JP6526164B2 - 神経幹細胞および運動ニューロンの生成 - Google Patents

神経幹細胞および運動ニューロンの生成 Download PDF

Info

Publication number
JP6526164B2
JP6526164B2 JP2017232724A JP2017232724A JP6526164B2 JP 6526164 B2 JP6526164 B2 JP 6526164B2 JP 2017232724 A JP2017232724 A JP 2017232724A JP 2017232724 A JP2017232724 A JP 2017232724A JP 6526164 B2 JP6526164 B2 JP 6526164B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mir
cells
mscs
mirna
stem cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2017232724A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018075017A (ja
Inventor
チャヤ ブローディー，
チャヤ ブローディー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henry Ford Health System
Original Assignee
Henry Ford Health System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henry Ford Health System filed Critical Henry Ford Health System
Publication of JP2018075017A publication Critical patent/JP2018075017A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6526164B2 publication Critical patent/JP6526164B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/10—Production naturally occurring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

本願は、２０１２年２月２２日に出願した米国特許仮出願第６１／６０１５９６号（参照として本明細書中にそれらの全体が援用される）の優先権の利益を主張する。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を使用して神経幹細胞および運動ニューロンに向かってエクスビボ分化させる方法に関連する。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤および血管周囲の組織を含むほとんどの結合組織に存在する、多数の種から単離することができる間質細胞の不均一な集団である。ＭＳＣはまた、胎盤および臍帯ワルトンゼリーからも単離することができる。
骨髄および脂肪組織を含むすべての組織におけるＭＳＣの濃度は非常に低いが、ＭＳＣの数をインビトロで拡大させることができる。典型的には、１５回までの継代培養を使用するＭＳＣの拡大では、遺伝的安定性を示す変異が生じていない。ＭＳＣは間葉系譜の細胞（例えば、骨、軟骨および脂肪など）に分化することができ、しかし、ある種の条件のもとでは、内胚葉系譜および神経外胚葉系譜の細胞の表現型を獲得することが報告されており、このことは「分化転換」のための何らかの潜在的能力を示唆している。
骨髄区画内において、これらの細胞はしっかりと混じり合い、造血および造血幹細胞の生存を黙従的状態において支援する（７）。加えて、培養における拡大の後において、ＭＳＣは、自然免疫および適応免疫を調節するその能力を保持する（８）。さらに、ＭＳＣは炎症部位に能動的に遊走し、ＣＮＳを含む損傷を受けた組織を保護する。これらは、自己免疫障害を含む炎症性疾患および免疫媒介疾患を処置するための、免疫抑制性の、正確に言えば、免疫調節性または抗炎症性の新しい作用因としてのその使用を裏付けた性質である（９）。ＭＳＣのこれらの特徴は、同種骨髄移植の後における命を脅かす移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制するためのその使用、したがって、同種骨髄移植の非常に重篤な合併症の１つを抑制し、これにより、多臓器傷害を伴う移植関連の毒性および死亡を低下させることを助けるに値した（１０）。
いくつかの研究では、種々の因子にインビトロでさらされた後のＭＳＣがその表現型を変化させ、ニューロンおよびグリアのマーカーを明らかにすることが示されている［Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．他，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＵＳＡ．９６（１９）：１０７１１−６，１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他 Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．１６４（２）：２４７−５６．２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６１（４）：３６４−７０，２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．他，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．６９（６）：９０８−１７，２００２；Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ Ｄｉｓ．２７（３）：６３２−６，２００１；Ｋｏｈｙａｍａ，Ｊ．他 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．６８（４−５）：２３５−４４，２００１；Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（２）：１２１−３２，２００３］。
したがって、ＭＳＣ（エクスビボ分化ＭＳＣおよび非分化の両方）が、多発性硬化症、パーキンソン病、ＡＬＳ、アルツハイマー病、脊髄傷害および卒中を含む様々な神経学的障害を処置するための細胞置換療法のための候補物として提案されている。
脊髄における運動ニューロンは骨格筋を神経支配し、発達途中の脊髄（神経管）の限られた領域における神経上皮細胞に起源を有する。胚発達の期間中に、運動ニューロンは、脊髄に隣接する骨格筋を神経支配するために周囲にその突起（神経）を伸ばす。しかしながら、成人の身体では、運動ニューロンの軸索が脊髄内の細胞体からかなり遠く突き出て、その標的筋肉に達する。このため、運動ニューロンは、より小型のニューロンと比較してより大きい代謝速度を有しており、このことが、運動ニューロンを、遺伝的変化、後成的変化および環境変化に対してより感受性にしている。運動ニューロンは自身を再生することができず、したがって、その喪失または変性が一般に、麻痺および様々な障害（例えば、小児の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および成人発症の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）など）を含む致死的な神経学的状態に伴う。
Ｒｏｙ他，２００５［Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２００５；１９６：２２４−２３４］；Ｚｈａｎｇ他，２００６［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００６；２４：４３４−４４２］；Ｂｏｈｌ他，２００８［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００８；２６：２５６４−２５７５］；ａｎｄ Ｄｉｍｏｓ他，２００８［Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；３２１：１２１８−１２２１］。これらの内容は参考として組み入れられ、運動ニューロンへの分化を誘導する様々な幹細胞の遺伝子改変を教示する。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、間葉系幹細胞の神経幹細胞への分化を促す方法であって、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−９３５ａ，ｍｉＲ３０２ｂ，ｍｉＲ−３７１，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３２，ｌｅｔ−７ｃ，ｍｉＲ−６６５，ｍｉＲ−４２５８，ｍｉＲ−３６１−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８９２ｂ，ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−６３６，ｍｉＲ−４２８４，ｍｉＲ−１２０８，ｍｉＲ−１２７４ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５０１−３ｐ，ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ，ｍｉＲ−３７８ｂ，ｍｉＲ−１２８７，ｍｉＲ−４２５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３２４−５ｐ，ｍｉＲ−３１７８，ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−５００−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−５０２−３ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−１２７５，ｍｉＲ−４２２ａ，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−１８１ｄ，ｍｉＲ−１３０７，ｍｉＲ−１３０１，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−５０５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−５３２−３ｐ，ｍｉＲ−１０６ａ，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１２７１，ｍｉＲ−７６９−３ｐ，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３２４−３ｐ，ｍｉＲ−２０ａ，ｍｉＲ−５０１−５ｐ，ｍｉＲ−３３０−３ｐ，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−７６９−５ｐ，ｍｉＲ−１２５ｂ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−１８１ａ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８８５−３ｐ，ｍｉＲ−１２４６，ｍｉＲ−９２ｂ，ｍｉＲ−３６２−５ｐ，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−４２７０，ｍｉＲ−３７８ｃ，ｍｉＲ−９３−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１４９，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−４９７，ｍｉＲ−３７８，ｍｉＲ−１２３１，ｍｉＲ−１３９−５ｐ，ｍｉＲ−３１８０−３ｐ，ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−２０ｂからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記ＭＳＣの前記神経幹細胞への分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣの神経幹細胞への分化を促す方法であって、ｍｉＲ−４３１７、ｍｉＲ−１５３，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−１０ｂ，ｍｉＲ−１４２−３ｐ，ｍｉＲ−１３１ａ，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ，ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−１３８，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−２２４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−４８７ｂ，ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ｂ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３７９，ｍｉＲ−２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−４３１７，ｍｉＲ−１９３ｂ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２２，５７４−３ｐ，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２１１３，ｌｅｔ−７ｉ，ｍｉＲ−２４，ｍｉＲ−２３ｂ，ｍｉＲ−２９９−３ｐ，ｍｉＲ−５１８ｃ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２２１，ｍｉＲ−４３１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５２３，ｍｉＲ−４３１３，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−６１４，ｍｉＲ−６５３，ｍｉＲ−２２７８，ｍｉＲ−７６８−５ｐ，ｍｉＲ−１５４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３０２ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３１９９およびｍｉＲ−３１３７からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの前記間葉系幹細胞における発現を、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因のレベルをアップレギュレーションすることによってダウンレギュレーションし、それにより、前記ＭＳＣの前記神経幹細胞への分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣの神経幹細胞への分化を促す方法であって、外因性ｍｉＲ−１２４の前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、かつ、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７の前記ＭＳＣにおけるレベルをダウンレギュレーションし、それにより、前記ＭＳＣの前記神経幹細胞への分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣの神経幹細胞への分化を促す方法であって、前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）の量および／または活性をダウンレギュレーションする作用因と接触させ、それにより、ＭＳＣの前記神経幹細胞への分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、神経幹細胞の運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３６５−３ｐ、ｍｉＲ−３６５−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−１３０ａからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それによりＮＳＣの前記運動ニューロンへの分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣの運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−３６８，ｍｉＲ−３６５，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−４９１，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−１９２，ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−３７３， ，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−１５１−５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２２，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−１，ｍｉＲ−２９ｃ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６６３ａ，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−４４９ａ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−５２０ｂ，ｍｉＲ−４５１，ｍｉＲ−５３２−５９，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３４ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−７ｂ，ｍｉＲ−１０３，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１３８５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−３３０，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−７０８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２０４，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−３７５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１２９−５ｐ，ｍｉＲ−１５３，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−３３８−３ｐ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−２１７，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−１２２８，ｍｉＲ−１８３，ｍｉＲ−１８５，ｍｉＲ−１９０，ｍｉＲ−５２２，ｍｉＲ−６５０，ｍｉＲ−６７５，ｍｉＲ−３４２−３ｐ，ｍｉＲ−３１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、ＭＳＣの前記運動ニューロンへの分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＮＳＣの運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２３からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因の前記ＮＳＣにおけるレベルをアップレギュレーションすることによってダウンレギュレーションし、それにより、ＮＳＣの前記運動ニューロンへの分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＭＳＣの運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−２１１３，ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ，ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−２１１３，ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３０２ｃ，ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３２６，ｍｉＲ−３２８，ｍｉＲ−３３１−３ｐ，ｍｉＲ−３４０，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７３−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ，ｍｉＲ−４２３−３ｐ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−４５１ａ，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５１５−３ｐ，ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５１９ｅ，ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｇ，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−５９０−５ｐ，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−６２６，ｍｉＲ−６３９，ｍｉＲ−６５４−３ｐ，ｍｉＲ−６５７，ｍｉＲ−６６１，ｍｉＲ−７０８−５ｐ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−９６，ｍｉＲ−９９ａｒｎｏおよびｍｉＲ−１９４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因の前記ＭＳＣにおけるレベルをアップレギュレーションすることによってダウンレギュレーションし、それにより、ＭＳＣの前記運動ニューロンへの分化を促すことを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−１３７からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１３１ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１５３およびｍｉＲ−１８１ａからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が神経幹細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３６５−３ｐ、ｍｉＲ−３６５−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１３０ａからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２３からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が運動ニューロンの表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、脳疾患または脳障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、請求項３３に記載される単離された細胞集団の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記脳疾患または脳障害を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載される単離された細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、運動ニューロン疾患の処置のために調節され得るｍｉＲＮＡを選択する方法であって、
（ａ）神経幹細胞の集団を運動ニューロン表現型に向かって分化させること；および
（ｂ）ＭＳＣの集団におけるｍｉＲＮＡの発現における変化を、前記ＭＳＣを運動ニューロン表現型に向かって分化させる前および分化させた後において分析すること（ただし、所定のレベルを越えるか、または下回るｍｉＲＮＡの発現の変化により、前記ｍｉＲＮＡが前記運動ニューロン疾患の処置のために調節され得ることが示される）
を含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、運動ニューロン疾患をその必要性のある対象において処置する方法であって、請求項３５に記載される単離された細胞集団の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記運動ニューロン疾患を処置することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−８９１ａ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−５７２およびｍｉＲ−９３５ａからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉＲ−４３１７、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−４２８８、ｍｉＲ−４０９−５ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が神経幹細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−５００およびｍｉＲ−４９１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡを含み、および／または、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２１１３、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を含む、細胞の遺伝子改変され単離された集団であって、前記細胞が運動ニューロンの表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−８９１ａ、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１２０２、ｍｉＲ−５７２およびｍｉＲ−９３５ａからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２５、ｍｉＲ−８９１およびｍｉＲ−３７８からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４３１７、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−４２８８、ｍｉＲ−４０９−５ｐおよびｍｉＲ−１９３ａ−５ｐからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９９ｂからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１３８であり、上記方法はさらに、
（ｉ）ｍｉＲ−８９１の発現を、ｍｉＲ−８９１にハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因を使用してダウンレギュレーションすること；
（ｉｉ）外因性ｍｉＲ２０ｂのレベルをアップレギュレーションすること；または
（ｉｉｉ）外因性ｍｉＲ３７８のレベルをアップレギュレーションすること
を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−６４８、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−５００およびｍｉＲ−４９１からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−９４２、ｍｉＲ−２１１３、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１９９ａ−５ｐからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３６８およびｍｉＲ−１５４のそれぞれを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１３０ａのそれぞれを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−２０ａのそれぞれを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２３およびｍｉＲ−３７３のそれぞれをダウンレギュレーションすることを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＮＳＣは、ＭＳＣをエクスビボ分化させることによって作製される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エクスビボ分化させることが、本明細書中に記載される方法のいずれかに従って実行される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血および臍帯からなる群から選択される組織から単離される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して自己である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して非自己である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＭＳＣは上記対象に対して半同種である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることは、上記ＭＳＣに上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡを導入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることが、上記ＭＳＣを、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡのプレ−ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記アップレギュレーションすることが、上記ＭＳＣを、上記少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりトランスフェクションすることによって実行される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ネスチンおよびＳｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を上記作製することの後において分析することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、ｉｓｌｅｔ１、ＨＢ９、ならびに、ニューロンマーカーのニューロフィラメントおよびβ３チューブリンからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を上記作製することの後において分析することを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はインビボで実行される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はエクスビボで実行される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞集団の少なくとも５０％が、ネスチンおよびＳｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞集団の少なくとも５０％が、ｉｓｌｅｔ１、ＨＢ９、ならびに、ニューロンマーカーのニューロフィラメントおよびβ３チューブリンからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は、脳疾患または脳障害を処置することにおいて使用するためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は、神経変性障害である脳疾患または脳障害のためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、脊髄傷害、脳性麻痺、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離された細胞集団は、運動ニューロン疾患を処置することにおいて使用するためのものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記運動ニューロン疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽性球麻痺および進行性球麻痺からなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経疾患または神経障害は神経変性障害である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、脊髄傷害、脳性麻痺、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面および画像を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１Ａ−１Ｂは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、神経幹細胞（ＮＳＣ）様細胞に分化し、かつ、ＮＳＣマーカーを発現するように誘導されることがあることを例示する写真およびグラフである。ＭＳＣを、方法において記載されるように細菌用ディッシュにおいてニューロスフェア培地に置床した。ＭＳＣ由来の球状体を免疫蛍光（図１Ａ）およびリアルタイムＰＣＲ（図１Ｂ）によって特徴づけた。
図２は、ＮＳＣ分化期間中にアップレギュレーションされた、幹細胞シグナチャーおよび自己再生に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
図３は、ＮＳＣ分化期間中にアップレギュレーションされた、造血に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
図４Ａは、ＮＳＣ分化期間中にアップレギュレーションされた、ニューロンシグナチャーおよび自己再生に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。 図４Ｂ−４Ｄは、ＮＳＣ分化期間中にアップレギュレーション（図４Ｂ，４Ｃ）またはダウンレギュレーション（図４Ｄ）された、ニューロンシグナチャーおよび自己再生に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
図４Ｅ−４Ｆは、ネスチンプロモーターレポーターアッセイを使用してａｎｔａｇｏｍｉＲ−１３８およびｍｉＲ−８９１によりトランスフェクションされる骨髄ＭＳＣを例示する写真である。
図５Ａ−５Ｄは、ＲＴＶＰ−１がＭＳＣのＮＳＣへの分化において役割を果たすことを例示するグラフおよび写真である。ＲＴＶＰ−１がＢＭ−ＭＳＣにおいて高レベルで発現され、これは、ウエスタンブロット分析によって明らかにされるように、このタンパク質の非常に高いレベルを発現した細胞であると見なされるいくつかの神経膠腫細胞と類似している（Ａ）。ＭＳＣの間葉系譜分化を示す略図（Ｂ）。ｓｉＲＮＡ二重鎖を使用するＢＭ−ＭＳＣにおけるＲＴＶＰ−１のサイレンシングはこれらの細胞の骨形成分化を低下させる（Ｃ）。ＢＭ−ＭＳＣにおけるＲＴＶＰ−１のサイレンシングは種々の間葉系マーカーの発現を低下させる（Ｄ）。
図５Ｅは、ＭＳＣ、および、ＮＳＣに分化させられるＭＳＣにおけるＲＴＶＰ−１の発現を例示する棒グラフである。図５Ｆは、ＭＳＣにおけるネスチン発現に対するＲＴＶＰ−１のサイレンシングの影響を例示する棒グラフである。
図６Ａ−６Ｄは、胎盤由来のＭＳＣに対するＯｌｉｇ２および分化培地のトランスフェクションの影響を例示する写真およびグラフである。培養での１２日の後、細胞を、リアルタイムＰＣＲを使用して運動ニューロン始原体マーカーの発現（図６Ｃ）および運動ニューロンマーカーの発現（図６Ｄ）について分析した。図６Ａは未分化ＭＳＣを例示する。図６Ｂは分化ＭＳＣを例示する。
図７Ａは、ＮＳＣが、運動ニューロン細胞に分化するように誘導されることがあることを例示する写真である。ヒト神経始原体細胞（Ｌｏｎｚａ）を球状体として成長させ、その後、ラミニン上に置床し、方法において記載されるような種々の因子により処理した。１２日〜１４日後、細胞を形態学的外観について分析し、また、リアルタイムＰＣＲを使用して種々のマーカーについて分析した。 図７Ｂは、ＮＳＣが、運動ニューロン細胞に分化するように誘導されることがあることを例示するグラフである。ヒト神経始原体細胞（Ｌｏｎｚａ）を球状体として成長させ、その後、ラミニン上に置床し、方法において記載されるような種々の因子により処理した。１２日〜１４日後、細胞を形態学的外観について分析し、また、リアルタイムＰＣＲを使用して種々のマーカーについて分析した。
図８は、運動ニューロン分化期間中にアップレギュレーションされた、幹細胞シグナチャーおよび自己再生に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
図９は、運動ニューロン分化期間中にアップレギュレーションされた、造血に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
図１０は、運動ニューロン分化期間中にアップレギュレーションされた、ニューロンシグナチャーおよび自己再生に関連する例示的ｍｉＲＮＡを例示する棒グラフである。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、間葉系幹細胞を、ミクロＲＮＡを使用して神経始原体細胞および運動ニューロンに向かってエクスビボ分化させる方法に関連する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
神経幹細胞（ＮＳＣ）が哺乳動物およびヒトの胚および胎児の脳から単離され、様々な培養系においてインビトロで増やされている（Ｄｏｅｔｓｃｈ他、１９９９、Ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ａｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ、Ｃｅｌｌ、９７：７０３〜１６；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ他、１９９９、Ｃｅｌｌ、９６：２５〜３４；Ｓｖｅｎｄｓｅｎ他、１９９８、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８５：１４１〜５２）。ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）を、ヒトｂＦＧＦおよびヒトＥＧＦを含有する血清非含有培地において増殖させるための系もまた報告されている（Ｋｉｍ他、２００２、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：４０２０〜４０２５；Ｑｕ他、２００１、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、１２：１１２７〜１１３２）。さらに、ｈＮＳＣの実験動物への移植が記載されている（Ｑｕ他、２００１、同上；Ｑｕ他、２００５、３５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２００５年１１月）。
しかしながら、様々な課題が、胚／胎児組織供給源に由来する幹細胞を使用する幹細胞治療の技術分野では存在した。胚性供給源を使用する幹細胞治療は、倫理的問題、細胞単離における技術的困難さ、および、移植レシピエントに長期の免疫抑制剤投与が必要であることなどの課題に直面する；胎児組織供給源を使用することの制限が上記で示されている。これらの課題により、ヒト使用のためのｈＮＳＣの適用性が妨げられている。
骨髄（ＢＭ）は、造血においてだけでなく、様々な非造血系組織を生じさせるためにも関与する幹細胞を含有する。骨髄における間質細胞の１つのサブセット、すなわち、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は自己再生することができ、かつ、骨、軟骨、脂肪、腱および他の結合組織を含む多数の間葉系細胞系譜を生じさせることができる（Ｍａｊｕｍｄａｒ他、１９９８、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１７６：５７〜６６；Ｐｅｒｅｉｒａ他、１９９５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９２：４８５７〜６１；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１４３〜７）。骨髄の間葉系幹細胞は通常、分化において神経系譜に決定されていない。成体幹細胞はある程度の多分化能を有し続けるにもかかわらず、成体幹細胞から生じる細胞タイプはそれらの組織特異的特性によって限定されると考えられている。この障壁を克服するためには、これらの成体幹細胞の細胞系譜を変化させることが必要である。
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、膨大な数の潜在的なミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の中から、特定のｍｉＲＮＡのみが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の神経幹細胞分化を誘導するために調節されることがあることを見出しており、そのような分化ＭＳＣは、脳の疾患または障害を有する患者を処置するために使用され得ることを提案する。
さらに、本発明者らは、ネスチンおよびＳＯＸ−２の発現によって測定されるように、調節により、ＮＳＣに向かう分化が相乗的に増大することが見出されたｍｉＲＮＡの特定の組合せを特定した。
さらに本発明を実施に移している間に、本発明者らは、ＮＳＣのｍｉＲＮＡ発現を操作したとき、運動ニューロンマーカーを発現する細胞が生じることがあることを発見した。
したがって、本発明者らは、神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３６５−３ｐ、ｍｉＲ−３６５−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１３０ａのうちの少なくとも１つのアップレギュレーションが運動ニューロンの表現型を誘導し、一方で、ＮＳＣにおけるｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２３のうちの少なくとも１つのダウンレギュレーションもまた、運動ニューロンの表現型を誘導したことを示した。
さらに、本発明者らは、ｉｓｌｅｔ１、ＨＢ９、ならびに、ニューロンマーカーのニューロフィラメントおよびβ３チューブリンを含む運動ニューロンマーカーの発現によって測定されるように、調節により、運動ニューロンに向かう分化が相乗的に増大することが見出されたｍｉＲＮＡの特定の組合せを特定した。
したがって、本発明の１つの局面によれば、間葉系幹細胞の神経幹細胞への分化を促す方法であって、ｍｉＲ３０２ｂ，ｍｉＲ−３７１，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−９３５ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２７５，ｌｅｔ−７ｃ，ｍｉＲ−６６５，ｍｉＲ−４２５８，ｍｉＲ−３６１−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８９２ｂ，ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−６３６，ｍｉＲ−４２８４，ｍｉＲ−１２０８，ｍｉＲ−１２７４ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５０１−３ｐ，ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ，ｍｉＲ−３７８ｂ，ｍｉＲ−１２８７，ｍｉＲ−４２５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３２４−５ｐ，ｍｉＲ−３１７８，ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−５００−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−５０２−３ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−１２７５，ｍｉＲ−４２２ａ，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−１８１ｄ，ｍｉＲ−１３０７，ｍｉＲ−１３０１，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−５０５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−５３２−３ｐ，ｍｉＲ−１０６ａ，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１２７１，ｍｉＲ−７６９−３ｐ，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３２４−３ｐ，ｍｉＲ−２０ａ，ｍｉＲ−５０１−５ｐ，ｍｉＲ−３３０−３ｐ，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−７６９−５ｐ，ｍｉＲ−１２５ｂ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−１８１ａ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８８５−３ｐ，ｍｉＲ−１２４６，ｍｉＲ−９２ｂ，ｍｉＲ−３６２−５ｐ，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−４２７０，ｍｉＲ−３７８ｃ，ｍｉＲ−９３−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１４９，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−４９７，ｍｉＲ−３７８，ｍｉＲ−１２３１，ｍｉＲ−１３９−５ｐ，ｍｉＲ−３１８０−３ｐ，ｍｉＲ−９−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−２０ｂからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションし、それにより、前記間葉系幹細胞の前記神経幹細胞への分化を促すことを含む方法が提供される。
本明細書中で使用される場合、表現「ＭＳＣの神経幹細胞（ＮＳＣ）への分化を促す」は、ＭＳＣを、ＮＳＣ系譜に沿って分化させることを示す。生じた細胞はＮＳＣに完全に分化させられる場合があり、または、ＮＳＣに部分的に分化させられる場合がある。
表現「少なくとも１つ」は、本明細書において使用される場合、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれ以上のｍｉＲＮＡを示す。ｍｉＲＮＡの特定の組合せの様々な例が本明細書中下記に提供される。
間葉系幹細胞は、生物活性因子（例えば、サイトカインなど）からの様々な影響に依存して、１種以上の間葉系組織（例えば、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性結合組織および繊維性結合組織、筋芽細胞）および胚の中胚葉に起源を有する組織とは異なる組織（例えば、神経系細胞）を生じさせる。そのような細胞は、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児および思春期の皮膚、血液および他の組織から単離することができるにもかかわらず、容易に利用可能な脂肪組織およびＢＭにおけるそれらの存在量は他の組織におけるそれらの存在量をはるかに超えており、したがって、ＢＭおよび脂肪組織からの単離が現時点では好ましい。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、精製し、拡大する様々な方法が当技術分野では知られており、これらには、例えば、ＣａｐｌａｎおよびＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによって米国特許第５４８６３５９号に開示される方法、ならびに、Ｊｏｎｅｓ Ｅ．Ａ．他、２００２、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、４６（１２）：３３４９〜６０に開示される方法が含まれる。
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、血液、絨毛膜および羊膜の胎盤（例えば胎盤の胎児側）、臍帯血、臍帯、羊水、胎盤（これらに限定されない）を含む様々な組織、および脂肪組織から単離される場合がある。
間葉系幹細胞を末梢血から単離する方法が、Ｋａｓｓｉｓ他［Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００６ Ｍａｙ；３７（１０）：９６７〜７６］によって記載される。間葉系幹細胞を胎盤組織から単離する方法が、Ｚｈａｎｇ他［Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、１１７（６）：８８２〜８８７］によって記載される。脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉系幹細胞を単離し、培養する方法が、Ｋｅｒｎ他［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００６；２４：１２９４〜１３０１］によって記載される。
本発明のこの局面の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒトの新生児の胎盤および臍帯から単離される。
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）が、ＦＩＣＯＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配によって、またはＨｅｔａｓｔａｒｃｈ（ヒドロキシエチルデンプン）を使用する赤血球の除去によって分離される場合がある。好ましくは、間葉系幹細胞の培養物が、ＢＭ吸引物（通常的には２０ｍｌ）を等体積のハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎａｄ、ＮＹ、米国）により希釈し、希釈された細胞を約１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌカラム（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）の上に重層することによって作製される。２５００×ｇでの遠心分離を３０分間行った後、単核細胞層が境界から取り出され、ＨＢＳＳに懸濁される。その後、細胞が１５００×ｇで１５分間遠心分離され、完全培地（ＭＥＭ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含まないα培地；ＧＩＢＣＯ）、ＭＳＣの迅速成長のために選択されたロットに由来する２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、および２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）に再懸濁される。再懸濁された細胞が１０ｃｍの培養ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）において約２５ｍｌの培地に置床され、５％の加湿ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションされる。培養で２４時間の後、非接着性細胞が捨てられ、接着性細胞がリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）により２回徹底的に洗浄される。培地が、３日毎または４日毎に約１４日間、新鮮な完全培地により取り換えられる。その後、接着性細胞が、０．２５％のトリプシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ）を３７℃で５分間用いて集められ、６ｃｍのプレートに再置床され、さらに１４日間培養される。その後、細胞がトリプシン処理され、細胞計数デバイス、例えば、血球計（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｏｒｓｈａｍ、ＰＡ）などを使用して計数される。培養細胞が遠心分離によって回収され、５％ＤＭＳＯおよび３０％ＦＣＳとともに、１ｍｌあたり１〜２×１０６細胞の濃度で再懸濁される。それぞれが約１ｍｌのアリコートが緩速凍結され、液体窒素において貯蔵される。
脂肪組織由来のＭＳＣを脂肪吸引によって得ることができ、また、単核細胞を、脂肪および脂肪細胞を除くことによって手作業で、またはＣｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）をＭＳＣの調製のために上記で記載されるのと同じ手順に従って使用して単離することができる。
１つの実施形態によれば、集団が（例えば、フラスコにおいて）ポリスチレンプラスチック表面に置床され、間葉系幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。代替では、間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞のマーカーを使用してＦＡＣＳによって単離される場合がある。
好ましくは、ＭＳＣは少なくとも５０％精製され、より好ましくは少なくとも７５％精製され、一層より好ましくは少なくとも９０％精製される。
間葉系幹細胞画分を拡大するために、凍結された細胞が３７℃で解凍され、完全培地により希釈され、ＤＭＳＯを除くために遠心分離によって回収される。細胞が完全培地に再懸濁され、約５０００細胞／ｃｍ２の濃度で置床される。培養で２４時間の後、非接着性細胞が除かれ、接着性細胞が、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して集められ、狭くしたパスツールピペットに通すことによって解離させられ、好ましくは、約１．５〜約３．０細胞／ｃｍ２の密度で再置床される。これらの条件のもとで、ＭＳＣ培養物は約５０回の集団倍加にわたって成長することができ、約２０００倍にわたって拡大させることができる［Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ他、Ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｃ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９７：３２１３〜３２１８、２０００］。
本発明のいくつかの実施形態によって利用されるＭＳＣ培養物には好ましくは、それらの形態学的特徴によって定義される３つの群の細胞、すなわち、小さい無顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−１として示される）、小さい顆粒細胞（これらは本明細書中下記ではＲＳ−２として示される）、および大きい適度な顆粒細胞（これらは本明細書中下記では成熟ＭＳＣとして示される）が含まれる。培養におけるそのような細胞の存在および濃度を、例えば、免疫蛍光、インサイチューハイブリダイゼーションおよび活性アッセイを使用することにより、様々な細胞表面マーカーの存在の有無を特定することによってアッセイすることができる。
ＭＳＣが本発明のいくつかの実施形態の培養条件のもとで培養されるとき、ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ４３およびＣＤ４５については陰性の染色を示す。小さい割合の細胞（１０％未満）がＣＤ３１および／またはＣＤ３８のマーカーについてかすかに陽性である。加えて、成熟ＭＳＣは、造血幹細胞マーカーであるＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）についてかすかに陽性であり、骨形成ＭＳＣのマーカーであるＳｔｒｏ−１について中程度に陽性であり［Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．＆Ｔｏｒｏｋ−Ｓｔｏｒｂ，Ｂ．（１９９１）、Ｂｌｏｏｄ、７８、５５６２］、かつ、胸腺細胞および末梢Ｔリンパ球のマーカーであるＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）について陽性である。他方で、ＲＳ−１細胞はＣＤ１１７およびＳｔｒｏ１のマーカーについて陰性であり、かつ、ＣＤ９０のマーカーについてかすかに陽性であり、ＲＳ−２細胞はこれらのマーカーのすべてについて陰性である。
本発明の間葉系幹細胞は、本明細書中下記でさらに記載されるように、自己、同系または同種の血縁者の供給源（一致した兄弟姉妹またはハプロタイプ一致の家族の一員）あるいは非血縁者の全く一致していない供給源のものである場合がある。
間葉系幹細胞の培養を、米国特許第６，５２８，２４５号およびＳａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｉｓｃｉ．Ｒｅｓ．９６：９０８−９１７，２００１）；ＢｌａｃｋおよびＷｏｏｄｂｕｒｙ（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２７：６３２−６３５，２００１）；Ｄｅｎｇ他（２００１），Ｋｏｈｙａｍａ他（２００１），ＲｅｙｅｓおよびＶｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３８：２３１−２３５，２００１）およびＪｉａｎｇ他（Ｎａｔｕｒｅ ４１８：４７−４９，２００２）に記載されたもののような神経幹細胞分化を支援する（または、神経幹細胞分化を少なくとも妨げない）任意の培地において行うことができる。
分化用培地は、Ｇ５、神経基礎培地、ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）、あるいは、ニューロンの成長を支援する任意の他の培地である場合がある。
述べられたように、間葉系幹細胞は、神経幹細胞への分化を誘導するために下記のｍｉＲＮＡの少なくとも１つと（エクスビボまたはインビボのどちらかで）接触させられる：ｍｉＲ３０２ｂ，ｍｉＲ−３７１，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−２１９，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−１２６，ｍｉＲ−１２７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−９３５ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２７５，ｌｅｔ−７ｃ，ｍｉＲ−６６５，ｍｉＲ−４２５８，ｍｉＲ−３６１−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８９２ｂ ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−１８１ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−６３６，ｍｉＲ−４２８４，ｍｉＲ−１２０８，ｍｉＲ−１２７４ｂ，ｍｉＲ−３０ｃ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５０１−３ｐ，ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ，ｍｉＲ−３７８ｂ，ｍｉＲ−１２８７，ｍｉＲ−４２５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３２４−５ｐ，ｍｉＲ−３１７８，ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−１８１ｂ，ｍｉＲ−５００−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−５０２−３ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−１２７５，ｍｉＲ−４２２ａ，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−１８１ｄ，ｍｉＲ−１３０７，ｍｉＲ−１３０１，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−５０５−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１２０２，ｍｉＲ−１２，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−１９５，ｍｉＲ−５３２−３ｐ，ｍｉＲ−１０６ａ，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−１２７１，ｍｉＲ−７６９−３ｐ，ｍｉＲ−１５ｂ，ｍｉＲ−３２４−３ｐ，ｍｉＲ−２０ａ，ｍｉＲ−５０１−５ｐ，ｍｉＲ−３３０−３ｐ，ｍｉＲ−８７４，ｍｉＲ−５００ｍｉＲ−２５，ｍｉＲ−７６９−５ｐ，ｍｉＲ−１２５ｂ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１３０ｂ，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−１８１ａ−２−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−８８５−３ｐ，ｍｉＲ−１２４６，ｍｉＲ−９２ｂ，ｍｉＲ−３６２−５ｐ，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−４２７０，ｍｉＲ−３７８ｃ，ｍｉＲ−９３−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１４９，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−１８ａ，ｍｉＲ−８９１ａ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−４９７，ｍｉＲ−３７８，ｍｉＲ−１２３１，ｍｉＲ−１３９−５ｐ，ｍｉＲ−３１８０−３ｐ，ｍｉＲ−９３５およびｍｉＲ−２０ｂ。
特定の実施形態によれば、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１３２からなる群から選択される。
別の実施形態によれば、上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９２５、ｍｉＲ−８９１およびｍｉＲ−３７８からなる群から選択される。
本発明ではまた、特定のｍｉＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１３１ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１５３およびｍｉＲ−１８１ａのダウンレギュレーションによって間葉系幹細胞を神経幹細胞表現型に向けて分化させることが意図される。
本発明者らは、ＭＳＣを神経幹細胞表現型に向けて分化させるためのさらなるｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションを意図する。これらのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−４３１７，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ，ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ，ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−１３８，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−２２４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−４８７ｂ，ｍｉＲ−４０９−５ｐ，ｍｉＲ−１９３ｂ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３７９，ｍｉＲ−２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−４３１７，ｍｉＲ−１９３ｂ，ｍｉＲ−２７ｂ，ｍｉＲ−２２，５７４−３ｐ，ｍｉＲ−４２８８，ｍｉＲ−２３ａ，ｍｉＲ−２２１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２１１３，ｌｅｔ−７ｉ，ｍｉＲ−２４，ｍｉＲ−２３ｂ，ｍｉＲ−２９９−３ｐ，ｍｉＲ−５１８ｃ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−２２１，ｍｉＲ−４３１−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−５２３，ｍｉＲ−４３１３，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−６１４，ｍｉＲ−６５３，ｍｉＲ−２２７８，ｍｉＲ−７６８−５ｐ，ｍｉＲ−１５４−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３０２ａ−ｓｔａｒ，ｍｉＲ−３１９９およびｍｉＲ−３１３７を含む。
特定の実施形態によれば、ダウンレギュレーションされることとなるｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９９ｂからなる群から選択される。
そのようなｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることを、当該ｍｉＲＮＡに対して生理学的条件下での細胞においてハイブリダイゼーション可能であるポリヌクレオチドを使用して実行させることができる。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−１２４の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における発現をアップレギュレーションし、一方で、同時に、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７のＭＳＣの当該集団における発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−８９１の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における発現をダウンレギュレーションし、一方で、同時に、ｍｉＲ−１３８のＭＳＣの当該集団における発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−２０ｂの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における発現をアップレギュレーションし、一方で、同時に、ｍｉＲ−１３８のＭＳＣの当該集団における発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−３７８の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）における発現をアップレギュレーションし、一方で、同時に、ｍｉＲ−１３８のＭＳＣの当該集団における発現をダウンレギュレーションすることによって作製される。
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション可能（な）」は、ハイブリダイゼーションすることができること、すなわち、二本鎖分子（例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよび／またはＤＮＡ：ＤＮＡ分子など）を形成できることを示す。「生理学的条件」は、細胞、組織あるいは完全な生物体または細胞体に存在する条件を示す。好ましくは、本発明によって使用される生理学的条件には、３４℃〜４０℃の間の温度、より好ましくは３５℃〜３８℃の間の温度、より好ましくは３６℃〜３７．５℃の間の温度、最も好ましくは３７℃〜３７．５℃の間の温度；０．８％〜１％の間、より好ましくは約０．９％の塩濃度（例えば、塩化ナトリウムＮａＣｌ）；および／または、６．５〜８の範囲でのｐＨ値、より好ましくは６．５〜７．５、最も好ましくは７〜７．５の範囲でのｐＨ値が含まれる。
述べられたように、本発明者らはまた、特定のｍｉＲＮＡを神経幹細胞において操作したとき、運動ニューロンマーカーを発現する細胞が生じることがあることを発見している。
したがって、本発明の別の局面によれば、神経幹細胞の運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−３０２ｂ、ｍｉＲ−３６５−３ｐ、ｍｉＲ−３６５−５ｐ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−１３０ａからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションすることを含む方法が提供される。
本発明のこの局面の神経幹細胞は、神経細胞のいずれの特定のタイプ（例えば、限定されずにニューロン細胞タイプおよびグリア細胞タイプ）にも決定されていない非拘束の神経幹細胞である場合がある。好ましくは、これらの細胞は、神経系の運命を受け入れる潜在的能力を有する。代替において、神経幹細胞は特定の神経細胞タイプ（例えば、運動ニューロンなど）に決定されている場合があり、しかし、最終分化のマーカーを発現／分泌せず、例えば、神経伝達物質を分泌しない。
特定の実施形態によれば、神経幹細胞はネスチンおよび／またはＳＯＸ−２の少なくとも１つを発現する。さらなるマーカーには、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよびＭＵＳＡＳＨＩ−１が含まれる。マーカーの発現を確認する様々な方法が本明細書中下記で提供される。「神経ロゼット」の形成が神経幹細胞形成のもう１つの形態学的マーカーである。
１つの実施形態によれば、神経幹細胞が、間葉系幹細胞または胚性幹細胞（もしくは誘導された胚性幹細胞）のエクスビボ分化によって作製されている。
間葉系幹細胞が本明細書中上記で記載されている。数多くの方法が、ＭＳＣを神経幹細胞の運命に向かって分化させるために当技術分野で公知であり、これらには、遺伝子改変、および／または、そのような運命に向かう分化を促進させる培地で培養することが含まれる。培地は典型的には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（これらに限定されない）を含めて様々な増殖因子および／またはサイトカインを含む。典型的には、分化が血清非含有培地または血清代替物において実行される。
特定の実施形態によれば、ＮＳＣが、本明細書中上記で記載されるように、外因性ｍｉＲＮＡを発現するようにＭＳＣを遺伝子改変することによって作製される。
表現「胚性幹細胞」は、胚の３つすべての胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞に分化することができるか、または、未分化状態に留まることができる胚性細胞を示す。表現「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚組織（例えば、胚盤胞）で、胚が着床する前の胚組織（すなわち、着床前胚盤胞）から得られる細胞、着床後／原腸形成前の段階の胚盤胞から得られる拡大胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開ＷＯ２００６／０４０７６３を参照のこと）、および、妊娠期間中の任意の時期に、好ましくは妊娠１０週目前に胎児の生殖組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含む場合がある。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ；胚性様幹細胞）は、多能性が付与される（すなわち、胚の３つの胚細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化することができる）、成体体細胞の脱分化によって得られる細胞である。本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような細胞が、分化した組織（例えば、皮膚などの体細胞組織）から得られ、胚性幹細胞の特徴を獲得するために細胞を初期化する遺伝子操作による脱分化を受ける。本発明のいくつかの実施形態によれば、誘導多能性幹細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ−Ｍｙｃの発現を体性幹細胞において誘導することによって形成される。
本発明のいくつかの実施形態の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞をヒトの胚盤胞から単離することができる。ヒトの胚盤胞が典型的には、ヒトの体内の着床前の胚から、または、体外受精（ＩＶＦ）の胚から得られる。代替では、単細胞のヒト胚を胚盤胞段階に拡大することができる。ヒトＥＳ細胞の単離のために、透明帯が胚盤胞から除かれ、内部細胞塊（ＩＣＭ）が、栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングによって無傷のＩＣＭから除かれる免疫手術によって単離される。その後、ＩＣＭが、その伸長成長を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに置床される。９日〜１５日後、ＩＣＭ由来の伸長成長物が機械的解離または酵素的解離のどちらかによって凝集塊に解離され、その後、細胞が、新鮮な組織培養培地に再置床される。未分化の形態学を明らかにするコロニーがマイクロピペットによって個々に選択され、機械的に凝集塊に解離され、再置床される。その後、生じたＥＳ細胞が４日毎〜７日毎に常法により分割される。ヒトＥＳ細胞を調製する方法に関するさらなる詳細については、下記を参照のこと：Ｔｈｏｍｓｏｎ他［米国特許第５８４３７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、３８：１３３、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４、１９９５］、Ｂｏｎｇｓｏ他［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ、４：７０６、１９８９］、および、Ｇａｒｄｎｅｒ他［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．、６９：８４、１９９８］。
市販されている幹細胞もまた、本発明のいくつかの実施形態のこの局面とともに使用され得ることが理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞をＮＩＨヒト胚性幹細胞登録所（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販されている胚性幹細胞株の限定されない例には、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２がある。
加えて、ＥＳ細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，２００１），ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ他，１９８８，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４−７］，ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ他，１９９４，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８−９２］，ウサギ［Ｇｉｌｅｓ他 １９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０−８；Ｇｒａｖｅｓ ＆ Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ，１９９３，Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３，３６：４２４−３３］，幾つかの家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉ他，１９９１，Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５−６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４，Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３−８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ他，２００１，Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９−６７］および非ヒト霊長類の種（赤毛猿およびマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎ他，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９２：７８４４−８；Ｔｈｏｍｓｏｎ他 １９９６，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４−９］を含む他の種から同様に得られることができる。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚性様幹細胞）を、体細胞の遺伝子操作によって、例えば、体細胞（例えば、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞など）の転写因子（例えば、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ−２、ｃ−ＭｙｃおよびＫＬＦ４など）によるレトロウイルス形質導入によって体細胞から作製することができる［Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００７、１（１）：３９〜４９；Ａｏｉ Ｔ他、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８ Ｆｅｂ １４（印刷に先立つＥｐｕｂ）；ＩＨ Ｐａｒｋ、Ｚｈａｏ Ｒ、Ｗｅｓｔ ＪＡ他、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２００８、４５１：１４１〜１４６；Ｋ Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔａｎａｂｅ Ｋ、Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ他、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：８６１〜８７２］。他の胚性様幹細胞を、レシピエント細胞が有糸分裂で停止させられるならば、卵母細胞への核移入、胚性幹細胞との融合、または、接合体への核移入によって作製することができる。
神経幹細胞をＥＳＣまたはｉＰＳ細胞から作製する様々な方法が当技術分野で公知であり、これらには、例えば、胚様体を介して分化を誘導する方法、および、接着性培養を介して分化を誘導する方法が含まれる。ＥＳＣをニューロンの運命に向かって分化させるための特定のプロトコルが、Ｄｈａｒａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０５：６３３〜６４０（２００８）に総説される（その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。多くの他の方法が、ＥＳＣ、ｉＰＳＣおよびＭＳＣをニューロン幹細胞に向かって分化させることが公知であり、本出願では、これらすべての方法の使用が意図されることが理解されるであろう。
本発明のニューロン幹細胞は、自己、同系または同種の血縁者供給源（一致した兄弟姉妹またはハプロタイプ一致の家族の一員）あるいは非血縁者の全く一致していない供給源のものである場合がある。
ニューロン幹細胞の培養を、神経幹細胞分化を支援する任意の培地において行うことができる（そのような培地の例が本明細書中上記で記載される）。
述べられたように、神経幹細胞は、運動ニューロン細胞系への分化を誘導するために下記のｍｉＲＮＡの少なくとも１つと（エクスビボまたはインビボのどちらかで）接触させられる：ｍｉＲ−３６８，ｍｉＲ−３０２ｂ，ｍｉＲ−３６５−３ｐ，ｍｉＲ−３６５−５ｐ，ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ａ ｍｉＲ−Ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１３４，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１２５ａ，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−１５４，ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−１３０ａ。
本発明ではまた、特定のｍｉＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−３３，ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２３）のダウンレギュレーションによって神経幹細胞の運動ニューロン表現型への分化が意図される。
そのようなｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることを、当該ｍｉＲＮＡ分子に対して生理学的条件下での細胞においてハイブリダイゼーション可能であるポリヌクレオチドを使用して実行させることができる。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ Ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３６８およびｍｉＲ−１５４のそれぞれの発現を神経幹細胞においてアップレギュレーションすることによって作製される。
特定の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１３０ａのそれぞれの発現を神経幹細胞においてアップレギュレーションすることによって作製される。
さらに別の実施形態によれば、細胞集団が、ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−２０ａのそれぞれの発現をアップレギュレーションすることによって作製される。
本発明者らはさらに、運動ニューロン表現型に向かう分化を強化するために、本明細書中上記で記載される方法のいずれかに加えて、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２３およびｍｉＲ−３７３のそれぞれをダウンレギュレーションすることを意図する。
間葉系幹細胞を、Ｏｌｉｇ２およびＨＢ９を過剰発現させることによって運動ニューロンに分化させた。本発明者らは、分化細胞および非分化細胞に対するｍｉＲＮＡアレイ分析を行い、（３倍を超える）統計学的に有意な様式で過剰発現された多数のｍｉＲＮＡ、および、（３倍を超える）統計学的に有意な様式でダウンレギュレーションされた多数のｍｉＲＮＡを見出した。本発明者らは、発現が分化細胞において増大したｍｉＲＮＡが、運動ニューロンをＭＳＣから作製するための過剰発現の候補であり得ることを意図する。本発明者らは、発現が分化細胞において低下したｍｉＲＮＡが、運動ニューロンをＭＳＣから作製するためのダウンレギュレーションの候補であることを意図する。
したがって、本発明のさらに別の局面によれば、ＭＳＣの運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−３６８，ｍｉＲ−３６５，ｍｉＲ−５００，ｍｉＲ−６４８，ｍｉＲ−４９１，ｍｉＲ−２１８，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−１９２，ｌｅｔ−７ｂ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２１０，ｍｉＲ−１９７，ｍｉＲ−２１，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−２７ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−１７，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−１９６ａ，ｍｉＲ−１２２，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−１５１−５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−２２，ｍｉＲ−３１，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−１，ｍｉＲ−２９ｃ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６６３ａ，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−４４９ａ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−５２０ｂ，ｍｉＲ−４５１，ｍｉＲ−５３２−５９，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５０３，ｍｉＲ−１５５，ｍｉＲ−３４ａ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−７ｂ，ｍｉＲ−１０３，ｍｉＲ−１２４，ｍｉＲ−１３８５ｐ，ｍｉＲ−１６，ｍｉＲ−３３０，ｍｉＲ−５２０，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−７０８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１３７，ｍｉＲ−１３２，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−２０４，ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−２２４，ｍｉＲ−３０ａ，ｍｉＲ−３７５，ｍｉＲ−１０１，ｍｉＲ−１０６ｂ，ｍｉＲ−１２８，ｍｉＲ−１２９−５ｐ，ｍｉＲ−１５３，ｍｉＲ−２０３，ｍｉＲ−２１４，ｍｉＲ−３３８−３ｐ，ｍｉＲ−３４６，ｍｉＲ−９８，ｍｉＲ−１０７，ｍｉＲ−１４１，ｍｉＲ−２１７，ｍｉＲ−４２４，ｍｉＲ−４４９，ｍｉＲ−７，ｍｉＲ−９，ｍｉＲ−９３，ｍｉＲ−９９ａ，ｍｉＲ−１００，ｍｉＲ−１２２８，ｍｉＲ−１８３，ｍｉＲ−１８５，ｍｉＲ−１９０，ｍｉＲ−５２２，ｍｉＲ−６５０，ｍｉＲ−６７５，ｍｉＲ−３４２−３ｐ，ｍｉＲ−３１からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡの前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）におけるレベルをアップレギュレーションすることを含む方法が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、ＭＳＣの運動ニューロンへの分化を促す方法であって、ｍｉＲ−１９９ａ，ｍｉＲ−３７２，ｍｉＲ−３７３，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−２１１３，ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３０２ｃ，ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ｃ，ｍｉＲ−３２６，ｍｉＲ−３２８，ｍｉＲ−３３１−３ｐ，ｍｉＲ−３４０，ｍｉＲ−３４５，ｍｉＲ−３６１−５ｐ，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７１ａ−３ｐ，ｍｉＲ−３７３−３ｐ，ｍｉＲ−３７４ａ，ｍｉＲ−４２３−３ｐ，ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−４５１ａ，ｍｉＲ−４９４，ｍｉＲ−５０４，ｍｉＲ−５１５−３ｐ，ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５１９ｅ，ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ，ｍｉＲ−５２０ｇ，ｍｉＲ−５３２−５ｐ，ｍｉＲ−５５９，ｍｉＲ−５６２，ｍｉＲ−５７２，ｍｉＲ−５９０−５ｐ，ｍｉＲ−６０５，ｍｉＲ−６０８，ｍｉＲ−６２６，ｍｉＲ−６３９，ｍｉＲ−６５４−３ｐ，ｍｉＲ−６５７，ｍｉＲ−６６１，ｍｉＲ−７０８−５ｐ，ｍｉＲ−９４２，ｍｉＲ−９６，ｍｉＲ−９９ａｒｎｏおよびｍｉＲ−１９４からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現を、前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡにハイブリダイゼーションし、かつ、その機能を阻害する少なくとも１つのポリヌクレオチド作用因の前記ＭＳＣにおけるレベルをアップレギュレーションすることによってダウンレギュレーションし、それにより、ＭＳＣの前記運動ニューロンへの分化を促すことを含む方法が提供される。
用語「ミクロＲＮＡ」、用語「ｍｉＲＮＡ」および用語「ｍｉＲ」は同義的であり、遺伝子発現を調節する、長さが約１９〜２８ヌクレオチドである非コードの一本鎖ＲＮＡ分子の集まりを示す。様々なｍｉＲＮＡが広範囲の生物において見出され、発達、恒常性および疾患原因において役割を果たすことが示されている。
下記はｍｉＲＮＡ活性の機構の簡単な記載である。
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、これにより、プリ−ｍｉＲＮＡとして公知のｍｉＲＮＡ前駆体の産生がもたらされる。プリ−ｍｉＲＮＡは典型的には、多数のプリ−ｍｉＲＮＡを含む多シストロン性ＲＮＡの一部である。プリ−ｍｉＲＮＡは、ステム／ループを有するヘアピンを形成する場合がある。ステムはミスマッチの塩基を含む場合がある。
プリ−ｍｉＲＮＡのヘアピン構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識される。Ｄｒｏｓｈａは典型的には、プリ−ｍｉＲＮＡにおける末端のループを認識し、およそ２回のらせん状ターンをステムに切断して、プレ−ｍｉＲＮＡとして公知の６０〜７０ｎｔの前駆体を生じさせる。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的な互い違いの切れ目を伴ってプリ−ｍｉＲＮＡを切断し、これにより、５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を有するプレ−ｍｉＲＮＡのステム・ループをもたらす。ステムのおよそ１回のらせん状ターン（約１０ヌクレオチド）がＤｒｏｓｈａ切断部位を越えて伸びることが、効率的なプロセシングのために必須であることが推定されている。その後、プレ−ｍｉＲＮＡが、Ｒａｎ−ＧＴＰおよび輸出受容体エクスポーチン−５によって核から細胞質に能動輸送される。
その後、プレ−ｍｉＲＮＡの二本鎖ステムがＤｉｃｅｒによって認識される（Ｄｉｃｅｒもまた、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼである）。Ｄｉｃｅｒはまた、ステム・ループの塩基において５’ホスファートおよび３’突出を認識する場合がある。その場合、Ｄｉｃｅｒは末端ループをステム・ループの塩基から２回のらせん状ターン離れて切断し、これにより、さらなる５’ホスファートおよび約２ヌクレオチドの３’突出を残す。生じたｓｉＲＮＡ様二重鎖はミスマッチを含む場合があり、成熟ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ＊として公知の類似サイズの断片とを含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊が、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡの相対するアームに由来する場合がある。ｍｉＲＮＡ＊配列が、典型的にはｍｉＲＮＡよりも低い頻度ではあるが、クローン化されたｍｉＲＮＡのライブラリーにおいて見出される場合がある。
最初はｍｉＲＮＡ＊との二本鎖の種として存在するにもかかわらず、ｍｉＲＮＡは最終的には、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のリボ核タンパク質複合体の中に一本鎖ＲＮＡとして取り込まれる。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、このことは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制するか、または活性化する）、およびｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のどの鎖がＲＩＳＣに入るかにおける変動性をもたらすことができる。
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣに入るとき、ｍｉＲＮＡ＊は除かれ、分解される。ＲＩＳＣに入るｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の鎖は、５’末端がそれほど強固に対形成しない方の鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両末端がほぼ同等な５’対形成を有する場合には、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の両方が遺伝子サイレンシング活性を有する場合がある。
ＲＩＳＣは、標的核酸を、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間における大きいレベルの相補性に基づいて、とりわけ、ｍｉＲＮＡの２〜７番目のヌクレオチドによる相補性に基づいて特定する。
数多くの研究が、翻訳の効率的な阻害を達成するための、ｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間における塩基対形成要件を調べている（これらがＢａｒｔｅｌ（２００４、Ｃｅｌｌ、１１６−２８１）によって総説される）。哺乳動物細胞では、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ＆Ｓｈａｒｐ、２００４、ＧｅｎｅｓＤｅｖ、２００４−５０４）。しかしながら、ミクロＲＮＡの他の部分もまた、ｍＲＮＡ結合に関与する場合がある。そのうえ、３’における十分な塩基対形成は５’における不十分な対形成を補うことができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ他、２００５、ＰＬｏＳ、３−ｅ８５）。コンピューター計算研究では、ゲノム全体に対するｍｉＲＮＡ結合が分析された場合、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’での２〜７番目の塩基に特異的な役割が示唆されており、しかし、通常では「Ａ」であることが見出される最初のヌクレオチドの役割もまた認められた（Ｌｅｗｉｓ他、２００５、Ｃｅｌｌ、１２０−１５）。同様に、１〜７番目のヌクレオチドまたは２〜８番目のヌクレオチドが、Ｋｒｅｋ他（２００５、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ、３７−４９５）によって、標的を特定し、検証するために使用された。
ｍＲＮＡにおける標的部位が、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域に存在する場合がある。興味深いことに、多数のｍｉＲＮＡが、同じ部位または多数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節する場合がある。多数のｍｉＲＮＡ結合部位がほとんどの遺伝子的に特定された標的に存在することは、多数のＲＩＳＣの協同作用により、最も効率的な翻訳阻害がもたらされることを示し得る。
ｍｉＲＮＡが、ＲＩＳＣに、遺伝子発現を２つの機構、すなわち、ｍＲＮＡ切断または翻訳抑制のどちらかによってダウンレギュレーションさせる場合がある。ｍＲＮＡが、ある特定の程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有するならば、ｍｉＲＮＡにより、ｍＲＮＡの切断が規定される場合がある。ｍｉＲＮＡが切断を導くとき、切れ目は典型的には、ｍｉＲＮＡの１０番目および１１番目の残基に対するヌクレオチド対形成の間である。代替では、ｍｉＲＮＡが、必要な程度の相補性をｍｉＲＮＡに対して有していないならば、ｍｉＲＮＡにより、翻訳が抑制される場合がある。翻訳抑制が動物においてより多く見られる場合がある。これは、動物は、より低い程度の相補性をｍｉＲＮＡと結合部位との間に有する場合があるからである。
どのｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の対の５’末端および３’末端にも、変動性が存在し得ることに留意しなければならない。この変動性は、切断部位に関するＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒの酵素プロセシングにおける変動性に起因する場合がある。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊の５’末端および３’末端における変動性はまた、プリ−ｍｉＲＮＡおよびプレ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する場合がある。ステム鎖のミスマッチにより、異なるヘアピン構造の集団がもたらされる場合がある。ステム構造における変動性はまた、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによる切断の生成物における変動性をもたらす場合がある。
用語「ミクロＲＮＡ模倣体」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成された非コードＲＮＡを示す。ｍｉＲＮＡ模倣体は内因性ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣しており、成熟型二本鎖分子または模倣体前駆体（例えば、またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、修飾された、または修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたは代替となり得る核酸化学（例えば、ＬＮＡまたは２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。他の修飾体が本明細書中下記に記載される。成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体については、二重鎖領域の長さが、１３〜３３ヌクレオチドの間、１８２４ヌクレオチドの間、または２１〜２３ヌクレオチドの間で変化し得る。ｍｉＲＮＡはまた、合計で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個のヌクレオチドを含む場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はプレ−ｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドである場合がある。ｍｉＲＮＡの配列はまた、プレ−ｍｉＲＮＡの最後の１３ヌクレオチド〜３３ヌクレオチドである場合がある。ｍｉＲＮＡの配列は本明細書中に記載された配列のいずれか、またはその変化体を含む場合がある。
間葉系幹細胞を接触することが下記のいくつかの方法で実行される場合があることが、本明細書中に提供される説明から理解されるであろう：
１．間葉系幹細胞を成熟型ｍｉＲＮＡ（または本明細書中下記で記載されるように改変形態）により一過性にトランスフェクションすること。本発明の教示に従って設計されるｍｉＲＮＡは、酵素的合成および固相合成の両方を含めて、当技術分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って作製することができる。固相合成を実行するための様々な設備および試薬が、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学（例えば、シアノエチルホスホルアミダイト）、その後、脱保護、脱塩および精製（例えば、自動トリチル・オン法またはＨＰＬＣによる精製）を利用して、例えば、下記において詳しく記載されるような確立された方法論により達成することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．他編（１９９４、１９８９）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８８）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＧａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”。
２．間葉系幹細胞を、成熟型ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより、またはｍｉＲＮＡ模倣体により安定的または一過性にトランスフェクションすること。
３．間葉系幹細胞を、プレ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プレ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０ヌクレオチド、６０〜８０ヌクレオチド、または６０〜７０ヌクレオチドを含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようなｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊を含む場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はまた、プリ−ｍｉＲＮＡの５’末端および３’末端から０〜１６０個のヌクレオチドを除外するプリ−ｍｉＲＮＡの配列である場合がある。プレ−ｍｉＲＮＡの配列はｍｉＲＮＡの配列、またはその変化体を含む場合がある。
４．間葉系幹細胞を、プリ−ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターにより安定的または一過性にトランスフェクションすること。プリ−ｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３００００ヌクレオチド、５０〜２５０００ヌクレオチド、１００〜２００００ヌクレオチド、１０００〜１５００ヌクレオチド、または８０〜１００ヌクレオチドを含む場合がある。プリ−ｍｉＲＮＡの配列は、本明細書中に示されるようにプレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ＊、ならびに、それらの変化体を含む場合がある。ｍｉＲＮＡ模倣体の調製を化学的合成法によって、または、組換え法によって行うことができる。
ｍｉＲＮＡアンタゴニストが、ｓｉＲＮＡまたは発現ベクター（例えば、Ａｎｔａｇｏｍｉｒなど）のどちらかを使用する当技術分野で公知のトランスフェクションプロトコルを使用して細胞に導入される場合がある。
本明細書中上記で述べられたように、本明細書中に記載されるｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションするポリヌクレオチドが、当技術分野で公知の様々な方法を使用して、修飾ポリヌクレオチドとして提供される場合がある。
例えば、本発明のオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ）またはポリヌクレオチドは、３’から５’へのホスホジエステル連結で結合する、プリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含む場合がある。
好ましく使用されるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中下記で幅広く記載されるように、骨格、ヌクレオシド間連結または塩基のいずれにおいても改変されるものである。
本発明のこの局面に従って有用である好ましいオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの具体的な例には、修飾された骨格または非天然型のヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドには、米国特許第４，４６９，８６３号；米国特許第４，４７６，３０１号；米国特許第５，０２３，２４３号；米国特許第５，１７７，１９６号；米国特許第５，１８８，８９７号；米国特許第５，２６４，４２３号；米国特許第５，２７６，０１９号；米国特許第５，２７８，３０２号；米国特許第５，２８６，７１７号；米国特許第５，３２１，１３１号；米国特許第５，３９９，６７６号；米国特許第５，４０５，９３９号；米国特許第５，４５３，４９６号；米国特許第５，４５５，２３３号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７６，９２５号；米国特許第５，５１９，１２６号；米国特許第５，５３６，８２１号；米国特許第５，５４１，３０６号；米国特許第５，５５０，１１１号；米国特許第５，５６３，２５３号；米国特許第５，５７１，７９９号；米国特許第５，５８７，３６１号；および米国特許第５，６２５，０５０号に開示されるように、リン原子を骨格に保持するものが含まれる。
好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格または修飾ポリヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオアート；キラルなホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；ホスホトリエステル；アミノアルキルホスホトリエステル；メチルホスホナートおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルなホスホナートを含む）；ホスフィナート；ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）；チオノホスホルアミダート；チオノアルキルホスホナート；チオノアルキルホスホトリエステル；ならびに、通常の３’−５’連結を有するボラノホスファート、これらの２’−５’連結アナログ、および、逆の極性を有するもの（この場合、ヌクレオシドユニットの隣接する対が、３’−５’から５’−３’に、または、２’−５’から５’−２’に連結される）が含まれる。上記修飾体の様々な塩、混合塩および遊離酸形態もまた使用することができる。
代替において、リン原子を骨格に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格または修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルの混合型ヌクレオシド間連結、あるいは、１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子ヌクレオシド間連結または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらには、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，２６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；および米国特許第５，６７７，４３９号に開示されるように、（部分的にはヌクレオシドの糖部分から形成される）モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびメチレンチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびに、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合成分部分を有する他のものが含まれる。
本発明に従って使用されることがある他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、糖およびヌクレオシド間連結の両方において修飾されるものであり、すなわち、ヌクレオチドユニットの骨格が新規な基により置き換えられる。塩基ユニットは、適切なポリヌクレオチド標的との相補のために維持される。そのようなオリゴヌクレオチド模倣体の一例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）により置き換えられるオリゴヌクレオチドを示す。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号が含まれるが、これらに限定されない（これらのそれぞれが参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明において使用されることがある他の骨格修飾が米国特許第６３０３３７４号に開示される。
本発明のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、塩基修飾または塩基置換を含む場合がある。本明細書中で使用される場合、「非修飾」塩基または「天然型」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびに、ピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。「修飾（された）」塩基には、他の合成塩基および天然型塩基、例えば、下記の塩基が含まれるが、それらに限定されない：５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチル誘導体および他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピル誘導体および他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プセウドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換されたアデニンおよびグアニン；５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換されたウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン；ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン。さらなる修飾塩基には、下記において開示される修飾塩基が含まれる：米国特許第３６８７８０８号；Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．他（１９９０）、“Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、８５８頁〜８５９頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ他（１９９１）、“Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ”、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０、６１３；および、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、第１５章、２８９頁〜３０２頁、Ｓ．Ｔ．ＣｒｏｏｋｅおよびＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９３。そのような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン類、ならびに、Ｎ−２−置換プリン、Ｎ−６−置換プリンおよびＯ−６−置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）が含まれる。５−メチルシトシン置換体は、核酸二重鎖の安定性を０．６℃〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．他（１９９３）、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、２７６頁〜２７８頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、現時点では好ましい塩基置換体であり、一層より具体的には、２’−Ｏ−メトキシエチルによる糖修飾と組み合わされるときには好ましい塩基置換体である。
ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを調節するポリヌクレオチド作用因を間葉系幹細胞または神経幹細胞において発現させるために、ｍｉＲＮＡ（またはプレ−ｍｉＲＮＡ、またはプリ−ｍｉＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションするポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド配列が好ましくは、間葉系幹細胞（または神経幹細胞）での発現のために好適である核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物は、細胞におけるポリヌクレオチド配列の転写を構成的様式または誘導可能な様式で行わせるためのプロモーター配列を含む。
本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物ではまた、所望される活性（例えば、運動ニューロン分化能または神経幹細胞分化能など）を示すｍｉＲＮＡホモログが利用され得ることが理解されるであろう。そのようなホモログは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して求められる場合（ただし、この場合、ギャップ重みが５０に等しく、長さ重みが３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しい）、例えば、本明細書中上記で記載される配列のいずれかに対する同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であることが可能である。
加えて、ホモログは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して求められる場合（ただし、この場合、ギャップ重みが５０に等しく、長さ重みが３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しい）、例えば、本明細書中上記で記載される配列に対する同一性が少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であることが可能である。
本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である構成的プロモーターが、ほとんどの環境条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性であるプロモーター配列であり、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などである。本発明のいくつかの実施形態との使用のために好適である誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｚａｂａｌａ Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。
真核生物プロモーターは典型的には、２つのタイプの認識配列、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位から２５塩基対〜３０塩基対上流に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼにＲＮＡ合成を開始させることに関与すると考えられている。もう一方の上流プロモーターエレメントにより、転写が開始される速度が決定される。
好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換された特定の細胞集団において、すなわち、間葉系幹細胞または神経幹細胞において活性である。
エンハンサーエレメントは、連結されている同種または異種プロモーターから転写を１０００倍にまで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流側または上流側に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは幅広い宿主範囲を有しており、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーが多くの細胞タイプのために好適である。本発明のいくつかの実施形態のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶなど）から得られる長末端反復に由来する組合せが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８３）を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
発現ベクターの構築において、プロモーターは好ましくは、異種の転写開始部位からの距離がその天然の環境における転写開始部位からの距離とおよそ同じで配置される。しかしながら、当技術分野では公知のように、この距離におけるいくらかの変動が、プロモーター機能を失うことなく受け入れられ得る。
既に記載されたエレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または組換えＤＮＡを有する細胞の特定を容易にするために意図される他の特化したエレメントを含有する場合がある。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外での複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子または宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のどちらかによって提供される限り、エピソームとして複製される。
ベクターは真核生物レプリコンを含む場合があり、または含まない場合がある。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅を行うことができない。代わりに、組換えＤＮＡが、操作された細胞のゲノムに一体化し、この場合、その細胞において、プロモーターにより、所望される核酸の発現が導かれる。
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。他の発現ベクターはＳＢＩまたはＳｉｇｍａから入手可能である。
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）から得られる調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０系ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および任意の、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されるＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳ガンウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは他のプロモーターの指示のもとでのタンパク質の発現を可能にする他のベクターが含まれる。
上記で記載されるように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構を逃れるために進化してきた非常に特殊化された感染性作用因である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、伝播する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的とし、かつ、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。したがって、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存するであろう。好適なベクターを形質転換された細胞タイプに従って選択できることは、十分に当業者の能力の範囲内であり、そのようなものとして、選択での考慮の一般的記載は本明細書中には提供されない。例えば、骨髄細胞を、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができ、また、腎臓細胞が、Ｌｉａｎｇ ＣＹ他（２００４）（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ、１４９：５１〜６０）に記載されるようなバキュロウイルスのオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化される場合がある。
１つの実施形態によれば、レンチウイルスベクターが、間葉系幹細胞または神経幹細胞をトランスフェクションするために使用される。
様々な方法を、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターを間葉系幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．（１９８８）、およびＧｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４〜５１２、１９８６］において一般的に記載されており、また、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選抜方法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きいトランスフェクション効率をウイルスの感染性のために得ることができるので、他の方法（例えば、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなど）を上回るいくつかの利点を提供する。
非ウイルス性である他のベクター、例えば、カチオン性脂質、ポリリシンおよびデンドリマーなどを使用することができる。
ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣体およびプレ−ｍｉＲは、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子など）を使用して、または、酸化第二鉄磁性ＮＰによってもまた、細胞にトランスフェクションすることができる。例えば、Ｇｈｏｓｈ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３（Ｊａｎ）、３４（３）：８０７〜１６；Ｃｒｅｗ Ｅ他、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１２（Ｊａｎ）、３、８４（１）：２６〜９を参照のこと。
組込みを伴わないトランスフェクションの他の様式には、小環状ＤＮＡベクターの使用、またはゲノムから後で除くことができる遺伝子のトランスフェクションを可能にするＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの使用が含まれる。
本明細書中上記で述べられたように、様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のいくつかの実施形態のｍｉＲＮＡまたは当該ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることができるポリヌクレオチド作用因を発現させるための宿主発現系として使用することができる。これらには、微生物、例えば、コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、組換えプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたは組換えコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌、コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母；コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染させられる植物細胞系、または、コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物発現系もまた、本発明のいくつかの実施形態のｍｉＲＮＡを発現させるために使用することができる。
細菌用構築物の例には、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのｐＥＴシリーズが含まれる［Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５：６０〜８９）。
酵母においては、米国特許第５９３２４４７号に開示されるように、構成的または誘導可能なプロモーターを含有する数多くのベクターを使用することができる。代替では、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
間葉系幹細胞または神経幹細胞を接触させるために使用される条件が、ｍｉＲＮＡ（またはその阻害剤）がその分化を誘導することを可能にする期間／細胞濃度／ｍｉＲＮＡ濃度／細胞とｍｉＲＮＡとの間の比率について選択される。本発明者らはさらに、運動ニューロン系譜または神経幹細胞系譜に向かう分化を促進させる分化因子との幹細胞のインキュベーションを意図する。そのような分化因子とのインキュベーションが、ｍｉＲＮＡと接触させることの前に、ｍｉＲＮＡと接触させることと同時に、または、ｍｉＲＮＡと接触させることの後で実行される場合がある。そのような作用因の様々な例が本明細書中下記の実施例の節において提供される。
代替において、または、加えて、間葉系幹細胞は、発現構築物を使用して、例えば、本明細書中上記で記載される発現構築物などを使用して、そのような分化因子を発現するように遺伝子改変される場合がある。
分化工程の期間中またはその後において、幹細胞はそれらの分化状態についてモニターされる場合がある。細胞分化を、分化を示すことが公知の細胞特異的マーカーまたは組織特異的マーカーを調べたときに明らかにすることができる。
例えば、神経幹細胞は、ネスチンおよびＳＯＸ−２の少なくとも１つを発現する場合がある。さらなるマーカーには、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＰＳＡ−ＮＣＡＭおよびＭＵＳＡＳＨＩ−１が含まれる。
下記は、運動ニューロンへの分化を確認するために使用され得るマーカーの列挙である：ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、Ｃｈｏｘ１０、Ｅｎ１、Ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄ（Ｅｖｅ）、転写因子、Ｅｖｘ１／２、線維芽細胞増殖因子−１（ＦＧＦ１または酸性ＦＧＦ）、ＨＢ９、Ｉｓｌ１（Ｉｓｌｅｔ−１）、Ｉｓｌ２、Ｉｓｌｅｔ１／２、Ｌｉｍ３、ｐ７５（ＮＴＲ）（ｐ７５ニューロトロフィン受容体）、ＲＥＧ２、Ｓｉｍ１、ＳＭＩ３２（ＳＭＩ−３２）およびＺｆｈ１。
組織／細胞特異的なマーカーを、当技術分野で周知の免疫学的技術を使用して検出することができる［Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ他（１９９８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５〜７］。例には、膜結合マーカーのためのフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーのための免疫組織化学、ならびに、分泌された分子マーカーのための酵素免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載される方法に従って得られる細胞は、特定の細胞タイプについて、例えば、始原体細胞タイプまたは成熟型細胞タイプについて富化されることがあることが理解されるであろう。したがって、例えば、分化時間が、より初期の始原体タイプ（例えば、下記のマーカー、すなわち、ネスチン、ｏｌｉｇ２およびＳｏｘ２の少なくとも１つを発現するもの）またはより後期の成熟型細胞タイプ（例えば、下記のマーカー、すなわち、ＣｈＡＴ、ｉｓｌｅｔ１、ＨＢ９およびβ３チューブリンの少なくとも１つを発現するもの）を得るために選択される場合がある。
特定の細胞タイプのさらなる富化が、細胞分取技術（例えば、ＦＡＣＳおよび磁気分取など）を使用して実行される場合がある。
加えて、細胞分化の後には、ＧＦＰまたはＲＦＰによりタグ化され、増大した蛍光を分化時に示す特異的レポーターを伴うことができる。
アップレギュレーションのために提案される本発明のｍｉＲＮＡの標的を決定することによって、本発明の範囲が、ｍｉＲＮＡと接触させること以外の手段による当該標的のダウンレギュレーションを包含するために拡大され得ることが理解されるであろう。それに対応して、ダウンレギュレーションのために提案される本発明のｍｉＲＮＡの標的を決定することによって、本発明の範囲が、当該標的のアップレギュレーションを包含するために拡大され得ることが理解されるであろう。
例えば、本発明者らは、ｍｉＲ−１３７の標的の１つが、Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）であることを示している。したがって、本発明では、神経幹細胞系譜に向かう分化がこのタンパク質のダウンレギュレーションによって実行させられることがあることが意図される。
したがって、本発明の別の局面によれば、神経幹細胞を作製する方法であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）の量および／または活性をダウンレギュレーションする作用因と接触させ、それにより、前記神経幹細胞を作製することを含む方法が提供される。
Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）が、２つのグループによってヒトＧＢＭ細胞株からクローン化され、神経膠腫病理発生関連タンパク質、すなわち、ＧＬＩＰＲ１またはＲＴＶＰ−１と名づけられた［Ｒｉｃｈ Ｔ他、Ｇｅｎｅ、１９９６、１８０：１２５〜３０］（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。ＲＴＶＰ−１は、ＴＰＸ−１、毒液アレルゲン抗原５、および、植物病理発生関連タンパク質のグループ１（ＰＲ−１）を含む他のＲＴＶＰ−１ホモログにもまた見出される未だに不明の機能とともに、推定されるシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびＳＣＰドメインを含有する。
ＲＴＶＰ−１（または本発明の他のｍｉＲＮＡ標的のいずれか）のダウンレギュレーションを、転写および／または翻訳を妨げる様々な分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング作用因、リボザイム、ＤＮＡザイムおよびアンチセンス）を使用してゲノムレベルおよび／または転写物レベルで、あるいは、例えば、アンタゴニスト、および、当該ポリペプチドを切断する酵素などを使用してタンパク質レベルで得ることができる。
下記は、ＲＴＶＰ−１の発現レベルおよび／または活性をダウンレギュレーションすることができる作用因の列挙である。
ＲＴＶＰ−１をダウンレギュレーションすることができる作用因の一例が、それに特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントである。好ましくは、抗体は、細胞によって内部に取り入れられ、核に進入することができる。
本発明で使用される用語「抗体」は、無傷の分子、並びにその機能的なフラグメント、例えば、マクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを意味する。これらの機能的な抗体フラグメントは次のように定義される：（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有するフラグメントであり、完全な抗体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖と、一方の重鎖の一部とを生じさせることによって作製することができる；（２）Ｆａｂ’は、完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元して、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせることによって得ることができる抗体分子のフラグメントである；２つのＦａｂ’フラグメントが１つの抗体分子あたり得られる；（３）（Ｆａｂ’）２は、その後の還元を行うことなく、完全な抗体を酵素ペプシンで処理することによって得ることができる抗体のフラグメントである；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’フラグメントのダイマーである；（４）Ｆｖは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝子的に融合された単一鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子である。
ＲＴＶＰ−１のダウンレギュレーションはまた、ＲＮＡサイレンシングによって達成することができる。本明細書中で使用される場合、表現「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される一群の調節機構［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）、相互抑制および翻訳抑制］を示す。ＲＮＡサイレンシングが、植物、動物およびカビを含む多くのタイプの生物において認められている。
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡサイレンシング作用因」は、標的遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」を行うことができるＲＮＡを示す。特定の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因はｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を転写後のサイレンシング機構により妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング作用因には、非コードＲＮＡ分子、例えば、対形成した鎖を含むＲＮＡ二重鎖、同様にまた、そのような小さい非コードＲＮＡを生じさせることができる前駆体ＲＮＡが含まれる。１つの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因はＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング作用因は翻訳抑制を媒介することができる。
ＲＮＡ干渉は、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを示す。植物における対応するプロセスが転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと一般に呼ばれ、これはまた、カビではクエリングと呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられており、多種多様な植物および動物によって一般に共有される。外来遺伝子発現からのそのような保護は、相同的な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して、ウイルス感染に由来するか、または、宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントのランダムな組み込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して進化してきたかもであり得る。
細胞における長いｄｓＲＮＡの存在により、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知のｄｓＲＮＡの小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来する短い干渉性ＲＮＡは、長さが典型的には約２１〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二重鎖を含む。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な配列を有する一般鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体（これは一般にはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる）を特徴とする。標的ＲＮＡの切断が、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において生じる。
したがって、本発明では、ｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレーションするためのｄｓＲＮＡの使用が意図される。
１つの実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは３０ｂｐ超である。長いｄｓＲＮＡ（すなわち、３０ｂｐ超のｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこれらのより長い領域がインターフェロン応答およびＰＫＲ応答の誘導を生じさせるであろうという考えのために非常に限定されている。しかしながら、長いｄｓＲＮＡの使用は下記の点で数多くの利点をもたらすことができる：細胞は、数多くのｓｉＲＮＡを試験しなければならないことを緩和する最適なサイレンシング配列を選択することができる；長いｄｓＲＮＡは、サイレンシングライブラリーが、ｓｉＲＮＡのために必要であろうと思われるよりも少ない複雑性を有することを可能にするであろう；および、おそらくは最も重要であるが、長いｄｓＲＮＡは、治療剤として使用されたときにはウイルスの回避変異を防止し得ると思われる。
様々な研究により、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導したり著しい標的外影響を引き起こすことなく、遺伝子発現を沈黙させるために使用され得ることが明らかにされる。例えば、［Ｓｔｒａｔ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３ ３８０３−３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａ他 Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．他，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．他，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４］を参照のこと。
特に、本発明ではまた、インターフェロン経路が活性化されない細胞（例えば、胚性細胞および卵母細胞）における遺伝子サイレンシングのための長いｄｓＲＮＡ（３０塩基を超える転写物）の導入が意図される。例えば、Ｂｉｌｌｙ他，ＰＮＡＳ ２００１，Ｖｏｌ ９８，ｐａｇｅｓ １４４２８−１４４３３．ａｎｄ Ｄｉａｌｌｏ他，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ １，２００３，１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと。
本発明ではまた、遺伝子発現をダウンレギュレーションするための、インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を誘導しないために特に設計される長いｄｓＲＮＡの導入が意図される。例えば、ＳｈｉｎａｇａｗａおよびＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ、１７（１１）：１３４０〜１３４５、２００３］は、長い二本鎖ＲＮＡをＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーターから発現するために、ｐＤＥＣＡＰと名づけられるベクターを開発している。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓＲＮＡ輸出を促進させる５’キャップ構造および３’ポリ（Ａ）テールの両方を欠くので、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を誘導しない。
インターフェロン経路およびＰＫＲ経路を哺乳動物系において避ける別の方法が、小さい阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、トランスフェクションまたは内因性発現のどちらかを介して導入することによるものである。
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小さい阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般には１８〜３０塩基対の間）を示す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐの二重鎖領域および両末端における対称的な２塩基の３’突出部を有する２１マー体として化学合成されており、だが、２５〜３０塩基の長さの化学合成されたＲＮＡ二重鎖が、同じ場所において２１マー体と比較して、効力において１００倍もの増大を有し得ることが近年には記載されている。ＲＮＡｉの誘発において長いＲＮＡを使用するほど得られる効力が増大していたのが観測されたが、これは、ダイサーに生成物（２１マー体）の代わりに基質（２７マー体）を提供すること、また、このことにより、ｓｉＲＮＡ二重鎖がＲＩＳＣに進入する速度または効率が改善されることから生じるためと理論化される。
３’突出の位置がｓｉＲＮＡの効力に影響すること、および、３’突出をアンチセンス鎖に有する非対称的な二重鎖が、３’突出をセンス鎖に有するものよりも一般に強力であることが見出されている（Ｒｏｓｅ他、２００５）。このことは、逆の効力パターンが、アンチセンス転写物を標的とするときに認められるので、非対称的な鎖がＲＩＳＣに入ることに起因すると考えられ得る。
二本鎖の干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖が、ヘアピン構造またはステム−ループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するためにつながれる場合がある。したがって、述べられたように、本発明のＲＮＡサイレンシング作用因はまた、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である場合がある。
用語「ｓｈＲＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第１および第２の領域を含む、ステム−ループ構造を有するＲＮＡ作用因を示し、ただし、この場合、これらの領域の相補性の程度および配向が、塩基対形成がこれらの領域の間で生じるように十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によってつながれ、ループが、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）の間での塩基対形成がないことから生じる。ループにおけるヌクレオチドの数は、３〜２３の間の数（３および２３を含む）、または、５〜１５の間の数（５および１５を含む）、または、７〜１３の間の数（７および１３を含む）、または、４〜９の間の数（４および９を含む）、または、９〜１１の間の数（９および１１を含む）である。ループにおけるヌクレオチドのいくつかは、ループにおける他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与することができる。ループを形成させるために使用することができるオリゴヌクレオチド配列の例には、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．他（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６：５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．他（２００２）、ＲＮＡ、８：１４５４）が含まれる。生じた一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ装置と相互作用することができる二本鎖領域を含むステム−ループ構造またはヘアピン構造を形成することが当業者によって認識されるであろう。
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング作用因は、本明細書中上記でさらに記載されるように、ｍｉＲＮＡである場合がある。
本発明との使用のために好適であるＲＮＡサイレンシング作用因の合成が下記のように実行され得る。最初に、ｍｉＲＮＡ標的のｍＲＮＡ配列（例えば、ＣＴＧＦ配列）がＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンから下流に走査される。それぞれのＡＡおよびその３’側の隣接する１９ヌクレオチドの存在が、可能性のあるｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくは、ｓｉＲＮＡ標的部位がオープンリーディングフレームから選択される。これは、非翻訳領域（ＵＴＲ）には調節タンパク質結合部位がより多いからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる場合がある［Ｔｕｓｃｈｌ、ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ、２：２３９〜２４５］。だが、非翻訳領域に向けられるｓｉＲＮＡもまた、５’ＵＴＲに向けられるｓｉＲＮＡがＧＡＰＤＨの細胞ｍＲＮＡにおける約９０％の低下を媒介し、かつ、タンパク質レベルを完全になくしたＧＡＰＤＨについて明らかにされるように（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）、効果的である場合があることが理解されるであろう。
次に、可能性のある標的部位が、任意の配列アライメントソフトウエア（例えば、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウエアなど）を使用して適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラットなど）に対して比較される。他のコード配列に対する有意な相同性を示す推定される標的部位が取り出される。
条件を満たす標的配列が、ｓｉＲＮＡ合成のためのテンプレートとして選択される。好ましい配列が、低いＧ／Ｃ含有量を含む配列である。これらは、Ｇ／Ｃ含有量が５５％よりも大きい配列と比較して、遺伝子サイレンシングを媒介することにおいてより効果的であることが判明しているからである。いくつかの標的部位が好ましくは、評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択される。選択されたｓｉＲＮＡのより良い評価のために、陰性対照が好ましくは、併せて使用される。陰性対照ｓｉＲＮＡは好ましくは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含み、しかし、ゲノムに対する有意な相同性を有していない。したがって、任意の他の遺伝子に対しても有意な相同性を何ら示さないならば、ｓｉＲＮＡのスクランブル型ヌクレオチド配列が好ましくは使用される。
本発明のＲＮＡサイレンシング作用因は、少なくとも１つの異なる連結（例えば、ホスホルアミダート連結、ホスホロチオアート連結、ホスホロジチオアート連結またはＯ−メチルホスホロアミダイト連結ならびにペプチド核酸の骨格および連結）を有することがある核酸アナログを含む場合がある。他のアナログ核酸には、米国特許第５２３５０３３号および同第５０３４５０６号（これらは参照によって組み込まれる）に記載されるものを含む、正荷電骨格を有するもの、非イオン性骨格を有するもの、および、非リボース骨格を有するものが含まれる。天然に存在しない、または修飾された１つまたは複数のヌクレオチドを含有する核酸もまた、核酸の１つの定義に含まれる。修飾されたヌクレオチドアナログが、例えば、核酸分子の５’末端および／または３’末端に位置する場合がある。ヌクレオチドアナログの代表的な例が、糖修飾または骨格修飾のリボヌクレオチドから選択される場合がある。しかしながら、また、核酸塩基修飾のリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在しない核酸塩基を天然に存在する核酸塩基の代わりに含有するリボヌクレオチド、例えば、５位で修飾されるウリジン化合物またはシチジン化合物（例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン）、８位で修飾されるアデノシン化合物およびグアノシン化合物（例えば、８−ブロモグアノシン）、デアザヌクレオチド（例えば、７−デアザ−アデノシン）、Ｏ−アルキル化ヌクレオチドおよびＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えば、Ｎ６−メチルアデノシン）などが好適であることには留意しなければならない。２’−ＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮから選択される基によって置換される場合があり、ただし、この場合、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。修飾されたヌクレオチドにはまた、例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ他、Ｎａｔｕｒｅ、４３８：６８５〜６８９（２００５）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ他、Ｎａｔｕｒｅ、４３２：１７３〜１７８（２００４）、および、米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号（これらは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなヒドロキシプロリノール連結を介してコレステロールとコンジュゲートされるヌクレオチドが含まれる。さらなる修飾されたヌクレオチドおよび核酸が米国特許出願公開第２００５０１８２００５号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される。リボース−リン酸骨格の修飾が、様々な理由のために、例えば、そのような分子の生理学的環境における安定性および半減期を増大させるために、細胞膜を横断する拡散を高めるために、または、バイオチップ上のプローブとして行われる場合がある。骨格の修飾はまた、分解に対する抵抗性を、例えば、細胞の過酷なエンドサイトーシス環境などにおいて高める場合がある。骨格の修飾はまた、例えば、肝臓および腎臓などにおける肝細胞による核酸クリアランスを低下させる場合がある。天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製される場合がある；代替では、種々の核酸アナログの混合物、ならびに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物が作製される場合がある。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるＲＮＡサイレンシング作用因は、細胞透過性ペプチドと機能的に関連することができる。本明細書中で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」は、細胞の形質膜および／または核膜を横断する膜透過性複合体の輸送を伴うエネルギー非依存的（すなわち、非エンドサイトーシス的）転位置性を与える短い（約１２〜３０残基の）アミノ酸配列または機能的モチーフを含むペプチドである。本発明の膜透過性複合体において使用される細胞透過性ペプチドは好ましくは、少なくとも１つの非機能的なシステイン残基を含み、この場合、この非機能的システイン残基はフリーであるか、または、そのような連結のために改変されている二本鎖リボ核酸とのジスルフィド連結を形成するために誘導体化されるかのどちらかである。そのような性質を与える代表的なアミノ酸モチーフが米国特許第６３４８１８５号に列挙される（その内容は明示的に、参照によって本明細書中に組み込まれる）。本発明の細胞透過性ペプチドには好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓ１、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳおよびＭＡＰが含まれるが、これらに限定されない。
ＲＴＶＰ−１をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、ＣＴＧＦのｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。ＤＮＡザイムは、一本鎖標的配列および二本鎖標的配列の両方を切断することができる一本鎖のポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．およびＪｏｙｃｅ，Ｇ．、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４３：４２６２）。ＤＮＡザイムのための一般的なモデル（“１０−２３”モデル）が提案されている。“１０−２３”ＤＮＡザイムは、１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒作用ドメインを有しており、この触媒作用ドメインには、それぞれが７個〜９個のデオキシリボヌクレオチドである２つの基質認識ドメインが隣接している。このタイプのＤＮＡザイムはその基質ＲＮＡをプリン：ピリミジン接合部において効果的に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９；ＤＮＡザイムの総説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ［Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、４：１１９〜２１（２００２）を参照のこと］。
一本鎖標的切断部位および二本鎖標的切断部位を認識する合成される操作されたＤＮＡザイムの構築および増幅の様々な例が米国特許第６３２６１７４号（Ｊｏｙｃｅ他）に開示されている。
ＲＴＶＰ−１のダウンレギュレーションはまた、ＲＴＶＰ−１をコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイゼーションすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを使用することによって得ることができる。
ＲＴＶＰ−１を効率的にダウンレギュレーションするために使用することができるアンチセンス分子の設計は、アンチセンス取り組みにとって重要である２つの側面を考慮に入れなければならない。第１の側面が、適切な細胞の細胞質へのオリゴヌクレオチドの送達であり、一方、第２の側面が、設計されたｍＲＮＡと、その翻訳を阻害する様式で細胞内で特異的に結合するオリゴヌクレオチドの設計である。
先行技術は、オリゴヌクレオチドを広範囲の様々な細胞タイプに効率的に送達するために使用することができる数多くの送達戦略を教示する［例えばＬｕｆｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７６：７５−６（１９９８）；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ他 Ｂｌｏｏｄ ９１：８５２−６２（１９９８）；Ｒａｊｕｒ他 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ８：９３５−４０（１９９７）；Ｌａｖｉｇｎｅ他 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７：５６６−７１（１９９７）ａｎｄ Ａｏｋｉ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３１：５４０−５（１９９７）を参照のこと］。
加えて、最大の予測された結合親和性をそれらの標的ｍＲＮＡについて有するそのような配列を、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造変化のエネルギー論を説明する熱力学的サイクルに基づいて特定するためのアルゴリズムもまた利用可能である［例えば、Ｗａｌｔｏｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、６５：１〜９（１９９９）を参照のこと］。
そのようなアルゴリズムが、細胞におけるアンチセンス取り組みを実行するために首尾よく使用されている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ他によって開発されたアルゴリズムは、科学者がウサギベータ−グロビン（ＲＢＧ）およびマウス腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦアルファ）の転写物のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを首尾よく設計することを可能にした。同じ研究グループはより近年には、合理的に選択されたオリゴヌクレオチドの、細胞培養物における３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢならびにラットｇｐ１３０）に対するアンチセンス活性が、動的ＰＣＲ技術によって評価された場合、ホスホジエステルオリゴヌクレオチド化学およびホスホロチオアートオリゴヌクレオチド化学を用いた２つの細胞タイプにおける３つの異なる標的に対する試験を含む、ほとんどすべての場合において効果的であることが判明したことを報告している。
加えて、特異的なオリゴヌクレオチドを設計し、その効率を、インビトロ系を使用して予測するためのいくつかの取り組みもまた発表された（Ｍａｔｖｅｅｖａ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：１３７４〜１３７５（１９９８）］。
ＲＴＶＰ−１をダウンレギュレーションすることができる別の作用因が、ＲＴＶＰ−１をコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。様々なリボザイムが、目的とするタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の配列特異的な阻害のためにますます使用されている［Ｗｅｌｃｈ他、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９：４８６〜９６（１９９８）］。リボザイムを、任意の特異的な標的ＲＮＡを切断するために設計することができることにより、リボザイムは基礎的研究および治療的応用の両方において有益なツールになっている。
ＲＴＶＰ−１遺伝子の発現を細胞において調節するさらなる方法が、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を介するものである。近年の研究では、二本鎖のらせん状ＤＮＡにおけるポリプリン／ポリピリミジン領域を配列特異的様式で認識し、かつ、当該領域に結合することができるＴＦＯが設計され得ることが示されている。これらの認識規則が、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４５：７２５〜７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７、２３８：６４５〜６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２、２５１：１３６０〜１３６３；Ｃｏｏｎｅｙ，Ｍ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８、２４１：４５６〜４５９；およびＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．他、欧州特許公開第３７５４０８号によって概略される。そのようなオリゴヌクレオチドの改変、例えば、インターカレーターおよび骨格置換の導入など、ならびに、結合条件（ｐＨおよびカチオン濃度）の最適化は、ＴＦＯ活性に対する固有的障害（例えば、電荷反発および不安定性など）を克服することを助けており、また、近年には、合成オリゴヌクレオチドが特異的配列に対して標的化され得ることが示された（近年の総説については、ＳｅｉｄｍａｎおよびＧｌａｚｅｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ、２００３、１１２：４８７〜９４を参照のこと）。
一般には、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは下記の配列対応を有する：
オリゴ ３’−−Ａ Ｇ Ｇ Ｔ
二重鎖 ５’−−Ａ Ｇ Ｃ Ｔ
三重鎖 ３’−−Ｔ Ｃ Ｇ Ａ
しかしながら、Ａ−ＡＴ三重鎖およびＧ−ＧＣ三重鎖が最大の三重らせん安定性を有することが示されている（ＲｅｉｔｈｅｒおよびＪｅｌｔｓｃｈ、ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００２、Ｓｅｐｔ １２、Ｅｐｕｂ）。同じ著者らは、Ａ−ＡＴおよびＧ−ＧＣの規則に従って設計されるＴＦＯは非特異的な三重鎖を形成しないことを明らかにしており、このことは、三重鎖形成が実際に配列特異的であることを示している。
三重鎖形成オリゴヌクレオチドは好ましくは、長さが少なくとも１５、より好ましくは２５、さらにより好ましくは３０ヌクレオチド以上であり、最大でも５０ｂｐまたは１００ｂｐである。
ＴＦＯによる（例えば、カチオン性リポソームを介した）細胞のトランスフェクションおよび標的ＤＮＡとの三重らせん構造の形成は、立体的および機能的な変化を誘導し、これにより、転写の開始および伸長を阻止し、内因性ＤＮＡにおける所望される配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特異的なダウンレギュレーションを生じさせる。ＴＦＯにより処置される細胞における遺伝子発現のそのような抑制の例には、哺乳動物細胞におけるエピソームのｓｕｐＦＧ１遺伝子および内因性のＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ他、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、１９９９、２７：１１７６〜８１、および、Ｐｕｒｉ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００１、２７６：２８９９１〜９８）、ならびに、Ｅｔｓ２転写因子（これは前立腺ガンの病因において重要である）（Ｃａｒｂｏｎｅ他、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、２００３、３１：８３３〜４３）および前炎症性ＩＣＡＭ−１遺伝子（Ｂｅｓｃｈ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００２、２７７：３２４７３〜７９）の発現の配列特異的かつ標的特異的なダウンレギュレーションが含まれる。加えて、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌは近年、配列特異的なＴＦＯはｄｓＲＮＡに結合することができ、これにより、ｄｓＲＮＡ依存性酵素（例えば、ＲＮＡ依存性キナーゼなど）の活性を阻害することができることを示している（ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０００、２８：２３６９〜７４）。
加えて、上記原則に従って設計されるＴＦＯは、ＤＮＡ修復を実行することができる定方向突然変異誘発を誘導することができ、したがって、内因性遺伝子の発現のダウンレギュレーションおよびアップレギュレーションの両方をもたらすことができる（ＳｅｉｄｍａｎおよびＧｌａｚｅｒ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、２００３、１１２：４８７〜９４）。効果的なＴＦＯの設計、合成および投与の詳細な記載を、米国特許出願公開第２００３０１７０６８号および同第２００３００９６９８０（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ他）、米国特許出願公開第２００２０１２８２１８号および同第２００２０１２３４７６号（Ｅｍａｎｕｅｌｅ他）、ならびに、米国特許第５７２１１３８号（Ｌａｗｎ）において見出すことができる。
間葉系幹細胞を接触させるために使用される条件が、ＲＴＶＰ−１ダウンレギュレーション作用因がその分化を誘導することを可能にする期間／細胞濃度／ＲＴＶＰ−１ダウンレギュレーション作用因の濃度／細胞とＲＴＶＰ−１ダウンレギュレーション作用因との間の比率について選択される。
本明細書中に記載される方法に従って得られる単離された細胞集団は典型的には不均一であり、だが、均一な細胞集団もまた意図される。
特定の実施形態によれば、細胞集団は、外因性ｍｉＲＮＡまたは当該ｍｉＲＮＡをダウンレギュレーションすることができるポリヌクレオチド作用因を発現するように遺伝子改変される。
用語「単離された」は、本明細書中で使用される場合、その生体内場所（例えば、骨髄、神経組織）から取り出されている細胞の集団を示す。好ましくは、単離された細胞集団は、その生体内場所に存在する他の物質（例えば、他の細胞）を実質的に含んでいない。
細胞集団は、細胞の約５０％超（代替では、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、または、それどころか、約９５％超）が、運動ニューロンについてのマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つを発現するか、または、神経幹細胞についてのマーカーの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つを発現するように選択される場合がある。
細胞の特定の亜集団の単離が、細胞の蛍光活性化細胞分取および／または磁気分離を含む当技術分野で公知の技術を使用して実行される場合がある。
本発明のこの局面の集団の細胞は、細胞サイズ、細胞形状、オルガネラサイズおよびオルガネラ数を含む構造的な運動ニューロン表現型または神経幹細胞表現型を含む場合がある。これらの構造的表現型が、顕微鏡技術（例えば、走査型電子顕微鏡法）を使用して分析される場合がある。抗体または色素が、分析を助けるための識別特徴を強調するために使用される場合がある。
本発明の細胞および細胞集団は様々な治療目的のために有用でありうる。本明細書で記載される細胞で有益に治療しうるＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害の代表的な例には、疼痛性障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、精神疾患および痙攣性障害が含まれるが、これらに限定されない。
そのような状態のより具体的な例には、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチントン病、自己免疫性脳脊髄炎、脊髄損傷、脳性まひ、糖尿病性神経障害、緑内障性（ｇｌａｕｃａｔｏｍｕｓ）神経障害、黄斑変性、動作時振戦および遅発性ジスキネジー、パニック、不安、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病的行動、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、躁うつ疾患、アルツハイマー病ならびにてんかんが含まれるが、これらに限定されない。
分化ＭＳＣの使用はまた、脊髄傷害を含む神経系の外傷性病変を処置するために、また、出血または血栓症または塞栓症によって引き起こされる卒中を処置するためにも適応される場合がある。これは、神経形成を誘導し、かつ、損傷ニューロンに対する傷害を最小限に抑えるための生存因子を提供することが必要であるからである。
本発明の運動ニューロン様細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽性球麻痺および進行性球麻痺（これらに限定されない）を含めて様々な運動ニューロン疾患のために有用である場合がある。
本明細書中に記載される方法のどれにおいても、細胞が、自己、半同種または非自己（すなわち、同種または異種）のヒトのドナーまたは胚または臍帯／胎盤から得られる場合がある。例えば、細胞がヒト死体またはドナー対象から単離される場合がある。
半同種の用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩの遺伝子座においてレシピエント細胞に対して部分的に一致していないドナー細胞を示す。
本発明の細胞は、埋め込み部位にその性質が依存する様々な移植取り組みを使用して、処置された個体に投与することができる。
「移植」、「細胞置換」または「移植する」の用語または表現は本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。上述のように、細胞はレシピエントに、あるいは、同種ドナー、半同種ドナーまたは異種ドナーに由来することができる。
細胞は全身的には循環に注入するか、クモ膜下腔内に投与するかまたは中枢神経系、脊髄もしくは脳室腔の中に移植するか、あるいは、硬膜下において宿主の脳の表面に移植することができる。成功する移植のための条件には、（ｉ）埋め込み物の生存性、（ｉｉ）移植部位における移植片の保持、および（ｉｉｉ）移植部位における最少量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚性脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＣＮＳ”、ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）；Ｆｒｅｅｄ他（２００１）；Ｏｌａｎｏｗ他（２００３）に記載されている。これらの手順には、実質内移植、すなわち、組織を移植時に脳の実質に注入するか、または置くことによって達成される、（脳外または実質外移植と比較されるような）宿主の脳の内部における実質内移植が含まれる。
実質内移植を、２つの取り組みを使用して行うことができる：（ｉ）細胞を宿主の脳の実質に注入すること、または（ｉｉ）宿主の脳の実質を露出させるために外科的手段によって腔を準備し、その後、移植片をこの腔の中に置くこと。両方の方法が、移植片と宿主脳組織との間における実質での設置を移植時にもたらし、また、ともに、移植片と宿主脳組織との間における解剖学的一体化を容易にする。移植片が宿主の脳の不可欠な部分となり、かつ、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、このことは重要である。
代替では、移植片が、室（例えば、脳室）に、あるいは、硬膜下に、すなわち、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳の実質から隔てられる宿主の脳の表面に置かれる場合がある。脳室に移植することが、ドナー細胞の注入によって、または細胞を基体（例えば、３％コラーゲンなど）において成長させて、その後、移植片のずれを防止するために脳室内に埋め込まれることがある充実組織のプラグを形成することによって達成される場合がある。硬膜下移植のために、細胞が、隙間を硬膜に作製した後で脳の表面の周りに注入される場合がある。宿主の脳の選択された領域への注入が、ドリルで穴を開け、硬膜を突き通して、マイクロシリンジの針が挿入されることを可能にすることによって行われる場合がある。マイクロシリンジは好ましくは、定位フレームに取り付けられ、三次元定位座標が、針を脳または脊髄の所望される場所に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状領域に、同様にまた、脊髄に導入される場合がある。
細胞はまた、組織の健康な領域に移植される場合がある。場合により、損傷した組織区域の正確な場所が不明である場合があり、細胞が、健康な領域に気付かずに移植される場合がある。他の場合には、細胞を健康な領域に投与して、それにより、その領域に対する何らかのさらなる損傷を回避することが好ましい場合がある。どのような場合であれ、移植後、細胞は好ましくは、損傷区域に遊走する。
移植のために、細胞懸濁物がシリンジに引き入れられ、麻酔された移植レシピエントに投与される。複数の注入が、この手順を使用して行われる場合がある。
細胞を、脳または脊髄における任意の所定の部位に移植することをこのように可能にする細胞懸濁物手順は、比較的非外傷性であり、複数の移植を、同じ細胞懸濁物を使用していくつかの異なる部位または同じ部位において同時に可能にし、また、異なる解剖学的領域から得られる細胞の混合物を可能にする。複数の移植片が、細胞タイプの混合物、および／または細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる場合がある。好ましくは、およそ１０４〜およそ１０９個の細胞が移植片あたり導入される。細胞は、冒された区域への標的化の機会を最大にするために、異なる場所に同時に投与することができる（例えば、クモ膜下腔内および静脈内の組み合わされた投与など）。
脊髄移植に好ましい場合がある腔内への移植のために、組織が中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から取り出され、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳の上にある骨を除き、出血をゲルフォームなどの材料により止めることによって移植腔を形成する。吸引が、腔を作り出すために使用される場合がある。その後、移植片が腔に置かれる。２つ以上の移植片が、細胞または充実組織埋め込み物の注入を使用して同じ腔に置かれる場合がある。好ましくは、埋め込み部位が、処置されるＣＮＳ障害によって決定される。脱髄したＭＳ病変が、ＭＳの効果的な処置が適切な標的部位への細胞の遊走能により依拠し得るように、ＣＮＳの至るところ、多数の場所にわたって分布する。
細胞の鼻腔内投与もまた意図される。
ＭＳＣは典型的には、ＭＨＣクラス２をダウンレギュレーションし、したがって、免疫原性がそれほど大きくない。臍帯血、臍帯ワルトンゼリーまたは胎盤から得られる胚性細胞または新生児細胞は、特にそのような細胞は最初は免疫抑制的かつ免疫調節性であるので、強い免疫原性である可能性がさらにより少なく、したがって、拒絶される可能性がそれほど大きくない。
それにもかかわらず、非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導することがあるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞の拒絶の可能性を軽減するために開発されている。さらに、多発性硬化症などの疾患は、炎症に基づく疾患であるので、免疫反応の問題が悪化する。これらには、細胞を免疫学的寛容部位に投与すること、あるいは、代替では、最初は自己免疫障害を抑えるために適応されることがある抗炎症性処置を提供して、および／または、非自己／半自己の細胞を移植前に免疫隔離性の半透過性膜でカプセル封入して、レシピエントの免疫系を抑制することのどちらもが含まれる。
本明細書中上記で述べられたように、本発明者らはまた、免疫反応を制限するための新生児間葉系幹細胞の使用を提案する。
下記の実験が、神経学的障害を処置するための、臍帯／胎盤から単離される新生児ＭＳＣの潜在的な使用を確認するために行われる場合がある。
１）分化ＭＳＣ（様々な神経細胞または神経始原体細胞に至るもの）が、同種Ｔ細胞との一方向混合リンパ球培養において刺激因子として役立つ場合があり、同じドナーから単離される同種リンパ球に対して応答するＴ細胞との比較での増殖応答が、低応答性を実証するために３Ｈ−チミジン取り込みによって評価される場合がある。
２）分化ＭＳＣが、Ｔ細胞により媒介される増殖応答に対する免疫抑制影響を確認するために、一方向混合リンパ球培養に対して、また、Ｔ細胞マイトジェン（フィトヘマグルチニンおよびコンカナバリンＡ）との細胞培養に対して添加／共培養される場合がある。
３）Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットから培養される臍帯細胞および胎盤細胞（非改変細胞および分化細胞）がＭＳＣについて富化される場合があり、これらの細胞が、誘導された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するＬｅｗｉｓラットに注入される場合がある。代替では、ＢＡＬＢ／ｃマウスの（ＢＡＬＢ／ｃｘＣ５７ＢＬ／６）Ｆ１から培養される臍帯細胞および胎盤細胞、または、Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットから得られる異種細胞（非改変細胞および分化細胞）がＭＳＣについて富化される場合があり、これらの細胞が、誘導された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を有するＣ５７ＢＬ／６またはＳＪＬ／ｊレシピエントに注入される場合がある。麻痺に対する臨床効果が、異種のＭＨＣ、完全不一致ＭＳＣまたはハプロタイプ一致した不一致ＭＳＣの治療効果を評価するために調べられる場合がある。そのような実験は、遺伝的障害または遺伝的傾向のある障害を有する患者を家族の一員のハプロタイプ一致したＭＳＣにより処置するための基礎を提供する場合がある。
４）臍帯および胎盤から培養されるＢＡＬＢ／ｃのＭＳＣが、ＧＦＰまたはＲＦＰにより標識されるプレ−ｍｉＲとともに輸注される場合がある（この場合、ＧＦＰまたはＲＦＰは、本発明者らが、誘導されたＥＡＥを有するＣ５７ＢＬ／６レシピエントの脳におけるこれらの細胞の遊走および持続を追跡することを可能にするであろう）。標識されたＭＨＣ不一致の分化ＭＳＣの臨床効果が、疾患、麻痺および組織病理学の兆候をモニターすることによって評価される場合がある。そのような細胞の遊走および局在化もまた、遺伝的に形質導入されたＧＦＰ「緑色」ドナーまたはＲｅｄ２「赤色」ドナーに由来する蛍光性細胞を使用することによってモニターされる場合がある。
述べられたように、本発明ではまた、免疫応答を最小限に抑えるためのカプセル化技術も意図される。
カプセル化技術は一般には、小さい球状ビヒクルを伴うマイクロカプセル化として、また、より大きい平坦シートおよび中空繊維膜を伴うマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
マイクロカプセルを調製する様々な方法が当技術分野で公知であり、これらには、例えば、下記によって開示される方法が含まれる：Ｌｕ Ｍ Ｚ他、Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３；Ｃｈａｎｇ Ｔ ＭおよびＰｒａｋａｓｈ Ｓ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ，ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０、ならびに、Ｌｕ Ｍ Ｚ他、Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１。
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メチルアタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー殻と複合体化することによって調製され、これは２〜５．ｍｕ．ｍのカプセル厚さを生じさせる。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２〜５．ｍｕ．ｍのターポリマー殻によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
他のマイクロカプセルが、海洋多糖であるアルギン酸塩（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｔｈｅｒ、２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよびセルロース硫酸ナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との間における塩化カルシウム存在下での高分子電解質複合体化によって調製することができる。
細胞のカプセル化が、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解されるであろう。したがって、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が、カプセルサイズが１ｍｍから４００．ｍｕ．ｍに縮小されたときに改善した（Ｃａｎａｐｌｅ Ｌ．他、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、調整された表面化学、および、精密な微細構造様式を有するナノ多孔性バイオカプセルが、細胞のための微小環境を首尾良く免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ、Ｓｍａｌｌ ｉｓ ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；およびＤｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト、ＴＮＦアルファ遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的作用因、および、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載される方法のどれにおいても、細胞は、それ自体で、または、好ましくは、医薬的に許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部としてそのどちらでも投与することができる。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される細胞組成物の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する細胞の投与を容易にすることである。
本明細書中以降、表現「医薬的に許容される担体」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。担体の非限定的な例としては、ポリプロピレングリコール、生理食塩水、乳剤、および有機溶媒と水の混合物が挙げられる。
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
好適な投与経路には、血液循環（静脈または動脈内）内へ、髄液内へ、または関心のある組織もしくは器官内への直接投与を含む。したがって、例えば細胞は脳内へ直接投与されることができる。
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。好ましくは、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定される。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。例えば、脱髄性疾患の動物モデルには、シバラー（ｓｈｉ／ｓｈｉ、ＭＢＰ欠失）マウス、ＭＤラット（ＰＬＰ欠損）、Ｊｉｍｐｙマウス（ＰＬＰ変異）、イヌの身震いする子犬（ＰＬＰ変異）、単収縮体マウス（ガラクトシルセラミダーゼ欠如、ヒトのグラッベ病の場合のように）、振せん体マウス（ＰＭＰ−２２欠損）が含まれる。ウイルス誘導の脱髄モデルは、タイラーウイルスおよびマウス肝炎ウイルスの使用を含む。自己免疫性ＥＡＥが多発性硬化症のための可能なモデルである。
これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。例えば、多発性硬化症患者を、処置に対する陽性の応答を示している改善された運動機能について症候的にモニターすることができる。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。
投薬量および投薬間隔は、脳疾患／障害を効果的に処置するために十分である有効成分のレベルに個々に調節され得る。所望される効果を達成するために必要である投薬量は、個体の特徴および投与経路に依存するであろう。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を求めるために使用することができる。
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
投与されるための組成物の量は当然のことながら、処置されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存しているであろう。投与量および投与時期が、個体の変化する状態の注意深い連続したモニターリングに応じて変わるであろう。例えば、処置された多発性硬化症患者には、モニターしている徴候に基づいて、疾患の症状を軽減するために十分である量の細胞が投与されるであろう。
本発明の細胞は、神経変性障害を処置することにおいて有用である治療剤、例えば、ガングリオシド；抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、トキシン、神経突起促進分子；ならびに、神経伝達物質分子（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）の代謝拮抗剤および前駆体などとともに共投与され得る。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
本明細書で記載される各ｍｉＲについて対応する配列（成熟およびプレ）が本明細書の部分として見なされるべきである配列表に与えられる。
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
実施例１
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の神経幹細胞（ＮＳＣ）への分化
方法
骨髄、脂肪、胎盤または臍帯のどれからも得られる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、細菌用ディッシュにおいて高密度で、１０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦおよびｂＦＧＦが補充される血清非含有培地に１０日間置床した。細胞は凝集し始め、４〜５日後において、プレートからのそれらの剥離を促進させるために機械的に解離させた。その後、細胞を２週間維持し、その後、細胞をＮＳＣマーカーの発現について、また、低血清（５％）培地においてラミニンに置床したときには、ニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞を生じさせることができるかについて分析した。
その後、細胞を、記載されるようなｍｉＲＮＡマイクロアレイに供した。
結果
図１Ａ〜図１Ｂに例示されるように、間葉系幹細胞は神経幹細胞分化の後でニューロンマーカーを発現した。
実施例２
ＮＳＣ分化期間中でのｍｉＲＮＡ発現における変化
材料および方法
様々なｍｉＲＮＡは、様々な神経細胞および神経幹細胞の分化において役割を果たすことが示されている。特異的ｍｉＲＮＡの発現および機能をＭＳＣ由来のＮＳＣにおいて分析するために、ＭＳＣを実施例１に記載されるようにＮＳＣに向かって分化させ、ｍｉＲＮＡアレイ分析を対照細胞および分化細胞に対して行った。幹細胞にすべてが関連づけられ、幹細胞とのそれらの公知の関連に基づいてサブグループ（神経関連ｍｉＲＮＡ、造血ｍｉＲＮＡおよび器官関連ｍｉＲＮＡ）に分けられた９６個のｍｉＲＮＡを含有するｑＲＴ−ＰＣＲマクロアレイを行った。
対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣにおける特異的ｍｉＲＮＡの示差的発現を分析するために、幹細胞ミクロＲＮＡのｑＰＣＲアレイを、使用者プロトコル（その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に従って、ＳＢＩ社から得られるｑｕａｎｔｉＭｉＲ（カタログ＃ＲＡ６２０Ａ−１）とともに用いた。ｑＰＣＲのために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲマスターミックス（ｃａｔ＃４３６７６５９）を使用した。
このシステムは、２つの別個の実験用ＲＮＡサンプルの間における９５個の別々のミクロＲＮＡの倍数差を定量化することを可能にする。アレイプレートはまた、Ｕ６転写物を正規化シグナルとして含む。アレイのために選ばれる９５個すべてのミクロＲＮＡは、幹細胞自己再生、造血、ニューロン発達および分化組織特定における可能性のある役割に関して、公表された意味付けを有する。アレイプレートはまた、Ｕ６ ＲＮＡを正規化シグナルとして含む。
総ＲＮＡを、サイズが２００ｂｐ未満であるＲＮＡ画分を単離するＱｉａｇｅｎから得られるｍｉＲｎｅａｓｙ総ＲＮＡ単離キット（カタログ＃２１７００４）を使用して、対照ＭＳＣおよび分化ＭＳＣの１０５個〜１０６個の細胞から単離した。
５００ｎｇの総ＲＮＡを、“ＳＢＩ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｑＰＣＲ Ａｒｒａｙ ｗｉｔｈ ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（商標）”（Ｃａｔ．＃ ＲＡ６２０Ａ−１）の使用者プロトコルに従って処理した。ｑＰＣＲのために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲマスターミックス（ｃａｔ＃４３６７６５９）を使用した。
妥当性確認のために、目的とする特異的ｍｉＲＮＡのｓｙｂｒ−ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲを、ＱＩＡＧＥＮ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍのハンドブック（ｃａｔ．＃２１８０６１＆２１８０７３）に従って処理される同じＲＮＡサンプルに対して行った。
９６個のｍｉＲＮＡの発現を検出するＨｕ ｈｓａ−ｍｉＲミクロＲＮＡプロファイリングキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）“ＳＢＩ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｑＰＣＲ Ａｒｒａｙ ｗｉｔｈ ＱｕａｎｔｉＭｉｒ（商標）”（Ｃａｔ．＃ ＲＡ６２０Ａ−１）を使用して、星状膠細胞に分化させられるＭＳＣと比較される非改変のＢＭ−ＭＳＣにおけるｍｉＲＮＡのプロファイリングを行った。５００ｎｇの総ＲＮＡをポリＡポリメラーゼによってその３’末端に対してポリ（Ａ）によりタグ化し、ＱｕａｎｔｉＭｉｒ ＲＴ技術によってオリゴｄＴアダプターとともに逆転写した。ｍｉＲＮＡの発現レベルを、ＳＹＢＲグリーン試薬およびＶＩＩＡ７を使用する定量的ＰＣＲによって、すなわち、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。すべてのｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ特異的順方向プライマーおよび万能的逆方向プライマー（ＳＢＩ）により測定することができた。ｍｉＲＮＡの発現レベルを、下記の式により計算されるような相対的定量化のための比較ＣＴ法を使用して、Ｕ６ ｓｎＲＮＡに対して正規化した：２−［（ＣＴ星状膠細胞ｄｉｆｆ ｍｉＲＮＡ−ＣＴ星状膠細胞内因性対照）−（ＣＴ ＤＭＥＭ ｍｉＲＮＡ−ＣＴ ＤＭＥＭ内因性対照）］。
加えて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のｍｉＲＮＡ３．０アレイを使用して、ＢＭ−ＭＳＣおよびヒトＮＳＣを比較し、示差的に発現されたｍｉＲＮＡを特定した。
結果
図２、図３および図４Ａに示されるように、各グループの特異的ｍｉＲＮＡの発現における有意な変化が対照ＭＳＣと分化ＭＳＣとの間に存在した。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のｍｉＲＮＡ３．０アレイによる分析の結果が本明細書中下記の表１に詳しく記載される。
ネスチンプロモーターに基づくレポーターアッセイを使用して、本発明者らは、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−８９１およびｍｉＲ−３７８の過剰発現がまた、ＭＳＣのＮＳＣへの分化を誘導したことを確認した（図４Ｂ）。
同様に、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１９９ａおよびｍｉＲ−１９９ｂのサイレンシングがすべてのＭＳＣの間葉系表現型を低下させ、それらのＮＳＣ分化を誘導した（図４Ｃ）。
ｍｉＲ−２０ｂまたはｍｉＲ−３７８のａｎｔａｇｏｍｉＲ−１３８との組合せを用いたＭＳＣの共トランスフェクションは、ＭＳＣのネスチン陽性細胞への分化をさらに増大させた（図４Ｄ）。
図４Ｅ〜図４Ｆに示されるように、ａｎｔａｇｏｍｉＲ−１３８およびｍｉＲ−８９１模倣体の過剰発現は、ネスチン−ＧＦＰレポーターにより形質導入される細胞の増大した蛍光強度によって明らかにされるように、トランスフェクションされたＭＳＣにおけるネスチン陽性細胞の生成における有意な増大を誘導した。
実施例３
ＭＳＣのＮＳＣへの分化において役割を果たすｍｉＲＮＡ
本発明者らはさらに、ＭＳＣのＮＳＣへの分化のときにｍｉＲマイクロアレイにおいて変化することが見出された特異的ｍｉＲＮＡの役割を調べた。これらの実験を、特異的な成熟型ｍｉＲＮＡ模倣体またはｍｉＲＮＡ阻害剤、あるいは、成熟型ｍｉＲＮＡ模倣体またはｍｉＲＮＡ阻害剤の組合せのどちらかによりＭＳＣをトランスフェクションすることによって行い、その後、ニューロスフェアを生じさせ、かつ、マーカーのネスチンおよびＳｏｘ２を発現するそれらの能力を調べた。
結果
ｍｉＲ−１２４の発現と一緒でのｌｅｔ−７の阻害がＮＳＣ分化を増大させたことが見出された。
加えて、下記ｍｉＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１２７のアップレギュレーション、ならびに、下記ｍｉＲ、すなわち、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１３１ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１５３およびｍｉＲ−１８１ａのダウンレギュレーションは、単独または様々な組合せのどちらでも、種々の程度にもかかわらず、ＭＳＣのＮＳＣへの分化を誘導したことが見出された。
ｍｉＲＮＡアレイにおいて記載されたｍｉＲＮＡに加えて、ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−１３７によるＭＳＣのトランスフェクションもまたＮＳＣ分化を増大させることがまた見出された。
実施例４
ＭＳＣのＮＳＣへの分化を促進させるさらなる因子
Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｖｅｓｐｉｄ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓタンパク質１（ＲＴＶＰ−１）が、２つのグループによってヒトＧＢＭ細胞株からクローン化され、神経膠腫病理発生関連タンパク質、すなわち、ＧＬＩＰＲ１またはＲＴＶＰ−１と名づけられた［３］。ＲＴＶＰ−１は、ＴＰＸ−１［４］、毒液アレルゲン抗原５［５］、および、植物病理発生関連タンパク質のグループ１（ＰＲ−１）を含む他のＲＴＶＰ−１ホモログにもまた見出される未だに不明の機能とともに、推定されるシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびＳＣＰドメインを含有する。ＲＴＶＰ−１が神経膠腫において腫瘍プロモーターとして作用することが近年には報告されている。したがって、ＲＴＶＰ−１の発現は星状膠細胞腫瘍の悪性度と相関し、また、ＲＴＶＰ−１の過剰発現は、細胞増殖、浸潤、遊走および足場非依存的成長を増大させる。そのうえ、ＲＴＶＰ−１のサイレンシングはアポトーシスを神経膠腫細胞株および原発性神経膠腫培養物において誘導する［６］。興味深いことに、ＲＴＶＰ−１は前立腺ガン細胞において腫瘍抑制因子として作用し、また、ＲＴＶＰ−１のアデノウイルス媒介送達は治療効果をマウス前立腺ガンモデルにおいて有する［７〜９］。
結果
ＲＴＶＰ−１のＭＳＣにおける発現は、ウエスタンブロットによって明らかにされるように非常に大きい（図５Ａ）。そのうえ、ＲＴＶＰ−１のＭＳＣにおけるサイレンシングは、間葉系譜細胞に分化するその能力をなくし、神経幹細胞マーカーおよび神経マーカーの発現を低下させた（図５Ｃ〜図５Ｄ）。
さらに、ＲＴＶＰ−１のＭＳＣにおけるサイレンシングはネスチンおよびＳｏｘ２の両方の発現を増大させ、また、ベータ３チューブリンのレベルをいくらか増大させた（データは示されず）。
興味深いことに、ＲＴＶＰ−１がｍｉＲ−１３７の新規な標的であることが見出された。このことは、ＭＳＣのＮＳＣ分化に対するｍｉＲ−１３７の正の影響がＲＴＶＰ−１によって媒介され得ることを示唆する。
ＲＴＶＰ−１の役割をさらに調べるために、その発現を、ＭＳＣ、ＮＳＣ、および、ＮＳＣに分化させられたＭＳＣにおいて調べた。
ヒトＮＳＣはＲＴＶＰ−１を全く発現せず（データは示されず）、ＲＴＶＰ−１のＭＳＣにおける発現が、調べられたＭＳＣの供給源にかかわらず、ＮＳＣに分化させられたＭＳＣの発現よりも有意に大きかった（図５Ｅ）。
ＲＴＶＰ−１過剰発現のヒトＮＳＣにおける影響を調べた。これらの細胞が間葉系表現型を獲得し、とりわけ、脂肪細胞に分化しやすくなったことが見出された（データは示されず）。
調べられた種々のＭＳＣにおけるＲＴＶＰ−１のサイレンシングはこれらの細胞におけるネスチンの発現を増大させた（図５Ｆ）。
間葉系の形質転換に対するＲＴＶＰ−１の影響をさらに分析するために、遺伝子アレイ分析を、ＲＴＶＰ−１の発現が沈黙させられたＢＭ−ＭＳＣに対して行った。ＲＴＶＰ−１のサイレンシングはＡＬＤＨ１Ａ３の発現を３．２倍増大させ、ＶＡＶ３の発現を１５倍増大させ、ＣＤ２００の発現を５倍増大させ、また、幹細胞性マーカーのＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２の発現を、２．３倍、３．４倍および４．２倍それぞれ増大させた。まとめると、これらの結果は、ＲＴＶＰ−１がこれらの細胞の増殖および幹細胞性シグナチャーを低下させることを示している。
対照的に、ＲＴＶＰ−１は、ある種の遺伝子の発現を増大させた（例えば、ネスチン（３．４倍）、ＮＫＸ２．２（４．７倍）およびカルシウムチャネル電位依存性型（３倍）など）。
まとめると、これらの結果はＲＴＶＰ−１を主要な間葉調節因子として暗示しており、ＲＴＶＰ−１のサイレンシングが、神経表現型を有する細胞へのＭＳＣの分化を誘導することを明らかにする。
実施例５
神経始原体細胞の運動ニューロンへの分化
材料および方法
プレートを２０μｇ／ｍｌのラミニンにより一晩被覆し、その後、ＰＢＳにより２回洗浄した。ＮＰＣを５０％のコンフルエンシーで置床し、２４時間後、プライミング培地、すなわち、ヘパリン（１０μｇ／ｍｌを使用する）およびｂＦＧＦ（１００μｇ／ｍｌ）を有するＮＭ培地と５日間インキュベーションした。５日後、培地を、分化培地、すなわち、５０ｍＬのＦ１２における１ｍＬのＢ２７（すなわち、２％）、レチノイン酸（ＲＡ、１μＭ）およびＳＨＨ（２００ｎｇ／ｍＬ）を有するＦ１２に変更した。ＲＡを１日おきに加えた。５日後、ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦを培地に加えた（１０ｎｇ／ｍＬ）。
結果
発達中の脊髄において、運動ニューロン（ＭＮ）および乏突起膠細胞（ＯＬＰ）の逐次生成が認められる。最初にＭＮを生じさせ、その後、乏突起膠細胞を生じさせるｐＭＮと呼ばれる共通の始原体が存在する。塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子のＯｌｉｇ２がｐＭＮドメインにおいて発現され、Ｏｌｉｇ２は、両方の細胞タイプの発達において役割を果たす重要な転写因子の１つである。２００ｎｇ／ｍｌの組換えＳＨＨ、それぞれが２０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦおよびＮＴ−３、ならびに、１ｍＭのレチノイン酸が補充されるＮＭ培地で成長させられたＭＳＣにおけるＯｌｉｇ２の過剰発現は、運動ニューロンの２つの特異的マーカー、すなわち、Ｈｂ９およびＩｓｌｅｔ１の発現を誘導した（図６Ａ〜図６Ｄ）。
実施例６
ＮＰＣの運動ニューロンへの分化におけるｍｉＲＮＡの関与
材料および方法
運動ニューロン分化と関係する特異的なｍｉＲＮＡを特定するために、本発明者らは、実施例５に記載されるプロトコルを使用して、２つのタイプの神経幹細胞／始原体細胞を発達の異なる段階にある運動ニューロンに分化させた。運動ニューロンとしての細胞の特徴づけを、特異的マーカーのｉｓｌｅｔ１、ＨＢ９、ならびに、ニューロンマーカーのニューロフィラメントおよびβ３チューブリンの発現によって特徴づけた。
運動ニューロンにおける特異的ｍｉＲＮＡの発現および機能を分析するために、本明細書中上記で記載される神経始原体細胞システムを使用した。ｍｉＲＮＡアレイ分析を対照細胞および分化細胞に対して行った。実施例２に記載されるように、幹細胞にすべてが関連づけられ、かつ、幹細胞とのそれらの公知の関連に基づいてサブグループ（神経関連ｍｉＲＮＡ、造血ｍｉＲＮＡおよび器官関連ｍｉＲＮＡ）に分けられた９６個のｍｉＲＮＡを含有したｑＲＴ−ＰＣＲマイクロアレイ。
結果
図７Ａ〜図７Ｂに例示されるように、神経幹細胞が、運動ニューロンに分化するように誘導される場合がある。
図８〜図１０に示されるように、各グループの特異的ｍｉＲＮＡの発現における有意な変化が対照ＭＳＣと分化ＭＳＣとの間に存在した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ研究を、対照細胞と分化細胞との間で認められたｍｉＲＮＡ発現における差を検証するために行った。
マイクロアレイのデータに関して得られた結果と類似して、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果により、ｍｉＲ３７２、ｍｉＲ３７３、ｍｉＲ１４１、ｍｉＲ１９９ａ、ｍｉＲ３２、ｍｉＲ３３、ｍｉＲ２２１およびｍｉＲ２２３における低下が明らかにされた。
対照的に、有意な増大が、アレイにおいて増大したｍｉＲＮＡのすべてにおいて、具体的には下記のｍｉＲＮＡにおいて認められた：ｍｉＲ−３６８、３０２ｂ、３６５−３ｐ、３６５−５ｐ、Ｌｅｔ−７ａ、Ｌｅｔ−７ｂ、２１８、１３４、１２４、１２５ａ、９、１５４、２０ａ、１３０ａ。
本発明者らはさらに、ＭＳＣの運動ニューロンへの分化における特異的ｍｉＲＮＡの役割を調べた。Ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−３６８およびｍｉＲ−１５４の組合せが、Ｈｂ９およびＩｓｌｅｔ−１の発現を増大させたことが見出された。同様に、ｍｉＲ−１２５ａ、９、１３０ａおよび２１８、１３４および２０ａの互いの組合せ、ならびに、ｍｉＲ−１４１、３２、３３、２２１、２２３およびｍｉＲ３７３のｍｉＲＮＡ阻害剤との組合せでの組合せによるトランスフェクションもまた、運動ニューロン始原体または未成熟な運動ニューロンへのどちらに対してもＭＳＣの分化を誘導した。
実施例７
配列
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

Claims (19)

  1. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の神経幹細胞への生体外での分化を促す方法であって、（ｉ）ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−２０ｂからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲを前記ＭＳＣ中で発現させること、および（ｉｉ）ｍｉＲ−１３８ポリヌクレオチド阻害剤を前記ＭＳＣ中で発現させ、それにより、前記ＭＳＣを前記神経幹細胞へ分化させることを含む方法。
  2. 前記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血および臍帯からなる群から選択される組織から単離される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記発現させることが、（ｉ）前記ｍｉＲを前記ＭＳＣ中に導入すること、（ｉｉ）前記ｍｉＲのプレ−ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにより前記ＭＳＣをトランスフェクションすること、または（ｉｉｉ）前記ｍｉＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにより前記ＭＳＣをトランスフェクションすることを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ニューロン細胞の増殖および分化を支持する培地中で前記ＭＳＣを培養することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. ネスチンおよびＳｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を前記発現させることの後において分析することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記分析することが、前記少なくとも１つのマーカーの増大した発現を確認することを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記分析することが、ＭＳＣのうちの少なくとも５０％が前記少なくとも１つのマーカーを発現することを確認することを含む、請求項５に記載の方法。
  8. 前記ポリヌクレオチド阻害剤が、ａｎｔａｇｏｍｉＲである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. ｍｉＲ−８９１，ｍｉＲ−３７８およびｍｉＲ−２０ｂからなる群から選択される少なくとも１つの外因性ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲ−１３８にハイブリダイゼーションし、かつ阻害するポリヌクレオチド作用因とを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の遺伝子改変され単離された集団であって、前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が神経幹細胞の表現型を有する、遺伝子改変され単離された細胞集団。
  10. 前記ＭＳＣが、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血および臍帯からなる群から選択される組織から単離される、請求項９に記載の単離された細胞集団。
  11. 前記ポリヌクレオチド作用因が、ａｎｔａｇｏｍｉＲである、請求項９または１０に記載の単離された細胞集団。
  12. 前記細胞集団の少なくとも５０％が、ネスチンおよびＳｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、請求項９〜１１のいずれかに記載の単離された細胞集団。
  13. 脳疾患または脳障害を処置することにおいて使用するためのものである、請求項９〜１２のいずれかに記載の単離された細胞集団。
  14. 前記脳疾患または脳障害が神経変性障害である、請求項１３に記載の単離された細胞集団。
  15. 前記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、脊髄傷害、脳性麻痺、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１４に記載の単離された細胞集団。
  16. 請求項９〜１２のいずれかに記載される単離された細胞集団と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  17. 脳疾患または脳障害を処置することにおいて使用するためのものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記脳疾患または脳障害が神経変性障害である、請求項１７に記載の単医薬組成物。
  19. 前記神経変性障害は、多発性硬化症、パーキンソン病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、レット症候群、自己免疫性脳脊髄炎、脊髄傷害、脳性麻痺、卒中、アルツハイマー病およびハンチントン病からなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
JP2017232724A 2012-02-22 2017-12-04 神経幹細胞および運動ニューロンの生成 Expired - Fee Related JP6526164B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261601596P 2012-02-22 2012-02-22
US61/601,596 2012-02-22

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014558252A Division JP2015509366A (ja) 2012-02-22 2013-02-21 神経幹細胞および運動ニューロンの生成

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018075017A JP2018075017A (ja) 2018-05-17
JP6526164B2 true JP6526164B2 (ja) 2019-06-05

Family

ID=48014135

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014558252A Pending JP2015509366A (ja) 2012-02-22 2013-02-21 神経幹細胞および運動ニューロンの生成
JP2017232724A Expired - Fee Related JP6526164B2 (ja) 2012-02-22 2017-12-04 神経幹細胞および運動ニューロンの生成

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014558252A Pending JP2015509366A (ja) 2012-02-22 2013-02-21 神経幹細胞および運動ニューロンの生成

Country Status (4)

Country Link
US (3) US9803175B2 (ja)
EP (2) EP2844745A2 (ja)
JP (2) JP2015509366A (ja)
WO (1) WO2013124816A2 (ja)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2354246A1 (en) 2010-02-05 2011-08-10 febit holding GmbH miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
SG187845A1 (en) 2010-08-16 2013-03-28 Brainstem Biotech Ltd Methods of generating oligodendrocytes and cell populations comprising same
US10385314B2 (en) 2010-08-16 2019-08-20 Exostem Biotec Ltd. Methods of generating oligodendrocytes and cell populations comprising same
WO2013124817A2 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. MicroRNAS FOR THE GENERATION OF ASTROCYTES
EP2844745A2 (en) 2012-02-22 2015-03-11 Brainstem Biotec Ltd. Generation of neural stem cells and motor neurons
EP2833893B1 (en) * 2012-04-03 2018-08-29 Reneuron Limited Stem cell microparticles
GB201317887D0 (en) 2013-10-09 2013-11-20 Reneuron Ltd Product
US20170002349A1 (en) * 2013-10-09 2017-01-05 Sun Yat-Sen University Small rna, preparation method therefor and application thereof in pharmaceuticals for specifically up-regulating gene transcriptional activity
EP3083986B1 (en) 2013-12-19 2020-05-27 Hummingbird Diagnostics GmbH Mirnas as non-invasive biomarkers for parkinson's disease
WO2016138287A1 (en) 2015-02-25 2016-09-01 Washington University METHODS TO DETECT MOTOR NEURON DISEASE COMPRISING MICRO-RNAs
US20180064748A1 (en) * 2015-03-27 2018-03-08 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating motor neuron diseases
CA2978109A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Delivery vehicles for stem cells and uses thereof
CA3001536A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Riken Compositions for use in recovering or ameliorating deterioration of physiological functions due to aging
US11174461B2 (en) * 2016-03-16 2021-11-16 Cynata Therapeutics Limited Colony forming medium and use thereof
IT201600093825A1 (it) * 2016-09-19 2018-03-19 Fondazione St Italiano Tecnologia Composizione farmaceutica di miRNA e suoi usi terapeutici.
KR20190109389A (ko) * 2016-11-03 2019-09-25 엑소스템 바이오텍 리미티드 간엽 줄기 세포 집단, 이들의 산물 및 이들의 용도
IT201700012604A1 (it) * 2017-02-06 2018-08-06 Consiglio Naz Delle Ricerche Cnr Nuovi regolatori dell’angiogenesi
KR102113646B1 (ko) 2017-03-30 2020-05-22 울산대학교 산학협력단 신경줄기세포 사멸 억제 효과를 가지는 miR-383-5p 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물
KR102113647B1 (ko) 2017-03-30 2020-05-22 울산대학교 산학협력단 신경줄기세포 사멸 억제 효과를 가지는 miR-494-3p 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물
KR101964748B1 (ko) 2017-06-01 2019-04-03 울산대학교 산학협력단 신경줄기세포 사멸 억제 효과를 가지는 miR-141-5p 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물
CN107982537A (zh) * 2017-11-17 2018-05-04 厦门大学 针对microRNA-155的治疗性药物及其应用
KR20190105334A (ko) 2018-03-05 2019-09-17 울산대학교 산학협력단 신경줄기세포 사멸 억제 효과를 가지는 miR-125a-5p 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 조성물
EP3587575A1 (en) * 2018-06-26 2020-01-01 Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale Mirna mir-218 and use thereof for stimulating mesenchymal stem cells
WO2020037254A1 (en) * 2018-08-17 2020-02-20 City Of Hope Compounds of chemically modified oligonucleotides and methods of use thereof
CN109609554B (zh) * 2018-11-29 2022-03-15 南方医科大学 一种mir338基因沉默的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用
US20220339198A1 (en) * 2019-08-22 2022-10-27 Seoul National University R&Db Foundation Pharmaceutical composition for alzheimer's treatment containing as active ingredient late passage human mesenchymal stem cells induced to differentiate into glia-like cells
ES2973364T3 (es) * 2019-09-16 2024-06-19 Genieus Genomics Pty Ltd Biomarcadores para enfermedades neurodegenerativas
WO2021072163A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for reprogramming age-restricted non-neuronal cells
EP4041250A1 (en) * 2019-11-29 2022-08-17 Novadip Biosciences Mirna-based pharmaceutical compositions and uses thereof for the prevention and the treatment of tissue disorders
CN111850047B (zh) * 2020-07-28 2022-08-12 枣庄学院 一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用
RU2742449C1 (ru) * 2020-09-30 2021-02-05 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ ортотопической трансплантации фрагмента глиобластомы головного мозга человека в область cortex parietalis головного мозга иммунодефицитных мышей
KR20230079403A (ko) * 2020-10-09 2023-06-07 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 이식편 거부반응을 치료하기 위한 면역공학 생체물질
KR102791586B1 (ko) 2021-11-23 2025-04-08 재단법인 아산사회복지재단 miR-92b-5p 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물
CN116333994A (zh) * 2021-12-07 2023-06-27 上海鲸奇生物科技有限公司 非编码rna介导的神经性疾病治疗
WO2023238948A1 (ja) * 2022-06-09 2023-12-14 国立大学法人九州大学 ｍｉＲＮＡを含む新規脳神経新生促進剤
WO2025255571A1 (en) * 2024-06-07 2025-12-11 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Ask neurogenic and neurotrophic reprogramming of the skin

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
CA2006008C (en) 1988-12-20 2000-02-15 Donald J. Kessler Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex dna molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
MY107332A (en) 1990-08-03 1995-11-30 Sterling Drug Inc Compounds and methods for inhibiting gene expression.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US6933286B2 (en) 1991-03-19 2005-08-23 R. Martin Emanuele Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US20020123476A1 (en) 1991-03-19 2002-09-05 Emanuele R. Martin Therapeutic delivery compositions and methods of use thereof
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5721138A (en) 1992-12-15 1998-02-24 Sandford University Apolipoprotein(A) promoter and regulatory sequence constructs and methods of use
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5541110A (en) 1994-05-17 1996-07-30 Bristol-Myers Squibb Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AU3888699A (en) 1998-05-07 1999-11-23 University Of South Florida Bone marrow cells as a source of neurons for brain and spinal cord repair
CA2328457A1 (en) 1998-06-20 1999-12-29 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
GB0001309D0 (en) 2000-01-20 2000-03-08 Nestle Sa Valve arrangement
CN101584869B (zh) 2002-02-06 2013-03-27 桑比欧公司 通过导入notch基因将骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞或骨骼肌细胞的方法
US20050058641A1 (en) 2002-05-22 2005-03-17 Siemionow Maria Z. Tolerance induction and maintenance in hematopoietic stem cell allografts
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
EP1506997A1 (en) 2003-08-14 2005-02-16 NeuroProgen GmbH Leipzig Method of generating neural stem cells
US20050182005A1 (en) 2004-02-13 2005-08-18 Tuschl Thomas H. Anti-microRNA oligonucleotide molecules
WO2005110479A2 (en) 2004-04-28 2005-11-24 Fibrogen, Inc. Treatments for pancreatic cancer
WO2006040763A2 (en) 2004-10-12 2006-04-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Isolated primate embryonic cells and methods of generating and using same
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
EP1705245B1 (en) 2005-03-23 2009-05-20 Stiftung CAESAR Neural stem cells
EP2465924A3 (en) 2005-06-16 2013-01-02 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Isolated cells and populations comprising same for the treament of cns diseases
KR101022401B1 (ko) 2005-09-29 2011-03-15 아주대학교산학협력단 자살유전자를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 암치료용 조성물
US20100021434A1 (en) 2005-12-08 2010-01-28 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Isolated Oligodendrocyte-Like Cells and Populations Comprising Same for the Treatment of CNS Diseases
EP2064319B1 (en) 2006-08-28 2017-02-22 Yeda Research and Development Co. Ltd. Methods of generating glial and neuronal cells and use of same for the treatment of medical conditions of the cns
US20080176328A1 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Seoul National University Industry Foundation Method of inducing differentiation of mesenchymal stem cells into neurons
US8580757B2 (en) * 2007-08-09 2013-11-12 Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. Methods of modulating mesenchymal stem cell differentiation
WO2009070805A2 (en) * 2007-12-01 2009-06-04 Asuragen, Inc. Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009122413A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Motor neurons developed from stem cells
EP2620493B1 (en) 2008-05-28 2019-03-27 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Mesenchymal stem cells for the treatment of CNS diseases
CA2756670A1 (en) 2009-03-26 2010-09-30 The Regents Of The University Of California Mesenchymal stem cells producing inhibitory rna for disease modification
WO2010115050A2 (en) * 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
JP2012530054A (ja) * 2009-06-10 2012-11-29 ブレインステム バイオテック リミテッド 多能性ストローマ細胞のニューロン分化のための方法、システム及び組成物
WO2011030336A1 (en) 2009-09-08 2011-03-17 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Methods of diagnosing amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2011159075A2 (ko) 2010-06-14 2011-12-22 차의과학대학교 산학협력단 2차원 배양을 이용한 성체줄기세포의 신경전구세포로의 분화방법 및 신경전구세포를 이용한 신경손상 질환 치료용 약학 조성물
KR101183620B1 (ko) 2010-06-18 2012-09-18 서울대학교산학협력단 지방조직 유래의 간엽줄기세포를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물 및 파킨슨병 진단용 바이오마커
CA2804791C (en) * 2010-07-08 2019-07-30 Duke University Direct reprogramming of cells to cardiac myocyte fate
SG187845A1 (en) 2010-08-16 2013-03-28 Brainstem Biotech Ltd Methods of generating oligodendrocytes and cell populations comprising same
WO2013124817A2 (en) 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. MicroRNAS FOR THE GENERATION OF ASTROCYTES
EP2845010A2 (en) 2012-02-22 2015-03-11 Brainstem Biotec Ltd. Mesenchymal stem cells for in vitro modeling and cell-based therapy of human diseases and banks thereof
EP2844745A2 (en) * 2012-02-22 2015-03-11 Brainstem Biotec Ltd. Generation of neural stem cells and motor neurons

Also Published As

Publication number Publication date
EP3401394A1 (en) 2018-11-14
US20180142208A1 (en) 2018-05-24
WO2013124816A2 (en) 2013-08-29
JP2018075017A (ja) 2018-05-17
WO2013124816A8 (en) 2013-10-17
WO2013124816A3 (en) 2014-01-03
US20200377854A1 (en) 2020-12-03
EP2844745A2 (en) 2015-03-11
JP2015509366A (ja) 2015-03-30
US9803175B2 (en) 2017-10-31
US20150037299A1 (en) 2015-02-05
US10752883B2 (en) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6526164B2 (ja) 神経幹細胞および運動ニューロンの生成
JP6329911B2 (ja) 星状膠細胞作製のためのミクロｒｎａ
US9783781B2 (en) Methods of generating oligodendrocytes and cell populations comprising same
JP2024073546A (ja) 幹細胞微粒子
US20210228647A1 (en) Mesenchymal stem cell and use thereof for treatment of muscle injury and muscle-associated diseases
JP2015510401A (ja) ヒト疾患のインビトロモデル化および細胞に基づく治療のための間葉系幹細胞ならびにそのバンク
US20170009211A1 (en) DOWNREGULATION OF miR-7 FOR PROMOTION OF BETA CELL DIFFERENTIATION AND INSULIN PRODUCTION
US20190015453A1 (en) MicroRNAS FOR THE GENERATION OF ASTROCYTES
US20190367873A1 (en) Methods of generating oligodendrocytes and cell populations comprising same
TW202140783A (zh) 活體外誘導多潛能性幹細胞增殖及分化
EP3814501A1 (en) Mirnas mir-155 and mir-27b, and use thereof for stimulating mesenchymal stem cells
JP2026502521A (ja) 増強された抗炎症性活性を有するドーパミン作動性ニューロンを使用して神経学的疾患を処置するための組成物および方法
WO2026074556A1 (en) Methods for rejuvenating human cells with micro rnas
Chang et al. MicroRNAs in Development, Stem Cell Differentiation, and Regenerative Medicine
Jones Development of methods for retinal ganglion cell replacement in glaucoma

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181102

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190124

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190412

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190507

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6526164

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees