位置に存在するアミノ酸から齧歯類可変領域中のその位置に存在するアミノ酸に変えるべきヒトＦＲにおけるいくつかのアミノ酸が同定される。
表３および４は、再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域がどのように設計されたかを要約する。表３は、再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_L領域の設計に用いたアミノ酸配列のアラインメントであり、４列にはヒト化対象のマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：７）、５列（マウスκ−II）にはマウスＡｃｔ−１可変領域が属するマウス可変領域のサブグループに関するコンセンサス配列（配列番号：５０）、６列（ヒトκ−II）にはマウスＡｃｔ−１可変が最も類似するヒト可変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（配列番号：５１）、７列には鋳型として供する（即ち、ＧＭ６０７’ＣＬ）ヒト可変領域のアミノ酸配列（配列番号：８）および８列（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶκ）には設計された再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域のアミノ酸配列（配列番号：５２）を掲載する。表４は、再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_H領域の設計に用いたアミノ酸配列のアラインメントであり、４列にはヒト化対象のマウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号：９）、５列（マウスIIＢ）にはマウスＡｃｔ−１可変領域が属するマウス可変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（配列番号：５３）、６列（ヒトＩ）にはマウスＡｃｔ−１が最も類似するヒト可変領域のサブグループに対するコンセンサス配列（配列番号：５４）、７列には鋳型として供する（即ち、２１／２８’ＣＬ）ヒト可変領域のアミノ酸配列（配列番号：１０）および８列（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶ_H）には設計された再形成Ａｃｔ−１可変領域のアミノ酸配列（配列番号：５５）を掲載する。表３および４の終わりから２番目の列は、マウスＡｃｔ−１と選択されたヒトＦＲとの間で異なる残基のＦＲにおける位置（表面または埋没）を示す。表３および４の最後の列は、可変領域中のその位置に関連したコメントを掲載する。
表３において、以下の印を用いる：（＊）カバット（Kabat）コンセンサス配列即ち、カバットサブグループ内の９５％以上の出現（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））（５列および６列の場合）、またはショチアら、Nature 342:877-883（1989）により規定されたようなＣＤＲループ（５列および６列の場合）に対する規定構造の一部としてもしくはＣＤＲループ（８列の場合）に対する規定構造の一部としてのいずれかにより規定された非変異残基；（太字）ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基により置換されたＦＲおよびＣＤＲでの位置；（下線）ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なるＦＲでの位置；（△）ヒトＦＲでの変化の番号付け；（マウス Ａｂ Ａｃｔ−１）マウスＡｃｔ−１抗体由来のＶ_L領域のアミノ酸配列；（マウスκ−II）サブグループII由来のマウスカッパＶ_L領域のコンセンサス配列（カバットら、前述）（ヒトκ−II）サブグループII由来のヒトカッパＶ_L領域のコンセンサス配列（カバットら、前述）；（ＧＭ６０７’ＣＬ）ヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体由来のアミノ酸配列（クロベックら、Nature 309:73-76（1984））；（表面または埋没）抗体可変領域の両鎖における残基の残りに関連したアミノ酸の位置；（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨＶ_K）再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_L領域のアミノ酸配列。

表４において、以下の印を用いる：（＊）カバット（Kabat）コンセンサス配列即ち、カバットサブグループ内の９５％以上の出現（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991））（５列および６列の場合）、またはショチアら、Nature 342:877-883（1989）により規定されたようなＣＤＲループ（８列の場合）に対する規定構造の一部としてのいずれかにより規定された非変異残基；（太字）ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基により置換されたＦＲおよびＣＤＲでの位置；（下線）ヒト残基が類似のマウス残基番号と異なるＦＲでの位置；（△）ヒトＦＲでの変化の番号付け；（マウス Ａｂ Ａｃｔ−１）マウスＡｃｔ−１抗体由来のＶ_H領域のアミノ酸配列；（マウスIIＢ）サブグループIIＢ由来のマウスＶ_H領域のコンセンサス配列（カバットら、前述）；（ヒトＩ）サブグループＩ由来のヒトＶ_H領域のアミノ酸配列（カバットら、前述）；（ヒト２１／２８’ＣＬ ヒト２１／２８’ＣＬ抗体由来のアミノ酸配列（デルシモニアンら、J.Immunol.139:2496-2501（1987））；（表面または埋没）抗体可変領域の両鎖における残りの残基に関連したアミノ酸の位置；（Ａｃｔ−Ｉ ＲＨ Ｖ_H）再形成ヒトｍＡｂ Ａｃｔ−Ｉ Ｖ_H領域のアミノ酸配列。

再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域の設計（表３）に関して、ヒトＦＲの１つの残基がヒトＦＲに存在するアミノ酸から元のマウスＦＲに存在するアミノ酸に変化した。この変化は、ＦＲ１の２位であった（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）により規定されたように）。特に、ヒトＧＭ６０７’ＣＬ軽鎖可変領域で見られるイソロイシンがマウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域で見られるようなバリンに変化した。カッパ軽鎖可変領域でのこの位置は、Ｌ１ループの正しい方向と構造に厳密な位置の１つとして、ショチアら、Nature 342:877-883（1989）により同定され、それ自体、「標準アミノ酸」の１つとして知られている。ループコンフォメーションにおける重要な役割のため、かかるマウス枠組み残基は、再形成可変領域で一般にいつも保存されている。
ＦＲ１の４位では、マウス配列においてバリンおよびヒト配列においてメチオニンが存在する。バリンからメチオニンへの変化は、両アミノ酸が非極性で、疎水性残基であるので、それ自体ドラスティックな変化ではなく、したがって、ヒト配列に存在するメチオニンを再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域に使用した。しかしながら、該モデルは、バリンがＬ１ループとＬ２ループとの間に埋もれており、蛋白質に埋もれた場合のバリンの平均体積は１４２ųであることを示唆するが、一方、メチオニンは約１７１ųの空間を占める。より大きなメチオニン残基は、Ｌ１ループとＬ２ループのいずれかまたは両方のコンフォメーション変化を生じさせうるであろう。再形成ヒトＡｃｔ−１の抗原結合は、再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域において４位のメチオニンからバリンへの追加の変化により改良されてもよい。
再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域の設計（表４）に関して、ヒトＦＲに存在するアミノ酸から元のマウスＦＲに存在するアミノ酸に変化したヒトＦＲの５つの残基が存在した。ＦＲ１の２４位およびＦＲ３の７１位では（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）により規定されたように）、これらの位置はそれぞれＨ１ループとＨ２ループの標準構造の一部であるので（ショチアら、Nature 342:877-883（1989））、マウス配列に存在するようなアミノ酸残基が再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域に保持されていた。これらの位置でのいかなるアミノ酸変化もＨ１ループとＨ２ループのパッキングと最終的な構造を破壊しうるので、これらの厳密な位置でのマウス残基は、ヒト化重鎖可変領域で定型的に保存されている。
ＦＲ２の４８位では、ヒト配列のメチオニンがマウスＡｃｔ−１配列に存在するようなイソロイシンに変化した。イソロイシンをメチオニンに置換することは異常である。より重要なことには、該モデルは、イソロイシン残基がＨ２ループの下に隠れて埋もれていることを示す。結論として、この埋もれた位置での変化は、Ｈ２ループの構造に影響を及ぼし、故に抗原結合を妨害したかもしれない。
ＦＲ３の６９位では、ヒト配列のイソロイシンがマウスＡｃｔ−１配列に存在するようなロイシンに変化した。イソロイシンをロイシンに置換することは異常ではないけれども、該モデルは、ロイシンがＨ２ループの下に埋もれていることを示す。結論として、４８位の残基のように、この位置での変化は、Ｈ２ループのコンフォメーションに影響を及ぼし、それにより抗原結合を破壊しうるだろう。
最後に、ＦＲ３の７３位では、ヒト配列のスレオニンがマウス配列に存在するようなイソロイシンに変化した。ＦＲ３のこの位置でのイソロイシンは、マウスサブグループIIＢまたはヒトサブグループＩでこれまで見られたことがなく（カバット（Kabat,E.A.）ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、米国保健およびヒトサービス省、米国政府印刷局（1991）により規定されたように）、このことは、この位置のイソロイシンが抗原結合に重要な役割を有するかもしれないことを示唆する。
該モデルにおいて、７３位のロイシンが結合部位の縁近辺の表面上に存在するようであり、α４β７インテグリンのエピトープの大きさと方向に応じて抗原結合に直接の役割を果たす可能性があるだろう。しかしながら、表面残基の位置として、抗体全体は、もしマウスアミノ酸が再形成ヒト抗体に存在しないならば、より低い免疫原性ポテンシャルを有するだろう。イソロイシンは、再形成抗体誘導体においてヒトスレオニン残基に置換でき、新規な構築物を再試験して、２番目のバージョンが類似のレベルの抗原結合を維持するかどうかを決定した。
再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域の元の設計でなされたヒトＦＲでの５つの変化に加え、抗原結合を改良するかもしれない２つの別の変化が存在した。該モデルは、マウスｍＡｂ Ａｃｔ−１の重鎖可変領域の３８Ｌｙｓおよび４０Ａｒｇ残基がＨ２ループの下に隠れて位置し、ＣＤＲ２の６３Ｐｈｅに近接してパッキングすることを示唆する（表４と同じ番号付け）。しかしながら、これらの残基も重鎖可変領域の核に位置し、それらがそれらの対応するヒトアミノ酸（各３８Ａｒｇおよび４０Ａｌａ）を置換するために用いられるならば、他の有害な効果を有するかもしれないであろう。したがって、ＦＲ２の３８位と４０位に対する変化は、ｍＡｂ Ａｃｔ−１の再形成ヒト重鎖可変領域に取り込まれなかった。しかしながら、再形成重鎖の修飾のいずれかまたは両方を誘導体に用いて抗原結合を改良してもよい。
結論
マウスＡｃｔ−１可変領域のモデルは、主に他の抗体可変領域の溶解した構造に基づいて作られた。該モデルをヒト化Ａｃｔ−１可変領域の設計に用いた。再形成ヒト可変領域の抗原結合部位の構造を保持することに特に重点を置いた。
再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域および再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域を設計した（表３および４）。再形成ヒトＡｃｔ−１軽鎖可変領域は、マウスＡｃｔ−１軽鎖可変領域のＣＤＲおよびヒトＧＭ６０７’ＣＬ抗体の軽鎖可変領域由来のＦＲを基礎とした。１つのアミノ酸変化がヒトＦＲの２位でなされた。再形成ヒトＡｃｔ−１重鎖可変領域は、マウスＡｃｔ−１重鎖可変領域のＣＤＲおよびヒト２１／２８’ＣＬ抗体の重鎖可変領域由来のＦＲを基礎とした。５つのアミノ酸変化がヒトＦＲの２４、４８、６９、７１および７３位でなされた。
さらに、再形成ヒトＡｃｔ−１可変領域のさらなるバージョンの設計に考慮されるであろうカッパ軽鎖のＦＲ１の４位の１つの部位ならびに重鎖のＦＲ２の３８および４０位の２つの部位が注目された。また、抗体の表面上の位置という観点から、重鎖のＦＲ３の７３位の１つの残基もマウスからヒトアミノ酸への復帰突然変異の候補として同定された。
実施例３ 再形成可変領域をコードする核酸の構築
正しい重鎖および軽鎖可変領域が生物化学的に（部分アミノ酸配列）および機能的に（ＨｕＴ７８細胞のキメラ抗体染色）クローニングされたことを確認した後、再形成アミノ酸配列を前記のように設計した。次に、再形成抗体鎖をコードする遺伝子を設計して調製した。
ヒト化ＡＣＴ−１の設計、構築および発現
実施例２に記載のようにヒト化抗体の一次アミノ酸配列を決定した後、該配列を縮重核酸配列に逆翻訳し、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Kodak,Scientific Imaging Systems）４．５．３版を用いて可能性のある制限酵素部位を分析した。次いで、制限酵素切断部位を取り込むが一次アミノ酸配列を保存する核酸配列を選択した。サブクローニングに使用される注目の制限酵素部位を有する重鎖核酸配列（配列番号：１８）およびアミノ酸配列（配列番号：１９）を図１１に示し、ならびに軽鎖核酸配列（配列番号：２０）およびアミノ酸配列（配列番号：２１）を図１２に示す。
以下のようにして、ヒト化Ａｃｔ−１重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を構築した。軽鎖に対してＬ１〜Ｌ６（それぞれ配列番号：２２〜２７）、重鎖に対してＨ１〜Ｈ１０（それぞれ配列番号：２８〜３７）と称する重複した相補的なオリゴヌクレオチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３９２を用いて合成した（図１３）。５５℃で一晩脱保護した後、オリゴをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃで乾燥させ、１００ｍｌの水に再懸濁させ、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラム（Bio-Rad）で脱塩した。該オリゴの濃度は、２６０ｎｍで吸光度を測定することにより決定し、オリゴを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
各オリゴの１００μｇを２倍容量の負荷色素（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）と混合し、６５℃で２分間加熱し、１Ｘ ＴＢＥ中で約３時間、２５０Ｖで泳動した。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線下で観察した。次いで、正しい長さのオリゴをゲルから切り出し、水とともに透析チューブに入れ、電気溶出させた。該オリゴを、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１ ｖ／ｖ）（Gibco/BRL）で２回抽出し、０．１倍容量の３．０Ｍ 酢酸カリウム（ｐＨ６）と２倍容量の冷エタノールの添加により沈澱させた。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、真空乾燥させ、５０μｌの水に再懸濁させた。
相補性オリゴを、等モル量（５０μｌの水に約１００μｇ）の精製オリゴを等容量（１００μｌ）の２Ｘ アニーリング緩衝液（２Ｘ＝１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合することによりアニーリングした。オリゴは、９５℃まで１０分間加熱することにより変性させた後、６５℃で８時間インキュベーションした。次いで、アニーリングしたオリゴを、以前に記載のようにエタノール沈澱させ、４０μｌの水に再懸濁した。
アニーリングしたオリゴの伸長は、２μｌのラージフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）、５μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰおよび５μｌの１０Ｘ 緩衝液（１０Ｘ＝１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）を添加し、最終容量を５２μｌまで上げることにより達成した。該混合物を室温で１時間インキュベートした。３７℃で０．５時間のインキュベーションで１μｌのｄＮＴＰと１μｌのＫｌｅｎｏｗをさらに添加した。重鎖断片Ａを伸長させる必要がなかったことに注目すること。
アニーリングして伸長した断片を、１２％非変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により一本鎖のアニーリングしていないものから精製した。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線下で観察した。正しい長さの断片を切り出し、前記したように透析チューブ中の電気溶出により回収した。該断片を、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで２回洗浄し、エタノール沈澱し、１０μｌの水に再懸濁させた。
３つの軽鎖断片（ＬＡ、ＬＢおよびＬＣ）ならびに５つの重鎖断片（ＨＡ〜ＨＥと称する）を、別々にｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMにライゲートし、以下に記載したことを除いて、製造業者の推奨したプロトコールに従ってｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔキット（Stratagene）を用いてＸＬ−１ Ｂｌｕｅ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓに形質転換した。断片ｐＣＲ−ＬＡおよびｐＣＲ−ＬＢは、制限酵素ＭｓｃＩでの消化を阻止するであろうＤｃｍメチラーゼを避けるために、ＤＭ１（Gibco/BRL）コンピテント細胞に形質転換した。白色コロニーを拾い、製造業者の推奨したプロトコールに従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼキットを用いてミニプレップＤＮＡをシーケンスした。インサートのそれぞれ反対側にアニーリングするＴ３およびＴ７プライマーをシーケンスに用いた。
ヒト化重鎖可変領域および軽鎖可変領域断片の複雑サブクローニングは、合成の間に配列に取り込まれた特異的な制限部位を用いて達成された。重鎖断片ＨＡ〜ＨＤは、以下に記載するように断片の連続サブクローニングを可能にする、各配列の末端に追加のＡｇｅＩ制限部位を含む。
ｐＣＲ−ＨＡおよびｐＣＲ−ＨＢ由来のミニプレップＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩとＡｇｅＩで消化した。ＤＮＡは、１％アガロースゲルで電気泳動した。１４１ｂｐ断片ＨＢを該ゲルから回収し、ＳｐｅＩおよびＡｇｅＩ部位でｐＣＲ−ＨＡにライゲートし、ｐＣＲ−ＨＡＢが生じた。次に、１１２ｂｐ断片ＨＣを、ＸｂａＩとＡｇｅＩを用いてｐＣＲ−ＨＣから放出させ、ｐＣＲ−ＨＡＢのＸｂａＩおよびＡｇｅＩ部位にライゲートし、プラスミドｐＣＲ−ＡＣを得た。断片ＨＤ（１４１ｂｐ）およびＨＣ（１３０ｂｐ）は、断片ＨＤに対しては制限部位ＮｈｅＩおよびＡｇｅＩを、ならびに断片Ｅに対しては制限部位ＢｓｔＥIIおよびＡｇｅＩを用いて、同じ一連の様式でライゲートした。ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔにすべての５つの重鎖可変領域断片を含む最終プラスミドを、ｐＣＲ−ＨＡＥと称した。すべての消化は、６５℃の最適インキュベーション温度を有するＢｓｔＥIIを用いる場合を除いて、３７℃で少なくとも２時間のインキュベーションでミニプレップＤＮＡを用いて行なった。ライゲーションは、１：１０のベクター対インサート比でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩行ない、次の日に、製造業者の推奨したプロトコールに従ってＤＨ５αサブクローニング効率コンピテント細胞（Gibco/BRL）に形質転換した。
ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中のＡｃｔ−１ヒト化重鎖可変領域を、ｐＣＲ−ＨＡＥのＨｉｎｄIIIとＡｇｅＩでの消化により放出させた。この４１１ｂｐ断片を用いて、ＨｉｎｄIIIとＡｇｅＩで消化しておいたｐＥＥ６ｍｈＡＣＴ１Ｈｃｈｉ（実施例１）のマウス可変領域配列を置換し、ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂにヒト化ＡＣＴ−１重鎖遺伝子を生成させた。得られたプラスミドをｐＥＥ６ｈＡＣＴ１Ｈと称する。正しいＤＮＡ配列は、シーケンスにより決定した。
ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中の軽鎖断片Ａを、ＢｓｐＥＩとＭｓｃＩで消化した。次いで、この１５３ｂｐ断片を用いて、ｐＣＲ−ｓｃｒｉｐｔ^TM中のマウス可変軽鎖のＢｓｐＥＩからＭｓｃＩのマウス部分を置換した。このプラスミドをｐＣＲ−ＬｈＡｍＢＣと称する。ＭｓｃＩとＮｒｕＩで消化した軽鎖断片ＢおよびＮｒｕＩとＫａｓＩで消化した軽鎖断片Ｃを、ｐＣＲ−ＬｈＡｍＢＣのＭｓｃＩおよびＫａｓＩ部位にトリプルライゲートし、残りのマウス配列を置換した。消化、ライゲーションおよび形質転換には、ＤＭ１コンピテント細胞を最後の形質転換を除くすべてに使用することを除いて、前述したのと同じ手法を用いた。
ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TM中のヒト化軽鎖可変領域およびプラスミドｐＥＥ１２ｍｈＡＣＴ１Ｌｃｈｉ（実施例１）をＨｉｎｄIIIとＫａｓＩで消化した。３６０ｂｐ軽鎖可変領域断片および３１５ｂｐ軽鎖定常領域をゲルで精製し、ｐＥＥ１２のＨｉｎｄIII制限部位にトリプルライゲートし、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１Ｌを得た。シーケンスを行ない、正しい方向および核酸配列を確認した。
ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現ベクターは、以下の例外を除いて、キメラ抗体に関して記載されたのと同じ方法（実施例１、キメラ免疫グロブリンの発現を参照のこと）を用いて構築した。ヒト化可変重鎖領域の追加のＢｇｌII制限部位により、ＢｇｌIIでの切断の際には部分消化を用いて正しい断片を得た。ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含むベクターを、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨと称する。
すべてのヒト化抗体構築物の一過性の発現および細胞染色は、キメラ抗体に用いられたものと同じプロトコールを用いて行なった（実施例１、キメラ免疫グロブリンの発現を参照のこと）。図１４は、無関係のアイソタイプ適合対照抗体（ＩｇＧ１、カッパ）と比較して、マウス−ヒトキメラＡｃｔ−１抗体またはヒト化Ａｃｔ−１抗体を用いるＨｕＴ７８染色の結果を示す。
骨髄腫細胞株であるＮＳＯ細胞（Methods in Enzymol.73（B）:3-46（1981）；ヨーロピアンコレクション・オブ・アニマルセルカルチャーズ、PHLS CAMR,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,U.K.,ECACC No.85110503）の安定なトランスフェクタントは、ＮＳＯ細胞のｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨとのエレクトロポレーションにより得た。
ＮＳＯ細胞の安定な発現
安定なトランスフェクション用の４０μｇのｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨを、構築物の細菌のプラスミド部分内を切断するＳａｌＩ制限酵素での消化により線状にした。線状ＤＮＡを、２倍容量のエタノールと１／１０倍容量の酢酸ナトリウムを用いて溶液から沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させて滅菌水に再懸濁した。
対数増殖中のＮＳＯ細胞は、非選択培地（ダルベッコの改変イーグル培地（高グルコース）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有、ピルビン酸ナトリウム不含、４５００ｍｇ／Ｌ グルコースおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（GIBCO/BRL、カタログ番号12430-021）含有、１０％ウシ胎仔血清（Gibco/BRL、カタログ番号16000-044）を補足）で維持した。ＮＳＯ細胞を遠心分離し、洗浄して、ＤＮＡの添加後に該細胞が１０⁷細胞／ｍｌの濃度で存在するように、冷ＰＢＳに再懸濁した。線状プラスミドＤＮＡ（４０μｇ）を、氷上のエレクトロポレーションキュベット中の１０⁷個の細胞に加えた。該細胞とＤＮＡを泡を生じさせないようにゆっくり混合させ、該混合物を氷上で１０分間放置した。該キュベットの外側を拭いて乾燥させ、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Bio-Rad）を用いて１５００Ｖ、３μＦの２回の連続パルスを加えた。該キュベットを１０分間氷上に戻した。
トランスフェクトした細胞を、５０μｌの非選択培地中３ｘ１０⁵、７．５ｘ１０⁴および１．５ｘ１０⁴細胞／ｍｌの密度で９６ウエルプレートに移し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、１５０μｌの選択培地（グルタミン不含ダルベッコの改変イーグル培地、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース含有、４ｍｇ／ＬのピリドキシンＨＣｌ含有、１１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム含有、硝酸鉄不含、Ｌ−グルタミン不含（JRH BioSciences、カタログ番号51435-78P）、１Ｘ ＧＳサプルメント（JRH Biosciences、カタログ番号58672-77Pから入手した５０Ｘ ＧＳサプルメント）と１０％透析ウシ胎仔血清（Gibco/BRL、カタログ番号26300-061）を補足）をすべてのウエルに添加した。該プレートを、実質的な細胞死が起こり、不連続な生存コロニーが出現するまでインキュベーターに戻した。一旦グルタミン非依存性トランスフェクタントのコロニーが見られれば、シングルコロニーを有するウエルを選択し、消費した組織培養上清を回収し、以下に記載のようにＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧ分泌をアッセイした。このようにして、その後の研究に用いた３Ａ９と称する抗体産生クローンを得た。第２のトランスフェクションは、選択をＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ、グルタミンシンテターゼインヒビター）の存在下で行なうことを除いて、前記したように行なった。
陽性のコロニーは、以下のようにしてヒトＩｇＧ分泌に対するＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレート（NUNC Maxisorp）を、炭酸塩緩衝液ｐＨ９．５中２．５μｇ／ｍｌで１００μｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、２００μｌ ＰＢＳ、１％ ＢＳＡで、３７℃で２時間ブロックした。プレートを洗浄し、１００μｌの安定なトランスフェクトＮＳＯの上清で３７℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳ １％ ＢＳＡ中１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１カッパを標準として用いた。新鮮なＮＳＯ培地（ＤＭＥ＋ＧＳサプルメント）を陰性対照として用いた。プレートを洗浄し、ＰＢＳ（Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺なし）中０．０５μｇ／ｍｌで１００μｌのペルオキシダーゼ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）₂断片ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を用いて、３７℃で１５分間インキュベートした。５ｍｇ Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）の１錠（Sigma）を１２ｍｌのクエン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）に溶解し、該錠剤が溶解した後、１２μｌの３０％過酸化水素を加えた。洗浄して二次抗体を除去した後、１００μｌの溶解したＯＰＤ基質を加えた。反応は１２．５％の硫酸で停止させ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで４９０ｎｍでプレートを読んだ。陽性のウエルを、ウエル当たり２、１および０．５個の細胞の限界希釈によりクローニングした。シングルクローニング由来のすべてのウエルをＥＬＩＳＡによる抗体産生に関して陽性と評価した場合、該株はクローニングされたと見なした。
一過性または安定細胞トランスフェクタント培養物の細胞培養上清由来のヒト化ＡＣＴ−１抗体の精製は、Ｂｉｏ−Ｃａｄワークステーション（Perseptive Biosystems,Inc.）を用いるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Poros A/M 4.6/100mm,5mL/min）により行なった。該カラムは、ＰＢＳで平衡化させた後、前もって０．２ミクロンフィルターで濾過しておいた細胞培養上清を適用した。１回の操作当たり適用した細胞培養上清の体積は、抗体の濃度により変えた。通常、１回の所定の操作で、１５ｍｇ以下の抗体をカラムに適用した。流速は、精製手法を通して５ｍｌ／ｍｉｎであった。結合後、まず、該カラムをＯＤ₂₈₀ｎｍ＝０になるまでＰＢＳで大量に洗浄した。次いで、該カラムを最小限５０カラム体積でさらに洗浄した。次いで、該カラムを引き続き０．１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄した。溶出は、０．１Ｍ クエン酸Ｎａ、ｐＨ３．５での洗浄により達成された。溶出液は、５ｍｌの画分で回収し、２００μｌの１．５Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃ ｐＨ１２の添加によりｐＨを中性にした。次いで、抗体含有画分をプールし、限外濾過（セントリコン、３０，０００ＫＤａカットオフ、Amicon）により所望の濃度に濃縮した。
Ｆｃ変異改変体の構築
また、ヒト化Ａｃｔ−１抗体の非Ｆｃ結合（Ｆｃ変異）版も構築した。この抗体は、ヒト化Ａｃｔ−１抗体と同じ可変領域（図１１および図１２）ならびに、ＦｃＲ認識を排除し、Ｆｃ結合を除去するように設計されたＩｇＧ１重鎖定常領域に２個のアミノ酸の置換（即ち、Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵置換およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷置換）を除いて同一のヒトＩｇＧ１定常領域を有する。Ｆｃ変異誘導体の重鎖をコードする核酸を以下のように構築した。ｐＥＥ１２発現ベクター中でヒト化抗ＣＤ１８抗体（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット（１９９３年２月４日公開）；シムズら、J.Immunol.151（4）:2296-2308（1993））の軽鎖および重鎖をコードするが、部位特異的変異導入（Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）により２個のアミノ酸置換をＩｇＧ１重鎖定常領域内に導入した３６７８と称する構築物（ヘルマン・ウォルトマン博士、オックスフォード大学から供与）を、ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩで消化してガンマ定常領域変異を含む９００ｂｐの断片を放出させた。次いで、この断片を用いて、ＰＥＥ６ｈＡＣＴ１ＨのＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位で重鎖野生型ガンマ１定常領域を置換し、ｐＥＥ６ｈＡＣＴ１Ｈ／ＦＣｍｕｔを生じさせた。両鎖を含有する他の構築物に対しては、前記したのと同様な方法で、再形成軽鎖遺伝子およびＦｃ変異再形成重鎖遺伝子を含む１つの構築物（ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍｕｔ）を調製した。
実施例４ ヒト化ＡＣＴ−１抗体ＬＤＰ−０２のキャラクタライゼーション
最初のキャラクタライゼーション研究は、ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍｕｔで一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から産生された抗体を用いて行なった。この抗体標品は、前記したように産生および精製され、以下、適当なロット番号が後に続く「１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１」と称する。
前記ネズミ細胞株ＮＳＯの安定なトランスフェクタント（線状ｐＥＥ１２ｈＡＣＴ１ＬＨ／ＦＣｍｕｔでトランスフェクト）から産生された抗体を用いて、追加のアッセイを行なった。この抗体標品を以下、「ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ１」と称する。
「ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１」抗体を以下に記載の次の研究に用いた：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、等電点電気泳動、アミノ酸組成分析、種交差反応性、滴定、補体介在溶解アッセイ、ＡＤＣＣアッセイおよび結合阻害アッセイ。「１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃７をアフィニティーアッセイ＃１〜２に使用し、１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃８／９をアフィニティーアッセイ＃３〜５に使用し、そして１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃８／９をＣ１ｑ結合アッセイに使用した。
Ａ．物理化学的特性
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
同一性の立証を補助し、最初の標品をキャラクタライズして純度を評価するために、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を、非還元および還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、コロイドクーマシーブルーで染色した。
０．８２ｍｇ／ｍｌの公称濃度のＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を８０μｌ、微量濃縮器に加えた。抗体を溶解したクエン酸緩衝液を、１６０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（０．５ｍＭ、ｐＨ８．８）で３回交換した。緩衝液交換後の試料の最終容量は、１３５μｌであり、０．４８６ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度を得た。この溶液を非還元および還元緩衝液で２倍に希釈し、０．２４３ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。３．１６μｇの蛋白質を含む０．２４３ｍｇ／ｍｌ溶液の１３μｌアリコートを、ＳＤＳゲルの指定された試料のレーンに負荷した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、対照アーティクルは、マーク（Ｍａｒｋ）１２分子量標準（Novex,#LC5677）を含んでいた。
非還元条件下では、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に、２００，０００ダルトンよりわずかに小さい見かけ上の分子量を有する主要なバンドが存在した。１１６，３００〜２００，０００ダルトンの間に、いくつかのマイナーな成分が観察された。約９７，４００ダルトンの分子量、５５，４００ダルトンよりわずかに大きな分子量および３１，０００ダルトンより小さい分子量を有する３つの追加のマイナーな成分も観察された。レーザーデンシトメトリーを用いてゲルをスキャンすることにより、染色されたポリペプチドバンドの定量分析、次いで、各可視化バンドに関連したエリアのパーセントの計算を可能にした（表５）。定量分析から得られたデータは、約２００，０００ダルトンで観察された主要な成分が試験した試料のレーンで全染色バンドの８４．４％に相当することを示唆する。この主要なバンドは、インタクトな抗体に相当したが、５５，０００および、３１，０００ダルトンの他のバンドはそれぞれ、１本の重鎖および軽鎖に相当した。
還元条件下では、２つの主要な成分が電気泳動ゲル上で観察された。該成分のうちの１つの分子量は、約５５，４００ダルトンであり、該ゲルレーンで可視化された全染色バンドの６８．６％に相当し、一方、３１，０００ダルトンよりわずかに小さいものに相当する第２の成分は、全染色バンドの３０．５％に相当した（表５）。これらの２つの成分の分子量は、免疫グロブリンＧの重鎖および軽鎖の予想される分子量とよく一致する。これらのデータは、約９９％の標品がインタクトな抗体または１本の重鎖もしくは軽鎖免疫グロブリン鎖のいずれかからなることを示唆する。また、２つの主要な成分以外にも、６６，３００ダルトンよりわずかに小さい１つのマイナーな成分が観察された。
この分析から、インタクトな免疫グロブリンＧに対するものと一致する高分子量種がＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に主要なバンドとして存在する。また、いくつかのマイナーなバンドもＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に存在する。還元後、免疫グロブリンＧ分子の重鎖および軽鎖のものと一致する電気泳動上の移動度を示す２つの主要なバンドが観察された。

２．ウエスタンブロット分析
前記したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料および標準を分析した。要約すると、還元しないおよび還元した試料を４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで分析した。また、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）マーク（Ｍａｒｋ）１２分子量標準もゲルで泳動した。それぞれ０．５１および１．０９μｇの蛋白質を生ずる、０．２１４３ｍｇ／ｍｌ溶液の２．１μｌおよび４．５μｌアリコートの容量をＳＤＳゲルの指定された試料レーンに負荷した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ウエスタン・トランスファー・アパレイタス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）の使用説明書に従って、試料蛋白質をゲルからニトロセルロースに移した。用いたトランスファー緩衝液は、２０％メタノール中１Ｘ Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液であった。約２時間後、該ニトロセルロースブロットをトランスファー装置から除去し、ＤＤＩ水でリンスした。次いで、該ニトロセルロースブロットを、３％ゼラチンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ）中、３７℃で３５分間ブロックした。該ブロットをブロッキング溶液から除去し、Ｔｒｉｓ緩衝液で２回洗浄した。抗マウスＩｇＧ抗体ストック溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−３％ ＢＳＡ溶液で１０００倍に希釈することにより調製したヤギ抗マウスＩｇＧ溶液を、該ブロットに添加し、２〜８℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、該ブロットを５分毎にＴｒｉｓ緩衝液を４回交換することで洗浄した。抗ヤギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲートを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−３％ ＢＳＡ溶液で５０００倍に希釈することにより調製した抗ヤギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート溶液を、該ブロットに添加し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該ブロットを５分毎にＴｒｉｓ緩衝液を４回交換することで洗浄した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩／ニトロ−ブルーテトラゾリウムクロリド）基質を、１０ｍｌ同時に該ブロットに添加した。ブロットを揺動させながら室温で現像した。Ｔｒｉｓ緩衝液でブロットをリンスすることにより反応を停止させた。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて前記手法を繰り返した。
抗マウスＩｇＧ試薬を用いる非還元および還元の両条件下で、０．５１μｇおよび１．０９μｇのＩｇＧ試料が、該ニトロセルロースブロット上で明確に検出された。バンドの強度は、濃度が増加するにつれて増加した。非還元条件下で、２００，０００ダルトンマーカーよりもわずかに速く移動する主要なバンドが検出された。また、いくつかのより弱いバンドも検出された。これらのバンドのうちの２つは、主要バンドよりも遅く移動し、他の３つのバンドは概ねより速く移動した。還元条件下では、免疫グロブリンＧの重鎖および軽鎖の特徴を有する２つのバンドが検出された。
非還元および還元の両条件下で抗ヒトＩｇＧ試薬を用いて、０．５１μｇおよび１．０９μｇのＩｇＧ試料を該ニトロセルロースブロット上で明確に検出した。バンドの強度は、濃度が増加するにつれて増加した。非還元条件下で、２００，０００ダルトンよりもわずかに小さい見かけ上の分子量マーカーを有する種に相当する主要バンドが検出された。また、抗マウスＩｇＧで検出され、該ブロットで観察されたより弱いバンドも検出された。免疫染色の強度は、抗ヒトＩｇＧで検出した際のすべてのバンドに対してより強かった。他のブロットでは観察されないいくつかの追加のバンドが検出された。これらのバンドは、抗マウスＩｇＧで認識されるエピトープを欠くＩｇＧ断片に相当すると思われる。還元条件下では、免疫グロブリンＧの重鎖の特徴を有するバンドが検出された。該抗体はヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的であったので、軽鎖は検出されなかった。抗ヒトＩｇＧで検出を行なった際に、抗マウスＩｇＧで現像したブロットでは見られないいくつかのマイナーバンドが観察された。２つのブロット間のこの相違は、抗マウスＩｇＧ結合に対するエピトープを欠くＩｇＧ断片の存在の結果であろう。
３．等電点電気泳動
ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供し、コロイドクーマシーブルーで染色した。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に対して得られた結果を、同一のゲルで泳動したＩＥＦ標準と比較した。
０．８２ｍｇ／ｍｌの公称濃度のＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を８０μｌ、微量濃縮器に加えた。抗体が入っているクエン酸緩衝液を、１６０μｌのＴｒｉｓ緩衝液（０．５ｍＭ、ｐＨ８．８）で３回交換した。試料の最終容量は、１３５μｌであった。最終濃度は、０．４８６ｍｇ／ｍｌであると計算された。この溶液を、２Ｘ ＩＥＦ試料緩衝液で２倍に希釈して、０．２４３ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。３．１６μｇの蛋白質を生ずる０．２４３ｍｇ／ｍｌ溶液に対して１３μｌのアリコートを、ＩＥＦゲルの指定された試料の上に負荷した。対照のアーティクルは、ＩＥＦ標準ｐＩ３．６〜９．３を含んでいた（Sigma、Cat #I-3018）。
標準プロットは、８つのＩＥＦ標準の相対的な移動距離の平均をこれらの標準蛋白質のそれぞれに関して公知のｐＩに対してグラフ化することにより作成した。これらのデータの回帰直線に適合させることにより、０．０３４５９の負の傾斜と８．９１８５７の切片を得た。該適合のＲ²は、０．９９２０６に等しかった。
表６は、６つのＩＥＦ標準およびＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１により移動した平均の距離を含む。また、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に関して計算されたｐＩもこの表に示す。
標準プロット由来の直線回帰パラメーターを用いて、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に関する５つのバンドの概略ｐＩ値は、８．０９のｐＩ値で表される優勢なピークとともに、７．８８、７．９５、８．０９、８．２６および８．４３であると計算された（表６）。この主要ピークのｐＩ値は、一次アミノ酸配列に基づく予想ｐＩ値７．９１に都合よく匹敵する。

４．アミノ酸組成分析
アミノ酸組成分析を、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１の蛋白質含有量およびアミノ酸組成を決定して同一性を確認するために行なった。
まず、三連の４５μｌアリコートを加水分解用に取り除いた。加水分解は、６Ｎ ＨＣｌ蒸気を用いて１６５℃で６０分間行なった。対照として、加水分解容器は、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１と同時に加水分解される標準蛋白質を含んでいた。また、アミノ酸標準は、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１分析の前後にクロマトグラフィーに付した。対照のアーティクルは、標準蛋白質としてウシ血清アルブミン（Tektagen Solution Control:310:197A）、およびアミノ酸標準としてアミノ酸加水分解混合物（Tektagen Solution Control:310:199A）を含んでいた。
試験方法には、カラム後ニンヒドリン反応および２波長での吸光度のモニターを伴うイオン交換ＨＰＬＣによる再懸濁した蛋白質加水分解物または遊離のアミノ酸溶液の分析を用いた。両波長での吸光度は、三連でアミノ酸標準を分析することにより得られた校正表と比較して定量化した。
表７にアミノ酸組成を示す。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１の蛋白質濃度は、０．７０９ｍｇ／ｍＬであると決定された。ＷおよびＣの定量の欠如に関する補正に基づいて、蛋白質濃度を、０．７４０ｍｇ／ｍＬに修正した。データおよび直接関係のある計算値を表８に要約する。
ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１に関しては、１６５℃で６Ｎ ＨＣｌ蒸気を用いる単一の加水分解時点（６０分）を行なった。標準蛋白質（ＢＳＡ）に由来する補正係数を、蛋白質含有量の決定に適用した（表８）。
この方法の条件下では、ともに溶出するシステインのピークの存在により、プロリンに関して得られたモルパーセント値（表７）がわずかに高くなるかもしれない。その結果として、プロリンの定量の精度は試料に依存し、試料加水分解物中に存在するシステインの量に基づく。この分析に関して、プロリンの含有量を、ＢＳＡ由来の補正係数を用いて補正した（表８）。この補正の精度は試料に依存し、ＢＳＡ（６．０％）および試料中のシステインの相対量に基づく。
重鎖および軽鎖のヌクレオチド配列に基づき、相対パーセント（頻度またはモルパーセント）としてのＬＤＰ−０２の予想アミノ酸組成（予想％）ならびにアミノ酸分析の実際の結果（実測％）を表９に示す。予想値対実測値の比較は、前記したようにプロリンがともに溶出するシステインのピークにより人為的に高いと思われることを除いて、良好な相関を示す。

５．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析
ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析して、分子量を決定した。１４９，８０８Ｄａを中心とする質量を有する主要ピークが検出された。７４，９２７Ｄａを中心とするピークは、主要ピークに見出される種の＋２イオンを表す。＋２イオンの質量は、Ｍ＋Ｈイオンのちょうど半分ではないことに注目すべきであり；このわずかな格差は実験上の不正確さにより生ずると思われ、これは測定値の+/- ０．２％以内である。
抗体の予測された一次配列に基づくと、予想された分子質量は、１４７，１５４Ｄａであるべきである。観測されたおよび予測されたＩｇＧ分子質量の間の２，６５４Ｄａという質量の差は、該分子のグリコシル化によることが最も蓋然性が高いといえる。この観測された差は、約１．８％のグリコシル化レベルを表す。
Ｂ．アフィニティー
まず、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１およびネズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃２）の滴定を、ヒト由来のＨＵＴ−７８細胞でフローサイトメトリーを用いて行なった。要約すると、１．０ｘ１０⁶個のＨＵＴ−７８細胞を、ビオチニル化ネズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃２）、ビオチニル化ネズミＩｇＧ１（LeukoSite,Inc.で作られたＬｏｔ＃１）、ビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１またはビオチニル化ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch,Avondale,PA;Lot 25794）のいずれか１００μｌの容量に４℃で２０分間懸濁した後、抗体を除去した。特に示さない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで希釈した。両抗体に対する濃度変化には、３０μｇ／ｍｌ（ネズミＡＣＴ−１のみ）、１５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌおよびそれぞれの続く１：１０希釈が含まれた。一次抗体の除去後、次に、該細胞を、１：２００に希釈した１００μｌのストレプトアビジンフィコエリスリン（Dako Corp.,Carpinteria,CA）に懸濁した。２００μｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍのレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.,San Jose,CA）で分析した。各試料に対して、最小限１０，０００個の細胞を分析し、最大平均チャンネルフルオレッセンス（ＭＣＦ）の半値を計算した。すべての試料は、二連で行なった。
これらの滴定研究により、約１．０μｇ／ｍｌの濃度で、ネズミＡＣＴ−１およびＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１の両方を用いて最大の蛍光に近づくことが示唆された（図１５）。最大平均チャンネルフルオレッセンスの半値は、ネズミＡＣＴ−１よりもＬＤＰ−０２の方が低い濃度で達成された（それぞれ、ビオチニル化ネズミＡＣＴ−１Ｌｏｔ＃２に対して０．１μｇ／ｍｌおよびＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃に対して０．０２μｇ／ｍｌ）。
アフィニティー（および特異性）の相対的評価は、フローサイトメトリーならびにＬＤＰ−０２およびネズミＡｃｔ−１抗体の交差競合結合を用いて、逆にヒト由来のＨｕＴ−７８細胞で行なった。要約すると、１．０ｘ１０⁶個のＨｕＴ−７８細胞を、種々の濃度の非コンジュゲート化１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１または非コンジュゲート化ネズミＡｃｔ−１のいずれかと０．１μｇ／ｍｌのビオチニル化ネズミＡｃｔ−１（Ｌｏｔ＃２）の１００μｌに、４℃で２０分間懸濁した後、抗体を除去した。別々の実験において、１００μｌの０．０２μｇ／ｍｌのビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１を、種々の濃度の非コンジュゲート化ネズミＡＣＴ−１（Ｌｏｔ＃２）および非コンジュゲート化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１とともに用いた。一定に保たれたビオチニル化抗体の濃度は、前記したように、同一の条件下で染色したＨＵＴ−７８細胞での最大平均チャンネルフルオレッセンス（ＭＣＦ）の半値で得られた濃度であった。特に示さない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで希釈した。両抗体に対する濃度変化は、２．０Ｘ１０^-6Ｍ〜５．０Ｘ１０^-11Ｍの対数増加の半値にわたっていた。一次抗体の除去後、次に、該細胞を、１：２００に希釈した１００μｌのストレプトアビジンフィコエリスリン（Dako Corp.,Carpinteria,CA）に懸濁した。２００μｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍのレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.,San Jose,CA）で分析した。各試料に対して、最小限１０，０００個の細胞を分析し、ＭＣＦを計算した。すべての試料は、二連で行なった。ＩＣ₅₀は、ビオチニル化ホモログ抗体からＭＣＦで５０％の低下を生ずる非コンジュゲート化抗体の濃度として決定された。
アフィニティーの見積もりは、ＬＤＰ−０２（１°ＨＵＭ ＡＣＴ−１）とネズミＡＣＴ−１との間の５つの独立した交差競合実験で行なった。ビオチニル化ネズミＡｃｔ−１を該アッセイで一定に保つ抗体として用いた場合、ＬＤＰ−０２に対する平均ＩＣ₅₀値（±１ ＳＥＭ）（５．４３±０．８６ｎＭ）は、ネズミＡＣＴ−１に対するもの（７．９４±１．１７ｎＭ；ｐ＝．０２、両側ｔ−検定：平均に対して対の２個の試料）よりも統計学的に低く、一方、無関係なヒトＩｇＧ１またはネズミＩｇＧ１は、競合的効果を有していなかった（すべての実験を表１０に要約する；１つの実験を図１６に示す）。同様に、ビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１が該アッセイで一定に保たれた抗体である場合、ＨｕＴ−７８細胞膜からＬＤＰ−０２を競合除去するのにＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１よりも高い濃度の非コンジュゲート化ネズミＡｃｔ−１を要した（それぞれ、ＩＣ₅₀＝６．３ｎＭ対４．３ｎＭ）。各実験において、ＬＤＰ−０２は、ネズミＡｃｔ−１よりも低いＩＣ₅₀を有した。これらの結果は、ＬＤＰ−０２がネズミＡｃｔ−１により認識されるエピトープこ対して特異的であり、その結合アフィニティーがネズミ抗体のものよりも良好であったことを示唆する。

Ｃ．種の交差反応性
フローサイトメトリーを用いて、種の交差反応性を評価した。ヒト、イヌ、ネコ、モルモットまたはラットから採取した１００μｌのＥＤＴＡ抗凝固血を、ＦＡＣＳチューブに加えた。血漿を除去し、次いで、血液ペレットを、１５μｇ／ｍｌの濃度でビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／ＬＯＴ＃１、無関係なビオチニル化ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch,Avondale,PA）、ビオチニル化ネズミＡｃｔ−１ Ｌｏｔ＃２または無関係なビオチニル化ネズミＩｇＧ１（Dako Corp.,Carpinteria,CA）のいずれか１００μｌ中に再懸濁した。特に示さない限り、すべての試薬は、０．１５Ｍ ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳ／０．１％アジ化ナトリウムで希釈した。試料を４℃で２０分間抗体とともにインキュベートした後、該抗体を洗浄により除去した。次いで、細胞を４℃で２０分間、１：２００に希釈したストレプトアビジンフィコエリスリン（Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham,AL）１００μｌとともにインキュベートした。次いで、赤血球を、製造業者のプロトコールに従って、市販の溶解試薬（FACS Lysing Solution,Becton Dickinson,San Jose,CA）を用いて溶解した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は、フィコエリスリンを励起させるために４８８ｎｍのレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.,San Jose,CA）で分析した。リンパ球捕捉ゲートを前方に９０度の光散乱パラメーターでセットした。各試料に対して、１０，０００個の細胞を分析した。
ビオチニル化ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１は、ネズミＡｃｔ−１で生じたものと類似で、ヒトまたはネズミアイソタイプ適合対照での染色により生じたパターンとは異なる異質の染色パターンでヒトリンパ球の亜集団を認識した。さらに、イヌまたはネコ由来のリンパ球で調べたとき、ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１およびネズミＡｃｔ−１は両方とも、ヒトリンパ球を用いて派生したものと類似の異質な染色パターンを生じた。ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１またはネズミＡＣＴ−１は、これらの条件下でラットまたはモルモット由来のリンパ球を認識しなかった。
Ｄ．Ｃ１ｑ結合
以前に記載された技術（シムズら、J.Immunol.151:2296-2308（1993））を用いて、フローサイトメトリーを使用してＬＰＤ−０２のヒト補体成分Ｃ１ｑを結合する能力を評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度分離により単離した。まず、３７５，０００個の細胞を４℃で１０分間、１０％正常ウサギ血清／ＰＢＳでブロックした。洗浄による除去の後、該細胞を、１０μｇ／ｍｌの（ａ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Therapeutic Antibody Center,Cambridge,U.K.）、（ｂ）ヒトＩｇＧ１（Sigma Chemial Co.,St.Louis,MO）、（ｃ）ＬＤＰ−０１（２個のアミノ酸置換をＩｇＧ１重鎖定常領域に含み（Ｌｅｕ₂₃₅→Ａｌａ₂₃₅およびＧｌｙ₂₃₇→Ａｌａ₂₃₇）、また、「ＦｃＲｍｕｔ ＣＤ１８」とも称する、国際公開第９３／０２１９１号パンフレット（１９９３年２月４日公開）およびシムズら、J.Immunol.151（4）:2296-2308（1993）に記載された抗ＣＤ１８抗体の誘導体、Therapeutic Antibody Center,Cambridge,U.K.）、または（ｄ）ＬＤＰ−０２（１°Ｃ ｈｕｍ ＡＣＴ−１ Ｌｏｔ＃８／９）のいずれか１００μｌとともに、４℃で２０分間インキュベートした。ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈを陽性対照抗体として供し、一方、ＬＤＰ−０１およびヒトＩｇＧ１を陰性対照抗体として用いた。すべての試薬を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した。追加の陰性対照として、２％ＢＳＡ／ＰＢＳも単独で加えた。次いで、抗体を洗浄により除去し、細胞を４℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌのヒト補体成分Ｃ１ｑ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）５０μｌに再懸濁した。次いで、細胞を洗浄して、２０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ウサギ抗ヒトＣ１ｑ抗体（Dako Corp.,Carpinteria,CA）１００μｌに４℃で２０分間再懸濁した。２００μｌのＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／１％ホルマリンに再懸濁し、分析するまで冷凍した。試料は、ＦＩＴＣを励起させるために４８８ｎｍのレーザーを用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson Corp.,San Jose,CA）で分析した。各試料について、最小限１０，０００個の細胞を分析し、平均チャンネルフルオレッセンス（ＭＣＦ）を計算した。
ヒトＰＢＭＣを、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ結合ヒトＣ１ｑとともにインキュベートし、ＭＣＦで有意なシフトが生じたが、ＰＢＭＣのＬＤＰ−０１、ＢＳＡまたはヒトＩｇＧ１とのインキュベーションにより誘発された染色パターンはすべて類似しており、相対的に低いバックグランド染色を特徴とした。ＬＤＰ−０２とのＰＭＢＣのプレインキュベーションにより生じた染色のパターンは、これらの陰性対照試料で生じたものと同一であり、ＬＤＰ−０２はこれらの条件下ではＣ１ｑを結合しないことを示唆した。
Ｅ．補体介在溶解
ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１の補体介在細胞溶解に関与する能力を、ビンドン（Bindon,C.I.）ら（Transplantation,40:538-544（1985））により以前に記載されたプロトコールを用いて調べた。ヘパリン処理したヒト血液を無菌的に吸引し、血漿を回収してすぐに氷上に置いた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、密度１．０７７ｇ／ｍｌの層に重層して１５分間遠心分離することにより単離し、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン／２．０ｍＭ Ｌ−グルタミンからなる完全培地で２回洗浄した。次いで、２５００万個の細胞を３７℃で１時間、１５０μＣｉの⁵¹クロム酸ナトリウム（E.I.du Pont de Nemours & Co.Inc.,Wilmington,DE）の滅菌塩水中でインキュベートした。細胞を培地で２回洗浄し、１０⁶／ｍｌに再懸濁した。次いで、培地中に５０、２５、５、２．５および０．５μｇ／ｍｌの濃度の（ａ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Therapeutic Center,Cambridge,U.K.）、（ｂ）ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇ（Therapeutic Center,Cambridge,U.K.）、（ｃ）ヒトＩｇＧ１（Sigma Chemial Co.,St.Louis,MO）、（ｄ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１、または（ｅ）ＬＤＰ−０１（ＦｃＲｍｕｔ ＣＤ１８、Therapeutic Antibody Center,Cambridge,U.K.（前記参照のこと））のいずれか１００μｌを含むＵ底マイクロタイタープレートのウエルに、５０μｌの懸濁物（５．０ｘ１０⁴個の細胞）を添加した。ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体を陽性対照抗体としてアッセイに用い、一方、ヒトＩｇＧ１およびＬＤＰ−０１を陰性対照として用いた。追加のウエルは、完全培地中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ）の１００μｌに懸濁した細胞を含んでいた。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００とインキュベートした細胞を用いて全放出を測定し、一方、抗体を含まない対照ウエルを用いて自発放出を測定した。室温で１５分間のインキュベーション後、補体供給源として５０μｌの自己血漿を各ウエルに添加して２０％の最終濃度とした。該細胞を３７℃で４５分間インキュベートし、次いで、１００ｇで２分間遠心分離し、１００ｕｌの上清を回収した。放出された⁵¹Ｃｒは、ＣｏｂｒａIIガンマカウンター（Packard Instruments,Downers Grove,IL）で測定した。すべての試料は、二連で行なった。特異的⁵¹Ｃｒ放出パーセントは、式：

を用いて計算した。
ビンドン（Bindon）ら（Transplantation,40:538-544（1985））により以前に報告されたように、ＣＡＭＰＡＴＨ−１ＨおよびＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇは両方とも、用量に依存した様式でヒトＰＢＭＣの補体介在溶解を３５％まで誘発した。さらに、予想されたように、ヒトＩｇＧ１およびＬＤＰ−０１（Ｆｃ−ｍｕｔ ＣＤ１８）対照は、いかなる検出可能な細胞溶解をも誘発しなかった。ＬＤＰ−０２は、２５μｇ／ｍｌまでを含む調べたいかなる濃度でも細胞溶解を仲介しなかった（図１７）。
Ｆ．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ヒトＣＤ３＋芽球を標的細胞として用い、ＬＤＰ−０２の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を評価した。ＣＤ３＋芽球は、ＰＢＳで５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した抗ＣＤ３抗体ＲＴ６６で被覆した２４ウエルプレートで生成した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）は、フィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）、密度１．０７７ｇ／ｍｌの層に重層して１５分間遠心分離することにより単離し、前章で記載したように、完全培地で洗浄および再懸濁した。次いで、２００万個の細胞を２４ウエルプレートの各ウエルに加え、３７℃、５％ＣＯ₂で４日間インキュベートした。次いで、細胞をカルチャーフラスコに移し、１０ユニット／ｍｌの濃度のヒト組換えＩＬ−２（Genzyme Corp.,Cambridge,MA）を含む培地で、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。培養３日後、次に、１０．０ｘ１０⁶個のＣＤ３芽球を３７℃で４５分間、１５０μＣｉの⁵¹クロム酸ナトリウム（E.I.du Pont de Nemours & Co.Inc.,Wilmington,DE;Lot#95M682）の滅菌塩水中でインキュベートした。完全培地で２回洗浄した後、細胞を２ｘ１０⁵細胞／ｍｌになるように再懸濁し、５０μｌの懸濁物（１０，０００個の細胞）をＵ底９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルに加えた。該ウエルは、培地中に５０、５、２．５、０．５、０．２５または０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度のＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（Therapeutic Antibody Center,Cambridge,U.K.）またはＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１のいずれか５０μｌを含んでいた。細胞を室温で３０分間抗体とともにインキュベートした後、異なるドナー由来の０．５ｘ１０⁶個の新たに単離したＰＢＭＣ（ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配、３７℃で完全培地で２回洗浄）をエフェクター細胞として各ウエルに加えた（５０：１のエフェクター：標的比）。追加のウエルには、培地中５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ）の１００μｌを加えた。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００とインキュベートした細胞を用いて全放出を測定し、一方、抗体およびエフェクター細胞を含まない対照を、自発放射能放出を測定するために算入した。細胞を室温で１００ｇ、２分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ₂で２０時間インキュベートした後、細胞をＶ底９６ウエルプレートに移し、室温で沈澱させた。１００μｌの上清を回収し、放出された放射能をＣｏｂｒａIIガンマカウンター（Packard Instruments,Downers Grove,IL）で測定した。すべての試料は、二連で行なった。特異的⁵¹Ｃｒ放出パーセントは、式：

を用いて計算した。
シムズら、J,Immunol.,151（4）:2296-2308（1993）により以前に示されたように、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈは、用量に依存した様式でＡＤＣＣに関与し、５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度で約３０％までの特異的⁵¹Ｃｒ放出を誘発した。調べたいかなる濃度でもＬＤＰ−０２を含むウエルでは特異的放出を検出しなかった。
Ｇ．ＭＡｄＣＡＭ−１への接着阻害
α４β７のＭＡｄＣＡＭ−１への結合を阻害するＬＤＰ−０２の能力は、蛍光標識したα４β７＋ＲＰＭＩ８８６６細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（Ｆｃ変異ＬＤＰ−０２の定常領域を作製するために用いた同じ構築物由来の定常領域）に融合したヒトＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを含有するＭＡｄＣＡＭ−１キメラを用いて評価した。
１．ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧキメラの構築
ｐｃＤｈｕＭＡｄ４と称するヒトＭＡｄＣＡＭ−１クローン（ｐＣＤＮＡ３中のクローン４ｃＤＮＡ；シジャン（Shyjan,A.M.）ら、J.Immunol.,156:2851-2857（1996）；その教示は、参照によりそのまま本明細書に取り込まれる）を、１９９５年２月１０日に出願された米国出願第０８／３８６，８５７号明細書の一部継続出願である、１９９５年９月１日に出願された米国出願第０８／５２３，００４号明細書の一部継続出願である、１９９６年２月１２日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２１５３（国際公開第９６／２４６７３号パンフレット）に記載されたように、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の細胞外領域のＰＣＲ増幅用の鋳型として用い、ヒトＩｇＧ１の定常領域と融合させた。ＭＡｄＣＡＭ−ＩｇＧキメラを構築するために、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１コーディング配列の５’末端（ＡＴＧコドン、太字）を含むプライマーＨＵＭＡＤＩＧ４／２（配列番号：６２）を合成した：

この５’プライマーは、ＨＵＭＡＤＩＧ３と称する３’プライマーと合わせて用い、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインをコードする領域を増幅した。３’プライマーＨＵＭＡＤＩＧ３（配列番号：６３）は、下記配列を有する：

示したように、５’ＨｉｎｄIII部位または３’ＳｐｅＩ部位を有するプライマーを設計した。これらのプライマーを使用して、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（San Diego,CA）製のＰＣＲオプティマイザーキットを用いてＭＡｄＣＡＭ断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩで消化して、クローニング用末端を生成させ、グラスマックス（Ｇｌａｓｓｍａｘ）ＤＮＡ単離システム（Gibco,Bethesda,MD）を用いるゲル電気泳動により精製した。
ＣＨ１、Ｈ（ヒンジ）、ＣＨ２およびＣＨ３領域を包含する約１ｋｂの断片を、Ｆｃ変異ヒト定常領域を有するヒト免疫グロブリンγ１重鎖をコードする構築物からＳｐｅＩとＥｃｏＲＩとの消化により切り出した。その教示がそれぞれ参照によりそのまま本明細書に取り込まれる、シムズら（J.Immunol.,151:2296-2308（1993））およびウォルトマンら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット １９９３年２月４日（第２３頁））により記載されたように、この構築物中のヒト定常領域は、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ重鎖（ライヒマンら、Nature,322:323-327（1988））のＰＣＲ増幅により得られたものに相当する。この構築物の定常領域中の変異（Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷）は、ヒトＦｃγレセプターへの結合を低下させるように設計され、オリゴヌクレオチド特異的変異導入により生成された。したがって、生成したＭＡｄＣＡＭ−Ｉｇ融合体は、Ｌｅｕ²³⁵→Ａｌａ²³⁵およびＧｌｙ²³⁷→Ａｌａ²³⁷変異の導入を除いて、シムズら（J.Immunol.,151:2296-2308（1993））およびウォルトマンら（国際公開第９３／０２１９１号パンフレット）により記載されたＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ定常領域断片を含む。
Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域をコードする１ｋｂのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｇｌａｓｓｍａｘ ＤＮＡ単離システム（Gibco,Bethesda,MD）を用いるゲル電気泳動により単離した。この定常領域断片およびＭＡｄＣＡＭの全細胞外ドメインを含むＨｉｎｄIII−ＳｐｅＩ断片を、ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで消化しておいたベクターｐＥＥ１２（ステファンズ（Stephens,P.L.）とコケット（M.L.Cockett）、Nucl.Acids Res.,17:7110（1989）およびベビングトン（Bebbington,C.R.）とヘンチェル（C.C.G.Hentschel）、1987、哺乳動物細胞におけるクローン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの利用、（Academic Press,N.Y.）に三部ライゲーションで連結した。細菌株ＤＨ１０Ｂの形質転換体を得た。コロニーを生育させ、ミニープラスミドプレップを制限マッピングにより分析した。Ｆｃ変異ＩｇＧ１定常領域に融合したＭＡｄＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを含有する融合蛋白質をコードする構築物（構築物ＨｕＭＡｄＩｇ２１）を、全ＭＡｄＣＡＭ−１部分にわたってシーケンスし、セグメントが適切に融合していることおよびＰＣＲで誘導した変異がないことを確認した。キメラをＮＳＯ細胞で生成させ、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
２．接着アッセイ
高結合型平底９６ウエルプレート（Costar）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５で２．５μｇ／ｍｌに希釈した５０μｌのＭＡｄＣＡＭ−１キメラを用いて、３７℃で１時間被覆した。次いで、マイクロプレート自動洗浄機（Bio-Tek Instruments,Winooski,VT）を用いて、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ₂、ｐＨ７．２）で１回ウエルを洗浄し、ＰＢＳに希釈した１０％ＦＢＳ１００μｌで、３７℃で１．５時間ブロックした。
まず、ＲＰＭＩ８８６６細胞（α４β７を発現する（そしてα４β１を発現しない）ヒトＢリンパ腫細胞株（アール（Erle,D.J.）ら、J.Immunol.,153:517（1994）；アール博士から供与））を２０ｍｌのＰＢＳ（４℃）で洗浄し、ＰＢＳ中４．０ｘ１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁した。ＢＣＥＣＦ（２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（アンド６）−カルボキシフルオレッセイン，アセトキシメチルエステル；Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR）を、ＤＭＳＯ中５０μｇ／ｍｌに再構成し、１：５００の最終希釈になるように細胞懸濁物に加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、次に、細胞をアッセイ緩衝液（２％ウシ胎仔血清を含むＨＢＳＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２）で洗浄し、Ｖ底９６ウエルプレートの各ウエルに５０，０００個の細胞を加えた。次いで、細胞を、アッセイ緩衝液中に１５．０〜０．０００７５μｇ／ｍｌの濃度の（ａ）ネズミＡｃｔ−１、（ｂ）ネズミＩｇＧ１（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）、（ｃ）ＬＤＰ−０２／３Ａ９／Ｌｏｔ＃１、または（ｄ）ヒトＩｇＧ１（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）のいずれか１００μｌに室温で１０分間再懸濁した。ＭＡｄＣＡＭ−１キメラで被覆したプレートを洗浄してブロッキング緩衝液を除去し、次いで、これらの蛍光標識されたＲＰＭＩ８８６６細胞を各ウエルに移した。該プレートをアルミホイルで覆って、室温で３０分間、４０ＲＰＭのプラットホーム振盪機（New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,NJ）上に置いた。未結合の細胞を１回の洗浄工程で除去し、続いて洗浄前後に、フルオレッセンス コンセントレーター アナライザー（Fluorescence Concentrator Analyzer）（IDEXX Laboratories,Inc.,Westbrook,ME）で蛍光を測定した（４８５ｎｍで励起、５３５ｎｍで読む）。各ウエルについての結合した細胞のパーセントは、式：

を用いる相対蛍光単位（ＲＦＵ）から計算された。
ＬＤＰ−０２およびネズミＡｃｔ−１の両方は、用量に依存した様式で、ヒトＭＡｄＣＡＭへのＲＰＭＩ８８６６細胞の接着を阻害した（図１８Ａ〜１８Ｂ）。５０％接着を阻害する濃度（ＩＣ₅₀）は、ネズミＡｃｔ−１（０．００１８μｇ／ｍｌ）およびＬＤＰ−０２（０．００１４μｇ／ｍｌ）に関して相対的に類似していた。したがって、ＬＤＰ−０２は、少なくともネズミＡｃｔ−１と同じ程度に有効にＭＡｄＣＡＭ−１へのα４β７介在接着を機能的に阻害した。
実施例５ 追加のヒト化抗体
前記したように、実施例２で設計された再形成抗体のいくつかの変異を作製してアフィニティーを改良することおよび／または再形成抗体の抗原性を減少させることができる。かかる構築物は、１以上の下記変異：軽鎖のＭ４Ｖ変異、重鎖のＲ３８Ｋ変異、重鎖のＡ４０Ｒ変異および重鎖のＩ７３Ｔ復帰突然変異を有するものを含むがこれに限定されるものではない。変異体は、独立して（例えば、１つの鎖に１つの変異）または種々の組合せで生成させることができる。
例えば、図１９は、再形成抗体（実施例２で設計された）または軽鎖に１つの追加の変異（ＭＶ４）および重鎖に２つの追加の変異（Ｒ３８Ｋ、Ａ４０Ｒ）を有する誘導体を用いたＨｕＴ７８染色の結果を示す。これらの２つの抗体は、ＨｕＴ７８細胞で類似の染色パターンを示す（図１９）。該変異は、製造業者の提案するプロトコールに従って、トランスフォーマー サイト−ディレクテッド ミュータゼネシス キット（Clontech）を用いて核酸配列を変化させることにより作製した。重鎖および軽鎖可変領域の両方の変異は、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ^TMにクローニングされた可変領域で作製された。トランスオリゴＳｃａＩ／ＳｔｕＩ（Clontech）をトランスオリゴ用に用いた。変異誘発オリゴの配列（配列番号：３８〜４０）は、下記のようであった：

発現ベクターｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２へのサブクローニングならびに重鎖および軽鎖遺伝子の両方を含む発現プラスミドの構築を含む他のすべての操作は、最初の再形成抗体に関する記載と同様であった。また、一過性のトランスフェクションおよび細胞染色も最初の再形成抗体に関する記載と同様になされた。
均等物
当業者であれば、単なる日常的な実験方法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲の範疇に含まれることを意図されている。

Claims (15)

1. 非ヒト起源の軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の軽鎖可変領域に由来する枠組み領域ならびに非ヒト起源の重鎖可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の重鎖可変領域に由来する枠組み領域を含有する抗原結合領域を含有してなり、該相補性決定領域が以下：
   軽鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１２のアミノ酸４４−５９
   ＣＤＲ２ 配列番号：１２のアミノ酸７５−８１
   ＣＤＲ３ 配列番号：１２のアミノ酸１１４−１２２
   重鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１５のアミノ酸５０−５４
   ＣＤＲ２ 配列番号：１５のアミノ酸６９−８５
   ＣＤＲ３ 配列番号：１５のアミノ酸１１８−１２９
   に示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖が配列番号：２１の可変領域を含有し、重鎖が配列番号：１９の可変領域を含有してなる、α４β７インテグリンを選択的に結合するヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合断片。
2. ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片がネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体の軽鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の軽鎖の可変領域に由来する枠組み領域を含有し、該相補性決定領域が該ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片を含む抗体が選択的にα４β７インテグリンを結合するように、以下：
   軽鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１２のアミノ酸４４−５９
   ＣＤＲ２ 配列番号：１２のアミノ酸７５−８１
   ＣＤＲ３ 配列番号：１２のアミノ酸１１４−１２２
   に示されるアミノ酸配列を含有し、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片が配列番号：２１の可変領域を含有してなる、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片。
3. 請求項２記載のヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含有してなる単離された核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号：２０の可変領域コーディング配列を含有してなる単離された核酸。
4. 請求項２記載のヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含有してなる発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が配列番号：２０の可変領域コーディング配列を含有してなる発現ベクター。
5. ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片がネズミＡｃｔ−１モノクローナル抗体の重鎖の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の重鎖の可変領域に由来する枠組み領域を含有し、該相補性決定領域が該ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片を含む抗体がα４β７インテグリンを選択的に結合するように、以下：
   重鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１５のアミノ酸５０−５４
   ＣＤＲ２ 配列番号：１５のアミノ酸６９−８５
   ＣＤＲ３ 配列番号：１５のアミノ酸１１８−１２９
   に示されるアミノ酸配列を含有してなり、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片が配列番号：１９の可変領域を含有してなる、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片。
6. 請求項５記載のヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含有してなる単離された核酸であって、前記ヌクレオチド配列が配列番号：１８の可変領域コーディング配列を含有してなる単離された核酸。
7. 請求項５記載のヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を含有してなる発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列が配列番号：１８の可変領域コーディング配列を含有してなる発現ベクター。
8. 請求項４又は７記載の発現ベクターを含有してなる宿主細胞。
9. 請求項８記載の宿主細胞をヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖の発現に適した条件下で維持し、それによりヒト化免疫グロブリン軽鎖、ヒト化免疫グロブリン軽鎖抗原結合断片、ヒト化免疫グロブリン重鎖、またはヒト化免疫グロブリン重鎖抗原結合断片を発現させ、産生させ、任意に単離させる工程を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖、ヒト化免疫グロブリン軽鎖抗原結合断片、ヒト化免疫グロブリン重鎖、またはヒト化免疫グロブリン重鎖抗原結合断片の調製方法。
10. ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合断片をコードする第１の組換え核酸およびヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合断片をコードする第２の組換え核酸を含有し、該軽鎖またはその抗原結合断片および該重鎖またはその抗原結合断片を含む抗体または抗原結合断片が選択的にα４β７インテグリンを結合する宿主細胞であって、
    該第１核酸は以下：
    軽鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１２のアミノ酸４４−５９
    ＣＤＲ２ 配列番号：１２のアミノ酸７５−８１
    ＣＤＲ３ 配列番号：１２のアミノ酸１１４−１２２
    に示されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の軽鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含み；
    該第２核酸は以下：
    重鎖：ＣＤＲ１ 配列番号：１５のアミノ酸５０−５４
    ＣＤＲ２ 配列番号：１５のアミノ酸６９−８５
    ＣＤＲ３ 配列番号：１５のアミノ酸１１８−１２９
    に示されるアミノ酸配列を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）の少なくとも１つおよびヒト起源の重鎖に由来する枠組み領域をコードするヌクレオチド配列を含み、第１核酸が配列番号：２１の可変領域をコードし、第２核酸が配列番号：１９の可変領域をコードする、宿主細胞。
11. 請求項１０記載の宿主細胞をヒト化免疫グロブリンの発現に適した条件下で維持し、それによりヒト化免疫グロブリン鎖が発現され、ヒト化免疫グロブリンが産生され、任意に単離される工程を含む、ヒト化免疫グロブリンの調製方法。
12. 治療または診断における使用のための請求項１記載のヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合断片。
13. 請求項１記載のヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合断片、および医薬としての使用のための適当な担体を含有してなる、炎症性腸疾患の治療用医薬組成物。
14. 炎症性腸疾患の治療用の医薬の製造のための請求項１記載のヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合断片の使用。
15. 炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎およびクローン病患者における炎症性腸疾患からなる群より選択される、請求項１４記載の使用。

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