JP5118977B2 - 経口投与のための弱毒化生ロタウイルスワクチン - Google Patents

Description

本発明は、医薬組成物およびワクチンとして有用である新規液体ロタウイルス製剤、それらを調製する方法、ならびにロタウイルス、特に、ヒトロタウイルスに関連する疾患の防止におけるそれらの使用に関する。

急性の感染性下痢は、世界の多くの地域における疾患および死亡の主要な原因である。発展途上国においては、下痢性疾患の影響は非常に重要である。アジア、アフリカおよびラテンアメリカについては、毎年30〜40億人の下痢の事例があり、そのうち約500万〜1000万人が死亡すると見積もられてきた(Walsh, J.A.ら、N. Engl.J. Med., 301:967-974 (1979))。

ロタウイルスは、乳児および幼児における重篤な下痢の最も重要な原因の1つであると認識されてきた(Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, 第3版、Fieldsら(編)、Raven Publishers, Philadelphia, 1996)。ロタウイルス疾患は、年に600,000人を超える死亡の原因であると見積もられている。ロタウイルスにより誘導される病気は、最も一般的には、6〜24ヶ月齢の子供を襲い、この疾患のピークの流行は、一般的には、温暖気候においては寒冷月中に、および熱帯地方においては1年を通じて発生する。ロタウイルスは、典型的には、約1〜約3日の潜伏期間で、顔面-経口経路により人から人へ伝染する。6〜24ヶ月齢群における感染とは異なり、新生児は一般的には無症候性であるか、または軽度な疾患のみを有する。通常、幼児において遭遇する重篤な疾患とは対照的に、多くの成人は以前のロタウイルス感染の結果として保護されるため、多くの成人の感染は軽度であるか、または無症候性である(Offit, P.A.ら、Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982)。

ロタウイルスは球状であり、その名前はそれらの独特の外殻および内殻または二重殻キャプシド構造に由来する。典型的には、ロタウイルスの二重殻キャプシド構造は、ゲノムを含む内部タンパク質殻またはコアを取り囲む。ロタウイルスのゲノムは、少なくとも11個の異なるウイルスタンパク質をコードする二本鎖RNAの11個の断片から構成される。VP4(Pタンパク質)およびVP7(Gタンパク質)と命名された2個のこれらのウイルスタンパク質は、二重殻キャプシド構造の外部に配置された構造タンパク質である。ロタウイルスの内部キャプシドは、VP6と命名されたロタウイルスタンパク質である1つのタンパク質を提供する。ロタウイルス感染後の免疫応答の誘導におけるこれらの3つの特定のロタウイルスタンパク質の相対的な重要性は、依然として明らかではない。にもかかわらず、VP6タンパク質は群抗原およびサブ群抗原を決定し、VP4およびVP7タンパク質は血清型特異性の決定因子である。

現在まで、少なくとも14種類のロタウイルスG血清型および11種類のP血清型が同定されている(Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330)。これらのうち、10種類のG血清型および6種類のP血清型が、ヒトロタウイルスの間で同定されている。

VP7タンパク質は、株に応じて、ゲノム断片7、8または9の翻訳産物である38,000 MWの糖タンパク質(グリコシル化されていない場合、34,000 MW)である。このタンパク質は、ロタウイルス感染後の主要な中和抗体の形成を刺激する。VP4タンパク質は、ゲノム断片4の翻訳産物である約88,000 MWの非グリコシル化タンパク質である。このタンパク質も、ロタウイルス感染後の中和抗体を刺激する。VP4およびVP7タンパク質は中和抗体に対するウイルスタンパク質であるので、これらはロタウイルス疾患に対する防御を提供する、ロタウイルスワクチンの開発のための第一候補であると考えられる。

早期の幼児期における天然ロタウイルス感染は、防御免疫を引き出すことが知られている。

ロタウイルス感染を防止するための早期のワクチン開発は、該ウイルスの発見後、1970年代に始まった。最初は、動物およびヒトに由来する弱毒化株が研究されたが、より最近の努力はヒト-動物再集合体に焦点を当てられている。

新規ロタウイルス製剤の開発は、全世界での配給能力ならびに様々な環境および保存条件下での安定性などの、いくつかの要件に従わなければならない。具体的には、製剤、特に、医薬組成物またはワクチン組成物の安定性は、一般的には、室温以上の温度と比較して、より低い温度でより良好であろう。

その結果、1つの安定化方法は、凍結保存(-20℃〜-70℃)することができるワクチン製剤を開発するか、またはあるいは、冷蔵温度(2℃〜8℃)周辺で長時間維持することができる凍結乾燥ワクチンを開発することであった。しかしながら、凍結乾燥プロセスは限定的な能力を有し、高い製造費用に関連することは公知の事実である。さらに、凍結乾燥ワクチンは、それらが、1つのチェンバー中には活性成分を、別のチェンバーには再構成液体を含む、複数チェンバー／バイアルのワクチンなどの、より複雑な、従って、比較的高価な装置を要し得るため、投与のためにより精巧な取り扱いを有する。凍結乾燥ワクチンはまた、より高い輸送費用および保存費用にも関連する。これらのオプションは、投与装置を財政的に手ごろにしなければならず、製造および保存のインフラストラクチャーの利用可能性が存在しないか、または信頼できないものであり得る発展途上世界におけるいくつかの国にとっては不十分なものであり得る。

ロタウイルスは、従来的にはヒト乳児に経口投与されるので、この経路は免疫原性ロタウイルス組成物に対するいくつかのチャレンジをもたらす。

ロタウイルスは、例えば、酸性バッファーまたは酸性の胃液への曝露に際して、酸性環境においては迅速に不活化される(C. WeissおよびH.F. Clark, 1985, J. Gen. Virol.,66, 2725-2730; T. Vesikariら、1984, The Lancet, 700頁; R.H.FosterおよびA.J.Wagstaff, 1998, BioDrugs Feb: 9(2) 155-178)。従って、ロタウイルス組成物を、それらが保存中および宿主レシピエントへの投与後に安定である方法で製剤化するのが望ましい。

ロタウイルスワクチンは、早くは4週齢の新生児に投与されることを主に意図される。2 ml未満または1.5 ml未満の用量などの少ないワクチン用量が、その集団にとって有利であろう。従って、ロタウイルス組成物を小用量で製剤化するのが望ましい。

液体ウイルスワクチンのための安定化製剤は公知である。例えば、EP 0 065 905は、麻疹またはインフルエンザを引き起こすものなどの一連のウイルスにとって好適な安定化組成物を一般的に開示し、特に、それは弱毒化生ウイルスにとって好適な安定化リン酸バッファー含有溶液を開示している。

他の安定化製剤は、WO 98/13065およびClarkら(Pediatr Infect Dis J. 2003 Oct; 22(10): 914-20)に開示されている。そのような製剤はまた、他の構成成分のうち、胃酸を中和する緩衝剤として働くリン酸塩の存在をも必要とする。しかしながら、これらの製剤は、ロタウイルス製剤の開発の成功について上記で設定された要件に適合せず、特に、それらはヒト乳児に最も適合するワクチン用量の容量の減少と適合しない。特に、本発明者は、効率的な制酸能力を維持しながら、1.5 ml以下などの低い用量設定に、この従来技術の製剤を適合させることは、製剤の構成成分、特に、リン酸バッファーの不適当な濃度から生じる問題をもたらす。

従って、代替的なロタウイルス製剤、特に、胃酸に抵抗することができ、リン酸塩が存在しないにも関わらず冷蔵庫で安定である代替的な液体製剤を開発する必要がある。さらに、そのような代替製剤を、できるだけ少ないワクチン用量で製剤化することもできる必要がある。

従って、本発明は、リン酸塩を含まないか、または最小量のリン酸塩のみを含む代替的な安定な免疫原性組成物を提供するだけでなく、ヒト乳児への経口投与にとって好適である低用量でロタウイルスを製剤化することもできる。

従って、本発明の第1の態様においては、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩を含む、ヒト乳児への経口投与にとって好適である液体ロタウイルス免疫原性組成物であって、約5.0〜約8.0のpHを有し、5 mM未満のリン酸塩を含む前記組成物が提供される。好適には、特許請求された組成物におけるリン酸塩の濃度は、1 mMを超えない。

本発明の特定の態様においては、好適なワクチン用量は、新生児または乳児への経口投与にとって好適である、通常は1.5 mlまたは好適には、2 ml以下の容量などの2.5 mlより少ない任意の容量であろう。特に、この用量は、前記製剤の技術的実現が可能であり、該製剤の免疫原性に対する有害な作用がないようなものであろう。特許請求された組成物は、2.0 mlより少ないものなどの通常より少ない用量の製剤と適合可能であるか、または1.5 ml以下の用量と適合可能にさせながら、胃酸に抵抗することができ、長い保存期間に渡って免疫原性および安定性を保持することができる従来技術のリン酸塩含有製剤を超える利点を提供する。

特定の実施形態においては、本発明による液体免疫原性組成物は、Baby Rossett-Riceアッセイ(基本的Rossett-Rice試験から、実施例III.2.2に詳細に記載のように適合させた)により評価されるように、6〜23分の制酸能力を有する。好適には、この制酸能力は、少なくとも8分、典型的には、少なくとも12分であり、好適な範囲は12〜20分である。驚くべきことに、特許請求された組成物は、リン酸塩を含有する従来技術の製剤と比較して、より少ない用量においてさえ、許容し得るだけでなく、より高い制酸能力を示した。

別の態様においては、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩を、製薬上許容し得る希釈剤と混合することを含む、前記液体ロタウイルス免疫原性組成物の調製のための方法が提供される。

本発明はまた、別の態様においては、ヒトにおけるロタウイルスに関連する疾患の予防または治療のための経口免疫原性組成物であって、5 mMを超えるリン酸塩を含まず、約5.0〜約8.0のpHを有する前記組成物の製造のための、カルボン酸塩および糖との混合物中でのロタウイルス抗原の使用を提供する。

さらなる態様においては、有効量の前記液体免疫原性組成物を、それを必要とするヒト被験者に投与することにより、ヒトにおけるロタウイルスに関連する疾患を治療または予防する方法も提供する。

本発明の他の態様および利点を、好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに説明する。

本発明者は、冷蔵庫温度(2〜7℃、典型的には、4℃)で免疫原性であり、安定であり、経口投与した場合に、胃の本来の酸の性質に抵抗することができ、および少ない用量と適合可能である新規液体ロタウイルス組成物を開発した。

液体組成物とは、乾燥形態とは対照的に、液体形態の製剤を意味することが意図され、その容量は一定の特定条件(例えば、室温または冷蔵庫温度で、大気圧で)の下で固定されており、その形状はそれを充填する容器により決定される。

本明細書で言及される刊行物および特許または特許出願の主題およびその中に開示される情報は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

本明細書の用語「含む」(comprising、compriseおよびcomprises)は、必要に応じて、全ての例において、それぞれ用語「からなる」(consisting of、consist ofおよびconsists of)と置換可能であることが本発明者により意図される。

本発明は、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩を含む液体ロタウイルス免疫原性組成物であって、約5.0〜約8.0のpHを有し、5 mM未満のリン酸を含む前記組成物を提供する。本発明の組成物は、リン酸含有製剤と比較した場合、免疫原性プロフィールを維持しながら、非常に良好な安定性プロフィールを示す。これらの組成物は、そのリン酸塩を含有する対応物と少なくとも同じ程度に安定である。本発明の組成物のさらなる利点は、それらを、リン酸塩が存在する従来技術の製剤と比較して、2.0 ml未満、典型的には、例えば1.5 mlなどの小さい用量で調製することができることである。

特定の実施形態においては、免疫原性組成物内のリン酸塩の濃度は、5 mMを超えず、好適には1 mMであり、特に、それは0.5 mMを超えない。リン酸塩とは、リン酸の塩(オルトリン酸(H₃PO₄)としても知られる)を指し、通常はナトリウム塩もしくはカリウム塩またはナトリウム塩とカリウム塩の混合物を用いる(例えば、Na₃PO₄、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、K₃PO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄)。好適には、リン酸塩濃度は、0.4 mM以下、典型的には、0.2 mM以下、理想的には、0.1 mM以下である。別の特定の実施形態においては、本明細書で特許請求された組成物は、リン酸塩を含まない。典型的には、存在する場合、リン酸塩は、DMEM(Dulbeccoの改変イーグル培地)、Eagle BME基本培地またはPBSなどの、細胞培養培地または希釈剤として用いられる生理食塩水バッファーから生じる。

本明細書を通して言及されるリン酸塩濃度は、特許請求された組成物の調製において操作されるリン酸塩含有化合物の量から決定される、計算された濃度であろう。あるいは、本明細書で特許請求された組成物中に存在するリン酸塩の濃度を、分析的な日常的技術を用いて実験的に測定することができる。

1つの好適な技術は、Macherey-Nagal(カタログ番号91878)により市販されている「Nanocolor」という名称の比色アッセイである。この方法は、酸溶液中でリン酸-モリブデン酸塩-バナジウム酸塩により形成される黄色の複合体の光度定量に基づく。該アッセイの定量限界は、2μg/mlリン酸塩または0.02 mMである。

代替的な方法は、誘導結合プラズマ原子発光分析(ICP-AES) (Boss & Fredeen、「誘導結合プラズマ発光分析における概念、装置、および技術(Concepts, Instrumentation, and Techniques in Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy)」、Perkin Elmer(編)、第2版、1997 - 72ページ前方の方法)などの原子発光分析技術によるリン(P)の投与である。このアッセイの定量限界は、0.030μg/mlリンであり、これは0.00032 mMのリン酸塩濃度に対応する。

一実施形態においては、前記組成物のpHは、5.0〜8.0である。別の特定の実施形態においては、特許請求された組成物のpHは、約5.5〜約7.5である。「pH約」とは、記述されたpH値の0.2単位内を意味する。特に、前記組成物のpHは、5.5〜7.5である。例えば、該組成物のpHは、約6.0〜約7.0であり、特に、6.0〜7.0であり、典型的には、6.2〜6.8であるか、または6.2〜6.6である。約6.4、特に6.4のpHが想定される。ロタウイルスは、4.0未満のpHなどの酸性pHでは悪影響を与えることが知られており、最大の安定性が、中性またはわずかに塩基性のpH、すなわち、例えば、従来技術のリン酸緩衝製剤において得られる、7.0〜8.0のpH範囲で得られることが期待される。実験の節に示されるように、本発明の組成物は、リン酸塩を含まないにも関わらず、特許請求されたpH範囲で良好な安定性プロフィールを示し、さらに、驚くべきことに、中程度に酸性の条件下、すなわち、例えば、約6.4のpHなどの約6.0〜7.0のpHでさえ、許容し得る安定性および免疫原性プロフィールを示した。

本明細書で特許請求された液体組成物は、カルボン酸塩を含む。

カルボン酸塩(「-COO-」)は、解離した形態のカルボン酸であり、塩基性基質により酸機能(「-COOH」)の中和をもたらす。カルボン酸は、カルボキシル基：「-COOH」を含む化合物であり、正式には、カルボニル基(「-CO-」)とヒドロキシル基(「-OH」)を組合わせることにより作製される。しかしながら、これらの2つの部分の間の相互作用は、全体の基がそれ自身の特徴的な特性を有する新しい機能として考えられるその化学的特性を改変する(J.B. Hendrickson, D.J. CramおよびG.S. HammondによるOrganic Chemistry, McGraw-Hill Book Company, 第3版, 1970, 131頁)。国際純正応用化学連盟(IUPAC)はアルカン酸(モノカルボン酸について)およびアルカンジオン酸(ジカルボン酸について)命名法を使用することを推奨したが、多くのカルボン酸の慣用名は、これらの生成物が当業者によく知られているため、本文中で用いられている。例えば、酢酸のIUPAC名は、エタノン酸であり、アジピン酸については、その名前はヘキサンジオン酸であろう。

特定の実施形態においては、無機酸または、好適には、有機酸に由来するカルボン酸塩を用いる。特定の実施形態においては、前記カルボン酸塩は、弱酸に由来する。例えば、前記カルボン酸塩は、アジピン酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、ピメリン酸塩およびその2個以上の任意の組合せからなる群より選択されるカルボン酸塩である。好適なカルボン酸塩は、4を超えるpK_aを有するカルボン酸から誘導されたカルボン酸塩または4を超える数値平均のpK_aを有するジ-もしくはトリ-カルボン酸(ジ-もしくはトリ-カルボン酸塩)から誘導されたカルボン酸塩である。前者のクラスの例としては、プロピオン酸、酪酸および酢酸から誘導されたカルボン酸塩が挙げられる。後者のクラスの例としては、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、グルタル酸およびリンゴ酸から誘導されたカルボン酸塩が挙げられる。

特定の実施形態においては、前記カルボン酸塩は、GRAS一覧表、すなわち、米国食品医薬品局により「一般に安全と認められ」、酢酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩、および酒石酸塩を含む一覧表から選択されるカルボン酸塩に属する。好適には、カルボン酸塩は、アジピン酸の塩、すなわち、アジピン酸のモノナトリウム塩、アジピン酸のモノカリウム塩であり、好適には、アジピン酸ジナトリウムもしくはアジピン酸ジカリウム、またはアジピン酸カルシウムである。

特定の実施形態においては、50 mM〜2 Mのカルボン酸濃度が、前記液体ロタウイルス組成物において好適に用いられる。上記の範囲内のカルボン酸塩濃度を、カルボン酸塩の性質、達成しようとする制酸能力およびワクチン用量の容量に従って、日常的な実験を介して好適に適合させることができることが理解されるであろう。例えば、1.5 mlの用量あたり、Baby Rossett Rice試験により評価されるように、8分を超える、好適には10分を超える、または12分を超えるものなどの高い制酸能力が必要である場合、1 Mを超える高いカルボン酸塩濃度を用いることができる。典型的には、100 mM〜1 Mの濃度、典型的には、200 mM〜800 mMの濃度などの1 M以下の濃度を用いる。好適なカルボン酸塩濃度は、約300 mM〜約800 mM、好適には、400 mM〜700 mMを含む。特に、カルボン酸塩がアジピン酸塩である場合、好適な濃度範囲は400〜500 mMである。しかしながら、当業者であれば、記述された値の10〜20％以内の濃度が好適であってよく、すなわち、100 mMを記述する場合、80〜90 mMから110〜120 mMの範囲も開示され、カバーすることを意味することを認識するであろう。例示的な濃度を、種々のカルボン酸塩について以下の表1に示す。

本明細書で特許請求された液体ロタウイルス免疫原性組成物のpHを、カルボン酸とカルボン酸塩を混合することにより取得することができる。特に、カルボン酸を、異なるカルボン酸塩との混合物中で用いることができ、例えば、クエン酸塩をアジピン酸と混合する。これは、市販の化合物を用いる場合に有利であってよく、そのうちのいくつかは容易に入手可能ではないものであるか、または製剤化工程を単純化するためのものであってよい。例えば、1個(以上)の前記カルボン酸を、アジピン酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、炭酸、プロピオン酸、酪酸、マロン酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、グルコン酸、フマル酸、酒石酸、ピメリン酸からなる一覧から選択することができ、アジピン酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、乳酸、グルコン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、ピメリン酸塩からなる一覧から選択される1個(以上)のカルボン酸塩と好適な比率で混合する。

本明細書で特許請求された液体組成物は、糖を含む。スクロースが特に好適である。デキストロースは、別の好適な糖である。例えば、グリセロール、エリスロース、エリスリオール、キシリトール、アラビトール、リボース、キシロース、アラビノース、グルコース、タガロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、イノシトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、グルコースとフルクトースの混合物、マルトース、ソホロース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、トレハロース、スクロース、パラチノース、マルツロース、ラクツロース、マルチトール、ラクチトール、ラフィノース、マルトトリオース、メレジトース、セロトリオース、シリトール、マルトテトラオース、スタキオース、セロテトラオース、マルトペンタオース、セロペンタオース、マルトヘキサオース、セロヘキサオース、オリゴサッカリドなどの他の糖類または糖アルコールを、スクロースまたはデキストロースの代わりに用いることもできる。

典型的な糖濃度は、約1％w/w〜約70％w/w、例えば、約25％w/w〜約60％w/wの範囲である。しかしながら、当業者であれば、糖の性質および濃度を、それが、濾過などの、製剤の下流の製造工程と適合可能であるレベルの粘度を維持しながら、満足なウイルスの生存能力を確保するように最適化しなければならないことを認識するであろう。特定の実施形態においては、スクロースを用いる。典型的には、その濃度を、最大で30％w/wに維持する。さらに、より高い、すなわち、30％w/wを超えるスクロース濃度を用いて、長期間の保存を確保することができるが、それはそのような製剤の高い等浸透圧は細菌の増殖を防止することが期待されるためである。従って、本明細書で特許請求された液体組成物中のスクロースの濃度に関するより低い限界は、好適には、35％w/w以上、好適には40％w/w以上などの、30％w/w以上である。好適なスクロース濃度は、約40％w/w〜約70％w/wの範囲である。例えば、スクロースの好適な濃度は、45％w/w〜60％w/w、好適には50％w/w〜55％w/wであろう。特に、約50％w/wまたは約55％w/wの濃度のスクロースを用いる。50％w/wまたは55％w/wの最終スクロース濃度が好適である。

当業者であれば、糖濃度の日常的な最適化を行って、別の糖をスクロースに置換する場合にもウイルスの安定性を確保することができることを理解するであろう。

さらに、糖に関して記述された値を、用量などの製剤／製造パラメーターを考慮に入れてわずかに適合させることができる。従って、当業者であれば、記述された値の10％以内の濃度が好適であり、すなわち、50％w/wと記述する場合、45％w/w〜55％w/wの範囲も開示され、カバーされることを意味する。

本発明の液体ロタウイルス免疫原性組成物は、ロタウイルス抗原をも含む。特に、本明細書で特許請求された液体組成物は、免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物である。ロタウイルス抗原は、ワクチン組成物における使用にとって好適である任意のロタウイルス抗原を意味すると理解される。経口生ロタウイルス抗原が特に想定される。例えば、任意の好適なロタウイルス抗原を、動物もしくはヒトに由来する弱毒化生ロタウイルス、特に、ヒト弱毒化生ロタウイルス；再集合体ウイルス、特に、限定されるものではないが、ヒト-ヒト再集合体ロタウイルス、ウシ-ヒト再集合体ロタウイルスもしくはアカゲザル-ヒト再集合体ロタウイルスからなる群より選択することができる。

全てのロタウイルス株、ヒトまたは動物株が、本発明において想定される。ヒトロタウイルス株が好適である。特に、ロタウイルス抗原は、一実施形態においては、WO 01/12797に開示されたようなVP4およびVP7と命名された少なくとも1種の主要なウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列により定義される単一の変異体または実質的に単一の変異体、特に、WO 01/12797の表2、表3.1および3.2に記載の突然変異により定義される、任意の、例えば、1種以上の該変異体を含む弱毒化ヒトロタウイルス集団である。特定の実施形態においては、ロタウイルス抗原は、以下のヒト弱毒化生ロタウイルス株のいずれかである：受託番号ATCC VR 2272の下で寄託されたHRV 89-12C2株(EP 0 557 427に記載)、その子孫、再集合体および免疫学的に活性なその誘導体；受託番号ECACC 99081301(WO 01/12797)の下で寄託されたHRV P43株(WO 01/12797に記載)、その子孫、再集合体およびその免疫学的に活性なその誘導体。

上記の寄託された株のいずれかの特徴を有するロタウイルス集団も、好適なワクチン株である。前記寄託株に由来する誘導体を、さらなる継代、クローニング、もしくは生ウイルスを用いる他の手順により増殖させるか、または遺伝子工学技術もしくは再集合技術などの任意の方法で前記寄託株を改変することによるなど、さらなる加工に該株をかけることにより、それらを取得することができる。そのような工程および技術は、当業界でよく知られている。特定の目的のロタウイルス抗原は、前記寄託株のいずれかの子孫であり、免疫学的に活性なその誘導体である。免疫学的に活性な誘導体は、寄託株のいずれかから、またはそれを用いて、特に、受託番号ECACC 99081301の下で寄託されたHRV P43株から、またはそれを用いて取得された材料、特に、宿主動物中に注入した場合、ロタウイルスに対して反応する免疫応答を引き出すことができるウイルスの抗原を意味する。

上記の寄託株から誘導された材料も、好適なロタウイルス抗原であり、タンパク質および遺伝子材料を含む。特に興味深いのは、少なくとも1種の抗原または前記寄託株のいずれかの少なくとも1つの断片を含む再集合体ロタウイルス、例えば、11個のゲノム断片の1つもしくは1つの一部が、前記寄託株のいずれかのゲノム断片もしくはその一部により置換されたロタウイルスの毒性株を含む再集合体である。具体的には、NSP4をコードする断片または部分的断片が、前記寄託株のいずれかの断片または部分的断片であるロタウイルス再集合体は、有用な特性を有してもよい。再集合体ウイルスおよびそれらを調製するための技術は、当業界でよく知られている(Foster, R.H.およびWagstaff, A.J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998)。

特許請求された組成物のロタウイルス抗原を、日常的な製造技術に従って製造することができる。典型的には、ロタウイルス抗原調製物を、該ウイルスを増殖させるか、または組換えロタウイルス抗原を発現させるのに用いられる組織培養方法から誘導することができる。該ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質としては、例えば、MDCKなどのイヌ腎臓細胞またはMDCKのクローンに由来する細胞、MDCK様細胞、特に好適であるVero細胞を含むAGMK細胞などのサル腎臓細胞、BSC-1、LLC-MK2およびMA104などのサル腎臓起源の他の細胞系、好適なブタ細胞系、ワクチン目的のためのロタウイルスの製造にとって好適な任意の他の哺乳動物細胞型が挙げられる。好適な細胞基質としては、ヒト細胞、例えば、MRC-5細胞も挙げられる。好適な細胞基質は、細胞系に限定されない；例えば、一次細胞も含まれる。

また、上記の寄託株のいずれかと、他のロタウイルス変異体、例えば、他のクローン化された変異体もしくは他の再集合体ロタウイルス、または他のウイルス、特に、他の弱毒化ウイルスとの混合物も、本発明の範囲に含まれる。特に、本発明に従う組成物は2個のロタウイルス抗原を含む。特に、該組成物内の1個の抗原は、受託番号ECACC 99081301の下で寄託されたHRV P43株であり、他の抗原はその再集合誘導体または任意の免疫学的に活性なその誘導体である。

特許請求された組成物中への含有のためのロタウイルス抗原は、一価、すなわち、単一のロタウイルス株を含むか、または多価、すなわち、少なくとも2つ以上のロタウイルス株を含むものであってよい。

当業者であれば、寄託機関から取得可能である、ヒトまたは動物起源に由来する、他の容易に入手可能な弱毒化株も好適であり、記載の寄託株の代用物として用いることができる。

本発明に従えば、好適な免疫原性組成物は、1.5 ml容量中に、ロタウイルス抗原、特に、用量あたり10⁵〜10⁶ffu(または用量あたりのCCID50で表される10^5.5〜10^6.5と等価である)の濃度でヒト弱毒化P43株(受託番号ECACC 99081301の下で寄託されたもの、WO 01/12797を参照)、55％w/wスクロース、0.465 Mアジピン酸ジナトリウム(用量あたり132.74 mgに相当)を含み、かつ約6.2〜6.6のpHを有する。この組成物については、DMEM含量は6％w/wであり、従って、0.1 mM未満のリン酸塩である。

本発明に従う組成物はさらに、無機制酸剤、例えば、水酸化アルミニウムAl(OH)₃および水酸化マグネシウムMg(OH)₂などの追加の制酸成分を含んでもよい。水酸化アルミニウムが特に好適である。本発明における使用にとって好適である他の市販の制酸剤としては、水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムを含むMylanta(商標)が挙げられる。これらは水に不溶性であり、懸濁液中で与えられる。本発明のワクチン組成物中でさらに用いることができる別の特に好適な制酸剤は、不溶性無機塩、炭酸カルシウム(CaCO₃)である。典型的なCaCO₃濃度は、例えば、ワクチン用量あたり80 mgである。

他の好適な水に不溶性の制酸剤は、炭酸マグネシウム、炭酸アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムと炭酸マグネシウムの混合物、アルミニウム-マグネシウム-炭酸水素塩、水酸化アルミニウム-炭酸マグネシウム-ソルビトール-マンニトール、ヒドロキシ-アルミニウム-ナトリウム-炭酸塩、ジヒドロキシ-アルミニウム-カリウム-炭酸塩、マガルドレート、ハイドロタルサイト、アルマグシット、マグネシウム-アルミニウム-シリケート-水和物である。

本発明に従う免疫原性組成物は、製薬上好適な化合物および／または担体、特に、乳児への経口投与にとって好適であると当業界で知られるものをさらに含んでもよい。そのような担体としては、限定されるものではないが、炭水化物、ポリアルコール、アミノ酸、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ヒドロキシアパタイト、タルク、酸化チタン、水酸化鉄、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、ゼラチン、植物性ペプトン、キサンタン、カラゲナン、アラビアゴム、β-シクロデキストリンが挙げられる。

本発明に従う組成物は、ロタウイルスを安定化すると示唆されたカルシウムイオンをさらに含んでもよい。

増粘剤を、本発明の組成物中にさらに含有させてもよい。

用いることができる可能な増粘剤としては、偽塑性賦形剤が挙げられる。好適な増粘剤としては、プロピレングリコール、アラビアゴム、アドラガントゴム、寒天、アルギナート、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム(Tyloses C(登録商標))、メチルセルロース(Methocels A(登録商標)、Viscotrans MC(登録商標)、Tylose MH(登録商標)およびMB(登録商標))、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(Klucels(登録商標))、ヒドロキシプロピルセルロース(Methocels E(登録商標)およびK(登録商標)、Vicotrans MPHC(登録商標))、Carbopol(登録商標)、キサンタンゴム、Veegum(登録商標)(マグネシウム-アルミニウムシリケート)、Avicel(登録商標)(約89％の微結晶セルロースおよび11％のカルボキシメチルセルロースナトリウム)が挙げられる。キサンタンゴムまたはデンプンが、本発明に従う液体組成物中でのさらなる使用にとって特に好適な増粘剤である。

特許請求された組成物中に、ビロソーム(virosome)もしくはリポソームなどの脂質に基づくビヒクル、水中油乳濁液または担体粒子を含有させることも有利である。あるいは、またはさらに、経口ワクチンのための当業界で公知のものなどの免疫刺激剤を、前記組成物中に含有させることができる。そのような免疫刺激剤としては、細菌毒素、特に、ホロトキシン(分子全体)もしくはB鎖のみ(CTB)の形態のコレラ毒素(CT)および大腸菌の熱不安定性エンテロトキシン(LT)が挙げられる。天然のLTよりもその活性な形態にあまり変換されないようである突然変異したLT(mLT)が、WO 96/06627、WO 93/13202および米国特許第5,182,109号に記載されている。

本発明に従う組成物は、限定されるものではないが、任意の起源に由来する解毒されたリピドAおよびリピドAの非毒性的誘導体、サポニンならびにTH1型応答を刺激することができる他の試薬などの、アジュバントまたは免疫刺激剤をさらに含んでもよい。

腸内細菌のリポ多糖(LPS)が免疫系の強力な刺激剤であることは長く知られてきたが、アジュバントにおけるその使用はその毒性作用により抑制されてきた。還元末端グルコサミンに由来するコアの炭水化物基およびリン酸塩の除去により作製された、LPSの非毒性的誘導体、モノホスホリルリピドA(MPL)は、Ribiら(1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)に記載されており、以下の構造：

を有する。

MPLのさらに解毒されたバージョンは、ジサッカリド骨格の3位置からのアシル鎖の除去をもたらし、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)と呼ばれる。それを、GB 2122204Bに教示される方法により精製および調製することができ、その参考文献はジホスホリルリピドA、およびその3-O-脱アシル化変異体の調製も開示している。

好適な形態の3D-MPLは、直径0.2μm未満の小さい粒子径を有する乳濁液の形態にあり、その製造方法はWO 94/21292に開示されている。モノホスホリルリピドAおよび界面活性剤を含む水性組成物はWO9843670A2に記載されている。

本発明の組成物中で製剤化しようとする細菌のリポ多糖に由来するアジュバントを、細菌起源から精製し、加工するか、またはあるいは、それらを合成することができる。例えば、精製されたモノホスホリルリピドAはRibiら、1986(上掲)に記載されており、サルモネラ種から誘導された3-O-脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリルリピドAはGB 2220211および米国特許第4,912,094号に記載されている。他の精製された、および合成のリポ多糖も記載されている(Hilgersら、1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgersら、1987, Immunology, 60(1):141-6;およびEP 0 549 074 B1)。特に好適な細菌リポ多糖アジュバントは3D-MPLである。

従って、本発明において使用することができるLPS誘導体は、LPSもしくはMPLもしくは3D-MPLのものと構造において類似する免疫刺激剤である。本発明の別の態様においては、LPS誘導体は、MPLの上記構造にとってサブ部分である、アシル化されたモノサッカリドであってよい。

リピドAの合成誘導体も知られており、限定されるものではないが、
OM174 (2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルリン酸二水素)(WO 95/14026)、
OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(リン酸二水素) (WO99 /64301およびWO 00/0462)、
OM 197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-リン酸二水素 10-(6-アミノヘキサノエート)(WO 01/46127)、
が挙げられる。

経口アジュバントとしての精製されたサポニンが、WO 98/56415に記載されている。サポニンおよびモノホスホリルリピドAを、別々に、または組合わせて用いることができ(例えば、WO 94/00153)、他の薬剤と共にアジュバント系において製剤化することができる。3D-MPLは、Ribi Immunochem, Montanaにより製造されたよく知られたアジュバントであり、その製造はGB 2122204に記載されている。

本発明における使用にとって別の好ましい免疫刺激剤は、Quil Aサポニンおよびその誘導体である。サポニンは、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H.(1996、「サポニンの生物学的および薬理学的活性の総説(A review of the biological and pharmacological activities of saponins)」、Phytomedicine vol 2 pp 363-386)に教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界において広く分布するステロイドまたはトリテルペンである。サポニンは、水中でコロイド溶液を形成して振とうの際に気泡を発し、コレステロールを沈降させることに留意すべきである。サポニンが細胞膜に近い場合、それらは膜において間隙様構造を作り、膜の破裂を引き起こす。赤血球の溶血はこの現象の一例であり、全てではないが、特定のサポニンの特性である。

サポニンは、全身投与のためのワクチンにおけるアジュバントとして知られる。個々のサポニンのアジュバント活性および溶血活性は、当業界で幅広く研究されてきた(Lacaille-DuboisおよびWagner,上掲)。例えば、Quil A(南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)、およびその画分は、米国特許第5,057,540号および「ワクチンアジュバントとしてのサポニン(Saponins as vaccine adjuvants)」、Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55；およびEP 0 362 279 B1に記載されている。Quil Aの画分を含む、免疫刺激複合体(ISCOMS)と呼ばれる粒子構造は溶血性であり、ワクチンの製造において用いられてきた(Morein, B., EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739)。溶血性サポニンQS21およびQS17(Quil AのHPLC精製画分)は、強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は米国特許第5,057,540号およびEP 0 362 279 B1に開示されている。QS-21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から誘導された天然のサポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および優勢なIgG2a抗体応答を誘導し、本発明の内容において好適なサポニンである。全身的ワクチン接種研究において用いられてきた他のサポニンとしては、カスミソウ(Gypsophila)およびシャボンソウ(Saponaria)などの他の植物種から誘導されたものが挙げられる(Bomfordら、Vaccine, 10(9):572-577, 1992)。

増強された系は、非毒性的リピドA誘導体とサポニン誘導体の組合せ、特に、WO 94/00153に開示されたようなQS21と3D-MPLの組合せ、またはWO 96/33739に開示されたような、QS21をコレステロールでクエンチする低反応性組成物を含む。本発明の一部を形成するサポニンは、ミセルの形態で分離されていてもよく、またはコレステロールおよび脂質と共に製剤化する場合、ISCOM((EP 0 109 942 B1)もしくはリポソーム)などの大規模構造の形態、もしくは水中油乳濁液(WO 95/17210)の形態にあってもよい。好適には、サポニンを、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどの金属塩と結合させることができる(WO 98/15287)。

水中油乳濁液中にQS21および3D-MPLを含む特に強力なアジュバント組成物が、WO 95/17210およびWO 99/11241およびWO 99/12565に記載されており、好適な組成物である。

経口免疫化のためのビヒクルおよびアジュバントの一般的考察を、PowellおよびNewman、Plenum Press, New York, 1995により編集されたVaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approachに見出すことができる。

本発明に従うワクチン組成物は、例えば、香料(特に、経口ワクチンについて)および静菌剤などの追加の成分を含んでもよい。

特定の実施形態においては、本発明に従う液体組成物は、Baby Rossett-Riceアッセイ(基本的Rosset-Rice試験から実施例III.2.2に詳述されるように適合させたもの)により評価されるように、6〜23分の制酸能力を有する。本発明に従えば、「制酸能力」とは、試験下での製剤のpHが、実施例III.2.2に与えられる実験手順に従って評価されるように、4を超えるままである、分で表される時間を意味する。好適には、制酸能力は12〜20分であろう。例えば、29〜30分などの23分より高い制酸能力も、ワクチン開発展望から完全に許容可能であるが、そのような高い能力は過剰である。特に、少なくとも8分、少なくとも10分、少なくとも12分の制酸能力が特に想定される。少なくとも12分、少なくとも13分、少なくとも14分、少なくとも15分、少なくとも16分の制酸能力が好適である。3時間食事を摂っていない小さい乳児の胃は非常に酸性であり、ロタウイルスはそのような酸性pHにより悪影響を受けることが知られている。本発明者らの手で、望ましい低容量製剤を用いて試験する場合、リン酸塩の溶解性を容易に超え、製剤および／または短期間の保存中に構成成分の結晶化が起こるため、古典的なリン酸塩含有製剤の制酸能力を測定することは不可能であった。対照的に、特許請求された組成物は、驚くべきことに、リン酸塩を含有する従来技術の製剤と比較して、より少ない用量でも、許容し得るが、より高い制酸能力を示した。

別の特定の実施形態においては、前記液体免疫原性組成物は、以下の条件：37℃で7日間、4℃で1年間、4℃で18ヶ月間、4℃で2年間、の少なくとも1つの下で安定である。本発明に従って、所与の温度で規定の時間、製剤を保存した後、実施例III.1に記載の手順に従って、ウイルス力価(すなわち、ウイルスの安定性)を測定することにより、所与の組成物の安定性を評価する。前記組成物の安定性を、例えば、37℃で1週間、製剤を保存した後、加速安定性試験により評価することができる。あるいは、前記組成物の安定性を、冷蔵庫温度(2〜7℃、典型的には、4℃)または室温(20〜22℃)で数ヶ月間などのより長い期間に渡って評価することもできる。これらの条件下では、安定な組成物は、規定の試験条件においてlog₁₀ ffu/用量で表されるように、1の最大ロタウイルス力価喪失を有するものである。特に好適な組成物は、最大0.5のlog₁₀、例えば、0.4以下、0.3以下、0.2以下または好適には、0.1のlog₁₀ ffu/ワクチン用量が、37℃で1週間の加速安定性試験に際して失われるものである。

あるいは、本明細書で特許請求された液体免疫原組成物を凍結し、-20℃以下で、または-70℃で数年間凍結保存することができ、かつそれは解凍の際に少なくとも1年間、4℃で安定なままである。典型的には、凍結された製剤は、少なくとも6ヶ月、少なくとも12ヶ月、少なくとも18ヶ月、少なくとも2年、または少なくとも3年間安定であり、解凍に際して、少なくとも1年間、好適には、18ヶ月間または2年間、4℃で安定なままであるだろう。

本発明に従う組成物は、免疫原性組成物、例えば、ワクチンである。例えば、特許請求された免疫原性組成物は、典型的には、1回の投与、好適には、1または2ヶ月により分離された2回の投与後に、免疫応答、例えば、良好なワクチン取込みおよび血清ロタウイルス特異的IgA応答を引き出すことができる。「ワクチン取込み」は、血清学的応答、例えば、免疫後の血清中で20 U/ml以上の力価(ELISA)のロタウイルスに対する血清IgAの出現を示す被験体の比率、および／または任意の便サンプル中のロタウイルスのシェディング(shedding)(ELISA)として定義される。ワクチン取込みを、1回目の投与と、2回目の投与後の最大1〜2ヶ月との間に回収された任意の便サンプルにおけるワクチンウイルスのシェディングとして定義することができる。特定の実施形態においては、本発明に従うワクチンは、偽薬と比較して、任意の、および好ましくは重篤なロタウイルス胃腸炎の発生率を減少させることができる。典型的には、前記ワクチンは、該ワクチン中に存在するもの以外の循環株に対して交差防御を付与することができる。典型的には、前記ワクチンが、弱毒化ヒトウイルスP43のものなどのG1型株を含む場合、G1ならびにG2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13およびG14血清型からなる群より選択される非G1血清型のうちの少なくとも1つに対する免疫応答が誘導される。好適には、G1株を含むワクチンは、G1ならびにG2、G3および／またはG4株などの非G1株の両方に対する防御、ならびに特に、全般的に出現するG9血清型に対する防御を付与することができる。

特定の実施形態においては、前記胃腸炎または重篤な胃腸炎は、特許請求された組成物中に含まれるものとは異なる血清型のロタウイルス株により引き起こされる。特に、特許請求された組成物中に存在するロタウイルス株が、限定されるものではないが、弱毒化生ヒトロタウイルス株HRV P43(ECACC 99081301)などのG1血清型である場合、G1血清型のロタウイルス株ならびにまた、非G1血清型のロタウイルス株、例えば、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13およびG14からなる一覧より選択される血清型を有するロタウイルス株により引き起こされる胃腸炎または重篤な胃腸炎に対する保護が与えられる。特定の実施形態においては、本明細書で特許請求された免疫原性組成物は、以下の非G1血清型：G2、G3、G4およびG9のうちの少なくとも1つ、好適には全部により引き起こされる胃腸炎もしくは重篤な胃腸炎に対する免疫応答を誘導し、および／またはそれらに対する保護を提供することができる。別の特定の実施形態においては、特許請求された組成物中に存在するロタウイルス株が、限定されるものではないが、弱毒化生ヒトロタウイルス株HRV P43(ECACC 99081301)などのP[8]ロタウイルス型である場合、P[8]型のロタウイルス株ならびに非P[8]型、例えば、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P9およびP11型からなる一覧より選択される血清型を有するロタウイルス株により引き起こされる胃腸炎または重篤な胃腸炎に対する保護が与えられる。特に、本明細書で特許請求された免疫原性組成物は、以下の非P[8]型：P4、P6のうちの少なくとも1つ、好適には全部により引き起こされる胃腸炎もしくは重篤な胃腸炎に対する免疫応答を誘導し、および／またはそれらに対する保護を提供することができる。別の実施形態においては、特許請求された組成物は、投与される組成物中に存在するものとは異なるG型および異なるP型のロタウイルス株により引き起こされる胃腸炎もしくは重篤な胃腸炎に対する免疫応答を誘導し、および／またはそれらに対する保護を提供することができる。特に、特許請求された組成物は、G1P[8]ロタウイルス株を含み、G2P[4]ロタウイルス株により引き起こされる胃腸炎もしくは重篤な胃腸炎に対する免疫応答を誘導し、および／またはそれらに対する保護を提供することもできる。

好適には、本発明に従う組成物を、経口投与により投与する。好適には、前記組成物を、小さい乳児への送達にとって好適なガラスバイアルもしくはプラスチックバイアルまたはシリンジなどの単回投与デバイス中で供給する。

本発明のワクチンを、典型的なワクチンにおける有意な有害副作用なしにロタウイルス感染に対する有効な防御を提供するのに好適な量の生ウイルスを用いて、公知の技術により製剤化および投与することができる。

従って、本発明は、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩を、製薬上許容し得る希釈剤と混合することを含む、本明細書に記載の液体ロタウイルス製剤または免疫原性組成物の調製のための方法を提供する。

生ウイルスの好適な量は、通常、用量あたり10⁴〜10⁷ ffuであろう。典型的な用量のワクチンは、用量あたり10⁵〜10⁶ ffuを含んでもよく、一定の期間に渡って数回の用量で、例えば、2ヶ月間隔で与えられる2回の用量で与えることができる。ロタウイルス力価をCCID50で表すこともでき、本発明の内容においては、10^6.0のCCID50は用量あたり10^5.5 ffuに等しいと評価することができる。しかしながら、特に、発展途上国においては、3回以上、例えば、3または4回の投与計画を有することにより、利益が得られる。好適には、1回目の投与を、4週〜14または15週齢、好適には、6〜14週齢の乳児に与えることができる。投与の間の間隔は、少なくとも4週間であるが、2ヶ月以上であってもよく、例えば、2回目の投与、および必要に応じて、任意のその後の投与を、局所免疫スケジュールに応じて、前回の投与の1ヶ月後または3ヶ月後に与えてもよい。単回投与または複数回投与計画のための最適な量の生ウイルスおよび該投与のための最適なタイミングを、被験体における抗体力価および他の応答の観察を含む標準的な研究により確認することができる。

典型的には、本発明に従うワクチン用量の容量は、通常、2.5 ml以下、典型的には、0.5 ml〜2.5 mlであろう。本発明の特定の態様においては、好適なワクチン用量は、通常、新生児または乳児への経口投与にとって好適である、1.5 mlであるか、または好適には、2 ml以下の容量などの2.5 ml未満の任意の容量であろう。特に、投与容量は、前記製剤の技術的実現可能性が可能であり、該製剤の免疫原性に対する有害な作用が存在しないようなものであろう。特許請求された組成物は、2.0 mlより少ないもの、または好適には、1.5 ml以下の用量などの通常より少ない用量の製剤と適合可能にさせながら、それらが胃酸に抵抗し、長い保存期限に渡って免疫原性および安定性を保持することができる、従来技術のリン酸塩含有製剤を超える利点を提供する。典型的には、本発明に従うワクチンの用量の容量は、0.5 ml〜2.0 ml、好適には、約1.3 mlもしくは約1.4 mlもしくは約1.5 mlなどの約1.0 ml〜1.5 mlである。典型的な用量の容量は、例えば、1.1 ml、1.2 ml、1.3 ml、1.4 mlもしくは1.5 mlなどの2 ml以下であってもよい。1 mlの容量または1 ml未満の容量、例えば、200μl〜800μlも、本発明の範囲内にあると意図される。経口投与することができる液体の容量を、ワクチン送達デバイスにより部分的に決定することもできる。

本発明の免疫原性組成物を、他の抗原、特に、他の疾患に対する防御のための他の好適な生ウイルス、例えば、ポリオウイルスに由来する抗原を含むように製剤化することもできる。経口投与にとって好適な前記追加の活性成分を、ロタウイルス組成物との混合物中で与えるか、またはあるいは、本明細書で特許請求されたロタウイルス組成物と同時投与(すなわち、別の用量中であるが、同じ機会に)することができる。

特許請求された組成物を、他の非経口ワクチン、例えば、DTPwもしくはDTPaワクチン(百日咳菌(Bordetella pertussis)-百日咳、ジフテリア、破傷風に対するワクチン)、B型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)誘導性髄膜炎、B型肝炎、もしくは麻疹、おたふく風邪、風疹(MMR)に対するワクチン、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)などの小児ワクチン接種者集団にとって好適な親ワクチンと同時に与えて、医師への訪問者数を最適化することができる。

別の実施形態においては、本発明は、有効量の液体製剤、特に、本明細書で特許請求された免疫原性組成物またはワクチンを、それを必要とするヒト、特に、新生児または乳児などの幼児に投与することにより、前記ヒト被験者におけるロタウイルスに関連する疾患を治療するか、または予防する方法も提供する。特に、特許請求された組成物は、ロタウイルス感染を防止するであろう。特定の実施形態においては、本明細書で特許請求された組成物は、ロタウイルス胃腸炎、特に、重篤な胃腸炎に対する防御を提供することができる。重篤な胃腸炎とは、医療施設における入院および／もしくは補水塩療法(WHOの計画BもしくはCと等価)を必要とする症状、または20点のVesikariスケール(Ruuska TおよびVesikari T.「フィンランド人の子供におけるロタウイルス疾患：下痢症状の重篤度に関する数値スコアの使用(Rotavirus disease in Finnish children: use of numerical scores for severity of diarrheal episodes)」、Scand J Infect Dis 1990, 22:259-67)で11を超えるスコアを有する症状と定義される。

さらなる実施形態においては、本発明は、ヒトにおけるロタウイルス関連疾患の治療または予防のための、5.0〜8.0のpHを有し、5 mM未満のリン酸塩を含む免疫原性組成物、例えば、ワクチンの製造における、ロタウイルス抗原、カルボン酸塩および糖の使用を提供する。特に、ロタウイルス感染の予防、および／または胃腸炎およびより特には、重篤な胃腸炎に対する防御が特に意図される。

別の特定の実施形態においては、本発明は、腸重積症を引き起こすことなく、ロタウイルス関連疾患の治療または予防のための本明細書で特許請求された免疫原性組成物の製造のためのヒト弱毒化生ロタウイルスの使用も提供する。特に、前記治療または予防は、ヒト弱毒化生ロタウイルス組成物の安全かつ有効な量の2回以上の用量を、1回目の投与の時点で、4〜14もしくは15週齢内の乳児に投与することを含む。典型的には、この乳児は、1回目の投与の時点で6〜14週齢であるだろう。本発明の内容の範囲内では、ヒト乳児は誕生後4〜14もしくは15週齢の乳児を意味すると取られる。

別の実施形態においては、本発明は、ロタウイルス抗原、糖、リン酸塩およびカルボン酸塩を含む液体免疫原性組成物であって、該組成物は約5.0〜約8.0のpHを有し、該カルボン酸塩はアジピン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、ピメリン酸塩、およびそれらの2個以上の任意の組合せからなる一覧より選択される前記組成物も提供する。典型的には、リン酸塩を、10 mM〜1 Mの濃度で存在させることができる。本発明者らは、経口ワクチン製剤の開発と関連していなかったこれらの特定のカルボン酸塩が、ヒト乳児のための好適な経口ロタウイルスワクチンの開発について本明細書に記載のように、少ない用量で安定性、酸抵抗性、免疫原性および製剤の望ましい要件を全て満たすことを見出した。特に、前記カルボン酸塩は、製剤中のロタウイルス力価に対する有害な作用を有さない。これらのカルボン酸塩は、例えば、リン酸塩を含有するロタウイルス製剤中で、コハク酸塩、グルタミン酸塩およびクエン酸塩などの従来のカルボン酸塩の代替物として十分に働くことができる。本明細書で上記のような全ての他の特定の実施形態を、本発明のこの態様に等しく適用することができる。典型的には、前記組成物のpH範囲は、本明細書に定義された通りであり、これは制酸能力および保存期限安定性も同様である。本発明は、前記組成物の調製のための方法、使用および前記組成物を用いるヒト乳児の予防または治療の方法も提供する。

本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明する。

実施例I-i)追加のリン酸塩およびカルボン酸塩の非存在下で、およびii)追加のリン酸塩の非存在下でカルボン酸塩としてのクエン酸塩の存在下での弱毒化ヒト生ロタウイルス液体ワクチンの製剤
I.1. 製剤の調製
I.1.1. DMEM培地の組成(1リットルのDMEMを調製するため)
注入用の水：0.8リットル
以下の化合物を連続的に溶解する：
塩化ナトリウム：6.40 g
塩化カリウム：0.40 g
硫酸マグネシウム・7H₂O：0.20 g
0.1 g/Lの硝酸鉄溶液を添加：1.00 ml
NaH₂PO₄・2H₂O：0.1412 g
ピルビン酸ナトリウム：0.11 g
グルコース無水物：4.50 g
ビタミン溶液(500倍濃縮)：2.00 ml
注入用の水：1.50 ml
塩酸(濃縮)：0.083 ml
L-シスチン：0.048 g
L-チロシン：0.072 g
注入用の水：2.00 ml
アミノ酸溶液：20.00 ml
L-グルタミン：0.5846
塩化カルシウム・2H₂O：0.2649 g
炭酸水素ナトリウム：3.70 g
注入用の水で1リットルまで
DMEMは、実施例IIに記載の製剤の5％、6％または8％である。これは、
-それぞれ0.059 mM、0.071 mMおよび0.094 mMの最終リン酸塩濃度、および
-それぞれ0.065 mM、0.078 mMおよび0.104 mMの最終ピルビン酸塩濃度
に相当する。

ビタミン溶液(500倍濃縮)：
注入用の水：80.00 L
葉酸：200.10 g
パンテノン酸カルシウム：200.10 g
塩化コリン：200.10 g
イノシトール：350.00 g
ニコチンアミド：200.00 g
塩酸ピリドキシン：200.10 g
塩酸チアミン：200.10 g
リボフラビン：20.002 g
注入用の水で100リットルまで

アミノ酸溶液：
注入用の水：144.00 L
L-アルギニン：755.70 g
グリシン：270.10 g
L-ヒスチジン：378.00 g
L-イソロイシン：943.40 g
L-ロイシン：943.50 g
L-リジン2HCl：1,315.80 g
L-メチオニン：270.00 g
L-フェニルアラニン：594.10 g
L-トレオニン：856.30 g
L-トリプトファン：144.00 g
L-セリン：377.90 g
L-バリン：842.00 g
注入用の水で180リットルまで

硝酸鉄溶液
注入用の水：1,035.000 ml
硝酸鉄・9H₂O：0.115 g
注入用の水で1.150リットルまで

I.1.2. 追加のリン酸塩およびカルボン酸塩の非存在下でのロタウイルス製剤の調製
表2に提示された製剤60を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 g(250 ml)の全量で作製した。

製剤60：143 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、162.5 gのスクロース(50％ w/w)を添加する。完全に溶解させた後、0.2μm膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.5 mlである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

制酸能力の結果、最初のウイルス力価およびウイルス安定性を、表2〜4に示す。

I.1.3. カルボン酸塩を含むロタウイルス製剤の調製
クエン酸(存在する場合)およびクエン酸塩を、表5および6に例示される比率および条件で混合する。製剤のロタウイルス安定性および制酸能力を、それぞれ実施例III.1およびIII.2に与えられる方法に従って測定する。

製剤110〜115および128〜130を調製した。用量の容量は、製剤110〜115については2.5 mlであり、製剤128〜130については1.5 mlであった。表5に提示された製剤110〜115を、それぞれ2.5 ml(3.25 g)の100用量である325 g(250 ml)の全量で作製した。

製剤110を、以下のように調製した。123.71 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、19.29 gのクエン酸三ナトリウム(クエン酸Na₃・2H₂O、Mw 294)(262 mMの最終濃度に相当する)および162.50 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、単回用量は2.5 mlまたは3.25 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。

本実施例においては、DMEM培地は6％ w/wであり、これは0.059 mMの最終リン酸塩濃度に相当する。

製剤111〜115を、成分の量を表5に記載のように適合させる以外は、製剤110に関して説明したものと類似する手順に従って調製する。例えば、以下の成分：123.73 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定する)、19.07 gのクエン酸三ナトリウム(クエン酸Na₃・2H₂O、Mw 294)(259 mMの最終濃度に相当する)、0.197 gのクエン酸(Mw 192)(4 mMの最終濃度に相当する)および162.50 gのスクロース(50％ w/w)を混合することにより、製剤111を調製した。残りの手順を、製剤110に関してと同様に行った。

制酸能力、最初のウイルス力価およびウイルス安定性の結果を、表5〜8に示す。

表6に提示された製剤を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 g(250 ml)の全量で作製した。制酸物質：クエン酸・1H₂O(Mw 210)、クエン酸Na₃・2H₂O(Mw 294)。

製剤128を、110.89 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)と、以下の成分：31.78 gのクエン酸三ナトリウム(クエン酸Na₃・2H₂O、Mw 294)(432 mMの最終濃度に相当する)、0.328 gのクエン酸(クエン酸・1H₂O、Mw 210)(6 mMの最終濃度に相当する)および162.50 gのスクロース(50％ w/w)とを混合することにより調製した。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。

滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEM培地は6％ w/wであり、これは0.059 mMの最終リン酸塩濃度に相当する。

製剤129および130を、表6に従って成分の量を適合させながら、製剤128について記載の手順と同様に調製した。簡単に述べると、製剤129を、0.77 gのクエン酸(クエン酸・1H₂O、Mw 210)(15 mMの最終濃度に相当する)と、31.36 gのクエン酸三ナトリウム(クエン酸Na₃・2H₂O(Mw 294)、426 mMの最終濃度に相当する)とを混合することにより調製した。製剤130を、2.75 gのクエン酸(クエン酸・1H2O、Mw 210)(52 mMの最終濃度に相当する)と、34.7 gのクエン酸三ナトリウム(クエン酸Na₃・2H₂O(Mw 294)、472 mMの最終濃度に相当する)とを混合することにより調製した。残りの成分および比率を表6に示す。

I.2 ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を実施例III.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を、表2〜8に例示する。

カルボン酸塩および追加のリン酸塩を含まない対照製剤60のpHは、制酸能力を有さず、ウイルス安定性にとってpH8.0の上限に近いpHをさらに示した。

表5〜8で試験された全ての実験製剤については、8.0を超えるpHを示した製剤110について以外は、pHを約5.0〜7.0の範囲に維持した。ウイルス力価およびウイルス喪失の結果から認められるように、液体製剤中のロタウイルス安定性は、この製剤のpHに関連する。pH約5.4(すなわち、製剤115)〜7.0(すなわち、製剤111および128)の範囲で、37℃で7日後のウイルス喪失は低レベルに維持され(すなわち、0.5 log未満)、これは製剤110について得られた結果とは対照的であった(pH>8、0.9 logのウイルス力価喪失)。

さらに、製剤111〜115および128〜130は、Baby Rossett-Riceアッセイ(実施例III.2.2を参照)により評価されるように、製剤110のものと類似する制酸能力を示した。この制酸能力は、2.5 mlならびに1.5 mlの用量の製剤に関する8分の下限を超え、実際には最小12分に達し、従って、高度に満足のいくものであると考えられた。

代替的なカルボン酸塩も試験したが、これらは、比較的少量のカルボン酸塩が望ましい場合、例えば、非常に少量の用量を用いて行う場合、技術的に実現可能な代替物であり得るためである。

そのような代替的なカルボン酸塩を含む製剤の例を、実施例IIおよび表10〜39に与える。

実施例II-追加のリン酸塩の非存在下で代替的カルボン酸塩を含む製剤
以下のカルボン酸塩：酢酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩およびリンゴ酸塩を用いて、バッファー能力を作製した。所与のカルボン酸のpK_aに従って、およびその分子量に応じて、pH5.0〜8.0のpHウィンドウ中にしながら、BRR試験により評価されるように、少なくとも8分、好適には少なくとも12分の標的制酸能力を達成するために製剤化すべき量を見出すことができる。

化学的に言うと、「バッファー」作用は、強酸(HClなど)と、弱酸から誘導された塩(酢酸ナトリウムなど)を混合する場合に得られる。バッファー平坦域の中間に相当するpH値は、弱酸のpK_aに等しい。カルボン酸のpK_aは、酸の強度の尺度であり、換言すれば、化合物の有効な緩衝範囲の指示因子である。

ロタウイルスはpH4未満では迅速に分解されるため(C. WeissおよびH.F. Clark, 1985 K. Gen. Virol., 66, 2725-2730)、pH4を超えるバッファー平坦域が望ましい、すなわち、好適には、4を超えるpK_aを有するカルボン酸塩または4を超える平均pK_aを有するジカルボン酸塩が望ましい。好適なカルボン酸塩を表9に示す。数値平均pK_a値を与える。

4種のカルボン酸塩(リンゴ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびアジピン酸ナトリウム)に関する標準的な酸-塩基滴定曲線を、図1に示す。例えば、pH4.0〜7.0の有用な制酸能力は、アジピン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびリンゴ酸ナトリウムについては、それぞれ72.50％、68.75％、57.70％および41.25％である。

以下のカルボン酸塩：酢酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩、アジピン酸塩およびリンゴ酸塩を用いて、製剤を調製した。本実施例に示された全ての製剤を、1.5 mlの用量中で調製した。

II.1. 酢酸塩を含む製剤
II.1.1.
表10に提示された製剤を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 g(250 ml)規模で作製した。制酸物質：酢酸(Mw 60)、NaOH(Mw 40)。

製剤36：148.84 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するのに十分な量)に、10.66 gのNaOH、pH 7.16までの氷酢酸および130 gのスクロース(40％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤37および42：製剤36についてと同様に行うが、表10に従って量を調整する。

製剤87：75.00 gの水に、8.00 gのNaOH、15.00 gの氷酢酸、7.00のpHを達成するのに十分な1N NaOH溶液(この場合、2 gの1N NaOHを添加する)、325 gの十分な量を達成するための追加の水(この場合、43.00 gの水を添加する)、および162.50 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの手順を、製剤36についてと同様に実施する。

製剤88〜90に関する例：表10に記載のように量を適合させる以外は、製剤87についてと同様に行った。

製剤33〜35に関する例：表10に記載のように量を適合させ、NaOHをCa(OH)₂により置換する以外は、製剤36についてと同様に行った。製剤33〜35は、37℃で1週間の安定性試験に適合しないため、短期間の安定性試験に含まれなかった。にも関わらず、追加のカルシウムイオンの存在下で満足のいく結果が、アジピン酸塩シリーズ中で提供される(実施例II.5.4および表26を参照)。

II.1.2.
表11に提示された製剤を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 g規模(250 ml)で作製した。制酸物質：酢酸ナトリウム・3H₂O (Mw 136)。

製剤58に関する例：113.00 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、30.00 gの酢酸ナトリウム・3H₂Oおよび162.50 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤59、66、69および70：量を調整して、製剤58と同様に行う(表11を参照)。

II.1.3. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
様々な時点でのロタウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を、表10、11、12および13に示す。

結果として、液体酢酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性は、pHに関連する。好適な作用範囲はpH6.0〜7.5である。

II.2. マロン酸塩を含む製剤
II.2.1.
製剤67(表14を参照)を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの全量(250 ml)で作製した。制酸物質：マロン酸(Mw 104)、NaOH(Mw 40)。

製剤54(表14)を、それぞれ1.75 ml(2.2 g)の20回分の用量である44 gの全量(35 ml)で作製した。制酸物質：マロン酸(Mw 104)、NaOH(Mw 40)。

製剤67：110.70 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、14.00 gのNaOH、18.230 gのマロン酸および162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤54：16.64 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、3.1213 gのマロン酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.2.2.
表15に提示される製剤を、それぞれ1.75 ml(2.20 g)の147.7回分の用量である325 gの全量(250 ml)で作製した。制酸物質：マロン酸二ナトリウム(Mw 148)。

製剤62：138.50 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、23.00 gのマロン酸二ナトリウムおよび144.00 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.2.3. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
結果として、液体マロン酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性は、pHに関連する。pH6.5は37℃で1週間、良好な安定性を与えるが、0.9 logを超える損失がpH8.2で観察される。

II.3 コハク酸塩を含む製剤
II.3.1.
製剤127(表16を参照)を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの規模(250 ml)で作製した。制酸物質：コハク酸(Mw 118)、NaOH(Mw 40)。

製剤51(表16を参照)を、それぞれ1.75 ml(2.2 g)の20回分の用量である44 gの規模(35 ml)で作製した。制酸物質：コハク酸(Mw 118)、NaOH(Mw 40)。

製剤127：120.16 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、9.10 gのNaOH、13.74 gのコハク酸および162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤67について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤51：16.22 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、3.5414 gのコハク酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.3.2.
製剤56を表17に提示し、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの全量(250 ml)で作製した。制酸物質：コハク酸二ナトリウム(Mw 162)。

製剤56：122.50 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、20.50 gのコハク酸二ナトリウムおよび162.50 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤62について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.3.3. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
結果として、液体コハク酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性は、pHに関連する。pH6.3は37℃で1週間、良好な安定性を与えるが、0.8 logの損失がpH8.1で観察される。

II.4. グルタル酸塩を含む製剤
II.4.1. グルタル酸塩を含む製剤を表18に提示する
製剤65を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の164回分の用量である320.8 gの全量(246 ml)で作製した。制酸物質：グルタル酸(Mw 132)、NaOH(Mw 40)。114.1 gの水(最終的に320.8 gの調製物を達成するように量を決定)に、9.3 gのNaOH、15.40 gのグルタル酸および162.5 gのスクロース(50.6％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6.08％ w/wである。

製剤50を、それぞれ1.75 ml(2.2 g)の20回分の用量である44 gの全量(35 ml)で作製した。制酸物質：グルタル酸(Mw 132)、NaOH(Mw 40)。15.8 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、3.964 gのグルタル酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤125および126を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの全量(250 ml)で作製した。制酸物質：グルタル酸(Mw 132)、NaOH(Mw 40)。

製剤125：100.35 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、9.10 gのNaOH、15.40 gのグルタル酸および162.5 gのスクロースを連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤67について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤126：製剤125についてと同様であるが、量を調整して行った(表18を参照)。

II.4.2. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
結果として、液体グルタル酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性は、pHに関連する。pH6.17は37℃で1週間、良好な安定性を与えるが、0.7 logの損失がpH8.1で観察される。

II.5. アジピン酸塩を含む製剤
II.5.1.
表19に提示されたアジピン酸塩を含有する製剤を、製剤45を、それぞれ1.75 ml(2.2 g)の20回分の用量である44 gの規模(35 ml)で調製し、製剤63を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の164回分の用量である320.8 gの規模(247 ml)で調製した以外は、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの規模(250 ml)で作製した。制酸物質：アジピン酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤45：15.38 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、4.3809 gのアジピン酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤63：112.50 gの水(最終的に320.8 gの調製物を達成するように量を決定)に、9.3 gのNaOH、17.00 gのアジピン酸および162.5 gのスクロースを連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6.08％ w/wである。

製剤81：116.70 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、9.28 gのNaOH、17.00 gのアジピン酸および162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤67について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤82、83、91〜97、100〜109、122〜124、131〜134、136〜145、147、148：水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、NaOH、アジピン酸およびスクロースを、表19および23に記載の量で連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

表19に太字で示されるいくつかのパラメーターを変化させて、制酸能力およびウイルスの安定性に関して得られる製剤の性能を試験した。

II.5.2. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を実施例III.2.2に与えられたプロトコルに従って評価した。結果を、表19、20、21および22に示す。

製剤91〜94の制酸能力を、「Baby Rossestt-Rice法」(実施例III.2.2を参照)により測定したが、それはpH>4で8、12、16、または20分を達成する可能性を示す。結果を表22および図2Aに示す。

結果として、アジピン酸塩シリーズにおいては、他のカルボン酸塩製剤について観察されたように、高いpH値は良好な安定性データを与えなかった(例えば、製剤124は9.5のpHを有し、37℃で1週間の保存後に2.85を超えるlogのウイルス喪失を示す)。

pHの最も高い許容し得る限界値は、約8.0であり(例えば、製剤143については7.96のpH値が得られた)、0.5 logのウイルス喪失が37℃で1週間後に観察される。

好適なpH範囲は、これらの製剤についてはpH約5.5〜約8であり、最も好適な範囲はpH6.0〜7.7である。

アジピン酸塩(食品添加物)製剤は、合理的な量の材料(用量あたり約100 mg)を用いて標的制酸能力(例えば、t＝12分)を達成することができる最適なpK_a値(pK_a1 5.4およびpK_a2 4.43)と良好に妥協する。さらに、これらの量は、可溶性パラメーターと適合し、それによって1.5 mlの用量でワクチンを製剤化することができる。これは、リン酸塩の結晶化などの技術的非実際性に起因して、古典的クエン酸塩リン酸塩製剤に関しては不可能である(比較実施例IVを参照)。それらはまた、毒性データは他のカルボン酸塩と比較して、アジピン酸塩についてはむしろ低い(ラットにおける経口LD50：5.7 g/kg)ため、毒性パラメーターと適合可能である。

II.5.3. ウイルスの安定性に対するワクチン用量中でのウイルス力価の効果
以下の実験を行って、ロタウイルスの安定性に対する、1.5 mlのワクチン用量中での最初のロタウイルス力価(10^6.0、10^6.5、10^5.2)の効果を評価した。

様々な時点でのロタウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を表23、24、および25に示す。

結果として、評価された範囲において、ロタウイルスの安定性は、最初のウイルス力価がどんなものでも依然として類似し、許容し得るものである。

II.5.4. カルシウムイオンの存在下でのアジピン酸塩を含む製剤
カルシウムは、キイロタマホコリカビ(Dictyostelium discoideum)中で発現されるロタウイルスのSA11糖タンパク質VP7の安定性およびコンフォメーションに影響し得ることが報告されている(K.R.Emslieら、1996, Journal of Biotechnology 50, 149-159)。カルシウムイオンは製剤内のロタウイルスの安定性に寄与し得るので、本発明のアジピン酸塩ロタウイルス液体製剤に該イオンを添加することが有益であり得る。従って、様々な量のカルシウムイオンを、アジピン酸塩製剤中で試験した(表26)。2つの代替物を試験した：CaCl₂およびCa(OH)₂。

製剤98、116〜118：9.28 gのNaOHに、水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)、17.00 gのアジピン酸、表26中で特定されたCaCl₂(沈降が起こるが、沈降物は、製剤117における以外は、室温で1時間攪拌した後、再溶解する)、および178.75 gのスクロースを連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤82について記載されたものと同一である。本製剤においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤99：水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、表26中で特定されたCa(OH)₂、17.00 gのアジピン酸、9.02 gのNaOHおよび178.75 gのスクロースを連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤82について記載されたものと同一である。本製剤においては、DMEMは6％ w/wである。様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を表26、27および28に示す。

製剤119〜121：表26中で特定されたCaCl₂に、水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)、9.28 gのNaOH(この場合、Ca(OH)₂の沈降が起こるが、沈降物は、製剤121における以外はアジピン酸の添加後に再溶解する)、17.00 gのアジピン酸および178.75 gのスクロースを連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤82について記載されたものと同一である。本製剤においては、DMEMは6％ w/wである。

結論：カルシウムイオンの存在下でのロタウイルスの安定性を示す：0.3未満のlogの喪失が37℃で1週間後に経験されるが、これは同じ条件下で作製され、カルシウムイオンを添加した以外は同じ成分を含む製剤について得られた結果と類似している(例えば、表19〜21中の製剤83を参照)。

II.5.5 経口ポリオウイルスの存在下でのアジピン酸塩を含む製剤
いくつかの日常的な免疫スキームは、同じ時点で、経口ポリオウイルスおよびロタウイルスのワクチン接種に関連しうる。以下の実験の主題は、両方のワクチン接種が適合可能であるかどうかを評価することであった。従って、実験的経口ポリオ／ロタウイルス混合ワクチンを調製した。

製剤149、151〜155に用いたOPV培地の組成
注入用の水：80.00L
ラクトアルブミン加水分解物：1500.00 g
注入用の水：200.00L
塩化ナトリウム：2040.00 g
塩化カリウム：120.00 g
硫酸マグネシウム7H₂O：30.00 g
KH₂PO₄:38.00 g
グルコース無水物：1200.00 g
硫酸ネオマイシン：15.00 g
Tween 80:6.00 g
塩化カルシウム・2H₂O：80.00 g
水酸化ナトリウム：30.00 g
炭酸水素ナトリウム：660.00 g
フェノールレッド：6.00 g
L-シスチン：30.00 g
塩酸1N：550.00 g
硫酸ポリミキシンB：30.00 g
注入用の水で300.00Lに。

製剤149〜155：水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、表29に記載の量のNaOHおよびアジピン酸、ならびに178.75 gのスクロースを連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、および表29に記載の量に従って、用量あたり10^6.5のCCID50を得るのに必要な量のロタウイルスを含むDMEM培地および用量あたり10^6.6のI型、10^5.6のII型、10^6.1のIII型のCCID50を得るのに必要な量のポリオウイルスを含むOPV培地を添加した。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。得られる混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。これらの実施例においては、DMEMは6％ w/wであり、スクロースは55％ w/wであり、NaOHは0.92Mであり、アジピン酸は0.466Mである。

様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を、表30に示す。

結論：
1)ポリオ培地は制酸能力と適合可能である(製剤149においてはBRR 12分)。

2)ポリオ培地はロタウイルスと適合可能である(製剤150を製剤151と比較する場合、t＝0の4℃および37℃で1週間後の両方で、同じ力価が両製剤について得られることが認められる)。

3)ロタウイルス組成物はポリオウイルスと適合可能である(製剤152中で期待されるポリオウイルス力価が得られた)。

II.5.6 凍結事象中のアジピン酸塩製剤の安定性
II.5.6.1 -20℃での凍結
+4℃〜+8℃で6ヶ月間保存した後、ロタウイルス製剤95を、以下のタイミングに従って3回の連続する凍結(-20℃)事象にかけた(表31)。

II.5.6.2 -70℃での凍結
+4℃〜+8℃で14ヶ月間保存した後、ロタウイルス製剤95を、以下のタイミングに従って1回の凍結(-70℃)事象にかけた(表31)。

サンプルを分析し、t＝0(4℃)でのウイルス力価と比較し、また通常の冷蔵庫温度(この場合、+4℃で15ヶ月)で保存した同じ年齢のサンプルのウイルス力価とも比較した。結果を表32に示す。

結果として、製剤95(アジピン酸塩製剤)の組成物は、-20℃での少なくとも3回の連続する凍結事象と適合可能である。また、それは-70℃での少なくとも1回の凍結事象と適合可能である。

II.6. カルボン酸塩としてのリンゴ酸塩を含む製剤
II.6.1.
表33に提示される製剤(製剤46、64、84、85および86以外)を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの規模(250 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤46を、それぞれ1.75 ml(2.2 g)の20回分の用量である44 gの規模(35 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤46：15.74 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、4.0211 gのリンゴ酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤64を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の163回分の用量である318.4 gの規模(244.5 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤84を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の66.6回分の用量である130 gの規模(100 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤85を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の66.6回分の用量である130 gの規模(100 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤86を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の66.6回分の用量である130 gの規模(100 ml)で作製した。制酸物質：D,L-リンゴ酸(Mw 146)、NaOH(Mw 40)。

製剤64：97.3 gの水(最終的に318.4 gの調製物を達成するように量を決定)に、14.6 gのNaOH、24.50 gのリンゴ酸および162.5 gのスクロース(51％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6.12％ w/wである。

製剤71：103.9 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、14.90 gのNaOH、25.00 gのアジピン酸および162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤67について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤72〜77、84〜86：製剤71についてと同様であるが、量を調整して行った(表33を参照)。

製剤78：75.00 gの水に、8.00 gのNaOH、25.00 gのリンゴ酸、6.48のpHを達成するのに十分な1N NaOH溶液、325 gを達成するための追加の水および162.50 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。残りの製剤化工程は、製剤67について記載されたものと同一である。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤79および80：製剤78についてと同様であるが、量を調整して行った(表33を参照)。

様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を表33、34および35に示す。

II.6.2. ロタウイルスの安定性および制酸能力-結果
液体リンゴ酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性はpHに関連する。調査したpHの範囲、すなわち、6.0〜7.0のpH範囲は、37℃で1週間、良好な安定性を与える。

II.7. グルタミン酸塩を含む製剤
アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩は、その側鎖にカルボン酸塩基を有するアミノ酸である。これらの側鎖カルボン酸のpKa値は、それぞれ3.65および4.25である。かくして、4より高いpKaを有するグルタミン酸塩をバッファーとして用いて、制酸能力を構築することができる。表36を参照。

製剤41：水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、表36に記載の量でNaOH、グルタミン酸およびスクロースを連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。得られる混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤43：水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、7.1 gのグルタミン酸一ナトリウム1H₂Oおよび19.50 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.64 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤61：水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、52.43 gのグルタミン酸一ナトリウム1H₂Oおよび144 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤68：水(最終的に250 gの調製物を達成するように量を決定)に、0.2 gのグルタミン酸一ナトリウム1H₂O、2.5 gのウシ血清アルブミン、0.250 gのNa₂HPO₄・2H₂O、0.125 gのKH₂PO₄、0.5 gのEDTAおよび18.75 gのスクロース(7.5％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を該溶液に添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.5 g付近である。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは7.8％ w/wである。

様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を表36、37および38に示す。

液体グルタミン酸塩製剤中でのロタウイルスの安定性は、上記の他のカルボン酸塩を用いて得られる安定性と類似している。手短に述べると、
-安定性は、より塩基性の高い培地(製剤43においてはpH10.36)と比較して、7周辺(製剤61においては6.93)のpHでより良好である。

-また、安定性は、高いスクロース比率(製剤68における7.5％のスクロースと比較して、製剤61における44％のスクロース)においてより良好である。

-37℃、室温、および4〜8℃で1週間での安定性のプロフィール曲線は、上記の他のカルボン酸塩と類似している。

II.8. フマル酸塩を含む製剤
製剤44：16.28 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、3.4811 gのフマル酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。室温で1時間攪拌した後、不溶性物質は懸濁液中に残存する。調製物を廃棄した。

II.9. ラクトビオン酸塩を含む製剤
製剤47：16.02 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、1.2 gのNaOH、10.7414 gのラクトビオン酸および13.7 gのスクロース(31％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.10. マレイン酸塩を含む製剤
製剤48：16.88 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、2.8821 gの無水マレイン酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

製剤57：110.3 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、32.7 gのマレイン酸二ナトリウムおよび162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む19.5 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.5 mlまたは1.95 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.11. グルクロン酸塩を含む製剤
製剤49：16.14 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、1.2 gのNaOH、5.8211 gのグルクロン酸および18.5 gのスクロース(42％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.12. ガラクツロン酸塩を含む製剤
製剤52：16.14 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、1.2 gのNaOH、5.8218 gのガラクツロン酸および18.5 gのスクロース(42％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.13. ガラクタル酸塩を含む製剤
製剤53：15.96 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、6.3008 gのガラクタル酸および17.0 gのスクロース(38％ w/w)を連続的に添加する。室温で1時間攪拌した後、不溶性物質は懸濁液中に残存する。調製物を廃棄した。

II.14. 酒石酸塩を含む製剤
製剤55：15.26 gの水(最終的に44 gの調製物を達成するように量を決定)に、2.4 gのNaOH、4.4996 gの酒石酸および19.5 gのスクロース(44％ w/w)を連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む2.34 gのDMEM培地を添加する。この場合、用量は1.75 mlまたは2.2 gである。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。

II.15. 追加のリン酸塩の非存在下でカルボン酸塩を含む製剤に関する全体的な結論
追加のリン酸塩の非存在下で、種々のカルボン酸塩を用いていくつかの安定な製剤を調製した。これらの実験的製剤中に存在する唯一のリン酸塩は、DMEMバッファーが起源であり、0.059 mM(5％ w/w DMEM)、0.071 mM(6％ w/w DMEM)、または0.094 mM(8％ w/w DMEM)を決して超えなかった。試験したカルボン酸塩は全て、胃酸の中和において緩衝剤として作用し、それによって製剤中に存在する活性成分、すなわち、ロタウイルス抗原の不活性化を防止するか、または最小化する能力を示した。様々な投与用量(すなわち、1.5 ml、2.0 mlおよび2.5 ml)で作製した試験した製剤は全て、約5.0〜約8.0のpHを示し、多くの製剤については、約5.5〜約7.5のpHを示した。これらの製剤は、3つの試験した保存温度(すなわち、37℃、室温または4℃)で安定性試験の間に良好に働いた。さらに、これらの製剤は、満足のいく制酸能力、すなわち、BRR試験により評価されるように、少なくとも8分の制酸能力を示し、多くの製剤については、少なくとも12分の制酸能力を示した(実施例III.2.2に記載の手順を参照)。

以下の表39において、製剤のpHに従って選択されたアジピン酸塩製剤について得られた安定性データの簡潔な概要を提供する。以下の基準を評価した：i)37℃で1週間(加速安定性)の保存後のウイルス喪失(^*)、ii)言及された時間で到達したウイルス力価と共に、ウイルス力価の喪失が1.0 log未満のままである(室温での保存後)、月で表される時間(^**)、iii)4℃で1年間(12ヶ月)の保存後に到達したffu/ワクチン用量でのウイルス力価(^***)。

明らかに、試験したアジピン酸塩製剤において、約6.0〜約8.0(6〜8)のpH範囲は、1.0 logの最大ウイルス力価喪失と適合可能な良好で許容し得る安定性プロフィールを示し、約6.0〜6.8(6〜6.8)のpHサブ範囲は、0.5 logの最大ウイルス力価喪失と適合可能な良好で許容し得る安定性プロフィールを示した。

実施例III-方法
III.1 ロタウイルスのウイルス力価測定
感染性ロタウイルスの検出を、許容状態のMA104細胞(ATCC CRL 2378)上でロタウイルスおよび様々な成分を含む製剤のインキュベーションにより行う。ロタウイルス(例えば、P43ロタウイルス、ECACC 99081301)を、上記実施例に記載のように製剤化した。ウイルスサンプルの接種後、細胞を16〜18時間インキュベートする。次いで、細胞を固定し、80％アセトンを用いて透過性にする。フルオセレイン結合IgGにより検出し、UV顕微鏡下で試験したVP6タンパク質(Mab 9F6)に特異的なモノクローナル抗ロタウイルス抗体を用いる間接的免疫蛍光により、感染した細胞を同定する。ロタウイルスVP6タンパク質に対する任意の市販のモノクローナル抗体が好適であり、好適な作用する希釈液を、日常的な実験により決定することができる。例えば、以下のモノクローナルが好適である：
- Rural Technologies Inc(www.ruraltechinc.com)社製のRV 11-2(IgG2a、フルオレセインイソチオシアネートと結合した腹水液)
- Austral Biologicals(www.australbiologicals.com)社製の5F8 F9(IgG1、カタログ番号RVM-1601A-5)または2F2 I9(IgG2b、カタログ番号RVM-1601B-5)
- Immunological and Biochemical testsystems Gmbh(www.afsbio.com)社製のMABR10(IgG画分)
- 抗Vp6ロタウイルスポリクローナル抗体、例えば、Chemicon(www.chemicon.com)社製のAB1129Fも好適である。

それぞれの蛍光フォーカスは1個の感染性ウイルスに対応する。力価を、1 mlあたりのフォーカス形成単位の対数(log(ffu/ml))として表す。ウイルス力価測定の正確さは+または-0.2 logの周辺である。ffu/mlでのウイルス力価測定の結果を、最初のサンプル用量に従ってffu/用量に変換する。表に提供される全データは、log₁₀ ffu／用量である。

良好な結果は、「37℃で1週間」(加速安定性試験)で0.5未満のlogの減少を達成するものである。1 log以上のウイルス喪失を示す製剤を、さらなる安定性試験から廃棄する。

III.2 制酸測定の方法：Baby Rossett-Rice(BRR)力価測定
III.2.1. はじめに
Baby Rossett-Rice(BRR)力価測定試験は、元々は成人集団のために開発されたRossett-Rice力価測定試験から新生児の集団に適合させたものである。

Rossett-Rice力価測定は、制酸のドメイン中で用いられるよく知られた試験である(N.E. RossettおよびMarion L. Rice, Gastroenterology, 1954、第26巻、490-495頁:「錠剤への特定の注意と共により頻繁に用いられる制酸剤の効率のin vitroでの評価(An in vitro evaluation of the efficacy of the more frequently used antacids with particular attention to tablets)」を参照)。Rossett-Rice力価測定は、0.1 N塩酸を用いる試験およびpH上昇の期間の下で、制酸物質の反応速度を測定するものである。空の胃における条件をシミュレートするために、新鮮な塩酸を、測定の開始時に1回添加する。消化プロセス中の胃における条件をシミュレートするために、新鮮な塩酸を、試験下の反応混合物に一定の速度で添加する。

簡単に述べると、成人のRossett-Rice力価測定は2つの部分に分割される：
- 30 mlの0.1 N HClの最初の添加(これは空の胃のボーラスの酸含量を代理する)；
- 次いで、0.1 N HClの、4 ml/分の速度での連続的添加(これは消化中の胃酸分泌の模倣である)。

これらは、平均的な成人の胃の代理であると通常考えられる実験条件である。

III.2.2 Baby Rossett-Rice力価測定アッセイ
元の手順に記載された標準的なRossett-Rice条件に基づいて、この試験は6ヶ月齢の新生児の胃を代理するように適合させたものであり、以下「Baby Rossett-Rice(BRR)力価測定アッセイ」と呼ぶ。

Geigy Scientific Tables(第1巻、126頁、Ciba-Geigy(編)、1981)に従えば、以下のデータは、胃のHCl排出が関連する限り、興味深いものである(表40を参照)。

そこで、これらのデータに基づいて、本発明者らは、全ての状況を包含する最も厳しい条件を選択する：
- 最初のHCl量：0.40 mmol(4 mlの0.1 N HCl)
- 0.1 N HCl量の連続的添加：2.90 mmol/h(または0.048 mmol/分)。実際には、0.5 ml/分の速度の0.1 N HClを用いる。

BRRの実験設定の概略を図2Bに示す。表41は、元々の公開された手順と比較した、BRR間の差異をまとめたものである。

III.2.2.1. BRRアッセイのための作業手順
実験設定を図2Bに提供する。

1. 50 mlビーカーを用いて、工程4(後述)の後、10 mlの最終液体容量を有するように注入用の水を十分にその中に入れる。

2. ビーカーを水浴中に入れる。

3. 水浴の温度を、ビーカー内部が37℃になるように調整する。

4. 測定しようとする制酸剤のサンプルをビーカーに添加する。

5. この段階でのpH値の測定は「最初のpH」(データ表中でt=0)である。

6. 4 mlの0.1N HCl(0.40 mmol)を1回添加し、それと同時に時間計測を開始し、ポンプを開始する(0.5 ml/分の0.1N HClの連続的添加)。これらの3つの動作は全て、時間計測開始点の最初の5秒以内に行うべきである。

7. pH4が得られるまで、時間に沿ってpH値を記録する。操作者の任意で、pH3(元のRossett-Roce法におけると同様)が得られるまで、pHの低下を進行させることができるが、pH4を達成した後、関連する制酸能力値を記録する。

8. 時間計測およびポンプを停止する。

III.2.2.2. 実験データの提示
実験データを、表に提示するが、例えば、表22を参照されたい。そこから図面を描くことができる：例えば、図2Aを参照されたい。

III.2.2.3. 結果の解釈
ロタウイルスは、4未満のpHに置かれた場合、破壊される。従って、このウイルスを保存するためには、pH4以上の時間を考慮すべきである。Baby Rossett-Rice力価測定の結果は、時間単位(分)で表される。それは、4以上のpH値を測定した時間、すなわち、いわゆる製剤の制酸能力である。いくつかの例においては、2つの値を記録する(例えば、表22の製剤92においては11〜12分であり、11分で、pHは4.08であり、12分ではpHは3.98であったが、これはpH4.00での通過が11分よりも12分に近かったことを示唆している)。

III.2.2.4. 補正
温度を、補正された温度計(-10℃〜+50℃規模)を用いて測定する。pHメーターを、市販のものであるpH7およびpH4の標準バッファーを用いて補正する。

ポンプ速度を、0.5 ml/分を得るように、時間に対する容量測定により調整する。蠕動ポンプはIsmatec S.A. Model MS-Reglo社製の8ローラーモデルである。液滴形成を回避するために、チューブ先端を、液面上でビーカー壁に沿って置く。

0.1N塩酸は、市販の標準滴定溶液である。

公知の標準緩衝溶液を用いて、未知の制酸剤サンプルの分析の前に実験設定をチェックする。この標準緩衝溶液は、24.066 gのリン酸三ナトリウム12水和物(Merck社製品番号1.06578.1000)を、十分な量の水に溶解させて1リットルの溶液を得たものである。典型的には、10 mlのこの溶液は、記載されたBaby Rossett-Rice力価測定設定において6〜7分(1回目のリン酸塩のpHジャンプ)で生じる9.0のpHおよび19〜20分(2回目のリン酸塩のpHジャンプ)で生じる4.0のpHを与えるであろう。結果を表42に示す。

III.3 所与の製剤の屈折率の測定
本発明で例示されたいくつかの製剤を、高いスクロース濃度(例えば、55％)を含み、依然として安定性および制酸能力の要件を満たさなければならない少ない容量(例えば、および以下に記載のように、1.5 ml容量)で調製する。従って、製剤が成功裏に調製されたこと、および各構成要素の完全な可溶化が達成されたことを検証することが重要であり得る。これを行うための1つの単純な方法は、製剤の屈折率を測定することである。屈折率は、カルボン酸塩バッファー段階(ロタウイルスの添加前)およびまた最後の製剤化工程(ロタウイルスの添加後)の両方で用いることができるよく知られた単純な測定値である。

III.3.1. 方法
水溶液の屈折率は、溶液中のスクロース濃度を決定するための標準的な方法である。屈折率対スクロース濃度の表を、the handbook of Chemistry and Physics、第70版、1989〜1990 CRC Press, E 386頁に見出すことができる。

Index Instrument Automatic Refractometer GPR 11-37装置を用いて、溶液の液滴を該装置中に入れ、屈折率を記録する。装置をチェックするための標準物として水を用いる(1.3330の屈折率)。

様々な量のスクロースを含むいくつかのアジピン酸塩製剤を調製し、屈折率測定にかけた。反復測定を行った。

III.3.2. 結果
これらの測定の結果を、図3Aおよび3Bに示す。結果として、試験した濃度ウインドウにおいて、糖濃度と他の可溶性成分と測定された屈折率の間には直線状の相関が存在する。

例えば、製剤95においては、カルボン酸塩バッファー段階で前記成分を完全に溶解させた後(ロタウイルスの添加前)、1.4578の屈折率値(この場合、標的スクロース濃度は58.5％ w/wである)が得られるであろうが、製剤の最終段階(ロタウイルスの添加後または偽薬調製物の場合は、6％ w/w DMEMの添加後)では、1.4480の屈折率(この場合、標的スクロース濃度は55％ w/wである)が得られるであろう。両方の場合、測定された屈折率値は、水溶液中で1回の58.5％(1.4385の屈折率)または55％(1.4307の屈折率)のスクロースについて得られたものよりも高いが、これは屈折率が緩衝調製物の他の成分に寄与することを示唆している。

III.3.3. 結論
かくして、屈折率測定を用いて、プロセス制御中に、添加された製剤の成分の全てが完全に溶解したことを迅速に調べることができる。

実施例IV-クエン酸リン酸バッファーを含む製剤-比較例
IV.1. 製剤の調製(表43および44)

表44中での製剤18〜24、26〜30の結果に対する注釈
製剤18〜24および30を、37℃で1週間の安定性試験中に得られた不満足な結果のため、長期間の安定性試験から廃棄した。製剤26および28を、4〜8℃の静置で結晶化が起こるため、廃棄した。製剤25、27および29を、4〜8℃の静置で再結晶化する高い危険性があるため廃棄した。

IV.1.1. 製剤1〜11：2.5 ml容量の製剤
製剤1〜11(表43を参照)を、それぞれ2.5 ml(3.25 g)の100回分の用量である325 g(250 ml)規模で作製した。制酸物質：NaH₂PO₄・2H₂O(Mw 156)；Na₂HPO₄・2H₂O(Mw 178)；クエン酸Na₃・2H₂O(Mw 294)。

液体製剤1を以下のように調製した。125.84 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)に、7.605 gのNaH₂PO₄・2H₂O、8.677 gのNa₂HPO₄・2H₂O、9.555 gのクエン酸Na₃・2H₂Oおよび162.5 gのスクロースを連続的に添加する。完全に溶解させた後、0.2μmの膜上での濾過により溶液を滅菌する。滅菌条件下で、用量あたり10^6.0 ffuを得るのに必要な量のロタウイルスを含む10.82 gのDMEM培地を添加する。混合物をホモジェナイズし、好適な投与容器中に分布させる。この場合、1回の用量は2.5 mlまたは3.25 gの最終的に製剤化された調製物からなる。本実施例においては、DMEMは3.33％ w/wである。

製剤2〜11を、同様に調製した(表43中の成分および比率を参照)。このシリーズにおいては、様々な量のスクロースおよびDMEMを試験した。低い(20％)スクロース濃度を用いて調製された製剤7および11を除いて、同様の結果が得られたが、これはロタウイルスを十分に安定させなかった。

IV.1.2. 製剤17：2.0 ml用量の製剤
製剤17(表43を参照)を、それぞれ2.0 ml(2.60 g)の125回分の用量である325 g(250 ml)規模で作製した。制酸物質：NaH₂PO₄・2H₂O(Mw 156)；Na₂HPO₄・2H₂O(Mw 178)；クエン酸Na₃・2H₂O(Mw 294)。簡単に述べると、110.7 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)を量り、9.51 gのNaH₂PO₄・2H₂O、10.84 gのNa₂HPO₄・2H₂O、11.94 gのクエン酸Na₃・2H₂Oおよび162.5 gのスクロース(50％ w/w)を連続的に添加する。本実施例においては、19.5 gのDMEMを用い、これは6％ w/wである。

IV.1.3. 製剤12〜16：1.5 ml用量の製剤
これらのクエン酸塩／リン酸塩製剤(詳細については、表43を参照)の投与用量を、2 ml未満の用量に減少させるさらなる試みは失敗した。

製剤17(2 ml用量)のために用いた成分の濃度を、1.5 ml用量に調整した。リン酸塩成分の再結晶化は、4℃での製剤の保存の際に迅速に生じた。この現象は、リン酸塩クエン酸塩成分内のNa₂HPO₄のむしろ低い可溶性に起因する(表45を参照)。

これらのパラメーターに従って、1.5 ml用量中に製剤17を製剤化する試みにより、理論的には0.65 M((0.244 M + 0.244 M)*2/1.5)の最終リン酸塩濃度が得られるであろうが、これはNa₂HPO₄の溶解性データ(0.52 M)より高い。

リン酸塩のこの低い溶解性の問題を回避するために、追加のリン酸塩を使用しないこと、およびカルボン酸形態(R-COOH)とカルボン酸塩形態(R-COO^-)との間の平衡を取ることにより、pHを調整することが提案される。これの一例は、2.5 mlの投与用量で作製された製剤100〜115(表5を参照)または1.5 mlの投与用量で実現された製剤128〜130(表6を参照)において与えられる。

IV.1.4. 製剤25〜32および38〜40：1.5 ml用量の製剤および減少した量のリン酸塩
減少した量のリン酸塩を含むいくつかの製剤(詳細については表44を参照)を、それぞれ1.5 ml(1.95 g)の166.6回分の用量である325 gの規模(250 ml)で調製した。許容し得る制酸能力を維持しながら、リン酸塩におけるこの減少を補填するために、クエン酸塩濃度を増加させた。簡単に述べると、8.76 gのNaH₂PO₄・2H₂O、10.00 gのNa₂HPO₄・2H₂O、21.00 gのクエン酸Na₃・2H₂Oおよび130 gのスクロース(40％ w/w)を連続的に添加して混合することにより、製剤25を調製した。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。スクロースおよびDMEM濃度をわずかに改変した以外は、製剤26〜29を同様に作製した(表44を参照)。0.1653 gのNaH₂PO₄・2H₂O、0.1884 gのNa₂HPO₄・2H₂O、32.16 gのクエン酸Na₃・2H₂Oおよび130 gのスクロース(40％ w/w)を連続的に添加して混合することにより、製剤30を調製した。本実施例においては、DMEMは6％ w/wである。スクロースおよびDMEM濃度をわずかに改変した以外は、製剤31および32を同様に作製した(表44を参照)。

製剤25〜29においては、総リン酸塩濃度が0.45 Mである、すなわち、Na₂HPO₄に関する0.52 Mの理論的溶解性限界値未満であるという事実にも関わらず、いくつかの製剤(例えば、製剤26および28)は+4℃で保存中に再結晶化を示した。理論的な溶解性の値と、実際の値との間のこの実際の差異はおそらく、培地(DMEM培地を介して輸入されたスクロース、クエン酸塩または他のもの)に溶解した他の化合物の存在に起因するものであるが、類似する製剤については矛盾する結果が得られた(例えば、製剤26と27を比較する)。そのような製剤について経験される変動性は、最小限の時間に渡って物理的な安定性を保持しなければならない大規模製剤を調製する場合に必要とされる信頼性と適合しない。

製剤(表44中の30〜32および38〜40を参照)中のリン酸塩の量をさらに減少させることにより、4〜8℃でのウイルスの安定性における芳しくない結果が得られる(表47を参照)。

また、他の1.5 ml用量の製剤(18〜24)を、追加のリン酸塩の非存在下で作製した(詳細については、表44を参照)。これらの製剤の制酸能力を、より高い濃度(438 mM)のクエン酸三ナトリウムを用いて、12分の標的値に維持した。簡単に述べると、143.34 gの水(最終的に325 gの調製物を達成するように量を決定)、32.16 gのクエン酸Na₃・2H₂Oおよび130 gのスクロース(40％ w/w)を連続的に添加して混合することにより、製剤18を調製した。製剤19〜23については、様々な量のスクロースおよびDMEMを試験した(表44を参照)。製剤24については、スクロースを50％ w/wの濃度(162.5 g)で用いた。これらの製剤においては、DMEMは6％ w/wである。

これらの製剤(18〜24)のpHは8.3を超えていたが、そのpHで、37℃で1週間の保存後の0.8より高いウイルス喪失により証明されるように、ロタウイルスの安定性は影響される。

37℃での迅速な試験の間にこれらの製剤の安定性が芳しくないことを考えて、室温または4℃での中期安定性計画を行った。

これらの結果は、製剤中に含まれるリン酸塩が次第に少なくなり、クエン酸塩(制酸能力を維持するため)が次第に多くなる場合、製剤の得られるpHはますます増加する：
- 製剤25〜29においては約6.7のpH
- 製剤30〜32および38〜40においては約7.7のpH、および
- リン酸塩を含まない製剤18〜24においては約8.3のpH。

本明細書の以降に示されるように(表46および47)、これらのより高いpH値は良好なロタウイルスの安定性を支持しない。

さらに、これらの結果は、製剤110〜115(表5を参照)および128〜130(表6を参照)について得られる結果に一致するが、ここで、クエン酸／クエン酸ナトリウム比のみ(従って、追加のリン酸塩を用いずに)を調整することにより、pHを補正した。

IV.2. ロタウイルスのウイルス力価測定および制酸能力
様々な時点でのロタウイルスのウイルス力価測定を、実施例III.1に与えられる手順に従って評価し、製剤の制酸能力を、実施例III.2に与えられるプロトコルに従って評価した。結果を表46および47に示す。

IV.3. 結果および結論
製剤2〜3(2.5 mlの用量)および製剤17(2.5 mlから2 mlに減少させた用量)：
表46および47に示されるように、製剤2、3および17については、室温で6ヶ月の保存から1-logのウイルス力価における喪失が得られた。4℃で、最大12ヶ月の保存期間に渡って、ウイルス力価の有意な喪失は経験されなかった。

製剤25、27、29および31〜32(1.5 mlに減少させた用量)：
製剤29について、4ヶ月の期間経過した以外は、室温で、ウイルス力価における1-logの喪失は一般的に3ヶ月以内に到達した。製剤25〜27は、4℃での保存期間の間に再結晶化し、従ってこれはリン酸塩濃度の減少が、上記のように不十分であることを示唆している。従って、そのような製剤は4℃で少なくとも1年である保存期間にとって好適ではない。

さらにリン酸塩濃度を減少させる場合(製剤30〜32)、最終製剤のpHは、相対的に増加する量のクエン酸塩に起因して増加し、これは同じ値の制酸能力を維持するのに必要である。pHのこの増加は、ロタウイルスの安定性に影響し、室温での安定性研究の間に迅速に検出することができる。これらの傾向は、製剤(製剤18および24)からリン酸塩を完全に取り出す場合に確認される。

実施例IVの全体的な結論
これらの結果は、2.5 mlの用量と比較して、2 ml未満の用量を達成するためには、製剤中に存在するリン酸塩の量を、そのむしろ低い水溶性およびその再結晶化する傾向(propency)により、減少させる必要がある。結果として、同じ標的値の制酸能力(すなわち、BRR試験により評価されるように、最小で少なくとも8分、好適には少なくとも12分)を維持するために、クエン酸塩の量を増加させなければならない。これは製剤の最終的なpHの増加をもたらし、これは液体製剤におけるロタウイルスの安定性にとって有害である。

実施例V-さらなる製剤
以下の製剤を調製したが(表48)、設定基準の少なくとも1つを満たさないために長期間の安定性計画には含まれなかった。いくつかの製剤を廃棄する特定の理由を、表48のコメント欄に概略する。

実施例VI-健常な乳児におけるヒト一価ロタウイルス液体ワクチンの2回の経口用量の第II相免疫原性、反応性および安全性
VI.1. はじめに
第II相の無作為化、二重盲検化、偽薬制御化された第II相試験を行って、乳児の免疫化のための、ヒト弱毒化G1P8ロタウイルス株(受託番号99081301の下でECAACに寄託されている、WO 01/12797を参照)を含むワクチンの免疫原性、反応性および安定性を評価した。この研究を、フィンランドの複数のセンターにおいて実施した。研究設計の要旨を、図4に与える。

この試験中、1回目の用量のワクチン、候補HRV(ヒトロタウイルス)ワクチンの液体製剤(N=100)またはHRVワクチンの凍結乾燥製剤(N=100)のいずれかと、それぞれの偽薬(それぞれのN=25につき2群)を、約2.5ヶ月齢(6〜12週齢)で、医師への最初の訪問の時点で投与した。2回目の用量を、約3.5ヶ月齢で投与した(医師への2回目の訪問中、典型的には、1回目の投与の4週間後)。採血および免疫原性の評価のために、追加の訪問を、2回目の投与の1ヶ月後に、約4.5ヶ月齢で実施した。

この臨床試験は、無作為化されており、偽薬制御されており、自己を含んでいた。合計250人の被験者、HRV群あたり100人および偽薬群あたり25人を登録した。それを、それぞれのHRVワクチン製剤とその対応する偽薬との間で二重盲検様式で行った。しかしながら、2つの異なる製剤間で、盲検は技術的に不可能であった。

日常的な子供へのワクチン接種を、局所的な実務に従って与えたが、HRVワクチンのそれぞれの投与から少なくとも14日離して行った。

VI.2. ワクチンの説明
具体的には、用いたワクチンは、ロタウイルス成分として、ECACC受託番号99081301(WO 01/12797)として寄託された弱毒化G1ヒト株を含む。

このワクチンは、Cincinnati, USAにおいて15ヶ月齢の子供の大便から単離された血清型G1P1Aおよび遺伝子型[P8]に属する89-12 HRV株から誘導された弱毒化ヒトロタウイルス(HRV)候補ワクチンである。89-12株による自然感染は、2年のプロスペクティブ研究において、その後の病気および再感染に対する防御を提供することが示された(Bernstein DIら、「ロタウイルスの再感染からの防御：2年のプロスペクティブ研究(Protection from rotavirus reinfection: 2 years prospective study.)」、J Infect Dis. 1991;164: 277-83)。

制酸剤は、胃を通過する間にHRVが不活性化されるのを防止するであろう。

表49は、アジピン酸塩液体製剤の組成物と、WO 01/12797に従って調製され、大規模臨床試験において有効であると証明された凍結乾燥製剤とを比較するものである(De Vosら、Pediatr Infect Dis J. 2004 Oct 23 (10 Suppl): S179-82)。

HRVワクチンの2つの製剤の容量および制酸能力のまとめを、表50に提供する。

製剤化されたアジピン酸塩液体HRVワクチンの単回用量を、適正製造基準(GMP)に従って、単回用量ガラスシリンジ中に充填する。

ロタウイルス力価(すなわち、ロタウイルス効力)を、間接的免疫蛍光により同定されるMA104感染細胞を用いて、実施例III.1に詳述された手順に従って測定することができる。あるいは、特異的抗ロタウイルス抗体を用いる直接的免疫蛍光により検出されたウイルスを含むMA104細胞上で該ウイルスをin vitroで滴定することにより、それを測定する。この方法は、50％の細胞培養物に感染する用量を決定するものであり、ロタウイルス力価を、中央細胞培養感染用量(CCID₅₀)で表す。アッセイ間およびアッセイ内再現性を評価したが、等価な結果を与える(変数を0.3 logで評価する)。

VI.3. 投与
VI.3.1. HRVワクチンまたは偽薬の凍結乾燥製剤
投与のためのワクチンまたは偽薬を調製するために、炭酸カルシウムバッファーを含む1個の予め充填されたシリンジの全含量を、凍結乾燥製品(ワクチンまたは偽薬)のバイアル中に注入した後、再懸濁された製品を単回経口用量として円滑に投与した。

VI.3.2. HRVワクチンまたは偽薬の液体製剤
予め充填したガラスシリンジを、使用前に振とうした。次いで、製品(ワクチンまたは偽薬)を単回経口用量として円滑に投与した。

VI.4. 安全性および反応性
安全性および反応性の以下の基準を適用した：応答型の一般的な有害事象は、発熱、興奮性／小うるさいこと、下痢、嘔吐、食欲減退および咳／鼻水であった。これらを、観察された徴候を記録するために被験者の両親／保護者に提供された日記カードを用いて、それぞれのワクチン投与後の15日間記録した。訪問の間に生じる全ての胃腸炎事象(下痢)を書類化し、大便サンプルを回収した(胃腸炎の開始後、最後の7日で)。各投与後の31日以内に生じる非応答型の有害事象を記録した。重篤な有害事象を、全体の試験期間の間に記録した。

VI.5. 実験室アッセイ
VI.5.1. 大便の分析
それぞれの試験ワクチン投与の日、もしくはその1日前、各投与後の7±1日目および15±1日目、ならびに訪問3の日もしくはその1日前に、全被験者から回収した大便サンプルを、GSK BiologicalsまたはGSK Biologicalsにより指示された実験室で分析して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA-第VI.6.1節を参照)を用いてワクチンRVの存在を検出し、ウイルスのシェディングを評価した。

投与1から訪問3までの後の予め決定された時点で回収された任意の大便中のELISAにより証明されたロタウイルス抗原の存在を、ワクチンウイルスのシェディングと考え、被験者がHRVワクチンまたは偽薬の投与1の日にロタウイルスに関して陰性であった場合、ワクチン応答の証拠として取った(すなわち、ワクチン取り込み)。偽薬被験者については、この場合、配列決定を行う。

最初はロタウイルスに関して陰性である被験者を、両方の結果が入手可能である場合、血清中の抗ロタウイルスIgA抗体およびワクチン接種前の時点での大便サンプル中のロタウイルス抗原について陰性であるか、または一方の結果のみが入手可能である場合、これらのマーカーの少なくとも1つについて陰性であった被験者であると定義する。

また、訪問1から訪問3までのそれぞれのGE症状の間に回収された大便サンプルを、GSK BiologicalsまたはGSK Biologicalsにより指示された実験室で、ELISAを用いて試験してRVを検出する。陽性の場合、G型を、PCRに基づく手法を用いて決定する。これらの分子的方法は、様々なG型間で非常に異なり、それぞれ所与のG型内で高度に保存されたVP7遺伝子内の領域を標的化する。例えば、Gouveaら(1990, J Clin Microbiol., 28:276-282)により開発されたRT-PCR法は、VP7遺伝子の異なる領域に位置する、異なる遺伝子型特異的プライマーのカクテルを用いる。ゲル電気泳動により見積もられた得られるPCR産物の大きさは、対応するG遺伝子型を同定するための情報を提供する。G1 RVが検出された場合、ワクチンウイルスを、配列分析または等価な手法により野生型血清型と区別する。

訪問3までに回収された任意の大便中のワクチンウイルスの任意の検出を、ワクチン応答(すなわち、ワクチン取込み)の証拠として取る。

VI.5.1. 血清分析
それぞれの試験訪問での被験者から回収された全血サンプルから得られた血清を、GSK Biologicalsにより指示された実験室でELISAにより試験して、血清抗ロタウイルスIgA抗体濃度を測定した。アッセイのカットオフは20 U/mlである。抗ロタウイルスIgA抗体の血清陰性被験者を、アッセイのカットオフ値より下の抗体濃度を有する被験者であると定義した。抗ロタウイルスIgA抗体の血清陽性被験者を、アッセイのカットオフ値より大きいか、またはそれと等しい抗体濃度を有する被験者であると定義した。

VI.6. 免疫原性：血清の分析
VI.6.1. ELISAによるIgA抗体の測定
このアッセイにより、ヒト血清におけるロタウイルスIgAの検出が可能になり、これはR. Ward(1,2)により最初に設計され、GSK Biologicalsにより適合化された。それを、ワクチン接種および／または感染後に免疫応答を測定するために用いた。サンプルを、GSK Biologicals, Rixensart, Belgium(または指示された実験室)で分析した。

ELISAアッセイの説明
96穴プレートを、抗ロタウイルス抗体希釈液との一晩のインキュベーションによりコーティングする。ウェルを洗浄し、ワクチン株に感染させた(陽性ウェル)か、または未感染(陰性ウェル)の細胞溶解物を添加する。回転式プラットフォーム上でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、血清サンプルまたは標準血清の希釈液を、両方の種類のウェル(陽性および陰性)中でインキュベートする。陰性ウェルの使用により、非特異的IgA結合の評価が可能になる。

プレートを洗浄し、ビオチン化されたウサギ抗ヒトIgAの添加(攪拌下で30分)により、結合したヒトIgAを検出する。プレートを洗浄した後、最適な濃度のペルオキシダーゼ結合アビジン-ビオチンを各ウェルに添加し、インキュベートする(攪拌下でRTで30分)。プレートを再度洗浄し、オルトフェニレンジアミン(OPD)を添加する。次いで、プレートをインキュベートした後(暗室中、室温(RT)で30分)、2N H₂SO₄を用いて反応を停止させる。吸光度を490/620 nmで測定する。特定の光密度を、陽性および陰性ウェルの間の差異を測定することにより、各サンプル／標準について算出する。サンプルの濃度を、標準曲線により作製された4つのパラメーターのロジスティック関数を用いることにより決定する。結果の算出のために、標準曲線(動作範囲)の最も正確な部分を決定する。1ミリリットルあたりのユニット(U/ml)での抗体濃度を、標準曲線の動作範囲内にあるそれぞれ未知の値を平均化した後、希釈因子について補正することにより、標準(濃度＝1000U/ml)と比較して算出する。それぞれの実験は、陰性および陽性対照を含む。全ての試薬について、最適濃度を予め決定する。

参考文献
1. Bernstein DI, Smith VE, Sherwood JRら、「弱毒化ヒト生ロタウイルス89-12ワクチンの安全性および免疫原性(Safety and immunogenicity of a live attenuated human rotavirus 89-12 vaccine.)」、Vaccine. 1998; 16:381-7。

2. Bernstein DI, Sack DA, Rothstein Eら、「乳児における弱毒化ヒト生ロタウイルスワクチン89-12の効率：無作為化偽薬制御試験(Efficacy of live attenuated human rotavirus vaccine 89-12 in infants: a randomised placebo-controlled trial.)」、Lancet. 1999; 354:287-90。

VI.7. 結果：抗ロタウイルスIgA抗体応答
表51は、抗ロタウイルスIgA抗体GMCおよび血清変換率(免疫原性に関する合計ワクチン接種コホート(cohort))を提供する。表52は、合計ワクチン接種コホート上で算出された抗ロタウイルスIgA抗体に対して血清陽性な被験者上で算出された抗ロタウイルスIgA抗体GMCを提供する。

血清変換率に関してHRVワクチンに対する抗体応答は、2回目の投与の1ヶ月後に両方のワクチン群において類似していた(HRV_Lyo群においては82.2％およびHRV_Liq群においては90.1％)。プールされた偽薬群においては、2回目の投与の1ヵ月後に血清変換された被験者は0％であったが、これはこの試験が共同体に野生型感染が存在しなかった時に行われたことを示唆している。

VI.8. 結論
・血清変換率に関する免疫原性は、2つのワクチン製剤間で類似していた。

・ワクチンの液体製剤は、0、1ヶ月のスケジュールに従って子供に投与した場合に、非常に免疫原性であった。

IgAは、ロタウイルスワクチンの効率のための良好なマーカーであるので、これらのデータは、病院で試験した製剤の保護的作用を支持している。

4つのカルボン酸塩に関する標準的な酸塩基滴定曲線を示す。 種々のアジピン酸塩を含有する製剤の制酸能力を示す。 Baby Rossett-Riceアッセイの実験設定を示す。 アジピン酸塩を含有する製剤の屈折率を示す。図3Aは、アジピン酸塩バッファー工程で、標的値が、混合物中で1.4578の屈折率を与えるスクロース58.5％ w/wであることを示す。図3Bは、最終製剤化工程で、標的は、1.4480の屈折率を誘導するスクロース55％ w/wであることを示す。 第II相臨床試験設計の概略を示す。

Claims (39)

1. ヒト乳児への経口投与用の液体ロタウイルス免疫原性組成物であって、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩を含み、pHが5.5〜7.5であり、リン酸塩を含まないか、または1 mM未満のリン酸塩を含み、前記カルボン酸塩が、アジピン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、マロン酸塩、グルタル酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、ピメリン酸塩およびその2以上の組合せからなる群より選択されるものである、前記組成物。
2. 前記組成物がリン酸塩を含まないか、または0.1 mM未満のリン酸塩を含む、請求項１に記載の液体組成物。
3. 前記組成物がリン酸塩を含まない、請求項１または２に記載の液体組成物。
4. 前記組成物のpHが、6.0〜7.0である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体組成物。
5. 前記カルボン酸塩がアジピン酸塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体組成物。
6. 前記カルボン酸塩が、50 mM〜2 Mの濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の液体組成物。
7. 前記カルボン酸塩が、100 mM〜1 Mの濃度で存在する、請求項６に記載の液体組成物。
8. 前記カルボン酸塩が、400 mM〜700 mMの濃度で存在する、請求項７に記載の液体組成物。
9. 前記糖が、グリセロール、エリスロース、エリスリオール、キシリトール、アラビトール、リボース、キシロース、アラビノース、グルコース、タガロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、イノシトール、ソルビトール、マンニトール、ガラクチトール、グルコースおよびフルクトースの組合せ、マルトース、ソホロース、ラクトース、セロビオース、メリビオース、トレハロース、スクロース、パラチノース、マルツロース、ラクツロース、マルチトール、ラクチトール、ラフィノース、マルトトリオース、メレジトース、セロトリオース、シリトール、マルトテトラオース、スタキオース、セロテトラオース、マルトペンタオース、セロペンタオース、マルトヘキサオース、セロヘキサオース、オリゴサッカリドからなる一覧から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の液体組成物。
10. 前記糖が、スクロースまたはデキストロースである、請求項９に記載の液体組成物。
11. 前記糖の濃度が1％ w/w〜70％ w/wである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の液体組成物。
12. 前記糖の濃度が、25％ w/w〜60％ w/wである、請求項１１に記載の液体組成物。
13. 前記糖の濃度が、50％ w/wまたは55％ w/wである、請求項１２に記載の液体組成物。
14. カルボン酸をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の液体組成物。
15. 前記カルボン酸が、アジピン酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、炭酸、プロピオン酸、酪酸、マロン酸、グルタル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、グルコン酸、フマル酸、酒石酸からなる一覧より選択される、請求項１４に記載の液体組成物。
16. カルシウムイオンをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の液体組成物。
17. 前記ロタウイルス抗原が、弱毒化生ロタウイルスなどの生ロタウイルスである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の液体組成物。
18. 前記弱毒化生ロタウイルスが、弱毒化生ヒトロタウイルスである、請求項１７に記載の液体組成物。
19. 前記弱毒化生ヒトロタウイルスが、受託番号ATCC VR 2272の下で寄託されたHRV 89-12C2株、その子孫、再集合体および免疫学的に活性な誘導体；受託番号ECACC 99081301の下で寄託されたHRV P43株、その子孫、再集合体および免疫学的に活性な誘導体からなる群より選択される、請求項１８に記載の液体組成物。
20. 前記組成物が、Baby Rossett-Riceアッセイにより評価されるように少なくとも8分の制酸能力を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の液体組成物。
21. 前記組成物が、Baby Rossett-Riceアッセイにより評価されるように少なくとも12分の制酸能力を有する、請求項２０に記載の液体組成物。
22. 前記組成物が、Baby Rossett-Riceアッセイにより評価されるように8〜23分の制酸能力を有する、請求項２０に記載の液体組成物。
23. 前記組成物が、Baby Rossett-Riceアッセイにより評価されるように12〜23分の制酸能力を有する、請求項２２に記載の液体組成物。
24. 前記組成物が、Baby Rossett-Riceアッセイにより評価されるように12〜20分の制酸能力を有する、請求項２１または２３に記載の液体組成物。
25. 前記組成物が、以下の条件：37℃で7日間、4℃で1年間、4℃で2年間の少なくとも1つの下で安定である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の液体組成物。
26. ワクチンである、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の液体組成物。
27. 前記組成物が、0.2 ml〜2.0 mlの用量で提供される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の液体組成物。
28. 前記組成物が、0.5 ml〜1.5 mlの用量で提供される、請求項２７に記載の液体組成物。
29. 前記組成物が、1.5 mlの用量で提供される、請求項２８に記載の液体組成物。
30. ロタウイルス関連疾患の治療または予防のための免疫原性組成物の製造における、ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩の使用であって、該免疫原性組成物は請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物である、前記使用。
31. 前記治療または予防が、安全かつ有効な量のヒト弱毒化生ロタウイルス組成物の2回経口用量を、投与1の時点で4〜15週齢以内の乳児に投与することを含む、請求項３０に記載の使用。
32. ヒトにおけるロタウイルス感染の予防のための、請求項３０または３１に記載の使用。
33. ヒトにおけるロタウイルス胃腸炎の予防のための、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の使用。
34. ヒトにおけるロタウイルスによる重篤な胃腸炎の予防のための、請求項３３に記載の使用。
35. 前記胃腸炎または重篤な胃腸炎が、前記液体製剤中に含まれるロタウイルス株のものとは異なる血清型のロタウイルス株により引き起こされる、請求項３３または３４に記載の使用。
36. 前記組成物が、0.2 ml〜2.0 mlの用量で提供される、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の使用。
37. 前記組成物が、0.5 ml〜1.5 mlの用量で提供される、請求項３６に記載の使用。
38. 前記組成物が、1.5 mlの用量で提供される、請求項３６または３７に記載の使用。
39. ロタウイルス抗原、糖およびカルボン酸塩と、製薬上許容し得る希釈剤とを混合することを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の液体ロタウイルス組成物の調製方法。

Images