JP5657406B2 - エロンガーゼ遺伝子及びそれらの使用 - Google Patents

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Description

本発明は、長鎖ポリ不飽和脂肪酸の伸長に関与するいくつかの遺伝子（即ち「エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ）」）の同定及びそれらの使用に関する。特に、エロンガーゼ酵素は、脂肪酸の他の脂肪酸への変換において利用される。例えば、エロンガーゼは、ガンマリノレン酸（ＧＬＡ）のジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３ｎ−６）への変換及びステアリドン酸（ｓｔｅａｒｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＳＴＡ、１８：４ｎ−３）の（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。エロンガーゼは、アラキドン酸（ＡＡ、２０：４ｎ−６）のアドレン酸（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）への変換、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）のω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）への変換及びα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）の２０：３ｎ−３への変換も触媒する。例えば、ＤＧＬＡは、薬学的組成物、栄養組成物、動物飼料及び化粧品のようなその他の製品へ添加されうる、アラキドン酸（ＡＡ）のようなその他のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造において利用されうる。
（背景情報）
過去に同定されたエロンガーゼは、それらが作用する基質に関して異なっている。さらに、それらは、動物及び植物の両方に存在する。哺乳動物において見出されるものは、飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸に作用する能力を有する。対照的に、植物において見出されるものは、飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸に特異的である。従って、植物においてポリ不飽和脂肪酸を生成させるためには、ＰＵＦＡ特異的なエロンガーゼが必要である。
植物においても動物においても、伸長過程は、４段階のメカニズムの結果であると考えられている（Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２（１９９６））。ＣｏＡが、アシル・キャリヤーである。第１段階は、マロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡとの縮合を含み、それにより二酸化酸素と、アシル部分の２炭素原子が伸長されたβ−ケトアシル−ＣｏＡとが生じる。続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水及び第二の還元が含まれ、それにより伸長されたアシル−ＣｏＡが生じる。最初の縮合反応は、基質特異的な段階であるのみならず、律速段階でもある。
前述のように、エロンガーゼ、より具体的に、ＰＵＦＡを基質として利用するエロンガーゼは、多くの重要な機能を有する長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生成において重要である。例えば、ＰＵＦＡは、細胞膜の重要な成分であり、細胞膜にリン脂質の形態で見出される。ＰＵＦＡは、哺乳動物のプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプロスタグランジンの前駆体としてもはたらく。さらに、ＰＵＦＡは、発達中の幼児の脳の適切な発達、並びに組織の形成及び修復に必要である。ＰＵＦＡの生物学的重要性を考慮して、それら及びそれらの生成に至る中間体を効率的に製造すべく、努力がなされている。
エロンガーゼ（ｅｌｏ）（図１参照）を含む多数の酵素が、ＰＵＦＡの生合成に関与している。例えば、リノレン酸（ＬＡ、１８：２−△９，１２又は１８：２ｎ−６）は、△１２デサチュレースにより、オレイン酸（ＯＡ、１８：１−△９又は１８：１ｎ−９）から生成される。ＧＬＡ（１８：３−△６，９，１２）は、△６−デサチュラーゼにより、リノレン酸から生成される。ＡＡ（２０：４−△５，８，１１，１４）は、△５−デサチュラーゼにより、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３−△８，１１，１４）から生成される。前述のように、ＤＧＬＡは、エロンガーゼにより、ＧＬＡから生成される。
動物は、Δ９位より先を不飽和化することができず、従ってオレイン酸をリノレン酸に変換することができないことに注意しなければならない。同様に、動物は、Δ１５デサチュラーゼ活性を欠いているため、α−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３−△９，１２，１５又は１８：３ｎ−３）を合成することができない。しかし、α−リノレン酸は、哺乳動物及び藻類においては、Δ６−デサチュラーゼ（ＰＣＴ公開第９６／１３５９１号参照：米国特許第５，５５２，３０６号も参照のこと）により、ステアリドン酸（ＳＴＡ、１８：４−Δ６，９，１２，１５）へ変換され、続いて（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４−Δ８，１１，１４，１７又は２０：４ｎ−３）へ伸長されうる。このポリ不飽和脂肪酸（即ち、２０：４−Δ８，１１，１４，１７）は、次いで、Δ５−デサチュラーゼにより、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５−Δ５，８，１１，１４，１７）へと変換されうる。真菌及び植物を含むその他の真核生物は、１２位（ＰＣＴ公開第９４／１１５１６号及び米国特許第５，４４３，９７４号を参照のこと）及び１５位（ＰＣＴ公開第９３／１１２４５号参照）の炭素を不飽和化する酵素を有する。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は、食事、並びに／又はリノール酸もしくはα−リノレン酸の不飽和化及び伸長に由来する。哺乳動物が、これらの必須長鎖脂肪酸を生成させることができないことを考慮すると、これらの脂肪酸を天然に生成させる種から、ＰＵＦＡ生合成に関与している遺伝子を単離し、商業的な品質の一つ又は複数のＰＵＦＡの製造を提供するように改変されうる、微生物、植物又は動物の系において、これらの遺伝子を発現させることは非常に重要である。従って、エロンガーゼ酵素、その酵素をコードする遺伝子及びこの酵素を製造する組み換え法が、明らかに必要とされている。さらに、天然に存在する油よりも高いレベルのＰＵＦＡを含有する油、及び新規なＰＵＦＡが濃縮された油が必要とされている。そのような油は、エロンガーゼ遺伝子の単離及び発現によってのみ作製されうる。
最も重要な長鎖ＰＵＦＡの一つは、前述のように、アラキドン酸（ＡＡ）である。ＡＡは、繊維状真菌に見出され、肝臓及び副腎を含む哺乳動物の組織からも精製されうる。前述のように、ＡＡのＤＧＬＡからの生成は、Δ５−デサチュラーゼにより触媒され、ＤＧＬＡのγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からの生成は、エロンガーゼにより触媒される。しかし、本発明以前には、長鎖ＰＵＦＡ、特に、ＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、アドレン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）、ω３−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−３）又はω６−ドコサペンタエン酸（２２：５ｎ−６）の生成のための経路において、基質脂肪酸に対する活性を有するエロンガーゼは、同定されていなかった。
２つの遺伝子が、エロンガーゼ遺伝子に関する本研究において重要であると考えられた。特に、ホホバβ−ケトアシル−補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）又はホホバＫＣＳ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号Ｕ３７０８８）は、脂肪酸アシル−ＣｏＡ伸長経路の最初の反応（即ち、マロニル−ＣｏＡと長鎖アシル−ＣｏＡとの縮合（Ｌａｓｓｎｅｒ ら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２（１９９６）））を触媒する。ホホバＫＣＳの基質選択性は、１８：０、２０：０、２０：１、１８：１、２２：１、２２：０及び１６：０である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｃｙｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エロンガーゼ（ＥＬＯ２）も、長鎖の飽和脂肪酸及びモノ不飽和脂肪酸の変換を触媒し、高レベルの２２：０、２４：０を生成させ、１８：０、１８：１、２０：０、２０：１、２２：０、２２：１及び２４：１も生成させる（Ｏｈら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（２８）：１７３７６−１７３８４（１９９７）；ＥＬＯ２の配列を含むヌクレオチド配列に関しては、米国特許第５，４８４，７２４号の参照のこと；実施例Ｖに記載されているグリコシル化阻害因子の配列の考察に関しては、ＰＣＴ公開第８８／０７５７７号を参照のこと）。これらの２つの遺伝子間の相同性の考慮に基づき、ＰＵＦＡ−エロンガーゼ活性に関する発現スクリーニングにより、モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）における長鎖ＰＵＦＡ特異的エロンガーゼの研究を開始した。
国際公開第９６／１３５９１号 米国特許第５，５５２，３０６号明細書 国際公開第９４／１１５１６号 米国特許第５，４４３，９７４号明細書 国際公開第９３／１１２４５号 米国特許第５，４８４，７２４号明細書 国際公開第８８／０７５７７号
Ｌａｓｓｎｅｒら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：２８１−２９２（１９９６） Ｏｈら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２（２８）：１７３７６−１７３８４（１９９７）
本発明は、配列番号１（図６）に示されたヌクレオチド配列の少なくとも約５０％と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列に関する。この単離された配列は、配列番号１により表されうる。その配列は、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。特に、その配列は、モルチエレラ属の真菌に由来するものであってよく、特に、モルチエレラ・アルピナから単離されうる。
本発明は、前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質も含み、さらに、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、かつ前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約５０％のアミノ酸類似性を有する、精製されたポリペプチドも含む。
さらに、本発明は、ａ）配列番号１（図６）により表されたヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）ｉ）プロモーター、およびｉｉ）該プロモーターと機能的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並びにｃ）エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を包含する。宿主細胞は、真核細胞であっても、又は原核細胞であってもよい。
原核細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞、シアノバクテリア細胞又は枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞でありうる。真核細胞は、例えば、真核細胞の適当な例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞でありうる。真菌細胞は、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞でありうる。真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、カンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）、リポミセス種（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ヤロウイア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．）、クルイベロミセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノイロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）又はピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）でありうる。特に、真菌細胞は、サッカロミセス種、特にサッカロミセス・セレビシエ、カンジダ種、ハンセヌラ種、又はピキア種のような酵母細胞でありうる。
本発明は、ａ）プロモーター、およびｂ）該プロモーターと機能的に連結された配列番号１（図６）により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも含み、さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。宿主は、真核細胞であっても、又は原核細胞であってもよい。原核細胞の適当な例には、大腸菌細胞、シアノバクテリア細胞、又は枯草菌細胞が含まれる。真核細胞の適当な例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞及び真菌細胞が含まれる。真菌細胞は、例えば、サッカロミセス種、カンジダ種、リポミセス種、ヤロウイア種、クルイベロミセス種、ハンセヌラ種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、ニューロスポラ種、トリコデルマ種及びピキア種でありうる。特に、真菌細胞は、例えば、例えばサッカロミセス種、特にサッカロミセス・セレビシエ、カンジダ種、ハンセヌラ種及びピキア種のような酵母細胞でありうる。
本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、植物細胞、植物又は植物組織によるモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される少なくとも一つの脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織を含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、２０：４ｎ−３及びアドレン酸（ＡＤＡ）でありうる。本発明は、植物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は脂肪酸も含む。さらに、本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含むトランスジェニック植物を包含する。
さらに、本発明は、プロモーターと機能的に連結されたエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を含む。ＤＮＡ配列は、配列番号１（図６）により表されうる。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ、又は例えばＤＧＬＡ、ω６−ドコサペンタエン酸、ＡＤＡ及び／もしくは２０：４ｎ−３（図１参照）のようなそれらの生成物を検出可能なレベルで含む、ヒト以外のトランスジェニック動物により産生された体液（例えば、乳汁）も含む。
さらに、本発明は、ａ）配列番号１（図６）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、ｃ）単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにｄ）基質を「生成物」ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を「基質」ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための方法を含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＴＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）からなる群より選択され、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡからなる群より選択されうる。本発明は、生成物ポリ不飽和脂肪酸を「第二生成物」ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、生成物ポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡからなる群より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω６−ドコサペンタエン酸からなる群より選択され、少なくとも一つのデサチュラーゼは、ＡＡ又はＥＰＡの製造に関してはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造に関してはΔ４−デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を「最終」ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
又、本発明は、前記方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、前記方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物を含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡからなる群より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。栄養組成物は、例えば、幼児用調合物、栄養補助食品又は食品代用物であってよく、ヒト又は動物へ投与されることができ、経口的又は非経口的に投与されうる。栄養組成物は、ココヤシ油、ダイズ油、カノーラ油、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、グルコース、食用ラクトース、電気透析されたホエー、電気透析されたスキムミルク、乳清、ダイズ・タンパク質、タンパク質加水分解物、ヒマワリ油、ベニバナ油、コーン油及びアマ油からなる群より選択される、少なくとも一つの多量養素をさらに含みうる。栄養組成物は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びビタミンＢ複合体からなる群より選択される少なくとも一つのビタミン、並びにカルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、リン、銅、塩素、ヨウ素、セレン及び鉄からなる群より選択される少なくとも一つの無機物も含みうる。
さらに、本発明は、１）前記方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、請求項３２の前記方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、２）薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を包含する。この組成物は、ヒト又は動物へ投与されうる。この組成物は、ビタミン、無機物、塩、炭水化物、アミノ酸、遊離脂肪酸、保存料、賦形剤、抗ヒスタミン、増殖因子、抗生物質、希釈剤、リン脂質、抗酸化剤及びフェノール化合物からなる群より選択される少なくとも一つの要素をさらに含みうる。この組成物は、経口、非経口、局所、直腸内、筋肉内、皮下、皮内、又はその他の任意の適当な手段により、投与されうる。
本発明は、前記方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、前記方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
さらに、本発明は、前記方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、前記方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び前記方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品も含む。
さらに、本発明は、予防又は治療を行うために十分な量で前記栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法を含む。
本発明は、配列番号２（図２２）に示されたヌクレオチド配列の少なくとも約３５％と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列も含む。この配列は、配列番号２により表されうる。その配列は、ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。この配列は、例えば、モルチエレラ属の真菌に由来するものであってよい。特に、それは、Ｍ．アルピナに由来するものであってよい。
さらに、本発明は、前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質を含み、さらに、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、かつ精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有する、精製されたポリペプチドを含む。
本発明は、前記のようなエロンガーゼ酵素を製造する方法も含む。ベクターへ挿入される配列は、配列番号２（図２２）により表される。宿主細胞は、原核細胞であっても、又は真核細胞であってもよい。適当な例は、前記と同様である。
本発明は、ａ）プロモーター、およびｂ）該プロモーターと機能的に連結された配列番号２（図２２）により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも含み、さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。この場合にも、宿主細胞は、原核細胞であっても、又は真核細胞であってもよい。適当な例は、前記と同様である。
本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、植物細胞、植物又は植物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織も含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。さらに、本発明は、植物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は脂肪酸を含む。
さらに、本発明は、ベクターのヌクレオチド配列（配列番号２）の発現により、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含むトランスジェニック植物も含む。
本発明は、プロモーターと機能的に連結されたエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物も含む。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を検出可能なレベルで含む、ヒト以外のトランスジェニック動物により産生された体液も含む。
本発明は、ａ）配列番号２（図２２）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、ｃ）単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにｄ）基質を生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための方法も含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡ及びＡＡであり、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。本発明は、生成物ポリ不飽和脂肪酸を第二生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を、少なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えばＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡであり、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸であり、少なくとも一つのデサチュラーゼは、ＡＡ又はＥＰＡの製造に関してはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造に関してはΔ４−デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ドコサヘキサエン酸、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
本発明は、配列番号２に関して記載された方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２に関して記載された方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号２に関して記載された方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物を含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡからなる群より選択されうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ及びω６−ドコサペンタエン酸からなる群より選択されうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びω３−ドコサペンタエン酸からなる群より選択されうる。投与、特徴、成分等に関する組成物のその他の属性は、前記と同様である。
本発明は、１）配列番号２に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号２に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、２）薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も含む。前記の薬学的組成物の特徴（例えば、投与、成分等）が、この組成物にも適合する。
本発明は、配列番号２に関して記載された方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号２に関して記載された方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、アドレン酸、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
本発明は、配列番号２に関する前記の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号２に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号２に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品も含む。
さらに、本発明は、予防又は治療を行うために十分な量で、直前に記載された栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法を含む。
さらに、本発明は、配列番号３（図４３）に示されたヌクレオチド配列の少なくとも約３５％と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列も含む。この配列は、配列番号３により表されるものでありうる。この配列は、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。この配列は、例えばヒトのような哺乳動物に由来する。
本発明は、このヌクレオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質も含む。また、本発明は、ポリ不飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸を伸長し、かつこの精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有する、精製されたポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、ａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）ｉ）プロモーター、およびｉｉ）該プロモーターと機能的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並びにｃ）エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へ該ベクターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を含む。宿主細胞は、配列番号１又は２を利用した対応する方法に関する前記の細胞と同様でありうる。
本発明は、ａ）プロモーター、およびｂ）該プロモーターと機能的に連結された配列番号３（図４３）により表されたヌクレオチド配列を含むベクターも含み、さらに、このベクターを含む宿主細胞も含む。宿主細胞は、前記の細胞と同様でありうる。
本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、植物細胞、植物又は植物組織によるモノ不飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される少なくとも一つの脂肪酸の生成が引き起こされる、前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織も含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。本発明は、植物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は酸も含む。
本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号３を含むベクターを含むトランスジェニック植物も含む。
さらに、本発明は、プロモーターと機能的に連結されたエロンガーゼをコードするヒトＤＮＡ配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を含む。ＤＮＡ配列は、配列番号３（図４３）により表される。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を検出可能なレベルで含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物により産生された体液も含む。
本発明は、ａ）配列番号３（図４３）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）該ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、ｃ）単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにｄ）基質を生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための方法も包含する。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡ又はＡＡであり、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。この方法は、生成物ポリ不飽和脂肪酸を第二生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、生成物ポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３及びＡＤＡであり、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡ及びω６−ドコサペンタエン酸であり、少なくとも一つのデサチュラーゼは、ＡＡ又はＥＰＡの生成に関してはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の生成に関してはΔ４−デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸及びω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
例えば、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号３に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸でありうる、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸からなる群より選択されうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。組成物のその他の特性又は特徴（例えば、投与、成分等）は、他の栄養組成物に関する前述のものと同様である。
さらに、本発明は、１）配列番号３に関する前記の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号３に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、２）薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も含む。組成物のその他の特性（例えば、投与、付加的成分等）は、他の薬学的組成物に関する前述のものと同様である。
本発明は、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号３に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
また、本発明は、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号３に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号３に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品を含む。
予防又は治療を行うために十分な量で、配列番号３に関する前述の栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法。
さらに、本発明は、配列番号４（図４６）に示されたヌクレオチド配列の少なくとも約３５％と一致するか、又は相補的である、単離されたヌクレオチド配列を含む。この配列は、配列番号４により表されうる。この配列は、ポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する、機能的活性を有するエロンガーゼをコードする。この配列は、セノラブディティス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）属の線虫に由来し、又はそれから単離され、特にＣ．エレガンス（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）から単離されうる。
本発明は、前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製されたタンパク質を含む。本発明は、ポリ不飽和脂肪酸を伸長し、かつこの精製されたタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有する精製されたポリペプチドも含む。
さらに、本発明は、ａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）ｉ）プロモーター、およびｉｉ）該プロモーターと機能的に連結された単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、並びにｃ）エロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程を含む、エロンガーゼ酵素を製造する方法を含む。宿主細胞の特性は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に関する前記の特性と同様である。
本発明は、ａ）プロモーター、およびｂ）該プロモーターと機能的に連結された配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を含むベクターも包含し、さらに、このベクターを含む宿主細胞も包含する。宿主細胞は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のための前述の宿主細胞に関する前述の特性と同一の特性を有する。
さらに、本発明は、ベクターの該ヌクレオチド配列の発現により、植物細胞、植物又は植物組織によるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号４を含む前記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織を含む。ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。本発明は、植物細胞、植物又は植物組織により発現された一つ又は複数の植物油又は脂肪酸も含む。
本発明は、ベクターのヌクレオチド配列の発現により、トランスジェニック植物の種子におけるポリ不飽和脂肪酸の生成が引き起こされる、配列番号４に相当するヌクレオチド配列を含む前記ベクターを含むトランスジェニック植物も含む。
さらに、本発明は、プロモーターと機能的に連結されたエロンガーゼをコードするＣ．エレガンスＤＮＡ配列を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を含む。そのＤＮＡ配列は、配列番号４（図４６）により表されうる。本発明は、少なくとも一つのエロンガーゼ又はそれらの生成物を検出可能なレベルで含む、請求項１８７のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物により産生された体液も含む。
本発明は、ａ）配列番号４（図４６）により表されるヌクレオチド配列を単離する工程、ｂ）単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築する工程、ｃ）単離されたヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼ酵素の発現にとって十分な時間及び条件で、宿主細胞へベクターを導入する工程、並びにｄ）基質を生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸へ曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸を製造するための方法も含む。基質ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＧＬＡ、ＳＴＡ又はＡＡであり、生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。この方法は、該生成物ポリ不飽和脂肪酸を第二生成物ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、発現されたエロンガーゼ酵素を、少なくとも一つのデサチュラーゼへ曝露する工程をさらに含みうる。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡであり、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、それぞれＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸であり、少なくとも一つのデサチュラーゼは、ＡＡ又はＥＰＡの製造に関してはΔ５−デサチュラーゼであり、ω６−ドコサペンタエン酸の製造に関してはΔ４−デサチュラーゼである。この方法は、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸へ変換するため、少なくとも一つのエロンガーゼ及び少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼからなる群より選択される一つ又は複数の酵素へ、第二生成物ポリ不飽和脂肪酸を曝露する工程をさらに含みうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
本発明は、配列番号４に関する前記の方法に従い製造された該ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４に関する前記の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号４に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。組成物のその他の特徴は、前記の栄養組成物に関して記述されたものと同様である。
さらに、本発明は、１）配列番号４に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号４に関する前述の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸と、２）薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を含む。組成物は、他の薬学的組成物に関する前記の特性と同様の特性（例えば、投与、追加要素等）を有する。
本発明は、配列番号４に関する前記の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号４に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択される、少なくとも一つのポリ不飽和脂肪酸を含む動物飼料も含む。生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＧＬＡ、２０：４ｎ−３又はＡＤＡでありうる。第二生成物ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＡＡ、ＥＰＡ又はω６−ドコサペンタエン酸でありうる。最終ポリ不飽和脂肪酸は、例えば、ＤＨＡ、ＡＤＡ、ω６−ドコサペンタエン酸又はω３−ドコサペンタエン酸でありうる。
さらに、本発明は、配列番号４に関する前述の方法に従い製造された生成物ポリ不飽和脂肪酸、配列番号４に関する前述の方法に従い製造された第二生成物ポリ不飽和脂肪酸及び配列番号４に関する前記の方法に従い製造された最終ポリ不飽和脂肪酸からなる群より選択されるポリ不飽和脂肪酸を含む化粧品を含む。
さらに、本発明は、予防又は治療を行うために十分な量で、配列番号４に関して記述された栄養組成物を患者に投与することを含む、ポリ不飽和脂肪酸の不十分な摂取又は生成により引き起こされる状態を予防又は治療する方法を包含する。
本明細書において言及された米国特許及び公開物は全て、参照として完全に本明細書に組み込まれる。
様々な脂肪酸生合成経路を示す図である。エロンガーゼの役割に注意されたい。 ホホバＫＣＳ及びＥＬＯ２のアミノ酸配列の類似性（％）及び同一性（％）を示す図である。 図２のホホバＫＣＳ配列（下線部がプライマー配列）と相同なＳ．セレビシエＥＬＯ２配列を示す図である。 図４Ａは、ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡを含有するｐＲＡＥ−２の物理的地図を示す図である。図４Ｂは、酵母におけるエロンガーゼ酵素産生に使用された構成性発現ベクターｐＲＡＥ−５の物理的地図を示す図である。 クローンｐＲＡＥ−５及びｐＲＡＥ−６のヌクレオチド配列の比較を示す図である。 モルチエレラ・アルピナ・エロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の全長ヌクレオチド配列を示す図である。 ＭＡＥＬＯ（図６参照）から翻訳されたモルチエレラ・アルピナ・エロンガーゼのアミノ酸配列を示す図である。 ３つのエロンガーゼ、Ｓ．セレビシエＥＬＯ２（ＧＮＳ１）とＳ．セレビシエＥＬＯ３（ＳＵＲ４）と図７に示された翻訳されたＭＡＥＬＯ配列とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。 ＭＡＥＬＯのヌクレオチド配列とＳ．セレビシエ由来のＥＬＯ２のヌクレオチド配列との比較を示す図である。 パン酵母において発現されたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 パン酵母において発現されたＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 ＡＡを生成するようＭ．アルピナ由来のΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現された場合のＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 ＭＡＥＬＯのＰＵＦＡエロンガーゼ活性と、パン酵母におけるＳ．セレビシエ由来のＥＬＯ２の過剰発現との比較を示す図である。 ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．エレガンス・ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列と、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの異なる比較を示す図である。 ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．エレガンス・ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列と、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの異なる比較を示す図である。 ＧｅｎＥＭＢＬデータベースのＣ．エレガンス・ヌクレオチド配列由来のアミノ酸配列と、翻訳されたＭＡＥＬＯとの３つの異なる比較を示す図である。 ＧｅｎＥＭＢＬデータベースの２つの異なる哺乳動物配列のアミノ酸翻訳と、翻訳されたＭＡＥＬＯとの比較を示す図である。 翻訳されたＤＮＡ配列（公開されたＰＣＴ出願第８８／０７５７７号を参照）と、データベース検索において検出されたＭＡＥＬＯ由来のアミノ酸配列との比較を示す図である。 Ｍ．アルピナ由来のΔ５−デサチュラーゼの全長ヌクレオチド配列を示す図である。 ＭＡＤ７０８プールの一次ＧＣ−ＦＡＭＥ分析を示す図である。ＤＧＬＡ（Ｃ２０：３ｎ−６）ピークの検出に注意されたい。 酵母中の５つのＭＡＤ７０８クローンの、ＧＬＡを基質として用いたＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。全てのクローンが明白なエロンガーゼ活性を有する。 プラスミドｐＲＰＢ２のＤＮＡ配列決定分析を示す図である。分析により９５７ｂｐ長のオープン・リーディング・フレームが明らかとなった。 ＧＬＡエロンガーゼ活性のためＧＬＥＬＯと名付けられた、プラスミドｐＲＰＢ２に含まれるＭ．アルピナｃＤＮＡの全長ヌクレオチド配列を示す図である。 ＧＬＥＬＯ（図２２参照）から翻訳されたＭ．アルピナ・エロンガーゼのアミノ酸配列を示す図である。 ＧＬＡを補足した場合の、３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導された培養物におけるｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 ２５μｍの他の脂肪酸基質を補足した場合の、３３４（ｐＲＰＢ２）の誘導された培養物におけるｎ−３及びｎ−６ ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 図２６Ａは、ＡＡを生成するようＭ．アルピナのΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現された場合の、ＧＬＥＬＯのＧＬＡを基質として用いたエロンガーゼ活性を示す図である。図２６Ｂは、ＥＰＡを生成するようＭ．アルピナのΔ５−デサチュラーゼｃＤＮＡと共に共発現された場合の、ＧＬＥＬＯのＳＴＡを基質として用いたエロンガーゼ活性を示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列（図２３参照）と翻訳されたＭＡＥＬＯ配列（図７参照）との比較を示す図である。 ４つのエロンガーゼのアミノ酸配列、即ちＧＬＥＬＯ（図２３参照）、ＭＡＥＬＯ配列（図７参照）、Ｓ．セレビシエＥＬＯ２（ＧＮＳ１）及びＳ．セレビシエＥＬＯ３（ＳＵＲ４）の翻訳されたアミノ酸配列の比較を示す図である。ヒスチジン・ボックスが下線で示されている。 翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒト・ホモログＨＳ１配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒト・ホモログＨＳ２配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定マウス・ホモログＭＭ２配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＭＡＥＬＯと翻訳された推定マウス・ホモログＡＩ２２５６３２配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒト・ホモログＡＩ８１５９６０配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒト・ホモログＨＳ１配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定ヒト・ホモログＡＣ００４０５０配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウス・ホモログＭＭ２配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウス・ホモログＡＩ２２５６３２配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定マウス・ホモログＵ９７１０７とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定Ｃ．エレガンスＵ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定Ｃ．エレガンスＵ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）ホモログ配列とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＧＬＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ・ホモログ配列ＤＭ１とのアラインメントを示す図である。 翻訳されたＭＡＥＬＯ配列と翻訳された推定キイロショウジョウバエ・ホモログ配列ＤＭ１とのアラインメントを示す図である。 ヒト・エロンガーゼＨＳＥＬＯ１の全長ヌクレオチド配列を示す図である。 ヒト・エロンガーゼＨＳＥＬＯ１の推定アミノ酸配列を示す図である。 ＧＬＡ又はＡＡを補足した場合の、３３４（ｐＲＡＥ−５８−Ａ１）の誘導された培養物のエロンガーゼ活性（ＰＵＦＡ及びその他）を示す図である。 Ｃ．エレガンス・エロンガーゼＣＥＥＬＯの全長ヌクレオチド配列を示す図である。 Ｃ．エレガンス・エロンガーゼＣＥＥＬＯの推定アミノ酸配列を示す図である。 ＧＬＡ又はＡＡを補足した場合の、３３４（ｐＲＥＴ−２１）及び３３４（ｐＲＥＴ−２２）の誘導された培養物のＰＵＦＡエロンガーゼ活性を示す図である。 推定ヒト・エロンガーゼ遺伝子ＨＳ３の全長ヌクレオチド配列を示す図である。 推定ヒト・エロンガーゼ酵素ＨＳ３の推定アミノ酸配列を示す図である。
（発明の詳細な説明）
本発明は、モルチエレラ・アルピナ由来の２つのエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列に関し、さらにヒト由来のエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列、並びにＣ．エレガンス由来のエロンガーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は、ｃＤＮＡの使用、及び遺伝子によりコードされるタンパク質の使用も含む。例えば、遺伝子及び対応する酵素は、薬学的組成物、栄養組成物及びその他の有用な製品へ添加されうる、ＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡのような、ポリ不飽和脂肪酸及び／又はモノ不飽和脂肪酸の製造において使用されうる。
エロンガーゼ遺伝子及びそれらによりコードされる酵素
前述のように、エロンガーゼｃＤＮＡによりコードされるエロンガーゼ酵素は、様々なポリ不飽和脂肪酸、特に２０〜２４個の炭素を含むＰＵＦＡの生成に必須である。本発明に関して、単離されたＭ．アルピナ・エロンガーゼｃＤＮＡ（ＭＡＥＬＯ）のヌクレオチド配列は、図６に示され、このヌクレオチド配列によりコードされる対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図７に示されている。さらに、単離されたＧＬＡエロンガーゼｃＤＮＡ（ＧＬＥＬＯ）のヌクレオチド配列は、図２２に示され、このヌクレオチド配列によりコードされる対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図２３に示されている。単離されたヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）エロンガーゼのヌクレオチド配列は、図４３に示され、この配列によりコードされる対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図４４に示されている。さらに、単離されたＣ．エレガンス・エロンガーゼｃＤＮＡ（ＣＥＥＬＯ１）のヌクレオチド配列は、図４６に示され、それによりコードされる対応する精製されたタンパク質又は酵素のアミノ酸配列は、図４７に示されている。
例として、本発明のｃＤＮＡによりコードされる単離されたエロンガーゼは、ＧＬＡをＤＧＬＡへ、又はＳＴＡを２０：４ｎ−３へ、又はＡＡをＡＤＡへ伸長する。次いで、ＤＧＬＡからのアラキドン酸の生成、又は２０：４ｎ−３からのＥＰＡの生成が、Δ５−デサチュラーゼにより触媒される。従って、ＡＡ（又はＥＰＡ）、ＤＧＬＡ（又は２０：４ｎ−３）、ＡＤＡ（又はω３−ドコサペンタエン酸）は、いずれも、少なくとも一つのエロンガーゼｃＤＮＡ及びそれらによりコードされる酵素が存在しない場合には合成されえない。
本発明は、配列番号１のヌクレオチド（即ち、本明細書に記載されたＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図６参照））の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％と一致する（即ち、同一性を有する）か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応するコードされるタンパク質）も包含することに注意されたい。さらに、本発明は、配列番号２のヌクレオチド（即ち、本明細書に記載されたＧＬＥＬＯ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図２２参照））の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％と一致する（即ち、同一性を有する）か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応するコードされるタンパク質）も含む。さらに、本発明は、配列番号３のヌクレオチド（即ち、本明細書に記載されたヒト配列１（ＨＳＥＬＯ１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図４３参照））の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％と一致する（即ち、同一性を有する）か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応するコードされたタンパク質）も含む。さらに、本発明は、配列番号４のヌクレオチド（即ち、本明細書に記載されたＣ．エレガンスｃＤＮＡ、ＣＥＥＬＯ１のヌクレオチド配列（図４６参照））の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４５％、より好ましくは少なくとも約５５％と一致する（即ち、同一性を有する）か、又は相補的な配列を有するヌクレオチド配列（及び対応するコードされるタンパク質）も含む。そのような配列は、モルチエレラ以外の起源（例えば、真核生物（例えば、トラウストキトリウム種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、トラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ）及びトラウストキトリウム・ロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ））、シゾキトリウム種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、シゾキトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ））、コニディオボルス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、コニディオボルス・ナノデス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｎａｎｏｄｅｓ））、エントモルフトラ種（Ｅｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）（例えば、エントモルフトラ・エキシタリス（Ｅｎｔｏｍｏｒｐｈｔｈｏｒａ ｅｘｉｔａｌｉｓ））、サプロレグニア種（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｓｐｐ．）（例えば、サプロレグニア・パラシティカ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）及びサプロレグニア・ディクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ））、レプトミツス種（Ｌｅｐｔｏｍｉｔｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、レプトミツス・ラクテウス（Ｌｅｐｔｏｍｉｔｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ））、エントモフトラ種（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ピチウム種（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｓｐｐ．）、ポルフィリディウム種（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）（例えば、ポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ））、コニディオボルス種（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、フィトフトラ種（Ｐｈｙｔｏｐｈａｔｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ペニシリウム種、コイドスポリウム種（Ｃｏｉｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ．）（例えば、ムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）及びムコール・ジャバニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ））、フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、アスペルギルス種及びロドトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐｐ．））、酵母（例えば、ディポダスコプシス・ユニヌクレアタ（Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔａ））、哺乳動物以外の生物、例えばハエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））又はセノラブディティス種（例えば、セノラブディティス・エレガンス）、又は哺乳動物（例えば、ヒトもしくはマウス））に由来するものでありうる。そのような配列は、アルピナ種以外のモルチエレラ属に属する種、例えば、モルチエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルチエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルチエレラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、モルチエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）及びモルチエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、ｖａ．アングリスポラ（ｖａ． ａｎｇｕｌｉｓｐｏｒａ）に由来するものであってもよい。さらに、本発明は、本発明のヌクレオチド配列（即ち、配列番号１（ＭＡＥＬＯ）、配列番号２（ＧＬＥＬＯ）、配列番号３（ＨＳＥＬＯ１）及び配列番号４（ＣＥＥＬＯ１））及びモルチエレラ以外の起源に由来する、前記の相補性又は一致性／同一性を有する配列の断片及び誘導体も包含する。前記配列の機能的等価物（即ち、エロンガーゼ活性を有する配列）も、本発明に包含される。
本発明の目的のために「相補性」を２個のＤＮＡセグメント間の関連性の程度と定義する。これは適当な条件下で１個のＤＮＡセグメントのセンス鎖が別のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして２重らせんを形成する能力を測定することにより決定する。２重らせんではアデニンが一方の鎖に現れるともう一方の鎖にはいつもチミンが現れる。同様に一方の鎖にグアニンが現れるともう一方の鎖にはいつもシトシンが現れる。２個のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど２個のＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド２本鎖を形成する能力が大きくなる。
２個のヌクレオチド配列間の「同一性」を、２個のＤＮＡセグメントの同一鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）間の同一性、対応性または同等性の程度と定義する。同一性％が大きくなるほど、鎖間の対応性、同一性または同等性が高くなる。
２個のアミノ酸配列間の「類似性」を、両方の配列における一連の同等および保存アミノ酸残基の存在と定義する。２個のアミノ酸配列間の類似性の程度が高いほど、２個の配列の対応性、同一性または同等性が高くなる。（２個のアミノ酸配列間の「同一性」を両配列における一連の正確に類似したまたは不変のアミノ酸残基の存在と定義する）
「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は当業者に周知である。
本発明はまたポリ不飽和およびモノ不飽和脂肪酸を伸長し、前記タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸類似性を有し（例えば図７（ＭＡＥＬＯ）を参照のこと）、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドをも含む。さらに、本発明はポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し（例えば図２３（ＧＬＥＬＯ）を参照のこと）、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドをも含む。さらに、本発明はまたポリ不飽和およびモノ不飽和脂肪酸を伸長し、前記のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し（例えば図４４（ＨＳＥＬＯ１）を参照のこと）、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドをも含む。また、本発明はポリ不飽和脂肪酸を伸長し、前記のタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約３０％のアミノ酸類似性を有し（例えば図４７（ＣＥＥＬＯ１）を参照のこと）、また前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチドをも含む。
本発明はまたＰＵＦＡエロンガーゼ活性をコードし、穏やかなストリンジェント条件下で図６に示す配列番号１（ＭＡＥＬＯ）および／または図２２に示す配列番号２（ＧＬＥＬＯ）および／または図４３に示す配列番号３（ＨＳＥＬＯ１）および／または図４６に示す配列番号４（ＣＥＥＬＯ１）により表されるヌクレオチド配列に対応するまたは相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸にハイブリダイズできる単離されたヌクレオチド配列をも包含する。適当な温度およびイオン強度条件下で核酸分子の１本鎖形態が別の核酸分子にアニーリングできる場合、核酸分子は別の核酸分子に「ハイブリダイズできる」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（１９８９）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州）。温度およびイオン強度はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」により決定する。「ハイブリダイゼーション」には相補的な配列を含有する２個の核酸が必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションの厳密性に応じて塩基間の誤対合を生じ得る。核酸をハイブリダイズするのに適当な厳密性は核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。このような変動要因は当業界で周知である。より具体的には、２個のヌクレオチド配列間の類似性または相同性が高くなるほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ（融解温度）値が高くなる。１００ヌクレオチド以上の長さのハイブリッドに関しては、Ｔｍを算出するための方程式が誘導されている（前記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。短い核酸でのハイブリダイゼーションに関しては、誤対合の位置がより重要であり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（前記で引用したＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）。
エロンガーゼ酵素の生成
一度エロンガーゼをコードする遺伝子を単離すると、次いでそれをベクター、プラスミドまたは構築物を使用して原核または真核宿主細胞のいずれかに導入できる。
ベクター例えばバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミドはエロンガーゼをコード化するヌクレオチド配列および宿主細胞中で機能し、ヌクレオチド配列によりコードされるエロンガーゼの発現を誘導できるいずれかのプロモーターを含むことができる。プロモーターはヌクレオチド配列と関連して機能できるかまたはヌクレオチド配列と機能的に連結できる。（プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列と「機能的に連結している」と言える。）適当なプロモーターには例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ホスフォグルコイソメラーゼ、ホスフォグリセレートキナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰ１、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメガロウィルス前初期、乳清酸性タンパク質、グルコアミラーゼ、およびガラクトースの存在下で活性化されるプロモーター、例えばＧＡＬ１およびＧＡＬ１０などがある。さらに、その他のタンパク質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列もまたベクターおよびポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ抗原、卵アルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）のようなその他の制御配列に含まれ得る。構築物に存在する配列の選択は望ましい発現生成物および宿主細胞の特性に依存する。
前記するように、一度ベクターを構築すると、次いで当業者に周知の方法、例えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版（１９８９）１ないし３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレスを参照のこと）により、これを選択した宿主細胞に導入できる。次いでＰＵＦＡの発現を可能にする適当な条件下で宿主細胞を培養し、次いで回収し、精製する。
２個またはそれ以上のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含んでなる一つの構築物またはベクターを用いる場合、独特のトリグリセリドまたはオイルを設計できることにも留意すべきである（例えばＭＡＥＬＯ、ＧＬＥＬＯ、ＨＳＥＬＯ１および／またはＣＥＥＬＯ１）。次いでこのベクターを１個の宿主細胞に導入できる。別法として、各々の配列を別個のベクターに導入できる。次いでこれらのベクターを各々２個の宿主細胞に、または１個の宿主細胞に導入できる。
適当な原核細胞宿主の例としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような細菌、およびスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）種（すなわち青緑藻）のようなシアノバクテリアなどが挙げられる。適当な真核細胞宿主の例としては、例えば哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、リポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種例えばヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（カンジダ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種もしくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、または糸状菌細胞のような真菌細胞、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）などが挙げられる。好ましくはビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン酵母）細胞を用いる。
宿主細胞における発現は一過性のまたは安定した方法で行うことができる。一過性の発現は宿主細胞で機能する発現シグナルを含有する導入構築物から生じることができるが、この構築物は複製せず、宿主細胞に組み込まれることはまれであるか、または宿主細胞は増殖性でない。一過性の発現はまた目的の遺伝子に機能的に連結した制御可能なプロモーターの活性を誘導することにより達成することもできるが、このような誘導システムでは発現レベルの基底値がたびたび低くなる。安定した発現は宿主ゲノムに組み込むことができるかまたは宿主細胞において自発的に複製される構築物の導入により達成できる。発現構築物に位置するかまたは発現構築物でトランスフェクトされた選別可能なマーカーを使用し、続いてマーカーを発現する細胞を選別することにより、目的の遺伝子の安定発現を選択することができる。組み込みにより安定発現が得られた場合、構築物の組み込み部位を宿主ゲノム内に無作為に生じることができるか、または宿主座との組換えを標的化するのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有する構築物を使用することにより構築物の組み込み部位を標的化できる。構築物が内在性の座を標的にする場合、転写または翻訳制御領域の全てまたは一部が内在性の座により提供できる。
前記のヌクレオチド配列の一つまたは両方によりコードされる目的の酵素（すなわちエロンガーゼ）を発現するために、トランスジェニックマウスをも用いることができる。より具体的には、一度前記の構築物を作ると、これを胚の前核に挿入できる。次いで胚を受体の雌に移植できる。別法として、核の移送法をも利用できる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：２１３０−２１３３（１９９７））。次いで妊娠および出産してもよい（例えば米国特許第５７５０１７６号、米国特許第５７００６７１号を参照のこと）。次いで子孫の乳、組織またはその他の体液サンプルは非トランスジェニック動物に通常見出されるレベルに比較して変化したレベルのＰＵＦＡを含有するはずである。レベルが変化したまたは増加したＰＵＦＡ生成、およびエロンガーゼ酵素をコードする一つのまたは複数の遺伝子のゲノムへの組み込みに関して次世代をモニター観察できる。宿主として利用される哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシからなる群から選択できる。しかしながら、目的の酵素をコードするＤＮＡをゲノムに組み込む能力を有すればいずれの哺乳動物を用いてもよい。
エロンガーゼポリペプチドを発現するために、機能的な転写および翻訳開始および終止領域をエロンガーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに機能できるように結合する。転写および翻訳開始および終止領域を、発現すべきＤＮＡを含む種々の非排他的供給源、望ましい系において発現可能であると知られているかもしくは考えられている遺伝子、発現ベクター、化学合成から、または宿主細胞の内在性の座から誘導する。植物組織および／または植物の部分における発現はとりわけ組織または部分が種子、葉、果実、花、根等のような初期に収穫されたものである場合、特定の有効性を呈する。特異的な制御配列例えば米国特許第５４６３１７４号、４９４３６７４号、５１０６６７３９号、５１７５０９５号、５４２００３４号、５１８８９５８号および５５８９３７９号の配列を利用することにより発現を植物のその位置に標的化できる。また別に、発現したタンパク質は、直接かまたはさらに修飾して宿主植物からの液体分画に混合することができる生成物を生成する酵素でよい。一つのまたは複数のエロンガーゼ遺伝子の発現、またはアンチセンスエロンガーゼ転写物は植物部分および／または植物組織に見出される特異的ＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを変化させることができる。望ましいＰＵＦＡを高い比率で含有するか、またはＰＵＦＡ組成物がヒト母乳によりよく類似している組織および／または植物部分を作るために、エロンガーゼコーディング領域を単独でまたはその他の遺伝子をと共に発現できる（Ｐｒｉｅｔｏら、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２４４９４）。開始領域が得られる遺伝子の３’領域から、または異なる遺伝子から終止領域を誘導できる。多くの終止領域が周知であり、同一および異なる属および種の種々の宿主において満足できるものであることが解っている。終止領域は通常いずれかの特別な特性のためというよりむしろ利便性から選択する。
前記したように植物（例えばグリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（大豆）またはブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）カノーラ））、植物組織、トウモロコシ、ジャガイモ、ヒマワリ、紅花または麻を各々エロンガーゼ酵素発現のための宿主または宿主細胞として用いることもでき、またポリ不飽和脂肪酸の生成に利用することができる。より具体的には、望ましいＰＵＦＡを種子に発現できる。種子油の単離方法は当業界で周知である。このように、ＰＵＦＡ供給源の提供に加え、エロンガーゼ遺伝子および恐らくデサチュラーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作して栄養組成物、薬学的組成物、動物飼料および化粧品に加えることができる種子油を提供できる。再度、一時的にエロンガーゼ遺伝子が十分に発現できる条件下で、機能的にプロモータに結合したエロンガーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなるベクターを植物組織または植物に導入する。ベクターは別の酵素例えばΔ４−デサチュラーゼ、Δ５−デサチュラーゼ、Δ６−デサチュラーゼ、Δ８−デサチュラーゼ、Δ９−デサチュラーゼ、Δ１０−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１３−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼおよび／またはΔ１９−デサチュラーゼをコードする１個またはそれ以上の遺伝子をも含んでなってよい。植物組織または植物は酵素が作用する関連基質（例えばＤＧＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、ＥＰＡ、２０：４ｎ−３、等）を生成できるか、またはこのような基質を生成する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞、植物、または目的の宿主細胞に導入できる。加えて、適当な酵素を発現する植物組織に基質をスプレーできる。これらの種々の技術を用いることにより、植物細胞、植物組織、植物または目的の宿主細胞を用いてＰＵＦＡ（例えばＤＧＬＡ、ＡＡもしくはＡＤＡのようなｎ−６不飽和脂肪酸、またはＥＰＡ、もしくはＤＨＡのようなｎ−３脂肪酸）を生成できる。本発明はまた前記したベクターを含んでなるトランスジェニック植物をも包含し、この場合ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、例えばトランスジェニック植物の種子にポリ不飽和脂肪酸を生成することにも注目すべきである。
天然かまたはトランスジェニックのいずれかにより宿主細胞が生成できる基質、および続いて宿主細胞に導入されるベクターに存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
前記を鑑み、本発明はまた１）エロンガーゼｃＤＮＡの望ましいヌクレオチド配列を単離する工程；２）該ヌクレオチド配列を含んでなるベクターを構築する工程；および３）エロンガーゼ酵素を生成するのに十分な時間および条件下で該ベクターを宿主細胞に導入する工程；からなる前記のエロンガーゼ酵素の一つを生成する方法をも包含する。
本発明はまたエロンガーゼが酸をポリ不飽和脂肪酸に変換するように酸を前記のように生成したエロンガーゼに曝露することからなるポリ不飽和脂肪酸の生成方法をも包含する。例えばＧＬＡをエロンガーゼに曝露するとＧＬＡはＤＧＬＡに変換される。次いでＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露すると、これはＤＧＬＡをＡＡに変換する。次いでΔ１７−デサチュラーゼを用いてＡＡをＥＰＡに変換でき、またエロンガーゼおよびΔ４−デサチュラーゼを用いてＤＨＡに変換できる。別法として、エロンガーゼを用いて１８：４ｎ−３を２０：４ｎ−３に変換し、これをΔ５−デサチュラーゼに曝露してＥＰＡに変換できる。またエロンガーゼを用いて１８：３ｎ−３を２０：３ｎ−３に変換し、これをまたΔ８−デサチュラーゼにより２０：４ｎ−３に変換できる。このようにエロンガーゼをポリ不飽和脂肪酸の生成に用いることができ、またこれを特定の有益な目的のために使用することができる。（いくつかの生合成経路でエロンガーゼが果たす多くの重要な役割の説明に関して図１を参照のこと。）
エロンガーゼ遺伝子およびそれによりコードされる酵素の使用
前記するように単離されたエロンガーゼｃＤＮＡおよびそれによりコードされる対応するエロンガーゼ酵素（または精製ポリペプチド）には多くの用途がある。例えば各々のｃＤＮＡおよび対応する酵素をポリ不飽和脂肪酸、例えばＤＧＬＡ、ＡＡ、ＡＤＡ、２０：４ｎ−３またはＥＰＡの生成において間接的または直接的に使用できる。（「直接的」とは酵素が直接的に酸を別の酸に変換する状況を包含することを意味し、後者の酸は組成物において利用される（例えばＧＬＡのＤＧＬＡへの変換）。）「間接的」とはエロンガーゼにより脂肪酸を別の脂肪酸（すなわち経路中間体）に（例えばＧＬＡをＤＧＬＡに）変換する状況を包含することを意味し、次いでエロンガーゼ以外の酵素を用いて後者の脂肪酸を別の脂肪酸に（例えばΔ５−デサチュラーゼによりＤＧＬＡをＡＡに）変換する。これらのポリ不飽和脂肪酸（すなわちエロンガーゼ酵素の活性により直接的または間接的のいずれかにより生成されたもの）を例えば栄養組成物、薬学的組成物、化粧品および動物用飼料に添加することができ、これらはすべて本発明に包含される。これらの用途に関しては以下に詳細に記載する。
栄養組成物
本発明は栄養組成物を包含する。本発明の目的のためのこのような組成物には経腸または非経口摂取を含むヒト摂取用のいずれかの食物または調製物が含まれ、これは体内に取り込まれると（ａ）栄養を与える、もしくは組織を作り上げる、もしくはエネルギーを供給するおよび／または（ｂ）十分な栄養状態もしくは代謝機能を維持、回復もしくは補助する。
本発明の栄養組成物は各々のエロンガーゼ遺伝子を用いて生成した少なくとも一つのエロンガーゼ酵素を用いて生成し、固体または液体のいずれかの形態でよい少なくとも一つの油または酸を含んでなる。加えて、組成物は特定の用途に望ましい量の食用多量要素、ビタミンおよびミネラルを含んでよい。このような成分の量は、組成物を正常で健康な幼児、子供に使用することを意図しているのか、それとも特定の代謝状態を伴う成人のような特別な必要性を有する（すなわち代謝障害）成人に使用することを意図しているのかに依存して変動する。
組成物に加えることができる多量要素の例としては食用脂肪、炭水化物およびタンパク質などがあるが、これらに限定するものではない。このような食用脂肪の例としてはココナッツ油、大豆油並びにモノおよびジグリセリドなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。このような炭水化物の例としてはグルコース、食用乳糖および加水分解デンプンなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。加えて、本発明の栄養組成物において用いることができるタンパク質の例としては大豆タンパク質、電気透析乳清、電気透析スキムミルク、乳清、またはこれらのタンパク質の加水分解物などが挙げられるが、これらに限定するものではない。
ビタミンおよびミネラルに関しては、以下のものを本発明の栄養組成物に添加してよい：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、ヨウ素並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体。その他のこのようなビタミンおよびミネラルを添加してもよい。
本発明の栄養組成物に用いられる成分は供給源を半精製または精製したものである。半精製または精製したとは天然物の精製により、または合成により調製された物質を意味する。
本発明の栄養組成物の例としては幼児調合物、栄養補助食品、食品代用物、および再水和組成物などが挙げられるが、これらに限定するものではない。特定の目的の栄養組成物には、幼児用の経腸または非経口補助食品、幼児専用調合物、高齢者用の補助食品、並びに胃腸障害および／または吸収不良を有する者の補助食品に利用するものなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
本発明の栄養組成物はまた食事に補充する必要がない場合でも食物に添加してよい。例えば、マーガリン、調製バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック類、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉、魚および飲料などのいかなる型の食品に添加してもよいが、これらに限定するものではない。
本発明の好ましい実施態様では、栄養組成物は経腸栄養剤であり、より好ましくは成人または小児科用の経腸栄養剤である。ストレスを経験しているかまたは慢性もしくは急性の疾病状態のために特に必要性のある成人または子供にこの組成物を投与できる。組成物は本発明に従って生成したポリ不飽和脂肪酸に加えて、前記するような多量要素、ビタミンおよびミネラルを含んでなってよい。多量要素は人乳に存在するのと等価の量で、またはエネルギーを基準にして、すなわちカロリー当たりを基準にして存在してよい。
液体または固体経腸または非経口栄養剤を処方する方法は当業界で周知である。（以下の実施例も参照のこと。）
例えば経腸処方を滅菌し、次いでそのまま供給できるよう（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｆｅｅｄ：ＲＴＦ用）にするかまたは濃縮液体もしくは粉末として保存する。粉末は前記するように調製した処方をスプレー乾燥して調製でき、濃縮物を再水和することにより再構成する。成人および小児科栄養調合物は当業界で周知であり、市販により入手できる（例えば、ロス・プロダクツ・ディビジョン、アボット・ラボラトリーズ、コロンバス、オハイオ州のＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）、およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明に従って製造される油または脂肪酸をこれらの処方のいずれかに添加してよい。
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体の形態では約０．６ｋｃａｌから約３ｋｃａｌ／ｍｌの範囲でよい。固体または粉末の形態では栄養補助食品は約１．２から９ｋｃａｌ／ｇ以上、好ましくは約３ないし７ｋｃａｌ／ｇを含んでよい。一般に、液体製品のオスモル濃度は７００ミリオスモル以下、より好ましくは６６０ミリオスモル以下にすべきである。
栄養剤は前記するように本発明に従って製造したＰＵＦＡに加えて、多量要素、ビタミンおよびミネラルを含んでよい。これらの付加的な成分が存在することにより個体がこれらの要素の１日最低必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡの供給に加えて亜鉛、銅、葉酸および抗酸化剤を組成物に添加するのも望ましい。これらの物質はストレスをうけた免疫系を高め、それにより組成物を摂取している個体がさらなる利益を享受することになると考えられる。薬学的組成物もまたこれらの要素を補給しうる。
より好ましい実施態様では、栄養組成物は、抗酸化剤および少なくとも一つのＰＵＦＡに加えて、少なくとも炭水化物の５重量％が消化しにくいオリゴ糖である炭水化物供給源を含んでなる。より好ましい実施態様では栄養組成物はさらにタンパク質、タウリンおよびカルニチンを含んでなる。
前記するように、静脈内投与を行っている患者用に、または栄養失調もしくはその他の症状もしくは疾病状態の予防もしくは治療のために、本発明に従って製造したＰＵＦＡまたはその誘導体を食品代用物または栄養補助食品、とりわけ幼児調合物に添加してよい。背景としてヒトの母乳は約０．１５％から約０．３６％のＤＨＡ、約０．０３％から約０．１３％のＥＰＡ。約０．３０％から約０．８８％のＡＡ、約０．２２％から約０．６７％のＤＧＬＡ、および約０．２７％から約１．０４％のＧＬＡからなる脂肪酸プロフィールを有することに留意すべきである。従って、本発明に従って製造したＤＧＬＡ、ＡＡ、ＥＰＡおよび／またはデコサヘキサエノン酸（ＤＨＡ）のような脂肪酸を用いて例えばヒトの母乳のＰＵＦＡ含量をよりよく模写するために幼児調合物の組成を変化させるか、またはヒト以外の哺乳動物の乳に通常見出されるＰＵＦＡの存在を変化させることができる。とりわけ薬理学的に、または栄養補助食品、特に母乳代用品もしくは補助食品において使用するための組成物は一つまたはそれ以上のＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡを含んでなるのが好ましい。より好ましくは、油ブレンドは約０．３から３０％のＡＡ、約０．２から３０％のＤＧＬＡ、および／または約０．２から約３０％のＧＬＡからなる。
非経口用栄養組成物はトリグリセリドとして算出した脂肪酸を約２から約３０重量％含んでなり、これは本発明に包含される。好ましい組成物ではＧＬＡとして全ＰＵＦＡ組成物の約１から約２５重量％含まれる（米国特許第５１９６１９８号）。その他のビタミン、とりわけビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＬ−カルニチンのような脂溶性ビタミンを含んでもよい。望む場合、アルファ・トコフェロールのような保存剤を約０．１重量％の量で加えてもよい。
加えて、ＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの比率は特定の最終使用目的に適合させることができる。母乳補助食品または代用品として処方する場合、一つまたはそれ以上のＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡを含んでなる組成物が各々約１：１９：３０から約６：１：０．２の比率で提供される。例えば、動物の乳はＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比率が１：１９：３０から６：１：０．２の範囲で変動し、好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間的な比率も含まれる。宿主細胞において一緒に製造した場合、ＧＬＡおよびＤＧＬＡのような前駆体基質のＡＡへの変換率および％を調整してＰＵＦＡの比率を正確に調節できる。例えばＤＧＬＡのＡＡへの変換率を５％から１０％にしてＡＡのＤＧＬＡに対する比率を約１：１９にでき、一方変換率を約７５％から８０％にしてＡＡのＤＧＬＡに対する比率を約６：１にできる。このように、細胞培養系においても宿主動物においても、エロンガーゼ発現およびその他のデサチュラーゼ発現の時期、程度および特異性を制御してＰＵＦＡレベルおよび比率を調節できる。次いで本発明に従って製造したＰＵＦＡ／酸（例えばＡＡおよびＤＧＬＡ）を望ましい濃度および比率で別のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と組み合わせてよい。
加えて、本発明に従って製造したＰＵＦＡまたはそれらを含有する宿主細胞を動物用補助食品として用いて動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物の摂取により望ましいものに変化させることもできる。
薬学的組成物
本発明はまた本明細書に記載した方法に従って、少なくとも一つのエロンガーゼｃＤＮＡ（すなわちＭＡＥＬＯ、ＧＬＥＬＯ、ＨＳＥＬＯ１またはＣＥＥＬＯ）を用いて製造した一つまたはそれ以上の脂肪酸および／または得られた油を含んでなる薬学的組成物をも包含する。より具体的にはこのような薬学的組成物は一つまたはそれ以上の酸および／または油、ならびに標準的で周知の無毒性の医薬的に許容される担体、アジュバントまたはベヒクル例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または水／油エマルションのようなエマルションを含んでなってよい。組成物は液体または固体の形態でよい。例えば、組成物を錠剤、カプセル、摂取可能な液体または粉末、注射可能なまたは局所用軟膏またはクリームの形態でよい。例えば分散液の場合、必要な粒子径を維持することにより、および界面活性剤を使用することにより適当な流動性を維持できる。等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウム等を含有するのも望ましい。このような不活性希釈剤に加え、組成物はまたアジュバント、例えば湿潤化剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤並びに芳香剤をも含有できる。
懸濁液は活性化合物に加えて例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントまたはこれらの基質の混合物を含んでなってよい。
錠剤およびカプセルのような固体投与形態は当業界で周知の技術を用いて調製できる。例えば、本発明に従って製造されたＰＵＦＡをラクトース、スクロース、およびコーンスターチのような慣用される錠剤基剤をアカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸のような崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤と組み合わせて錠剤化できる。これらの賦形剤を抗酸化剤および適当なＰＵＦＡと共にゼラチンカプセルに組み入れてカプセルを調製できる。抗酸化剤およびＰＵＦＡ成分は前記したガイドラインに適合しなければいけない。
静脈内投与用には本発明に従って製造したＰＵＦＡまたはその誘導体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（登録商標）のような市販の処方に組み入れてよい。典型的な正常の成人血漿脂肪酸プロフィールは６．６４から９．４６％のＡＡ、１．４５から３．１１％のＤＧＬＡおよび０．０２から０．０８％のＧＬＡからなる。患者の正常な脂肪酸プロファイルを達成するために、これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体を単独でまたはその他のＰＵＦＡと組み合わせて、投与できる。望む場合、処方の各々の成分を別個に、キットの形態で１回または多数回投与用に提供できる。特定の脂肪酸の典型的な投与量は１日０．１ｍｇから２０ｇ（１００ｇまで）、好ましくは１日１０ｍｇから１、２、５または１０ｇである。
本発明の薬学的組成物の可能な投与経路には例えば経腸（例えば経口および直腸経路）および非経口経路等がある。例えば、液体調製物を例えば経口または直腸経路で投与できる。加えて、均質な混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下で生理学的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝液またはプロペラントと混合してスプレーまたは吸入剤を形成できる。
投与経路はもちろん望まれる効果に依存する。例えば、組成物を荒れて乾燥した、または加齢皮膚の処置または外傷のあるまたは火傷した皮膚の処置、または疾病もしくは症状の影響を受けた皮膚もしくは髪の処置に用いる場合、恐らく局所的に適用できる。
患者に投与すべき組成物の用量は当業者により決定でき、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等に依存する。
形態に関しては、組成物を例えば溶液、分散液、懸濁液、エマルションまたは次いで再構築するための滅菌粉末にできる。
本発明はまた本明細書に記載した薬学的および／または栄養組成物を用いた種々障害の処置をも包含する。とりわけ、本発明の組成物を用いて血管形成後の再狭窄を処置することができる。さらに、本発明の組成物を用いて炎症、リウマチ性関節炎、喘息および乾癬の症状を処置することもできる。ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与し得ることも実証されており；従って、本発明の組成物を恐らく骨粗鬆症および腎臓または尿路結石の処置または予防に利用することができる。
加えて、本発明の組成物を癌の処置にも用いることができる。悪性細胞が脂肪酸組成を変化させていることが明らかになっている。脂肪酸の添加がその成長を遅延させ、細胞死を招き、化学療法剤の感受性を高めることが示されている。さらに本発明の組成物はまた癌に関連する悪液質の処置にも有益である。
本発明の組成物を用いて糖尿病を処置することもできる（米国特許第４８２６８７７号およびＨｏｒｒｏｂｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．５７（補）：７３２Ｓ−７３７Ｓを参照のこと）。糖尿病の動物では脂肪酸代謝および組成が変化していることが明らかにされている。
さらに、エロンガーゼ酵素を使用して直接的かまたは間接的のいずれかにより製造したＰＵＦＡを含んでなる本発明の組成物を、湿疹の処置、血圧低下および数学的な試験スコアの改善にも用いることができる。加えて、本発明の組成物を血小板凝集の阻止、血管拡張の誘発、コレステロール値の低下、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖の阻止（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５−１０１（１９７６））、消化管出血およびその他の非ステロイド性抗炎症薬の副作用の低減または予防（米国特許第４６６６７０１号）、子宮内膜症および月経前症候群の予防または処置（米国特許第４７５８５９２号）、並びに筋肉脊髄炎およびウイルス感染後の慢性疲労の処置（米国特許第５１１６８７１号）に用いることができる。
さらに本発明の組成物の用途にはＡＩＤＳ、多発性硬化症および炎症性皮膚障害の処置、並びに一般的な健康状態の保持における使用も含まれる。
加えて、本発明の組成物を化粧用の目的に利用することもできる。これを、混合物を形成するように既存の化粧用組成物に加えるか、または単独の組成物として用いることができる。
獣医学的適用
前記の薬学的および栄養組成物をヒトと同様に動物（すなわち家畜または家畜以外の動物）に関連して利用できることも注目すべきである。動物はヒトと同じ必要性および状況を多く経験するからである。例えば、本発明の油または酸を動物用栄養補助食餌、動物用食餌代用品、動物用ビタミンに、または動物用局所用軟膏に利用することができる。
本発明を以下の実施例を用いて説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
モルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）で用いるコドンの決定
１０００のランダムｃＤＮＡクローンの５’末端をモルチエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーからシークエンシングした。配列をファストＡアルゴリズムを用いるＧＣＧ（ジェネティックス・コンピューター・グループ（マジソン、ウィスコンシン州））を用いて６個の読み枠で翻訳し（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：２４４４−２４４８（１９８８））、クエリー配列と同型の配列群（核酸またはタンパク質）の類似性を、とりわけスイスポート・データベース（ジェネバイオ、ジュネーブ、スイス）を用いて調べた。既知遺伝子に対するタンパク質配列相同性に基づいて多くのクローンを推定ハウスキーピング遺伝子として同定した。データベースの既知ハウスキーピング遺伝子に適合する２１個のＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ配列を選別した（以下の表１を参照のこと）。これらの２１個の配列およびＭ．アルピナΔ５−（図１８を参照のこと）、Δ６−およびΔ１２−デサチュラーゼ配列全長に基づいてＭ．アルピナコドンバイアスの表（表２を参照のこと）を作った。Ｍ．アルピナｃＤＮＡ配列によってコードされる推定タンパク質および既知タンパク質配列間のファストＡ整列化がいくつかの区域で弱いので、相同性の強い区域のコドンのみを用いた。
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実施例ＩＩ
Ｍ．アルピナのエロンガーゼ様ｃＤＮＡ全長のクローニング
ホホバ由来のβ−ケトアシル補酵素Ａシンターゼ（ＫＣＳ）およびビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エロンガーゼ（ＥＬＯ２）を並べてアミノ酸相同性の区域を決定した（図２を参照のこと）。コドンバイアスを二つのエロンガーゼ間の相同性アミノ酸に対応する配列の区域に適用し、この配列の偏りに基づいてプライマーを設計した（図３を参照のこと）。Ｍ１１Ｍ．アルピナｃＤＮＡライブラリーから挿入物の大きさの平均が１．１キロ塩基対である約６ｘ１０５のクローンを含むｃＤＮＡを切除した（Ｋｎｕｔｚｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））。内在プライマーＲＯ３３９（５’−ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ−３’）およびベクター順行プライマーＲＯ３１７（５’−ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ Ｇ−３’）を用いて切除したｃＤＮＡを増幅した。切除したＭ．アルピナｃＤＮＡライブラリー３００ｎｇ、各プライマー５０ピコモル、１０倍バッファー１０μｌ、１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチド・ミックス（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）、およびＴａｑポリメラーゼ１．０ユニット；を含有する１００μｌの容量でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。パーキン・エルマー９６００（ノーウォーク、コネチカット州）の熱循環器条件は以下のとおりである：９４℃で２分間、次いで９４℃で１分間を３０サイクル、５８℃で２分間、および７２℃で３分間。続いて７２℃で２分間さらにＰＣＲを延長した。
ＰＣＲ増幅生成物をゲルに流し、約３６０塩基対の増幅フラグメントのゲルを精製し、ＡＢＩ ３７３ＡＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州）を用いて単離したフラグメントを直接的にシークエンシングした。ＧＣＧの配列分析パッケージを用いて得られた配列を既知配列と比較した。ファストＡアルゴリズムを用いるＧＣＧ分析プログラムで、６個の読み枠全てで配列を翻訳した（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、前記で引用）。タンパク質のスイスポートデータベース（ジェネバイオ、ジュネーブ、スイス）を検索した。ビール酵母菌ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）に対する推定タンパク質配列の相同性に基づき、この翻訳したｃＤＮＡフラグメントを推定エロンガーゼの一部であると同定し、これは６３個のアミノ酸において４１．３％の同一性を有した。
推定エロンガーゼ配列およびＭ．アルピナｃＤＮＡライブラリーの構築に使用したベクター、ｐＺＬ１（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、ガイザースブルグ、メリーランド州）配列に基づいて新規プライマーを設計した。前記した条件を用いて、ＢａｍＨＩ制限部位を加えた（下線）プライマーＲＯ３５０（５’−ＣＡＴ ＣＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＣＡＡ ＴＣＴ ＴＧ−３’）、およびベクター逆行プライマーＲＯ３５２（５’−ＡＣＧ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ−３’）を使用してＭ．アルピナ切除したｃＤＮＡライブラリーを再度ＰＣＲ増幅し、Ｍ．アルピナエロンガーゼｃＤＮＡの全長を単離した。約１．５キロ塩基対のＰＣＲ増幅フラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）で埋め、ブラント末端を作り、ｐＣＲ−ブラントベクター（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド。カリフォルニア州）にクローン化した。これにより２個のクローン、ｐＲＡＥ−１およびｐＲＡＥ−２を得た（図４Ａを参照のこと）。（ブダペスト条約の条件下、１９９８年８月２８日、プラスミドＤＮＡ ｐＲＡＥ−２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ボウルバード大学、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託し、寄託番号：ＡＴＣＣ ２０３１６６が付与された。）これらのベクターからのエロンガーゼｃＤＮＡをＥｃｏＲＩフレグメントとして切断し、ＥｃｏＲＩ消化ｐＹＸ２４２（ノバゲン、マジソン、カリフォルニア州）ベクターにクローン化した。ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６クローン（図４Ｂを参照のこと）は各々ｐＲＡＥ−１およびｐＲＡＥ−２に由来するエロンガーゼｃＤＮＡを有する。（ブダペスト条約の条件下、１９９８年８月２８日、プラスミドＤＮＡ ｐＲＡＥ−５をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１０８０１ボウルバード大学、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託し、寄託番号：ＡＴＣＣ ２０３１６７が付与された。）ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６のシークエンシングによりｐＲＡＥ−５のエロンガーゼ遺伝子の５’未翻訳領域は１６塩基対であり、ｐＲＡＥ−６のエロンガーゼ遺伝子よりも短い（図５を参照のこと）。完全なＭ．アルピナエロンガーゼｃＤＮＡ配列はＭＡＥＬＯと称し、ｐＲＡＥ−２より得られた（図６を参照のこと）。図７はＭＡＥＬＯの翻訳により得られたアミノ酸である。前記したように翻訳ＭＡＥＬＯでスイスポートデータベースを再度検索した：ＭＡＥＬＯはビール酵母菌ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）と３１７個のアミノ酸において４４．３％の同一性を有し、ビール酵母菌ＳＵＲ４（ＥＬＯ３）と３１８個のアミノ酸において４４．７％の同一性を有する。３個のエロンガーゼ間のファストＡ整列化を図８に示す。ヌクレオチドレベルでは（図９を参照のこと）、ＭＡＥＬＯビール酵母菌ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）と５４９塩基対の重複において５７．４％の同一性を有する。しかしながら、９５４塩基対の完全ＭＡＥＬＯ遺伝子およびビール酵母菌ＧＮＳ１（ＥＬＯ２）間の同一性は３３．０％である。
実施例ＩＩＩ
パン酵母におけるＭ．アルピナエロンガーゼｃＤＮＡの発現
ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−６構築物をビール酵母菌３３４に形質転換し（Ｈｏｖｅｌａｎｄら、Ｇｅｎｅ、８３：５７−６４（１９８９））、エロンガーゼ活性についてスクリーニングした。ｐＹＥＳ２ベクター（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）のホホバＫＣＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＧＮ７８７５（カルジーン、エルエルシー、デービス、カリフォルニア州）を陽性対照として用いた。Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）におけるエロンガーゼ活性を検出するために用いた基質はＧＬＡであり、ホホバＫＣＳの基質はオレイン酸（ＯＡ）であった。陰性対照株はｐＹＸ２４２ベクターを含有するビール酵母菌３３４であった。選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３章：３−５（１９９２））中、特定の基質を存在させて培養物を２５℃で４０ないし４８時間成長させた。ｐＹＥＳ２にクローン化したホホバＫＣＳ遺伝子の発現はＧＡＬ１プロモーターの調節下にあり、一方ｐＹＸ２４２のプロモーターはＴＰ１であり、これは構成要素である。従って、３３４（ｐＣＧＮ７８７５）および３３４（ｐＹＥＳ２）培養物はガラクトースにより誘導される。各細胞ペレットの脂質分画のＧＣ−ＦＡＭＥ分析は前記するように実施した（Ｋｎｕｔｚｏｎら、前記で引用）。
異なる実験により得られたエロンガーゼ活性を図１０Ａおよび１０Ｂで提供する。ホホバＫＣＳはモノ不飽和脂肪酸１８：１ｎ−９長鎖を２０：１ｎ−９に伸長する。Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）並びにビール酵母菌ＥＬＯ２およびＥＬＯ３間のアミノ酸相同性により、これらの遺伝子によりコードされたタンパク質は類似の基質特異性を有することが示唆された。Ｍ．アルピナエロンガーゼの活性、モノ不飽和脂肪酸および飽和脂肪酸長鎖の伸長（ＭＡＥＬＯ）は１８：１ｎ−９の２０：１ｎ−９への変換、また２４：０の合成においても認められる。調節株、３３４（ｐＹＸ２４２）では２０：１および２４：０の量は非常に少ししか、または全く検出されなかった（図１０Ａを参照のこと）。Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）はまた少なくとも一つのＰＵＦＡに作用し、１８：３ｎ−６（ＧＬＡ）を２０：３ｎ−６（ＤＧＬＡ）に変換する。全脂質における２０：３ｎ−６のパーセンテージは、対照３３４（ｐＹＸ２４２）と比較した場合、Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）ｃＤＮＡを有する３３４（ｐＲＡＥ−５）および３３４（ｐＲＡＥ−６）において高い。製造した２０：３ｎ−６のパーセンテージは３３４（ｐＹＸ２４２）で０．０９２％であり、対して３３４（ｐＲＡＥ−５）では０．３２４％であり、３３４（ｐＲＡＥ−６）で０．２６９％であった（図１０Ａおよび１０Ｂの括弧に示す）。脂肪酸プロフィールにおけるこの差異はまた生成した２０：３ｎ−６の全量にも認められる。３３４（ｐＹＸ２４２）により２０：３ｎ−６が０．２２６μｇしか生成されなかったが、一方３３４（ｐＲＡＥ−５）および３３４（ｐＲＡＥ−６）では各々２０：３ｎ−６が２．５０４μｇ、および２０：３ｎ−６が１．００６μｇ生成された。また、基質を加えない場合、２０：３ｎ−６のレベルは検出されなかった。
一旦Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）により２０：３ｎ−６を生じると、Δ５−デサチュラーゼは望ましい発現系においてそれをＡＡに変換できる。この仮説を試験するために、ｐＲＡＥ−５およびｐＲＡＥ−４構築物（プラスミドを含有するΔ５−デサチュラーゼ）をビール酵母菌３３４に同時形質転換し、ＡＡ生成に関してスクリーニングした。使用した基質はＧＬＡ（１８：３ｎ−６） ２５μＭであった。Ｍ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）が酵母において活性である場合、次いで基質をＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換し、これをΔ５−デサチュラーゼがＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換する。図１１に示す結果よりＡＡの生成、すなわちＭ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の活性が確認される。
エロンガーゼと共に、酵母におけるΔ５−、Δ６−およびΔ１２−デサチュラーゼの発現により脂肪酸の外来性の供給を必要とせずにＡＡを生成（図１を参照のこと）するはずである。
実施例ＩＶ
パン酵母におけるＭ．アルピナエロンガーゼｃＤＮＡ ＭＡＥＬＯおよびビール酵母菌エロンガーゼＥＬＯ２の発現の比較
制限部位（下線部）ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（各々）を組み込んだプライマーＲＯ５１４（５’−ＧＧＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＴＣ ＧＴＴ ＡＣＴ ＣＡＡ ＴＡＴ Ｇ−３’）およびＲＯ５１５（５’−ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＣＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＧ−３）を用いて、酵母エロンガーゼをコード化するＥＬＯ２遺伝子をビール酵母菌ゲノムライブラリー（オリジーン、ロックビル、メリーランド州）からクローン化した。ＥＬＯ２遺伝子をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でベクターｐＹＸ２４２にクローン化し、これをｐＲＥＬＯと称し、ビール酵母菌宿主３３４に形質転換し（Ｈｏｖｅｌａｎｄら、前記で引用）、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。陰性対照としてベクタープラスミドを用い、ＰＵＦＡエロンガーゼ活性を比較するために３３４（ｐＲＡＥ−５）を成長させた。培地中ガラクトースを含まず、基質として２５μＭ ＧＬＡを添加して、前記するように培養物を成長させた。図１２は３３４（ｐＲＡＥ−５）により生成された２０：３ｎ−６またはＤＧＬＡ（１８：３ｎ−６またはＧＬＡから伸長）の量を示すが、これは変化していないベクターｐＹＸ２４２を含む陰性対照の約４倍になり、一方２個の別個のクローン３３４（ｐＲＥＬＯ−１）および３３４（ｐＲＥＬＯ−２）は陰性対照の２倍にしかならなかった。加えて、生成したＤＧＬＡを全脂質のパーセントとして表現した場合（図１２の括弧に示す）、クローン３３４（ｐＲＥＬＯ−１）および３３４（ｐＲＥＬＯ−２）は各々ＤＧＬＡ０．１５３％および０．２％を生成し、一方３３４（ｐＹＸ２４２）はＤＧＬＡ０．１８５％を生成した。このようにこれらの株は全て類似のパーゼンテージのＤＧＬＡを生成した。しかしながら、株３３４（ｐＲＡＥ−５）はＤＧＬＡ０．２７９％を生成し、３３４（ｐＹＸ２４２）（陰性対照）より５０．８％増加している。これらのデータは、ビール酵母菌エロンガーゼ遺伝子ＥＬＯ２が酵母において過剰発現する場合においてさえ、ＧＬＡをＤＧＬＡに効果的に伸長しないことを示している。対照、３３４（ｐＹＸ２４２）に比較して高量のＤＧＬＡが生成されることから明白であるように、Ｍ．アルピナＰＵＦＡエロンガーゼ活性はこの変換に関して特異的である。
実施例Ｖ
ＭＡＥＬＯを用いる別の供給源に由来するエロンガーゼの同定
ＴファストＡアルゴリズム（ＰｅｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、前記で引用）を用いてクエリーペプチド配列および６個の読み枠の各々に翻訳されたデータベースＤＮＡ配列間の類似性を検索した。ＧＣＧのＧｅｎＥＭＢＬデータベース（６／９８）でＧＣＧのＴファストＡ検索に翻訳されたＭＡＥＬＯをクエリーとして用い、翻訳ＭＡＥＬＯに対するアミノ酸類似性の比較に基づいて別の潜在性エロンガーゼ配列を同定した。例えば図１３および１４において、２個の整列化は染色体ＩＩＩおよびＭＡＥＬＯに由来する２個の異なるシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）配列の翻訳の間に示されている。シー・エレガンスＤＮＡ配列（ジェンバンク受入番号：Ｚ６８７４９）はＧＮＳ１（ＥＬＯ２）との類似性を意味すると注釈されており、一方さらにシー・エレガンスＤＮＡ配列（ジェンバンク受入番号：Ｕ６１９５４）はＧＮＳ１およびＳＵＲ４（ＥＬＯ３）の両方に類似することが示されている。これらはスプライシングされたＤＮＳフラグメントであり、ここではイントロンはゲノム配列から除去されており、エクソンが集められ翻訳されている。シー・エレガンスの推定ＰＵＦＡエロンガーゼおよび翻訳ＭＡＥＬＯ間の同一アミノ酸の量は約３０％である。これは脂肪酸代謝において共通する機能、例えばＰＵＦＡエロンガーゼを示している。図１５は染色体ＩＩＩに由来する翻訳シー・エレガンス配列（ジェンバンク受入番号：ＡＦ００３１３４）の別の実例である。ＤＮＡ配列がビール酵母菌ＥＬＯ２に対してＤＮＡ相同性を有することが同定された。このＤＮＡ配列およびそのアミノ酸翻訳をさらに検査し、翻訳ＭＡＥＬＯと相同性があることが決定された。従って、シー・エレガンスはＰＵＦＡエロンガーゼを含有し得る。
図１６は各々マウスおよびヒトに由来する、翻訳ＭＡＥＬＯを有する翻訳ＤＮＡ配列の整列化を示す。マウス配列ＣＩＧ３０（ジェンバンク受入番号：Ｕ９７１０７）を褐色脂肪組織から単離し、「酵母ＳＵＲ４タンパク質に類似する」と報告されている。図１６に示すように、Ｕ９７１０７の翻訳のアミノ酸番号１３０ないし１５２は翻訳ＭＡＥＬＯに対し高度の類似性を有する。染色体４に由来するヒト配列（ジェンバンク受入番号：ＡＣ００４０５０）はＨＴＧＳ（ハイ・スループット・ゲノム・シークエンス）による。この配列に注釈はない。しかしながら、翻訳ＡＣ００４０５０は翻訳ＭＡＥＬＯと１５０個のアミノ酸において２８．７％の相同性を有した。この遺伝子フラグメントは、翻訳ＭＡＥＬＯに対するアミノ酸類似性に基づくと、ヒトＰＵＦＡエロンガーゼのフラグメントであり得る。
図１７は翻訳ＭＡＥＬＯおよび哺乳動物配列（ジェンバンク受入番号：Ｉ０５４６５、ＰＣＴ番号ＷＯ８８／０７５７７）のアミノ酸整列化を示しており、これはこの配列の発現物に由来するタンパク質がポリコスリル化阻害因子であることを主張している。二つのタンパク質間のアミノ酸同一性は関連する機能、例えばＰＵＦＡエロンガーゼ活性があり得ることを意味している。
別の翻訳ＤＮＡ配列および翻訳ＭＡＥＬＯに対するそれの相同性に関するこれらの実例は前記の実施例のいずれかが潜在的にＰＵＦＡエロンガーゼになり得ることを説明している。これらの実施例は可能なエロンガーゼ全てを包含するものではない。しかしながら、ＭＡＥＬＯまたはそのアミノ酸翻訳をデータベース検索のクエリーとして使用してＰＵＦＡエロンガーゼ活性を有する別の遺伝子を同定することができる。
実施例ＶＩ
プラークハイブリダイゼーション法を用いるＭ．アルピナｃＤＮＡライブラリースクリーニング
Ｍ．アルピナに由来するさらなるＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子を単離するために、慣用的なプラークハイブリダイゼーション法を用いてラムダベクターに作成したＭ．アルピナｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ＭＡＥＬＯヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡプローブを作り、これを用いてλジプロックスベクター（Ｋｎｕｔｚｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））に作成したＭ７＋８Ｍ．アルピナｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブを作るために、ＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡをＮｓｐＩおよびＰｖｕＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。平均約３００塩基対の大きさの小型ＤＮＡフラグメント３個を作り、プローブとして使用した。フラグメント化したＭＡＥＬＯ ｃＤＮＡの混合物を用いる原理はＭ．アルピナに存在する種々ＰＵＦＡエロンガーゼに保存されているアミノ酸配列の共通の領域またはドメインがあるであろうという仮定に基づいている。標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（１９８９））に準じ、プラークハイブリダイゼーション技術により、ＭＡＥＬＯ ＤＮＡプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
簡単には、５００００個の１次クローンをプレートし、ナイロン膜に移した。膜を変性し、２０％ ホルムアミド、０．２％ ＰＶＰ、ＢＳＡ、フィコール、０．１％ ＳＤＳおよび０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するハイブリダイゼーションバッファー中、アルファ３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＭＡＥＬＯ ＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイズした。３７℃で０．５Ｘ ＳＳＣを用いてフィルターを洗浄し、オートラジオグラフィー用にＸ線フィルムに曝露した。この手順を３回繰り返した。繰り返しハイブリダイズした４個のクローン（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４と称する）を取り、７％ ＤＭＳＯを含有するＳＭバッファー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記で引用）に懸濁した。
各候補の最も大きいオープン・リーディング・フレームを酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（ノバゲン・インコーポレーティッド、マジソン、ウィスコンシン州）にサブクローン化した。ｃＤＮＡクローンＦ１およびＦ３をＥｃｏＲＩ部位でｐＹＸ２４２にサブクローン化し、一方Ｆ２およびＦ４をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位でサブクローン化した。酵母で発現するために、各候補を含有する組換えｐＹＸ２４２をＳＣ３３４に形質転換した（Ｈｏｖｅｌａｎｄら、前記で引用）。エロンガーゼ活性および基質特異性を決定するために、実施例ＩＩＩに記載のＧＬＡ基質２５μＭの存在下、ロイシンを欠く最低培地で各ｃＤＮＡクローンを含有するＳＣ３３４を成長させた。Ｋｎｕｔｚｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））に記載されるように脂肪酸分析を実施した。その結果、ＧＬＡのＤＧＬＡへの変換においてこれら４個のｃＤＮＡクローンはいずれも有意な活性を呈しないことが示された。このように、さらなるＰＵＦＡエロンガーゼの同定には、ハイブリダイゼーション法は成功しないようである。
実施例ＶＩＩ
酵母におけるＭ．アルピナの直接ｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築
ＭＡＥＬＯ以外のＰＵＦＡエロンガーゼ遺伝子を同定するために、異なる方法でＭ．アルピナｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。とりわけ、パン酵母がデサチュラーゼおよびエロンガーゼの各々を欠如しているために長鎖ＰＵＦＡを生成することができないので、ビール酵母菌にＭ．アルピナの発現ｃＤＮＡライブラリーを構築する試みを行った。ビール酵母菌におけるｃＤＮＡライブラリーを発現するために、ＧＡＬ１プロモーターを含有するベクターｐＹＥＳ２（ノバゲン・インコーポレーティッド、マジソン、ウィスコンシン州）を選択した。
ｃＤＮＡを作成する慣用的な方法（すなわちＤＮＡ混合物をライゲートしたｃＤＮＡ／ベクターの宿主細胞への形質転換）は酵母においては困難である。なぜならばライゲートしたＤＮＡ混合物の直接的エレクトロポレーションによる形質転換効率は精製スーパーコイル化プラズミドＤＮＡの効率に比較して非常に低い。しかしながらこの方法の主に優れた点は中間体として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にライブラリーを作成した場合に起こる１次クローンの増幅を避けられることである。スクリーニングされるコロニー数が制限されるために、ｃＤＮＡ／ベクターライゲーション混合物を用いて異なるビール酵母菌株において形質転換する効率を最初に最適化することが決まっている。得られた最もよい結果ではビール酵母菌株ＳＣ３３４におけるライゲートしたＤＮＡのμｇあたり４ないし５ｘ１０５の形質転換体を生じた（Ｈｏｖｅｌａｎｄら、前記で引用）。
酵母に直接的Ｍ．アルピナｃＤＮＡ発現ライブラリーを作成するために、全ＲＮＡを真菌類から単離した。Ｍ．アルピナ真菌類（ＡＴＣＣ番号：３２２２１）をコーンミール寒天（ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州）上にプレートし、室温で３ないし４日間成長させた。一度菌類の成長が可視化されると、これをジャガイモデキストローズブロス５０ｍｌに接種し、室温で非常にゆっくりと振盪して胞子を形成させる。一度胞子が可視化されると、培養物５０ｍｌをジャガイモデキストロースの培養物１ｌに接種し、胞子を７２時間成長させた。滅菌ガーゼを通してろ過した後、さらにＲＮＡ抽出するためにすぐに細胞を液体窒素で凍結した。熱フェノール／ＬｉＣｌ抽出法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記で引用）を用いて細胞ペレット３６ｇから全ＲＮＡを調製した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳおよび２００ｍＭ 酢酸ナトリウムの溶液（ｐＨ４．８）中で細胞ペレットをホモジナイズした。ホモジネートにフェノールおよびクロロホルムを加え、水層を抽出した。再度フェノールおよびクロロホルムで水層を戻し抽出した。次いで４Ｍ 塩化リチウム等量を加えた。氷上で３時間サンプルをエタノール沈殿させ、遠心によりペレットを得た。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、ＤＥＰＣ処理した水に再懸濁した。分光測光法により全ＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により可視化し、２８Ｓおよび１８Ｓリボソームのバンドの存在を確認した。細胞ペレット３６ｇから全ＲＮＡ約１５ｍｇを得た。
標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（１９８９））に準じてライブラリーを構築した。オリゴｄＴセルロース・アフィニティー精製を用いて全ＲＮＡからメッセンジャーＲＮＡを調製した。ＡＭＶ逆転写酵素を用いてＸｈｏＩ制限部位を含有するオリゴｄＴプライマーでメッセンジャーＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡの第１の鎖を合成した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼおよびＲＮアーゼ Ｈを添加してｃＤＮＡの第２の鎖を合成した。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによりＥｃｏＲＩアダプタをブラント末端化したｃＤＮＡにライゲートした。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてｃＤＮＡサンプルをキナーゼ処理し、ＸｈｏＩで消化し、カラムバッファーで希釈し、セファクリルＳ−４００カラムに通した。高塩濃度バッファーによりＤＮＡサンプルを希釈した。４００ないし５０００塩基対のＤＮＡを含有するサンプルをプールし、これをｐＹＥＳ２ベクター（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）へのライゲーションに用いた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐＹＥＳ２ベクターにｃＤＮＡをライゲートした。酵母の直接的形質転換には多量のライゲート化ＤＮＡ（２ないし３μｇ）が必要であるので、大容量のライゲーション反応を実施した。
ｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２ライゲート化混合物で酵母細胞を直接形質転換するために、ＬｉＡｃ ＴＲＡＦＯ法を用いてコンピーテントＳＣ３３４細胞を調製した（Ｇｉｅｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２５５−２６９（１９９５））。簡単には、プレートからのＳＣ３３４の新鮮培養物をＹＰＤ培地５０ｍｌに接種した。３０℃で振盪しながら６００でのＯＤが１．０に達するまで培養物を成長させた。この出発物質３０ｍｌをＹＰＤ液体培地３００ｍｌに接種し、培養物の細胞数が〜３ないし５ｘ１０６セル／ｍｌに達するまで（約３ないし４時間）振盪しながらインキュベートした。細胞を収穫し、滅菌水で洗浄した。全細胞ペレットを新しく調製した１Ｘ ＴＥ／ＬイＡｃ（０．１Ｍ ＬｉＡｃ）１．５ｍｌに再懸濁した。すぐにこれらの細胞を形質転換に用いた。
コンピーテントＳＣ３３４細胞７５０μｌを１５ｍｌファルコンチューブに等分した。ｃＤＮＡ／ｐＹＥＳ２ライゲートしたＤＮＡの約２μｇを担体ＤＮＡと共に細胞に加え、穏やかに混合した。滅菌した４０％ＰＥＧ／ＬｉＡｃ３ｍｌを細胞に加え、穏やかにしかし完全に混合した。振盪しながら３０℃で３０分間細胞をインキュベートし、続いて４２℃で１５分間熱ショックを与えた。細胞を冷却し、ペレット化し、１Ｘ ＴＥ５ｍｌに再懸濁した。前記の細胞の１００μｌアリコートをウラシル不含の１５０ｍｍ選択寒天プレート５０個にプレートし（Ａｕｓｕｂｅｌ、前記で引用）、３０℃で３日間インキュベートした。全部で８ｘ１０５個の１次クローンを得た。５個のコロニーをウラシル不含の最低培地１ｍｌにプールし（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記で引用）、貯蔵用にグリセロールを添加した。全部で５０００個のプールをスクリーニング用に作った。
実施例ＶＩＩＩ
酵母におけるＭＡＤ（Ｍ．アルピナ直接）スクリーニング
ライブラリーにおけるｃＤＮＡの平均の大きさを決定することによりライブラリーの品質を分析した。ライブラリーのスクリーニングがｃＤＮＡの発現に基づいているので、ライブラリーに存在するｃＤＮＡの平均の大きさを決定することが重要である。最も長いｃＤＮＡを含有する発現ライブラリーを選択するのが、目的のｃＤＮＡ全長を単離するために最も適切であろう。この目標のために、実施例ＶＩＩに記載するように、無作為に選択したプールを選択寒天プレートにプレートし、個々のコロニーを得た。４０個の異なる酵母コロニーを無作為に取り、各コロニーをウラシル不含の選択液体培地５ｍｌに接種し（実施例ＶＩＩに記載するように）、３０℃で２４時間、振盪しながら成長させた。ビーズ・ビーティング法（Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｇｅｎｅ、５７：２６７（１９８７））を以下のように適応させてこれらのコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した：
１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ ＳＤＳ溶液０．５ｍｌ中培養物５ｍｌからのペレットを溶解した。等量の滅菌０．５ｍｍガラスビーズを加え、３分間手動で攪拌した。同じバッファー２００μｌを加え、混合物をさらに１分間攪拌した。サンプルを高回転で２分間遠心し、次いで新しいチューブに細胞抽出物を移した。等容量のフェノール／ＣＨＣｌ３をサンプルに加え、攪拌し、再度２分間遠心した。水層を２回再抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび約２．５容量のエタノールを用いて−２０℃で３０分間沈殿させた。７０％エタノールで沈殿物を洗浄し、水に再懸濁した。ＲＮＡおよびいかなるタンパク質夾雑物をも排除するために、製造者プロトコルに準じてＱＩＡプレップ・スピン・ミニプレット・キットを用いて（キアゲン・インコーポレーティッド、バレンシア、カリフォルニア州）、４０個の異なるサンプルから単離したプラスミドＤＮＡをさらに精製した。次いでＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼでプラスミドＤＮＡサンプルを制限してｃＤＮＡフラグメントを放出し、１％アガロースゲル上で消化物を分析した。その結果、直接ライブラリーのｃＤＮＡの大部分が０．８キロ塩基対から１．５キロ塩基対の長さで変動することが示された。
ライブラリーをスクリーニングするために、グリセロール保存物を解凍し、約０．５ｍｌをウラシル不含（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記で引用）の液体選択培地５ｍｌに加え、３０℃で２４時間成長させた。次いで培養物を２％ガラクトースおよび２５μｌＧＬＡ（エロンガーゼ酵素の基質）を含むウラシル不含液体選択培地５０ｍｌに移して２５℃で２４時間攪拌した。各々の誘導培養物の細胞ペレット中の脂質含量のＧＣ−ＦＡＭＥ分析を前記のように実施した（Ｋｎｕｔｚｏｎら、前記で引用）。ＭＡＥＬＯ（ウラシル不含選択培地中で成長したｐＹＸ２４２のｐＲＡＥ−５）を各バッチのランにおける陽性対照として用いた。ＭＡＥＬＯはは一貫してＧＬＡの１．５％をＤＧＬＡに変換できる（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
実施例ＩＸ
潜在ＰＵＦＡエロンガーゼをコードするｃＤＮＡの同定
ＧＣ−ＦＡＭＥ分析により約７５０個の個々のプールをスクリーニングおよび分析した後、実施例ＶＩＩＩに記載するように、５個のコロニーからなる１個のプール（すなわちＭＡＤ７０８）がＧＬＡのＤＧＬＡへの変換における有意な酵素活性を有すると考えられた。ＤＧＬＡ／ＧＬＡ比率に関してこの活性はＭ．アルピナエロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）よりも約５倍の高いことが認められた（図１９）。同じアッセイ条件下でプールを再度試験し、最初の知見を確認した。反復試験によりＧＬＡがＤＧＬＡに９．５％変換され、Ｍ．エアルピナエロンガーゼ活性（ＭＡＥＬＯ）より約５倍高かった。これらの結果よりＭＡＤ７０８プールが、基質であるＧＬＡに特異的なエロンガーゼ候補を含有することが強く示された。ＭＡＤ７０８が異なる５個のクローンからなる１個のプールであるので、このプールからエロンガーゼ活性をコードする個々のｃＤＮＡクローンを単離する必要があった。そのために元来のＭＡＤ７０８グリセロール貯蔵物をウラシル不含の選択培地寒天プレートにプレートした（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記で引用）。３０個の個々のコロニーを取り、実施例ＶＩＩＩに前記するように、ＧＬＡの存在下ウラシル不含で２％ガラクトースを含む液体選択培地で成長させた。次いで各培養物から得られた細胞ペレットを陽性対照が３３４（ｐＲＡＥ−５）（ｐＹＸ２４２のＭＡＥＬＯ）の脂肪ＧＣ−ＦＡＭＥ分析（Ｋｎｕｔｚｏｎら、前記で引用）に供した。酵母のＭＡＤ７０８発現プールからの３０個の個々のクローンの脂肪酸分析により、３０個のクローンのうち５個がＧＬＡのＤＧＬＡへの変換においてエロンガーゼ活性を示すことが明らかにされた。活性クローンＭＡＤ７０８−２、ＭＡＤ７０８−１０、ＭＡＤ７０８−１８、ＭＡＤ７０８−１９およびＭＡＤ７０８−３０の脂肪酸プロフィールを図２０に示す。この図に示されるように、ＭＡＤ７０８−２、１０および３０が最もＤＧＬＡを生成し、ＭＡＥＬＯ（ｐＲＡＥ−５）の約２５倍以上である。これらの３個は４１％ないし４９％の範囲でＧＬＡをＤＧＬＡに変換する。その他のクローン、ＭＡＤ７０８−１８およびＭＡＤ７０８−１９は８％および２１％ＧＬＡをＤＧＬＡに変換する。全てのＭＡＤ７０８クローンはエロンガーゼをコードするＭＡＥＬＯに関して高いパーセンテージてＧＬＡをＤＧＬＡに変換する（３．４％）。
実施例Ｘ
エロンガーゼをコードするｃＤＮＡの特性化
実施例ＶＩＩＩに記載するように、ビーズビーティング法により有意なＧＬＡ特異性エロンガーゼ活性を呈するＳＣ３３４酵母クローン（ＭＡＤ７０８プール）からプラスミドＤＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ挿入物の大きさを決定するために、陽性エロンガーゼクローンから得た各プラスミドＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲを実施した。順行プライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＡＣ−３’）および逆行プライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ −３’）はｐＹＥＳ２ベクターのマルチクローニング部位にあり、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位内のｃＤＮＡ挿入物を増幅するのに使用した。プラスミドＤＮＡ ４マイクロｌ、各プライマー５０ピコモル、１０Ｘバッファー５μｌ、１０μＭ ＰＣＲヌクレオチドミックス（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）１μｌおよびハイ・ファイブ・Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）０．５μｌ含有する５０μｌ容量中ＰＣＲを実施した。増幅は以下のように実施した：９４℃で２分間変性、次いで９４℃で１分間、５５℃で２分間、および７２℃で３分間、３０サイクル、増幅の最後に７２℃で７分間延長。ＰＣＲ増幅生成物を１％アガロースゲル上で分析し、エロンガーゼｃＤＮＡの大きさが約１．０ないし１．２キロ塩基対であることが示された。潜在エロンガーゼｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡをｐＲＰＢ２、ｐＲＰＢ１０、ｐＲＰＢ１８、ｐＲＰＢ１９およびｐＲＰＢ３０と称する。ｐＹＥＳ２ベクターのＥｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位でｃＤＮＡライブラリーを作成したので、前記プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化することにより各プラスミドに存在するｃＤＮＡの大きさをさらに確認した。
ｃＤＮＡクローンの長期保存用およびＤＮＡシークエンシング用に酵母から単離したプラスミドＤＮＡを大腸菌で再増幅した。製造者プロトコルに従って、大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）細胞をｐＲＰＢ組換えプラスミドで形質転換した。各プラスミドＤＮＡから得た形質転換体をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢに接種し、振盪しながら３７℃で一晩成長させた。製造者プロトコルに従ってＱＩＡプレップ・スピン・ミニプレップ（キアゲン・インコーポレーティッド、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてこれらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。次いで精製プラスミドＤＮＡを用いて５’および３’の両末端よりシークエンシングした。製造者プロトコルに従って３７３ＡストレッチＡＢＩ自動ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州）を用いてＤＮＡシークエンシングを実施した。シークエンシングに用いたプライマーはｐＹＥＳ２ベクターのマルチクローニング部位に含まれる順行プライマーＲＯ５４１（５’−ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＡＣ−３’）および逆行プライマーＲＯ５４０（５’−ＧＴＧ ＡＡＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＴＡＡ −３’）である。得られたヌクレオチド配列を分析するためにシークエンサー・ソフトウェア・プログラム（ジーン・コード・コーポレーション、アン・アルボア、ミシガン州）に移した。ＤＮＡ配列分析により５個のエロンガーゼｃＤＮＡ全てが３０１ヌクレオチドの共通重複と同等のヌクレオチドを含有することが示された。各ＤＮＡ配列は５’末端の初めに推定出発部位を、３’末端でポリＡテールを有する停止コドンを含有する。ＤＮＡ配列をさらに確認するために内部の順行プライマーＲＯ７２８（５’−ＧＡＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＧＧＴ ＴＣＧ−３’）およびＲＯ７３０（５’−ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＴＧＡ ＡＣＴ ＣＧ−３’）を逆行プライマーＲＯ７２９（５’−ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＴＣ ＧＡＡ Ｃ−３’）およびＲＯ７３１（５’−ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＣＧ ＴＧ−３’）と共にｃＤＮＡ内に設計し、ｐＲＰＢ２のシークエンシングに用いた。なぜならばこの候補は最も高いエロンガーゼ活性を有するからである。シークエンサープログラムにより全ヌクレオチド配列を分析し、ｐＲＰＢ２の全ｃＤＮＡ配列から推測される最も長いオープン・リーディング・フレームは９５７塩基対の長さであると考えられた（図２２）。次いで推測されるオープン・リディング・フレームを対応するアミノ酸配列に翻訳し、予測される配列を図２３に示す。Ｍ．アルピナから同定されたｃＤＮＡによりコードされたエロンガーゼは３１８アミノ酸長のタンパク質であると考えられ、これは翻訳ＭＡＥＬＯの大きさとほとんど同等である。この新規エロンガーゼを「ＧＬＥＬＯ」と称し、そのコード化タンパク質を「ＧＬＡエロンガーゼ」と命名した。
ブダペスト条約の条件下、１９９９年７月２２日にプラスミドＤＮＡ ｐＲＰＢ２をアメリカン・カルチャー・コレクション、１０８０１ ボウルバード大学、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託した。これにはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−４０２が付与された。
実施例ＸＩ
ＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）の生化学的特性
Ａ．ＧＬＡエロンガーゼ活性の確認
ｐＲＰＢ２組換えプラスミドによりコードされたＧＬＡエロンガーゼの活性をさらに確認するために、ｐＲＰＢ２プラスミドを含有する酵母クローンＳＣ３３４でエロンガーゼ活性スクリーニングを繰り返した。またこの実験を行うことにより一貫した脂質抽出を確実にし、４つの別個の実験を平均化することによりＧＬＡエロンガーゼ活性を検出できた。ｐＲＰＢを含有するビール酵母菌３３４グリセロール貯蔵物をウアシル不含の最低培地寒天プレートにプレートした。個々のコロニーを無作為に取り、実施例ＶＩＩＩに記載するように、ウラシル不含の最低培地で成長させた。４個の別個の培養物を組み合わせ、５ｍｌアリコートを用いて４個の別個の培養物５０ｍｌに接種した。次いでＧＬＡの存在下培養物を成長させ、実施例ＶＩＩＩに記載するように、ｐＹＥＳ２を含有するビール酵母菌３３４の陰性対照と共に脂肪酸分析に供した。２５μＭ ＧＬＡを含む３３４（ｐＲＰＢ２）の４個の別個の培養物の平均エロンガーゼ活性を図２４に示す。３３４（ｐＲＰＢ２）の４個の別個のサンプルの各々のＧＬＡエロンガーゼ活性は６２％のＧＬＡのＤＧＬＡへの平均変換に一致すると考えられた。
Ｂ．ＧＬＡエロンガーゼに関するＧＬＥＬＯ基質特異性の決定
ＧＬＡエロンガーゼの基質特異性を分析するために、３３４（ｐＲＰＢ２）の培養物をＧＬＡに加えて別の脂肪酸基質（例えばＳＡ（１８：０）、ＯＡ（１８：１）、ＬＡ（１８：２ｎ−６）、ＡＡ（２０：４ｎ−６）、ＡＤＡ（２２：４ｎ−６）、ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）、ＳＴＡ（１８：４ｎ−３）、およびＥＰＡ（２０：５ｎ−３））で試験した。同等のアッセイ条件下でエロンガーゼ酵素により利用される唯一の別の基質はｎ−３経路の脂肪酸、ＳＴＡであった。ＧＬＡエロンガーゼは７３％のＳＴＡを２０：４ｎ−３に変換できた（図２５）。これらの実験より、ＧＬＡエロンガーゼがＧＬＡとＳＴＡの両方に基質特異性を有すると結論づけられ、これはこれがｎ−６およびｎ−３経路の両方でエロンガーゼ活性を有していることを示している。
Ｃ．酵母における菌類のＧＬＥＬＯおよびΔ５−デサチュラーゼ遺伝子の同時発現
望ましい同時発現系において一度ＧＬＡエロンガーゼによりＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）を生成すると、Δ５−デサチュラーゼがそれをＡＡ（２０：４ｎ−６）に変換できる。図１で表されるように、この反応図式はＥｃｏＲＩ部位でクローン化されたプラスミドｐＲＰＢ２およびｐＲＰＢ３１（Δ５−デサチュラーゼｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドｐＹＸ２４２）（図１８）を用いてビール酵母菌３３４を同時形質転換することにより試験できる。同時形質転換した酵母培養物に２５μＭ ＧＬＡを補充し、ＡＡ合成に関して分析した。エロンガーゼおよびΔ５−デサチュラーゼ酵素の両方を発現する場合、ＧＬＡ基質はＤＧＬＡに変換され、これは次いでＡＡに変換される。２６Ａの結果はＧＬＡエロンガーゼおよびΔ５−デサチュラーゼのＧＬＡ基質に及ぼす一連の作用の結果、平均２７％のＧＬＡをＡＡに変換する。従って、ＧＬＡエロンガーゼはｎ−６ＰＵＦＡ合成経路において別の酵素と働いて望ましい脂肪酸を生成することができる。
前記の変換がｎ−３経路でも真実であるかどうかを決定するために、２５μＭ ＳＴＡの存在下同様の同時発現実験を実施した。再度両酵素を発現する場合、ＳＴＡ基質は２０：４ｎ−３に変換され、これがΔ５−デサチュラーゼによりＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換される。図２６ＢではＥＰＡの生成（約４０％）が観察されたことを示している。再度、ＧＬＡエロンガーゼがｎ−３経路においてΔ５−デサチュラーゼと共に働いて望ましい脂肪酸を生成できることが示された。
実施例ＸＩＩ
ＧＬＥＬＯおよびその他の菌類のエロンガーゼ間の配列比較
ＧＣＧの配列分析パッケージ（実施例Ｉを参照のこと）を用いてＧＬＥＬＯ配列を既知タンパク質配列と比較した。ＧＬＥＬＯオープン・リーディング・フレームのヌクレオチド配列が最初に翻訳され、これをクエリー配列として用いてファストＡアルゴリズム（実施例Ｉを参照のこと）を用いるスイスポートデータベース（実施例Ｉを参照のこと）を検索した。アミノ酸配列類似性に基づき、ビール酵母菌ＹＪＴ６（未知の注釈を付したＥＳＴ）と１８９個のアミノ酸重複において３３．９％の同一性、ビール酵母菌ＥＬＯ２（ＧＮＳ１）と２９５個のアミノ酸重複において２５．８％の同一性、およびビール酵母菌ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）と３１３個のアミノ酸重複において２５．２％の同一性で最も適合することが見出された。ＧＬＥＬＯのＭＡＥＬＯとのファストＡ整列化により２７５個のアミノ酸において３０．９％の同一性が示された（図２７）。発展的なペア化した整列化を用い（実施例Ｉを参照のこと）、前記のエロンガーゼと共に用いてＧＣＧパイルアッププログラムにより、関連する配列群から多数の配列整列化を作った。パイルアップの結果により、エロンガーゼには推定ヒスチジンボックスを含む多くの保存領域があり、これには下線を付してある（Ｋｎｕｔｚｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２９３６０−２９３６６（１９９８））（図２８）。このように、ＧＬＥＬＯはＭＡＥＬＯと類似性を有するが、基質優先性は恐らくコード化されたエロンガーゼにおける差異によるものであろう。ＧＬＡエロンガーゼはＭ．アルピナよりも高いパーセンテージでＧＬＡをＤＧＬＡに変換できる。加えてビール酵母菌におけるＭＡＥＬＯの発現はＧＬＡのＤＧＬＡへの伸長に加え、飽和およびモノ不飽和脂肪酸の伸長を呈する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。
実施例ＸＩＩＩ
哺乳動物におけるＭ．アルピナＭＡＥＬＯ相同性の同定
ＭＡＥＬＯ翻訳配列を用いてアボット・ラボラトリーズ、１００アボット・パーク・ロード、アボット・パーク、イリノイ州６００６４のユニファイド・ヒューマン・トランスクリプト・データベースを検索した。ベーシック・ローカル・整列化・サーチ・ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いてデータベースを検索した。このツールは「クエリーがタンパク質であるかＤＮＡであるかにかかわらず、全ての可能な配列データベースのずべてを探るために設計された一連の類似性検索プログラムである」。具体的には、ツブラストン（ｔｂｌａｓｔｎ）アルゴリズムを用いた（すなわち６個の読み枠で翻訳されたヌクレオチドデータベースに対するタンパク質クエリー検索）。ユニファイド・ヒューマン・トランスクリプト・データベースにおけるコンティグ（ＣＣ）配列は共通のドメインおよび発現配列タグ（ＥＳＴ）のＩｎｃｙｔｅ ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベース（インサイト・ファーマシューティカルズ・インコーポレーティッド、３１７４ポーター・ドライブ、パロ・アルト、カリフォルニア州９４３０４）（規定した配列相同性に基づいてクラスター化し、重複配列に基づいてアセンブルする）に由来する発現配列タグ（ＥＳＴ）ｃＤＮＡの群を代表するコンセンサス配列である。このデータベースからの２個の配列、ＣＣ０６７２８４Ｒ１およびＣＣ１４８４５４８Ｔ１は各々翻訳ＭＡＥＬＯ配列を有し、２４２個のアミノ酸重複において２８％の同一性、２６６個のアミノ酸重複において２８．６％の同一性を有した。２個の誘導および編集した配列を各々ｈｓ１およびｈｓ２と称し、ＧＣＧの配列分析ソフトウェアパッケージにコピーした（実施例Ｉを参照のこと）。ファストＡアルゴリズムを用いて翻訳ＭＡＥＬＯ配列を翻訳ＨＳ１（２４２個のアミノ酸において２８．５％の同一性）および翻訳ＨＳ２（２６６個のアミノ酸において２８．２％の同一性）ｃＤＮＡ配列と整列化し、各々図２９および３０に示した。ＨＳ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列はまた８４４塩基対においてＩ０５４６５ヌクレオチド配列と８６．９％の同一性を有した（実施例Ｖを参照のこと）。翻訳ＨＳ２ ｃＤＮＡ配列は受入番号：Ｗ７４８２４のジェンバンクからのアミノ酸配列と１００％の同一性を有した（公開ＰＣＴ出願ＷＯ９８３９４４８を参照のこと）。
ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いてＡＣ００４０５０（ＴファストＡ検索で同定されたヒト配列、実施例Ｖを参照のこと）から翻訳された２８個のアミノ酸配列（ＤＴＩＦＩＩＬＲＫＱＫＬＩＦＬＨＷＹＨＨＩＴＶＬＬＹＳＷ）を有するツブラストンを用いるデータベース検索を行った。このアミノ酸配列はヒスチジンボックス（下線部）を含み、これはデサチュラーゼ（Ｋｎｕｔｚｏｎら、前記で引用）並びにＭＡＥＬＯおよびＧＬＥＬＯの両方のＰＵＦＡエロンガーゼの注目すべきモチーフを有する（図２８を参照のこと）。実施例Ｖにおいて前記した翻訳マウス配列（ジェンバンク受入番号：Ｕ９７１０７）および翻訳シー・エレガンス配列（ジェンバンク受入番号：Ｕ４１０１１）はこの２８個のアミノ酸クエリーと高度に適合する。翻訳Ｕ４１０１１をクエリーとして用いてＮＣＢＩマウスＥＳＴデータベースを再度ツブラストンで検索した。さらなるマウス配列を同定し（ジェンバンク受入番号：ＡＦ０１４０３３．１）、「脂肪酸伸長における関与が推定される」と注釈した。マウスＥＳＴデータベースを翻訳ＡＦ０１４０３３．１でツブラストン検索することによりこれらの長い配列（ジェンバンク受入番号：ＡＡ５９１０３４、ＡＡ１８９５４９、およびＡＡ８３９３４６）を同定し、ｍｍ２と称する１個の配列と組み合わせた。翻訳ｍｍ２およびＭＡＥＬＯのファストＡ整列化（実施例Ｉを参照のこと）を図３１に示す。関連するが同一ではない別のマウス配列（ジェンバンク受入番号：ＡＩ２２５６３２）をもＡＦ０１４０３３．１でマウスＥＳＴデータベースのツブラストン検索において同定した。ＭＡＥＬＯに対する翻訳ＡＩ２２５６３２のファストＡ整列化を図３２に示す。翻訳ＭＭ２およびＡＩ２２５６３２の両方の翻訳ＭＡＥＬＯとの同一性パーセントは各々１９１個および１１５個のアミノ酸重複において３０．４％である。これらの２個の翻訳マウス配列と翻訳ＭＡＥＬＯとのアミノ酸同一性のレベルより、これらがＰＵＦＡエロンガーゼの推定相同体であることが確認される。
実施例ＸＩＶ
哺乳動物におけるＭ．アルピナＧＬＥＬＯ相同体の同定
クエリーとして翻訳ＧＬＥＬＯを用いて、タンパク質配列を６個の読み枠の各々において翻訳されているデータベースＤＮＡ配列と比較するＴファストＡアルゴリズムを使用した。ＧＣＧのジーンＥＭＢＬデータベースを用いて、翻訳ＧＬＥＬＯに対するアミノ酸類似性に基づいて別の潜在するエロンガーゼ配列を同定した。３個のヒト配列がＧＬＥＬＯアミノ酸配列に適合することが解った。これらの配列はジェンバンク受入番号：１）ＡＩ８１５９６０、２）ＡＬ０３４３７４および３）ＡＣ００４０５０を有する。ＡＩ８１５９６０、ホモ・サピエンＥＳＴ配列は１４４個のアミノ酸重複において翻訳ＧＬＥＬＯと４０．３％の同一性を有する（図３３を参照のこと）。ヒトゲノムの翻訳領域、ＡＬ０３４３７４は染色体ＶＩに由来し、６０個のアミノ酸重複において翻訳ＧＬＥＬＯと４６．７％の同一性を有する（図３３を参照のこと）。ＡＬ０３４３７４における相同領域は翻訳ＭＡＥＬＯと相同性を有することが示されているＨＳ１アミノ酸配列の一部であると考えられる（実施例ＸＩＩＩを参照のこと）。従って、ＨＳ１配列はＭＡＥＬＯ（図２９を参照のこと）とＧＬＥＬＯ（図３４を参照のこと）の両方と類似性を有する。染色体ＩＶに由来するヒトゲノム配列ＡＣ００４０５０の翻訳領域は８９個のアミノ酸重複において翻訳ＧＬＥＬＯと３４．８％の同一性を有する（図３５を参照のこと）。ＧＬＥＬＯとこれらのヒト配列間のアミノ酸同一性により、これらのヒト配列に由来するタンパク質がＰＵＦＡエロンガーゼ活性のような機能と関連し得ることが示される。
ＧＬＥＬＯに類似するマウスｃＤＮＡを同定するために、翻訳ＧＬＥＬＯをクエリーとして用い、ジーンＥＭＢＬでＴファストＡ検索を実施した。ＴファストＡ検索により翻訳ＧＬＥＬＯに高度に適合する３個のマウス配列を同定した：（ジェンバンク受入番号：１）ＡＦ１０４０３３、２）ＡＩ５９５２５８および３）Ｕ９７１０７）。ＡＦ１０４０３３には「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）に相同である推定脂肪酸エロンガーゼを有するＭＵＥＬタンパク質」と注釈し、これはＭＭ２の配列の一部である。ＭＭ２配列は最初ＡＦ１０４０３３マウス配列から誘導したが、最終的にはさらなるマウスＥＳＴデータベース検索により全ＭＭ２配列を得、これもまた翻訳ＭＡＥＬＯと相同であることが示された（実施例ＸＩＩＩおよび図３１を参照のこと）。ファストＡを用いてこのＭＭ２アミノ酸配列を翻訳ＧＬＥＬＯ配列と整列化した場合、２１１個のアミノ酸重複において３４．６％の同一性が見出され（図３６を参照のこと）、このことはＭＭ２もまたＧＬＥＬＯと相同であることを示している。ＡＩ５９５２５８は酵母ＥＬＯ３エロンガーゼと５’類似性を有するマウスｃＤＮＡクローンであり、マウスＥＳＴ ｃＤＮＡ ＡＩ２２５６３２の一部である。ＡＩ２２５６３２マウス配列はＡＩ５９５２５８よりも長い配列であり、翻訳ＭＡＥＬＯと類似性を有することが示された（図３２を参照のこと）。ＡＩ２２５６３２をまた翻訳ＧＬＥＬＯとも整列化し、ファストＡアルゴリズムを図３７に示す。１９９個のアミノ酸重複において３５．３％の同一性が見出された。第３の配列、Ｕ９７１０７はマウス配列であり、「酵母ＥＬＯ３（ＳＵＲ４）遺伝子に類似する」と注釈されている。翻訳ＧＬＥＬＯのＵ９７１０７との整列化を図３８に示すが、ここでは２７９個のアミノ酸重複において２３．７％の同一性が見出された。前記するように、ファストＡ整列化に基づいてＵ９７１０７の領域はまたＭＡＥＬＯと高度な相同性を有することも見出された（実施例Ｖおよび図１６を参照のこと）。
前記の検索により、クエリーとしてＭＡＥＬＯまたはＧＬＥＬＯのいずれかを用いて同一のヒトおよびマウス配列が得られることが明白に示された。
実施例ＸＶ
別のＰＵＦＡ生成生物におけるＭ．アルピナＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯ相同体の同定
Ａ）カエノルハブディティス・エレガンス
シー・エレガンスの染色体配列から推測される推定アミノ酸配列（ジェンバンク受入番号：Ｕ４１０１１）は、ＧＬＡエロンガーゼ（ＧＬＥＬＯ）およびＭ．アルピナエロンガーゼ（ＭＡＥＬＯ）の両方とアミノ酸類似性を有するマウスＭＭ２推定ＰＵＦＡエロンガーゼに含まれる部分配列を同定できる。従ってＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯのシー・エレガンス相同体が線虫データベースに存在するかもしれないと考えられる。ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯ配列に由来する推定アミノ酸配列をクエリーとして用いて別個に線虫データベースを検索した。ＢＬＡＳＴ検索（実施例ＸＩＩＩを参照のこと）をウォームペップ１６（ブラストプ（ｂｌａｓｔｐ）はヌクレオチド配列データベースに対してアミノ酸クエリー配列を比較する）およびウォームペップ１６ｃＤＮＡ（ツブラストン）データベース（これはシー・エレガンスゲノムシクエンシングプロジェクトまたはＥＳＴおよびその対応するｃＤＮＡ配列から得られるタンパク質およびｃＤＮＡを予測する）で実施した。これらの配列データはシー・エレガンスシークエンシング群により作られ、サンガー・センターおよびゲノム・シークエンシング・センターにより統合され、ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｗｏｒｍｐｅｐ／より入手できる。少なくとも７個の推定シー・エレガンス翻訳ハイブリダイゼーションをＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯの両方の翻訳アミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列により同定した。推定アミノ酸を含有するこれらのゲノム配列のジェンバンク受入番号はＺ１９１５４、Ｕ６８７４９（２個の推定タンパク質（Ｆ５６Ｈ１１．４およびＦ５６Ｈ１１．３（ウォームペップ受入番号）））、Ｕ４１０１１、Ｕ６１９５４（２個の推定タンパク質（Ｆ４１Ｈ１０．７およびＦ４１Ｈ１０．８（ウォームペップ受入番号）））およびＺ８１０５８であると同定された。これらの下線部分は翻訳ＭＡＥＬＯをクエリーとして用いる前記の検索において同定された（実施例Ｖを参照のこと）。実例として、翻訳ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯを有する翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）のファストＡアミノ酸整列化を図３９および４０に示す。翻訳Ｕ６８７４９（Ｆ５６Ｈ１１．４）は約２００個のアミノ酸重複においてＭ．アルピナエロンガーゼおよびＧＬＡエロンガーゼの両方と２５ないし３０％の同一性を有する(図３９、４０を参照のこと)。７個の翻訳推定シー・エレガンスｃＤＮＡの全てに関して、翻訳ＧＬＥＬＯに対するファストＡ整列化により２００個のアミノ酸重複で同一性が２５ないし３０％であり、一方翻訳ＭＡＥＬＯに関しては同一性は少なくとも１８８個のアミノ酸重複において２６ないし３４％であった。整列化の類似性により翻訳ＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯのいずれかを用いてエロンガーゼ活性を有するシー・エレガンス由来の潜在遺伝子を同定できる。
Ｂ）ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）
ＮＣＢＩ（実施例ＸＩＩＩを参照のこと）による「その他のＥＳＴ」データベースのブラストン検索（ヌクレオチドデータベースに対してヌクレオチドクエリー配列を比較する）において、ゲノム配列Ｕ４１０１１（シー・エレガンス）の翻訳推定ｃＤＮＡはドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＥＳＴ（受入番号：ＡＩ１３４１７３）と高度に適合し、重複ＤＮＡ ＥＳＴフラグメント（受入番号：ＡＩ５１７２５５）と共にアセンブルした。ＧＣＧのファストＡを用いて２個の重複配列に由来する翻訳ＤＮＡフラグメントＤＭ１を翻訳ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯ（図４１および４２を参照のこと）と整列化した（実施例Ｉを参照のこと）。整列化により２０６個のアミノ酸重複においてＧＬＡエロンガーゼと２７．２％の同一性が示され、２３７個のアミノ酸重複においてＭ．アルピナエロンガーゼと３０％の同一性が示された。このように、アミノ酸類似性に基づいて、ＤＭ１をＰＵＦＡエロンガーゼ様活性を有するＧＬＥＬＯまたはＭＡＥＬＯに対する潜在相同体であり得る。さらに、データベース検索のためのクエリーとしてＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯのＤＮＡ配列を用いて、ドロソフィラからＰＵＦＡエロンガーゼ活性を有する相同体を同定できる。
実施例ＸＶＩ
ヒトＰＵＦＡエロンガーゼ相同体のクローニングおよび発現
翻訳ＧＬＥＬＯおよび／またはＭＡＥＬＯに対するアミノ酸類似性に基づいて、多くの潜在ＰＵＦＡエロンガーゼを同定した。これらの配列の潜在エロンガーゼ活性を決定するために、次いで、本実施例で示すように、タンパク質全長をコードするｃＤＮＡを同定し、クローン化し、発現した。
推定ＨＳ１配列に基づいてプライマーＲＯ７１９（５’−ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＧＡＡ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＣ−３’）およびＲＯ７２０（５’−ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＣＣＧ−３’）を設計し、これを用いてヒト肝臓マラソン・レディーｃＤＮＡ（クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州）を増幅した。ヒト肝臓マラソン・レディーｃＤＮＡ ５μｌ、各プライマー５０ピコモル、１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチドミックス（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）１μｌ、１０Ｘ バッファー５μｌおよびアドバンテージ・クレンＴａｑ・ポリメラーゼ・ミックス（クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州）を含有する５０μｌ容量で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。パーキン・エルマー９６００（ノーウォーク、コネチカット州）の熱循環器条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間、次いで９４℃、１分間を３０サイクル、５８℃で２分間、および７２℃で３分間。続いてさらに７２℃で７分間ＰＣＲのサイクルを延長した。
ＰＣＲ増幅生成物をゲルに流し、約９６０塩基対の増幅フラグメントがゲル精製され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）でフラグメントの末端を埋め、製造者プロトコルに従ってｐＣＲブラントベクター（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）にクローン化した。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５２と称し、ＡＢＩ ３７３ＡストレッチＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州）を用いて、このクローンにおける推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡをシークエンシングした。プラスミドｐＲＡＥ−５２のこの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ配列を図４３に示し、翻訳配列を図４４に示す。
次いでプラスミドｐＲＡＥ−５２の推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡをＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、ｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）にライゲートした。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５８−Ａ１と称した。（ブダペスト条約の条件下、１９９９年８月１９日にプラスミド５８−Ａ１をアメリカン・タイプ・オブ・カルチャー・コレクション、１０８０１ボウルバード大学、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託し、寄託番号 が付与された。）
構築物ｐＲＡＥ−５８−Ａ１をビール酵母菌３３４（Ｈｏｖｅｌａｎｄら、前記で引用）に形質転換し、エロンガーゼ活性に関してスクリーニングした。陰性対照株はｐＹＸ２４２ベクターを含有するビール酵母菌であった。２５μＭ ＧＬＡまたはＡＡ存在下、選択培地（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記で引用）で培養物を３０℃で２４時間成長させた。この研究においてＤＧＬＡまたはアドレン酸（ＡＤＡ、２２：４ｎ−６）は各々ヒトエロンガーゼ活性の生成が予測されている。基質としてＧＬＡを用いた場合、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞に含まれるＤＧＬＡレベルは上昇しており、対照細胞と比較すると各々全脂肪酸の２．７５％対０．０９％であった（図４５を参照のこと）。基質としてＡＡを用いた場合、、ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞に含まれるＡＤＡレベルは対照細胞と比較して上昇しており、各々全脂肪酸の未検出対１．２１％であった。このように、ヒトエロンガーゼは１８および２０炭素鎖長のＰＵＦＡを共にその各々の伸長脂肪酸に変換する。
ヒトエロンガーゼｃＤＮＡを含有する酵母細胞はまた対照株に比較して１８：１ｎ−７、２０：１ｎ−７、２０：１ｎ−９および１８：１ｎ−５などのモノ不飽和脂肪酸のレベルをも上昇させた。従って、これらの結果より同定されたヒトエロンガーゼはＰＵＦＡおよびモノ不飽和脂肪酸を基質として利用できることが示された。このように、このヒト配列ＨＳＥＬＯ１、およびそれにコードされるタンパク質は基質特異性とは独立してエロンガーゼ活性を有する。
実施例ＸＶＩＩ
シー・エレガンスＰＵＦＡエロンガーゼのクローニングおよび発現
いくつかの推定シー・エレガンスエロンガーゼで、翻訳ＧＬＥＬＯおよびＭＡＥＬＯの両方に対してアミノ酸相同性が確立されている。ヒトｃＤＮＡ配列を有するので、ｃＤＮＡクローニングおよび酵母における発現により、これが本当にＰＵＦＡエロンガーゼであるかどうかを決定した。制限部位ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（下線部）を有するプライマーＲＯ７３８（５’−ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＴＴ ＣＡＡ Ｃ−３’）およびＲＯ７３９（５’−ＣＣＧ ＣＴＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＧＧ ＣＡＣ−３’）は各々、ゲノム配列Ｕ６８７４９（ウォームペップｃＤＮＡ受入番号：Ｆ５６Ｈ１１．４）に含まれる推定ｃＤＮＡ配列に基づいた。切除シー・エレガンスライブラリーｃＤＮＡ（オリジーン・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、ロックビル、メリーランド州）２５０ｎｇ、各プライマー５０ピコモル、１０Ｘ反応バッファー（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）１０μｌ、１０ｍＭ ＰＣＲヌクレオチドミックス１μｌ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）およびＴａｑポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）２．５ユニットを含有する１００μｌ容量でＰＣＲ増幅を行った。パーキン・エルマー９６００（ノーウォーク、コネチカット州）の熱循環器条件は以下のとおりであった：９５℃で５分間、次いで９４℃、３０秒間を２５サイクル、５５℃で２分間、および７２℃で２分間。続いてさらに７２℃で７分間ＰＣＲのサイクルを延長した。
ＰＣＲ増幅生成物をアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、製造者プロトコルに従ってラピッド・ライゲーション・キット（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ州）を用いてｐＹＸ２４２にライゲートし、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）に形質転換した。新規プラスミドをｐＲＥＴ−２１およびｐＲＥＴ−２２（ライゲーションによる２個の個々のクローン）と称し、３７３ＡストレッチＤＮＡシークエンサーＡＢＩ（パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州）でシークエンシングし、ｃＤＮＡ配列を同定した。推定エロンガーゼを含有するプラスミドｐＲＥＴ−２２の８６７個の塩基のｃＤＮＡヌクレオチド配列を図４６に示し、２８８個のアミノ酸の翻訳配列を図４７に示す。（ブダペスト条約の条件下、１９９９年８月１９日にプラスミドｐＲＥＴ−２２をアメリカン・タイプ・オブ・カルチャー・コレクション、１０８０１ボウルバード大学、マナサス、バージニア州２０１１０−２２０９に寄託し、寄託番号 が付与された。）
前記するようにプラスミドｐＲＥＴ−２１および−２２をビール酵母菌３３４に形質転換し（実施例ＩＩＩを参照のこと）、得られた酵母培養物（３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２））を５０μＭ ＧＬＡおよびＡＡの存在下、ロイシン不含の選択培地１００ｍｌ中（Ａｕｓｕｂｅｌら、前記で引用）２０℃で４８時間成長させた。細胞ペレットを収集し、脂肪酸分析に供し、結果を図４８に示す。ＧＬＡの伸長により生成されると予測されるＤＧＬＡが２個のサンプルにおいて全脂質の平均１．７９％見出され、これに対して陰性対照（プラスミドｐＹＸ２４２を含有する３３４）では０．１３％であり、このことはｐＲＥＴ−２１およびｐＲＥＴ−２２の両方によりコードされる酵素がＧＬＡエロンガーゼ活性を有していることが示された。３３４（ｐＲＥＴ−２１）および３３４（ｐＲＥＴ−２２）によるＧＬＡのＤＧＬＡへの変換パーセントは各々１１．１％および１９．４％であり、平均１５．２５％であった。興味深いことに、ＡＡまたは外因性の脂肪酸はほとんど全く伸長が観察されなかった（図４８）。これらの結果によりこの新規に同定されたシー・エレガンスｃＤＮＡ、ＣＥＥＬＯ１によりコードされるエロンガーゼはＧＬＡをＤＧＬＡに特異的に伸長でき、このことにより、これがＧＬＡエロンガーゼのシー・エレガンス相同体であり得ることが示唆される。
実施例ＶＩＩＩ
ＡＣ００４０５０に基づく推定ヒトエロンガーゼｃＤＮＡの単離
ＡＣ００４０５０配列に基づいて推定エロンガーゼｃＤＮＡの全長を単離するために、プライマーＲＰ７３５（５’−ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＡＱＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＴＣ−３’）およびＲＯ７３（５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ−３’）を用いてヒト肝臓マラソン・レディーｃＤＮＡ（クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州）をＰＣＲ増幅した。製造者のプロトコルに従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標） ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド、パロ・アルト、カリフォルニア州）を用いて、ヒト肝臓マラソン・レディーｃＤＮＡ５μｌおよび各プライマー５０ピコモルでＰＣＲを実施した。パーキン・エルマー９６００（ノーウォーク、コネチカット州）の熱循環器条件は以下のとおりであった：９４℃で２分間、次いで９４℃、１分間を３０サイクル、５８℃で２分間、および７２℃で３分間。続いてさらに７２℃で７分間ＰＣＲのサイクルを延長した。
ＰＣＲ増幅生成物をゲルに流し、約１キロ塩基対の増幅フラグメントをゲル精製し、製造者の指示書に従って、フラグメントの末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）で埋めた。新規プラスミドをｐＲＡＥ−５９と称し、このプラスミドの推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡをＨＳ３と称し、ＡＢＩ ３７３Ａストレッチ・シークエンサー（パーキン・エルマー、フォスター・シティー、カリフォルニア州）を用いてシークエンシングした。推定ＰＵＦＡエロンガーゼｃＤＮＡ配列ＨＳ３を図４９に示し、翻訳配列を図５０に示す。
栄養組成物
発明の詳細な説明に記載のＰＵＦＡを、種々の栄養補助剤、乳児用粉乳、栄養代替剤、および他の栄養溶液に利用することができる。
Ｉ．特殊調製粉乳
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）（鉄を含むダイズ製剤）：
用途：牛乳に対してアレルギーまたは感受性を示す乳児、小児、および成人用の飲料。ラクトースを避けるべき疾患（ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症、およびガラクトース血症）の患者に与えるため。
特徴：
−牛乳タンパク質のアレルギーまたは過敏症の症状を予防するためのダイズタンパク質単離物。
−ラクトース関連の下痢を予防するための無ラクトース処方物。
−浸透性下痢のリスクを減少させるための低浸透性（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）。
−炭水化物吸収を促進し、損傷した腸の過剰な吸収のリスクを減少させるように設計された２種の炭水化物（ｄｕａｌ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ）。
−鉄欠乏症の予防を補助するための１００カロリーあたり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
−推奨レベルのビタミンおよびミネラル。
−推奨レベルの必須脂肪酸を得るための植物油。
−乳白色、ミルク様濃度、および好ましい香り。
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）８５％水、４．９％コーンシロップ、２．６％糖（スクロース）、２．１％ダイズ油、１．９％ダイズタンパク質単離物、１．４％ココナッツ油、０．１５％クエン酸カルシウム、０．１１％三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、二塩基性リン酸カリウム、塩化カルシウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ（下痢用ダイズ処方物）。
用途：乳児および幼児の食事管理用の短期摂食
特徴：特に下痢管理用のダイズ繊維由来の添加食物繊維を含む最初の乳児の処方物。
−乳児の軽症または重症の下痢による軟らかい、水様便の持続期間を減少させることが臨床的に示されている。
−乳児の栄養必要量を栄養的に完全に満たす。
−乳児の全必須アミノ酸必要量を満たすか超える添加Ｌ−メチオニンを含むダイズタンパク単離物。
−ラクトース関連の下痢を予防する無ラクトース処方物。
−浸透圧性下痢のリスクを減少させる低浸透性（２４０ ｍＯｓｍ／ｋｇ水）。
−炭水化物吸収を促進し、損傷した腸の過剰な吸収のリスクを減少させるように設計された２種の炭水化物。
−Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｉｙ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓに推奨され、Ｉｎｆａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａ Ａｃｔで必要とされるビタミンおよびミネラルレベルを満たすか超えている。
−鉄欠乏症の予防を補助するための１００カロリーあたり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
−推奨レベルの必須脂肪酸を得るための植物油。
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）８６％水、４．８％コーンシロップ、２．５％糖（スクロース）、２．１％ダイズ油、２．０％ダイズタンパク質単離物、１．４％ココナッツ油、０．７７％ダイズ食物繊維、０．１２％クエン酸カルシウム、０．１１％三塩基性リン酸カルシウム、０．１％クエン酸カリウム、塩化カリウム、塩基性リン酸カリウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、二塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦ（鉄を含む無スクロースダイズ製剤）
用途：牛乳タンパク質に対してアレルギーまたは感受性を示すかスクロース不耐の乳児、小児、および成人用の飲料。ラクトースおよびスクロースを避けるべき疾患の患者に与えるため。
特徴：
−牛乳タンパク質のアレルギーまたは過敏症の症状を予防するためのダイズタンパク質単離物。
−ラクトース関連の下痢を予防するための無ラクトース処方物（炭水化物源は、Ｐｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒである）。
−スクロース不耐患者用にスクロースを含まない。
−浸透圧性下痢のリスクを減少させる低浸透性（１８０ ｍＯｓｍ／ｋｇ水）。
−鉄欠乏症の予防を補助するための１００カロリーあたり１．８ｍｇの鉄（硫酸第一鉄として）。
−推奨レベルのビタミンおよびミネラル。
−推奨レベルの必須脂肪酸を得るための植物油。
−乳白色、ミルク様濃度、および好ましい香り。
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）７５％水、１１．８％加水分解コーンスターチ、４．１％ダイズ油、４．１％ダイズタンパク質単離物、２．８％ココナッツ油、１．０％改変コーンスターチ、４．９％コーンシロップ、０．３８％三塩基性リン酸カルシウム、０．１７％クエン酸カリウム、０．１３％塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０（調製済みの鉄を含むダイズ処方物（２０Ｃａｌ／オンス））
用途：ダイズ食が望ましい場合。
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）８５％水、４．９％コーンシロップ、２．６％糖（スクロース）、２．１％ダイズ油、１．９％ダイズタンパク質単離物、１．４％ココナッツ油、０．１５％クエン酸カルシウム、０．１１％三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩基性リン酸カリウム、塩化カリウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、二塩基性リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）（乳児用処方物）
用途：乳児用処方物が必要な場合。１歳未満の乳児に母乳栄養を継続できないと診断された場合、母乳栄養の補助食品が必要な場合、または母乳栄養不適用の場合の日常の摂食。
特徴：
−ミルク関連腸出血のリスクを減少させる、良好な成長に適切な質および量の熱変性タンパク質。
−容易に吸収される必須リノール酸が得られる植物油の混合物（２種類を均質化）由来の脂肪。
−人乳と類似の比率のラクトースとしての炭水化物。
−器官の発達に対するストレスを最小にするための低腎臓溶質負荷。
−粉末、濃縮液、または調製済み処方物。
成分：（Ｐａｒｅｖｅ）蒸留水、脱脂乳、ラクトース、ダイズ油、ココナッツ油、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ（鉄を含む未熟乳児用処方物）
用途：退院後の未熟幼児の特別に栄養を必要とする場合。Ｓｉｍｉｌａｃ ＮｅｏＣａｒｅは、成長の遅れを取り戻すのを促進し、発達を支持するために必要な付加的なカロリー、タンパク質、ビタミン、およびミネラルを未熟児が得られるように開発された栄養的に完全な処方物である。
特徴：
−カロリーおよびビタミン補助の必要性を減少させる。標準期間の処方物（２０ Ｃａｌ／オンス）よりカロリーが高い（２２ Ｃａｌ／オンス）。
−未熟児の消化を特別に補助する中鎖トリグリセリド（ＭＣＴオイル）を含む、高吸収性脂肪酸混合物。
−病院で開始される栄養補助を拡張するための１００カロリーあたり高レベルのタンパク質、ビタミン、およびミネラルを含む。
−骨鉱化作用改良用のより大量のカルシウムおよびリンを含む。
成分：固体コーンシロップ、脱脂乳、ラクトース、ホエイタンパク濃縮物、ダイズ油、高オレイン酸ベニバナ油、分留ココナッツ油（中鎖トリグリセリド）、ココナッツ油、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−カルニチン、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、ビタミンＡパルミテート、β−カロテン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ（調製済み低鉄人乳強化剤（２４ Ｃａｌ／オンス））。
用途：人乳と混合するか低出生時体重の乳児に人乳と共にを与えるために設計されている。
成分：蒸留水、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、ラクトース、分留ココナッツ油（中鎖トリグリセリド）、ホエイタンパク質濃縮物、ダイズ油、ココナッツ油、三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノおよびジグリセリド、ダイズレシチン、カラゲナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、リボフラビン、ビタミンＡパルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、セレン酸ナトリウム、およびシアノコバラミン。
本発明の種々のＰＵＦＡを、上記の乳児用処方物および他の当業者に公知の乳児用処方物と置換するか添加することができる。
ＩＩ．栄養処方物
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥは、主に、適切な量を食事中または食間に使用する経口栄養補助剤または食事の代わりとして用いるように設計された低残渣流動食である。ＥＮＳＵＲＥは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低コレステロール食を含む加工食（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｉｅｔ）としての使用に適切である。主に経口補助剤であるが、チューブによって摂取させることができる。
患者の健康状態：
−加工食を摂取している患者。
−栄養危険性を有する高齢患者。
−無意識に体重減少している患者。
−疾患または手術から回復中の患者。
−低残渣食を必要とする患者。
成分：蒸留水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウムおよびカゼイン酸ナトリウム、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズタンパク質単離物、ダイズ油、カノーラ油、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、二塩基性リン酸マグネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、ダイズレシチン、コリンクロリド、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、Ｇｅｌｌａｎガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫化マンガン、硫酸銅、ビタミンＡパルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム。
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは、食間または食事中に使用される完全にバランスの取れた栄養素である。ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは、他のスナックより美味で、栄養豊富である。ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは、バーあたり１ｇ未満のラクトースを含み、チョコレート味のブラウニー風味は、グルテンを含まない（ハニーグラハムクランチ風味は、グルテンを含む）。
患者の健康状態：
−付加的にカロリー、タンパク質、ビタミン、およびミネラルを必要とする患者。
−十分なカロリーおよび栄養素を摂取できない患者に特に有用である。
−咀嚼および嚥下することができる患者。
−ビーナッツアレルギーまたは任意の型のナッツアレルギーを有する患者には使用しない。
成分：ハニーグラハムクランチ−−高フルクトースコーンシロップ、ダイズタンパク質、黒砂糖、ハチミツ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、Ｃｒｉｓｐ Ｒｉｃｅ（製粉したコメ、糖（スクロース）、塩（塩化ナトリウム）、および麦芽）、カラスムギのふすま、部分水素付加綿実油およびダイズ油、ダイズ多糖類、グリセリン、ホエイタンパク質濃縮物、ポリデキストリン、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、コカ粉末、人工香料、カノーラ油、高オレイン酸ベニバナ油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、ダイズレシチン、およびトウモロコシ油。ナッツを加工する施設で製造される。
ビタミンおよびミネラル：三塩基性リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カリウム、酸化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、酸化鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラン、β−カロテン、塩酸ピリドキシン、チアミン硝酸塩、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：ハニーグラハムクランチ−タンパク質供給源は、ダイズタンパク質単離物とミルクタンパク質との混合物である。
ダイズタンパク質単離物 ７４％
ミルクタンパク質 ２６％
脂肪：ハニーグラハムクランチ−脂肪供給源は、部分的水素付加綿実油、ダイズ油、カノーラ油、高オレイン酸ベニバナ油、およびダイズレシチンとの混合物である。
部分的水素付加綿実油およびダイズ油 ７６％
カノーラ油 ８％
高オレイン酸ベニバナ油 ８％
トウモロコシ油 ４％
ダイズレシチン ４％
炭水化物：ハニーグラハムクランチ−炭素供給源は、高フルクトースコーンシロップ、黒砂糖、マルトデキストリン、ハチミツ、クリスプライス（ｃｒｉｓｐ ｒｉｃｅ）、グリセリン、ダイズ多糖類、およびカラスムギふすまの組み合わせである。
高フルクトースコーンシロップ ２４％
黒砂糖 ２１％
マルトデキストリン １２％
ハチミツ １１％
ｃｒｉｓｐ ｒｉｃｅ ９％
グリセリン ９％
ダイズ多糖類 ７％
カラスムギふすま ７％
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、食事で付加的なカロリー、タンパク質、ビタミン、およびミネラルを必要とする患者用に設計された濃縮高タンパク質流動食である。これは、食事中もしくは食間の経口補助剤として、または適切な量を食事の代わりとして使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、無ラクトースおよび無グルテンであり、一般的な手術または臀部骨折から回復しつつある患者および圧迫潰瘍のリスクを負う患者への使用に適切である。
患者の健康状態：
−付加的なカロリー、タンパク質、ビタミン、およびミネラルを必要とする患者（一般的な手術または臀部骨折から回復しつつある患者および圧迫潰瘍のリスクを負う患者および低コレステロール食患者など）。
特徴：
−低飽和脂肪。
−１回の食事あたり全脂質の６ｇの脂質およびコレステロールの５ｍｇ未満を含む。
−コクがあり、軟らかい。
−タンパク質、カルシウム、ならびに他の必須ビタミンおよびミネラルの優れた供給源である。
−低コレステロール食用である。
−無ラクトースで容易に消化される。
成分：バニラシュープレーム：蒸留水、糖（スクロース）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウムおよびカゼイン酸ナトリウム、高オレイン酸ベニバナ油、ダイズタンパク質単離物、ダイズ油、カノーラ油、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、二塩基性リン酸マグネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、ダイズレシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、Ｇｅｌｌａｎガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：タンパク質供給源は、２つの生物学的に価値の高いタンパク質（カゼインおよびダイズ）の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム ８５％
タンパク質単離物 １５％
脂肪：脂肪供給源は、３つのオイル（高オレイン酸ベニバナ油、カノーラ油、およびダイズ油）の混合物である。
高オレイン酸ベニバナ油 ４０％
カノーラ油 ３０％
ダイズ油 ３０％
ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪レベルは、米国心臓病協会（ＡＨＡ）のガイドラインを満たす。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の６ｇの脂肪は、全カロリーの２４％を占め、そのうち２．６％の脂肪は飽和脂肪酸に由来し、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、ＡＨＡガイドライン（脂肪由来の全カロリーの３０％未満、飽和脂肪酸由来の１０％未満のカロリー、およびポリ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの１０％未満）の範囲内である。
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは、マルトデキストリンとスクロースとの組み合わせを含む。ほのかに甘い、種々の風味（バニラシュプリーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー、およびバナナ）ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
スクロース ６０％
マルトデキストリン ４０％
チョコレート：
スクロース ７０％
マルトデキストリン ３０％
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、食事中または食間に用いる経口栄養補助剤として使用するために設計された低脂肪流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低コレステロール食を含む加工食としての使用に適切である。
患者の健康状態：
−ＥＮＳＵＲＥより５０％低い脂肪および２０％低いカロリーを含む栄養補助食品中に付加的な栄養を必要とする正常な体重または超過体重の患者用。
−正確で必要な付加的栄養素を摂ることができない健常な成人。
特徴：
−低脂肪および低飽和脂肪
−１回の食事あたり３ｇの全脂肪および５ｍｇ未満のコレステロールを含む。
−コクがあり、軟らかい。
−カルシウムおよび他の必須ビタミンならびにミネラルの優れた供給源である。
−低コレステロール食である。
−無ラクトースであり、容易に消化される。
成分：フレンチバニラ：蒸留水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖（スクロース）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸ベニバナ油、カノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、二塩基性リン酸カリウム、二塩基性リン酸マグネシウム、天然香料および人工香料、三塩基性リン酸カルシウム、Ｇｅｌｌａｎガム、塩化コリン、ダイズレシチン、カラゲナン、塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：
タンパク質供給源は、カゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム １００％
脂肪：脂肪供給源は、２つのオイル（高オレイン酸ベニバナ油およびカノーラ油）の混合物である。
高オレイン酸ベニバナ油 ７０％
カノーラ油 ３０％
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の脂肪レベルは、米国心臓病協会（ＡＨＡ）のガイドラインを満たす。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の３ｇの脂肪は、全カロリーの１３．５％を占め、そのうち１．４％の脂肪は飽和脂肪酸に由来し、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、ＡＨＡガイドライン（脂肪由来の全カロリーの３０％未満、飽和脂肪酸由来の１０％未満のカロリー、およびポリ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの１０％未満）の範囲内である。
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは、マルトデキストリンとスクロースとの組み合わせを含む。チョコレート風味はコーンシロップなどを含む。ほのかに甘い種々の風味（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
スクロース ５１％
マルトデキストリン ４９％
チョコレート
スクロース ４７．０％
コーンシロップ ２６．５％
マルトデキストリン ２６．５％
ビタミンおよびミネラル：食事あたり８オンスのＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴで、２４種類の重要なビタミンおよびミネラルのＲＤＩの少なくとも２４％が得られる。
カフェイン：チョコレート香料には、８オンスあたり２．１ｍｇのカフェインを含む。
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、付加的なカロリーおよび栄養素が必要であるが、通常のタンパク質濃度が必要な場合の、高カロリーの低残渣流動食である。これは、主に、食事中または食間に使用する経口栄養補助食品としてまたは適切な量を食事の代わりとして使用するように設計されている。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、無ラクトースおよび無グルテンである。主に経口補助剤であるが、チューブによって摂取させることができる。
患者の健康状態：
−限られた体積で付加的なカロリーおよび栄養素が必要であるが、通常のタンパク質濃度が必要な患者。
−健常な体重に増加させるか維持することを必要とする患者。
特徴：
−コクがあり、軟らかい。
−必須ビタミンおよびミネラルの良好な供給源である。
成分：バニラ：蒸留水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、糖（スクロース）、ダイズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、ダイズレシチン、天然香料および人工香料、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン、およびビタミンＤ３。
タンパク質：タンパク質供給源は、２つの生物学的に価値の高いタンパク質（カゼインおよびダイズ）の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム ８４％
タンパク質単離物 １６％
脂肪：脂肪源はトウモロコシ油である。
トウモロコシ油 １００％
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは、マルトデキストリンとスクロースとの組み合わせである。ほのかに甘い、種々の風味（バニラ、チョコレート、ストロベリー、コーヒー、バターペカン、およびエッグノッグ）ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
バニラ、ストロベリー、バターペカン、およびコーヒー風味は以下を含む。
コーンシロップ ３９％
マルトデキストリン ３８％
スクロース ２３％
チョコレートおよびエッグノッグ風味は以下を含む。
コーンシロップ ３６％
マルトデキストリン ３４％
スクロース ３０％
ビタミンおよびミネラル：食事あたり８オンスのＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳで、２５種類の重要なビタミンおよびミネラルのＲＤＩの少なくとも１５％が得られる。
カフェイン：チョコレート香料には、８オンスあたり３．１ｍｇのカフェインを含む。コーヒー香料には微量のカフェインを含む。
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは、高カロリーおよび高タンパク質を必要とするか摂取体積が制限される患者用に設計された、栄養的に完全な高カロリーおよび高窒素流動食である。これは、経口での栄養補給またはチューブによる全栄養支持に有用であり得る。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは、無ラクトースおよび無グルテンである。
患者の健康状態：
−手術後または損傷後などのカロリーおよびタンパク質の増加が必要な患者。
−摂取体積が制限され、すぐに満腹になる患者。
特徴：
−補助または全栄養補給に使用される。
−経口またはチューブによる食物摂取用。
−１．５ ＣａＶｍＬ。
−高窒素。
−カロリー密度が高い。
成分：バニラ：蒸留水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、トウモロコシ油、糖（スクロース）、ダイズタンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、三塩基性リン酸カルシウム、ダイズレシチン、天然香料および人工香料、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸銅、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン、およびビタミンＤ３。
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲ（水で再生される）は、主に、食事中または食間に使用される経口栄養補助剤として設計された低残渣流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低カロリー食を含む加工食としての使用に適切である。
患者の健康状態：
−加工食を摂取している患者。
−栄養危険性を有する高齢患者。
−疾患／手術から回復中の患者。
−低残渣食を必要とする患者。
特徴：
−便利で混合が容易。
−低飽和脂肪。
−１回の食事あたり９ｇの全脂肪および５ｍｇ未満のコレステロールを含む。
−高ビタミンおよびミネラル。
−低コレステロール食。
−無ラクトースで消化しやすい。
成分：蒸留水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖（スクロース）、トウモロコシ油、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、ダイズタンパク質単離物、人工香料、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、三塩基性リン酸カルシウム、塩化カリウム、ダイズレシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、チアミンクロリド塩酸塩、硫酸銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：タンパク質供給源は、２つの生物学的に価値の高いタンパク質（カゼインおよびダイズ）である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム ８４％
タンパク質単離物 １６％
脂肪：脂肪供給源はトウモロコシ油である。
トウモロコシ油 １００％
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲは、コーンシロップ、マルトデキストリンとスクロースとの組み合わせである。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲのほのかに甘さならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
バニラ：
コーンシロップ ３５％
マルトデキストリン ３５％
スクロース ３０％
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、食事中および食間に使用される非液体形態のバランスのとれた栄養素を得るための栄養密度の高い補助食品である。これは、継続的な加工食（たとえば、軟らかい、ピューレ状、または完全な液体）を摂取している患者および嚥下障害患者に適切である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、無グルテンである。
患者の健康状態：
−継続的な加工食（例えば、軟らかい、ピューレ状、または完全な液体）を摂取している患者。
−嚥下障害患者。
特徴：
−コクがあり、軟らかく、味がよい。
−必須ビタミン、およびミネラルの良好な供給源である。
−冷蔵不要で便利。
−無グルテン。
５オンスあたりの栄養プロフィールは、２５０カロリー、タンパク質１０．９％、全脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％である。
成分：脱脂乳、水、糖（スクロース）、部分的に水素負荷したダイズ油、加工食品デンプン、硫酸マグネシウム、ステアロイルラクチリン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、人工香料、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、塩酸コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃５、クエン酸カリウム、硫酸銅、ビタミンＡパルミテート、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：タンパク質供給源は、脱脂乳である。
脱脂乳 １００％
脂肪：脂肪供給源は、水素付加ダイズ油である。
水素付加ダイズ油 １００％
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは、スクロースと加工食品デンプンの組み合わせである。ほのかな甘さおよび多種の風味（バニラ、チョコレート、バタースカッチ、およびタピオカ）は、風味に関する不快感を避ける一助となる。製品には、１回の食事あたり９．２グラムのラクトースを含む。
バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
スクロース ５６％
ラクトース ２７％
加工食品デンプン １７％
チョコレート：
スクロース ５８％
ラクトース ２６％
加工食品デンプン １６％
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ。
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、食物繊維および栄養素を強化することに利点を有し得る患者用に設計された、食物繊維を含む栄養的に完全な流動食である。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、低残渣食を必要としない患者に適切である。これは、経口およびチューブによって摂取させることができ、通常の食事の栄養補助剤として、または適切な量を食事の代わりとして与えることができる。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、無ラクトースおよび無グルテンであり、低コレステロール食を含む加工食としての使用に適切である。
患者の健康状態：
−食物繊維および栄養素を強化することに利点を有しうる患者用。
特徴：
−低飽和脂肪酸、高ビタミンおよび高ミネラルの新規の進歩した処方物。
−１回の食事あたり６ｇの全脂肪および５ｍｇ未満のコレステロールを含む。
−コクがあり、軟らかい。
−良好な繊維の供給源。
−必須ビタミンおよびミネラルの優れた供給源。
−低コレステロール食。
−ラクトースおよびグルテンを含まない。
成分：蒸留水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖（スクロース）、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム、カラスムギ繊維、高オレイン酸ベニバナ油、カノーラ油、ダイズタンパク質単離物、トウモロコシ油、ダイズ繊維、三塩基性リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、ダイズレシチン、二塩基性リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然および人工香料、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、α−酢酸トコフェロール、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸銅、パルミチン酸ビタミンＡ、チアミンクロリド塩酸塩、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３、およびシアノコバラミン。
タンパク質：タンパク質供給源は、２つの生物学的に価値の高いタンパク質（カゼインおよびダイズ）の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カルシウム ８０％
タンパク質単離物 ２０％
脂肪：脂肪供給源は、３つのオイル（高オレイン酸ベニバナ油、カノーラ油、およびダイズ油）の混合物である。
高オレイン酸ベニバナ油 ４０％
カノーラ油 ４０％
ダイズ油 ２０％
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の脂肪レベルは、米国心臓病協会（ＡＨＡ）のガイドラインを満たす。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の６ｇの脂肪は、全カロリーの２２％を占め、そのうち２．０１％の脂肪は飽和脂肪酸に由来し、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は、ＡＨＡガイドライン（脂肪由来の全カロリーの３０％以下、飽和脂肪酸由来の１０％以下のカロリー、およびポリ不飽和脂肪酸由来の全カロリーの１０％以下）の範囲内である。
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは、マルトデキストリンとスクロースとの組み合わせを含む。ほのかに甘く、種々の風味（バニラ、チョコレート、およびバターペカン）ならびにペカン、チェリー、ストロベリー、レモン、およびオレンジの香りのＶＡＲＩ−ＦＬＡＶＯＲＳ（登録商標）Ｆｌａｖｏｒ Ｐａｃｓは、風味に関する不快感を避ける一助となり、患者の服薬遵守の援助となる。
バニラおよび他のチョコレート以外の風味は以下である。
マルトデキストリン ６６％
スクロース ２５％
カラスムギ繊維 ７％
ダイズ繊維 ２％
チョコレート
マルトデキストリン ５５％
スクロース ３６％
カラスムギ繊維 ７％
ダイズ繊維 ２％
繊維：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲで使用される繊維混合物は、カラスムギ繊維およびダイズ繊維からなる。この混合物により、８オンス缶あたり全食物繊維の約４グラムが得られる。不溶性繊維：可溶性繊維は９５：５である。
上記および当業者に公知の種々の栄養補助剤を、本発明で作製したＰＵＦＡと置換および／または補充することができる。
Ｊ．ＯｘｅｐａＴＭ栄養製品。
Ｏｘｅｐａは、ＡＲＤＳ患者またはその疑いのある患者の食事管理用に設計された、低炭水化物でカロリー密度が高い経腸栄養製品である。これは、エイコサペンタエン酸（魚油由来のＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリヂサ油由来のＧＬＡ）を含み、抗酸化レベルを高めた特許油混合物を含む固有の成分の組み合わせである。
カロリー分布：
エネルギーの必要量を満たすために必要な体積を最小にするために、カロリー密度は高い（１．５ Ｃａｌ／ｍＬ（３５５ Ｃａｌ／８オンス））。
Figure 0005657406
脂肪：
−Ｏｘｅｐａは、８オンスの食事（９３．７ｇ／Ｌ）あたり２２．２ｇの脂肪を含む。
−脂肪供給源は、３１．８％カノーラ油、２５％中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）、２０％ルリヂサ油、２０％魚油、および３．２％ダイズレシチンとのオイル混合物である。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィールを、表Ｖに示す。
−表ＶＩに示すように、Ｏｘｅｐａによれば、バランスの取れた量のポリ不飽和脂肪酸、一不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸が得られる。
−中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）（脂肪混合物の２５％）は、胆汁酸によって乳化されることなく腸管によって吸収されるので、胃排出の一助となる。
ＯｘｅｐａＴＭ栄養製品の種々の脂肪酸構成成分を、本発明で作製したＰＵＦＡと置換および／または補充することができる。
Figure 0005657406
 脂肪酸は、全脂肪の約９５％に相当する。
Figure 0005657406
炭水化物：
−炭水化物含有量は、８オンス（１０５．５ｇ／Ｌ）の１回の食事あたり２５．０ｇである。
−炭水化物供給源は、４５％マルトデキストリン（炭水化物複合体）および５５％スクロース（単糖類）であり、これらは共に容易に消化吸収される。
−Ｏｘｅｐａの高脂肪および低炭水化物成分を、二酸化炭素（ＣＯ２）生成が最小になるように設計する。高ＣＯ２レベルは、人工呼吸器に依存している患者の離乳を複雑にし得る。低レベルの炭水化物はまた、ストレス誘導性高血糖症患者に有用であり得る。
−Ｏｘｅｐａは、無ラクトースである。
食物炭水化物、タンパク質由来のアミノ酸、および脂肪のグリセロール部分を、体内のグルコースと変換することができる。この過程の間中、グルコース依存性組織（中枢神経系および赤血球など）の炭水化物要求が満たされる。しかし、炭水化物を含まない食事は、ケトーシス、組織タンパク質の過剰な異化、および体液および電解質の欠乏を誘導し得る。これらの効果を、カロリー摂取が適切である場合、５０ｇから００ｇの消化しやすい炭水化物の毎日の注射によって予防することができる。Ｏｘｅｐａ中の炭水化物レベルはまた、エネルギー要求が満たされる場合、糖新生を最小にするのに十分である。
タンパク質：
−Ｏｘｅｐａは、８オンスの１回の食事（６２．５ｇ／Ｌ）あたり１４．８ｇのタンパク質を含む。
−全カロリー／窒素比（１５０：１）は、ストレス患者の要求を満たす。
−Ｏｘｅｐａによれば、呼吸困難を誘発することなく同化作用の促進および除脂肪体重の維持に十分なタンパク質が得られる。高タンパク質の摂取は、胚不全患者に重要である。タンパク質は、ＣＯ２産生に対してほとんど効果がないにもかかわらず、高タンパク質食は、人工呼吸器の運転性を向上させる。
−Ｏｘｅｐａのタンパク質供給源は、８６．８％のカゼイン酸ナトリウムおよび１３．２％のカゼイン酸カルシウムである。
−Ｏｘｅｐａにおけるタンパク質系のアミノ酸プロフィールは、科学アカデミーによって設定された高品質のタンパク質の基準を満たすか超える。
＊Ｏｘｅｐａは、無グルテンである。
Figure 0005657406
Figure 0005657406
Figure 0005657406
Figure 0005657406

Claims (3)

  1. ａ）配列番号３（図４３）と１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を単離する工程、
    ｂ）前記単離された核酸を含むベクターを構築する工程、
    ｃ）前記単離された核酸によってコードされたエロンガーゼ酵素の発現に十分な時間および条件の下で、前記ベクターを宿主細胞に導入する工程、ならびに
    ｄ）基質ポリ不飽和脂肪酸を生成物ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記基質に前記発現されたエロンガーゼ酵素を曝露する工程を含む、ポリ不飽和脂肪酸の製造方法。
  2. 前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記の生成物ポリ不飽和脂肪酸を少なくとも一つのデサチュラーゼに曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換するために、前記別のポリ不飽和脂肪酸を、少なくとも一つのエロンガーゼと少なくとも一つの付加的なデサチュラーゼからなる群から選択された一つまたは複数の酵素に曝露する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
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