JP4338080B2 - アイチュリンａおよびその同族体の製造法 - Google Patents

Description

本発明は、大豆あるいはその抽出物を窒素源として含む液体培地でバチルス属微生物を培養し、培養液中に高濃度のアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積させるアイチュリンＡおよびその同族体の製造方法に関する。また、製造されたアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物、それを乾燥したアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物、それらの利用方法に関する。

バチルス（Bacillus）属微生物、特にバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）がアイチュリンＡおよびその同族体を生産することが、従来より知られている（例えば、ベッソン（Besson）その他，「ジャーナル オブ アンチバイオチクス（Journal of Antibiotics）」，1978年，第31巻，p.284-288（非特許文献１）参照。）。

アイチュリンＡおよびその同族体は、次に示す式１に記載の構造を有する化合物群のことを指し、真菌類、特に植物病原菌に対する抗菌作用を持つことから、優れた植物病害防除成分として注目されてきた。

（式中、Ｒは炭素数３ないし１０の直鎖型または分岐型アルキル基を示す。）
アイチュリンＡおよびその同族体の製造方法としては、特開昭59-212416号公報（特許文献１）、特開平7-143897号公報（特許文献２）等がある。

しかしながら、バチルス（Bacillus）属微生物が生産するアイチュリンＡおよびその同族体の生産性は低く、アイチュリンＡおよびその同族体もしくはこれらを含む培養物を工業的に利用するために十分な生産性が得られなかったため、多くの研究者によりアイチュリンＡおよびその同族体生産性を向上させる努力がなされてきた。
畑田らは、バチルス・ズブチリスＮｏ．ＮＡ−ａｐｂ−１株を栄養培地で好気的に培養し、アイチュリンＡ系物質を製造する方法を開示している（特公昭63-20519号公報（特許文献３）参照。この中で窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、コーンスターチリカー、グルテンミール、無機窒素源が教示されており、ペプトン、肉エキス、酵母エキスを含む培地で同株を培養して得られた培養ろ液３０ＬからアイチュリンＡ２７０ｍｇが得られる。Ｓａｎｄｒｉｎらは、プロリンを窒素源とした合成培地で４８０ｍｇ／ＬのアイチュリンＡおよびその同族体が得られることを開示している（「バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）」，1990年，第12巻，p.370-375（非特許文献２））。

Ｈｂｉｄらは、ペプトンを含む培地でアイチュリンＡおよびその同族体収量１３８８ｍｇ／Ｌが達成される方法を開示している（「アプライド バイオケミストリー アンド バイオテクノロジー（Applied Biochemistry and Biotechnology）」，1996年，第57/58巻，p.571-579（非特許文献３）参照。）。Ｐｈａｅらは、ペプトンを含む培地でアイチュリンＡおよびその同族体収量６２０ｍｇ／Ｌが達成される方法を開示している（「ジャーナル・オブ・ファーメンテイション・アンド・バイオエンジニアリング（Journal of Fermentation and Bioengineering）」，1991年，第71巻，p.118-121（非特許文献４）参照。）。

一方、大豆粉またはその抽出物を含む液体培地でバチルス（Bacillus）属微生物を培養する方法については、本発明者らにより、サーファクチンの製造法が開示されている（特開2002-176993号公報（特許文献４））。しかしながら、この公開特許公報にはアイチュリンＡおよびその同族体については何も開示されていない。また、前記特開昭59-212416号公報（特許文献１）には１％の大豆粉を含む培地で培養を行い、１６Ｌの培養液から３００ｍｇのアイチュリンＡおよびその同族体が得られることが開示されているが、アイチュリンＡの取得量は公知の培養方法で得られる量とほぼ同等であった。

大豆粉またはその抽出物を２質量％以上含む液体培地でアイチュリンＡおよびその同族体生産能を有するバチルス（Bacillus）属微生物を培養することにより培養液中に1.5ｇ／Ｌ以上の濃度でアイチュリンＡおよびその同族体が蓄積されることはこれまで知られていない。

ベッソン（Ｂｅｓｓｏｎ）その他，「ジャーナル オブ アンチバイオチクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，１９７８年，第３１巻，ｐ．２８４−２８８ 特開昭５９−２１２４１６号公報 特開平７−１４３８９７号公報 特公昭６３−２０５１９号公報 「バイオテクノロジー アンド アプライド バイオケミストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９０年，第１２巻，ｐ．３７０−３７５ 「アプライド バイオケミストリー アンド バイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，１９９６年，第５７／５８巻，ｐ．５７１−５７９ 「ジャーナル オブ ファーメンテイション アンド バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，１９９１年，第７１巻，ｐ．１１８−１２１ 特開２００２−１７６９９３号公報

従来のアイチュリンＡおよびその同族体生産性は工業的な利用に供するには十分でなく、さらに生産性を向上させる製造法が望まれていた。
したがって、本発明の課題は、アイチュリンＡおよびその同族体を生産するバチルス属微生物を培養し、培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体を高濃度に蓄積させるアイチュリンＡおよびその同族体の製造方法を提供することにある。
また、本発明の他の課題は、アイチュリンＡおよびその同族体、含有培養物、その固形物およびそれらの使用方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決すべく、各種培地成分について鋭意検討を重ねた結果、大豆の粉砕物あるいはその抽出物を窒素源として２質量％以上含有する培地においてアイチュリンＡおよびその同族体を生産するバチルス属微生物を培養することにより培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体が高濃度に蓄積されることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法、アイチュリンＡおよびその同族体含有培養物、およびアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物等に関する。

［１］アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有するバチルス（Bacillus）属微生物を大豆粉またはその抽出物を２質量％以上含む液体培地で培養し、培養液中に1.5ｇ／Ｌ以上の濃度でアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積させることを特徴とするアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［２］アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有するバチルス（Bacillus）属微生物が、1.5ｇ／Ｌ以上のアイチュリンＡおよびその同族体を含有する培地中で生育可能なバチルス（Bacillus）属微生物である前記１に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［３］アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有するバチルス（Bacillus）属微生物が、アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有しサーファクチン生産能を実質的に有さないバチルス（Bacillus）属微生物である前記１または２に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［４］液体培地が、リン酸塩の添加量をＫ₂ＨＰＯ₄換算で０〜３質量％にした液体培地である前記１に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［５］バチルス属微生物がバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）である前記１乃至３のいずれかに記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［６］バチルス属微生物がバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）である前記１乃至３のいずれかに記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［７］バチルス属微生物がバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）の変異株である前記１乃至３のいずれかに記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［８］大豆粉またはその抽出物を２質量％以上含む液体培地が、マルトース、水飴、可溶性デンプン、デキストリン、グルコース、ショ糖、およびフルクトースからなる群より選ばれる一種以上を含むものである前記１に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
［９］前記１乃至８のいずれかに記載の方法で培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積させたアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物。
［１０］前記９に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物を乾燥したアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物。
［１１］前記９または１０に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物または固形物を含有することを特徴とする植物病害防除剤。
［１２］前記９または１０に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物または固形物を精製せずに使用することを特徴とする植物病害防除方法。

発明の詳細な説明

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のアイチュリンＡおよびその同族体とは、下記式（１）で表される誘導体を意味する。

（式中、Ｒは炭素数３ないし１０の直鎖型または分岐型アルキル基を示す。）

本発明によれば、アイチュリンＡおよびその同族体を生産する微生物を培養する培地中に窒素源として大豆の粉砕物あるいはその抽出物を２質量％以上添加して培養を行うことにより培養液中に高い濃度でアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積できる。発明者らの知るところによれば、従来、大豆の粉砕物あるいはその抽出物を窒素源として含む培地でバチルス属微生物を培養することは知られていたが、アイチュリンＡおよびその同族体を生産する微生物を大豆の粉砕物あるいはその抽出物を窒素源として２質量％以上含む培地で培養し、培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体を高い濃度で蓄積することは本発明者が新規に見出したものである。

本発明で使用されるバチルス属微生物としては、アイチュリンＡおよびその同族体を生産するものであれば特に制限はないが、培地中にアイチュリンＡおよびその同族体を高い濃度で蓄積するため、高濃度のアイチュリン存在下で生育できる必要があることから、アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有し1.5ｇ／ＬのアイチュリンＡおよびその同族体を含有する培地中で生育可能なバチルス（Bacillus）属微生物が好ましい。また、好ましい他の例として、アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有しサーファクチン生産能を実質的に有さないバチルス（Bacillus）属微生物が好ましい。ここで言うサーファクチン生産能を実質的に有さないとは、大豆の粉砕物あるいはその抽出物を窒素源として含む培地で培養したとき、サーファクチンの蓄積量が５０ｐｐｍ以下であることをいう。アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有し1.5ｇ／ＬのアイチュリンＡおよびその同族体を含有する培地中で生育可能なバチルス（Bacillus）属微生物として、例えばバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）が好適である。

バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）は堆肥から分離されたものであり、以下の菌学的性質を示す。

細菌学的性質（ａ）形態(1)細菌の形：桿状(2)細菌の大きさ：0.7〜0.9×1.5〜3.0μｍ(3)多形性：なし(4)運動性：あり(5)胞子の有無：あり胞子の形：楕円形あるいは円筒状(6)グラム染色性：陽性(7)抗酸性：陰性（ｂ）生育状況肉汁寒天平板培養：コロニーは円形で大きさは直径１〜２ｍｍ、周縁形は波状、粘性あり、光沢無し。（ｃ）生理学的性質(1)硝酸塩の還元：陽性(2)ＶＰテスト：陽性(3)インドールの生成：陰性(4)クエン酸の利用：陽性(5)コハク酸の利用：陰性(6)プロピオン酸の利用：陰性(7)酒石酸の利用：陰性(8)ウレアーゼ：陰性(9)オキシダーゼ：陽性(10)カタラーゼ：陽性(11)生育の範囲：ｐＨ５〜９温度２０〜５０℃(12)１０％ＮａＣｌ培地：生育(13)嫌気培養：陰性(14)卵黄反応：陰性(15)デンプンの加水分解：陽性(16)アルギニンの分解：陽性(17)チロシンの分解：陰性(18)ゼラチンの液化：陽性(19)エスクリンの分解：陽性(20)ＯＦテスト：酸化的(21)グルコースからの酸生成：陰性

前記バチルス・ズブチリスは、２００２年９月２４日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所に寄託され（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１９０３２）、２００３年７月１０日に国際寄託に移管されている（国際受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）。

また、本発明にはバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）から突然変異によって取得された変異株も好適に使用できる。変異株は自然突然変異株として、平板培地上のコロニーの形状が変化したものを選抜することによっても得ることができるし、バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）に化学的または物理的変異誘発因子を作用させ、アイチュリンＡおよびその同族体収量が変化した菌株ストックを作成し、ここから生産能が増大したコロニーを単離することにより得られる。

化学的変異誘発物質としては、例えばＥＭＳ（エチルメタンスルフォネート）、ジエチルサルフェート、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）等が使用できる。物理的変異誘発因子としては、変異誘発量の紫外線、ガンマ線、Ｘ線等が使用できる。

変異菌株ストックを作成する方法としては、例えばＮＢ（Nutrient Broth;Difco Laboratories社製）等の栄養培地で対数増殖期まで生育させたバチルス・ズブチリスを集菌し、洗浄後に生理食塩水に懸濁し、変異誘発量のＮＴＧを添加して変異を誘発し、再度集菌、洗浄してＮＴＧを除去し、再度ＮＢ（Difco Laboratories社製）等の栄養培地で培養することにより変異菌株ストックを作成する方法等が挙げられる。

生産能が増大したコロニーを単離する方法としては、例えばヒツジ血液を添加したＴＢＡＢ（Tryptose Blood Agar Base;Difco Laboratories社製）等の培地に寒天を加えて調製した平板培地上に適当に希釈した変異菌株ストックを塗布し、生育したバチルス・ズブチリスのコロニーの周囲に形成されるクリアゾーンの大きさが他より大きいコロニーを選抜することによりアイチュリンＡおよびその同族体を高濃度で生産できる突然変異株を選別することができる。

ついで、このようにして単離されたバチルス・ズブチリスの変異株のアイチュリンＡおよびその同族体生産性を、コントロールとしてバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）を使用し、試験管培養により確認することができる。

以下、本発明のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法を説明する。
本発明のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法は、最も簡便には、例えばバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）を、Ｌ培地等の栄養培地で、２５〜４２℃、好ましくは２８〜３８℃の温度で５〜２４時間程度培養し、得られた培養液を大豆粉あるいはその抽出物を窒素源として含む培地に0.1〜１０質量％、好ましくは0.5〜７質量％、より好ましくは１〜５質量％植菌する。これを２５〜４２℃、好ましくは２８〜３５℃の温度で３０〜１５０時間程度培養することにより達せられる。上記温度範囲を外れた場合にはアイチュリンＡおよびその同族体の生産が著しく低下するため、好ましくない。

本発明において大豆粉あるいはその抽出物とは、大豆または脱脂大豆を顆粒状に粉砕した粗粒大豆粉、粉末状に粉砕した粉砕大豆粉、それらの抽出物（例えば、熱水抽出物）、加水分解物（例えば、酸加水分解物、酵素加水分解物）等のことを言う。大豆粉あるいはその抽出物の濃度は２質量％以上が望ましい。しかし、一方で大豆粉あるいはその抽出物が高濃度になると滅菌が不十分になるおそれがあるので、２０質量％濃度を超えないことが望ましい。よって高い生産量を得るための大豆粉あるいはその抽出物濃度は２〜２０質量％であり、好ましくは３〜１７質量％、より好ましくは４〜１４質量％である。

本発明に使用する培地には、大豆粉あるいはその抽出物の他に、通常使用する異化可能な炭素源、窒素源および無機塩等を含有させることができる。さらに必要であればアミノ酸および／またはビタミン等を添加することができる。

異化可能な炭素源としては、グルコース、マルトース、ショ糖、フルクトース、可溶性デンプン、水飴、デキストリン、糖蜜、馬鈴薯エキス、モルト、ピート、植物油、コーンスティープリカー、フルクトース、シロップ、糖質（sugar）、液糖（liquid sugar）、転化糖（invert sugar）、アルコール、有機酸、有機酸塩、アルカンまたは他の一般的な炭素源が利用でき、単独、あるいはこれらを組み合わせて使用することができ、これらのなかでもマルトース、可溶性デンプン、水飴、デキストリンが好ましい。これらは通常0.01〜５０質量％、好ましくは１〜４０質量％程度の濃度で用いることができる。

また、異化可能な窒素源としては、たとえば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アンモニア、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、グルタミン酸ナトリウム、尿素、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン水解物、フェザーミール、酵母エキス等の無機または有機窒素を含有するものが利用でき、これらを単独、あるいは組み合わせて使用することができる。これらは、通常0.01〜３０質量％、好ましくは0.1〜１０質量％程度の濃度で用いるのがよい。

さらに、無機成分として、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、鉄イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、モリブデンイオン、硫酸イオン、塩化物イオンまたは硝酸イオン等のカチオンまたはアニオンを添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、マグネシウム塩として１０ｐｐｍ〜２質量％、リン酸塩以外の他の塩は0.1ｐｐｍ〜1000ｐｐｍ程度である。リン酸イオンはリン酸塩として添加することができるが、添加濃度がＫ₂ＨＰＯ₄換算で３質量％より高いとアイチュリンＡおよびその同族体の蓄積濃度が低下するため、３質量％以下であることが好ましく、さらに好ましくはリン酸イオンを添加しない培地である。

また、添加するアミノ酸としては、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システイン、シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｄ−バリン、Ｄ−イソロイシン等が挙げられ、これらを１種または２種以上添加することができる。添加濃度は0.001〜５質量％、好ましくは0.01〜１質量％程度である。

ビタミンとしてはビオチン、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ピリドキサール、ピリドキシン、ｍｙｏ−イノシトール、コリン、葉酸、コバラミン、シアノコバラミン等を１種または２種以上添加することができる。添加濃度は0.1〜１００ｐｐｍであり、好ましくは１〜５０ｐｐｍである。

本発明における培養では、試験管、フラスコ、発酵槽等の容器に上記の培地を添加し、強く通気しながら、培養を行う。

試験管、フラスコ等の容器を用いた培養の場合は強く振とうすることにより通気を行い、培地の初発のｐＨを6.5〜8.0に調整する。発酵槽等の容器により高濃度の生産を行う場合は無菌空気を通気し、撹拌しながら培養を行い、発泡があって培養が困難な場合は通常使用される一般的な消泡剤を添加することができる。

培地のｐＨは6.0〜9.0、好ましくは6.5〜8.0、より好ましくは6.8〜7.3に維持する。ｐＨの調節は、例えばアンモニア水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液または炭酸カリウム水溶液等の塩基性水溶液の添加によって行うが、それらの中でもアンモニア水溶液を使用することが好ましい。アンモニア水溶液の濃度は８〜２５質量％程度がよい。このような培養を好適な条件下で行うことにより、３０〜１５０時間でアイチュリンＡおよびその同族体を1.5ｇ／Ｌ以上の濃度で含むアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物が得られる。

上記培養物を凍結乾燥、噴霧乾燥等の既知の方法で乾燥することにより、アイチュリンＡおよびその同族体含有固形物を得ることができる。これらのアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物、およびアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物は、農地の土壌に施用したり、あるいは農作物の葉面に散布したりすることにより植物病害を防除する作用効果を示すので有用である。
これらのアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物およびアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物もまた本発明に含まれる。
また、アイチュリンＡおよびその同族体含有培養物からアイチュリンＡおよびその同族体を回収し精製することができる。精製は、例えば培養物を硫酸、塩酸、硝酸等の添加により酸性にし、沈殿したアイチュリンＡおよびその同族体をメタノール、エタノール、クロロホルム等の有機溶媒による抽出、活性炭処理、結晶化等の公知の方法で行うことができる。

本発明により得られるアイチュリンＡおよびその同族体は、植物病害防除剤の他、例えば洗浄剤、乳化剤、湿潤剤、分散剤、可溶化剤、帯電防止剤、防曇剤、滑剤として用いることができ、化粧品、食品、医薬品、農薬等へ分野の配合剤として有用である。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら限定されるものではない。

バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）の変異株の取得例１：
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）を、Ｌ培地（ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水で１Ｌとする）５ｍＬに植菌し、３５℃、３００ｒｐｍで１６時間培養した。ついで、同培地５ｍＬに、得られた培養液を１ｖ／ｖ％植菌し、３５℃、３００ｒｐｍでＯＤ６６０が0.2となるまで培養した。その後、菌体を遠心分離により回収し、上清を捨て、ＰＢＳ緩衝液（0.8ｗ／ｖ％ＮａＣｌ、0.02ｗ／ｖ％ＫＣｌ、0.144ｗ／ｖ％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、0.024ｗ／ｖ％ＫＨ₂ＰＯ₄、ＨＣｌでｐＨ7.4に調整）５ｍＬで３回洗浄し、同緩衝液0.5ｍＬに再度懸濁した。

2000ｐｐｍのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン水溶液0.05ｍＬを懸濁液に添加し、３０℃で１０分間静置した。懸濁液を遠心分離し、上清を捨て、菌体を同緩衝液５ｍＬで３回洗浄し、新たなＬ培地１ｍＬ中に再度懸濁した。懸濁液をＬ培地４ｍＬに添加し、３５℃で一晩生育させた後、５０質量％グリセリン水溶液2.5ｍＬを添加し、凍結保存用バイアルに少量ずつ分注し、−１３５℃で凍結させ、形質転換体保存ストックとした。

ついで、５ｗ／ｖ％ヒツジ血液、４ｗ／ｖ％グルコース、0.1ｗ／ｖ％ＮＢ（Difco Laboratories社製）、0.1ｗ／ｖ％酵母エキスを含む寒天平板培地（Applied Environmental Microbiology,42:408〜412(1981)）50000プレートに、約２００コロニー／プレートとなるように滅菌水で希釈した形質転換体保存ストックを塗布した。３５℃で２０〜４８時間インキュベートした後、生育したコロニーの周囲に形成されたクリアゾーンを観察し、大きいクリアゾーンを形成するコロニーを50000コロニー選抜した。

バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）および得られた50000コロニーをＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。下記組成Ａの培地１ｍＬを試験管に分注し、Ｌ平板培地から１白金耳をとり植菌し、３５℃で７２時間培養を行った。

［組成Ａ］（単位は質量％）
大豆粉 ８
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
イオン交換水 残部

培養液を遠心分離し、上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により以下の条件で定量した。
サンプル量：１０μＬ、
カラム：ShodexシリカＣ１８Ｐ４Ｅ、4.6ｍｍ×２５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）、
カラム温度：４０℃、
溶離液：アセトニトリル：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液＝３５：７５（ｖ／ｖ）、
流速：1.5ｍＬ／ｍｉｎ、
検出器：ＵＶ検出器、
波長：２０５ｎｍ。
定量はアイチュリンＡおよびその同族体の標準サンプル（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて検量線を作成して測定した。

アイチュリンＡおよびその同族体の蓄積濃度がバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）より向上したアイチュリンＡおよびその同族体高生産変異株（変異株１）を取得した。

バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）の変異株の取得例２：
取得例１の培養上清中のサーファクチン濃度をＨＰＬＣ法により以下の条件で定量した。
サンプル量：２０μＬ、
カラム：Shodex
シリカＣ１８Ｐ４Ｅ、4.6ｍｍ×２５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）
カラム温度：４０℃、
溶離液：アセトニトリル：１９ｍＭ トリフルオロ酢酸水溶液＝８０：２０（ｖ／ｖ）
流速：1.0ｍＬ／ｍｉｎ、
検出器：ＵＶ検出器、
波長：２０５ｎｍ。
定量はサーファクチンの標準サンプル（シグマ−アルドリッチ社製）を用いて検量線を作成して測定した。

上記条件で検出されず、サーファクチン蓄積濃度が５０ｐｐｍ以下である実質的にサーファクチン非生産の変異株（変異株２）を取得した。

実施例１：試験管培養におけるアイチュリンＡおよびその同族体の生産に対する窒素源の効果
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）をＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。下記組成Ｂの培地１ｍＬを試験管に分注し、Ｌ平板培地から１白金耳をとり植菌し、３５℃で７２時間培養を行った。

［組成Ｂ］（単位は質量％）
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
窒素源＊ 2.0
イオン交換水 残部
＊：大豆粉、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素グルタミン酸ナトリウムおよびペプトンから１種を選択。

培養液を遠心分離し、上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により定量した。

各窒素源に対するアイチュリンＡおよびその同族体の蓄積濃度は以下の通りであった。
大豆粉 1.5ｇ／Ｌ
硝酸カリウム 0.03ｇ／Ｌ
硝酸アンモニウム 0.03ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム 0.03ｇ／Ｌ
尿素 0.03ｇ／Ｌ
グルタミン酸ナトリウム 0.1ｇ／Ｌ
ペプトン 0.15ｇ／Ｌ

実施例２：試験管培養におけるアイチュリンＡおよびその同族体の生産に対する大豆粉濃度の効果
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）をＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。下記組成Ｃ、ＤおよびＥの培地各１ｍＬを試験管に分注し、Ｌ平板培地から１白金耳をとり植菌し、３５℃で７２時間培養を行った。

［組成Ｃ］（単位は質量％）
大豆粉 １
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
イオン交換水 残部

［組成Ｄ］（単位は質量％）
大豆粉 ２
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
イオン交換水 残部

［組成性Ｅ］（単位は質量％）
大豆粉 ８
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
イオン交換水 残部

培養液を遠心分離し、上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により定量した。各培地に対するアイチュリンＡおよびその同族体量は以下の通りであった。
組成Ｃ： 0.3ｇ／Ｌ
組成Ｄ： 1.5ｇ／Ｌ
組成Ｅ： 3.8ｇ／Ｌ

実施例３：試験管培養におけるアイチュリンＡおよびその同族体の生産に対する炭素源の効果
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）をＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。下記組成Ｆに下記の炭素源を添加した培地各１ｍＬを試験管に分注し、Ｌ平板培地から１白金耳をとり植菌し、３５℃で７２時間培養を行った。

［組成Ｆ］（単位は質量％）
大豆粉 ８
Ｋ₂ＨＰＯ₄ 0.5
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
炭素源＊ 6.7
イオン交換水 残部
＊：マルトース、可溶性デンプン、水飴、デキストリン、グルコース、ショ糖およびフルクトースから１種を選択。

培養液を遠心分離し、上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により定量した。各炭素源に対するアイチュリンＡおよびその同族体の蓄積濃度は以下の通りであった。
マルトース 3.8ｇ／Ｌ
可溶性デンプン 3.8ｇ／Ｌ
水飴 3.8ｇ／Ｌ
デキストリン 3.8ｇ／Ｌ
グルコース 2.8ｇ／Ｌ
ショ糖 2.2ｇ／Ｌ
フルクトース 2.3ｇ／Ｌ

実施例４：試験管培養におけるアイチュリンＡおよびその同族体の生産に対するリン酸塩の効果
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）をＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。下記組成Ｇに下記(1)〜(6)の濃度のＫ₂ＨＰＯ₄を添加した６種の培地各１ｍＬを試験管に分注し、Ｌ平板培地から１白金耳をとり植菌し、３５℃で７２時間培養を行った。

［組成Ｇ］（単位は質量％）
大豆粉 ８
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.05
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.0025
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.0022
ＣａＣｌ₂ 0.0184
マルトース 6.7
Ｋ₂ＨＰＯ₄
(1) ０ 質量％（添加せず。）
(2) 0.1質量％
(3) 0.5質量％
(4) 1.5質量％
(5) 3.0質量％
(6) 4.5質量％
イオン交換水 残部

炭酸ナトリウムでｐＨ７に調整後、培養液を遠心分離し、上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により定量した。各Ｋ₂ＨＰＯ₄濃度に対するアイチュリンＡおよびその同族体の蓄積濃度は以下の通りであった。

(1) ０ 質量％ 3.8ｇ／Ｌ
(2) 0.1質量％ 3.6ｇ／Ｌ
(3) 0.5質量％ 3.5ｇ／Ｌ
(4) 1.5質量％ 3.0ｇ／Ｌ
(5) 3.0質量％ 2.2ｇ／Ｌ
(6) 4.5質量％ 1.5ｇ／Ｌ

実施例５：発酵槽におけるアイチュリンＡおよびその同族体の生産
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）、変異株１および変異株２をＬ平板培地に画線し、３５℃で一晩生育させた。そこからＬ培地５０ｍＬを添加したバッフル付きフラスコに１白金耳植菌し、３５℃、１５０ｒｐｍで８時間培養した。下記組成Ｈの培地を５Ｌ容の発酵槽に作成し、Ｌ培地の培養液を添加し、２０％アンモニア水でｐＨを6.5〜7.5に調整しながら３５℃で１５０時間培養を行った。

［組成Ｈ］
大豆粉 １６０ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ５ｇ
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.25ｇ
ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.22ｇ
ＣａＣｌ₂ 1.84ｇ
水飴 ４５０ｇ
イオン交換水 1383ｇ

培養液を遠心分離した上清に含まれるアイチュリンＡおよびその同族体をＨＰＬＣ法により定量した。アイチュリンＡおよびその同族体量は以下の通りであった。
バチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７） 3.8ｇ／Ｌ
変異株１ 6.7ｇ／Ｌ
変異株２ 6.7ｇ／Ｌ
この結果より、これらの菌株はいずれも1.5ｇ／Ｌ以上のアイチュリン存在下で生育できることが明らかである。

本発明によれば、医薬品、農薬、食品、化粧品、化学品等の幅広い様々な産業分野において有用なアイチュリンＡおよびその同族体を安価な培地原料を用いて従来の方法に比較して飛躍的に高濃度で生産することができる。

また、農薬、植物病害防除の分野においては、培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体を高濃度で生産できるため、これまで、培養液そのままでは濃度の不足していた用途に培養液をそのまま使用することも可能となる。

Claims (7)

1. アイチュリンＡおよびその同族体生産能を有し、大豆の粉砕物あるいはその抽出物を窒素源として含む培地で培養したとき、サーファクチンの蓄積量が５０ｐｐｍ以下であるバチルス（Bacillus）属微生物を大豆粉またはその抽出物を２質量％以上含む液体培地で培養し、培養液中に1.5ｇ／Ｌ以上の濃度でアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積させるアイチュリンＡおよびその同族体の製造法であって、前記微生物がバチルス・ズブチリス（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２７）またはその変異株である製造法。
2. 液体培地が、リン酸塩の添加量をＫ₂ＨＰＯ₄換算で０〜３質量％にした液体培地である請求項１に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
3. 大豆粉またはその抽出物を２質量％以上含む液体培地が、マルトース、水飴、可溶性デンプン、デキストリン、グルコース、ショ糖、およびフルクトースからなる群より選ばれる一種以上を含むものである請求項１に記載のアイチュリンＡおよびその同族体の製造法。
4. 請求項１乃至３のいずれかに記載の方法で培養液中にアイチュリンＡおよびその同族体を蓄積させたアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物。
5. 請求項４に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物を乾燥したアイチュリンＡおよびその同族体含有固形物。
6. 請求項４または５に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物または固形物を含有することを特徴とする植物病害防除剤。
7. 請求項４または５に記載のアイチュリンＡおよびその同族体含有培養物または固形物を精製せずに使用することを特徴とする植物病害防除方法。