JP7475323B2 - ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１５年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，５８０号明細書、および２０１６年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／３７８，９６４号明細書の優先権を主張する。前述の各特許出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、これは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。２０１６年１２月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１－０５０２０＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、サイズは、６０６，６５５バイトである。
肝臓への過剰なトリグリセリドの蓄積は、肝臓脂肪症（または脂肪肝）として知られ、インスリン抵抗性および脂肪異常症をはじめとする有害な代謝結果を伴う。脂肪肝は、多くの場合、過剰なアルコール摂取を有する対象、および肥満、糖尿病、または高脂血症を有する対象に見出される。しかしながら、過剰なアルコール摂取がない（＞１０ｇ／日）場合でも、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が発症し得る。ＮＡＦＬＤは、単純な脂肪肝（脂肪症）から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、硬変（肝臓の不可逆性、進行性瘢痕）に進行し得る広範囲の肝臓疾患を指す。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、共通して肝臓細胞（肝細胞）中に脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。
ＮＡＦＬＤ範囲は、単純性脂肪肝（脂肪症）と呼ばれるその最も単純な病期から始まり、そこから進行する。単純性脂肪肝は、肝臓細胞中の脂肪（トリグリセリド）の蓄積を含み、炎症（肝炎）または瘢痕（線維症）はない。ＮＡＦＬＤ範囲の次の段階および重症度は、ＮＡＳＨであり、これは、肝細胞中の脂肪の蓄積と共に、肝臓の炎症を含む。炎症性細胞は、肝臓細胞を破壊し（肝細胞壊死）、ＮＡＳＨは、最終的に肝臓の瘢痕（線維症）を招いた後、不可逆性、進行性瘢痕（硬変）に至る。ＮＡＳＨにより引き起こされる硬変は、ＮＡＦＬＤ範囲の最後の最も重篤な病期である。
ＮＡＦＬＤは、今や米国における慢性肝疾患の原因の第１位であり、現在、ＮＡＳＨと診断されている患者は約１００万人いる。ＮＡＳＨを有する対象は、心血管死亡リスクが一般集団と比較したときに２倍に上り、ＮＡＳＨは肝移植の３番目によく見られる原因である。
ヒト肝臓における脂質生合成の調節の中心エレメントは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）と呼ばれる転写因子群である。ＳＲＥＢＰ－１ａ、ＳＲＥＢＰ－１ｃおよびＳＲＥＢＰ－２と呼ばれる３つのＳＲＥＢＰアイソフォームがある。これらは前駆体形態で小胞体（ＥＲ）に位置し（非特許文献１；非特許文献２）、コレステロールの存在下でコレステロールおよび他の２つのタンパク質：ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＦシャペロン）およびＩｎｓｉｇ１（インスリン誘導性遺伝子１）に結合されている。コレステロールレベルが下がると、Ｉｎｓｉｇ－１がＳＲＥＢＰ－ＳＣＡＰ複合体から解離して、複合体がゴルジ体に移動することが可能になり、そこでＳＲＥＢＰが、ＳＣＡＰによって活性化される２つの酵素、Ｓ１ＰおよびＳ２Ｐ（サイト１／２プロテアーゼ；非特許文献３；非特許文献４）によって切断される。切断されたＳＲＥＢＰは、次に核へと移動し、いくつもの遺伝子のＳＲＥ（ステロール調節エレメント）に結合してその転写を刺激することにより、転写因子としての役割を果たす（非特許文献５）。転写される遺伝子の中には、その上方制御が血流へのコレステロールの流入増加につながるＬＤＬ受容体、デノボコレステロール合成における律速酵素であるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（非特許文献６）、ならびに脂肪酸合成に関与するいくつもの遺伝子、例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（トリグリセリド加水分解）およびアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ活性（トリグリセリド合成）の両方を有する多機能性酵素であるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）がある。
ＳＣＡＰ結合は、３つのＳＲＥＢＰアイソフォームの全ての輸送および活性化に必須であるため、身体自体の脂質生合成を、例えば、ＳＣＡＰの阻害およびそれによるＳＲＥＢＰ活性の阻害によって選択的かつ効率的に減弱させる薬剤でＳＣＡＰの発現および／または活性を阻害する場合、ＳＣＡＰ発現によって直接または間接的に媒介される病的過程の治療に有用となるであろう。
Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９３，７５：１８７ Ｈｕａ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９３，９０：１１６０３ Ｓａｋａｉ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９８，２：５０５ Ｒａｗｓｏｎ Ｒ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９９７，１：４７ Ｂｒｉｇｇｓ Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８：１４４９０ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００３，１３：５３４
現在、ＮＡＦＬＤの治療は、減量およびインスリン抵抗性または脂肪異常症などの二次的疾患の治療に関するものである。しかしながら、これまでＮＡＦＬＤの薬理学的治療は承認されていない。したがって、ＮＡＦＬＤを患う対象のための治療法が求められる。したがって、ＮＡＦＬＤ、例えば脂肪症およびＮＡＳＨに罹患している対象の治療法が必要とされている。
本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＳＣＡＰ遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象内にある細胞内にあり得る。本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ組成物を用いてＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法、および／またはＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害または低減から利益を受けるであろう対象、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患しているかまたはそれに罹患し易い対象を治療する方法も提供する。
したがって、一態様において、本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供する。本二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１～１３のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号１４～２６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つにおける配列のいずれか１つからなる群から選択される配列を含む。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号２のヌクレオチド３４５～３６３、３７８～３９６、３８３～４０１、４０２～４２０、４３７～４５５、４５８～４７６、４９１～５０９、１０１４～１０３２、１２３７～１２５５、１２４３～１２６１、１２５９～１２７７、１３１８～１３３６、１３２３～１３４１、１４９７～１５１５、１５７１～１５８９、１５８８～１６０６、１６０５～１６２３、１７２５～１７４３、１７６７～１７８５、１９４６～１９６４、２００４～２０２２、２１６０～２１７８、２１９３～２２１１、２２１７～２２３５、２５１７～２５３５、２５４７～２５６５、２６１６～２６３４、２６６３～２６８１、２７１７～２７３５、２７３４～２７５２、２７５１～２７６９、２８７４～２８９２、２８８５～２９０３、２９９８～３０１６、３２７６～３２９４、３２９２～３３１０、３３２５～３３４３、３３４２～３３６０、３４２０～３４３８、３４６９～３４８７、３４７８～３４９６、３５３３～３５５１、３５４９～３５６７、３５６５～３５８３、３５７９～３５９７、３６２２～３６４０、３６６７～３６８５、３７７１～３７８９、３７８８～３８０６、３８７１～３８８９、３８９１～３９０９、３９０４～３９２２、３９２１～３９３９、４００２～４０２０、４０１０～４０２８、４０２７～４０４５、４０７５～４０９３、４１２９～４１４７、４１４５～４１６３、４１４９～４１６７、４１６８～４１８６、４１８４～４２０２および４１９７～４２１５のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、表５および表６に列挙されるとおりのＡＤ－７７６３３、ＡＤ－７７６３１、ＡＤ－７７６３０、ＡＤ－７７６２９、ＡＤ－７７６２７、ＡＤ－７７６２５、ＡＤ－７７６２４、ＡＤ－７７５８７、ＡＤ－７７５７３、ＡＤ－７７５７２、ＡＤ－７７５７１、ＡＤ－７７５６７、ＡＤ－７７５６６、ＡＤ－７７７３８、ＡＤ－７７７３１、ＡＤ－７７７３０、ＡＤ－７７７２９、ＡＤ－７７７２１、ＡＤ－７７７１８、ＡＤ－７７７０６、ＡＤ－７７７０１、ＡＤ－７７６９０、ＡＤ－７７６８８、ＡＤ－７７６８６、ＡＤ－７７６６９、ＡＤ－７７６６７、ＡＤ－７７６６２、ＡＤ－７７６６０、ＡＤ－７７６５６、ＡＤ－７７６５５、ＡＤ－７７６５４、ＡＤ－７７５５５、ＡＤ－７７５５４、ＡＤ－７７５４７、ＡＤ－７７５３０、ＡＤ－７７５２９、ＡＤ－７７５２７、ＡＤ－７７５２６、ＡＤ－７７５２１、ＡＤ－７７５１９、ＡＤ－７７５１８、ＡＤ－７７５１４、ＡＤ－７７５１３、ＡＤ－７７５１２、ＡＤ－７７５１０、ＡＤ－７７５０７、ＡＤ－７７５０５、ＡＤ－７７４９９、ＡＤ－７７４９８、ＡＤ－７７４９４、ＡＤ－７７４９２、ＡＤ－７７４９１、ＡＤ－７７４９０、ＡＤ－７７４８６、ＡＤ－７７４８５、ＡＤ－７７４８４、ＡＤ－７７４８３、ＡＤ－７７４７９、ＡＤ－７７４７８、ＡＤ－７７４７７、ＡＤ－７７４７６、ＡＤ－７７４７５およびＡＤ－７７４７４からなる群から選択される二重鎖のアンチセンスヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖に４個以下（すなわち、４、３、２、１、または０個）の未修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に４個以下（すなわち、４、３、２、１、または０個）の未修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に４個以下（すなわち、４、３、２、１、または０個）の未修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖におけるヌクレオチドの実質的に全部が修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖におけるヌクレオチドの実質的に全部が修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖におけるヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から独立して選択される。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体およびドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’末端デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾および２’フルオロ修飾である。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、例えば、６、７、または８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１７ヌクレオチド長の相補性領域を含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、１９および２３ヌクレオチド長の相補性領域を含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長である相補性領域を含む。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の各鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも一方の鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。一実施形態では、リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に共役されている。一実施形態では、リガンドは、一価または分枝状の二価もしくは三価のリンカーを介してセンス鎖の３’末端に共役されている。一実施形態では、リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に共役されたＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。特定の実施形態では、リガンドは、分枝状の二価または三価のリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端に共役されている。特定の実施形態では、リガンドは、
Figure 0007475323000001
 である。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 0007475323000002
 に示されるとおりにリガンドに共役されており、式中、Ｘは、ＯまたはＳである。
一部の実施形態では、Ｘは、Ｏである。特定の実施形態では、リガンドは、コレステロールである。
一部の実施形態では、相補性領域は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のいずれか１つを含む。他の実施形態では、相補性領域は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つにおけるアンチセンス配列のいずれか１つからなる。
一態様において、本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されている。
一部の実施形態では、ｉは、０であり；ｊは、０であり；ｉは、１であり；ｊは、１であり；ｉおよびｊの両方は、０であり；またはｉおよびｊの両方は、１である。一部の実施形態では、ｋは、０であり；ｌは、０であり；ｋは、１であり；ｌは、１であり；ｋおよびｌの両方は、０であり；またはｋおよびｌの両方は、１である。
一部の実施形態では、ＸＸＸは、Ｘ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、およびＺＺＺは、Ｚ’Ｚ’Ｚ’と相補的である。一部の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。一部の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２および１３位に存在する。一部の実施形態では、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチルである。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）
によって表される。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｂ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）によって表される。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｂ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）によって表される。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｄ）
（式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、かつ各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）によって表される。
一部の実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対長である。一部の実施形態では、各鎖は、１５～３０ヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
一部の実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。
一部の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体；またはコレステロールである。
一部の実施形態では、リガンドは、
Figure 0007475323000003
 である。
一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合されている。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 0007475323000004
 に示されるとおりにリガンドに共役されている。
一部の実施形態では、本薬剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の３’末端にある。一部の実施形態では、この鎖は、アンチセンス鎖である。一部の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。
一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の５’末端にある。一部の実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。一部の実施形態では、鎖は、センス鎖である。
一部の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。一部の実施形態では、鎖は、アンチセンス鎖である。
一部の実施形態では、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位の塩基対は、ＡＵ塩基対である。一部の実施形態では、Ｙヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を含有する。一部の実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含有する。一部の実施形態では、ｐ’＞０である。一部の実施形態では、ｐ’＝２である。一部の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的である。一部の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと非相補的である。
一部の実施形態では、センス鎖は、合計で２１のヌクレオチドを有し、およびアンチセンス鎖は、合計で２３のヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている。一部の実施形態では、全てのｎｐ’がホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されている。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が修飾を含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。本組成物は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、非緩衝溶液において投与される。一部の実施形態では、非緩衝溶液は、生理食塩水または水である。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、緩衝溶液によって投与される。一部の実施形態では、緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。一部の実施形態では、本医薬組成物は、脂質製剤をさらに含む。一部の実施形態では、脂質製剤は、ＬＮＰを含む。一部の実施形態では、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。
一態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されている。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されている。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
さらに別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）
（式中、各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されている。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されている。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
さらに別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾と異なり、およびＮｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾と異なる）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
別の態様において、本発明は、細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＣＡＰをコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）
（式中、各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、および少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結されており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、各々独立に、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、これらの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である）によって表され；センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；センス鎖は、少なくとも１つのリガンドに共役されており、このリガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
さらに別の態様において、本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１～１３のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、およびアンチセンス鎖は、配列番号１４～２６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部は、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部は、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含み、センス鎖は、３’末端で分枝状の二価または三価のリンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に共役されている。
別の態様において、本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１～１３のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、およびアンチセンス鎖は、配列番号１４～２６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、センス鎖は、少なくとも１つの３’末端デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴ）を含み、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの３’末端デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴ）を含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞を提供する。
本発明はまた、細胞におけるＳＣＡＰ発現を阻害する方法も提供する。本方法は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物と細胞を接触させるステップと；細胞を、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それにより細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。
特定の実施形態では、細胞は、対象内にある。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、ヒト女性である。別の実施形態では、対象は、ヒト男性である。
特定の実施形態では、ヒト対象は、ＳＣＡＰ関連疾患に罹患している。一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。さらに別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、肥満症である。さらに別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、インスリン抵抗性である。
特定の実施形態では、ＳＣＡＰ発現は、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％または少なくとも約９０％だけ阻害される。
別の態様において、本発明は、ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう障害を有する対象を治療する方法を提供する。本方法は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それにより対象を治療するステップを含む。
特定の実施形態では、ヒト対象は、ＳＣＡＰ関連疾患に罹患している。一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。さらに別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、肥満症である。さらに別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患、はインスリン抵抗性である。
特定の実施形態では、対象への本二本鎖ＲＮＡｉ剤の投与は、１つ以上の血清脂質、例えばトリグリセリド類の減少および／またはＳＣＡＰタンパク質蓄積の減少を生じさせる。特定の実施形態では、対象への本二本鎖ＲＮＡｉ剤の投与は、ＰＮＰＬＡ３タンパク質蓄積またはＳＲＥＢＰタンパク質蓄積の減少を生じさせる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、例えば、生活習慣の変更、例えば、運動、減量、食事の変更、抗酸化剤療法、ω－３－脂肪酸の摂取、および／または肝移植など、追加の療法剤および／または治療の投与をさらに含む。
一部の実施形態では、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。他の実施形態では、本二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に皮下投与される。
さらなる態様において、本発明はまた、対象におけるＳＣＡＰの発現を阻害する方法も提供する。本方法は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それにより対象におけるＳＣＡＰの発現を阻害するステップを含む。
別の態様において、本発明は、対象における血漿トリグリセリドレベルを低下させる方法を提供する。本方法は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それにより対象における血漿トリグリセリドレベルを低下させるステップを含む。
別の態様において、本発明は、脂肪症を有する対象もしくは脂肪症を発症するリスクがある対象、例えば、イヌシン抵抗性を有する対象もしくは肥満の対象における脂肪症からＮＡＳＨへの進行；またはＮＡＳＨを有する対象もしくは肝硬変を発症するリスクがある対象におけるＮＡＳＨから肝硬変への進行など、対象におけるＮＡＦＬＤの進行を阻害する方法を提供する。本方法は、本明細書に提供される二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それにより対象におけるＮＡＦＬＤの進行を阻害するステップを含む。
一部の実施形態では、本発明の方法は、対象における血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、対象におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、対象における血漿トリグリセリドレベルを決定するステップ、および／または対象における肝脂肪レベルを決定するステップをさらに含み得る。
さらに別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態では、本発明は、細胞におけるＳＣＡＰの発現を阻害するのに有効な量の本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させることにより、細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法を実施するためのキットを提供する。本キットは、ＲＮＡｉ剤と、使用説明書と、任意選択で、対象にＲＮＡｉ剤を投与する手段とを含む。
本発明は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＳＣＡＰ遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象内にある細胞内にあり得る。本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用してＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法、および／またはＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害または低下から利益を受けるであろう障害、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有する対象を治療する方法も提供する。
本発明のｉＲＮＡとしては、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長などの約３０ヌクレオチド長以下の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が挙げられ、その領域は、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、Ｃ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な少なくとも１９の連続ヌクレオチドの領域を含むより長い長さ、例えば最長６６ヌクレオチド、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチド長を含み得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。より長い長さのアンチセンス鎖を有するこれらのｉＲＮＡは、好ましくは、２０～６０ヌクレオチド長の第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み、ここで、センス鎖とアンチセンス鎖とは、１８～３０の連続ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
これらのｉＲＮＡを使用することにより、哺乳類のＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡを標的化して分解することが可能になる。特に、極めて低い投薬量のＳＣＡＰ ｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を特異的かつ効率的に媒介することができ、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の有意な阻害をもたらし得る。本発明者らは、細胞ベースのアッセイを用いて、ＳＣＡＰを標的化するｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介し、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の有意な阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有する対象など、ＳＣＡＰタンパク質のレベルおよび／または活性の低下によって利益を受けるであろう対象の治療に有用である。
以下の詳細な説明は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作製して利用する方法、ならびにこの遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受けるであろう疾患および障害を有する対象を治療するための組成物および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合には常に、列挙された値の中間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。用語「または」は、本明細書では、文脈上特に明らかに指示されない限り、用語「および／または」を意味して使用され、およびそれと同義的に使用される。
「約」という用語は、本明細書では、当技術分野における典型的な誤差の範囲内を意味するために使用される。例えば、「約」は、平均値からの約２標準偏差として理解することができる。特定の実施形態では、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態では、約は、±５％を意味する。約が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「約」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
数値または一連の数値の前に置かれる「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数値、および文脈から明らかなように、論理的に包含され得るあらゆる後続の数値または整数を含むことが理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示される特性を有することを意味する。「少なくとも」が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「少なくとも」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
本明細書の用法では、「～以下」または「～未満」は、その語句に隣接する数値、および文脈から論理的であるように、論理的にそれより低い、ゼロまでの値または整数として理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、または０ヌクレオチドオーバーハングを有する。「～以下」が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「～以下」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
用語「ＳＣＡＰ」は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質としても知られる、限定はされないが、特に指定のない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、およびモルモットを含めた任意の脊椎動物または哺乳類起源のアミノ酸配列を有するステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロンを指す。この用語はまた、天然ＳＣＡＰの少なくとも１つの生体内または試験管内活性を維持している天然ＳＣＡＰの断片および変異体も指す。この用語には、完全長のプロセシングされていない前駆体形態のＳＣＡＰ、ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断によって生じる成熟形態が包含される。ヒトＳＣＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：６６９３２９０１（ＮＭ＿０１２２３５．２；配列番号１）を参照し得る。
ヒトＳＣＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：９８７９９６５９７（ＮＭ＿０１２２３５．３；配列番号２）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５３０３７２０９７（ＸＭ＿００５２６４９６７．１；配列番号３）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５３０３７２０９９（ＸＭ＿００５２６４９６８．１；配列番号４）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５３０３７２１０１（ＸＭ＿００５２６４９６９．１；配列番号５）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７６７９２２６９１（ＸＭ＿０１１５３３５０１．１；配列番号６）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７６７９２２６９３（ＸＭ＿０１１５３３５０２．１；配列番号７）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７６７９２２６９６（ＸＭ＿００５２６４９７０．３；配列番号８）；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５３０３７２１０５（ＸＭ＿００５２６４９７１．１；配列番号９）；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７６７９２２６９７（ＸＭ＿００５２６４９７２．３；配列番号１０）も参照し得る。
カニクイザルＳＣＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５４４４１３９７２（ＸＭ＿００５５４６９６３．１；配列番号１１）を参照し得る。マウスＳＣＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５５７６３６６６８（ＮＭ＿００１１０３１６２．２；配列番号１２）を参照し得る。ラットＳＣＡＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：１５５３６９２８６（ＮＭ＿００１１００９６６．１；配列番号１３）を参照し得る。ＳＣＡＰ配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを用いて容易に入手可能である。
用語「ＳＣＡＰ」はまた、本明細書で使用されるとき、ＳＣＡＰ遺伝子における一塩基変異多型など、ＳＣＡＰ遺伝子の天然に存在するＤＮＡ配列変異によって細胞で発現する特定のポリペプチドも指す。ＳＣＡＰ遺伝子内に多くのＳＮＰが同定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰを参照し得る（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）。ＳＣＡＰ遺伝子内にあるＳＮＰの非限定的な例については、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ受託番号ｒｓ９２６１０３；ｒｓ１２４８７７３６；ｒｓ１２４９０３８３；ｒｓ７５４４９８；ｒｓ８７７０９７；ｒｓ８７８６５９；ｒｓ８８１２６４；ｒｓ９００６９０；ｒｓ９００６９１；ｒｓ９００６９２；ｒｓ９０９２００；ｒｓ９０９２０１；ｒｓ９２８３９１；またはｒｓ９４３５５５を参照し得る。
本明細書で使用されるとき、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含め、ＳＣＡＰ遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、少なくとも、ＳＣＡＰ遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列のその部分またはその近傍におけるｉＲＮＡ指向性切断の基質としての役割を果たすのに十分な長さであり得る。
標的配列は、例えば約１５～３０ヌクレオチド長などの約９～３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドなど、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図される。
本明細書の用法では、「配列を含む鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば、表１を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分で置き換え得ることを十分承知している。限定を意図しない例として、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を調節し、例えば阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えば、ＳＣＡＰ標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）として知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、これらのｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＳＣＡＰ遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなＲＮＡｉを指すために本明細書で使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された一本鎖ＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２に結合し、次にこれが、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３－８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＳＣＡＰ遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載するとおり、各鎖または両方の鎖は、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。さらに、本明細書の用法では、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含んでもよい。本明細書の用法では、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立に、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、もしくは核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の薬剤での使用に好適な修飾は、本明細書に開示する、または当技術分野で公知のあらゆる種類の修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される任意のそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９～３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５～３０塩基対長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得；一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、１０ヌクレオチド以下であってもよい。一部の実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～１０の不対ヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであってよい。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。ＲＮＡｉ剤の一実施形態では、少なくとも一方の鎖が少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも一方の鎖が少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも一方の鎖が少なくとも２ヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。なおも他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端および５’末端の両方が少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を導くために標的ＲＮＡ配列、例えばＳＣＡＰ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用するｄｓＲＮＡであり、その各鎖は１９～２３ヌクレオチドを含む。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡと結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼは、標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたはそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組合せ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチド、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハングのヌクレオチドの１つ以上がヌクレオシドチオホスフェートに置換されている。
特定の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方のオーバーハングは、１０ヌクレオチドを超える伸長された長さ、例えば、１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドの長さを含み得る。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖にある。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖にある。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸で置換されている。特定の実施形態では、オーバーハングは、自己相補性部分を含み、そのため、オーバーハングは、生理的条件下で安定なヘアピン構造の形成能を有する。
用語「平滑」または「平滑末端化された」は、ｄｓＲＮＡを参照して本明細書で使用されるとき、ｄｓＲＮＡの所与の端部側の末端に対を成さないヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方または両方の末端が平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両方の末端が平滑である場合、そのｄｓＲＮＡは、平滑末端化されていると言われる。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、両方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えば、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、「相補性領域」という用語は、例えば、本明細書で定義されるとおりのＳＣＡＰヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。概して、最も許容されるミスマッチはｉＲＮＡの末端領域、例えば、５’末端および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチドの範囲内にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が起こる標的の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端、および切断部位に直接隣接する３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端、および切断部位に直接隣接する２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、特に、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１と結合する部位に存在し、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などの他の条件が適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし、本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つ以上であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかし、ハイブリダイゼーションに際して、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えば、ＳＣＡＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＳＣＡＰ遺伝子をコードするｍＲＮＡの非分断部分と実質的に相補的であれば、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＳＣＡＰ配列と完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＳＣＡＰ配列と実質的に相補的であり、配列番号１～１３のヌクレオチド配列、または配列番号１～１３の断片の均等な領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＳＣＡＰ配列と実質的に相補的であり、表２、表３、表５、または表６のいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つ、または表２、表３、表５、または表６のいずれか１つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか１つの断片とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、次に、そのアンチセンスポリヌクレオチドが標的ＳＣＡＰ配列と同じであり、ここで、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号１４～２６のヌクレオチド配列、または配列番号１４～２６のいずれか１つの断片の均等な領域とその全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約％９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＳＣＡＰ遺伝子が転写されるところであり、かつＳＣＡＰ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞集団から単離し得る、またはそこに検出し得るＳＣＡＰ ｍＲＮＡの量を、第１の細胞または細胞集団と実質的に同一であるがそのような処理を受けていない第２の細胞または細胞集団（対照細胞）と比較したときの低下によって評価される。阻害の程度は、
Figure 0007475323000005
 の点で表すことができる。
ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させる」という語句は、本明細書で使用されるとき、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させることには、ｉＲＮＡと試験管内で細胞を接触させること、またはｉＲＮＡと生体内で細胞を接触させることが含まれる。接触は直接または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤が、個々にこの方法を実施することによって細胞と物理的接触下に置かれてもよく、あるいはＲＮＡｉ剤が、続く細胞との接触を許容し得るかまたはそれを引き起こし得る状況に置かれてもよい。
試験管内での細胞の接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ剤とインキュベートすることにより行われ得る。生体内での細胞の接触は、例えば細胞が位置する組織中またはその近傍にＲＮＡｉ剤を注入することによるか、またはＲＮＡｉ剤を別の範囲、例えば血流中または皮下腔に注入して、続いて接触させようとする細胞が位置する組織に薬剤を到達させることによって行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば肝臓に導くリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３を含有し得るか、および／またはそれとカップリングされ得る。試験管内および生体内接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はまた、試験管内でＲＮＡｉ剤と接触させて、続いて対象に移植してもよい。
一実施形態では、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞への取込みまたは吸収を促進し、または生じさせることにより「導入すること」または「ｉＲＮＡを細胞に送達すること」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取込みは、自然の拡散または活性細胞過程で、または助剤もしくは装置によって起こり得る。細胞へのｉＲＮＡの導入は試験管内および／または生体内であってよい。例えば、生体内導入については、ｉＲＮＡが組織部位に注入され、または全身投与される。細胞への試験管内導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当技術分野において公知の方法を含む。さらなる手法については、本明細書で以下に記載され、および／または当技術分野において公知である。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、核酸分子、例えばｉＲＮＡまたはｉＲＮＡの転写元のプラスミドなど、薬学的に活性な分子を封入する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰについては、例えば、米国特許第６，８５８，２２５号明細書、同第６，８１５，４３２号明細書、同第８，１５８，６０１号明細書、および同第８，０５８，０６９号明細書（これらの内容は、全て本明細書によって参照により本明細書に援用される）に記載されている。
本明細書の用法では、「対象」は、霊長類（ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）をはじめとする哺乳類、または鳥類（例えば、アヒルもしくはガチョウ）などの動物である。一実施形態では、対象は、ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病状について治療または評価されるヒト；ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病状を有するヒト；および／または本明細書に記載されるようにＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病状について治療されるヒトなどのヒトである。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」または「治療」は、限定はされないが、ＳＣＡＰ遺伝子発現および／またはＳＣＡＰタンパク質産生に関連する１つ以上の症状、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝炎、肝臓細胞壊死、肝線維症、肥満症、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の軽減または改善を含めた有益なまたは所望の結果を指す。「治療」はまた、治療を施さない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味し得る。
対象におけるＳＣＡＰのレベルまたは疾患マーカもしくは症状に関連して「低下させる」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれを超え得る。特定の実施形態では、低下は少なくとも２０％である。対象のＳＣＡＰレベルに関連して「低下させる」とは、好ましくは、かかる障害を有しない個体の正常範囲内にあると認められるレベルに至るまでの低下である。
本明細書の用法では、ＳＣＡＰ遺伝子の発現および／またはＳＣＡＰタンパク質の産生の低下から利益を受けるであろう疾患、障害もしくはその病状に関して使用される「予防」または「予防する」は、対象が、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子発現の症状、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の存在などの疾患、障害、または病状に伴う症状を発症する可能性の低下を指す。疾患、障害または病状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または病状に伴う症状発症の減少（例えば、その疾患または障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％の）、または遅延した症状呈示の遅延（例えば、数日間、数週間、数ヶ月または数年間）が、効果的予防と見なされる。
本明細書で使用されるとき、用語「ＳＣＡＰ関連疾患」は、ＳＣＡＰ遺伝子発現またはＳＣＡＰタンパク質産生によって引き起こされるかまたはそれに関連する疾患または障害である。用語「ＳＣＡＰ関連疾患」には、ＳＣＡＰ遺伝子発現、複製、またはタンパク質活性の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病態が含まれる。ＳＣＡＰ関連疾患の非限定的な例としては、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満症、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、アテローム性動脈硬化症、膵炎、非インスリン依存性真性糖尿病、冠動脈心疾患、および脳血管疾患が挙げられる。一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、肝硬変である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、肥満である。
一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。本明細書の用法では、「非アルコール性脂肪性肝疾患」は、「ＮＡＦＬＤ」という用語と置き換え可能に用いられ、毎日２０ｇｍ未満のアルコール摂取の存在下で、大血管性脂肪症の存在により定義される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国で最も一般的な肝臓疾患であり、一般に、インスリン抵抗性／２型糖尿病および肥満に関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪症、脂肪性肝炎、硬変、および時として肝細胞癌により発現される。ＮＡＦＬＤについて詳しくは、Ｔｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｄａｌｐｉａｚ（２００７）Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｒｉｓｋ．Ｍａｎａｇ．，３（６）：１１５３－１１６３（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪症」、「肝脂肪症」、および「脂肪性肝疾患」は、肝臓細胞内へのトリグリセリド類および他の脂肪の蓄積を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」は、肝臓内への脂肪の蓄積によって引き起こされる肝炎および肝損傷を指す。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる病態群の一部である。ＮＡＳＨはアルコール性肝疾患と類似しているが、アルコールをほとんどまたは全く飲まない人にも起こる。ＮＡＳＨの主な特徴は、炎症および損傷を伴う肝臓内の脂肪である。ＮＡＳＨを有する人の大多数は体調が良く、肝臓に問題があることに気付かない。それにもかかわらず、ＮＡＳＨは重篤になることもあり、肝臓が永久的な損傷を受けて瘢痕化し、もはや正常に機能できなくなる肝硬変につながり得る。ＮＡＳＨは、通常、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）など、ルーチンの血液検査パネルに含まれる肝検査値の上昇が認められる人において初めは疑われる。さらなる評価によっても肝疾患の明確な理由（薬物療法、ウイルス性肝炎、またはアルコール過剰摂取など）が示されない場合、および肝臓のＸ線または画像診断が脂肪を示す場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの診断を立証し、それを単なる脂肪肝と区別する唯一の手段は肝生検である。
本明細書で使用されるとき、組織学的に定義される用語「肝硬変」は、線維症および正常な肝臓構造から構造的に異常な結節への変化によって特徴付けられる肝臓のびまん性の経過である。
本明細書で使用されるとき、用語「血清脂質」は、血中に存在する任意の重大な脂質を指す。血清脂質は、遊離形態で、またはタンパク質複合体、例えばリポタンパク質複合体の一部としてのいずれかで血中に存在し得る。血清脂質の非限定的な例としては、トリグリセリド類（ＴＧ）、コレステロール、例えば、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）および中間比重リポタンパク質コレステロール（ＩＤＬ－Ｃ）を挙げることができる。
「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、ＳＣＡＰ関連障害を有する対象への投与時に疾患の治療を（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減し、改善し、または維持することにより）もたらすのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤がどのように投与されるか、疾患およびその重症度ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、存在する場合には先行治療または併用治療のタイプ、および他の治療下の対象の個別的な特徴に応じて異なり得る。
「予防有効量」は、本明細書で使用されるとき、ＳＣＡＰ関連障害を有する対象への投与時に疾患または疾患の１つ以上の症状を予防または改善するのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾患の改善としては、疾患経過の減速、または後に発症する疾患の重症度の低下が挙げられる。「予防有効量」は、ｉＲＮＡ、薬剤投与方法、疾患リスクの程度、および治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、存在する場合には他の個人特性に応じて変動してもよい。
「治療有効量」または「予防有効量」としてはまた、あらゆる治療薬に当てはまる妥当な利点／リスク比で、いくつかの所望の局所性または全身性効果を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も挙げられる。本発明の方法で用いられるｉＲＮＡは、このような治療に当てはまる妥当な利点／リスク比を生じるのに十分な量で、投与されてもよい。
「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書で、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、または他の問題または合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒト対象および動物対象の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
本明細書の用法では、「薬理的に許容可能な担体」という語句は、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、滑石マグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸など）、または対象化合物を１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運搬または輸送するのに関与する溶媒封入材料などの薬理的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、治療される対象に傷害性でないと言う意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬理的に許容可能な担体の役割を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウム状態、ラウリル硫酸ナトリウム、および滑石などの平滑剤；（８）カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル、および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびエチルラウレートなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなどの血清成分；および（２２）医薬製剤で用いられる他の無毒の適合性物質が挙げられる。
本明細書の用法では、「サンプル」という用語は、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織の採取物、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄ）、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、臓器または局在性領域からのサンプルが挙げられる。例えば、サンプルは、特定の臓器、臓器の部分、または体液またはこれらの臓器内の細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定のセグメントまたは肝臓内の特定の種類の細胞、例えば肝細胞など）から得られてもよい。一部の実施形態では、「対象から得られたサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象から得られたサンプル」は、対象から得られた肝臓組織（またはその構成部分）または網膜組織（またはその構成部分）を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本明細書に記載されるのは、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡである。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などのＳＣＡＰ関連障害を有するヒトのような、哺乳類などの対象内の細胞などの細胞内で、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＳＣＡＰ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド長以下）である。ＳＣＡＰ遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、ＳＣＡＰ遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、もしくは鳥類ＳＣＡＰ遺伝子）の発現を、例えば、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づく方法により、あるいは、例えば、ウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などのタンパク質に基づく方法によりアッセイして、少なくとも約１０％だけ阻害する。
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、かつ当技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
一般に、二本鎖構造は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどの１５～３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長など１５～３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さも本発明の一部であることが意図される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２３ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの約９～３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることも認識するであろう。したがって、一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＳＣＡＰ遺伝子発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたはそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組合せ上にあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または両方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または両方を使用して調製し得る。
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖配列は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つに提供される配列の群から選択されてもよく、およびセンス鎖のアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド配列は、表２、表３、表５および表６のいずれか１つの配列の群から選択されてもよい。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＳＣＡＰ遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがって、この態様では、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、一方のオリゴヌクレオチドが、表２、表３、表５および表６のいずれか１つにおけるセンス鎖（パッセンジャー鎖）として記載され、および第２のオリゴヌクレオチドが、表２、表３、表５および表６のいずれか１つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として記載される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。
表２、表３、表５および表６の配列は、修飾された配列および／または複合体化した配列として記載されるが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、表２、表３、表５および表６のいずれか１つに示される修飾されていない、複合体化していない、および／またはそこに記載されているものと別様に修飾されているおよび／または複合体化している配列のいずれか１つを含み得ることが理解されるであろう。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８）。しかし、他の当業者は、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造も同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上述の実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けているより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって、本明細書で提供される配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、ＳＣＡＰ遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下だけ異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに、本明細書に記載されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＳＣＡＰ転写物中の部位を同定する。したがって、本発明は、この部位内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＳＣＡＰ遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結されている、本明細書で提供される配列の１つからの約１５個の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えば、コンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチも取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスにより、同定された配列の（本明細書に記載される、または当技術分野において公知のとおりのアッセイを用いた）体系的な合成および試験による最適なパフォーマンスの配列の同定と併せて、ｉＲＮＡ剤で標的化したときに標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定することができる。したがって、本明細書に同定される配列は有効な標的配列に相当するが、所与の配列の上流または下流に漸進的に１ヌクレオチドずつ「ウィンドウをずらす」ことにより、同等のまたはより良好な阻害特性の配列を同定して、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが企図される。
さらに、ヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、本明細書で同定されるあらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察される他の修飾により、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば、血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、標的配列との１つ以上のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えば、ＳＣＡＰ遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＳＣＡＰ遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に重要である。
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性または他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全部が修飾される。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全部が修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全部が修飾されている」本発明のｉＲＮＡは、大部分が修飾されているが、完全には修飾されておらず、５、４、３、２、または１以下の未修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当技術分野で確立された方法によって合成および／または修飾し得る。例えば、修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば、２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、かつ当技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると見なされる。一部の実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結されている、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有する他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載される。
本発明で取り上げる一部の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然リン酸ジエステル主鎖は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つ以上の置換糖部分を含有し得る。例えば、本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる、本明細書の以下の例に記載されるとおりのＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。さらなる例示的修飾には、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これらの３つのファミリーにおけるＲおよびＳ異性体の両方）；２’－アルコキシアルキル；および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が含まれる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
本発明のｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに、核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾することもできる。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分が、２’および４’炭素をつなぐ追加的な架橋を含んでいる。この構造はリボースを３’末端構造配置に有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックド核酸を加えると、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性が増し、オフターゲット効果が減少することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の二環式糖部分を含むように修飾することもできる。「二環式糖」は、２つの原子の架橋により修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を結合して、これにより二環系を形成する架橋を含む糖分子を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素および２’－炭素を結合する。このように、一部の実施形態では、本発明の薬剤は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’－エンド（ｅｎｄｏ）立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用する二環式ヌクレオシドの例としては、４’および２’リボシル環原子間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’－２’架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’－２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照））；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上に挙げた各々の内容全体を参照によって本明細書に援用する。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する追加の代表的な米国特許および米国特許公報としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；同第７，３９９，８４５号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；同第７，５６９，６８６号明細書；同第７，７４１，４５７号明細書；同第８，０２２，１９３号明細書；同第８，０３０，４６７号明細書；同第８，２７８，４２５号明細書；同第８，２７８，４２６号明細書；同第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含め、１つ以上の立体化学的糖配置を有する任意の前述の二環式ヌクレオシドを調製することができる（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾することもできる。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書で「Ｓ－ｃＥｔ」と称されるＳ配置である。
本発明のｉＲＮＡにはまた、１つ以上の「配座固定されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含まれ得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素またはリボースのＣ３炭素とＣ５’炭素をつなぐリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮはリボース環を安定した立体配置にロックし、ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション親和性を増加させる。このリンカーは酸素を安定性および親和性に関して最適な位置に置くのに十分な長さであるため、リボース環パッカリングが低減される。
上述のＣＲＮのいくつかの調製について教示する代表的な文献としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；および国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレット（その各々の内容全体が本明細書によって参照により本明細書に援用される）が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである１つ以上のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックド非環式核酸であり、この場合、糖の結合のいずれかが除去され、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素間の炭素－酸素－炭素共有結合）が除去されたモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の炭素－炭素共有結合）が除去されている（参照によって本明細書に援用する、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
前述したＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な文献として、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；および国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを挙げることができる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見出すことができる。
本発明のｉＲＮＡの他の修飾としては、５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に対する５’－末端リン酸またはリン酸模倣物がある。好適なリン酸模倣物は、例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書に開示されている。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１２年１１月１６日に出願された国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに開示されるように、化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号パンフレットに示されるとおり、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、特に切断部位またはその近傍において、３つの連続するヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを導入することにより、優れた結果を達成し得る。これ以外に、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾してもよい。これらのモチーフの導入により、存在する場合にはセンスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾パターンが分断される。ＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖のＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意選択で共役させてもよい。得られるＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を呈示する。
より具体的には、驚くことに、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位もしくはその近辺の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを有するように、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾するとき、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性は極めて増大することが見出された。
したがって、本発明は、標的遺伝的（すなわち、ＳＣＡＰ遺伝子）の発現をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２～３０ヌクレオチド長であってよい。例えば、各鎖は、１４～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長であってよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的に、デュプレックス二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成し、これは、本明細書で「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対長であってよい。例えば、二本鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対長、１７～３０ヌクレオチド対長、２７～３０ヌクレオチド対長、１７～２３ヌクレオチド対長、１７～２１ヌクレオチド対長、１７～１９ヌクレオチド対長、１９～２５ヌクレオチド対長、１９～２３ヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、２１～２５ヌクレオチド対長、または２１～２３ヌクレオチド対長であってよい。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一方もしくは両方の鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端に１つ以上のオーバーハング領域および／もしくはキャッピング基を含んでもよい。オーバーハングは、１～６ヌクレオチド長、例えば、２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、または１～２ヌクレオチド長であってよい。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長い結果、または同じ長さの２つの鎖がずれている結果生じ得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成してもよいし、または標的となる遺伝子配列と相補的であるか、または別の配列であってもよい。第１および第２鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加塩基により、または他の非塩基リンカーにより連結され得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、各々独立に、修飾または未修飾ヌクレオチドであってよく、こうしたものとして、２’－糖修飾、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端に対するオーバーハング配列であってよい。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成してもよいし、または標的となる遺伝子配列と相補的であるか、または別の配列であってもよい。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’もしくは３’末端をリン酸化してもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、２つのヌクレオチドは、同じでも異なってもよい。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、センス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、単一オーバーハングのみを含み、これは、その全体的安定性に影響を及ぼすことなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強化することができる。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはまた、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する、あるいはその逆の平滑末端であってもよい。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論による拘束は望まないが、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングの非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に作用する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
また別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖および２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑であるのに対し、他方の末端は、２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。２ヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、３つのヌクレオチドのうち２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、３番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第１鎖の１～２３位は、少なくとも８リボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の１～２３位と対合する位置に少なくとも８リボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であり、６つ以下の連続した３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であるため、１～６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と非対合である１０～３０の連続ヌクレオチドを含むため、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；センス鎖およびアンチセンス鎖を最大相補性のためにアラインメントすると、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合するため、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖化した領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり；センス鎖は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、これらのモチーフの少なくとも１つは、切断部位またはその近辺に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近辺に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５かつ最大で２９ヌクレオチドの長さを有する第１鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続ヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、最大で３０ヌクレオチドの長さを有する第２鎖とを含み；第１鎖の３’末端および第２鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２鎖は、その３’末端で第１鎖より１～４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、ここで、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近辺に存在する。
１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤の場合、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位および１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、またはアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近辺に３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖に対する３ヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖に対する３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するようにアラインメントされ得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、または全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位またはその近辺に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であってもよい。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位またはその近辺のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、または少なくとも１つ以上のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つ以上のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じかまたは異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位またはその近辺の第１のモチーフに対して一方の末端に、またはリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位またはその近辺に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つ以上のウイング修飾を含み得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対するウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端もしくは両方の末端に第１の１つまたは２つの末端を含まない。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対するウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端もしくは両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するようにアラインメントされ得る。
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドを修飾してもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の改変；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合により、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよいし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドのみに存在してもよく、あるいは二本鎖および一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端または両方の末端をリン酸化することができる。
例えば、安定性を高める、オーバーハング中に特定の塩基を含む、または一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、またはその両方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能となるであろう。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましい場合がある。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハング中の塩基の全部または一部を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾してもよい。修飾は、例えば、当技術分野で公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）もしくは２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルもしくは２’－フルオロ修飾、またはその他であってよい。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。「交互のモチーフ」という用語は、本明細書の用法では、１つ以上の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１ヌクレオチドおきに１つ、もしくは３ヌクレオチドごとに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであってよい。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じでも、異なっていてもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、そのヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、すなわち、１ヌクレオチドおきの修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対する交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖に対する交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するか、その逆であるようなシフトであってもよい。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合する場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、これにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、すなわち、センス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖および／またはアンチセンス鎖への、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフの導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを分断する。驚くことに、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを導入することによる、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの分断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を高める。
一実施形態では、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入されると、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾と異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、ＮａおよびＮｂは、同じかまたは異なる修飾であってよい。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在してもまたは存在しなくてもよい。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対する全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じでも、異なっていてもよく、センス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対してシフトを有し得る。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端での２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端での２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。さらに、ヌクレオチド間結合の修飾を実施して、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合させることもできる。例えば、少なくとも２、３、４、または全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合させる、追加ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端に存在してもよい。
一実施形態では、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方で、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似のまたは同様の分析を使用してもよい）を促進する傾向に基づいて評価することができる。解離の促進に関しては：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準または正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準もしくは正準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２または３塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態では、短い配列のデオキシ－チミンヌクレオチド、例えば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に対する２つのｄＴヌクレオチドがある。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉ）
によって表すことができ、式中、
ｉおよびｊは、各々独立に、０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立に、０～６であり；
各Ｎａは、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有しておらず；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて；または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得る（例えば、６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位または１１位、１２位、１３位に存在し得る）。
一実施形態では、ｉは１であり、ｊは０であり、またはｉは０であり、ｊは１であり、あるいは、ｉおよびｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでも、異なっていてもよい。
他の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩ）
によって表すことができ、式中、
ｋおよびｌは、各々独立に、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；
各Ｎａ’は、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有しておらず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近辺に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて；または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１で、ｌは０であるか、またはｋは０で、ｌは１であるか、またはｋおよびｌはいずれも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩｄ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、各Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋは０で、ｌは０であり、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同じでも、または異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾してもよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔであるとき、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで数え始めて、鎖の９位、１０位および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでもよく；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含んでもよく；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでもよく；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
によって表され、式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、各々独立に、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続ヌクレオチドに対する３つの同一の修飾の１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは、０で、ｊは、０であり；またはｉは、１で、ｊは０であり；またはｉは、０で、ｊは、１であり；またはｉおよびｊの両方が、０であり；またはｉおよびｊの両方が、１である。別の実施形態では、ｋは、０で、ｌは、０であり；またはｋは、１で、ｌは、０であり；ｋは０で、ｌは１であり；またはｋおよびｌの両方が、０であり；またはｋおよびｌの両方が、１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ’の各々は、独立に、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）中のＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでも、異なっていてもよい。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＹヌクレオチドの全３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＺヌクレオチドの全３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＸヌクレオチドの全３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドに対する修飾は、Ｙ’ヌクレオチドに対する修飾と異なり、Ｚヌクレオチドに対する修飾は、Ｚ’ヌクレオチドに対する修飾と異なり、および／またはＸヌクレオチドに対する修飾は、Ｘ’ヌクレオチドに対する修飾と異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。また別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカー（後述する）を介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に共役されている。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に共役されている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体に共役されている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれを超える二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される、２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに、および３’末端の一方もしくは両方と結合され、任意選択でリガンドに共役されている。ＲＮＡｉ剤は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；またはＲＮＡｉ剤の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
様々な文献が、本発明の方法に用いることができる多量体ＲＮＡｉ剤を記載している。そうした文献として、それぞれの全内容を参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号、同第２００７／１１７６８６号、同第２００９／０１４８８７号および同第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられる。
以下にさらに詳細に説明するように、ＲＮＡｉ剤に対する１つ以上の炭水化物部分の共役を含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットは、炭水化物リガンドに結合される別の部分、例えば、非炭水化物（好ましくは環状）担体で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってよく、すなわち、全ての環原子が炭素原子またはヘテロ環系である、すなわち、１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、イオウであってよい。環状担体は、単環系であってもよいし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含有するものであってもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよいし、または１つ以上の二重結合を含むものでもよい。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも１つの「係留結合点」を含む。「骨格結合点」は、本明細書の用法では、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸、もしくは修飾リン酸（例えば、イオウ含有）骨格への担体の組込みに利用可能で、しかもそれに好適な結合を指す。一部の実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）は、選択部分と結合する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子もしくはヘテロ原子（骨格結合点を賦与する原子と異なる）を指す。上記の選択部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であってよい。任意選択で、選択部分は、介入テザーによって環状担体と結合される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、または一般に、別の化学実体、例えば、リガンドを構成環に組み込む、または係留するのに好適な結合を提供する。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドに共役させてもよく、担体は、環状基または非環状基であってよく；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の実施形態では、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、表２および３のいずれか１つに列挙する薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドをさらに含んでもよい。
ＩＶ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つ以上のリガンド、部分または複合体をＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０）；例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：５３３－５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４）などの脂肪族鎖；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも血清タンパク質に結合することが知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもリガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなど、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合にかつ慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。加えてまたは代案として、当技術分野で公知のこのような合成のための他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製することも知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
一実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用し得る。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば、複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし、親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も脂質ベースのリガンドに代えてまたはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα－らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２７）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号２８））も標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号２９））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３０））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどのＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にする他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合された酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つ以上の単糖単位で構成される炭水化物自体；各炭素原子に結合された酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つ以上の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、
Figure 0007475323000006
Figure 0007475323000007
Figure 0007475323000008
Figure 0007475323000009
Figure 0007475323000010
 からなる群から選択される。
一実施形態では、単糖は、
Figure 0007475323000011
 などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
本明細書に記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合体としては、限定はされないが、
Figure 0007475323000012
 （ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である）が挙げられる。
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合されている。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合されている。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合されている。
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、各々独立に複数の一価のリンカーによって二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合された複数の（例えば、２、３、４、５、または６つの）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間で分断されていないヌクレオチド鎖によってつながることにより、複数の対を成さないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する１つのより大きい分子の一部であるとき、ヘアピンループ内にある対を成さないヌクレオチドの各々は、独立に、一価のリンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。ヘアピンループはまた、二重鎖の一方の鎖における延長したオーバーハングによって形成されてもよい。
一部の実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子および／または細胞透過性ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、上述の１つ以上の追加的なリガンドをさらに含む。
本発明での使用に好適なさらに別の炭水化物複合体（リンカー）としては、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１４／１７９６２０号および同第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されているものがある。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る様々なリンカーにより、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなど、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含み、その１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７この原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１７個の原子、または８～１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば、細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば、血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば、肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結され得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富む他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に、切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、または他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についても検査することも望ましい。したがって、第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件が他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
一実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば、候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役されている。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物複合体の非限定的な例としては、限定はされないが、
Figure 0007475323000013
Figure 0007475323000014
 （ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である）が挙げられる。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩＩ）～（ＸＸＸＶ）、
Figure 0007475323000015
 （式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終結され得；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、存在毎に各々独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 0007475323000016
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役されている。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＸＸＶＩ）、
Figure 0007475323000017
 （式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役された適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡにより、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要に応じて当技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって慣例的に検出し得る。
場合により、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合される分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合されている間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
ＩＶ．発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えばヒト対象などの対象（例えば、ＳＣＡＰ関連障害、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有する対象など、それを必要としている対象）内の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつもの異なる方法で達成することができる。例えば、送達は、試験管内または生体内のいずれかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つ以上のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に成功裏の遺伝子産物ノックダウンを示している。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、いずれも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａ．ｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得；いずれの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば、親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の両方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用も高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＳＣＡＰ遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば、形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのいずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモータにより、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結される逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための好都合な制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスも有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、必要に応じて、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて考慮すべき他の点は当技術分野において公知である。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含有する医薬組成物および製剤も含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。本ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、ＳＣＡＰ関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に有用である。
かかる医薬組成物は、送達方法に基づいて製剤化される。一例は、非経口送達を介した全身投与用、例えば、静脈内（ＩＶ）送達、筋肉内（ＩＭ）送達によるか、または皮下（ｓｕｂＱ）送達用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、連続ポンプ注入によるなど、肝臓への注入による肝臓への直接送達用に製剤化された組成物である。
本発明の医薬組成物は、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、レシピエントの体重１キログラム当たり１日約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、概して体重１キログラム当たり１日約１～５０ｍｇの範囲であり得る。典型的には、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇおよび約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
反復投与レジメンは、定期的な、例えば、１日おき～１年ごとの治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、約１ヵ月ごとから約３ヵ月ごと（すなわち、３ヵ月に約１回）に投与する。
最初の治療レジメン後、より低い頻度で治療薬を投与することができる。
医薬組成物は１日１回投与することができ、またはｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔を置いた２つ、３つ、またはそれを超えるサブ用量として、またはさらには制御放出製剤からの持続注入もしくは送達を用いて投与することができる。その場合、各サブ用量に含まれるｉＲＮＡは、対応して少なくして１日の総投薬量を達成しなければならない。投薬量単位はまた、例えば数日間にわたるｉＲＮＡの徐放をもたらす従来の徐放製剤を用いて、数日間にわたる送達用に化合物化することもできる。徐放製剤は当技術分野において周知であり、本発明の薬剤で用いられ得るような特定の部位への薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の１日用量を含有する。
他の実施形態では、医薬組成物の単回用量が長時間持続し得るため、後続の用量は３、４、または５日以下の間隔、または１、２、３、または４週間以下の間隔を置いて投与される。本発明の一部の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回用量が週１回投与される。本発明の他の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回用量が２ヵ月に１回投与される。
当業者は、限定はしないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患をはじめとする特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要な用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらには、治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡについての有効投薬量および生体内半減期の推定は、本明細書の他の部分に記載されるとおり、従来の方法を用いて、または適切な動物モデルを用いた生体内試験に基づいて行うことができる。
マウス遺伝学の進歩により、ＳＣＡＰの発現の低下から利益を受けるであろうＳＣＡＰ関連障害など、様々なヒト疾患の研究用にいくつものマウスモデルが作成されている。かかるモデルは、ｉＲＮＡの生体内試験および治療有効用量の決定に使用することができる。好適なマウスモデルは当技術分野において公知であり、例えば、肥満（ｏｂ）遺伝子に突然変異を含む肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Ｗｉｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：１０８１－１０８９）；ＬＤＬ受容体のホモ接合性ノックアウトを含むマウス（ＬＤＬＲ－／－マウス；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９２（２）：８８３－８９３）；食餌性アテローム性動脈硬化症マウスモデル（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．，３２：５５９－５６８）；およびヘテロ接合性リポタンパク質リパーゼノックアウトマウスモデル（Ｗｅｉｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６（６）：２５５５－２５６８）が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じてかつ治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば、経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
Ａ．膜様分子アセンブリーを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層以上の二重層など、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合により含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得、ＲＮＡｉを媒介し得る。場合により、リポソームも特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ＲＮＡｉ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得る。
必要に応じて、例えば凝縮を促進する担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨも調節して凝縮を支援し得る。
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９；およびＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載される例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組合せが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１を参照されたい）。一貫して小型（５０～２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９）。これらの方法は、リポソーム内のＲＮＡｉ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれらを封入する。核酸と脂質は、いずれも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；およびＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，４（６）：４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つ以上の特殊化された脂質を含むリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含み、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５，：６９４９）によって詳しく説明された。いずれもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含む、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質－核酸複合体を形成し、ＲＮＡｉ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷も正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合されることで、ＤＯＴＭＡと異なる。
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役されたカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役されているものが挙げられ、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８）。特定の細胞系では、共役されたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームは他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびＲＮＡｉ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのＲＮＡｉ剤の浸透を高めるのに使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：１８，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７－１７６；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２－５２７；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５を参照されたい）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）は、通常、界面活性剤である表面エッジ活性化剤を標準リポソーム組成物に添加して作成し得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに、脂質特性のために、これらのトランスファーソームは、自己最適化し（例えば、皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得、自己装填することが多い。
本発明を適用できる他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書も、本発明を適用できる製剤を記載する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常、界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成の両方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としても知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最もよく見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最もよく使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するために激しく混合される。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤も混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
ミセル調合物を噴霧として送達するために、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のために、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
Ｂ．脂質粒子
例えば、本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えば、ＬＮＰ、または他の核酸－脂質粒子などの脂質製剤中に完全にカプセル化してしてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「ＬＮＰ」は安定核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えば、ＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば、部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身的用途のために極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。加えて、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では、脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば限定なしに、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であり得る。
一部の実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように、（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合により、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で交換し得る。
Figure 0007475323000018
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
さらなる例示的脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を以下の表に記載する。
Figure 0007475323000019
Figure 0007475323000020
ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
ＸＴＣを含む製剤は、国際公開第２０１０／０８８５３７号パンフレット（この内容は、全て本明細書によって参照により本明細書に援用する）に記載される。
ＭＣ３を含む製剤は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年６月１０日に出願された、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載される。
ＡＬＮＹ－１００を含む製剤は、国際公開第２０１０／０５４４０６号パンフレット（この内容は、全て本明細書によって参照により本明細書に援用する）に記載される。
Ｃ１２－２００を含む製剤は、国際公開第２０１０／１２９７０９号パンフレット（この内容は、全て本明細書によって参照により本明細書に援用する）に記載される。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つ以上の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組合せが使用される。１つの例示的組合せは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではない他の適切な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその両方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要に応じて生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有し得る。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含む、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含む複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内によく分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなど、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いため、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、一般にエマルション製剤に添加されて製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組合せを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかし、マイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の両方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤も含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せをはじめとする他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の両方で、溶液中に存在する。しかし、通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を促進することに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照されたい）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することにより、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるため、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照されたい）。
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質も本発明医薬および他の組成物に添加し得る。例えば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとする他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって核酸と認識される核酸またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば、肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆる他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、乳糖および他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られる他の補助剤成分を、当技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかし、このような材料は、添加した場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得、必要に応じて製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有し得る。
一部の実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能し、ＳＣＡＰ関連障害の治療に有用な１つ以上の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定されるものではない。加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用される他の物質も、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用な他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＳＣＡＰ発現によって媒介される病理過程の治療に効果的な他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩ．ＳＣＡＰ発現の阻害方法
本発明はまた、細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本方法は、細胞におけるＳＣＡＰの発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させて、それにより細胞におけるＳＣＡＰの発現を阻害することを含む。本発明の特定の実施形態において、ＳＣＡＰは肝臓細胞において優先的に阻害される。
例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤などのｉＲＮＡと細胞の接触は、試験管内または生体内のいずれで実施してもよい。ｉＲＮＡと生体内の細胞の接触は、例えば、ヒト対象などの対象内の細胞または細胞群をｉＲＮＡと接触させることを含む。また、細胞を接触させる試験管内および生体内方法の組合せも可能である。細胞の接触は、前述したように、直接または間接的のいずれであってもよい。さらに、細胞の接触は、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意のリガンドをはじめとする、標的化リガンドによって達成することもできる。一部の実施形態では、標的化リガンドは、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンドなどの炭水化物部分、または目的の部位にＲＮＡｉ剤を誘導するいずれか他のリガンドである。
「阻害する」という用語は、本明細書の用法では、「低下する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」および他の類似用語と置き換え可能に用いられ、あらゆるレベルの阻害を含む。
語句「ＳＣＡＰの発現を阻害する」は、本明細書で使用されるとき、任意のＳＣＡＰ遺伝子（例えば、マウスＳＣＡＰ遺伝子、ラットＳＣＡＰ遺伝子、サルＳＣＡＰ遺伝子、またはヒトＳＣＡＰ遺伝子など）ならびにＳＣＡＰタンパク質をコードするＳＣＡＰ遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、ＳＣＡＰ遺伝子は、野生型ＳＣＡＰ遺伝子、突然変異体ＳＣＡＰ遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞集団、または生物のコンテクストにおけるトランスジェニックＳＣＡＰ遺伝子であり得る。
「ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する」には、少なくとも約２０％の阻害など、ＳＣＡＰ遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制が含まれる。特定の実施形態では、阻害は、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。
ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、ＳＣＡＰ遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベルまたはＳＣＡＰタンパク質レベルに基づいて評価し得る。ＳＣＡＰの発現はまた、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＩＤＬ－Ｃおよび総コレステロールを含む）、または遊離脂肪酸のレベルに基づいて間接的に評価してもよい。ＳＣＡＰの発現はまた、ＳＲＥＰＢレベルおよび／またはＰＮＰＬＡ３レベルのレベルに基づいて間接的に評価してもよい。
阻害は、これらの変数の１つ以上の絶対または相対レベルを対照レベルと比較した低下によって評価し得る。対照レベルは、当技術分野で利用されている任意のタイプの対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベル、または未処理の、もしくは対照（例えば、緩衝液単独対照または不活性薬剤対照など）によって処理された同様の対象、細胞、またはサンプルから決定されるレベルであってよい。
特定の実施形態では、代用マーカを用いてＳＣＡＰの阻害を検出することができる。例えば、許容できる診断およびモニタリング基準によって実証されるとおりの、ＳＣＡＰ発現を低下させる薬剤によるＳＣＡＰ関連障害、例えば肝障害の有効な治療とは、ＳＣＡＰの臨床的に関連性のある低下を実証することと理解され得る。
本発明の方法の一部の実施形態において、ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、またはアッセイの検出レベル未満まで阻害される。特定の実施形態では、本方法は、例えばＳＣＡＰの発現を低下させる薬剤による対象の治療後の臨床的に関連性のある転帰によって実証されるとおりの、ＳＣＡＰの発現の臨床的に関連性のある阻害を含む。
ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害は、ＳＣＡＰ遺伝子が転写されるところである、かつＳＣＡＰ遺伝子の発現が阻害されるように（例えば、その１つ以上の細胞を本発明のｉＲＮＡと接触させることによるか、またはその細胞が存在している、または存在した対象に本発明のｉＲＮＡを投与することにより）処理された第１の細胞または細胞集団（かかる細胞は、例えば、対象から得られたサンプル中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量を、第１の細胞または細胞集団と実質的に同一であるがそのような処理を受けていない第２の細胞または細胞集団（ｉＲＮＡで処理されていない、または目的の遺伝子を標的とするｉＲＮＡで処理されていない１つ以上の対照細胞）と比較したときの低下によって示され得る。阻害の程度は、
Figure 0007475323000021
 の点で表され得る。
他の実施形態では、ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害は、ＳＣＡＰ遺伝子発現と機能的に関係があるパラメータ、例えば、ＳＣＡＰタンパク質発現またはＳＣＡＰシグナル伝達経路の低下の点で評価し得る。ＳＣＡＰ遺伝子サイレンシングが、内因性または発現コンストラクトからの異種のいずれにしろ、ＳＣＡＰを発現する任意の細胞で、および当技術分野において公知の任意のアッセイにより決定されてもよい。
ＳＣＡＰタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群により発現されるＳＣＡＰタンパク質のレベル（例えば、対象由来のサンプル中で発現されるタンパク質のレベル）の低下によって明らかにすることができる。上に説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処置細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞または細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。
ＳＣＡＰ遺伝子の発現の阻害を評価するために使用することができる対照細胞または細胞群としては、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞または細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞または細胞群は、ＲＮＡｉ剤による対象の処置前に、個別の対象（例えば、ヒトもしくは動物対象）から得ることができる。
細胞または細胞群により発現されるＳＣＡＰ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態では、サンプル中のＳＣＡＰの発現レベルは、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡなどの転写ポリヌクレオチド、またはその部分を検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用をはじめとする、ＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイフォーマットとしては、核ランオン（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ－ｏｎ）アッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ）、ノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＳＣＡＰ ｍＲＮＡは、その全内容を参照によって本明細書に援用する、ＰＣＴ公開国際公開第２０１２／１７７９０６号パンフレットに記載の方法を用いて検出することができる。一部の実施形態では、ＳＣＡＰの発現のレベルは、核酸プローブを用いて決定される。「プローブ」という用語は、本明細書の用法では、特定のＳＣＡＰに選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるし、または適切な生物学的調製物から得ることもできる。プローブは、標識されるように、特にデザインしてもよい。プローブとして使用することができる分子の例として、限定はしないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに用いることができ、限定はしないが、こうしたものとして、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイが挙げられる。ｍＲＮＡレベルの一決定方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させるステップを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させ、ゲルからのｍＲＮＡをニトロセルロースなどの膜に移すことにより、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。別の実施形態では、プローブは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイを用いて、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡのレベルの決定に使用するために容易に適合させることができる。
サンプル中のＳＣＡＰの発現のレベルを決定するための別の方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載の実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－βレプリカーゼ（Ｑ－Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）またはいずれか他の核酸増幅法による、例えばサンプル中のｍＲＮＡの核酸増幅および／または逆転写酵素（ｃＤＮＡを生成するための）の工程後、当業者には周知の技術を用いて、増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少数存在する場合、核酸分子の検出に有用である。本発明の具体的な態様では、ＳＣＡＰの発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）または実施例２におけるＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイにより定量する。
ＳＣＡＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズもしくはファイバー（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を用いて、モニターすることができる。参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号および同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＳＣＡＰ発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡのレベルは、分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価する。このＰＣＲ方法の使用については、本明細書に提示する実施例の中で説明および例示する。かかる方法はまた、ＳＣＡＰ核酸、ＳＲＥＢＰ核酸またはＰＮＰＬＡ３核酸の検出にも使用することができる。
ＳＣＡＰタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のために、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することもできる。こうした方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元もしくは二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。かかるアッセイはまた、ＳＣＡＰタンパク質、ＳＲＥＢＰタンパク質またはＰＮＰＬＡ３タンパク質の存在または複製の指標となるタンパク質の検出にも使用することができる。
一部の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患の治療における本発明の方法の有効性は、ＳＣＡＰ ｍＲＮＡレベル（肝生検による）の低下によって評価される。
本発明の方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡが対象内の特定の部位に送達されるように、ｉＲＮＡを対象に投与する。ＳＣＡＰの発現の阻害は、対象内の特定の部位、例えば肝臓から得られたサンプル中のＳＣＡＰ ｍＲＮＡまたはＳＣＡＰタンパク質のレベルの測定値またはレベルの変化を用いて評価し得る。特定の実施形態では、本方法は、例えばＳＣＡＰの発現を低下させる薬剤による対象の治療後の臨床的に関連性のある転帰によって実証されるとおりの、ＳＣＡＰの発現の臨床的に関連性のある阻害を含む。
本明細書で使用されるとき、分析物のレベルを検出または決定するという用語は、材料、例えばタンパク質、ＲＮＡが存在するかどうかを決定するステップの実施を意味するものと理解される。本明細書で使用されるとき、検出または決定する方法には、用いられる方法の検出レベル未満である分析物レベルの検出または決定が含まれる。
ＶＩＩ．ＳＣＡＰ関連疾患の治療または予防方法
本発明はまた、細胞におけるＳＣＡＰ発現を低下させかつ／または阻害するための、本発明のｉＲＮＡの使用方法および／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物も提供する。本方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡと接触させることと、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって細胞を維持し、それにより細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害することとを含む。遺伝子発現の低下は、当技術分野において公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、ＳＣＡＰの発現の低下は、当業者にとってルーチンの方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＳＣＡＰのｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより；ウエスタンブロッティング、免疫学的技法など、当業者にとってルーチンの方法を用いてＳＣＡＰのタンパク質レベルを決定することにより決定し得る。ＳＣＡＰの発現の低下はまた、ＳＣＡＰの生物学的活性の低下、例えば、血清脂質、トリグリセリド類、コレステロールおよび／または遊離脂肪酸のレベルの低下、ＳＲＥＰＢまたはＰＮＰＬＡ３のレベルの低下によって間接的に評価してもよい。
本発明の方法では、細胞は試験管内または生体内で接触させてもよく、すなわち細胞は対象内にあってもよい。
本発明の方法を用いた治療に好適な細胞は、ＳＣＡＰ遺伝子を発現する任意の細胞であってよい。本発明の方法における使用に好適な細胞は、哺乳類細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（雌ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはスイギュウ細胞など）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞またはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であり得る。一実施形態では、細胞はヒト細胞、例えばヒト肝臓細胞である。
ＳＣＡＰ発現は、細胞において少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または約１００％だけ阻害される。好ましい実施形態では、ＳＣＡＰ発現は少なくとも２０％だけ阻害される。
本発明の生体内方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ここで、ｉＲＮＡは、治療しようとする哺乳類のＳＣＡＰ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療しようとする生物がヒトなどの哺乳類である場合、本組成物は、限定はされないが、経口、腹腔内、または非経口経路、例えば、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および髄腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸、および局所（頬側および舌下を含む）投与を含めた、当技術分野において公知の任意の手段によって投与することができる。特定の実施形態では、本組成物は静脈内注入または注射によって投与される。特定の実施形態では、本組成物は皮下注射によって投与される。
一部の実施形態では、投与はデポー注射による。デポー注射はｉＲＮＡを長時間にわたって一定して放出し得る。したがって、デポー注射によれば、所望の効果、例えば所望のＳＣＡＰ阻害、または治療上もしくは予防上の効果を達成するのに必要な投与頻度が減少し得る。デポー注射はまた、よりばらつきの少ない血清濃度ももたらし得る。デポー注射には、皮下注射または筋肉内注射が含まれ得る。好ましい実施形態では、デポー注射は皮下注射である。
一部の実施形態では、投与はポンプによる。ポンプは、外部ポンプまたは外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、薬物注入ポンプである。薬物注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、または硬膜外注入に用いられ得る。好ましい実施形態では、薬物注入ポンプは皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
投与方法は、所望されるのが局所治療か、それとも全身治療かに基づいて、および治療する範囲に基づいて選択され得る。投与経路および投与部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。
一態様において、本発明はまた、哺乳類におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本方法は、哺乳類の細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を哺乳類に投与することと、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって哺乳類を維持し、それにより細胞におけるＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害することとを含む。遺伝子発現の低下は、当技術分野において公知の任意の方法により、および本明細書に記載される方法、例えばｑＲＴ－ＰＣＲにより評価することができる。タンパク質産生の低下は、当技術分野において公知の任意の方法により、および本明細書に記載される方法、例えばＥＬＩＳＡにより評価することができる。一実施形態では、穿刺肝生検サンプルが、ＳＣＡＰ遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニタリングするための組織材料となる。
本発明は、それを必要としている対象の治療方法をさらに提供する。本発明の治療方法は、対象、例えば、ＳＣＡＰ発現の低下および／または阻害から利益を受けるであろう対象に、ＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｉＲＮＡまたはＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物の治療有効量で本発明のｉＲＮＡを投与することを含む。
本発明はまた、対象の血漿トリグリセリドレベルを低下させる方法も提供する。本方法は、対象、例えばＳＣＡＰ発現の低下および／または阻害から利益を受けるであろう対象に、ＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｉＲＮＡまたはＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物の治療有効量で本発明のｉＲＮＡを投与することを含む。
加えて、本発明は、脂肪症を有する対象もしくは脂肪症を発症するリスクがある対象、例えば、イヌシン抵抗性を有する対象もしくは肥満の対象における脂肪症からＮＡＳＨへの進行；またはＮＡＳＨを有する対象もしくは肝硬変を発症するリスクがある対象におけるＮＡＳＨから肝硬変への進行など、対象におけるＮＡＦＬＤの進行を阻害する方法を提供する。本方法は、本明細書に提供されるｄｓＲＮＡまたは医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それにより対象におけるＮＡＦＬＤの進行を阻害することを含む。
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与し得る。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。ネイキッドｉＲＮＡは好適な緩衝溶液中にあり得る。緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態では、緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよびオスモル濃度は、対象への投与に好適となるように調整することができる。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤など、医薬組成物として投与されてもよい。
ＳＣＡＰ遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受けるであろう対象は、ＳＣＡＰ関連障害を有する対象である。用語「ＳＣＡＰ関連疾患」には、ＳＣＡＰ遺伝子発現、複製、またはタンパク質活性の低下から利益を受けるであろう疾患、障害または病態が含まれる。ＳＣＡＰ関連疾患の非限定的な例としては、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満症、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高リポタンパク血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、アテローム性動脈硬化症、膵炎、非インスリン依存性真性糖尿病、冠動脈心疾患、および脳血管疾患が挙げられる。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は肝硬変である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患はインスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患はインスリン抵抗性でない。一実施形態では、ＳＣＡＰ関連疾患は肥満症である。
本発明は、例えば、ＳＣＡＰ発現の低下および／または阻害から利益を受けるであろう対象、例えばＳＣＡＰ関連障害を有する対象を治療するための、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物を他の医薬品および／または他の治療法、例えば公知の医薬品および／または公知の治療法、例えば、これらの障害の治療に現在用いられているものなどと組み合わせた使用についての方法をさらに提供する。例えば、特定の実施形態では、ＳＣＡＰを標的とするｉＲＮＡが、例えば本明細書の他の部分に記載されるとおりのＳＣＡＰ関連障害の治療において有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう対象、例えばＳＣＡＰ関連障害を有する対象の治療に好適な追加の薬剤には、１つ以上の血清脂質を降下させる薬剤が含まれ得る。かかる薬剤の非限定的な例としては、ＨＭＧＣＲ阻害薬、例えばスタチンなど、コレステロール合成阻害薬を挙げることができる。スタチン系としては、アトルバスタチン（リピトール（Ｌｉｐｉｔｏｒ））、フルバスタチン（レスコール（Ｌｅｓｃｏｌ））、ロバスタチン（メバコール（Ｍｅｖａｃｏｒ））、ロバスタチン持続放出（アルトプレブ（Ａｌｔｏｐｒｅｖ））、ピタバスタチン（リバロ（Ｌｉｖａｌｏ））、プラバスタチン（プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ））、ロスバスタチン（クレストール（Ｃｒｅｓｔｏｒ））、およびシンバスタチン（ゾコール（Ｚｏｃｏｒ））を挙げることができる。ＳＣＡＰ関連障害の治療において有用な他の薬剤としては、コレスチラミンおよび他の樹脂などの胆汁酸封鎖剤；ナイアシンなどのＶＬＤＬ分泌阻害薬；プロブコールなどの親油性抗酸化剤；アシル－ＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害薬；ファルネソイドＸ受容体拮抗薬；ステロール調節結合タンパク質切断活性タンパク質（ＳＣＡＰ）アクチベーター；ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）阻害薬；ＡｐｏＥ関連ペプチド；およびＳＣＡＰに対する治療用抗体を挙げることができる。追加の療法剤としてはまた、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害薬など、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を上昇させる薬剤も挙げることができる。さらに、追加の療法剤としてはまた、栄養補助食品、例えば魚油も挙げることができる。ｉＲＮＡおよび追加の療法剤は同時におよび／または同じ併用で、例えば非経口的に投与されてもよく、または追加の療法剤は、別個の組成物の一部としてまたは別個の時間におよび／または当技術分野において公知のまたは本明細書に記載される別の方法によって投与することができる。
一実施形態では、本方法は、標的ＳＣＡＰ遺伝子の発現が約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２、または約３６時間などにわたって低下するように、本明細書で取り上げる組成物を投与することを含む。一実施形態では、標的ＳＣＡＰ遺伝子の発現は、長時間、例えば、少なくとも約２、３、４日間またはそれを超えて、例えば、約１週間、２週間、３週間、または４週間またはそれを超えて低下する。
好ましくは、本明細書で取り上げる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＳＣＡＰ遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシング済み）を特異的に標的化する。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に記載されるとおり調製および実施することができる。
本発明の方法に従うｄｓＲＮＡの投与は、ＳＣＡＰ関連障害を有する患者におけるそうした疾患または障害の重症度、兆候、症状、および／またはマーカの低下をもたらし得る。これに関連して、「低下」は、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の治療または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛減少、生活の質、治療効果維持に必要な薬剤用量、疾病マーカのレベルまたは治療対象もしくは予防目標である、所与の疾患に適した、あらゆる他の測定可能パラメータレベルを測定することによって評価することができる。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組合せを測定することによって治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＳＣＡＰ関連障害の治療の有効性は、例えば、１つ以上の血清脂質値の定期的なモニタリングによって評価し得る。後期読取り値を初期読取り値と比較することにより、医師は治療が有効かどうかの指標を得る。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組合せを測定することで、治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＳＣＡＰを標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与と関連して、ＳＣＡＰ関連障害「に対して効果的」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状改善、治癒、疾患低減、延命、生活の質改善、またはＳＣＡＰ関連障害および関連原因の治療に精通している医者により、好ましいと一般に認められている他の効果などの有益な効果をもたらすことを意味する。
病態の１つ以上のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如により、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に証明される。
あるいは、有効性は、一例に過ぎないが、チャイルド・ピュースコア（時にチャイルド・ターコット・ピュースコア）など、臨床的に認められている疾患重症度のグレード分類尺度に基づいて診断の当業者が決定するとおりの疾患の重症度の低下によって測定することができる。例えば、適切な尺度を用いて測定された疾患の重症度の低下をもたらす任意の正の変化が、本明細書に記載されるとおりのｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ製剤を用いた適切な治療を表す。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇなど、治療量のｄｓＲＮＡを投与することができる。
本ｉＲＮＡは、静脈内注入によってある期間にわたり定期的に投与することができる。特定の実施形態では、初期治療レジメン後、治療は、頻度を下げて投与することができる。本ｉＲＮＡの投与は、例えば、細胞、組織、血液、尿または患者の他のコンパートメントにおけるＳＣＡＰレベルを少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または少なくとも約９９％またはそれを超えて低下させることができる。好ましい実施形態では、本ｉＲＮＡの投与は、例えば、細胞、組織、血液、尿または患者の他のコンパートメントにおけるＳＣＡＰレベルを少なくとも２０％低下させることができる。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に５％輸液反応などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターすることができる。別の実施例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベル増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニターすることができる。
あるいは、本ｉＲＮＡは、皮下に、すなわち皮下注射によって投与することができる。１回以上の注射を用いてｉＲＮＡの所望の１日用量を対象に送達してもよい。注射は、ある期間にわたって繰り返されてもよい。投与は定期的に繰り返されてもよい。特定の実施形態では、初期治療レジメン後、治療は、頻度を下げて投与することができる。反復用量レジメンには、一日おきなど、または年１回に至るまでの定期的な治療量のｉＲＮＡの投与が含まれ得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは約月１回～約年４回（すなわち、約３ヵ月に１回）投与される。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本発明において取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験には、本明細書に記載されるものと同様のまたは均等な方法および材料を使用し得るが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及される刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全て全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
実施例１．ｉＲＮＡ設計、合成、選択、および試験管内評価
本実施例は、ＳＣＡＰ ｉＲＮＡ剤の設計、合成、選択、および試験管内評価方法について記載する。
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示さない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
バイオインフォマティクス
カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、ヒトＳＣＡＰ遺伝子、「ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＲＥＢＦシャペロン」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０１２２３５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２２９３７）、ならびに毒性種ＳＣＡＰオルソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５４６９６３；マウス：ＮＭ＿００１１０３１６２；ラット：ＮＭ＿００１１００９６６）を標的とするｓｉＲＮＡ剤の組を設計した。ヒトＮＭ＿０１２２３５ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ、バージョン２は、４２５５塩基の長さを有する。このｓｉＲＮＡ設計の組の理論的根拠および方法は以下のとおりである：１０位～４２５５位におけるあらゆる可能な１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡの予想される有効性を、多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００を超える個別的なｓｉＲＮＡ設計からのｍＲＮＡノックダウンの直接的な測定から得られた線形モデルで決定した。ヒトとカニクイザルとの間で完全なまたはほぼ完全なマッチを有するＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡのサブセットを設計した。マウスおよびラットＳＣＡＰオルソログと完全なまたはほぼ完全なマッチを有するさらなるサブセットを設計した。ヒト、カニクイザルおよびマウスＳＣＡＰオルソログと完全なまたはほぼ完全なマッチを有するさらなるサブセットを設計した。ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＳＣＡＰオルソログと完全なまたはほぼ完全なマッチを有するさらなるサブセットを設計した。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり攻撃検索（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）で使用して、ｓｉＲＮＡと、標的種トランスクリプトーム内の全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位として画定されるシード領域内、ならびにここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０～１１位として画定されるｓｉＲＮＡの切断部位内のミスマッチに追加重みを付与した。ミスマッチの相対的重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位までの他の位置について２．８；１．２：１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、それぞれ重み付けしたミスマッチの値を合計することにより、特異性スコアを計算した。ヒトにおけるアンチセンススコアが＞＝２．２であり、かつ予想される有効性が＞＝ＳＣＡＰ転写物の５０％ノックダウンであるｓｉＲＮＡを優先した。
ＳＣＡＰ配列の合成
ＳＣＡＰ一本鎖および二重鎖の合成
Ｍｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）において固体支持体媒介性ホスホラミダイト化学を用いて１μｍｏｌスケールでＳＣＡＰ ｓｉＲＮＡ配列を合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンドまたはユニバーサル固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を充填した制御孔性ガラス（５００°Ａ）であった。補助合成試薬、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡならびにデオキシホスホロアミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から取得した。２’Ｆ２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび他の修飾ヌクレオチドは、対応するホスホロアミダイトを用いて配列に導入した。３’ＧａｌＮＡｃ共役一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体上で実施した。アンチセンス一本鎖の合成には、カスタムＣＰＧユニバーサル固体支持体を使用した。全ホスホロアミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間は、活性剤として５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中０．６Ｍ）を用いて、５分であった。ホスホロアミダイト結合は、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡから入手）の５０ｍＭ溶液を用いて生成した。酸化時間は、３分であった。全ての配列は、ＤＭＴ基を最終的に除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
固体相合成の完了後、一本鎖を固体支持体から切断し、２００μＬの水性メチルアミン試薬を用い、密封した９６深型ウェルプレート内で、６０℃で２０分間脱保護した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護される２’リボ残基（２’ＯＨ）を含む配列については、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を用いて、第２段階の脱保護を実施した。メチルアミン脱保護溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、溶液を６０℃でさらに２０分間インキュベートした。切断および脱保護ステップの終了時に、合成プレートを室温に到らせ、１ｍＬのアセトニトリル：エタノール混合物（９：１）の添加により沈殿させた。プレートを２時間かけて－８０℃に冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて、上清を慎重にデカンテーションした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液中に再懸濁させ、Ａ９０５オートサンプラーおよびＦｒａｃ９５０画分収集器を装備したＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルは９６ウェルプレートに収集された。各配列からのサンプルをＬＣ－ＭＳにより分析し、同一性を確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量し、選択したサンプルセットをＩＥＸクロマトグラフィーにより分析して純度を決定した。
ＳＣＡＰ一本鎖のアニーリングをＴｅｃａｎ液体処理ロボット上で実施した。等モル量のセンスおよびアンチセンス一本鎖の混合物を合わせ、９６ウェルプレート内でアニーリングした。相補的一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートを密封し、１００℃のオーブン内で１０分間加熱し、２～３時間かけてゆっくりと室温に到らせた。各二重鎖の濃度を１×ＰＢＳ中１０ｕＭに正規化し、次に試験管内スクリーニングアッセイにかけた。
修飾ＳＣＡＰセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは表２に示し、および未修飾ＳＣＡＰセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは表３に示す。
試験管内スクリーニング：
細胞培養およびトランスフェクション：
１ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを３８４ウェルプレート中の１ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に加えることにより、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）（ＧＩＢＣＯ）および初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）（Ｃｅｌｓｉｓ）をトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、このｓｉＲＮＡ混合物に、約５×１０３細胞を含有する４０μｌのウィリアムＥ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを精製した。１０ｎＭおよび０．１ｎＭで単回投与実験を実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番：６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームでの自動化プロトコルを用いて、ＲＮＡを単離した。５０μｌの溶解／結合緩衝液と、３μｌの磁性ビーズを含有する２５μｌの溶解緩衝液を、細胞を含むプレートに添加した。電磁シェーカ上でプレートを室温で１０分間インキュベートした後、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズ結合ＲＮＡを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを１５０μｌの溶離緩衝液で洗浄し、再度捕捉して、上清を除去した。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
１反応当たり１μｌ １０×緩衝液、０．４μｌ ２５×ｄＮＴＰ、１μｌランダムプライマー、０．５μｌ逆転写酵素、０．５μｌ ＲＮアーゼ阻害薬および６．６μｌのＨ２Ｏを含有する１０μｌのマスターミックスを各ウェルの単離ＲＮＡに加えた。プレートを密閉し、混合し、および電磁気振盪機において室温で１０分間インキュベートし、次に３７℃で２時間インキュベートした。次に、プレートを８１℃で８分間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）内の１ウェル当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌ ヒトＳＣＡＰ（Ｈｓ００１６８３５２＿ｍ１）、および５μｌ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに２μｌのｃＤＮＡを加えた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）でΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。各二重鎖につき少なくとも２回試験し、データは、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
相対倍数変化を計算するため、ΔΔＣｔ法を用いてリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞で実施したアッセイに対して正規化した。このアッセイの結果は表４に示す。
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実施例２．さらなるｉＲＮＡ剤の設計、合成、選択、および試験管内評価
本実施例は、さらなるＳＣＡＰ ｉＲＮＡ剤の設計、合成、選択、および試験管内評価方法について記載する。
バイオインフォマティクス
カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、ヒトＳＣＡＰ、「ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＳＲＥＢＦシャペロン」（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０１２２３５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２２９３７）を標的とするさらなるｓｉＲＮＡの組を設計した。ヒトＳＣＡＰ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは４２６８塩基の長さを有する。
さらなる修飾ＳＣＡＰセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは表５に示し、およびさらなる未修飾ＳＣＡＰセンスおよびアンチセンス鎖配列の詳細なリストは表６に示す。
試験管内Ｈｅｐ３ｂスクリーニング
細胞培養およびトランスフェクション
１ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭおよび０．１μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを３８４－ウェルプレート中の１ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に加えることにより、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。次に、このｓｉＲＮＡ混合物に約５×１０３細胞を含有する４０μｌのウィリアムＥ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡを精製した。１０ｎＭで単回投与実験を実施した。
上記の実施例１に関して記載した方法を用いて全ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲを実施した。この単回用量スクリーニングの結果は表７に示す。
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Claims (28)

  1. ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、
    二本鎖ＲＮＡｉ剤は二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    各鎖が独立して２１～２５ヌクレオチド長であり、
    センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    配列番号１９３のヌクレオチド配列５’－ＡＵＣＡＵＣＵＵＧＵＵＵＧＣＣＵＡＣＡＵＡ－３’および配列番号１９４のヌクレオチド配列５’－ＵＡＵＧＵＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＵＧＵ－３’；配列番号１９５のヌクレオチド配列５’－ＣＡＵＣＵＵＧＵＵＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣＵＡＡ－３’および配列番号１９６のヌクレオチド配列５’－ＵＡＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＵ－３’；ならびに配列番号１９７のヌクレオチド配列５’－ＵＣＵＵＧＵＵＵＧＣＣＵＡＣＡＵＣＵＡＣＵ－３’および配列番号１９８のヌクレオチド配列５’－ＡＧＵＡＧＡＵＧＵＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＡＵＧ－３’
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、
    前記センス鎖の前記ヌクレオチドの全部および前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの全部が、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾および２’フルオロヌクレオチド修飾からなる群から独立して選択されるヌクレオチド修飾を含み、
    二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含み、そして
    少なくとも一方の鎖が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体であるリガンドに共役されている、
    二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. 前記センス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして前記アンチセンス鎖が、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. 二本鎖領域が２１～２５ヌクレオチド対長である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 二本鎖領域が２１～２３ヌクレオチド対長である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 各鎖が独立して２１～２３ヌクレオチド長である、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 少なくとも１つの鎖が少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 少なくとも１つの鎖が少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. リガンドが、前記センス鎖の３’末端に共役されている、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. リガンドが、一価のまたは分枝状の二価もしくは三価のリンカーを介して前記センス鎖の３’末端に共役されている、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  10. リガンドが、
    である、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  11. 以下の概略図
    に示されるとおりにリガンドに共役されており、式中、ＸがＯまたはＳである、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  12. 前記ＸがＯである、請求項１１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する単離された細胞。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む、ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  15. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が非緩衝液中に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が緩衝液中に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
  18. 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  20. 細胞におけるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）シャペロン（ＳＣＡＰ）遺伝子の発現を阻害するためのインビトロでの阻害する方法であって、
    （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させるステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記細胞を、ＳＣＡＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それにより前記細胞における前記ＳＣＡＰ遺伝子の発現を阻害するステップと
    を含む方法。
  21. 前記ＳＣＡＰ発現が少なくとも約３０％阻害される、請求項２０に記載の方法。
  22. ＳＣＡＰ発現の低下から利益を受けるであろう障害を有する対象を治療するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 対象がＳＣＡＰ関連障害に罹患している、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
  24. 対象がヒトである、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
  25. 前記ＳＣＡＰ関連疾患が非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝（脂肪症）、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項２３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
  26. 追加の療法剤をさらに含む、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
  27. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物が約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるためのものである、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
  28. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物が皮下投与されるためのものである、請求項２２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または医薬組成物。
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