JP4199416B2 - パピローマウイルス・ウイルス様粒子（ｖｌｐ）の解集合／再集合のインビトロ方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、パピローマウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）をカプソメアおよび/またはより小さいサブユニットに解集合し、ＶＬＰに再集合する非常に効率的な手段を提供する。これらの再集合されたＶＬＰ含有組成物は、本発明により生成され、立体配座中和エピトープを発現し、非常に均質であり、よって、パピローマウイルス感染を診断または予防するための有効な診断薬および予防薬を含む。また、本発明は、所望の部分、例えば、診断薬または治療薬の包含のためのＶＬＰの使用および推定されるワクチンまたは治療法の効果を評価するための“プソイドビリオン”としての使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
パピローマウイルスは、ヒトを含む様々な種の動物に感染する。その感染の典型的な特徴は、感染部位に良性表皮および線維性表皮の腫瘍あるいは疣贅（ゆうぜい）を誘発することである。脊椎動物は種別によって、種特異的なグループのパピローマウイルスに感染する。各グループは、いくつかの違った型のパピローマウイルスを含む。例えば、６０種あまりのヒト・パピローマウイルスの遺伝子型が単離されている。パピローマウイルスは高度に種特異的な感染病原体である。例えば、イヌおよびウサギのパピローマウイルスはヒトのような異種組織にパピローマを誘発させることができない。ある一つの型のパピローマウイルスに対する感染を中和する免疫は、たとえその型が相同種を感染するときでも、他の型に対する免疫を付与することは一般的にない。
【０００３】
ヒト・パピローマウイルスは、流行の性感染症である陰部疣贅を引き起こす。ＨＰＶ６型および１１型は、良性の性器疣贅である尖形コンジローマともっとも一般的に関連している。性器疣贅は非常にありふれているが、準臨床的すなわち不顕性のＨＰＶ感染は臨床の感染症よりさらに広くみられる。たいていのＨＰＶ誘発の病変は良性であるが、その一方、ある型のパピローマウイルス、例えばＨＰＶ−１６型およびＨＰＶ−１８型による病変が悪性に進行することがある。さらに、悪性化関連パピローマウイルス型の一つによる感染は、子宮頚部癌の病状進行の重大な危険因子であると考えられている。子宮頚部癌は世界中で女性では第二番目に多い癌である。子宮頚部癌に含まれるＨＰＶの遺伝子型の中で、ＨＰＶ−１６型が最も普通で、同癌の約５０％に検出される。
【０００４】
パピローマウイルス感染、特にヒト・パピローマウイルス感染によってもたらされる重大な健康危険性を考慮して、様々の研究グループが、組換型パピローマウイルス抗原の開発およびその診断薬および予防ワクチンとしての使用法を報告している。一般的にそれらの研究は、メジャーカプシドタンパク質（Ｌ１）のみ、あるいはマイナーカプシドタンパク質（Ｌ２）との組合わせを含有する予防ワクチンの生成に焦点をあてている。例えば、Ghins et al, Virology, 190: 548-552 (1992)では、立体配座エピトーブを示すＣｏｓ細胞中での種痘疹発現を使用したＨＰＶ−１ Ｌ１タンパク質の発現、およびその種痘疹のワクチンとしての使用、あるいは血清分類、または検査のための使用が報告されている。この研究はまた、米国特許出願第０７／９０３，１０９号（１９９２年６月２５日に出願、１９９４年3月２２日出願の同第０８／２１６，５０６号のために放棄）の基本となっており、本出願の譲受人によりライセンスされている。また、Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92: 11553-11557 (1995)に、顆粒病ウイルス／昆虫細胞系に発現した組換えイヌ口頭パピローマウイルス（ＣＯＰＶ）によるイヌの免疫についての報告がある。この系はウイルス性粘膜パピローマの進行が完全に阻害されている。これらの研究結果は、多数のＨＰＶおよびＣＯＰＶの間の顕著な類似性が示されている点で重要である。例えば、ＣＯＰＶは、肛門性器および性器の癌に関連したＨＰＶと類似しており、粘膜部位の損傷に感染して病変を誘発する。また、ＣＯＰＶのＬ１配列は、ＨＰＶ Ｌ１配列との構造的類似性を有する。それらの類似性によって、ビーグル犬ＣＯＰＶモデルは、Ｌ１タンパク質含有ワクチンの研究、例えば感染防御免疫反応、自然感染予防、予防接種適化プロトコールなどの研究に有用である（同上出典）。
【０００５】
また、ロチェスター大学の研究グループによるヒト・パピローマウイルスのメジャーカプシドタンパク質（Ｌ１）およびウイルス様粒子生成についての報告がある。これは顆粒病ウイルス／昆虫細胞発現システムを使用している（Rose et al, University of Rochester, WO 94/20137, published on September 15, 1994）。このグループは、特にＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１型のＬ１メジャーカプシドタンパク質の発現およびＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８型のウイルス様粒子生成について報告している。
【０００６】
さらに、クイーンズランド大学研究グループもまた、パピローマウイルスＬ１および／またはＬ２タンンパク質およびウイルス様粒子の組換体形成と、それらの可能な利用法について報告している。(Frazer et al, WO 93/02189, published on February 4, 1993)。
【０００７】
さらにまた、米国政府の研究グループが、立体配座抗原エピトープを含むカプソメア構造およびウイルス性カプシドに自己集合できる組換体パピローマウイルスカプシドタンパク質について報告している。（米国特許第５，４３７，９５１号、Lowy et al, issued on August 1, 1995）。この特許は、自己集合可能なＬ１タンパク質をコード化する特異的ＨＰＶ−１６ＤＮＡ配列およびそれを使用した上記のＨＰＶ−１６ Ｌ１タンパク質を含む組換体ＨＰＶ−１６カプシドの発現を対象としている。
【０００８】
ワクチン含有のＨＰＶカプシドタンパク質に関して当業者間で広く認識されているのは、ＨＰＶ Ｌ１メジャーカプシドタンパク質依存のワクチンの効能に必要な要件としてのＬ１タンパク質が天然ヒト・パピローマウイルス メジャーカプシドタンパク質によって発現した立体配座エピトープを示すことである（例えば、Hines et al, Gynecologic Oncology, 53:13-20(1994); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 92: 11553-11557 (1995) 参照のこと)。
【０００９】
天然立体配座ＨＰＶ Ｌ１エピトープを呈する非粒子型および粒子型組換ＨＰＶ Ｌ１タンパク質が研究文献に報告されている。Ｌ１は、さまざまなオリゴマー立体配置、例えば（i）Ｌ１タンパク質のペンタマーを成すカプソメアおよび（ii）Ｔ＝７正二十面体構造で７２のカプソメアで構成されたカプシドなどにおいて安定していることが知られている。また、Ｌ１タンパク質がそれだけで、またはＬ２と共に真核細胞中に発現した場合、効果的に自己集合して、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と通常称せられカプシド様構造を呈することが知られている。
【００１０】
ＶＬＰは、形態的、抗原的に真性ビリオンに類似すると報告されている。さらに、ＶＬＰによる免疫処理はウイルス中和抗体の生成を誘発すると報告されている。さらに具体的に、さまざまな動物のパピローマウイルス（イヌ・口腔内パピローマウイルスおよびウシ・パピローマウイルス−４）に関する研究は、ＶＬＰによる免疫処理が連続的パピローマウイルス感染に対する予防となることを示唆している。その結果、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質含有のＶＬＰが、ヒト・パピローマウイルス感染症関連の疾患を予防するワクチンとして使用することが提案されている。
【００１１】
例えば、Ｌ１タンパク質が、組換えバキュロウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターを使用し、組換えイーストにおいて発現されるとき、ＶＬＰに集合し得ることが報告されている（Hagensee et al, J. Virol., 68:4503-4505 (1994); Hofmann et al, Virology, 209:506-518 (1995); Kirnbauer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89-12180-12184 (1992); Kirnbauer et al, J. Virol., 67:6929-6939 (1993); Rose et al, J. Virol., 67:1936-1944 (1993); Sasagawa et al, Virology, 206:126-135 (1995); Suzich et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11553-11557 (1995); Volpers et al, Virology 200:504-512 (1994); Zhou et al, J. Virol., 68: 619-625 (1994)。
【００１２】
真核生物の細胞から単離される先の組換えＬ１製造物はたいてい、直径５５nmに近いＶＬＰの不定な個体群をもたらす。該ＶＬＰは、無傷のビリオンに外観が類似している。しかしながら、ＶＬＰ集合は、ある程度細胞型に感受性である。例えば、Escherichia coliにおいて発現されたＬ１は、細胞においてまたは精製の際のいずれかで明らかなカプシドをわずかに有する、または全く有しないで、カプソメアまたはより小さい形態において、大いに発現される（Rose et al, J. Virol., 67:1936-1944 (1993); Li et al, J. Virol., 71:2988-2995 (1997)）。類似の結果が、ポリオーマウイルスＶＰ１タンパク質がE.coliで発現されたときに観察される（Salunke et al, Biophys. J., 56: 887-900 (1989)）。
【００１３】
現在まで、パピローマウイルスＶＬＰの量的な解集合およびその結果の再集合の有効なインビトロ方法は、報告されていない。このような方法は、より安定なおよび/または均質のパピローマウイルスＶＬＰの製造を潜在的に可能とするので、非常に好都合である。これは、均質性および安定性がともにワクチンの製造および製造の間の特徴化において重要な課題であるので、有益である。さらに、ＶＬＰを解集合および再集合する能力は、ＶＬＰ精製への重要な適合性を有する。真核生物の細胞において発現されたＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、上記のように、自然に集合してＶＬＰを形成する。しかしながら、ほとんどのタンパク質精製工程は、タンパク質を−２０００万ダルトン、５５nmＶＬＰよりもっと小さく精製するように設計されてきた。真核生物の細胞から抽出されたＶＬＰをＬ１カプソメアまたはより小さいレベルまで解集合し、従来の技法によってより小さい成分を精製し、次いで再集合して精製工程の所望の段階でＶＬＰを形成する能力は、非常に強力であり、下記するように、ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰの精製において現在使用されている（ＨＰＶ−１６ Ｌ１タンパク質の変異形態から構成される。Ｃ−末３４アミノ酸がＨＰＶ−１６ Ｌ１タンパク質から欠失された）。最後に、ＶＬＰをインビトロで解集合および再集合する能力は、再集合ＶＬＰ内の所望の外因性化合物のパッケージングをもたらす。
【００１４】
パピローマＶＬＰ解集合における初期の試みには、ポリオーマウイルス、関連パポバウイルスで行われた初期の研究に基づいた実験が含まれる。その研究において、ジスルフィド還元およびカチオンのキレート化の両方ともがビリオン解集合に必要であることが示された（Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977)）。しかしながら、ＨＰＶ ＶＬＰの場合、低レベルのキレート化剤（例えば、０．５−１０mM ＥＧＴＡ）の存在下で最適なポリオーマウイルス解集合を提供する低レベルの還元剤（１−１０mM ＤＴＴ）が、パピローマウイルスＶＬＰの解集合でほんのわずかしか有効でないことが示されている（参照、表１、Li et al, J. Virol., 71:2988-2995 (1997)）。それに反して、部分的にトリプトシン処理されたＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰは、このような条件下で効果的に解離することが報告されている（Li et al, J. Virol., 71:2988-2995(1997)）。しかしながら、これは、プロテアーゼの使用が有害な作用、例えば、中和エピトープの除去をもたらすことがあるので、不都合である。
【００１５】
また、Sappおよび共同研究者は、ＨＰＶ−３３ ＶＬＰの“部分的解集合”は、還元剤（２０mM ＤＴＴ）だけで処理することにより達成できることを明らかにした。しかしながら、ＶＬＰ分解の範囲は、測定されなかった（Sapp et al, J. Gen. Virol., 76:2407-2412 (1995)）。
【００１６】
上記のように、ＨＰＶカプシド集合は、正確な折りたたみＬ１タンパク質を必要とする。しかしながら、ＶＬＰ形成および安定性に重要な付加的要因はよく分かっていない。それに関して、ＶＬＰ集合は、多くの要因に影響を受け得ることが一般的に知られている。例えば、他のウイルスについて集合に影響するとわかっている要因および条件には、例えば：ｐＨ、イオン強度、ウイルス性カプシドタンパク質の翻訳後の修飾、ジスルフィド結合および二価のカチオン結合などがある。例えば、ビリオン整合性の維持におけるカチオン結合、特にカルシウムの重要性が、ポリオーマウイルス（Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977))およびロトウイルス（Gajardo et al, J. Virol., 71:2211-2216 (1997)）について示されている。また、ジスルフィド結合は、ポリオーマウイルス（Walter et al, Cold Spring Har. Symp. Quant. Biol., 39:255-257 (1975); Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977)）およびＳＶ４０ウイルス（Christansen et al, J. Virol., 21:1079-1084 (1977)）の安定化に重要なようである。また、ｐＨおよびイオン強度などの要因が、おそらく静電相互作用に影響を及ぼすことによりポリオーマウイルスカプシドの安定性に影響することが分かっている（Brady et al, J. Virol., 23:717-724 (1977); Salunke et al, Cell, 46:895-904(1986); Salunke et al, Biophys. J., 56:887-900(1980)）。また、いくつかのウイルス性カプシドタンパク質の翻訳後修飾は、カプシド安定性および集合、例えば、グリコシル化、リン酸化およびアセチル化に影響し得ることが分かっている（Garcea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:3613-3617 (1983); Xi et al, J. Gen. Virol., 72:2981-2988 (1991)）。従って、カプシドの安定性、集合および解集合に影響し得る多くの相互関連要因がある。これは関連ウイルスに関してさえも広範に変化するものである。
【００１７】
従って、パピローマウイルスＶＬＰ集合および解集合に影響する要因を解明することが当業者において必要とされている。さらに、それに基づいて、パピローマウイルスＶＬＰの解集合および再集合の効率的なインビトロでの方法が当業者において必要とされている。該方法は、良質の均質性、安定性および免疫原性特性、つまり、天然で無傷のパピローマウイルスビリオンの表面上で発現する立体配座エピトープ、特に中和エピトープを示すもの、を有するＶＬＰをもたらす。さらに、パピローマウイルスＶＬＰの解集合および再集合の方法、部分的なＶＬＰ解集合の問題を取り除き、パピローマウイルスＶＬＰを生成する従来の方法におけるプロテアーゼの使用を回避する方法について重要な必要性がある。
【００１８】
（発明の目的）
本発明の目的は、従来技術の問題を解決することである。
より具体的には、本発明の目的は、パピローマウイルスＶＬＰの解集合および再集合についての新しい方法を提供することである。
【００１９】
さらに具体的には、本発明の目的は、ヒト・パピローマウイルスＶＬＰの解集合および再集合についての新しい方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、多量のパピローマウイルスＶＬＰの定量的解集合および再集合を可能にする方法を提供することでもある。
【００２１】
本発明の他の目的は、パピローマウイルスＶＬＰ含有組成物を提供することであって、好ましくは、改善された質、例えば、均質性、免疫原性および／または安定性を有するヒト・パピローマウイルスＶＬＰ含有組成物を提供する。
【００２２】
本発明の他の目的は、ＶＬＰ精製の改善手段を提供するものであって、精製工程中にＶＬＰの解集合／再集合を組み込むことによってなされる。
【００２３】
さらに、本発明の他の目的は、パピローマウイルスＶＬＰ中に所望の部分、例えば治療薬または診断薬を包含する方法を提供する。
【００２４】
本発明の他の目的は、パピローマウイルスＶＬＰ、好ましくはヒト・パピローマウイルスＶＬＰを提供するものであって、このＶＬＰは所望の治療薬または診断薬、例えば抗癌剤や抗ウイルス剤を含有する。
【００２５】
本発明の別の目的は、ＨＰＶビリオンの再生可能量が現在得られていないＨＰＶウイルス型についての“プソイドビリオン”を生成することである。この目的は、この目的は、Ｌ１およびＬ１／Ｌ２タンパク質を用いて構築されたＨＰＶＶＬＰ中に外因性の化合物、特に該ＨＰＶのゲノムに対応するＤＮＡまたはその断片、またはβ−ガラクトシダーゼなどの選択性マーカーをコードするＤＮＡを、包含せしめることで達成される。
【００２６】
本発明の他の目的は、望む部分、例えばＤＮＡを望む細胞に運送する新しい方法を提供する。この細胞中で該部分、例えばセンスまたはアンチセンスＤＮＡについての運送担体には、パピローマウイルスＶＬＰが含まれる。
【００２７】
本発明の他の目的は、可能性のあるＨＰＶワクチンの効力をアッセイするためのインビトロアッセイにおいてＨＰＶ ＶＬＰに基づくプソイドビリオンを使用することである。このアッセイは、該ＨＰＶに普通に感染した細胞中への、包含されたＤＮＡの挿入を阻害する中和抗体の効力を調べる。
【００２８】
（発明の詳細な記述）
本発明は、インビトロでのパピローマウイルスＶＬＰ、特にヒト・パピローマウイルスＶＬＰの解集合および再集合についての新規方法に関する。
【００２９】
上記したように、パピローマウイルスＶＬＰは、構造性タンパク質Ｌ１から主に構成されている。このタンパク質は５量体カプソメアまたは７２のカプソメアからなるカプシドとして安定である。該ＶＬＰはＬ２タンパク質も含み得る。
【００３０】
特に、実験条件を適切に選択して、本発明者が驚くべき発見したのは、パピローマウイルスＶＬＰの定量的な解集合（ほとんど完全にカプソメアのレベルまで、またはより小さい）および続く再集合が、ＶＬＰを少なくとも１つのスルフヒドリル還元剤を高濃度で含有する、中程度から低度のイオン強度の緩衝液に長時間接触せしめると、確実に達成されることである。特に、この方法は、非常に高均質性の再集合ＶＬＰ含有組成物をもたらす。この組成物は主に完全サイズのＶＬＰ、平均５６.５±７.０（ｎ＝５）と、非常に少量の部分的集合ＶＬＰすなわち小さい複合体を含む。収率も非常に高く、すなわち定量的であり、最適の解集合条件では、出発物質から再集合ＶＬＰへの全Ｌ１タンパク質としての収率は平均８０−９０％である。さらに、特に前に解集合したすべてのカプソメアが再集合して、溶解性の濾過可能な完全サイズのＶＬＰを産生する。
【００３１】
予期せざる結果として、このような条件の使用は均質性が増加したパピローマウイルスＶＬＰ組成物（ＶＬＰ出発物質および入手可能なＶＬＰ組成物に比べて）が得られる。すなわち、均質組成物は、５５nm、１５０ＳであるパピローマウイルスＶＬＰからほとんどすべて構成される。さらに、判明したのは、これらの均質ＶＬＰが立体配座中和ＨＰＶエピトープ、効果的な予防的ＨＰＶのＶＬＰに基づくワクチンに必要なものを提示する。また、驚くべきことに本発明で判明したのは、キレート剤がＶＬＰ解集合を高めないで、カプソメアのＶＬＰへの再集合を阻害し得ることである。より詳細は後記するように、このような発見が驚くべきであるのは、関係パポバウイルス、ポリオマウイルスについて、低レベルのスルフヒドリル還元剤への接触およびカルシウムイオンのキレート化の両方がビリオン解集合に必須であるのが分かったからである。一方、このような条件はパピロマＶＬＰの解集合についてはほとんど効果がない。
【００３２】
さらに判明したことは、本発明により産生されたパピローマウイルスカプソメアおよびＶＬＰ組成物が、無傷のパピローマウイルスビリオンの表面にある構造特異的な（立体配座性）、特に中和エピトープを提示することである。このことは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける構造特異的抗Ｌ１パピローマウイルスモノクローナル抗体との反応性、およびＲＴ−ＰＣＴ感染アッセイにおけるパピローマウイルス感染を中和する抗体の合成を誘導する能力の両方によって示される。従って、これらは、ＰＶ感染を予防するための、および診断目的のための予防薬としての使用に適している。さらに、ＶＬＰ解集合および再集合についての本方法は、種々の程度のＶＬＰ純度で使用できる。このことで、ＶＬＰの粗製混合物の解集合、より小さい可溶性ＶＬＰ成分の精製（非常な減少サイズにより簡単である）、およびその後の、精製工程の望む段階での再集合が可能となる。
【００３３】
また、詳しくは下記するが、本発明方法は、再集合での所望の部分のＶＬＰへの導入を提供する。望ましい部分とは、例えば、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、ホルモン、放射核種、抗癌剤およびウイルス剤がある。これによって好都合にも、該ＶＬＰが、“運送担体”（望む部分を細胞中に挿入するため）として、およびパピローマウイルスワクチンの予防効果を判定するための“プソイドビリオン”として有用である。
【００３４】
本発明者の仮定によると、埋没してアクセス不可能とみられる安定なジスルフィド結合が存在するので、パピローマウイルスＶＬＰ解集合のために、非常に高レベルの還元剤との長時間接触が必要となり、局在的構造上の変動によるこれらの結合の溶媒への暴露が非常に頻繁である。（この現象は詳しく、出願番号０８／８８８,０５０、出願１９９７年７月３日に記載されている）明らかに、高い還元剤濃度および低から中程度のイオン強度での長時間接触で、これらの結合が時間を通じてアクセス可能となる。
【００３５】
定義
メジャーカプシドタンパク質すなわちＬ１タンパク質
ＰＶカプシド構造物のメジャー部分を形成するパピローマウイルス（ＰＶ）の構成タンンパク質を意味する。このタンパク質は、ＨＰＶワクチンの製造において、および診断薬として適用性を有すると報告されている。
【００３６】
マイナーカプシドタンパク質すなわちＬ２タンパク質
ＰＶウイルス性カプシド構造物のマイナー部分を形成するパピローマウイルスの構成タンパク質を意味する。
【００３７】
ウイルス様粒子すなわちＶＬＰ
パピロウイルスＬ１ ＤＮＡ配列の単独で、またはＬ２ＤＮＡ配列との組合せで発現および集合するカプシド様構造物を意味する。ＶＬＰは形態的および抗原的に真正型ビリオンに類似する。ＶＬＰは生体内や適当な宿主細胞、例えば哺乳動物や昆虫の宿主細胞内で生成でき、あるいは組換えＬ１タンパク質の精製時において自然に形成する。
【００３８】
プソイドビリオン
特異なＰＶ型のＬ１およびＬ２タンパク質で構成される外因性マーカー化合物を含むＶＬＰを意味する。プソイドビリオンは、本物のウイルスが入手できないとき、特異なウイルスの標的細胞への結合および/または摂取を遮断する抗体などの物質有効性の試験で使用することができる。。
【００３９】
正しく折り畳まれたＬ１タンパク質
Ｌ１タンパク質（単量体または、小さなオリゴマーの形態(二量体から四量体)カプソマー）を意味する。ＶＬＰ再集合に適切な構造であり、ウイルスカプシドまたはＶＬＰに存在するエピトープを保有する。
【００４０】
カプソメア
Ｌ１ペンタマーから構成されるＬ１タンパク質のオリゴマー立体配置を意味する。
【００４１】
カプシド
カプソメアを含むパピローマウイルスの構造部分を意味する。さらに詳しくいえば、カプシドは、Ｔ＝７正二十面体構造における７２カプソメアから成っている。
【００４２】
立体配座Ｌ１ ＨＰＶエピトープ
正しく折り畳まれたＬ１タンパク質の表面上に発現されたエピトープを意味する。このエピトープは、相応する天然（野性型）感染性ＨＰＶのＬ１タンパク質によっても発現するものである。立体配座エピトープの提示が、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質免疫原の予防薬および診断薬としての両方の効能にとって重要不可欠であることは当業者によく認識されている。
【００４３】
立体配座中和Ｌ１ ＨＰＶエピトープ
正しく折り畳まれたＬ１タンパク質の表面上に発現されたエピトープを意味する。このエピトープは、相応する野性型感染性ＨＰＶのＬ１タンパク質によっても発現し、かつ中和抗体を生成するものである。立体配座中和エピトープの提示が、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質免疫原の予防薬および診断薬としての両方の効能にとって重要不可欠であることは当業者によく認識されている。
【００４４】
立体配座抗体
正しく折り畳まれたＬ１タンパク質であるが変性Ｌ１タンパク質ではないものによって発現したエピトープと特異的に結合する抗体を意味する。
【００４５】
高濃度還元剤溶液
グルタチオン、β-メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールなどのスルフヒドリル還元剤を少なくとも一種類含む溶液を意味し、この溶液は、ＶＬＰが長い時間、少なくとも２時間、さらに好ましくは少なくとも１６時間接触するときに、少なくとも７０％の解集合パピローマウイルスを提供するものである。個々の還元剤に基づいて還元剤の濃度を変えることができる。β-メルカプトエタノールの場合、好ましい量は少なくとも１重量％であり、さらに好ましくは少なくとも３〜５重量％である。ジチオトレイトールの場合は、好ましい量は少なくとも１００ｍＭである。
【００４６】
ＶＬＰの高濃度還元剤溶液への長時間の露出または接触
ＶＬＰが高濃度還元剤溶液と接触する時間を意味し、これは少なくとも７０％の解集合 ＶＬＰをカプソマー中に供給するのに十分なものである。好ましくは、これらの長時間露出は７０〜９０％の解集合をもたらし、および最適には実質的に全量ＶＬＰ分解をもたらす。この時間はＰＶの型によって異なり、またＶＬＰ発現細胞(出発物質)、純度(集合体の有無)、ｐＨおよびイオン強度に依存する。さらに変異または化学修飾Ｌ１タンパク質、すなわちＣ-端部の短いＬ１タンパク質で形成されたＶＬＰは、穏和な条件で分解することができる。一般的に、この露出時間は少なくとも２時間（ＨＰＶ-１６_Tr ＶＬＰの場合）であり、さらに一般的に長い場合は、例えば少なくとも１２時間であり、さらに好ましくは少なくとも１６時間(ＨＰＶ-１１ ＶＬＰの場合)である。
【００４７】
図の詳細な説明
図１：精製ＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析。タンパク質を２mM ＤＴＴの不存在下（レーン１）または存在下（レーン２）でサンプル製造緩衝液と混合し、ゲル電気泳動の前に２分間煮沸した。分子量標準物（Ｄａ×１０^-3で）が遊走した位置を左側に示す。
【００４８】
図２：ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ解集合の３０％スクロースクッション分析。ＨＰＶ−１１製造物を、テキストに記載のように４℃で処理し、ゲル電気泳動の前にサンプルをスクロースクッションの上部（Ｔ）または底部（Ｂ）で採取した。グループ１、非処置、ＰＢＳにおける精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ出発物質。グループ２、５％βＭＥで１６時間インキュベートしたＶＬＰ。グループ３、５％βＭＥで１時間インキュベートしたＶＬＰ。グループ４、２％βＭＥで１６時間インキュベートしたＶＬＰ。グループ５、０．５％βＭＥで１６時間インキュベートしたＶＬＰ。グループ６、１０mM ＤＴＴ、５mM ＥＤＴＡでで１６時間インキュベートしたＶＬＰ。
【００４９】
図３：解集合されたＨＶＰ−１１ ＶＬＰの５−２０％線状スクロース勾配分析。ＰＢＳ中のＶＬＰを５％βＭＥ（ａ）、または２００mM ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６（ｂ）を用いて４℃で１６時間インキュベートし、テキストに記載のように５−２０％線状スクロース勾配上で遠心分離した。勾配を２５フラクション（０．５ml）に集め、０．５ml ＰＢＳにパレット（Ｐ）を再懸濁した。勾配と交わったＬ１タンパク質の位置を示す免疫ブロットを表示する。また、分離勾配上で作動すると沈降標準が遊走するピーク位置を示す。
【００５０】
図４：様々な状態の集合におけるＨＰＶ−１１ ＶＬＰの１０−６５％線状スクロース勾配分析。精製ＶＬＰ出発物質（ａ）のアリコットを５％βＭＥを用いて４℃で１６時間インキュベートした（ｂ）。βＭＥ処置ＶＬＰの一部を透析法によりＰＢＳ−０．５ ＮａＣｌに再集合し、還元剤を除去した（ｃ）。サンプルをテキストに記載のように１０−６５％線状スクロース勾配上で遠心分離した。各々の勾配を１２フラクション（１ml）に集め、パレット（Ｐ）を１ml ＰＢＳで再懸濁した。異なる勾配上でＬ１タンパク質が遊走した位置を示す免疫ブロットを表示する。また、図３のように、沈降標準が遊走するピーク位置を表示する。
【００５１】
図５：種々の状態の集合におけるＨＰＶ−１１ ＶＬＰの電子顕微鏡写真。前述のように処置したＶＬＰを２％リンタングステン酸で染色し、グリッドに適用し、15-25,000倍の培率で撮影した。ａ、精製ＶＬＰ出発物質、ｂ、５％βＭＥを用いて４℃１６時間インキュベートしてカプソメアのレベルに解集合したＶＬＰ、ｃ、透析法により解集合ＶＬＰからＰＢＳ−０．５ＮａＣｌに再集合したＶＬＰ、ｄ、拡大した画像Ｃの中心部分。スケールバー：ａ、ｃ＝２００nm；ｂ、ｃ＝１００nm。
【００５２】
図６：ＨＰＶ−１１構造特異的モノクローナル抗体を有する無傷および解集合ＶＬＰの反応。ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰ出発物質（Ａ）、次いで透析法を行って（Ｂ）、または行うことなく（Ｃ）、５％βＭＥで処置し、還元剤を除去するためにＰＢＳ−０．５Ｍ ＮａＣｌに解集合したＶＬＰ、および２００mMカルボネート、ｐＨ９．６の存在下で解集合し、ＰＢＳ−０．５ Ｍ ＮａＣｌに透析されたＶＬＰ（Ｄ）が、マイクロタイタープレートのウエルに付着している。材料および方法に記載したように、ＨＰＶ−１１構造特異的モノクローナル抗体Ｈ１１．Ｆ１（ＨＰＶ−１１中和性；▽）およびＨ１１．Ａ３（ＨＰＶ−１１非中和性；・）について、ＥＬＩＳＡにおける結合抗原への免疫反応を調べた。ＨＰＶ−１１ Ｌ１上に見られる線状エピトープを認識するモノクローナル抗体ＡＵ１（■）での反応はマイクロタイタープレートへの抗原付着物を示すコントロールとして使用した。
【００５３】
図７：ＨＰＶ-１１ ウイルスを中和する最初の精製ＨＰＶ-１１ ＶＬＰおよび再集合ＶＬＰに対する抗血清の性能比較。抗ＨＰＶ-１１血清をＨＰＶ−１１ビリオンを用いてＨａＣａＴ細胞を添加する前に３７℃で６０分間インキュベートした。別法として、ウイルスを血清でプレインキュベーションしない細胞に添加した。感染後６日で、細胞を採取し、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡのうち１０％分を逆転写に使用し、得られたｃＤＮＡの１０％を整列ＰＣＲの鋳型に使用し、さらにＨＰＶ-１１Ｅ１＾Ｅ４スプライスメッセージに特異的なプライマーも使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外光下で０．６kb Ｅ１＾Ｅ４バンドの存在を調べた(a)。βアクチンのＰＣＲ増幅を内部コントロールとして全ｃＤＮＡサンプル上で行った(b)。β-アクチンバンドの予想サイズは−０.６kbである。レーンＳは分子サイズマーカーを含む。レーンＣは、ウイルスなしでインキュベートした細胞のＲＮＡで行なった反応を意味し、レーンＶは血清でプレインキュベートしていないウイルスの存在下でインキュベートした細胞のものを意味する。予想通り、ウイルス-感染のものでＥ１＾Ｅ４バンドを検出したが、非感染細胞からは検出していない。隣りのレーンは、ウイルスに感染した細胞からのＰＣＲ産物を含む。この細胞は、最初の精製ＨＰＶ-１１ ＶＬＰおよび再集合ＶＬＰに対する連続log₁₀希釈の抗ＨＰＶ−１１抗血清（１０^-3−１０^-7）でプレインキュベートされていた。
【００５４】
図８：集合(−βＭＥ)および解集合(＋βＭＥ、２運転)状態におけるＨＰＶ-１６_TrＶＬＰのＳＤＳ/ページ比較であり、解集合状態において精製ＶＬＰの更なる精製を示している。ＨＰＶ-１６_TrＬ１タンパク質移動の位置を矢印で示す。
【００５５】
図９：解重合ＨＰＶ-１６_TrＶＬＰの５−２０％線状スクロース勾配分析。ＰＢＳ中の最終精製＋βＭＥ ２運転ＶＬＰ(表３参照)を、４％ βＭＥと共に４℃で１６時間インキュベートし、次いで、方法部分で記した５−２０％線状スクロース勾配で遠心分離した。勾配を２５画分(０.５ml)に集め、ペレット(P)をＰＢＳ ０.５mlに再懸濁した。ＨＰＶ-１６特異的モノクローナル抗体１６-Ｅをブローブした免疫ブロットを示し、勾配と交わったＬ１タンパク質の位置を示す免疫ブロットを表示する。また、分離勾配上で作動すると沈降標準が遊走するピーク位置を示す。
【００５６】
図１０：様々な重合状態におけるＨＰＶ-１６_TrＶＬＰの１０−６５％線状スクロース勾配分析。(a)精製ＶＬＰ出発物質(＋βＭＥ ２運転；表３参照)のアリコートを、４％ βＭＥと共に４℃で１６時間インキュベートした。(b) βＭＥ-処置ＶＬＰの位置を、ＰＢＳ-０.５ ＮａＣｌで透析して再集合し、還元剤を取り除いた。(c)サンプルを本明細書中で述べた１０−６５％線状スクロース勾配で遠心分離した。各勾配を１２画分(１ml)に集め、ペレット(P)をＰＢＳ １mlに再懸濁した。ＨＰＶ-１６特異的モノクローナル抗体１６-Ｅをプローブした免疫ブロットを示し、異なる勾配上でＬ１タンパク質が遊走した位置を示す免疫ブロットを表示する。また、図９のように、沈降標準が遊走するピーク位置を表示する。
【００５７】
（発明の詳細な記述）
上記したように、本発明は、パピローマウイルスＶＬＰの高度に効果的な解集合、すなわち少なくとも７０％の解集合、好ましくは７０−９０％の解集合、最も好ましくは完全なＶＬＰ解集合を提供する新しい方法に一般的に関する。解集合は、Ｌ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質との組合せを含むパピローマウイルスＶＬＰの、高濃度スルフヒドリル還元剤溶液との長時間接触を含む。一般に、還元剤の濃度は１重量％、好ましくは約３−５重量％であって、還元剤含有溶液は、最大約０.５、好ましくはこれより低いイオン強度を有する。
【００５８】
しかし、還元剤濃度およびイオン強度は、パピローマウイルスの型、元の宿主、Ｌ１タンパク質の変異および／または化学的変更形態、および純度によって異なる。より具体的には、本発明は、インビトロでの精製ＶＬＰの最大の解集合および続く効果的な再集合をもたらす条件を明らかにする。判明したことは、比較的高濃度の還元剤とパピローマウイルスＶＬＰとを、最大０.５Ｍのイオン強度および好ましくはほぼ生理的イオン強度以下で長時間インキュベートするのが、精製ＶＬＰから均質で可溶性のカプソメアを産生するのに必要かつ十分であることである。さらに、還元剤の除去あるいはその酸化において、無傷の適当なサイズのＶＬＰが得られることが見出された。
【００５９】
このことは具体的には、全ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＤＮＡ配列を含有する組換えバキュロウイルスで感染したTrichoplasia ni（High Five(商標)）において、バキュロウイルス／昆虫細胞系において産生したＨＰＶ−１１ ＶＬＰを用いる。しかし、これらの結果に基づき、理論的に結論されるのは、他の型および種、特に他のヒト・パピローマウイルス型から産生されたパピローマウイルスＶＬＰを用いても同種の結果が得られるであろうことである。この結論は、多数のパピローマウイルスＬ１タンパク質が適当な組換え発現ベクター系で発現されたときに、ＶＬＰをもたらすことが示されたので、理にかなっている。
【００６０】
同様に、合理的に推測されるのは、類似の結果がＬ１およびＬ２タンパク質の組合せを含むパピローマウイルスＶＬＰを用いて達成できるであろうことである。なぜなら、このＶＬＰはＬ１タンパク質のみからつくられたＶＬＰと実質的に同じである。〔しかし、Ｌ２が有意の安定化の役割を有すると推定して、本発明者の考えでは、解集合中において、より高い濃度の還元剤、より長時間の接触、高いｐＨおよび／または低いイオン強度を解集合に必要とする。〕さらに期待されるのは、本発明方法が、パピローマウイルスＶＬＰの産生をもたらす宿主系から得られた解集合／集合に適していることである。出願人はいくつかの宿主細胞に差異が存在することを認識しているが、後記するように、多くの宿主細胞がＶＬＰの形態でパピローマウイルスＶＬＰを発現すると報告されている。
【００６１】
一般に、望むＶＬＰ出発物質は適当な宿主細胞系、例えばバキュロウイルス／昆虫細胞系で産生され、既知技術を用いて、それから抽出される。抽出技法は、用いた特定の宿主細胞、濃度（タンパク質が細胞内に残留しているか、分泌されたか）などの因子によって相違する。
【００６２】
ＶＬＰの解集合は、ＶＬＰ純度の種々のレベルで行うことができる。精製と合わせて行うと、ＶＬＰは細胞から抽出され、解集合され、通常の技法で精製され、そして望む純度程度に再集合される。ＶＬＰが外因化合物をパッケージするのに用いられる場合、または解集合／再集合が最終産物の均質性を改善するため行われるとき、用いられたＶＬＰはかなり高純度である。これらの場合において、解集合に用いられるＶＬＰは、好ましくは少なくとも１０−３０重量％、さらに好ましくは５０重量％、最も好ましくは少なくとも７０−９０重量％である。ＶＬＰ純度の測定法はよく知られており、ＳＯＳ−ＰＡＧＥ比密度法などがある。
【００６３】
材料および方法などを後に詳記するように、本発明者は、スクロース勾配系を用いるＶＬＰ解集合の研究のための迅速スクリーニングアッセイを開発した。この系において、無傷のＶＬＰは３０％スクロールクッションを介して沈降し、非凝集カプソメア、より小さいＬ１オリゴマーまたはＬ１モノマーはクッションの上部に止まっている。従って、このアッセイ法の有利な点は、最大のＶＬＰ解集合を結果として生じる条件の正確な同定を容易にすることである。
【００６４】
一般に、最大ＶＬＰ解集合には、非凝集ＶＬＰの、高濃度スルフヒドリル還元剤含有の溶液への長時間接触を要することが分かった。上に説明したように、長時間接触は、ＶＬＰの少なくとも７０％の解集合、より好ましくは７０−９０％のＶＬＰ解集合、理想的には実質的に全ＶＬＰ解集合をもたらすのに十分な期間である。例示した昆虫細胞系において産生される組換えＨＰＶ−１１Ｌ１ＶＬＰの場合、最大解集合は４℃で１６時間後に起きた（５重量％のβ−メルカプトエタノールを含有する溶液を用いて）。しかし、各接触時間は別の出発物質、異なるｐＨ条件、より高い還元剤濃度、より低いイオン強度を用いて、大きく減少することができる。例えば、ＨＰＶ−１６Ｌ１タンパク質のＣ末切断形により形成されたＶＬＰの実質的な解集合は、このようなＶＬＰをβ−メルカプトエタノール液（４％）に４℃で約２時間接触させた後に効果的となる。
【００６５】
本ＶＬＰ解集合方法は、還元剤としてβ−メルカプトエタノールおよびジチオトレイトールを用いて効果的であることが示された。しかし、他の既知の還元剤も同様の結果を提供すると考えられる。本発明で有用である適当な還元剤の例には、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、システイン水素スルフィドおよびこれらの混合物がある。
【００６６】
本発明方法では、高濃度のスルフヒドリル還元剤を有する溶液にＶＬＰを接触せしめる。ここでは、ＶＬＰの実質的な解集合、すなわち少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７０−９０％、より好ましくは実質的に全ＶＬＰ解集合を長い接触の後にもたらす還元剤の濃度と定義される。
【００６７】
これらの還元剤濃度は、特定の還元剤または組合せによって異なる。β−メルカプトエタノールの場合、少なくとも約５重量％（７１３mM）の濃度が生理的イオン強度での最適のＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰ解集合をもたらす。還元剤の濃度が低いと、接触期間が減少すると、ＶＬＰ解集合が効果的でなくなる。例えば、４％β−メルカプトエタノール液も効果的な解集合（少なくとも７０％）を提供することが分かった。
【００６８】
解集合方法においてイオン強度が重要なパラメーターであることも分かった。好ましくは解集合を効果的にするには、用いる溶液のイオン強度が最大で０.５、好ましくはこれより低い。さらに好ましくはほぼ生理的な“イオン強度”（すなわち０.１５ＮａＣｌ）またはこれ以下で、より好ましい解集合が起きる。高いイオン強度はＶＬＰ解集合方法を効果的でなくすることが分かった。一般に、イオン強度は最大で約０.５、好ましくは約０.２５、最も好ましくは最大で０.１５である。
【００６９】
ＶＬＰ凝集の存在が解集合に対して有害作用を与えることも分かった。この作用は凝集物質の除去により回避される。また、高濃度の還元剤溶液にＶＬＰを長時間接触せしめることにより回避される。これは、ジスルフィド結合が凝集体中に埋没して還元剤にアクセスできず、それによって解集合を妨げるので、起きるようである。
【００７０】
また、述べたように、驚くべきことに、キレート剤が高濃度ですらもＨＰＶ−１１ ＶＬＰ解集合に有意な作用を及ぼさないことが分かった。これはＥＧＴＡおよびＥＤＴＡの両方でみられ、両者ともよく知られたキレート剤であり、単独またはジチオトレイトールと併せて用いられる。上述したように、キレート剤が関連パポバウイルスのＶＬＰ解集合に必要と報告されていたことからすると、驚くべきことである。
【００７１】
さらに、炭酸緩衝液（０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）がＨＰＶ−１１ＶＬＰの顕著な解集合を起こすことが分かった。しかし、スルフヒドリル還元剤への長時間接触による解集合と異なり、炭酸処理ＶＬＰを再集合するのは不可能であった。仮説として、炭酸処理はＬ１タンパク質を部分的に変性すると考えられる。これから言えるのは、正しく折りたたまれたＬ１タンパク質構造を維持しながらＶＬＰを解集合する本発明方法（スルフヒドリル還元剤の効果的な濃度に長時間接触）のみが、完全なサイズで可溶性のＶＬＰに再集合し得る物質を産生する。
【００７２】
ＨＰＶ−１１ＶＬＰの本解集合は、立体配座中和エピトープを表わす高均質性のカプソメアをもたらす。このエピトープは特定のパピローマウイルス（ＨＰＶ−１１例示）に対応する立体配座中和モノクローナル抗体により表示される。さらに最適条件で、本発明方法は、ＶＬＰがすべてカプソメアに分解する組成物をもたらす。逆に、ＨＰＶ−１６_TrＶＬＰの本解集合は、カプソメアの混合物、小さいＬ１オリゴマーとＬ１モノマーとなるようである。しかし、Ｌ１オリゴマーのこの混合物は定量的な再集合をつくり得る。これから示されるのは、本発明方法が正しく折りたたまれたＬ１タンパク質をカプソメアの形態でＶＬＰ再集合が可能な小さいＬ１オリゴマーまたはＬ１モノマーをつくることである。
【００７３】
上記したように、本発明の特定の利点は、カプソメアが単に還元剤の除去によりＶＬＰに定量的に集合することである。還元剤の除去は、種々の方法、例えば透析またはカラム・クロマトグラフィーによって行い得る。あるいは、過剰の酸化物の添加が適当なジスルフィド結合の再形成を強力に促進し、ＶＬＰ再集合に導く。上記したように、再集合は、正しく折りたたまれたＬ１タンパク質出発物質の構造的統合性により影響される。また、出発物資の溶解性も再集合に影響を及ぼし、凝集物質が定量的に再集合しない。
【００７４】
一般的に、再集合は、スルフヒドリル還元剤の除去、酸化物の添加、正しく折りたたまれたＬ１タンパク質出発物質の高イオン強度条件（例えば、少なくとも約０.５以上）での接触により影響される。塩の高濃度はＶＬＰを安定化するのに働く。しかし、キレート剤の添加は逆の作用を有する、すなわち再集合を緩やかに阻害する。
【００７５】
驚くべきことに、このような再集合は、元のＶＬＰ出発物質よりも粒子サイズが非常に均質のＶＬＰをもたらす。これが分かるのは、出発ＶＬＰ物質と再集合ＶＬＰ産物との、１０−６５％直線スクロース勾配での比較であり、電子顕微鏡で検査する。明らかに、完全サイズＶＬＰの範囲の粒子が検出され、平均５６.５±７.０nmであり、部分的集合ＶＬＰまたは小さい複合体は非常に少ない。また、収率は非常に高く、最適の再集合条件を用いて、出発物質から再集合ＶＬＰの全Ｌ１タンパク質比での収率は平均約８０−９０％である。基本的に解集合された出発物質のすべてが可溶性の濾過性の完全サイズＶＬＰを再形成するようである。また、これらのＶＬＰは、真正のパピローマウイルスビリオンの表面に立体配座中和エピトープを表わし、ＶＬＰ出発物質のように強力な中和抗体をつくり出す。
【００７６】
これらの結果は新規で予想できなかったものであるが、本出願の教示に基づき、当業者は、タンパク質濃度、ｐＨ、イオン強度および／または反応速度を変えることにより、さらに大きいＶＬＰ収率を得ることができる。
【００７７】
上記のように、本発明は、望む部分を包含するパピローマウイルスＶＬＰをつくるための方法を提供する。これは以下の工程によって一般的に達成される。
（ｉ）所望のパピローマウイルスのＶＬＰを得る。これはＬ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質の組合せから構成される。
（ii）最大０.５のイオン強度を有する高濃度のスルフヒドリル還元剤含有の溶液に、該ＶＬＰを接触せしめて、該ＶＬＰを解集合する。
（iii）包含されるべき部分を含有の、および選択的に精製Ｌ２タンパク質（例えば、解集合ＶＬＰがＬ２タンパク質を含有していない場合）を含有の溶液に解集合ＶＬＰを接触せしめる。
（iv）スルフヒドリル還元剤の除去または過剰の酸化物の添加によって該解集合ＶＬＰを再集合し、それによって所望の部分を含有するＶＬＰをつくる。
【００７８】
解集合および集合の工程は上記したようにしてなされる。すなわち、解集合が行われるには、高濃度のスルフヒドリル還元剤を、典型的には少なくとも１重量％またはそれ以上で、長時間、すなわち少なくとも２時間、典型的にはさらに長く、少なくとも１６時間使用する。接触時間および還元剤の濃度は、パピローマウイルスＶＬＰの型、そのつくられる宿主細胞系、Ｌ１タンパク質中での変異（例えば、Ｃ末切断）、純度のレベル、凝集体の存在の有無、ＶＬＰによるＬ１またはＬ１とＬ２の組合せの含有の有無によって影響される。再集合はスルフヒドリル還元剤の除去または酸化により生じる。
【００７９】
上記したように、Ｌ１およびＬ２からなるＶＬＰがＬ１に基づくＶＬＰと同様の条件で解集合すると考えるのは合理的であるが、Ｌ２タンパク質は安定機能として働く。従って、Ｌ１およびＬ２からなるＶＬＰの解集合には、より高濃度の還元剤、より長時間の接触、低いイオン強度、高いｐＨまたはこれらの組合せを非常に必要とする。あるいは、ＰＶＬ１タンパク質から完全に構成されているＶＬＰは、本明細書に述べるように、解集合され得、そして精製Ｌ２タンパク質（組換え法でつくられる）が再集合工程中に加えられる。
【００８０】
ＶＬＰ中に包含され得る部分は、治療的および診断的部分を含む。例えば、核酸配列、放射核種、ホルモン、ペプチド、抗ウイルス剤、抗癌剤、細胞生長調節剤、細胞生長阻害剤、サイトカイン、抗原、トキシンなどを含む。
【００８１】
本ＶＬＰは、包含された望む部分を含有し、望む宿主、好ましくはヒトに投与されたときに、特定のパピローマウイルスによって普通感染した細胞、例えば上皮細胞や角化細胞に取り込まれ、それによって該包含部分のこれらの細胞への強力な内部移行がなされる。このことで本ＶＬＰの治療（予防に対して）ついての利用が容易になる。治療薬を望む細胞部位、例えば頚管癌部位へ運送し得るからである。一般にＰＶが難しいと、望む部分を標的細胞に運送する高度に選択性の手段を提供する。例えば、核酸配列、例えば薬効ポリペプチドをコードするＤＮＡ、またはアンチセンス配列を運送する手段を提供する。
【００８２】
包含された部分は、もちろんＶＬＰ集合および／または安定性に有害な作用を与えるものであってはならない。この決定には、望む部分含有のＶＬＰをつくり、ＶＬＰ集合および／または安定性に対する作用があるかを評価する。
【００８３】
ＤＮＡまたはＲＮＡの場合、包含された核酸の配列は、８キロ塩基、ＰＶゲノムのサイズまであり得る。しかし、典型的には、包含配列はより小さく、例えば１−２キロ塩基程度である。典型的には、これらのＤＮＡは望むポリペプチド、例えば酵素、ホルモン、生長因子などの薬効のあるポリペプチドをコードする。この配列は、標的宿主細胞中でその発現を容易にする配列と操作的にさらに連結される。
【００８４】
包含ＤＮＡ含有のＶＬＰの別の用途は、“プソイドビリオン”としてである。この点について、ヒト疾患に関与するパピローマウイルスを含む多くのパピローマウイルスは稀であり、インビトロで容易に繁殖さすことができず、抗体中和アッセイでの使用を容易にする量でヒト細胞源からたやすく精製できない。このことは、これらの特異的ＨＰＶウイルスを防ぐためのワクチンなどの治療薬の実現性を評価するのを妨げたり、困難にしている。保存が現在なされ得ないＨＰＶ型の例には、ＨＰＶ−３１、３３、３５および４５がある。
【００８５】
本発明は、かかる問題を失くす、少なくとも減少する。基本的に“プソイドビリオン”は、これらのウイルスに対応して構築される。これは、特定のＰＶのＬ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質の組合せから構成され、そしてさらに、該パピローマウイルスゲノムまたは選択し得るマーカーが包含されているＶＬＰを含む。
【００８６】
このプソイドビリオンは、対応ＶＬＰワクチンの効力を調べるインビトロ細胞の“感染能”アッセイで用いられる。基本的に、細胞を該プソイドビリオンに接触することでなされる。これらのプソイドビリオンはこのような細胞を結合し、該ＤＮＡの挿入を提供する。その後、該ＤＮＡの挿入は、既知方法、例えばハイブリダイゼーション法や、β−ガラクトシダーゼなどの選択性のマーカーの発現を基にする方法によって調べられる。
【００８７】
これは、特定のＨＰＶに特異的なＬ１またはＬ２タンパク質に対する抗体の存在または不存在の両方で行われる。挿入が阻害され、例えば選択性マーカーの発現低下に基づいて測定されると、Ｌ１またはＬ２タンパク質がウイルス中和抗体の産生を誘導した徴候である。
【００８８】
本発明は、パピローマウイルスおよび特にヒトパピローマウイルスについてのＶＬＰをつくるに用いられる。多くのＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡが文献に報告され、公に入手可能である。（参照、例えば、Baker, Sequence Analysis of Papillomavirus, Genomes, pp. 321-384; Long et al, 米国特許第5,437,931号, Cole et al, J.Mol Biol., 193:599-608(1987); danos et al, EMBO J., 1:231-236 (1982); Cole et al J.Virol., 38(3):991-995(1986)。）また、ＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡが顕著に相同性を示すこともよく知られている。従って、所望のＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡは、例えば、既に報告されたＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡまたはそのフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）増幅におけるハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用して、容易に得られる。実際、多くのＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡがクローン化および発現されている。
【００８９】
好ましくは、本発明における該ＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡは、癌または尖圭コンジローマ関連のＨＰＶ由来であり、例えばＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５６は癌関連であり、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−７０は疣贅に関係している。しかしながら、対象の安定なカプソメアはいかなる所望のＨＰＶ Ｌ１ ＤＮＡからも産生し得る。
【００９０】
一般に、選択されたＨＰＶＬ１および選択的なＬ２配列は、所望の組換え宿主細胞系において発現され、解集合のためのＨＰＶＶＬＰを産生するのに用いられる。
【００９１】
選択された宿主と発現ベクターは、ＶＬＰの産生を促進する条件で培養される。これは、選択された宿主系とベクターに含まれる調節性配列に大いに依存している、例えば、発現に誘導が必要かどうか。発現後、ＨＰＶ ＶＬＰは宿主細胞から抽出される。抽出の方法もまた、宿主／ベクター系にある程度依存する。
【００９２】
例えば、細胞内発現ベクターが選択されるとき、宿主細胞は溶解される必要があり、ＨＰＶ ＶＬＰは溶解液から回収される。反対に、発現ベクターが分泌を容易にする配列を含んでいるとき、ＨＰＶ ＶＬＰは培地から直接回収される。異形タンパク質を組換え宿主細胞および培地から回収する方法は、当業者によく知られている。
【００９３】
ＨＰＶ Ｌ１配列は、ＨＰＶ ＶＬＰを再生可能の収率で発現するために提供されるいかなる宿主細胞においても発現される。組換えタンパク質の発現に適切な宿主系は、よく知られており、例として、細菌、哺乳動物細胞、イースト菌および昆虫細胞がある。好ましい発現系には、実施例に使用されるバキュロウイルス／昆虫細胞系が含まれる。この系は高いタンパク質収率を提供する。しかしながら、ＨＰＶ Ｌ１およびＬ２タンパク質は、他の系、特に細菌およびイースト菌でも産生される。
【００９４】
ＤＮＡ配列をコードする対象のＨＰＶ Ｌ１の発現をクローン化するのに適切なベクターは、当業者によく知られており、商業的に入手可能である。さらに、クローニングと発現を達成するのに適切な調節配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化配列、エンハンサー、選択的マーカーなどもよく知られている。再生可能なタンパク質収率を得るための適切な配列の選択は、当業者の日常的業務である。
【００９５】
ＶＬＰは、ＨＰＶ予防ワクチンおよび診断に用いられる。解集合によりつくられたカプソメアも有用であり、配座性中和エピトープを提示し、中和抗体を誘導することが分かった。本発明ＶＬＰは、均等性を高め、潜在的に安定性を増すので利点がある。
【００９６】
既に述べたように、本発明はいかなるＨＰＶ Ｌ１配列にも広く適用される。当業者に既知の種々のＨＰＶ型がある。さらに、特定の型のＨＰＶが特定の感染症、例えば、扁平疣贅、皮膚疣贅、表皮異形成疣贅、病変および頚部癌に関係している。６０以上の異なるＨＰＶ型がウイルス性ヌクレオチド配列相同性検査により臨床病変で同定されてきた。参照、例えば、Jenson et al, "Human papillomaviruses" In: Belshe, R. ed., Textbook of human virology, Second Edition, MASS:PSG, 1989:951およびKremsdorf et al, J. Virol., 52:1013-1018(1984)。ＨＰＶ型は、感染部位、病理的特徴および臨床的外見および関係病変の臨床過程を部分的に決定づける。
【００９７】
ＨＰＶ型についての交差免疫がほとんどまたは全くなく、感染症に対する免疫がＨＰＶ型特異性と考えられるので、予防または処置を行おうとする各々の特異的ＨＰＶ型について、組換えＨＰＶＶＬＰを産生する必要がある。しかしながら、Ｌ１タンパク質と遺伝子の相同性のため、ハイブリダイゼーション法が所望の特定Ｌ１遺伝子を単離するために使用できる。配列相同性を示すＬ１タンパク質の領域から選択されたヌクレオチドプローブは、他のＬ１遺伝子を単離するために使用し得る。ハイブリダイゼーション法は、当業者に既知である。参照、例えば、Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985); Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982);およびMolecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)。別法として、ＰＣＲ法をＬ１遺伝子または遺伝子フラグメントを増幅するのに使用し得る。参照、例えば、米国特許第4,683,195号；第4,683,202号；および4,800,159号。
【００９８】
ウイルス粒子はまた、特定のパピロ−マウイルス型、クローニングされたＤＮＡおよび単離されたＬ１タンパク質をコードする核酸配列について単離される。ウイルス粒子の単離法とウイルスＤＮＡのクローニング法が報告されている。参照、例えば、Heilman et al. J. Virology, 36:395-407 (1980); Beaudenon et al, Nature, 321:246-249(1986); Georges et al, J. Virology, 51:530-538 (1984); Kremsdorf et al, J. Virology, 52:1013-1018 (1984); Clad et al, Virology, 118:254-259 (1982); DeVilliers et al, J. Virology, 40:932-935 (1981); およびヨーロッパ特許出願第０１３３１２３号。
【００９９】
別法として、特にヒトパピローマウイルスに関するＬ１タンパク質が単離され、予測したＤＮＡ配列に基づいてアミノ酸配列が決定され、核酸プローブが集合される。このプローブはＬ１遺伝子をパピローマウイルスＤＮＡライブラリーから単離するのに使用される。参照、例えば、Suggs et al, PNAS, 78(11):6613-6617 (1981)。参照、Young and Davis, PNAS, 80:1194(1983)。
【０１００】
上記したように、ＶＬＰ形成は、発現なされる細胞型に何らか敏感である。従って、ＶＬＰ解集合について出発物質として多量のＶＬＰを産する系を選択することは利点がある。一般にこの発現系は、所望のＬ１タンパク質を有するベクター、適当な調節領域および適当な宿主細胞を含む。
【０１０１】
既に述べてきたように、バキュロウイルスベクターが好ましくは使用される。バキュロウイルス系がもたらす有利性は、細胞の大部分がトランスフェクション法よりも感染を利用するためにタンパク質を発現するように誘発される点である。バキュロウイルスは昆虫ウイルスであり、昆虫細胞（ＳＦ９）において成長するが、これらの細胞は、適切な立体配座のタンパク質を産生するのに重要となり得る糖鎖形成およびリン酸化を含むタンパク質を処理するための多くの真核細胞性メカニズムを保持している。バキュロウイルスベクター系は当業者に既知である。参照、例えば、Summers and Smith, Texas Agricultural Experimental Bulletin No. 1555 (1987); Smith et al, Mol. Cell Biol., 3:2156-2165 (1985); Posse, Virus Research, 5:4359 (1986); およびMatsuura, J. Gen. Virol., 68:1233-1250 (1987)。また、バキュロウイルス／感染細胞が、適切な立体配座を提示するＨＰＶ Ｌ１タンパク質を発現することが報告されている。
【０１０２】
適切な発現系における発現のために、Ｌ１遺伝子または修飾Ｌ１遺伝子を、操作できるように発現ベクターに結合し、宿主細胞に導入して、その細胞によりＬ１タンパク質を発現させる。適切な調節領域を有する遺伝子は、発現のための適切な方向および読み取り枠において提供される。遺伝子構築法は当業者に既知である。参照、特に、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)およびそこに引用されている文献。
【０１０３】
非常に様々な転写および調節配列が使用される。シグナルはウイルス源由来である。ウイルス源において、調節シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関係している。つまり、例えば、ウイルス源または哺乳動物源などの強いプロモーターが使用される。この方法で、本発明を実行するための最高の条件には、Ｌ１遺伝子を発現ベクターにクローニングすることを含む。発現ベクターは、形質導入または感染標的細胞におけるＬ１タンパク質の立体配座依存性ウイルス中和性エピトープを過発現する。
【０１０４】
本発明によって産生された特定の安定なＨＰＶＶＬＰのワクチンまたは診断試薬としての適合性は、無傷のビリオン上に存在する立体配座エピトープに反応または認識する抗体またはモノクローナル抗体との反応によって確認され、中和抗血清の産生を促進する能力に基づいている。中和抗体が産生されるかどうかを決定する適切なアッセイは、当業者に既知である。これはＨＰＶワクチンに使用されるべきＨＰＶカプソメアの本質的特徴である。この方法において、ＨＰＶＶＬＰが抗ＨＰＶ中和抗体をつくるかどうか証明される。このように、他の発現ベクターおよび発現系は本発明において利用するために検査される。
【０１０５】
既に述べてきたように、本発明のＶＬＰは、パピローマウイルス感染について検出、診断、血清型判定および治療に利用され得る。診断または血清型判定に利用されるとき、本発明によるＶＬＰは、種々の標識および標識法のいずれを用いても標識される。本発明において使用され得る標識型の例には、限定するわけではないが、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒素標識、化学発光標識が含まれる。
【０１０６】
適切な酵素標識の例には、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、イースト菌アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどがある。
【０１０７】
適当な放射性同位体標識の例には³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｔｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁵²Ｅｕ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃｕ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁰⁹Ｐｄがある。
【０１０８】
適切な放射性蛍光標識の例には、¹⁵²Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、およびアロフィコシアニン標識、ｏ−フタルデヒド標識、フルオレサミン標識などがある。
【０１０９】
適切な毒素標識の例には、ジフテリア毒素、リシンおよびコレラ毒素がある。化学発光標識の例には、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識およびアクリジニム塩標識、シュウ酸塩標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識などがある。
【０１１０】
当業者は、本発明において使用し得る他の適切な標識が分かるであろう。これらの標識の被標識物との結合は、当業者が通常知っている標準的技法を用いて達成し得る。典型的は技法は、Kennedy, J. H., et al, Clin. Chim. Acta, 70:1-31 (1976)および Schurs, A. H. W. M., et al, Clin. Chim. Acta, 81:1-40 (1977)に記載されている。後者に記載されているカップリング技法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミド−ベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−コハク酸イミドエステル法であり、これらの方法はすべて参照することにより、本明細書の一部とする。
【０１１１】
本ＶＬＰを用いる抗ＨＰＶ抗体の検出は、担体の使用を通して改良され得る。よく知られた担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび四三酸化鉄がある。担体の特性は、本発明の目的のためある程度可溶性であるかまたは不溶性であるかのどちらかである。当業者は、結合タンパク質に適切な多くの他の担体に留意し、また通常の実験を行うことにより、それを確かめることができるであろう。
【０１１２】
しかしながら、最も重要な本発明の態様は、ＰＶワクチンの開発である。本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体中に含まれる宿主における中和抗体の形成を誘導するのに充分な、本ＨＰＶ ＶＬＰの量を含む。
【０１１３】
ワクチンを含有する本ＶＬＰの投与は、薬学的に許容されるいかなる方法、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、局所的投与を例として含む、非経口的、局所的、全身的方法によって達成される。投与方法は、感染の天然経路を含む要因に依存する。投与用量は、年齢、健康状態、体重、もしあれば同時期の治療の種類および特定ヒトパピローマウイルスの特性と型を含む要因に依存する。ワクチンは、経口投与にはカプセル、溶液、懸濁液またはエリキシル、非経口または鼻腔内使用には溶液または懸濁液などの無菌性液体製剤などの用量形態で使用される。生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水などの不活性な免疫学的に許容される担体が好ましくは使用される。
【０１１４】
ワクチンは、治療に効果的な量で投与される。つまり、保護的免疫応答を産生するのに充分な量ということである。一般的に、約０.１mg−約２０mgタンパク質の範囲の用量で、もっと一般的には、約０.００１mg−約１００mgタンパク質の範囲の用量で投与される。単回または多回用量で投与される。
【０１１５】
本発明の方法は、パピローマウイルス感染を防止するためのワクチンを含むＨＰＶＶＬＰの製造を可能とする。さらに、本発明の方法に従って、ヒト特異的パピローマウイルスのいかなる免疫原性型に対してもワクチンをつくり得る。
【０１１６】
１以上のＰＶ型がＰＶ感染に関係しているので、ワクチンは１以上のＰＶ型由来の安定なＨＰＶＶＬＰを含み得る。例えば、ＨＰＶ１６および１８は子宮頚癌に関係しているので、子宮頚部異常増殖のためのワクチンはＨＰＶ１６；ＨＰＶ１８；またはＨＰＶ１６および１８の両方のＶＬＰを含み得る。
【０１１７】
実際、種々の異常増殖がＰＶ感染に関係していることが分かっている。例えば、ＨＰＶ３ａおよび１０は、扁平疣贅に関係している。ＨＰＶ３ａ、５、８、９、１０および１２を含む多くのＨＰＶ型が表皮異形成疣贅（ＥＶ）に関係していることが報告された。ＨＰＶ１、２、４および７が扁平疣贅に、ＨＰＶ６ｂ、１１ａ、１３および１６が粘液細胞膜の病変に関係していることが報告された。参照、例えば、Kremsdorf et al, J. Virol., 52:1013-1018 (1984); Beaudenon et al, Nature, 321:246-249 (1986); Heilman et al, J. Virol., 36:395-407 (1980); およびDeVilliers et al, J. Virol., 40:932-935 (1981)。従って、対象のワクチン製剤は、所望の保護により異なるＨＰＶ型からの再集合ＶＬＰの混合物を含む。
【０１１８】
指摘したように、本発明のＨＰＶＶＬＰはまた、血清型判定に、および血清型判定キットに組み入れて使用される。
【０１１９】
血清学的検査において、キットは、対象のＨＰＶＶＬＰと酵素基質、標識抗体のような検出手段とを含む。
【０１２０】
これまで本発明について一般的に記載してきたが、下記の実施例によって、より詳細に述べる。特に記さない限り、限定するわけではない。
【０１２１】
実施例
実施例では、下記の原材料および方法を使用した。
【０１２２】
材料および方法
ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ
精製タンパク質を用いるＶＬＰ−解集合および再集合の研究に使用のため、ＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質は、Ghim et al,In M. A. Stanley (ed.) Immunology of Human Papillomaviruses, Plenum, New York, pp 147-152 (1994)に記載された多面体プロモーターの完全Ｌ１読取り枠下流をコード化する組換えバクロウイルスにより感染させたトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni、ハイ・ファイブ（商標））細胞で異種発現させた。感染の約７２時間後に細胞を採取し、遠心分離により沈殿させ、冷凍した。ＶＬＰを製造するため、細胞ペーストを、ホモジナイゼーション緩衝液（２０ミリモルＮａＨ₂ＰＯ₄、１５０ミリモルＮａＣｌ、ｐＨ７.４、１０mg／mlロイペプチン、１mg／mlアプロチニン、および１mg／mlペプスタチンＡ含有）に再懸濁し、マイクロフルーイダイザー（マイクロフルーイディックスＨＣ８０００／３Ａ型）中に溶解した。次いで、ホモジネート化したライゼートを１０００００×ｇで９０分間遠心分離し、ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ含有ペレットをＣｓＣｌ（４０５g／Ｌ）含有ＰＢＳに再懸濁した。次いで、澄明化したライゼートを８３０００×ｇで一夜遠心分離し、ＶＬＰバンドを集めた。ＶＬＰをＰＢＳ−０．５モルＮａＣｌ中に希釈することにより、３０％および６３％スクロースで構成される２成分段階勾配で層状に重ねた。勾配を１６７０００×gで３時間遠心分離し、精製したＶＬＰバンドを３０％および６３％スクロース溶液間の界面で集めた。次に、ＶＬＰを選ばれた緩衝液（ＰＢＳ、またはＰＢＳにＮａＣｌを加えて０.３モルまたは０.５モルの最終濃度にする）に透析し、４℃で貯蔵した。参考タンパク質として牛血清アルブミンを用いるブラッドフォード検定法（Bradford et al., Anal. Biochem., 72: 248-254 (1976)）によりタンパク質濃度を測定し、(Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11553-11557 (1995))による記載に従いＬ１含有率を測定した。含水細胞ペースト２５−３０gから出発し、上記プロトコルにより１５−２５mgのＨＰＶ−１１ ＶＬＰを生成した。
【０１２３】
ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰｓ
精製時におけるＶＬＰ−解集合および再集合の研究に使用のため、ＨＰＶ−１６_Tr Ｌ１タンパク質(Ｃ末端の３４アミノ酸が欠失している変異形ＨＰＶ−１６ Ｌ１タンパク質を含む)は上記のようにハイ・ファイブ（商標）細胞で発現させた。細胞ペーストを、抽出緩衝液（１０ミリモルＴｒｉｓ、１．０％トライトン Ｘ−１００、ｐＨ６．０）に再懸濁し、攪拌により混合し、そして１，０００×ｇで短時間遠心分離した。ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰ含有ペレットを２０ミリモルＴｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液に再懸濁し、短時間ボルテックスし、そして３，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を回収し、０．４５μ酢酸セルロースシリンジフィルターで濾過し、次いで４％βＭｅの存在下または非存在下で２時間以上４℃でインキュベーションし、その後、カラム精製を試みた。透明の、濾過した上清(＋／−βＭＥ)を別のイオン交換樹脂に低導電率値(５−１５ミリオーム)で適用し、数カラム体積の平衡緩衝液で洗浄し、そして上昇するＮａＣｌの勾配で溶出した。残存ＤＮＡおよびタンパク質汚染を取り除くＨＩＣの利用性を試験するため、ＩＥＣからの溶出Ｌ１タンパク質のピークを含む画分をプールし、硫酸アンモニウムを０．７Ｍに調節し、同緩衝液で平衡化したＨＩＣカラムに適用した。カラムを数カラム体積の平衡緩衝液で洗浄し、次いで、Ｌ１タンパク質をＨＩＣカラムからより低い硫酸アンモニウム濃度で溶出させた。精製工程の最終産物(＋／−βＭＥ)をＰＢＳ(０．５Ｍ ＮａＣｌ)で大量に透析し、純度、収率および残存ＤＮＡについて比較した。ＶＬＰｓの様子を電子顕微鏡および直線状スクロース勾配分析により特徴付けた(以下参照)。
【０１２４】
スクロース密度勾配遠心分離
これらの実験では、３タイプのスクロース密度勾配を用いた。第一に、３０％スクロースクッションでの遠心分離を用いることにより、小さな可溶性成分へＶＬＰを解集合するのに適した条件を同定した。ＶＬＰ（５０−１００μｇ総タンパク質）プラスまたはマイナス可能な崩壊剤を含む１００−２００μｌの反応混合物を、４.８mlの３０％スクロース（ＰＢＳ−０．５モルＮａＣｌ中w／ｗ）を充填した５ml遠心管上部に層状に重ね、スイングバケットローター中４℃で２時間１９７０００×ｇで遠心分離した。５０μlアリコートを管の極上部から採取し、２Ｘラエムリ試料調製緩衝液（Laemmli, U.K. Nature, 227:680-685 (1970)）と混合した。３０％スクロースクッションの残りをピペットで除去し、「ペレット」（一般的には何も見えない）を１００μｌの１Xラエムリ試料調製緩衝液に再懸濁した。次いで、３０％スクロースクッションの上部または下部でのＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質の存在を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより測定し、ディジタル化されたゲル分析によりＬ１の相対量を定量化した。第二に、５−２０％直線スクロース密度勾配でのレートゾーン遠心分離法により、解集合されたＶＬＰの状態を測定した。解集合されたＶＬＰ（４００ml中１００−２００μg総タンパク質）を、５−２０％スクロース（ＰＢＳ−０.５モルＮａＣｌ中ｗ／ｖ）から成る前調製１１.６ml勾配上部に層状に重ね、スイングバケットローター中４℃で２４時間１１１０００×ｇで遠心分離した。勾配全体からフラクション（０.５ml）を集め、「ペレット」（一般的には何も見えない）を、ダウンスホモジナイゼーションにより０.５mlのＰＢＳに再懸濁した。勾配全体に及ぶＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質の位置を、イムノブロッティングにより測定した。沈降係数が確立された標準タンパク質（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ、１９Ｓ、ウシ肝臓カタラーゼ、１１.３Ｓ、牛血清アルブミン、４.３Ｓ）を用いて勾配を検定し、フラクションにおけるスクロースのパーセンテージを屈折率測定により決定した。
【０１２５】
第三に、初期、解集合および再集合ＶＬＰの状態を、１０−６５％直線スクロース勾配でのレートゾーン遠心分離法により測定した。様々な集合状態におけるＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質（４００μl中１００−２００μg総タンパク質）を、１０−６５％スクロース（ＰＢＳ−０.５モルＮａＣｌ中ｗ／ｖ）から成る前調製１１.６ml勾配上部に層状に重ね、スイングバケットローター中４０℃で２.５時間１８８０００×ｇで遠心分離した。勾配を集め（１.０mlフラクションで）、分析し、上記要領で、ただし追加の検定標準物質としてパルボウイルスB１９（７０S）およびＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰ（１６０Ｓ）を用いて検定した。
【０１２６】
ゲル電気泳動
「ＳＤＳ／ＰＡＧＥ」 ＳＤＳ／ＰＡＧＥを、主にLaemmli（Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970)）の方法に従って行った。試料を試料調製緩衝液と混合し、２分間沸騰させ、ミニフュージ中で短く回転させ、４％濃縮用ゲルと共に７.５％（図１）または１０％（図２−４）ミニゲルに充填した。ゲルを室温で約１時間２０ｍＡの一定電流で泳動させ、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーＲ２５０染色により明視化した。
【０１２７】
イムノブロッティング
ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルからのＨＰＶ−１１ Ｌ１のエレクトロブロットを、主としてTowbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350−4354 (1979))の方法に従い製造した。４℃で一夜ＰＢＳ中１％の脱脂乳タンパク質によりブロットを遮断した。ブロットをＡＵ１(Berkely Antibody Co.)、パピローマウイルスＬ１タンパク質の線形エピトープに対し指向したマウスモノクローナル抗体（25）で９０分間プローブし、ＰＢＳ、０.１％トライトン Ｘ−１００で洗浄し、次いで３０分間再遮断した。次に、ブロットを４０分間ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Southern Biotechnology Associates, Inc.）とインキュベーションし、上記と同様に洗浄した。次に、ブロットをＥＣＬウェスタンブロッティング試薬(Amersham)で展開し、エックス線フィルムに暴露した。
【０１２８】
ゲルの分析
モノマーおよびオリゴマーＬ１の分子量を、標準タンパク質（See, Jackowski et al., In T. E. Creighton (ed) Protein structure: a practical approach, IRL Press, NY, pp1-21, (1989))と比較して、７.５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥでのＲｆ値から決定した。指示された場合、ゲルをヒューレット・パッカード・スキャンジェット・プラス平床濃度計でディジタル化し、スキャン分析ソフトウェア（バージョン２．２、；スペコム・リサーチ）を用いてバンドの相対強度を測定した。
【０１２９】
電子顕微鏡法
タンパク質試料をホルムバールおよび炭素被覆銅グリッド(Electron Microscopy Sciences)に定着させ、ブロット乾燥し、新たにろ過した２％ホスホタングステン酸（ｐＨ６.８）で染色した。１００ＫＶの加速ボルト数でＪＥＯＬ１００５型透過型電子顕微鏡によりグリッドを調べ、１５−２５０００倍の名目倍率で撮影した。
【０１３０】
固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＰＢＳ−０.３モルＮａＣｌ中ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰ（０.５−１.０mg／ml L１）を４℃で処理せずに貯蔵するか、またはβＭＥ（５％の最終濃度まで）または２.０モル炭酸緩衝液、ｐＨ９.６（２００ミリモル炭酸の最終濃度まで）の追加後４℃で一夜インキュベーションした。次いで、処理試料の一分量を、４℃で２４時間以上４×１Ｌ ＰＢＳ−０.５モルＮａＣｌに対して透析した。試料を全て０.８μg L1／mlの濃度に希釈し、マイクロタイタープレートのウェル（１ウェル当たり８０ｎg Ｌ１）中に分配した。未処理ＶＬＰおよび透析物質をＰＢＳ中へ希釈した。後続の透析を行わなかったβＭＥ処理試料を、５％βＭＥ含有ＰＢＳに希釈し、２００ミリモル炭酸中でインキュベーションした非透析試料を２００ミリモル炭酸（ｐＨ９.６）に希釈した。３７℃で１時間インキュベーション後、プレートを０.１％トウィーン２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ）で洗浄し、ＰＢＳ中５％脱脂乳タンパク質で遮断した。モノクローナル抗体(ペンシルバニア州立大学より購入した腹水から精製した、ＡＵ１、またはＨ１１．Ｆ１およびＨ１１．Ａ３(Christensen et al., J. Virol., 64: 5678-5681(1990)))をＰＢＳ中１％脱脂乳で希釈し、ウェルに加えた。室温で２時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔｗで洗浄し、ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加えた。室温で１時間後、プレートを上記と同様に洗浄し、ＨＲＰ基質で展開した(Kirkegaard and Perry Laboratories)。１５分終点で光学密度測定を４０５nｍで行った。デュプリケイトのウェルの平均を最終光学密度値として計算した。
【０１３１】
ＨＰＶ−１１中性化アッセイ
オリジナル精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰに対する抗血清、および長時間メルカプト還元剤にさらし、次いで透析による還元剤除去中に再集合するＨＰＶ−１１ ＶＬＰがＢＡＬＢ／ｃマウスで生じた(グループ５)。マウスに、１ｍｇ／ｍｌアルヒドロゲル添加剤に吸着させたＶＬＰｓ１μｇを、０、４および９週間、最後には死ぬ１３週間目まで注射した。マウスに抗血清が生ずるかどうかを決定することにより、ＨＰＶ−１１ウイルスを中性化し得、ヒトセルライン(ＨａＣａｔ)で特異的ＨＰＶ−１１スプライスｍＲＮＡの発現を防ぐ抗血清能を試験した。
【０１３２】
ＨａＣａｔ、不滅のケラチン生成セルライン(Boukamp et al., J. Cell Biol., 106: 761-771 (1988))はＤｒ．Ｎｏｒｂｅｒｔ Ｆｕｓｅｎｉｇにより提供された。細胞は、ペニシリン(１００ ｕｎｉｔｓ／ｍｌ)およびストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)を添加した１５４／ＨＫＧＳ(Cascade Biologics, Inc.)で、２４ウェルプレートで増殖し集合した。Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｋｒｅｉｄｅｒから購入したＨＰＶ−１１_Heraheyショックウイルス(Kreider et al., J. Virol., 61: 590-593 (1987))を氷上で２５秒間超音波処理し、１５４／ＨＫＧＳ培地で希釈し、１時間３７℃でインキュベーションした。培地をＨａＣａＴ細胞から吸い取り、希釈ウイルス０．５ｍｌをウェルあたり加えた。対照として、各プレートにつき１つの細胞ウェルにウイルスのない培地０．５ｍｌを入れた。抗体を介する中性化のために、抗血清を１５４／ＨＫＧＳで希釈し、固定量のＨＰＶ−１１ストックウイルスと共に最終体積０．５ｍｌで１時間３７℃でインキュベーションし、その後、ＨａＣａＴ細胞に加えた。新鮮培地を、感染４日後細胞の各ウェルに添加し、６日目に細胞を回収し、総細胞性ＲＮＡをＴｒｉ Ｒｅａｇｅｎｔ(Molecular Research Center, Inc.)を用い調製した。最終ＲＮＡペレットをＤＥＰＣ処理水２０μｌに再懸濁し、分光光度計で定量した。
【０１３３】
ＨＰＶ−１１特異的スプライスｍＲＮＡの発現を防ぐ抗血清能を逆転写酵素(ＲＴ)−ＰＣＲで決定した。ＲＴ反応は、鋳型として総ＲＮＡ ２μｇおよびプライマーとしてオリゴｄＴと共にＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡキット (Boehringer Mannheim)を用い行った。繰り込みＰＣＲはＨＰＶ−１１ Ｅ１∧ Ｅ４ ｃＤＮＡの検出に必要であった。初回増幅により、各ＲＴ反応から２５％のｃＤＮＡが生じ、フォーワード・アウトサイド・プライマーとして５'−ＴＡＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＡ−３'(ＨＰＶ−１１ゲノム配列中の塩基７６５−７８７に位置)およびリバース・アウトサイド・プライマーとして５'−ＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡＧＣＡＣＡＣ−３'(ＨＰＶ−１１ゲノム配列中の塩基４０８８−４１１０に位置)で３０サイクルのＰＣＲを行った。１０％の初回ＰＣＲ混合物を繰り込み反応に使用し、繰り込みフォーワード・プライマーとして５'−ＡＴＡＴＴＧＴＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＧ−３'(塩基７９２−８１２に位置)および繰り込みリバース・プライマーとして５'−ＣＡＧＣＡＡＴＴＴＧＴＡＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣ−３'(ＨＰＶ−１１ゲノム配列中の塩基３８７７−３８９８に位置)で３０サイクルのＰＣＲを行った。初回および繰り込みＰＣＲ反応は、Ｈｏｔ Ｗａｘ ｂｅａｄｓ(１．５ｍＭ)、および２００μＭ ｄＮＴＰｓ、フォーワードおよびリバースプライマーそれぞれ１２５ｎｇおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼ(Perkin-Elmer)を伴うｐＨ９．５緩衝液(InVitrogen)で、最終体積５０μｌで行った。初回および繰り込みＰＣＲは両方とも温度プロファイルは、８０℃／５分間、９５℃／３０秒間、７２℃／３０秒間であり、最後の伸張は７２℃で１０分間であった。
【０１３４】
対照として、アッセイがＨａＣａＴ細胞から抽出したｍＲＮＡを検出できることを説明するため、全ｃＤＮＡサンプルを、分離ＰＣＲ反応に、上記(Smith et al., J. Invest. Dermatol., 105:1-7 (1995))同様記載し増幅したスプライス細胞性β-アクチンｍＲＮＡに特異なプライマーと共に使用した。
【０１３５】
すべてのＰＣＲ産物を２％アガロースゲルの電気泳動で分離し、臭化エチジウム蛍光発光により視覚化した。
【０１３６】
実施例１
ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの定量的な解集合
比較的多量のＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰをＶＬＰの解集合および再集合の試験のための出発物質として製造した。ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰをＣsＣlおよびスクロースの勾配遠心分離により組換えバキュロウイルスを感染させたＨigh Ｆivet(商標)細胞から分離した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥの比密度分析に基づいて計算されたこれらのＬ１調製物の純度は、７０−９０％の範囲であった(図１、レーン２を参照)。加えて、直線スクロース勾配では、個々のＶＬＰおよび凝集したＶＬＰの混合物に関して予想されるように、大部分のタンパク質が移動し(図４a)、電子顕微鏡では、中程度および完全な大きさ(５０−５５nm)の粒子の混合物がはっきり見えた(図５a)。
【０１３７】
集合Ｌ１ ＶＬＰを安定化する共有結合的相互作用および非共有結合的相互作用は完全に知られていないが、パピローマウイルスのＶＬＰおよび関係のあるポリオーマウイルス ビリオンおよびＶＬＰに関する初期の研究は、イオン強度、二価カチオン(Ｂradyら，Ｊ. Ｖirol.，２３：７１７−７２４（１９７７）；Ｓalunkeら，Ｂiophys. Ｊ.，５６：８８７−９００（１９８７））、およびジスルフィド結合(Ｓappら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７６：２４０７−２５１２（１９９５）；Ｖolpersら，Ｖirology，２００：５０４−５１２（１９９４）)の重要性を提唱した。特に、Ｓappおよび共同研究者達は、ＨＰＶ−３３ ＶＬＰのＬ１タンパク質の５０パーセント以下が、見掛けＭ_rがＬ１のトリマーと一致する、ある範囲のより大きなオリゴマーにジスルフィド結合すること、そして穏やかな還元条件が、ＨＰＶ−３３ ＶＬＰをカプソメアのレベルまで部分的に分解することを免疫ブロッティングにより実証した(Ｓappら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７６：２４０７−２４１２（１９９５）；Ｖolpersら，Ｖirol.，２００：５０４−５１２（１９９４）)。我々の研究では、還元剤の不存在下において、Ｍ_rが５５,０００ＤaであるＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質の一部分のみがＳＤＳ／ＰＡＧＥを移動した(図１、レーン１)。ＨＰＶ−１１ ＶＬＰのＬ１タンパク質の約４０％(パーセンテージは、様々なＶＬＰ調製物の間で変わった)は、推定されるＭ_r値が約１４４,０００Ｄa(恐らくは、Ｌ１トリマー)および２１０,０００Ｄa(恐らくは、テトラマー)である、より大きなオリゴマーにジスルフィド結合した(図１、レーン１)。Ｌ１オリゴマーは、シングルバンドとしては移動せず、大きさが不均一であるようだった。〜２００,０００Ｄaのオリゴマーもまた、Ｓappおよび共同研究者達による免疫ブロット(Ｓappら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７６：２４０７−２４１２（１９９５）；Ｖolpersら，Ｖirol.，２００：５０４−５１２（１９９４）)で、広くてより高い分子量のバンドの一部分として観察された。これらの結果は、ＨＰＶ−１１ ＶＬＰにおけるＬ１タンパク質の一部分がより高いオリゴマーにジスルフィド結合することを示す。ＶＬＰの安定性におけるジスルフィド結合および他の相互作用の役割を研究するため、ＶＬＰの解集合に関する迅速スクリーニングアッセイを開発した。精製ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰを、様々な処理の前および後の両方ともに、３０％ スクロースクッションの上部に重層し、遠心分離して、３０％ クッションの上部および下部でのＬ１タンパク質の分布をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより視覚化した。無傷のＶＬＰは、３０％ スクロースクッションを通ってペレットとなることが予想された。凝集しないカプソメアおよびＬ１モノマーは、クッションの上部に残留することが予想された。このアッセイの一例を図２に示す。Ｌ１タンパク質の相対分布を定量するために、ゲルをデジタル化し、クッションの上部および下部でのＬ１のバンドの全強度を測定した後、いずれかの位置で見出されるＬ１染色強度のパーセンテージを計算した。数多くのそのような測定の結果を表１および２に作表する。図２で実証されるように、精製ＶＬＰ出発物質は、３０％ スクロースを通って沈降し、推定されるように、Ｌ１は上部では見られなかった。しかしながら、高濃度の還元剤 β−メルカプトエタノール(βＭＥ)とインキュベーションすると、Ｌ１タンパク質は、主として、３０％ スクロースクッションの上部に見出されたことにより、還元剤は、ＨＰＶ−１１ ＶＬＰをより小さくて凝集しない成分に解集合したことが示された。興味深いことに、ＶＬＰの最大解集合は、典型的には、非常に高濃度の還元剤(この場合、５％、または７１３mＭ、βＭＥ)への暴露を比較的長い時間(４℃で１６時間以上)必要とした。より低い濃度の還元剤、またはより短い時間の還元は、ＶＬＰの解集合で確実に有効なものではなかった。低濃度のキレート化剤の添加は、解集合を高めなかった(図２および表１)。
【０１３８】
還元剤に加えて、ＶＬＰの定量的な解集合に関する他の重要な変数は、解集合反応の間のイオン強度およびＶＬＰ出発物質の溶解度であることが見出された。以前、ポリオーマウイルスビリオンに関して観察されたように、より低いイオン強度条件は、ＶＬＰを不安定にする(Ｂradyら，Ｊ. Ｖirol.，２３：７１７−７２４（１９７７）)が、Ｓappら(Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７６：２４０７−２４１２（１９９６）)は、ＶＬＰからのＨＰＶ−３３カプソメア生成が０.１５Ｍおよび０.６Ｍ ＮaＣlの間の塩濃度には感化されないことを報告した。ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの場合、５％ βＭＥに１６時間暴露したＶＬＰの最大解集合(〜９０％)は、「生理的」イオン強度(すなわち、０.１５Ｍ ＮaＣl)で観察されたが、イオン強度が増大するにつれて、それ相応にあまり有効ではなくなった(表１)。イオン強度の増大による安定化効果は、ＶＬＰを還元剤とより長い時間または高温でインキュベートすることで部分的に抑制され得た。しかしながら、ＶＬＰを５％ βＭＥと４℃で１２０時間または２４℃で２４時間インキュベートすると、解集合の範囲は、０.５Ｍ ＮaＣlで６０−７０％まで増大したが、解集合はまだ少しも完全ではなかった(データは示していない)。さらにまた、定量的な解集合のためには、ＶＬＰ出発物質の凝集の程度もまた重要であった。ここに報告する実験では、ＶＬＰ溶液を様々なイオン強度の緩衝液に透析して、解集合試験で使用するまで４℃で保存した。数日後、特に０.１５Ｍ ＮaＣlでは、溶液が僅かに濁るようになり、ある程度の凝集を示した(沈殿は、ほとんどまたは全く観察されなかったが)。その濁ったＶＬＰ溶液の還元剤での処理は、最初の可溶性ＶＬＰ溶液で観察されたのと同程度の解集合を与えず、凝集したＶＬＰが解集合に抵抗することを示した。しかしながら、凝集した物質(製造年月日により、全ＶＬＰの１０−５０％の範囲である)を濾過により除去すると、残留する可溶性ＶＬＰは、最初の可溶性ＶＬＰ出発物質と同程度に再び解集合され得た。
【０１３９】
興味深いことに、高濃度のキレート化剤でさえも、カチオンのキレート化は、ＶＬＰの解集合に著しく影響を及ぼさなかった。ＶＬＰの２００mＭ ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ緩衝液(ＰＢＳ−０.３Ｍ ＮaＣ、pＨ ７.４)への透析は、明らかな解集合を全くもたらさず、１０mＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)の透析緩衝液への添加は、ほとんど効果がなかった(表２)。高濃度のキレート化剤がＶＬＰを解集合できないことは、電子顕微鏡分析により確認されたが、ＥＤＴＡ(しかし、ＥＧＴＡではない)は、ＶＬＰを僅かに膨潤させるようであった(データは示していない)。これらの濃度のキレート化剤はいずれも、強固に結合した構造的に重要なイオンを抽出するには不十分であり、またはカチオンは、ＶＬＰの構造的完全性を維持するのに必須ではない。逆に、ＮaＨＣＯ₃緩衝液(pＨ ９.６)の濃縮したアリコートをＶＬＰ溶液に最終濃度が２００mＭ カーボネート(ＰＢＳ−０.３Ｍ ＮaＣl)となるまで加えると、ＶＬＰの著しい破壊が引き起こされた(表２)。ＤＴＴを(最終濃度が１０mＭとなるまで)加えても、カーボネートが誘発する分解はさらに高められなかった。ＶＬＰと２００mＭ カーボネート／１０mＭ ＤＴＴとのインキュベーションは、ＥＬＩＳＡにおいてＨＰＶビリオンまたはＶＬＰを変性させるために一般に使用される(Ｆavreら，Ｊ. Ｖirol.，１５：１２３９−１２３７（１９７５）；Ｃhristensenら，Ｊ. Ｖirol.，６４：３１５１−３１５６（１９９０）；Ｃhristensenら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７５：２２７１−２２７６（１９９４））。３０％ スクロースクッションアッセイにより測定されるように、ＨＰＶ−１１ ＶＬＰとpＨ ９.６のグリシン緩衝液(最終濃度２００mＭ)とのインキュベーションは、ＶＬＰの破壊をほとんど引き起こさなかったので、カーボネートの効果は緩衝液に特異的であって、単にpＨの関数ではないようである(表２)。同様に、Ｂradyら(Ｊ. Ｖirol.，２３：７１７−７２４（１９７７）)は、アルカリ性のpＨだけではなく、アルカリ性のpＨでのカーボネート緩衝液がポリオーマウイルスのビリオンを解離することを観察した。しかしながら、Ｂradyら(Ｊ. Ｖirol.，２３：７１７−７２４（１９７７）)により提示されたように、pＨ ９.６での２００mＭ ＥＤＴＡ(＋／− １０mＭ ＤＴＴ)がＶＬＰの解集合で全く効果がなかったように(データは示していない)、pＨ ９.６でのカーボネートの特異的な効果は、カーボネートの可能性のあるキレート化能力によるものであるとは思われない。
【０１４０】
実施例２
解集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの特性決定
高濃度の還元剤に長期間暴露した後、精製ＶＬＰは、カプソメアのレベルまで分解されるようである。図３aに示すように、５％ βＭＥとの４℃で１６時間のインキュベーションにより生成した解集合ＶＬＰは、５−２０％ 直線スクロース勾配で移動し、沈降標準と比較して測定された平均沈降係数は、１１.３±１.５Ｓ(ｎ＝５)であった。計算された沈降係数が１６−１８Ｓであるより大きな種(恐らくは、ダイマーのカプソメア)、およびペレット化された物質でさえも時折観察された。しかしながら、Ｌ１の１０％未満は、勾配の上部(Ｌ１モノマーに関して予想される位置)またはペレット中(無傷のＶＬＰまたは凝集したカプソメアに関して予想される場所)で検出されることは、精製ＶＬＰ出発物質が主として長期間還元後に個々のカプソメアレベルまで解集合されることを提示した。この結論は、５％ βＭＥと長期インキュベーションした後のＶＬＰの電子顕微鏡分析により裏付けられ、平均して直径が９.７±１.２nm(ｎ＝１５)である均一なカプソメアの視野(図５b)が描かれ、時折数個の大型凝集構造が見られた(この技術では、モノマーＬ１は検出されない)。推定されるカプソメアの直径は、低温電子顕微鏡法(１１−１２nm)で観察されたものより僅かに小さく(Ｂakerら，Ｂiophys. Ｊ.，６０：１４４５−１４５６（１９９１）；Ｈagenseeら，Ｊ. Ｖirol.，６８：４５０３−４５０５（１９９４）；Ｂelnapら，Ｊ. Ｍol. Ｂiol.，２５９：２４９−２６３（１９９６）)、恐らく電子顕微鏡グリッド調製中における収縮に起因すると思われる。図３aおよび５bに示されたデータは、高濃度の還元剤への暴露時間が長いとき、精製された可溶性ＶＬＰはカプソメアの均一な集団に定量的に解集合されることを実証した。
【０１４１】
高濃度の還元剤に長期間暴露してＨＰＶ−１１ ＶＬＰから生成されたカプソメアは、無傷のＶＬＰから見出される構造的エピトープを含む。ＨＰＶ−１１−特異的モノクローナル抗体のパネルで、「変性」Ｌ１ではなく無傷のＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰと反応するものが報告されている。これらのモノクローナルには、ＨＰＶ−１１ビリオンにおける優性中和エピトープを認識することが立証されたＨ１１.Ｆ１、およびＨ１１.Ａ３、すなわち独特な非中和構造依存的抗体がある(ＣhristensenおよびＫreider，Ｊ. Ｖirol.，６４：３１５１−３１５６（１９９０）；Ｃhristensenら，Ｊ. Ｖirol.，６４：５６７８−５６８１（１９９０）)。予想通り、Ｈ１１.Ｆ１およびＨ１１.Ａ３は、ＥＬＩＳＡにより分析すると精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ出発物質と強く反応した(図６a)。しかしながら、これらの抗体はまた、還元剤への暴露によりＶＬＰ出発物質から生成されたカプソメアとも反応した(図６b)。すなわち、カプソメアは、無傷のＶＬＰおよび真正ビリオンの表面で見出される構造依存的エピトープの少なくとも幾つかを有しており、Ｅ. coliにおいて発現されたＨＰＶ−１１カプソメアに関してＬiら(Ｊ. Ｖirol.，７１：２９８８−２９９５（１９９７）)により行われた試験結果と一致している。これらの結果は、さらにモノクローナル抗体Ｈ１１.Ｆ１およびＨ１１.Ａ３が、結合用の「天然様」立体配座を必要としながらも、先に報告されたようにＶＬＰ−依存的ではないことを立証している(Ｌudmererら，Ｊ. Ｖirol.，７１：３８３４−３８３９（１９７７）)。
【０１４２】
対照的に、モノクローナル抗体 Ｈ１１.Ｆ１およびＨ１１.Ａ３は、pＨ ９.６のカーボネート緩衝液での処理により解離したＨＰＶ １１ ＶＬＰを認識することはできない(データは示していない、Ｃhristensenら，Ｊ. Ｇen. Ｖirol.，７５：２２７１−２２７５（１９９４）)。カーボネート処理を行ってもカプソメアの均一な溶液は得られなかったが、電子顕微鏡により調べると、部分的に凝集した小物体の不明瞭な混合物として現れた(データは示していない)。この研究結果は、５−２０％ 直線スクロース勾配でのカーボネートで処理したＶＬＰの分析により部分的に確認されており、Ｌ１タンパク質は、主として、−４Ｓで移動したが、９−１１Ｓでの小集団が観察され(図３b)、ＢＰＶビリオンに対するカーボネート緩衝液(pＨ １０.６、１０mＭ ＤＴＴ)の効果と一致していた(Ｆavreら，Ｊ. Ｖirol.，１５：１２３９−１２４７（１９７５）)。最後に、pＨ ９.６でのグリシン緩衝液により処理した場合、ＶＬＰはさらに小さな個々の粒子には解離されず(表２)、ある程度の効果が見られた。pＨ ９.６グリシンで処理したＶＬＰは、電子顕微鏡では無傷で部分的に破壊されたＶＬＰおよび凝集したＶＬＰの輪郭不明瞭な混合物として現れた(データは示していない)。
【０１４３】
実施例３
ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの定量的な再集合
ＨＰＶ−１１カプソメアからのＶＬＰの再集合は、透析またはカラムクロマトグラフィーのいずれかにより還元剤を除去すると起こった。可溶性カプソメアの均一な調製物で出発して、還元剤の不存在下における長時間の透析は、限定された集団の再集合ＶＬＰを一貫して与えた(図４cおよび５c、d)。再集合ＶＬＰは、モノクローナル抗体 Ｈ１１.Ｆ１およびＨ１１.Ａ３により認識される構造エピトープを保持した(図６)。
【０１４４】
再集合に関して、カプソメア(０.５−１.０mg／mlの全タンパク質で１−５ml)を４×１Ｌ ＰＢＳ−０.５Ｍ ＮaＣlに対して４℃で２４時間以上透析した；高い塩濃度を設定して、ＶＬＰを安定化した。キレート化剤の添加は、ＶＬＰを解集合する還元剤の能力を認め得るほどに高めなかった(表１)が、２mＭ ＥＤＴＡの存在は、再集合を徐々に妨げて、１５０Ｓの粒子の適切に分離した集団として１０−６５％ 直線スクロース勾配で移動するが、電子顕微鏡では平らで部分的に開口しているようであるＶＬＰを与えた(データは示していない)。逆に、再集合反応の間の２mＭ Ｃa²⁺の添加は、１０−６５％ 直線スクロース勾配分析により示すように、ＶＬＰを互いに付着させて、カルシウムの存在下に再集合したＶＬＰは、ペレットに完全に移動した。しかしながら、Ｃa²⁺の存在は、その他の点では、電子顕微鏡で試験した場合の塩基性ＶＬＰの形態には影響を及ぼさないようであった(データは示していない)。最後に、カーボネートで処理したＶＬＰのＰＢＳ−０.５Ｍ ＮaＣlへの透析は、ＶＬＰの再集合をもたらさなかった。その代わり、Ｌ１タンパク質は、電子顕微鏡分析および１０−６５％ 直線スクロース勾配分析の両方により証明されるように、小さな可溶性成分または非晶質の凝集した沈殿のいずれかのままであった(データは示していない)。カーボネートで処理したＶＬＰの透析は、構造特異的なモノクローナル抗体 Ｈ１１.Ｆ１およびＨ１１.Ａ３との反応性を復活させなかった(図６d)。
【０１４５】
再集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの特性決定
還元剤を除去した後、カプソメアがＶＬＰに定量的に再集合した。驚いたことに、再集合ＶＬＰは、セシウムおよびスクロースの勾配で精製したＶＬＰ出発物質より粒径がずっと均一であった。３段階の解集合／再集合反応を１０−６５％ 直線スクロース勾配により比較した場合、精製ＶＬＰ出発物質は、勾配を超えて分布しており、多くの粒子(１５０−１６０Ｓ)は、無傷のＶＬＰに関して予想される位置に移動したが、大部分のタンパク質は、勾配よりさらに下およびペレット中に移動した(図４a)。同様に、電子顕微鏡で試験した場合(図５a)、ＶＬＰ出発物質は、完全な大きさを含め、様々な大きさの粒子、直径５０−５５nmのＶＬＰの混合物であることが分かった。精製工程の初期の段階の直線スクロース勾配分析がより均一な粒径の分布を示す場合には、ＶＬＰの幾つかの破壊が抽出および精製の間に起こることは可能である(データは示していない)。
【０１４６】
高濃度の還元剤に長時間の暴露すると、上記のように、ＶＬＰがカプソメアに解集合した。ＶＬＰ出発物質と比較すると、カプソメアは、１０−６５％ 直線スクロース勾配の上部で移動し(Ｌ１は、ほとんど、または全く検出されなかった；図４b)、電子顕微鏡では、カプソメアの未破壊領域として見られた(図５b)。
【０１４７】
カプソメアの再集合は、均一な集団の球状で完全な大きさのＶＬＰを与えた。再集合ＶＬＰは、１０−６５％ 直線スクロース勾配の中央にバンドが現れ、推定される沈降係数が１５０.４±４.６Ｓ(ｎ＝７)であり、ペレット中または勾配の下部のいずれかで検出されるＬ１が精製ＶＬＰ出発物質で観察されるよりずっと少なかった(図４c)。再集合ＶＬＰの均一性は、図５c、dで実証するように、電子顕微鏡で試験した場合により一層合致していた。主として、平均すると５６.５±７.０nm(ｎ＝１５)である、完全な大きさのＶＬＰの範囲の粒子を検出し、幾つかの部分的に集合したＶＬＰ、またはより小さな複合体はほとんどはっきり見えなかった。本質的には、全てのカプソメアが、可溶性で濾過できる完全な大きさのＶＬＰを再生するようである場合には、再集合工程の収率もまた印象的であった(最適な解集合条件下での出発物質から再集合ＶＬＰまでの全Ｌ１タンパク質の観点から平均すると、８３％であった)。
【０１４８】
実施例４
ウイルス中和抗体を生成する最初の精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰおよび再集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの能力の比較
再集合ＶＬＰをワクチン候補物質として上手く機能させるためには、実験動物に注射した場合、それらがウイルス中和抗体を誘起する能力を保持することが必須である。このことを試験するために、最初の精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰおよび解集合／再集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの両方に対するポリクローナル抗血清を、方法の節に記載したように、ＢＡＬＢ／ｃ マウスにおいて生成した。各々の抗血清は、ＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイした場合、対応する免疫原に対して同等に反応性であった(データは示していない)。より重要なことには、感染性ＨＰＶ−１１ビリオンを必要とするＲＴ−ＰＣＲ中和アッセイ(Ｓmithら，Ｊ. Ｉnvest. Ｄermatol.，１０５：１−７（１９９５）)で試験した場合、免疫後の再集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰに特異的なポリクローナル抗血清が、最初の精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰに対して生成した抗血清で得られる中和価に等しい、１０^-5−１０^-6の中和価を示した(図７)。このことは、再集合ＨＰＶ−１１ ＶＬＰが、ＨＰＶ−１１ビリオンの非常に免疫原性でカプシドを中和する抗原ドメインを保持し、そして生殖器のＨＰＶ疾患の予防のためのワクチンとして働く可能性を有することを実証する。さらにまた、再集合ＶＬＰが完全な大きさ(すなわち、感染性ウイルスの大きさ)のＶＬＰの均一な製造を示すならば、再集合ＶＬＰは、大きさが種々雑多である最初の精製ＶＬＰより強力な免疫原であろうことが可能であり、可能性は、現在、最初のＶＬＰおよび再集合ＶＬＰの量を減少させながらマウスに投薬することにより試験している。
【０１４９】
実施例５
ＨＰＶ ＶＬＰの精製中のＶＬＰ解集合および再集合の適用
上記のように、慣用のタンパク質精製法は、ＶＬＰのサイズ(２０,０００,０００Ｄａ、５５ｎｍ直径粒子)の使用に関して最適化されていない。特に、ＶＬＰの完全サイズは、樹脂上の殆どの反応性化学がＶＬＰに立体的に近づけないため、殆どのクロマトグラフィー樹脂のキャパシティーおよび利用性を劇的に低下させる。しかし、この困難性は、細胞から抽出した粗ＶＬＰの解集合、解集合ＶＬＰの標準法を使用した精製、および所望の純度の段階でのＶＬＰの再集合により避けることができる可能性がある。ＶＬＰ精製に関する第２の懸念は、残余ＤＮＡによる汚染である。精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰで行った先の実験において、あるレベルの背景ＤＮＡが存続し、それはＤＮＡｓｅでの処理でも除去されず、ＤＮＡがＶＬＰ内に包含されているか、非常に強くそれらと会合していることを示す。ＶＬＰの解集合は、臨床的使用を意図した生物学的化合物の重要な懸念である、汚染ＤＮＡの増加した除去を可能にする。
【０１５０】
この可能性の試験において、ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰをバキュロウイルス感染昆虫細胞から抽出し、慣用のＩＥＣおよびＨＩＣクロマトグラフィーにより、方法のセクションに記載のように、スルフヒドリル還元剤の非存在下(無傷ＶＬＰ)、または４％βＭＥの存在下(解集合ＶＬＰ)のいずれかで精製した。後者の場合、βＭＥでまた平衡化したＩＥＣおよびＨＩＣカラムでのクロマトグラフィー前に、抽出ＶＬＰを４％βＭＥと＞２時間、４℃でインキュベートした。両方の(即ち、スルフヒドリル還元剤の存在下または非存在下)精製工程での最終精製生産物を、４×１Ｌ ＰＢＳ(０.５Ｍ ＮａＣｌ)に対して透析し、純度、収率および残余ＤＮＡレベルを測定した。第３表に示すように、βＭＥ非存在下で精製した代表的調製物は、約６０％のみの純度(タンパク質汚染に関して)およびヒトでの使用に望まれるのより高いＤＮＡ含有レベルのＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰをもたらした。逆に、解集合状態で精製したＶＬＰの３つの調製物は、高い収率、有意に高いタンパク質純度および実質的に減少した残余ＤＮＡレベルにより特徴付けられた。解集合状態で精製したＶＬＰの高いタンパク質純度は、図８に示すように、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分析した時、容易に明らかとなる。再集合ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰの精製後のサイズおよび均質性は、精製ＨＰＶ−１１ ＶＬＰの再集合で観察させるものよりもさらに均質であるが、平均して、解集合なしで精製したＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰと同程度均質であり、ある場合には一様に均等な完全サイズのＶＬＰを形成する(データは示していない)。これは、解集合なしで精製したＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰで観察されていないものである。
【０１５１】
精製ＨＰＶ−１６_TrおよびＨＰＶ−１１ＶＬＰの間のスルフヒドリル還元剤での長い処理の作用における興味深い差異がある。第１に、ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰは還元剤の低濃度および／または短い暴露時間では定量的に解集合するように見える(データは示していない)。これがＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１１ ＶＬＰの間の真性の差異を示すのか、それとも、ＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質のＣ末のタンパク分解的切断がスルフヒドリル還元剤の存在下でＶＬＰの分解も加速するという予備的試験での観察のようにＨＰＶ−１６_Tr Ｌ１タンパク質のＣ−末端切断によるものか、明らかではない。より興味深い性質は、スルフヒドリル還元剤有りの精製ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰの処理が、解集合ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰの直線状５−２０％スクロース勾配分析を基にして、カプソメア、Ｌ１タンパク質およびＬ１モノマーの小さいオリゴマーの混合物を生成するように見えることである(図９)。しかし、透析による還元剤の除去により、この小さい可溶性成分の混合物は、直線状１０〜６５％スクロース勾配分析で証明されるように(図１０)、そして電子顕微鏡分析で確認されるように(データは示していない)、無傷ＶＬＰに〜９０％の収率で再集合することができる。これらの結果は、解集合条件が、可溶性の正しく折りたたまれたＬ１タンパク質を生成する限り、ＶＬＰがカプソメアのレベルに、またはより小さいＬ１オリゴマーにさえ解集合でき、無傷の完全サイズＶＬＰへの再集合にまた十分であることを証明する。
【表１】

^aＶＬＰ(０.５−１.０mg／mlタンパク質)を示したように４℃で処理し、３０％スクロースクッションを通ったＬ１の分散を方法のセクションに記載のように測定した。複数の測定(ｎ＝３−７)±標準偏差を示す。
【０１５２】
【表２】

^aＶＬＰ(０.５−１.０mg／mlタンパク質)を示したように１６時間、４℃で処理し、３０％スクロースクッションを通ったＬ１の分散を方法のセクションに記載のように測定した。二回の測定の平均値±範囲を示す。
【０１５３】
【表３】

^a無傷ＶＬＰ(−βＭＥ)の一つの精製物および解集合ＶＬＰ(＋βＭＥ、ラン１−３)の３種の精製物を比較し、それらは方法のセクションに記載のように製造した。スケールは、使用した細胞ペーストのグラムで示し、純度は、最初の細胞ペーストに存在する量と比較した最終生産物のＳＤＳ／ＰＡＧＥの比重分析により測定し、ＤＮＡはThreshold法で測定し、ヒトで予測される最大個別量であるＬ１タンパク質１００ｇ当りとして報告する。
【０１５４】
結論
従って、本発明は、パピローマウイルスＶＬＰのインビトロでの定量的解集合および続く再集合の正確な条件を提供する。記載のように、パピローマＶＬＰ解集合の先の試みは、ある程度、関連するパポバウイルスであるポリオーマウイルスについての研究に影響された。この研究では、ジスルフィドおよびカルシウムイオンのキレート化の両方がビリオン解集合に必須であると示されていた(Brady et al., J. Virol., (1977))。しかし、低レベルのキレート化剤(例えば、０.５−１０ｍＭ ＥＤＴＡ)の存在下でのポリオーマウイルス解集合に最適化した低レベルの還元剤(１−１０ｍＭ ＤＴＴ)が、パピローマＶＬＰの解集合にほんの僅かしか作用しないが(第１表、Li et al., (Id.) (1997))、部分的にトリプシン処理されたＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰは上記の条件で解集合した(Li et al., (Id.) 1997))ことが、驚くべきことに判明した。しかし、Sappおよび共同研究者は、カプソメアがＨＰＶ−３３ ＶＬから、還元剤単独(２０ｍＭ ＤＴＴ)での処理で生成するが、ＶＬＰ破壊の程度は測定されなかったことを証明した(Sapp et al., (Id.) (1995))。先に記載された本実験において、勾配分析により解集合を試験した時、“ペレット”中のＬ１タンパク質の存在の試験が必要であったことが判明した。多くの場合、勾配にまたがるフラクションの試験は、良好な分解が達成されたことを示した。しかし、ペレットの試験は、電子顕微鏡分析で確認されるように、見えなくても、大きな割合のタンパク質が可変性サイズのＶＬＰの形に止まるかまたはそうでなければ凝集していることを示した。３０％スクロースクッションアッセイの開発により、多くの解集合条件を速くスクリーニングし、ＶＬＰを小さい可溶性の成分に一貫して解集合するものを同定することが可能となった。個々のカプソメア(ＨＰＶ−１１ ＶＬＰに関して)またはカプソメアの混合物および正しく折りたたまれた小さいＬ１オリゴマーおよびＬ１モノマー(ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰ)の均質溶液への定量的解集合が、非凝集ＶＬＰを中程度から低いイオン強度の緩衝液中の高レベルの還元剤で長時間処理することにより一貫して達成されることが判明した。
【０１５５】
記載のように、カチオンのキレート化がＨＶＰ−１１ ＶＬＰ解集合に実質的に影響しないという観察は、これが、カルシウムキレート化がビリオン解集合を促進し、カルシウムの添加がキレート化剤の作用に打ち勝つというポリオーマウイルスでの先の研究と対照的であるため、驚きであった(Brady et al., (Id) (1977))。同様に、Montross et al., (Id) (1991)は、通常核内でのみ集合しているポリオーマウイルスＶＬＰが、恐らく細胞質カルシウム濃度を必要なレベルまで上昇させるカルシウムイオノフォアの添加に続いて細胞質内で形成されることを観察した。しかし、カルシウムはＨＰＶ−１１ Ｌ１カプシド安定性には重要でないように見える。逆に、アルカリｐＨでの炭酸緩衝液での処理は、ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰを“解集合”せず、ポリオーマウイルスで見られる結果と同様であった(Brady et al., (Id.) 1977))。しかし、この処理は、ＶＬＰが、炭酸処理に続くＰＢＳ−０.５Ｍ ＮａＣｌへの透析により再集合しないため、より厳しいように見える。
【０１５６】
炭酸処理によるＨＰＶ−１１ ＶＬＰ解集合は、構造依存的、ＨＰＶ−１１−特異的モノクローナル抗体と反応できないＬ１タンパク質をもたらした。対照的に、ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰの長い還元による解集合は、無傷ＨＰＶ−１１ Ｌ１ ＶＬＰおよびＨＶＰ−１１ビリオンの両方の表面に見られる構造特異的エピトープを有するカプソメアをもたらした。これらの結果は、正しく折りたたまれたＬ１タンパク質のみがＶＬＰに再集合する能力を有するという考えを支持する。
【０１５７】
インビトロでの完全なサイズのＶＬＰへの効率的な再集合のために、本明細書に記載の結果は、出発物質の構造的完全性、可溶性および均質性が重要であることを示す。このようなカプソメアの集団(ＨＰＶ−１１ ＶＬＰに関して)またはカプソメアの混合物および正しく折りたたまれた小さいＬ１オリゴマーおよびＬ１モノマー(ＨＰＶ−１６_Tr ＶＬＰ)のチオール還元による生成に続いて、再集合が還元剤の除去後に本質的に起こる。再集合は、カラムクロマトグラフィー法、または大過剰の緩衝液に対する透析のいずれかによるスルフヒドリル還元剤の除去により達成され、ＶＬＰ出発物質よりもサイズでより均質な、再集合した、完全サイズのＶＬＰの集団を生じた。ポリオーマウイルスでの先の実験において、Salunke et al., (Id.) (1989)は、カプソメアからのＶＬＰ集合が、多様な、多形体二十面体集合を、集合条件の関数(ｐＨ、イオン強度およびカルシウム濃度)として生成することを観察した。興味深いことに、最も一貫して形成される構造は、ウイルスカプシドの７２カプソメア二十面体に加えて、２４カプソメア二十面体および１２カプソメア二十面体であった。著者らは、ジスルフィド結合形成がポリオーマＶＬＰ集合を助けるが、高いイオン強度(２Ｍ硫酸アンモニウム)において、可変性のサイズのカプシドが、１５ｍＭ６ＭＥの存在下でさえ形成されるため、これは必須ではないことを記した。同様に、Li et al., (Id.) (1997)は、E. coli中で発現したカラム精製ＨＰＶ−１１カプソメアが、また１５ｍＭ βＭＥの存在下で１Ｍ ＮａＣｌ中でカプシド様構造を形成する能力を有することを観察している。しかし、高いイオン強度条件がなんらかの程度のカプシド形成に有利であるが、我々の実験によると、生理学的イオン強度でジスルフィド結合がＨＰＶ−１１およびＨＰＶ−１６_Tr Ｌ１ ＶＬＰを共に保つために必要である。
【０１５８】
解集合反応が４℃で撹拌無しで典型的に行われた場合でさえ、最大の解集合のために、非常に高レベルの還元剤への長い暴露を必要とすることは興味深い。先に記載したように、安定化ジスルフィド結合が埋没して、近づくことができず、これらの結合の、局所構造変動による溶媒への暴露が非常に稀であるというのが一番ありそうな説明である。
【０１５９】
バルクでの完全なサイズのＶＬＰに再集合する能力は、多くの可能性を開く。図７に示されるように、高用量で、再集合ＶＬＰは、精製ＶＬＰ出発物質としてウイルス中和抗体を誘発することができる。再集合ＶＬＰが、粒子サイズに関して均質性が低い精製ＶＬＰ出発物質と同程度の強い免疫原であるかを測定するために、これらの有効性を現在試験している。多くの異なるサイズおよび形の粒子が、インビボでの感染に続いて細胞の核内で観察されるが(Kiselev et al., J. Mol. Biol., 40:155-171 (1969))、恐らく完全なサイズのウイルスのみが生産的に感染する。記載のように、本再集合ＶＬＰは、本方法がより均質なＶＬＰ粒子を提供するので、より大きな安定性を示し得るであろう。更に、上記のように、再集合反応は、出発条件の大きな範囲での再集合を最適化するために、タンパク質濃度、ｐＨ、イオン強度および動態を変えることにより、更に促進し得る可能性がある。最後に、本発明は、選択化合物の濃縮溶液の存在下で再集合反応を行うことにより、外来化合物のＶＬＰ中へのパッケージングを可能にする。本発明は、上記のように、現在利用可能ではないＨＰＶウイルスタイプの代用物として、または医薬または他の標的化合物の送達システムとして使用するためのプソイドビリオンの生成に使用できる。
【０１６０】
本発明は、その精神または不可欠な特徴から逸脱することなく、他の特殊な形態でも実施され得る。記載された態様は、あらゆる点において説明的なものにすぎず、限定的なものではないと見なされるべきであり、従って、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付された「特許請求の範囲」により示されている。特許請求の範囲の法的に同じ価値を有する意味および範囲内に含まれる修飾も全てその範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 精製ＨＰＶ−１１ Ｌ１タンパク質のＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析。
【図２】 ＨＰＶ−１１ ＶＬＰ解集合の３０％スクロースクッション分析。
【図３】 解集合されたＨＶＰ−１１ ＶＬＰの５−２０％線状スクロース勾配分析。
【図４】 様々な状態の集合におけるＨＰＶ−１１ ＶＬＰの１０−６５％線状スクロース勾配分析。
【図５】 種々の状態の集合におけるＨＰＶ−１１ ＶＬＰの電子顕微鏡写真。
【図６】 ＨＰＶ−１１構造特異的モノクローナル抗体を有する無傷および解集合ＶＬＰの反応。
【図７】 ＨＰＶ-１１ ウイルスを中和する最初の精製ＨＰＶ-１１ ＶＬＰおよび再集合ＶＬＰに対する抗血清の性能比較。
【図８】 集合(−βＭＥ)および解集合(＋βＭＥ、２運転)状態におけるＨＰＶ-１６_TrＶＬＰのＳＤＳ/ページ比較であり、解集合状態において精製ＶＬＰの更なる精製を示している。
【図９】 解重合ＨＰＶ-１６_TrＶＬＰの５−２０％線状スクロース勾配分析。
【図１０】 様々な重合状態におけるＨＰＶ-１６_TrＶＬＰの１０−６５％線状スクロース勾配分析。

Claims (57)

1. 高度に均質のパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）含有の組成物をつくる方法であって、下記の工程：
   （ｉ）パピローマウイルス・ウイルス様粒子含有の組成物を長時間、高濃度の少なくとも１種のスルフヒドリル還元剤を含み、最大０．５モル／リットルのイオン強度を有する溶液と接触せしめて、少なくとも７０％の該ＶＬＰが小さい正しく折りたたまれたＬ１タンパク質含有の部分に解集合するようにし、
   （ii）該小さい正しく折りたたまれたＬ１タンパク質含有の部分をＶＬＰに、スルフヒドリル還元剤の除去または酸化により再集合せしめること
   を含む方法。
2. ＶＬＰが小さい正しく折りたたまれたＬ１タンパク質含有の部分に解集合される、請求項１の方法。
3. Ｌ１タンパク質含有の部分が、カプソメア、小さいＬ１オリゴマーおよび／またはＬ１モノマーよりなる群から選ばれる、請求項１または２の方法。
4. スルフヒドリル還元剤が透析、濾過またはカラムクロマトグラフィーにより酸化または除去される、請求項１−３のいずれかの方法。
5. イオン強度が再集合工程（ii）中に０．５モル／リットル以上に上げられて、再集合ＶＬＰの安定性を高める、請求項１−４のいずれかの方法。
6. 工程（ｉ）で使用される還元剤の濃度が少なくとも１重量％である、請求項１−５のいずれかの方法。
7. 該スルフヒドリル還元剤がグルタチオン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、システイン、水素スルフィドおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項１−６のいずれかの方法。
8. 解集合に用いられる溶液のイオン強度が０．２５モル／リットル以下である、請求項１−７のいずれかの方法。
9. 解集合に用いられる溶液のイオン強度が０．１５モル／リットル以下である、請求項１−８のいずれかの方法。
10. 工程（ｉ）においてＶＬＰをスルフヒドリル還元剤溶液と少なくとも２時間接触させる、請求項１−９のいずれかの方法。
11. 該接触が少なくとも１６時間行われる、請求項１０の方法。
12. 該接触が少なくとも１６から２４時間行われる、請求項１１の方法。
13. ＶＬＰがヒト・パピローマウイルスＶＬＰである、請求項１−１２のいずれかの方法。
14. 該ヒト・パピローマウイルスＶＬＰが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−７０およびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項１３の方法。
15. 解集合に使用されるＶＬＰが実質的に純である、請求項１−１４のいずれかの方法。
16. 解集合に使用されるＶＬＰが実質的に不純である、請求項１−１４のいずれかの方法。
17. 不純ＶＬＰが解集合状態で精製され、精製化の所望の段階で再集合される、請求項１６の方法。
18. 該精製ＶＬＰが直径＞０．４５μmより大きい凝集体を実質的に含まない、請求項１−１７のいずれかの方法。
19. プロテアーゼおよび／またはキレート剤の使用を含まない、請求項１−１８のいずれかの方法。
20. 該パピローマウイルスＶＬＰがＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質を含む、請求項１−１９のいずれかの方法。
21. 工程（ｉ）において該ＶＬＰの少なくとも７０％が小さいＬ１タンパク質含有の分子に解集合する、請求項１−２０のいずれかの方法。
22. 工程（ｉ）が、小さい正しく折りたたまれたＬ１タンパク質含有の部分へのＶＬＰの事実上完全な解集合を提供する、請求項１の方法。
23. 再集合工程（ｉｉ）が、少なくとも０．５モル／リットルのイオン強度を有する溶液を用いて行われる、請求項２２の方法。
24. 請求項１−２３のいずれかの方法によりつくられた均質のパピローマウイルスＶＬＰ組成物。
25. 該ＶＬＰがヒト・パピローマウイルスＶＬＰである、請求項２４のＶＬＰ組成物。
26. 該ヒト・パピローマウイルスＶＬＰが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−７０およびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項２５の組成物。
27. Ｌ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質の組み合わせを含むパピローマウイルス・ウイルス様粒子（少なくとも１種の所望の部分を包含している粒子）をつくる方法であって、
    （ｉ）Ｌ１タンパク質またはＬ１とＬ２タンパク質の組み合わせからなるパピローマウイルスＶＬＰを含むＶＬＰ組成物を、該ＶＬＰを長時間、高濃度の還元剤含有の溶液と接触せしめることにより、解集合し、
    （ii）得られた小さい正しく折りたたまれた成分を、再集合されたパピローマウイルスＶＬＰ中に包含されるべき少なくとも１種の部分を含有し、かつ選択的に精製Ｌ２タンパク質を含有する溶液と接触せしめ、
    （iii）該還元剤を除去するか、または酸化剤を加えて、該小さい正しく折りたたまれた成分の該部分含有パピローマウイルスＶＬＰへの再集合を提供する、
    ことを含む方法。
28. 得られた小さい成分が正しく折りたたまれた成分である、請求項２７の方法。
29. 工程（ｉｉ）の小さい成分がＬ１タンパク質含有分子またはＬ１タンパク質含有分子とＬ２タンパク質含有分子の組合せを含む、請求項２７の方法。
30. 該再集合ＶＬＰ中に包含される少なくとも１種の部分が、核酸配列、放射核種、抗癌剤、ペプチド、抗ウイルス剤、細胞生長調節剤、ホルモン、サイトカイン、抗原、トキシンおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項２７の方法。
31. 該部分が核酸配列である、請求項２７の方法。
32. 該核酸配列がＤＮＡである、請求項３１の方法。
33. 該ＤＮＡが選択可能なマーカーをコードする、請求項３２の方法。
34. 該選択可能なマーカーが、該パピローマウイルスに感染した細胞中で発現される、請求項３３の方法。
35. 該ＤＮＡが最大８キロ塩基である、請求項３２の方法。
36. 解集合に用いられる溶液のイオン強度が０．２５モル／リットル以下である、請求項２７の方法。
37. 解集合に用いられる溶液のイオン強度が０．１５モル／リットル以下である、請求項３６の方法。
38. ＶＬＰがヒト・パピローマウイルスＶＬＰである、請求項２７の方法。
39. 該ヒト・パピローマウイルスＶＬＰが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−７０およびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項３８の方法。
40. 該スルフヒドリル還元剤がグルタチオン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、システイン、水素スルフィドおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項２７の方法。
41. 請求項２７−４０のいずれかの方法によりつくられるパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
42. 推定のパピローマウイルスワクチンまたは治療薬の効力を調べるインビトロ方法であって、
    （i）インビトロで該パピローマウイルスに感染した細胞を、請求項４１のパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって該部分が対応のパピローマウイルスのゲノムの少なくとも１つの断片であるかまたは発現を提供する配列に操作的に連結した選択可能なマーカーをコードするＤＮＡであるパピローマウイルスＶＬＰに、可能性ある治療薬または該パピローマウイルスに対する抗血清の存在または不存在で接触せしめ、
    （ii）該細胞中の該選択可能マーカーの発現または該パピローマウイルスＤＮＡの存在のレベルに基づいて、該推定のパピローマウイルス治療薬またはワクチンの可能性ある効力を検査する、
    ことを含む方法。
43. 該パピローマウイルスがヒト・パピローマウイルスである、請求項４２の方法。
44. 該ヒト・パピローマウイルスが、感染ウイルスの保存が利用できないものである、請求項４３の方法。
45. 選択可能なマーカーが、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼまたは他の選択可能なマーカーからなる群より選ばれる、請求項４２の方法。
46. 精製されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をつくる方法であって、下記の工程：
    （ｉ）パピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）含有の組成物と、少なくとも１種のスルフヒドリル還元剤を含有する溶液とを、該ＶＬＰを小さいＬ１タンパク質含有の分子および／または変異および／または化学的変更されたＬ１タンパク質形態に解集合するのに十分な時間、接触せしめることによりつくられた、解集合されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を精製し、
    （ii）工程（ｉ）から該解集合されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を該スルフヒドリル還元剤の除去または酸化により再集合せしめ、精製されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）つくること
    を含む方法。
47. 該ＶＬＰがヒト・パピローマウイルスＶＬＰである、請求項４６の方法。
48. 該ヒト・パピローマウイルスＶＬＰが、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４３、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−７０およびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項４７の方法。
49. 該ヒト・パピローマウイルスＶＬＰが、ＨＰＶ−１６ＶＬＰである、請求項４８の方法。
50. 該パピローマウイルスＶＬＰが１以上のＬ１タンパク質、変異Ｌ１タンパク質および化学的変更Ｌ１タンパク質を含み、かつＬ２タンパク質を含む、請求項４６の方法。
51. 請求項４６−５０のいずれかの方法によりつくられるパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
52. 均質のパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含有する組成物をつくる方法であって、下記の工程：
    （ｉ）該パピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含有する組成物を、該ＶＬＰを解集合するためのスルフヒドリル還元剤を含む溶液で処理することにより、該パピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含有する組成物を解集合し、
    （ii）スルフヒドリル還元剤の除去または酸化により該解集合されたパピローマウイルス・ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を再集合せしめること、なお、該再集合されたＶＬＰは中和抗体を誘発し得る、
    を含む方法。
53. 該ＶＰＬがＨＰＶ−１６のＬ１タンパク質または末端切断Ｌ１タンパク質を含む、請求項５２の方法。
54. スルフヒドリル還元剤が、透析、ろ過またはカラムクロマトグラフィーにより酸化または除去される、請求項５２または５３の方法。
55. 工程（ｉ）で使用される還元剤の濃度が少なくとも１重量％である、請求項５２−５４のいずれかの方法。
56. 該スルフヒドリル還元剤がグルタチオン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、システイン、水素スルフィドおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項５２−５５のいずれかの方法。
57. 請求項５２−５５のいずれかの方法によりつくられる均質ＶＬＰ組成物。

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