JP7403485B2 - パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１５年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１１５，７２４号明細書、および２０１５年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６，８１８号明細書の優先権を主張する。前述の各出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、これは、その内容全体を参照によって本明細書に援用する。２０１６年２月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１－０３２２０＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、サイズは、５２９，７９９バイトである。
肝臓への過剰なトリグリセリドの蓄積は、肝臓脂肪症（または脂肪肝）として知られ、インスリン抵抗性および脂肪異常症をはじめとする有害な代謝結果を伴う。脂肪肝は、多くの場合、過剰なアルコール摂取を有する対象、および肥満、糖尿病、または高脂血症を有する対象に見出される。しかしながら、過剰なアルコール摂取がない（＞１０ｇ／日）場合でも、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が発症し得る。ＮＡＦＬＤは、単純な脂肪肝（脂肪症）から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、硬変（肝臓の不可逆性、進行性瘢痕）に進行し得る広範囲の肝臓疾患を指す。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、共通して肝臓細胞（肝細胞）中に脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。
ＮＡＦＬＤ範囲は、単純性脂肪肝（脂肪症）と呼ばれるその最も単純な病期から始まり、そこから進行する。単純性脂肪肝は、肝臓細胞中の脂肪（トリグリセリド）の蓄積を含み、炎症（肝炎）または瘢痕（線維症）はない。ＮＡＦＬＤ範囲の次の段階および重症度は、ＮＡＳＨであり、これは、肝細胞中の脂肪の蓄積と共に、肝臓の炎症を含む。炎症性細胞は、肝臓細胞を破壊し（肝細胞壊死）、ＮＡＳＨは、最終的に肝臓の瘢痕（線維症）を招いた後、不可逆性、進行性瘢痕（硬変）に至る。ＮＡＳＨにより引き起こされる硬変は、ＮＡＦＬＤ範囲の最後の最も重篤な病期である。
２００８年、肝臓脂肪含量を評価するための肝臓の陽子磁気共鳴分光法による個体のゲノムレベルの関連研究において、肝臓脂肪含量とパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子との間に有意な関連が認められた（例えば、非特許文献１）を参照されたい）。ノックインマウスを用いた試験では、ＰＮＰＬＡ３における配列多型（ｒｓ７３８４０９、Ｉ１４８Ｍ）の発現が、ＮＡＦＬＤを引き起こすこと、および脂肪滴の表面上への触媒不活性ＰＮＰＬＡ３の蓄積が、肝臓のトリグリセリドの蓄積と関連していることが明らかにされた（非特許文献２）。特に、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ変異体は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路を活性化することにより、線維形成の発生の促進に関連し、その結果、肝星細胞の活性化および増殖ならびに細胞外マトリックスの沈着を引き起こす（非特許文献３）。
Ｒｏｍｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４０（１２）：１４６１－１４６５ Ｓｍａｇｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，６１：１０８－１１８ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，２１（３）：７９４－８０２
現在のところ、ＮＡＦＬＤの治療は、減量およびインスリン抵抗性または脂肪異常症などの二次的疾患の治療に関するものである。これまで、ＮＡＦＬＤの薬理学的治療は承認されていない。したがって、ＮＡＦＬＤを患う対象のための治療法が求められる。
本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、例えばヒトなどの対象内の細胞などの細胞内にあってもよい。
表示するｉＲＮＡ剤の０．３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、または３．０ｍｇ／ｋｇの単回用量の投与後の、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓に残留するＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡのパーセンテージを示すグラフである。
一態様では、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つの配列のいずれかからなる群から選択される配列を含む。
別の態様では、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が修飾を含む。
別の態様では、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部が、修飾ヌクレオチドであり、センス鎖は、３’末端に結合したリガンドにコンジュゲートしている。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が修飾を含む。一実施形態では、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基包含ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基包含ヌクレオチド、メチルホスホネート基包含ヌクレオチド、５’－ホスフェート包含ヌクレオチド、および５’－ホスフェート模倣物包含ヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
一実施形態では、相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である。別の実施形態では、相補性領域は、１９～２１ヌクレオチド長である。別の実施形態では、相補性領域は、１９ヌクレオチド長である。別の実施形態では、各鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。
一実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。一実施形態では、リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端にコンジュゲートする。別の実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。一実施形態では、リガンドは、
Figure 0007403485000001
 である。
別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図：
Figure 0007403485000002
 に示されるリガンドにコンジュゲートし、式中、Ｘは、ＯまたはＳである。一実施形態では、Ｘは、Ｏである。
一実施形態では、相補性領域は、表３～５、７、および８のいずれか１つのアンチセンス配列の１つを含む。別の実施形態では、相補性領域は、表３～５、７、および８のいずれか１つのアンチセンス配列の１つからなる。
別の実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾とは異なり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている。
一実施形態では、ｉは、０であり；ｊは、０であり；ｉは、１であり；ｊは、１であり；ｉおよびｊの両方が、０であり；またはｉおよびｊの両方が、１である。別の実施形態では、ｋは、０であり；ｌは、０であり；ｋは、１であり；ｌは、１であり；ｋおよびｌの両方が、０であり；またはｋおよびｌの両方が、１である。別の実施形態では、ＸＸＸは、Ｘ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、ＺＺＺは、Ｚ’Ｚ’Ｚ’と相補的である。別の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近辺に存在する。別の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端からアンチセンス鎖の１１、１２および１３位に存在する。一実施形態では、Ｙ’は、２’－Ｏ－メチルである。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）
により表される。
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｂ）
により表され、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表す。
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｂ）
により表され、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表す。
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩｄ）
により表され、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、１～５個の修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は、独立に、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表す。
一実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対長である。別の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対長である。別の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対長である。別の実施形態では、二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対長である。別の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対長である。別の実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対長である。
一実施形態では、各鎖は、１５～３０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
一実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、ヌクレオチドに対する修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。
一実施形態では、リガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。一実施形態では、リガンドは、
Figure 0007403485000003
 である。
一実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合する。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図
Figure 0007403485000004
 に示すように、リガンドにコンジュゲートしている。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の３’末端にある。一実施形態では、この鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の５’末端にある。別の実施形態では、この鎖は、アンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、一方の鎖の５’および３’末端の両方にある。別の実施形態では、この鎖は、アンチセンス鎖である。
一実施形態では、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾を含む。別の実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。別の実施形態では、ｐ’＞０である。別の実施形態では、ｐ’＝２である。別の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して相補的である。別の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して非相補的である。
一実施形態では、センス鎖は、合計２１個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３個のヌクレオチドを有する。
一実施形態では、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結する。別の実施形態では、全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結する。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表３～５、７、および８のいずれか１つに列挙されるＲＮＡｉ剤の群から選択される。別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が、修飾を含む。
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾とは異なり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている。
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結しており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾とは異なり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしている。
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結しており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾とは異なり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、このリガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結しており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～１０個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；Ｎｂに対する修飾は、Ｙに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾は、Ｙ’に対する修飾とは異なり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、このリガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの一部と相補的な領域を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチド長であり、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）
により表され、
式中、各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’は、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；ｐ、ｑ、およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結しており；各ＮａおよびＮａ’は、独立に、修飾もしくは未修飾のいずれかまたはそれらの組合せである、０～２５個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；ここで、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートしており、このリガンドは、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
別の実施形態では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含み、ここで、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部が、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部が、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、３’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含み、センス鎖は、３’末端で、二価または三価の分岐状リンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートしている。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全部およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が、修飾ヌクレオチドである。別の実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するように、二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖をコードするベクターを提供し、ここで、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＰＮＰＬＡ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に対する相補性領域を含み、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、３０塩基対長以下であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、切断のためにｍＲＮＡを標的とする。一実施形態では、相補性領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、相補性領域は、１９～２１ヌクレオチド長である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するベクターを含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液中で投与される。別の実施形態では、非緩衝液は、食塩水または水である。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、緩衝液を用いて投与される。別の実施形態では、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
別の態様では、本発明は、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤と脂質製剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、脂質製剤は、ＬＮＰを含む。別の実施形態では、脂質製剤は、ＭＣ３を含む。
別の態様では、本発明は、細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害する方法を提供し、この方法は、（ａ）本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本発明の医薬組成物と細胞を接触させるステップ；および（ｂ）ステップ（ａ）で生成した細胞を、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、これにより、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するステップを含む。一実施形態では、細胞は、対象内にある。別の実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、女性のヒトである。別の実施形態では、対象は、男性のヒトである。一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約１００％阻害される。
別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける疾患または障害を有する対象を治療する方法を提供し、この方法は、治療有効量の本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本発明の医薬組成物を対象に投与し、これにより、対象を治療するステップを含む。
別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける疾患または障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供し、この方法は、予防有効量の本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本発明の医薬組成物を対象に投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防するステップを含む。
一実施形態では、対象への二本鎖ＲＮＡｉ剤の投与によって、ヘッジホッグシグナル伝達経路の低減が起こる。
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、肥満である。一実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、女性のヒトである。別の実施形態では、対象は、男性のヒトである。一実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ突然変異を有する。一実施形態では、突然変異は、異型接合性である。別の実施形態では、突然変異は、同型接合性である。
別の実施形態では、本発明は、抗ＰＮＰＬＡ３抗体、またはその抗原結合断片を対象に投与するステップをさらに含む。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与される。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、週１回対象に投与する。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、月１回対象に投与する。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に皮下投与する。
別の実施形態では、本発明の方法は、対象におけるヘッジホッグシグナル伝達経路レベルを測定するステップをさらに含む。一実施形態では、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路の発現または活性のレベルの低下は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患が治療または予防されていることを示す。
以下の詳細な説明および図面によって本発明をさらに詳しく説明する。
発明の詳細な説明
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、ｉＲＮＡ組成物を提供する。この遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあってもよい。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物中の対応する遺伝子（ＰＮＰＬＡ３遺伝子）のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。
本発明のＲＮＡｉ剤は、他の哺乳動物種のＰＮＰＬＡ３オーソログ内に保存される遺伝子の部分を含む、ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするようにデザインされている。理論による拘束は望まないが、前述の特性、ならびに特定の標的部分および／またはこれらのＲＮＡｉ剤における特定の修飾の組合せもしくは部分組合せが、本発明のＲＮＡｉ剤に、改善された効果、安定性、効力、持続性、および安定性を賦与すると考えられる。
したがって、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらすｉＲＮＡ組成物を用いて、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害または低下から利益を受ける障害、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療する方法を提供する。
特に、非常に低用量の本発明のｉＲＮＡが、特異的且つ効率的にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することができ、対応する遺伝子（ＰＮＰＬＡ３遺伝子）の発現の有意な阻害をもたらす。
本発明のｉＲＮＡとしては、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長などの約３０ヌクレオチド長以下の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が挙げられ、その領域は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。
以下の詳細な説明は、アンジオテンシノーゲン遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作製して利用する方法、ならびにＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を受ける疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
「約」という用語は、本明細書では、当技術分野における典型的な誤差の範囲内を意味するために使用される。例えば、「約」は、平均値からの約２標準偏差として理解することができる。特定の実施形態では、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態では、約は、±５％を意味する。約が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「約」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
数値または一連の数値の前に置かれる「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語に隣接する数値、および文脈から明らかなように、論理的に包含され得るあらゆる後続の数値または整数を含むことが理解される。例えば、核酸分子中のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示される特性を有することを意味する。「少なくとも」が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「少なくとも」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
本明細書の用法では、「～以下」または「～未満」は、当該語句に隣接する数値、および文脈から論理的であるように、論理的にそれより低い、ゼロまでの値または整数として理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、または０ヌクレオチドオーバーハングを有する。「～以下」が、一連の数値または範囲の前に置かれる場合、「～以下」は、上記一連の数値または範囲内の数値の各々を変更し得ることが理解される。
本明細書の用法では、「ＰＮＰＬＡ３」という用語と置き換え可能に使用される「パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３」は、脂肪細胞中でトリアシルグリセロール加水分解を媒介するトリアシルグリセロールリパーゼをコードする天然に存在する遺伝子を指す。ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の参照配列のアミノ酸および完全コード配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：１７１９６６２５（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０２５２２５．２；配列番号１；配列番号２）に見出すことができる。ヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子の哺乳動物オーソログは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：５４４４６１３２３（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＸＭ＿００５５６７０５１．１、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）；配列番号７および配列番号８）；ＧＩ：５４４４６１３２５（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＸＭ＿００５５６７０５２．１、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）；配列番号１１および配列番号１２）；ＧＩ：２９７２６１２７０（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＸＭ＿００１１０９１４４．２、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、配列番号９および配列番号１０）；ＧＩ：１４４２２６２４４（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０５４０８８．３、マウス；配列番号３および配列番号４）；ＧＩ：５３７３６１０２７（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿００１２８２３２４．１、ラット；配列番号５および配列番号６）に見出すことができる。
ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡ配列のさらに別の例は、一般に利用可能なデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＯＭＩＭを用いて容易に入手可能である。
本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たす上で、少なくとも十分長い。一実施形態では、標的配列は、ＰＮＰＬＡ３のタンパク質コード領域内にある。
標的配列は、例えば約１５～３０ヌクレオチド長などの約９～３６ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドなど、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
本明細書の用法では、「配列を含む鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される（例えば表２を参照されたい）。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調節し、例えば阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えば、ＰＮＰＬＡ３標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）として知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、これらのｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＰＮＰＬＡ３遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなＲＮＡｉを指すために本明細書で使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された一本鎖ＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２に結合し、次にこれが、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０；：８８３－８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。
別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＰＮＰＬＡ３遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載する通り、各鎖または両方の鎖は、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。さらに、本明細書の用法では、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含んでもよい。本明細書の用法では、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立に、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、もしくは核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の薬剤での使用に好適な修飾は、本明細書に開示する、または当技術分野で公知のあらゆる種類の修飾を含む。ｓｉＲＮＡタイプの分子に使用される任意のそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９～３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５～３０塩基対長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、４～１０の不対ヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであってよい。
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば、ＰＮＰＬＡ３標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次に、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導できるようにする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡと結合すると、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１～１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。特定の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方のオーバーハングは、１０ヌクレオチドを超える伸長された長さ、例えば、１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドの長さを含み得る。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖にある。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖にある。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端に存在する。特定の実施形態では、伸長されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端に存在する。特定の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオリン酸で置換されている。
「平滑」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の当該末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端化された」ＲＮＡｉ剤は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有する（すなわち、１つのオーバーハングおよび１つの平滑末端を有する剤）か、または双方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、双方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えば、ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「相補性領域」という用語は、例えば、本明細書で定義される通りのＰＮＰＬＡ３ヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、例えばｉＲＮＡの５’および／または３’末端の５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド内などの末端領域にある。一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖にヌクレオチドミスマッチを含む。一実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３、２、または１ヌクレオチド内にある。別の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端ヌクレオチド内にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、「切断領域」という用語は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が起こる標的の部位である。いくつかの実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端、および切断部位に直接隣接する３つの塩基を含む。いくつかの実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの末端、および切断部位に直接隣接する２つの塩基を含む。いくつかの実施形態では、切断領域は、特に、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１と結合する部位に存在し、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して５、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をコードするｍＲＮＡの非分断部分と実質的に相補的であれば、ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＰＮＰＬＡ３配列と完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書に開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＰＮＰＬＡ３配列と実質的に相補的であり、配列番号１、または配列番号１の１断片のヌクレオチド配列の同等領域と、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的であるセンス鎖を含み、このアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＰＮＰＬＡ３配列と相補的であり、ここで、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２、または配列番号２の１断片のヌクレオチド配列の同等領域と、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的であるセンス鎖を含み、このアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＰＮＰＬＡ３配列と相補的であり、ここで、センス鎖ポリヌクレオチドは、表３～５、７、および８のいずれか１つに示すセンス鎖のいずれか１つ、または表３～５、７、および８のいずれか１つに示すセンス鎖のいずれか１つの１断片のヌクレオチド配列の同等領域と、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的な連続したヌクレオチド配列を含む。
本発明の一態様では、本発明の方法および本発明の組成物に使用する薬剤は、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することにより、化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照されたい。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１５～約３０ヌクレオチド長であってよく、標的配列と相補的な配列を有する。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載するアンチセンス配列のいずれか１つからの少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続したヌクレオチドである配列を含み得る。
本明細書の用法では、「対象」は、霊長類（ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど）をはじめとする哺乳類、または鳥類（例えばアヒルもしくはガチョウ）などの動物である。一実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／または複製の低下から利益を受ける、疾患、障害または病状について治療または評価されるヒト；ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下から利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト；ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト；および／または本明細書に記載されるようにＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下から利益を受ける、疾患、障害または病状について治療されるヒトなどのヒトである。一実施形態では、対象は女性のヒトである。別の実施形態では、対象は男性のヒトである。
本明細書の用法では、「治療する」または「治療」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生に関連する１つまたは複数の症状、例えば、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路中に増加したタンパク質活性の存在、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の緩和または改善を含むが、これに限定されるものではない、有益な、または要望される結果を指す。「治療」はまた、治療を施さない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味し得る。
対象におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／もしくはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生のレベル、または疾患マーカもしくは症状に関連して「低下させる」という用語は、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上であり得るが、好ましくは、このような疾患がない個人の正常範囲内にあると一般に認められるレベルまで低下する。
本明細書の用法では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現および／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質の産生の低下から利益を受ける、疾患、障害もしくはその病状に関して使用される「予防」または「予防する」は、対象が、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の症状、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路中の増加レベルのタンパク質の存在、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などの、疾患、障害、または病状に伴う症状を発症する可能性の低下を指す。疾患、障害または病状を発症しないこと、またはこのような疾患、障害または病状に伴う症状発症の減少（例えばその疾患または障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％の）、または遅延した症状呈示の遅延（例えば数日間、数週間、数ヶ月または数年間）が、効果的予防と見なされる。
本明細書の用法では、「パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３関連疾患」または「ＰＮＰＬＡ３関連疾患」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現もしくはＰＮＰＬＡ３タンパク質の産生により引き起こされる、またはそれに関連する疾患または障害である。「ＰＮＰＬＡ３関連疾患」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現、複製、もしくはタンパク質活性の低下から利益を受ける疾患、障害、または病状を含む。ＰＮＰＬＡ３関連疾患の非限定的例として、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、肝硬変である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、肥満である。
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。本明細書の用法では、「非アルコール性脂肪性肝疾患」は、「ＮＡＦＬＤ」という用語と置き換え可能に用いられ、毎日２０ｇｍ未満のアルコール摂取の存在下で、大血管性脂肪症の存在により定義される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国で最も一般的な肝臓疾患であり、一般に、インスリン抵抗性／２型糖尿病および肥満に関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪症、脂肪性肝炎、硬変、および時として肝細胞癌により発現される。ＮＡＦＬＤについて詳しくは、Ｔｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｄａｌｐｉａｚ（２００７）Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｒｉｓｋ．Ｍａｎａｇ．，３（６）：１１５３－１１６３（その内容全体を参照によって本明細書に援用する）を参照されたい。
本明細書の用法では、「治療有効量」は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療するために対象に投与されると、（例えば既存の疾患の、または疾患の１つまたは複数の症状の低減、改善または維持によって）疾患の治療をもたらすのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤投与方法、疾患とその重症度、ならびに治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現により媒介される病理過程の段階、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動し得る。
本明細書の用法では、「予防有効量」は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患の症状をまだ経験していないか、または呈示していないが、罹患する傾向を有し得る対象に投与されると、疾患、または疾患の１つまたは複数の症状を予防もしくは改善するのに十分な量のｉＲＮＡ剤を含むことが意図される。疾患の改善としては、疾患経過の減速、または後に発症する疾患の重症度の低下が挙げられる。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤投与方法、疾患リスクの程度、および治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的体質、先行または併用治療薬のタイプ、もしあればその他の個人特性に応じて変動してもよい。
「治療有効量」または「予防有効量」としてはまた、あらゆる治療薬に当てはまる妥当な利点／リスク比で、いくつかの所望の局所性または全身性効果を生じる、ＲＮＡｉ剤の量も挙げられる。本発明の方法で用いられるＲＮＡｉ剤は、このような治療に当てはまる妥当な利点／リスク比を生じるのに十分な量で、投与されてもよい。
「薬学的に許容可能」という語句は、本明細書で、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答がなく、またはその他の問題または合併症が、妥当な利点／リスク比で釣り合う、ヒト対象および動物対象の組織との接触で使用するのに適する、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
本明細書の用法では、「薬理的に許容可能な担体」という語句は、液体または固体増量剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、滑石マグネシウム、カルシウムまたはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）など）、または対象化合物を１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分に運搬または輸送するのに関与する溶媒封入材料などの、薬理的に許容可能な材料、組成物またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合し、治療される対象に傷害性でないと言う意味で、「許容可能」でなくてはならない。薬理的に許容可能な担体の役割を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースとその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウム状態（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム、および滑石などの平滑剤；（８）カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーンオイル、および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびエチルラウレートなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質非含有水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ、およびＬＤＬなどの血清成分；および（２２）医薬製剤で用いられるその他の無毒の適合性物質が挙げられる。
本明細書の用法では、「サンプル」という用語は、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織の採取物、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織を含む。生体液の例としては、血液、血清および漿液（ｓｅｒｏｓａｌ ｆｌｕｉｄｓ）、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、臓器または局在性領域からのサンプルが挙げられる。例えばサンプルは、特定の臓器、臓器の部分、または体液またはこれらの臓器内の細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定のセグメントもしくは肝臓の特定タイプの細胞、例えば、肝細胞）、網膜または網膜の一部（例えば、網膜色素上皮細胞）、中枢神経系または中枢神経系の一部（例えば、脳室もしくは脈絡叢）、あるいは膵臓もしくは膵臓の特定の細胞もしくは一部から得られるものでよい。いくつかの実施形態では、「対象から得られるサンプル」は、対象から採取された脳脊髄液を指す。好ましい実施形態では、「対象から得られるサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。別の実施形態では、「対象から得られるサンプル」は、対象から得られる肝臓組織（もしくはその構成部分）または網膜組織（もしくはその構成部分）を指す。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有するヒトのような、哺乳類などの対象内の細胞などの細胞内で、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、または１８ヌクレオチド長以下）である。ＰＮＰＬＡ３遺伝子を発現する細胞との接触に際して、ｉＲＮＡは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、もしくは鳥類ＰＮＰＬＡ３遺伝子）の発現を、例えば、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）に基づく方法により、あるいは、例えば、ウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などのタンパク質に基づく方法によりアッセイして、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは相補的な２本のＲＮＡ鎖を含み、それらはその中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
一般に、二本鎖構造は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対長さなどの１５～３０塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
同様に、標的配列の相補性領域は、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長など１５～３０ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１５～約２３ヌクレオチド長、または約２５～約３０ヌクレオチド長である。一般にｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質となるのに十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者は、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの約９～３６塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のＲＮＡを切断に標的化する１５～３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３、または４ヌクレオチドなどの１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下でさらに考察されるように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動ＤＮＡ合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。
一態様では、本発明のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つで提供される配列群から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つの配列群から選択される。この態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現中に生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってこの態様では、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つのオリゴヌクレオチドは、表３～５、７、および８のいずれか１つのセンス鎖と説明され、第２のオリゴヌクレオチドは、表３～５、７、および８のいずれか１つのセンス鎖に対応するアンチセンス鎖と説明される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一オリゴヌクレオチド上に含有される。
表３、４、および７のいずれか１つに示す配列は、修飾および／またはコンジュゲート配列として記載されていないが、例えば、本発明のｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、表３～５、７、および８のいずれか１つに示す配列のいずれか１つ、または修飾されている表３～５、７、および８のいずれか１つの配列、またはコンジュゲートしている表３～５、７、および８のいずれか１つの配列を含み得ると理解される。言い換えれば、本発明は、本明細書に記載されるように、未修飾、未コンジュゲート、修飾、および／またはコンジュゲートしている表３～５、７、および８のいずれか１つのｄｓＲＮＡを包含する。
別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、実質的にそれらからなる、またはそれらからなり、ここで、センス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つに示すセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、表３～５、７、および８のいずれか１つに示す対応するアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。
当業者は、例えば２１塩基対などの約２０～２３塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上述の実施形態では、表３～５、７、および８のいずれか１つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表３～５、７、および８のいずれか１つの配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表３～５、７、および８のいずれか１つの配列の１つに由来する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続したヌクレオチドの配列を有して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むｄｓＲＮＡと、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％の以下異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが意図される。
さらに表３～５、７、および８のいずれか１つで提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＰＮＰＬＡ３転写物中の部位を同定する（例えば、表９を参照されたい）。したがって本発明は、これらの配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＰＮＰＬＡ３遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表３～５、７、および８のいずれか１つで提供される配列の１つからの約１５個の連続したヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に約１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。したがって、例えば、表３～５、７、および８のいずれか１つにおいて同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、徐々に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表３～５、７、および８のいずれか１つ中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＰＮＰＬＡ３遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＰＮＰＬＡ３遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
ＩＩＩ．発明の修飾ｉＲＮＡ
一実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの本発明のｉＲＮＡのＲＮＡは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および／または結合を含まない。別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどの発明のｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全部が修飾される。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全部が、修飾された本発明のｉＲＮＡであり、ここで、「ヌクレオチドの実質的に全部が修飾された」は、大部分が修飾されているが、完全には修飾されておらず、５、４、３、２、または１以下の未修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート結合、逆転結合）または３’末端修飾（コンジュゲート結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲート結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載される。
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然リン酸ジエステル主鎖は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
その他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、デオキシ－チミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾することができる。「二環式糖」は、２つの原子の架橋により修飾されるフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を結合して、これにより二環系を形成する架橋を含む糖分子を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’－炭素および２’－炭素を結合する。このように、いくつかの実施形態では、本発明の薬剤は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、その中でリボース部分は、２’および４’炭素を結合する追加の架橋を含む。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’－エンド（ｅｎｄｏ）立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドに使用する二環式ヌクレオシドの例としては、４’および２’リボシル環原子間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’－２’架橋を含む１つまたは複数の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’－２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照））；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上に挙げた各々の内容全体を参照によって本明細書に援用する。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する追加の代表的な米国特許および米国特許公報としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，５２５，１９１号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０３４，１３３号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；同第７，３９９，８４５号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；同第７，５６９，６８６号明細書；同第７，７４１，４５７号明細書；同第８，０２２，１９３号明細書；同第８，０３０，４６７号明細書；同第８，２７８，４２５号明細書；同第８，２７８，４２６号明細書；同第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである１つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックド非環式核酸であり、この場合、糖の結合のいずれかが除去され、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素間の炭素－酸素－炭素共有結合）が除去されたモノマーも包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の炭素－炭素共有結合）が除去されている（参照によって本明細書に援用する、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
１つまたは複数の立体化学的糖配置を有する、前述の二環式ヌクレオシドのいずれか、例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを調製することができる（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾することもできる。本明細書の用法では、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書で「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ配置である。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数の「立体構造的に規制されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含んでもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３およびＣ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配置にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を高める。リンカーは、安定性および親和性に最適な位置に酸素を配置して、リボース環パッカリングを低減する上で十分な長さを有する。
前述したＣＲＮのいくつかの調製を教示する代表的な文献として、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；および国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレットが挙げられるが、これに限定されるものではない。
さらに、本発明のｉＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドを含んでもよい。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式２’－３’－ｓｅｃｏ－ヌクレオチドであり、これは、「アンロックド核酸」（「ＵＮＡ」）修飾とも呼ばれる。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公報として、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；同第２０１３／００１１９２２号明細書；同第２０１３／０３１３０２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを挙げることができる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見出すことができる。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのその他の修飾としては、５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖に対する５’－末端リン酸またはリン酸模倣物がある。好適なリン酸模倣物は、例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書に開示されている。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、２０１１年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、または２０１２年１１月１６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に開示されるように、化学修飾を有する薬剤を含む。
本明細書、および米国仮特許出願第６１／６５１，７１０号明細書またはＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に示されているように、優れた結果は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖中に、特に、切断部位またはその近辺に導入することによって取得され得る。これ以外に、いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾してもよい。これらのモチーフの導入によって、もし存在すれば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の修飾パターンが分断される。ＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖のＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドと任意選択でコンジュゲートさせてもよい。得られるＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を呈示する。
より具体的には、驚くことに、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖の切断部位もしくはその近辺の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを有するように、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾するとき、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性は極めて増大することが見出された。
したがって、本発明は、標的遺伝的（すなわち、ＰＮＰＬＡ３遺伝子）の発現をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２～３０ヌクレオチド長であってよい。例えば、各鎖は、１４～３０ヌクレオチド長、１７～３０ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２７～３０ヌクレオチド長、１７～２３ヌクレオチド長、１７～２１ヌクレオチド長、１７～１９ヌクレオチド長、１９～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、１９～２１ヌクレオチド長、２１～２５ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長であってよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的に、デュプレックス二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成し、これは、本明細書で「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対長であってよい。例えば、二本鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対長、１７～３０ヌクレオチド対長、２７～３０ヌクレオチド対長、１７～２３ヌクレオチド対長、１７～２１ヌクレオチド対長、１７～１９ヌクレオチド対長、１９～２５ヌクレオチド対長、１９～２３ヌクレオチド対長、１９～２１ヌクレオチド対長、２１～２５ヌクレオチド対長、または２１～２３ヌクレオチド対長であってよい。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一方もしくは両方の鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端に１つまたは複数のオーバーハング領域および／もしくはキャッピング基を含んでもよい。オーバーハングは、１～６ヌクレオチド長、例えば、２～６ヌクレオチド長、１～５ヌクレオチド長、２～５ヌクレオチド長、１～４ヌクレオチド長、２～４ヌクレオチド長、１～３ヌクレオチド長、２～３ヌクレオチド長、または１～２ヌクレオチド長であってよい。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長い結果、または同じ長さの２つの鎖がずれている結果生じ得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成してもよいし、または標的となる遺伝子配列と相補的であるか、または別の配列であってもよい。第１および第２鎖は、例えば、ヘアピンを形成する追加塩基により、またはその他の非塩基リンカーによって連結することもできる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、各々独立に、修飾または未修飾ヌクレオチドであってよく、こうしたものとして、２’－糖修飾、例えば、２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端に対するオーバーハング配列であってよい。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成してもよいし、または標的となる遺伝子配列と相補的であるか、または別の配列であってもよい。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’もしくは３’末端をリン酸化してもよい。いくつかの実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、２つのヌクレオチドは、同じでも異なってもよい。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、センス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、単一オーバーハングのみを含み、これは、その全体的安定性に影響を及ぼすことなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強化することができる。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはまた、アンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する、あるいはその逆の平滑末端であってもよい。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑である。理論による拘束は望まないが、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングの非対称の平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖導入に有利に働く。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から７位、８位、９位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から８位、９位、１０位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
また別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチド長の平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドセンス鎖および２３ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端から９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑であるのに対し、他方の末端は、２ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２ヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、３つのヌクレオチドのうち２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、３番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチドの間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基が、独立して、例えば、交互のモチーフ中で、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾される。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第１鎖の１～２３位は、少なくとも８リボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の１～２３位と対合する位置に少なくとも８リボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し；アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であり、６つ以下の連続した３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であるため、１～６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と非対合である１０～３０の連続したヌクレオチドを含むため、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；センス鎖およびアンチセンス鎖を最大相補性のためにアラインメントすると、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合するため、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二本鎖化した領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり；センス鎖は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、これらのモチーフの少なくとも１つは、切断部位またはその近辺に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近辺に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５且つ最大で２９ヌクレオチドの長さを有する第１鎖と、５’末端から１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドに対する３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、最大で３０ヌクレオチドの長さを有する第２鎖とを含み；第１鎖の３’末端および第２鎖の５’末端が、平滑末端を形成し、第２鎖は、その３’末端で第１鎖より１～４ヌクレオチド長く、二本鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、第２鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子の発現を低下させるように、第２鎖長の少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、ここで、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、第２鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近辺に存在する。
１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有するＲＮＡｉ剤の場合、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０位、１１位および１２位の付近である。したがって、３つの同一修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、またはアンチセンス鎖の５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二本鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを含んでもよく；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近辺に３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖に対する３ヌクレオチドの１つのモチーフおよびアンチセンス鎖に対する３つのヌクレオチドの１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有し、すなわち、センス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つが、アンチセンス鎖中のモチーフの３つのヌクレオチドの少なくとも１つと塩基対を形成するようにアラインメントされ得る。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドが重複してもよく、または全ての３つのヌクレオチドが重複してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含み得る。第１のモチーフは、鎖の切断部位またはその近辺に存在してもよく、他のモチーフは、ウイング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であってもよい。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位またはその近辺のモチーフから離れた鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウイング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、または少なくとも１つまたは複数のヌクレオチドによって隔てられている。モチーフが、互いに直接隣接している場合、モチーフの化学構造は、互いに異なり、モチーフが、１つまたは複数のヌクレオチドによって隔てられている場合、化学構造は、同じかまたは異なり得る。２つ以上のウイング修飾が存在し得る。例えば、２つのウイング修飾が存在する場合、各ウイング修飾は、切断部位またはその近辺の第１のモチーフに対して一方の末端に、またはリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の２つ以上のモチーフを含んでいてもよく、モチーフの少なくとも１つが、鎖の切断部位またはその近辺に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウイング修飾と同様の配列で１つまたは複数のウイング修飾を含み得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対するウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端もしくは両方の末端に第１の１つまたは２つの末端を含まない。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に対するウイング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端もしくは両方の末端の二本鎖領域内に第１の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウイング修飾を含む場合、ウイング修飾は、二本鎖領域の同じ末端に位置してもよく、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウイング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の１つの末端に位置して、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がそれぞれ、二本鎖領域の他方の末端に位置して、１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖からの２つの修飾がリードモチーフの各側に位置して、二本鎖領域中に１つ、２つまたは３つのヌクレオチドの重複を有するようにアラインメントされ得る。
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中の全てのヌクレオチドを修飾してもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つまたは複数の結合リン酸酸素の一方もしくは両方の１つまたは複数の改変；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変；「脱リン（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸中の目的の位置の全てに存在し得るが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在してもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方に存在してもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在してもよいし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在してもよい。例えば、非結合Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチドのみに存在してもよく、あるいは、二本鎖および一本鎖領域、特に、末端に存在してもよい。５’末端または両方の末端をリン酸化することができる。
例えば、安定性を高める、オーバーハング中に特定の塩基を含む、または一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、またはその両方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を含むことが可能となるだろう。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含むことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、３’または５’オーバーハング中の塩基の全部または一部を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾してもよい。修飾は、例えば、当技術分野で公知の修飾によるリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）もしくは２’－Ｏ－メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾される。鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的に、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。それらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルもしくは２’－フルオロ修飾、またはその他であってよい。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。「交互のモチーフ」という用語は、本明細書の用法では、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、１つの鎖の交互のヌクレオチドに存在する。交互のヌクレオチドは、１ヌクレオチドおきに１つ、もしくは３ヌクレオチドごとに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであってよい。
交互のモチーフに含まれる修飾のタイプは、同じでも、異なっていてもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、当該ヌクレオチドに対する１つのタイプの修飾を表す場合、交互のパターン、すなわち、１ヌクレオチドおきの修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれが、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」「ＢＤＢＤＢＤ・・・」または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などの交互のモチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に対する交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトされた、センス鎖に対する交互のモチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するか、その逆であるようなシフトであってもよい。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合する場合、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、センス鎖における交互のモチーフは、鎖の５’から３’へと「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、アンチセンス鎖における交互のモチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へと「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、これにより、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾および２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対するシフトを有し、すなわち、センス鎖に対する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、アンチセンス鎖における２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、その逆も同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾から開始してもよく、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾から開始してもよい。
センス鎖および／またはアンチセンス鎖への、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフの導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖中に存在する最初の修飾パターンを分断する。驚くことに、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つまたは複数のモチーフを導入することによる、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの分断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を高める。
一実施形態では、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾のモチーフが、鎖のいずれかに導入されると、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで、「Ｙ」は、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なる、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドの修飾を表し、ＮａおよびＮｂは、同じかまたは異なる修飾であってよい。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウイング修飾が存在する場合、存在してもまたは存在しなくてもよい。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾は、鎖のいずれかの位置の、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方の鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に対する全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じでも、異なっていてもよく、センス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖に対するヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対してシフトを有し得る。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端での２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端での２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉは、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。さらに、ヌクレオチド間結合の修飾を実施して、オーバーハングヌクレオチドを、二本鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと結合させることもできる。例えば、少なくとも２、３、４、または全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合によって結合されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと結合させる、追加ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３つのヌクレオチドの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端に存在してもよい。
一実施形態では、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方で、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二本鎖内のミスマッチ、またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二本鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似のまたは同様の分析を使用してもよい）を促進する傾向に基づいて評価することができる。解離の促進に関しては：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準または正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二本鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準もしくは正準以外の対合または、ユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の最初の１、２または３塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内の第１の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態では、センス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端のヌクレオチドは、デオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態では、短い配列のデオキシ－チミンヌクレオチド、例えば、センスおよび／またはアンチセンス鎖の３’末端に対する２つのｄＴヌクレオチドがある。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉ）
により表すことができ、
式中：
ｉおよびｊは、各々独立に、０または１であり；
ｐおよびｑは、各々独立に、０～６であり；
各Ｎａは、独立に、０～２５個のの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立に、０～１０個のの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、ＮｂおよびＹは、同一修飾を有しておらず；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表す。好ましくは、ＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互のパターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて；または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得る（例えば：６位、７位、８位、７位、８位、９位、８位、９位、１０位、９位、１０位、１１位、１０位、１１位、１２位または１１位、１２位、１３位に存在し得る）。
一実施形態では、ｉは１であり、ｊは０であり、またはｉは０であり、ｊは１であり、あるいは、ｉおよびｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉｄ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）によって表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６個である。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでも、異なっていてもよい。
他の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩ）
により表すことができ、
式中：
ｋおよびｌは、各々独立に、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々独立に、０～６であり；
各Ｎａ’は、独立に、０～２５個のの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は、独立に、０～１０個のの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有しておらず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表す。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含む。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近辺に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて；または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１で、ｌは０であるか、またはｋは０で、ｌは１であるか、またはｋおよびｌはいずれも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （ＩＩｄ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、各Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋは０で、ｌは０であり、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’ （Ｉａ）
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同じでも、又は異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾してもよい。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔであるとき、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで数え始めて、鎖の９位、１０位および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含んでもよく；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含んでもよく；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで数え始めて、鎖の１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含んでもよく；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端にウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含んでいてもよく；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでいてもよく、各鎖は、１４～３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
により表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は、各々独立に、０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立に、０～２５個のの修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立に、０～１０個のの修飾ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、各々存在してもしなくてもよく、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々独立に、３つの連続したヌクレオチドに対する３つの同一修飾の１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは、０で、ｊは、０であり；またはｉは、１で、ｊは０であり；またはｉは、０で、ｊは、１であり；またはｉおよびｊの両方が、０であり；またはｉおよびｊの両方が、１である。別の実施形態では、ｋは、０で、ｌは、０であり；またはｋは、１で、ｌは、０であり；ｋは０で、ｌは１であり；またはｋおよびｌの両方が、０であり；またはｋおよびｌの両方が、１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）によって表される場合、各Ｎｂは、独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立に、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ’の各々は、独立に、交互のパターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）中のＸ、ＹおよびＺの各々は、互いに同じでも、異なっていてもよい。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＹヌクレオチドの全３つが全て、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＺヌクレオチドの全３つが全て、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し；またはＸヌクレオチドの全３つが全て、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドに対する修飾は、Ｙ’ヌクレオチドに対する修飾と異なり、Ｚヌクレオチドに対する修飾は、Ｚ’ヌクレオチドに対する修飾と異なり、および／またはＸヌクレオチドに対する修飾は、Ｘ’ヌクレオチドに対する修飾と異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合される。また別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカー（後述する）を介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートしている。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートしている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）によって表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合を介して隣接するヌクレオチドに結合され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートしている。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される少なくとも２つの二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の二本鎖を含む多量体であり、この二本鎖は、リンカーによって結合される。リンカーは、切断可能または切断不可能であり得る。任意選択で、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；または二本鎖の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表される、２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに、および３’末端の一方もしくは両方と結合され、任意選択でリガンドにコンジュゲートしている。ＲＮＡｉ剤は各々、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的とすることができ；またはＲＮＡｉ剤の各々は、２つの異なる標的部位において同じ遺伝子を標的とすることができる。
様々な文献が、本発明の方法に用いることができる多量体ＲＮＡｉ剤を記載している。そうした文献として、それぞれの全内容を参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号、同第２００７／１１７６８６号、同第２００９／０１４８８７号および同第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられる。
以下にさらに詳細に説明するように、ＲＮＡｉ剤に対する１つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲートを含むＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数の特性を最適化することができる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットは、炭水化物リガンドに結合した別の部分、例えば、非炭水化物（好ましくは環状）担体で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系であってよく、すなわち、全ての環原子が炭素原子またはヘテロ環系である、すなわち、１つまたは複数の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、イオウであってよい。環状担体は、単環系であってもよいし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含有するものであってもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよいし、または１つまたは複数の二重結合を含むものでもよい。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合してもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも１つの「係留結合点」を含む。「骨格結合点」は、本明細書の用法では、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸、もしくは修飾リン酸（例えば、イオウ含有）骨格への担体の組込みに利用可能で、しかもそれに好適な結合を指す。いくつかの実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）は、選択部分と結合する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子もしくはヘテロ原子（骨格結合点を賦与する原子とは異なる）を指す。上記の選択部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であってよい。任意選択で、選択部分は、介入テザーによって環状担体と結合される。したがって、環状担体は、多くの場合、官能基、例えば、アミノ基を含み、または一般に、別の化学実体、例えば、リガンドを構成環に組み込む、または係留するのに好適な結合を提供する。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートさせてもよく、担体は、環状基または非環状基であってよく；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の実施形態では、本発明の方法に使用するためのＲＮＡｉ剤は、表３～５、７、および８のいずれか１つに列挙する薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドをさらに含んでもよい。
ＩＶ．リガンドコンジュゲートｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）などの脂質部分；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）；例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）などの脂肪族鎖；例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓｅａｍｉｎｅ）多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
Ａ．脂質複合体
１つの実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα－らせん剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１４））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１６））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、ＨＢＶ以上（例えばＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＨＢＶ、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。一実施形態では、単糖は、
Figure 0007403485000005
 などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、
Figure 0007403485000006
Figure 0007403485000007
Figure 0007403485000008
Figure 0007403485000009
Figure 0007403485000010
 からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態で使用される別の代表的な炭水化物複合体としては、
Figure 0007403485000011
 （式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子および／または細胞透過性ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、上述の１つまたは複数の追加的なリガンドをさらに含む。
本発明での使用に好適なさらに別の炭水化物複合体としては、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第２０１４／１７９６２０号および同第２０１４／１７９６２７号パンフレットに記載されているものがある。
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含み、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４個の原子、３～２４個の原子、４～２４個の原子、５～２４個の原子、６～２４個の原子、６～１８個の原子、７～１８個の原子、７～１７この原子、８～１７個の原子、６～１６個の原子、７～１６個の原子、または、８～１６個の原子である。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍より迅速に切断される。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
ｉ．酸化還元切断可能連結基
１つの実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物とコンジュゲートする。本発明の組成物および方法のリンカーとコンジュゲートするｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
Figure 0007403485000012
Figure 0007403485000013
Figure 0007403485000014
 （式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＸＸＩＩ）～（ＸＸＸＶ）、
Figure 0007403485000015
 （式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 0007403485000016
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーとコンジュゲートする。三価のコンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶ）、
Figure 0007403485000017
 （式中、
Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書、米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲート結合されており、このようなコンジュゲート結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的なコンジュゲート結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基をコンジュゲート結合する分子と反応させる。コンジュゲート結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
Ｖ．発明のｉＲＮＡの送達
例えば、ヒト対象（例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現に関連する疾患、障害または病状を有する対象などの、それを必要とする対象）などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成することができる。
例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウンを示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．， ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分にコンジュゲート結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへのコンジュゲート結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＰＮＰＬＡ３遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０－２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２（１９９４）にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４（１９９３）である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、本発明のｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３（１９９５）にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターもまた、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
本発明のｉＲＮＡを送達するのに好適な別のウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
ＶＩ．発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含有する医薬組成物および製剤も含む。一実施形態では、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現または活性に関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。
このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。一実施例は、例えば、皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または静脈内（ＩＶ）送達による、非経口送達を通じた、全身投与のために調合される組成物である。別の例は、例えば、連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、脳実質内への直接送達のために調合される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与してよい。
本発明の医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与してよい。概して、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般に１日あたり体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇで投与してよい。反復投与レジメンは、定期的な、例えば、１日おき、または１年ごとの治療量のｉＲＮＡの投与を含み得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、約１ヵ月ごとから約３ヵ月ごと（すなわち、３ヵ月に約１回）に投与する。最初の治療レジメン後には、より低い頻度で治療薬を投与することができる。
当業者は、限定はしないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、ならびに存在するその他の疾患をはじめとする特定の要因が、対象を効果的に治療するのに必要な用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらには、治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期の推定は、当技術分野で公知のように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて実施することができる。
マウス遺伝学における進歩は、ＰＮＰＬＡ３の発現低下から利益を受ける障害などの、様々なヒト疾患研究のためのいくつかのマウスモデルを作り出した。このようなモデルは、薬剤の生体内試験のために、ならびに治療有効用量を判定するために、使用することができる。好適な食事および遺伝子マウスモデルは、ＫａｎｕｒｉおよびＢｅｒｇｈｅｉｍ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．（２０１３）１４：１１９６３－１１９８０）に論述されている。
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
Ａ．膜様分子アセンブリーを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ｉＲＮＡを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
ｉＲＮＡ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にｉＲＮＡ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はｉＲＮＡ剤と相互作用して、ｉＲＮＡ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ｉＲＮＡ剤のリポソーム調製物を得る。
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小型（５０～２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソーム内のｉＲＮＡ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０－９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９－２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４（６）４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含み、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含む、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ｉＲＮＡ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたｉＲＮＡ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質－核酸複合体を形成し、ｉＲＮＡ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つとコンジュゲートするカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分とコンジュゲートしているものが挙げられ、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、コンジュゲートするカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびｉＲＮＡ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ｉＲＮＡ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのｉＲＮＡ剤の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２－５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ｉＲＮＡ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ｉＲＮＡ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
本発明を適用できるその他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書、および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書もまた、本発明を適用できる製剤を記載する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
Ｂ．脂質粒子
例えば、本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えば、ＬＮＰ、またはその他の核酸－脂質粒子などの脂質製剤中に完全にカプセル化してしてもよい。「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの薬学的に活性の分子をカプセル化する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、例えば、その全内容を参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号明細書に記載されている。
ＬＮＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えば、ＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
別の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子凝集を阻害するコンジュゲート結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げるコンジュゲート結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で交換し得る。
Figure 0007403485000018
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
追加的な例示的脂質ｄｓＲＮＡ製剤は、表１に記載される。
Figure 0007403485000019
Figure 0007403485000020
Figure 0007403485000021
ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照によって本明細書に援用する、２００９年１月２９日に出願された米国仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮出願第号明細書；２００９年７月２４日に出願された米国仮出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載される。
ＭＣ３を含む製剤は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、２０１０年６月１０日に出願された、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載される。
ＡＬＮＹ－１００含有製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、２００９年１１月１０日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０９／６３９３３号明細書に記載される。
Ｃ１２－２００含有製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載される。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含む、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含む複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のｉＲＮＡ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ－２４，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照されたい）。
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照されたい）。
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｉＲＮＡＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ｉＲＮＡ機序によって機能し、溶血性障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定されるものではない。
それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、ＰＮＰＬＡ３発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＶＩＩ．ＰＮＰＬＡ３発現を阻害する方法
本発明はまた、細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。この方法は、細胞内でＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するのに有効な量の例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤などのＲＮＡｉ剤と細胞を接触させ、これにより、細胞内でＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するステップを含む。
例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤などのＲＮＡｉ剤と細胞の接触は、試験管内または生体内のいずれで実施してもよい。ＲＮＡｉ剤と生体内の細胞の接触は、例えば、ヒト対象などの対象内の細胞または細胞群をＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。また、細胞を接触させる試験管内および生体内方法の組合せも可能である。細胞の接触は、前述したように、直接または間接的のいずれであってもよい。さらに、細胞の接触は、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意のリガンドをはじめとする、標的化リガンドによって達成することもできる。好ましい実施形態では、標的化リガンドは、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンドなどの炭水化物部分、または目的の部位にＲＮＡｉ剤を誘導するいずれか他のリガンドである。
一実施形態では、ｉＲＮＡと細胞の接触は、細胞内への取込みまたは吸収を促進もしくは実施することによる「導入」または「細胞内へのｉＲＮＡの送達」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取込みは、自力拡散または活性細胞プロセスにより、または補助剤もしくは装置によって行うことができる。細胞内へのｉＲＮＡの導入は、試験管内および／または生体内のいずれであってもよい。例えば、生体内導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞内への試験管内導入は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当技術分野で公知の方法を含む。さらに別の手法は、以下に記載し、および／または当技術分野で公知である。
「阻害する」という用語は、本明細書の用法では、「低下する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」およびその他の類似用語と置き換え可能に用いられ、あらゆるレベルの阻害を含む。
「ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害する」という語句は、任意のＰＮＰＬＡ３遺伝子（例えば、マウスＰＮＰＬＡ３遺伝子、ラットＰＮＰＬＡ３遺伝子、サルＰＮＰＬＡ３遺伝子、またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子など）ならびにＰＮＰＬＡ３遺伝子の変異体もしくは突然変異体の発現の阻止を指す。したがって、ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、野生型ＰＮＰＬＡ３遺伝子、突然変異型ＰＮＰＬＡ３遺伝子（例えば、アミロイド沈着を引き起こす突然変異型ＰＮＰＬＡ３遺伝子など）、または遺伝子操作細胞、細胞群、もしくは生物に関連してトランスジェニックＰＮＰＬＡ３遺伝子であってもよい。
「ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する」は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の少なくとも一部の抑制を含む。ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、例えば、ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡレベル、ＰＮＰＬＡ３タンパク質レベル、またはアミロイド沈着物の数もしくは程度などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現と関連する任意の変数のレベル、またはレベルの変化に基づいて評価され得る。このレベルは、例えば、対象由来のサンプルをはじめとする、個々の細胞または細胞群において評価することができる。
阻害は、対照レベルと比較して、ＰＮＰＬＡ３発現に関連する１つまたは複数の変数の絶対もしくは相対レベルの減少によって評価してもよい。対照レベルは、例えば、投与前のベースラインレベル、または処置されていないか、または対照（例えば、緩衝剤のみの対照もしくは不活性剤対照）で処置された類似対象、細胞、若しくはサンプルから決定したレベルなどの当技術分野で使用されている任意のタイプの対照レベルであってよい。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％阻害される。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、同様に処置されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が阻害されるように、ＰＮＰＬＡ３遺伝子が転写され、且つ処置された（例えば、細胞を本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることにより、または当該細胞が存在する、もしくは存在した対象に本発明のＲＮＡｉ剤の投与することにより）第１の細胞または細胞群（こうした細胞は、例えば、対象由来のサンプル中に存在し得る）により発現されるｍＲＮＡの量の減少によって明らかにされ得る。好ましい実施形態では、阻害は、以下の式：
Figure 0007403485000022
 を用いて、対照細胞中のｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして処置細胞中のｍＲＮＡのレベルを表すことにより、評価される。
あるいは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、例えば、ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現またはヘッジホッグ経路タンパク質活性などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現に機能的に関連するパラメータの低下に関して評価することもできる。ＰＮＰＬＡ３遺伝子サイレンシングは、構成的に、またはゲノム操作によるいずれかで、ＰＮＰＬＡ３を発現する任意の細胞において、当技術分野で公知の任意のアッセイにより決定することができる。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群により発現されるＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベル（例えば、対象由来のサンプル中で発現されるタンパク質のレベル）の低下によって明らかにすることができる。上に説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処置細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞または細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害を評価するために使用することができる対照細胞または細胞群としては、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞または細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞または細胞群は、ＲＮＡｉ剤による対象の処置前に、個別の対象（例えば、ヒトもしくは動物対象）から得ることができる。
細胞または細胞群により発現されるＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡのレベル、または循環ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態では、サンプル中のＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡなどの転写ポリヌクレオチド、またはその部分を検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用をはじめとする、ＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイフォーマットとしては、核ランオン（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ－ｏｎ）アッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５））、ノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡは、その全内容を参照によって本明細書に援用する、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書に記載の方法を用いて検出することができる。
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３の発現のレベルは、核酸プローブを用いて決定される。「プローブ」という用語は、本明細書の用法では、特定のＰＮＰＬＡ３に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成することができるし、または適切な生物学的調製物から得ることもできる。プローブは、標識されるように、特にデザインしてもよい。プローブとして使用することができる分子の例として、限定はしないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに用いることができ、限定はしないが、こうしたものとして、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイが挙げられる。ｍＲＮＡレベルの一決定方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）と接触させるステップを含む。一実施形態では、例えば、アガロースゲル上で単離ｍＲＮＡを泳動させ、ゲルからのｍＲＮＡをニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。別の実施形態では、プローブは、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイを用いて、固体表面上に固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡのレベルの決定に使用するために容易に適合させることができる。
サンプル中のＰＮＰＬＡ３の発現のレベルを決定するための別の方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載の実験的な実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－βレプリカーゼ（Ｑ－Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）またはいずれか他の核酸増幅法による、例えばサンプル中のｍＲＮＡの核酸増幅および／または逆転写酵素（ｃＤＮＡを生成するための）の工程の後、当業者には周知の技術を用いて、増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少数存在する場合、核酸分子の検出に有用である。本発明の具体的な態様では、ＰＮＰＬＡ３の発現のレベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）により定量する。
ＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析に使用されているものなど）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズもしくはファイバー（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を用いて、モニターすることができる。参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号および同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＰＮＰＬＡ３発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブの使用も含み得る。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡのレベルは、分岐状ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価する。これらの方法の使用は、本明細書に提供する実施例に記載および例示する。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のために、当技術分野で公知の任意の方法を用いて決定することもできる。こうした方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元もしくは二元）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法の効果は、四肢、顔、喉頭、上気道、腹部、躯幹、および性器の浮腫状腫脹、前駆症；喉頭部浮腫；非掻痒性発疹；吐き気；嘔吐；または腹痛などのＰＮＰＬＡ３疾患の症状の低減を検出もしくはモニターすることにより、モニターすることができる。これらの症状は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて試験管内または生体内で評価することができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が対象内の特定の部位に送達されるように、ＲＮＡｉ剤を対象に投与する。ＰＮＰＬＡ３の発現の阻害は、対象内の特定の部位からの体液もしくは組織から得られたサンプル中のＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベルもしくはその変化の測定を用いて評価することができる。好ましい実施形態では、上記の部位は、肝臓、脈絡叢、網膜、および膵臓からなる群から選択される。上記部位は、上に挙げた部位のいずれか１つからの細胞の小単位または部分群であってもよい。この部位はまた、特定の受容体を発現する細胞も含み得る。
ＶＩＩＩ．ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療または予防する方法
本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、障害、および／もしくは病状を有する、またはＰＮＰＬＡ３関連疾患、障害、および／もしくは病状を発症しやすい対象に、ｉＲＮＡ剤を含む組成物、またはｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、または本発明のｉＲＮＡを含むベクターを投与するステップを含む、治療および予防方法を提供する。ＰＮＰＬＡ３関連疾患の非限定的な例として、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）が挙げられる。一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、ＮＡＦＬＤである。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、ＮＡＳＨである。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。
本発明の方法は、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減から利益を受ける対象などの、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療する上で有用である。一態様では、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象におけるパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子発現のレベルを低下させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象におけるＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベルを低下させる方法を提供する。本発明はまた、ＮＡＦＬＤを有する対象におけるヘッジホッグ経路の活性のレベルを低下させる方法も提供する。
別の態様では、本発明は、ＮＡＦＬＤを有する対象を治療する方法を提供する。一態様では、本発明は、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪蓄積、肝臓の炎症、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を治療する方法を提供する。本発明の治療方法（および使用）は、例えば、ヒトなどの対象に、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤、またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物、またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明のベクターを治療有効量で投与するステップを含む。
一態様では、本発明は、例えば、上昇したヘッジホッグシグナル伝達経路の存在、疲労、衰弱、減量、食欲不振、吐き気、腹痛、クモ状血管、皮膚および眼の黄色化（黄疸）、かゆみ、水分蓄積および脚の腫脹（浮腫）、腹部膨満（腹水）、および精神錯乱など、ＮＡＦＬＤを有する対象の少なくとも１つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、治療有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、本発明のｄｓＲＮＡ、医薬組成物、またはベクターを対象に投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下から利益を受ける障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防するステップを含む。
別の態様では、本発明は、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象などの対象を治療するための、治療有効量の本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減および／または阻害から利益を受ける対象などの対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低減から利益を受ける障害を有する対象を治療するための薬剤の製造における、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とする本発明のｉＲＮＡ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）、またはＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患など、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低減および／または阻害から利益を受ける障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための本発明のｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）の使用を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現および／またはＳＣＡＰタンパク質産生の低減および／または阻害から利益を受ける障害に罹患している対象の少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における本発明のｉＲＮＡ剤の使用を提供する。
一実施形態では、ＰＮＰＬＡ３を標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象に、例えば対象の細胞、組織、血液、またはその他の組織もしくは体液中で、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、ｄｓＲＮＡが対象に投与されたとき、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％以上低下するように、投与される。
本発明の方法および使用は、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が低減するように、１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、または約８０時間などの時間にわたって、本明細書に記載の組成物を投与するステップを含む。一実施形態では、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７日以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、または約４週間以上の長期間にわたって低減する。
本発明の方法および使用に従うｄｓＲＮＡの投与は、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する患者におけるそうした疾患または障害の重症度、兆候、症状、および／またはマーカの低下をもたらし得る。これに関連して、「低下」は、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％であり得る。
疾患の治療または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛減少、生活の質、治療効果維持に必要な薬剤用量、疾病マーカのレベルまたは治療対象もしくは予防目標である、所与の疾患に適した、あらゆるその他の測定可能パラメータレベルを測定することによって評価することができる。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＮＡＦＬＤの治療の効能は、例えば、ＮＡＦＬＤ症状、肝臓脂肪レベル、または下流遺伝子の発現を定期的にモニターすることによって評価してもよい。最初の読み取りと後の読み取りの比較は、治療が効果的かどうかの指標を医師に提供する。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＰＮＰＬＡ３を標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与と関連して、ＰＮＰＬＡ３関連疾患「に対して効果的」とは、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に、症状改善、治癒、疾患低減、延命、生活の質改善、またはＮＡＦＬＤおよび／もしくはＰＮＰＬＡ３関連疾患ならびに関連原因の治療に精通している医者によって、好ましいと一般に認められているその他の効果などの有益な効果をもたらすことを意味する。
病態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または処置がなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験動物モデルを使用する場合、治療の有効性は、マーカまたは症状の統計的に有意な低下が観察される場合に、証明される。
対象には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．６５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．８５ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．９５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、５．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、６．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、７．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、８．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．１ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．２ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．４ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．６ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．７ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．８ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．９ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、９．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、１５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、２５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、３５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、４５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡ、または約５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなどの治療量のｉＲＮＡを投与し得る。一実施形態では、対象に０．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを投与してよい。列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図される。
ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿またはその他のコンパートメント中で、ＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルの存在を少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％以上低下させ得る。
ｉＲＮＡの総用量の投与前に、５％輸液などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応などの悪影響についてモニターすることができる。別の実施例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ－αまたはＩＮＦ－α）レベル増大などの望まれない免疫賦活性効果について、患者をモニターすることができる。
ＰＮＰＬＡ３発現に対する阻害効果によって、本発明に従う組成物またはそれから調製される医薬組成物は、生活の質を高めることができる。
本発明のｉＲＮＡは、「裸の」形態で投与してもよく、この場合、修飾または未修飾ｉＲＮＡ剤は、「遊離ｉＲＮＡ」として、水性または好適な緩衝溶媒中に直接懸濁させる。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。遊離ｉＲＮＡは、好適な緩衝溶液中にあってもよい。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に適するように調節することができる。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与してもよい。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象は、本明細書に記載する非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および／またはＰＮＰＬＡ３関連疾患もしくは障害を有するものである。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象の治療は、治療的および予防的治療を含む。
本発明は、例えば、これらの障害を治療するために目下用いられているもののような、既知の医薬品および／または既知の治療法などのその他の医薬品および／またはその他の治療法と組み合わせて、例えばＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象などのＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を受ける対象を治療する方法、ならびにそのためのｉＲＮＡ剤またはその医薬組成物の使用をさらに提供する。
例えば、特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にするｉＲＮＡは、本明細書の他の箇所で記載されるように、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療するのに有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象などのＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける対象を治療するのに適した追加的な治療薬および治療法としては、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の異なる部分を標的とするｉＲＮＡ剤、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を治療するための治療薬、および／もしくは処置、またはこれらのいずれかの組合せが挙げられる。
特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にする第１のｉＲＮＡ剤は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の異なる部分を標的とする第２のｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与される。例えば、第１のＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成する第１センス鎖および第１アンチセンス鎖を含み、ここで、前記第１センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部と前記第１アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部が、修飾ヌクレオチドであり、前記第１センス鎖は、３’末端で結合したリガンドにコンジュゲートしており、このリガンドは、二価もしくは三価分岐状リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体であり；第２のＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成する第２センス鎖および第２アンチセンス鎖を含み、ここで、前記第２センス鎖のヌクレオチドの実質的に全部と前記第２アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全部は、修飾ヌクレオチドであり、前記第２センス鎖は、３’末端で結合したリガンドにコンジュゲートしており、このリガンドは、二価もしくは三価分岐状リンカーを介して結合された１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態では、第１および第２センス鎖のヌクレオチドの全部ならびに／または第１および第２アンチセンス鎖のヌクレオチドの全部は、修飾を含む。
一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基包含ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基包含ヌクレオチド、メチルホンスホン酸基包含ヌクレオチド、５’－リン酸塩包含ヌクレオチド、および５’－リン酸塩模倣物包含ヌクレオチドからなる群から選択される。
特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にする第１のｉＲＮＡ剤は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与される。例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にするｉＲＮＡ剤は、ＳＣＡＰ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与される。ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にする第１のｉＲＮＡ剤と、ＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤は、同じ医薬組成物の一部として投与してもよい。あるいは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的にする第１のｉＲＮＡ剤と、例えば、ＳＣＡＰ遺伝子などのＰＮＰＬＡ３遺伝子とは異なる遺伝子を標的とする第２のｉＲＮＡ剤は、別の医薬組成物の一部として投与してもよい。
ｉＲＮＡ剤および別の治療薬ならびに／または治療を同時におよび／もしくは同じ併用薬中で、例えば、非経口的に投与してもよいし、あるいは、別の治療薬を個別の組成物の一部としてもしくは別々に、および／または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載の別の方法により投与することができる。
本発明はまた、細胞内のＰＮＰＬＡ３発現を低下および／または阻害するために、本発明のｉＲＮＡ剤および／または本発明のｉＲＮＡ剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。他の態様では、本発明は、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を低下および／または阻害するのに使用するための、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を提供する。さらに別の態様では、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を低下および／または阻害する薬剤の製造を目的とする、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物の使用が提供される。また別の態様では、本発明は、細胞内のＰＮＰＬＡ３タンパク質産生の低下および／または阻害に使用するための、本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を提供する。さらに別の態様では、細胞内のＰＮＰＬＡ３タンパク質産生を低下および／または阻害する薬剤の製造を目的とする本発明のｉＲＮＡおよび／または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物の使用が提供される。本方法および使用は、本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡと細胞を接触させ、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって細胞を維持し、これによって細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現またはＰＮＰＬＡ３タンパク質産生を阻害するステップを含む。
遺伝子発現の低下は、当技術分野で公知の任意の方法により評価することができる。例えば、ＰＮＰＬＡ３の発現の低下は、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲなどの当業者には常用の方法を用いて、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡ発現レベルを決定することにより、ウエスタンブロッティング、免疫学的方法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡなどの当業者には常用の方法を用いて、ＰＮＰＬＡ３のタンパク質レベルを決定することにより、および／またはＰＮＰＬＡ３の生物活性を決定することによって決定することができる。
本発明の方法および使用において、細胞は、試験管内または生体内のいずれで接触させてもよく、すなわち、細胞は、対象内にあってもよい。
本発明の方法を使用するのに適した細胞は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を発現するあらゆる細胞、例えば、ＮＡＦＬＤを有する対象からの細胞、またはＰＮＰＬＡ３遺伝子もしくはＰＮＰＬＡ３遺伝子の部分を含む発現ベクターを含む細胞であってよい。本発明の方法および使用で使用するのに適した細胞は、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞、または例えば、サル細胞もしくはチンパンジー細胞などの非ヒト霊長類細胞など）、非霊長類細胞（ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、またはバッファロー細胞など）などの哺乳類細胞、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞もしくはガチョウ細胞）、またはクジラ細胞であってもよい。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現は、細胞中で、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％阻害され得る。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質産生は、細胞中で、少なくとも約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％阻害され得る。
本発明の生体内における方法および使用は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与するステップを含んでもよく、ｉＲＮＡは、治療される哺乳類のＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療しようとする生物がヒトである場合、組成物は、皮下、静脈内、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば脳室内、実質内およびクモ膜下腔内）、筋肉内、経皮、気道（煙霧剤）、経鼻、直腸をはじめとする非経口経路、ならびに局所（バッカルおよび舌下をはじめとする）投与を含むが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の手段によって投与することができる。特定の実施形態では、組成物は、皮下もしくは静脈輸液または注射によって投与される。一実施形態では、組成物は、皮下注射により投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期にわたり、一貫性を持ってｉＲＮＡを放出し得る。したがって、蓄積注射は、例えば、要望されるＰＮＰＬＡ３の阻害、または治療的もしくは予防的効果などの所望の効果を得るのに、必要な投薬頻度を減少させ得る。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉内注射が挙げられる。好ましい実施形態では、蓄積注射は皮下注射である。
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ、または外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、点滴ポンプである。点滴ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外輸液のために使用してもよい。好ましい実施形態では、点滴ポンプは、皮下点滴ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを対象に送達する、外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに基づいて、および治療領域に基づいて、選択してもよい。投与経路および部位は、標的化を向上させるように選択してもよい。
一態様では、本発明はまた、例えば、ヒトなどの哺乳類中で、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。本発明はまた、哺乳類中でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに使用される、例えば、哺乳類の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物も提供する。別の態様では、本発明は、哺乳類中でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する薬剤の製造における、例えば、哺乳類の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの使用を提供する。
方法および使用は、例えば、哺乳類の細胞内でＰＮＰＬＡ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を、例えば、ヒトなどの哺乳類に投与して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するに十分な時間にわたり哺乳類を保ち、それによって哺乳類中でＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するステップを含む。
遺伝子発現の低下は、例えば、本明細書に記載するｑＲＴ－ＰＣＲなどの当技術分野で公知のあらゆる方法によって、ｉＲＮＡ投与対象の末梢血サンプル中で評価することができる。タンパク質産生の低下は、技術分野で公知のあらゆる方法によって、そして例えば、本明細書に記載するＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティングなどの方法によって、評価することができる。一実施形態では、組織サンプルが、ＰＮＰＬＡ３遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニターするための組織材料の役割を果たす。別の実施形態では、血液サンプルが、ＰＮＰＬＡ３遺伝子および／またはタンパク質発現の低下をモニターするための組織材料の役割を果たす。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤の投与後の生体内標的のＲＩＳＣ媒介切断の確認は、５’－ＲＡＣＥまたは当技術分野で公知のプロトコルの改変（Ｌａｓｈａｍ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３８（３）ｐ－ｅ１９）（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－４）を実施することによって行う。
以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらは、限定的として解釈すべきではない。本明細書全体を通して言及される、全ての参考文献、特許および公開特許出願、ならびに配列表は、その内容全体を参照によって援用する。
実施例１：ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示さない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
ｓｉＲＮＡデザイン
ヒトＰＮＰＬＡ３、「パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３」（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０２５２２５、ＧＩ：１７１９６６２５；配列番号１および配列番号２）ならびに毒性種由来のＰＮＰＬＡ３オーソログ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＧＩ：５４４４６１３２３（ＲＥＦＳＥＱ受入番号ＸＭ＿００５５６７０５１．１、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）；配列番号７および配列番号８）；ＧＩ：５４４４６１３２５（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＸＭ＿００５５６７０５２．１、カニクイザル；配列番号１１および配列番号１２）；ＧＩ：２９７２６１２７０（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＸＭ＿００１１０９１４４．２、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、配列番号９および配列番号１０）；ＧＩ：１４４２２６２４４（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿０５４０８８．３、マウス；配列番号３および配列番号４）；ＧＩ：５３７３６１０２７（ＲｅｆＳｅｑ受入番号ＮＭ＿００１２８２３２４．１、ラット；配列番号５および配列番号６））を標的とするｉＲＮＡｓのセットは、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いてデザインした。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡは、２８０５塩基の長さを有する。ｉＲＮＡデザインのセットの理論的根拠および方法は、次の通りである：ヒトＰＮＰＬＡ３ｍＲＮＡ（コード領域を含む）の１位から２８０５位までのあらゆる潜在的１９量体ｉＲＮＡについての予測効能は、多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００超の異なるｉＲＮＡデザインのデータに基づくｍＲＮＡノックダウンの直接測定値を予測した線形モデルを用いて決定した。ＰＮＰＬＡ３ ｉＲＮＡのサブセットは、ヒトおよびカニクイザル同士の完全またはほぼ完全なマッチと共にデザインした。マウスおよびラットＰＮＰＬＡ３オーソログに対する完全またはほぼ完全なマッチと共に、さらに別のサブセットをデザインした。ｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり攻撃検索（ｂｒｕｔｅ ｆｏｒｃｅ ｓｅａｒｃｈ）で使用して、ｉＲＮＡと、標的種トランスクリプトーム内の全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位として画定されるシード領域内、ならびにここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０～１１位として画定されるｉＲＮＡの切断部位内のミスマッチに、追加重みを付与した。ミスマッチの相対重みは、シードミスマッチでは２．８、切断部位ミスマッチでは１．２、またアンチセンス１９位までの他の位置のミスマッチでは１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、それぞれ重み付けしたミスマッチの値を合計することにより、特異性スコアを計算した。ヒトおよびカニクイザルのアンチセンススコアが、３．０以上であり、予測効能が、ＰＮＰＬＡ３転写物の７０％以上のノックダウンであったｉＲＮＡを選択した。様々な２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ置換パターンをはじめとする、構造－活性修飾を含むｉＲＮＡの１セットもデザイン、合成およびスクリーニングした。
未修飾ＰＮＰＬＡ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧を表３に示す。
ｓｉＲＮＡ合成
ＰＮＰＬＡ３ｉＲＮＡ配列は、固体担体媒介ホスホロアミダイトケミストリーを用いて、Ｍｅｒｍａｄｅ１９２合成装置（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）により、１μｍｏｌスケールで合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンドまたはユニバーサル固体支持体（ＡＭ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を充填した制御孔性ガラス（５００Ａ）である。補助合成試薬、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡならびにデオキシホスホロアミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）およびＨｏｎｇｅｎｅ（中国）から取得した。２’Ｆ２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ（グリコール核酸）、５’リン酸およびその他の修飾は、対応するホスホロアミダイトを用いて導入した。３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲート一本鎖の合成は、ＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ支持体上で実施した。アンチセンス一本鎖の合成には、カスタムＣＰＧユニバーサル固体支持体を使用した。全ホスホロアミダイト（アセトニトリル中１００ｍＭ）のカップリング時間は、活性剤として５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）（アセトニトリル中０．６Ｍ）を用いて、５分であった。ホスホロアミダイト結合は、無水アセトニトリル／ピリジン（１：１ｖ／ｖ）中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手）の５０ｍＭ溶液を用いて生成した。酸化時間は、３分であった。全ての配列は、ＤＭＴ基を最終的に除去して合成した（「ＤＭＴオフ」）。
固体相合成の完了後、オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から切断し、２００μＬの水性メチルアミン試薬を用い、密封した９６深型ウェルプレート内で、６０℃で２０分間脱保護した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護した２’リボ残基（２’ＯＨ）を含む配列については、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミン三フッ化水素酸塩）試薬を用いて、第２段階の脱保護を実施した。メチルアミン脱保護溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦ試薬を添加し、溶液を６０℃でさらに２０分間インキュベートした。切断および脱保護ステップの終了時に、合成プレートを室温に到らせ、１ｍＬのアセトニトリル：エタノール混合物（９：１）の添加により沈殿させた。プレートを２時間かけて－８０℃に冷却し、マルチチャンネルピペットを用いて、上清を注意深くデカンテーションした。オリゴヌクレオチドペレットを２０ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液中に再懸濁させ、Ａ９０５オートサンプラーおよびＦｒａｃ９５０画分収集器を装備したＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩した。脱塩したサンプルは９６ウェルプレートに収集された。各配列からのサンプルをＬＣ－ＭＳにより分析し、同一性を確認し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量し、選択したサンプルセットをＩＥＸクロマトグラフィーにより分析して純度を決定した。
ＰＮＰＬＡ３一本鎖のアニーリングをＴｅｃａｎ液体処理ロボット上で実施した。等モル量のセンスおよびアンチセンス一本鎖の混合物を合わせ、９６ウェルプレート内でアニーリングした。相補的一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートを密封し、１００℃のオーブン内で１０分間加熱し、２～３時間かけてゆっくりと室温に到らせた。各二本鎖の濃度を１×ＰＢＳ中の１０μＭに対して正規化した。
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実施例２：ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から取得することができる。
転写物
ｓｉＲＮＡデザイン
ヒトＰＮＰＬＡ３（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０２５２２５、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：８０３３９）、ならびに毒性種ＰＮＰＬＡ３オーソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５６７０５１；マウス：ＮＭ＿０５４０８８；ラット：ＸＭ＿００６２４２１０９）を標的とするｉＲＮＡのセットは、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いてデザインした。ヒトＰＮＰＬＡ３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、２８０５塩基の長さを有する。ｓｉＲＮＡデザインのセットの理論的根拠および方法は、次の通りである：１７４位から２８０５位まで（コード領域および３’ＵＴＲ）のあらゆる潜在的１９量体ｉＲＮＡについての予測効能は、多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００超の異なるｉＲＮＡデザインからのｍＲＮＡノックダウンの直接測定値から得られた線形モデルを用いて決定した。ＰＮＰＬＡ３ ｉＲＮＡのサブセットは、ヒトおよびカニクイザル同士の完全またはほぼ完全なマッチと共にデザインした。マウスおよびラットＰＮＰＬＡ３オーソログに対する完全またはほぼ完全なマッチと共に、さらに別のサブセットをデザインした。ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＰＮＰＬＡ３オーソログに対する完全またはほぼ完全なマッチと共に、さらに別のサブセットをデザインした。ｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり攻撃検索で使用して、ｉＲＮＡと、標的種トランスクリプトーム内の全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。追加重みをシード領域内、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位、ならびにｓｉＲＮＡの切断部位、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの１０～１１位内のミスマッチに付与した。ミスマッチの相対重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位までの他の位置で、それぞれ、２．８、１．２および１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、各々重み付けしたミスマッチの値を合計することにより、特異性スコアを計算した。ヒトおよびカニクイザルのアンチセンススコアが、＞＝３．０であり、予測効能が、ＰＮＰＬＡ３転写物の＞＝７０％のノックダウンであったｉＲＮＡを選択した。
未修飾ＰＮＰＬＡ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧を表４に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧を表５に示す。
試験管内スクリーニング
細胞培養および形質移入
３８４ウェルプレートの個々のウェル内で、各５μｌのｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、Ｈｅｐ３ｂ細胞を形質移入し、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個の細胞を含有する、５０μｌのＥＭＥＭをｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間インキュベートした。２０ｎＭの最終二本鎖濃度で単回投与実験を実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームでの自動化プロトコルを用いて、ＲＮＡを単離した。手短には、５０μｌの溶解／結合緩衝液と、３μｌの磁性ビーズを含有する２５μｌの溶解緩衝液を、細胞を含むプレートに添加した。電磁シェーカ上でプレートを室温で１０分間インキュベートした後、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズ結合ＲＮＡを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを１５０μｌの溶離緩衝液で洗浄し、再度捕捉して、上清を除去した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号４３６８８１３）
反応あたり、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰｓ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および６．６μｌのＨ２Ｏを含有する、１０μｌのマスター混合物を、上で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密封し、混合し、電磁シェーカ上で室温にて１０分間インキュベートした後、３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレートのウェルあたり、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ９９９９９９０５）、０．５μｌのＰＮＰＬＡ３プローブ（Ｈｓ００２２８７４７＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、４つの独立した形質移入で試験した。
相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、２０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞、または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。アッセイから得られた結果を表６に示す。
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実施例３：ｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から取得することができる。
転写物
ｓｉＲＮＡデザイン
ヒトＰＮＰＬＡ３（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０２５２２５；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：８０３３９）、ならびに毒性種ＰＮＰＬＡ３オーソログ（カニクイザル：ＸＭ＿００５５６７０５１；マウス：ＮＭ＿０５４０８８；ラット：ＸＭ＿００６２４２１０９）を標的とするｉＲＮＡのセットは、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いてデザインした。ヒトＰＮＰＬＡ３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、２８０５塩基の長さを有する。ｉＲＮＡデザインのセットの理論的根拠および方法は、次の通りである：１７４位から２８０５位（コード領域および３’ＵＴＲ）までのあらゆる潜在的１９量体ｉＲＮＡについての予測効能は、多数の脊椎動物遺伝子を標的とする２０，０００超の異なるｉＲＮＡデザインからのｍＲＮＡノックダウンの直接測定値から得られた線形モデルを用いて決定した。ＰＮＰＬＡ３ ｉＲＮＡのサブセットは、ヒトおよびカニクイザル同士の完全またはほぼ完全なマッチと共にデザインした。マウスおよびラットＰＮＰＬＡ３オーソログに対する完全またはほぼ完全なマッチと共に、さらに別のサブセットをデザインした。ヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＰＮＰＬＡ３オーソログに対する完全またはほぼ完全なマッチと共に、さらに別のサブセットをデザインした。ｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを総当たり攻撃検索で使用して、ｉＲＮＡと、標的種トランスクリプトーム内の全ての可能なアラインメントとの間のミスマッチの数および位置を測定した。ここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位として画定されるシード領域、ならびにここではアンチセンスオリゴヌクレオチドの１０～１１位として画定されるｉＲＮＡの切断部位内のミスマッチに、追加重みを付与した。ミスマッチの相対重みは、シードミスマッチ、切断部位、およびアンチセンス１９位までの他の位置で、それぞれ、２．８、１．２および１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。各鎖について、各々重み付けしたミスマッチの値を合計することにより、特異性スコアを計算した。ヒトおよびカニクイザルのアンチセンススコアが、＞＝３．０であり、予測効能が、ＰＮＰＬＡ３転写物の＞＝７０％のノックダウンであったｉＲＮＡを選択した。
未修飾ＰＮＰＬＡ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧を表７に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３センスおよびアンチセンス鎖配列の詳細な一覧を表８に示す。表９は、表８に掲載した修飾ＰＮＰＬＡ３剤のｍＲＮＡ標的配列を示す。
試験管内スクリーニング
細胞培養および形質移入
３８４ウェルプレートの個々のウェル内で、各５μｌのｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、Ｈｅｐ３ｂ細胞、マウスおよびカニクイザル一次肝細胞を独立に形質移入し、室温で１５分間インキュベートした。次に、約５×１０３個のＨｅｐ３ｂ細胞を含有する４０μｌのＥＭＥＭ、または約５×１０３個の一次マウス肝細胞もしくは一次カニクイザル肝細胞を含有する４０μｌのウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ）培地をｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間インキュベートした。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で２つの単回投与実験を実施し、８、６倍希釈で、１０ｎＭから３６ｆＭまでの最終二本鎖濃度の用量範囲にわたり用量応答実験を実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡ単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームでの自動化プロトコルを用いて、ＲＮＡを単離した。手短には、５０μｌの溶解／結合緩衝液と、３μｌの磁性ビーズを含有する２５μｌの溶解緩衝液を、細胞を含むプレートに添加した。電磁シェーカ上でプレートを室温で１０分間インキュベートした後、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次に、ビーズ結合ＲＮＡを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、洗浄緩衝液Ｂで１回洗浄した。次に、ビーズを１５０μｌの溶離緩衝液で洗浄し、再度捕捉して、上清を除去した。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号４３６８８１３）
反応あたり、１μｌの１０×緩衝液、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰｓ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および６．６μｌのＨ２Ｏを含有する、１０μｌのマスター混合物を、上で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密封し、混合し、電磁シェーカ上で室温にて１０分間インキュベートした後、３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）のウェルあたり、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ９９９９９９０５）、０．５μｌのＰＮＰＬＡ３プローブおよび５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｈｓ９９９９９９０５）およびＰＮＰＬＡ３プローブ（Ｈｓ００２２８７４７＿ｍ１）を用いて、Ｈｅｐ３ｂ ｑＰＣＲをプロービングした。マウス一次肝細胞ｑＰＣＲは、マウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｍｍ０３３０２２４９＿ｇ１）およびマウスＰＮＰＬＡ３ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１）でプロービングした。カニクイザル一次肝細胞ｑＰＣＲは、カスタムカニクイザルＧＡＰＤＨプローブおよびカスタムカニクイザルＰＮＰＬＡ３プローブ（５’－ＡＧＣＧＧＧＧＵＣＵＧＡＡＧＵＣＡＵ－３’（配列番号１２０７））でプロービングした。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内でリアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、４つの独立した形質移入で試験した。
相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、２０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞、非標的化対照ｉＲＮＡ、または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。ＡＤ－１９５５のセンスおよびアンチセンス配列は、以下の通りである：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１２０８）；
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号１２０９）
試験管内Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）スクリーニング
細胞培養および形質移入
３７℃および５％ＣＯ２雰囲気内で、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で、Ｃｏｓ７細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエンス近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ構築物をｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド中で作製したところ、これは、約２．８ｋｂ（ヒト）ＰＮＰＬＡ３配列（配列番号１８）を含んでいた。デュアル－ルシフェラーゼプラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を用いて、１５×１０３個の細胞中にｓｉＲＮＡで同時形質移入した。９６ウェルプレートの各ウェルについて、０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを１０ｎｇのプラスミドベクターおよび１５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中のｉＲＮＡに添加し、室温で１５分かけて複合体化させた。次に、この混合物を、８０μｌの完全増殖培地に再懸濁させた細胞に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ルシフェラーゼを測定した。１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で２つの単回投与実験を実施し、８、６倍希釈で、１０ｎＭから３６ｆＭまでの最終二本鎖濃度の用量範囲にわたり用量応答実験を実施した。
Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ
ｓｉＲＮＡを形質移入してから４８時間後、ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）（３’ＵＴＲ中のＰＮＰＬＡ３標的配列に融合）ルシフェラーゼを測定した。初めに、培地を細胞から除去した。次に、各ウェル混合物に、培地量と同じ７５μｌのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅａｇｅｎｔを添加することにより、ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼ活性を測定した。混合物を室温で３０分間インキュベートした後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルミネッセンス（５００ｎｍ）を測定して、ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼシグナルを検出した。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性は、７５μｌの室温のＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに添加することにより測定し、プレートを１０～１５分間インキュベートした後、ルミネッセンスを再度測定して、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼシグナルを決定した。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔは、ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼシグナルをクエンチングし、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ反応はルミネッセンスを保持した。各ウェル内のウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）（ＰＮＰＬＡ３）シグナルをホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）（対照）シグナルに正規化することによって、ｉＲＮＡ活性を決定した。次に、ｓｉＲＮＡ活性の大きさを、同じベクターで形質移入したが、ｉＲＮＡで処置しなかった細胞、または非標的化ｉＲＮＡで処置した細胞と比較して評価した。全ての形質移入は、３回反復して行った。
表１０は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入したＨｅｐ３ｂ細胞を用いた１０ｎＭの単回投与スクリーニングおよび０．１ｎＭの単回投与スクリーニングの結果を示す。データは、未処置細胞に対して残るメッセージのパーセントとして表される。
表１１は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入したカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）一次肝細胞を用いた１０ｎＭの単回投与スクリーニングおよび０．１ｎＭの単回投与スクリーニングの結果を示す。データは、未処置細胞に対して残留するメッセージのパーセントとして表される。
表１２は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入したカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）一次肝細胞における用量応答を示す。示されるＩＣ５０値は、未処置細胞に対するＩＣ５０値を示す。
表１３は、示される修飾ＰＮＰＬＡ３ ＲＮＡｉ剤で形質移入したマウス一次肝細胞を用いた１０ｎＭの単回投与スクリーニングおよび０．１ｎＭの単回投与スクリーニングの結果を示す。データは、未処置細胞と比較した、残留メッセージのパーセントとして表される。
表１４は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入した一次マウス肝細胞における用量応答を示す。示されるＩＣ５０値は、未処置細胞に対するＩＣ５０値を示す。
表１５は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入したＣｏｓ７細胞を用いた１０ｎＭの単回投与スクリーニングおよび０．１ｎＭの単回投与スクリーニングの結果を示す。データは、負の対照と比較した、残留ｍＲＮＡのパーセントとして表される。
表１６は、示される修飾ＲＮＡｉ剤で形質移入したＣｏｓ７細胞における用量応答を示す。示されるＩＣ５０値は、未処置細胞に対するＩＣ５０値を示す。
Figure 0007403485000055
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実施例４．ＰＮＰＬＡ３ ｉＲＮＡ剤の単回用量投与の生体内効果
Ｏｂ／ｏｂマウスは、肝臓内にＰＮＰＬＡ３を強度に発現する。したがって、Ｏｂ／ｏｂマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｌｅｐｏｂ／Ｊ）に、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、もしくは３．０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量のＡＤ－６７５２５、ＡＤ－６７５２６、ＡＤ－６７５２８、ＡＤ－６５７３１、ＡＤ６７５３３、ＡＤ－６７５３８、もしくはＡＤ－６７５４４、または対照としてＰＢＳのみを投与した。投与から９６時間後に、動物を犠牲にして、肝臓を切除し、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのレベルを定量した。
図１に示すように、１．５ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与されたＡＤ－６５７２６、または３．０ｍｇ／ｋｇの単回用量として投与されたＡＤ－６７５３３が、アッセイした薬剤および用量のなかで最も頑健な肝臓ＰＮＰＬＡ３抑制を示した。
同等物
当業者は、常用の実験を用いるだけで、本明細書に記載した特定の実施形態および方法に対する多くの同等物を認めるか、または確認することができよう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

Claims (26)

  1. パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤であって、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は１６－２１ヌクレオチド長であり、そして前記アンチセンス鎖は１８－２３ヌクレオチド長であり、
    前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＧＡＣＡＵＵＡＵＣＣＵＡＡＵＧＧＧＵ－３’（配列番号５６３）からの少なくとも１８個の連続したヌクレオチドを含み、そして前記センス鎖は、ヌクレオチド配列５’－ＡＣＣＣＡＵＵＡＧＧＡＵＡＡＵＧＵＣＵ－３’（配列番号３１２）からの少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖のヌクレオチドの全部および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全部が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドおよび２’－フルオロ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドであり、
    前記センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして前記アンチセンス鎖は、５’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、３’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合とを含み、そして
    前記センス鎖は、３’末端で、分岐状二価または三価のリンカーを介して結合される１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートしている、
    二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 各鎖が、独立に、１９～２３ヌクレオチド長である、請求項１～３のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 各鎖が、独立に、２１～２３ヌクレオチド長である、請求項４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 前記リガンドが、
    Figure 0007403485000081
     である、請求項１～５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、以下の概略図：
    Figure 0007403485000082
     に示されるリガンドにコンジュゲートしている、請求項６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. 前記センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞。
  10. 請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  11. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、非緩衝液中に存在する、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 前記非緩衝液が、食塩水または水である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、緩衝液中に存在する、請求項１０に記載の医薬組成物。
  14. 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  16. 細胞におけるＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するインビトロでの方法であって、
    （ａ）請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤または請求項１０～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させるステップ；および
    （ｂ）ステップ（ａ）で生成した前記細胞を、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、これにより、前記細胞における前記ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するステップ
    を含むインビトロでの方法。
  17. 前記ＰＮＰＬＡ３の発現が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％阻害される、請求項１６に記載の方法。
  18. ＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける障害を有する対象を治療するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. ＰＮＰＬＡ３発現の低下から利益を受ける障害を有する対象の少なくとも１つの症状を予防するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤の予防有効量を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 前記障害が、ＰＮＰＬＡ３関連疾患である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記ＰＮＰＬＡ３関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記ＰＮＰＬＡ３関連疾患が、脂肪肝（脂肪症）である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  23. 前記ＰＮＰＬＡ３関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  24. 前記対象が、ヒトである、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 抗ＰＮＰＬＡ３抗体、またはその抗原結合断片を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  26. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下投与のためである、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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