JP7501876B2 - Ｉｌ－６阻害剤及びｃｃｒ２阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする泌尿器がんの治療剤 - Google Patents

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Description

本発明は、IL-6阻害剤及びCCR2阻害剤を組み合わせて投与することを特徴とする、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんの治療剤に関する。
膀胱がんは尿路上皮細胞の悪性腫瘍であり、人口高齢化と共にその発症率は増加傾向にある。早期の表在がんであれば経尿道的膀胱腫瘍切除術による治療が可能であるが、再発し易いという特徴を有している。また、進行した筋層浸潤性がんおよび転移症例の予後は改善されておらず、分子病態に基づく新規治療法が求められている。
UTX (ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat X chromosome, 別名lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)) はヒストンH3K27に対する脱メチル化酵素であり、様々なヒト腫瘍で機能欠失型変異が報告されている（非特許文献１）。変異の中では膀胱がん（Bladder cancer）の頻度が最も多く、また前立腺がん（Prostate cancer）及び陰茎がん（Penile cancer）の割合も高く、UTX機能欠失は泌尿器科領域の腫瘍発症に深く関与していると考えられている（非特許文献２、非特許文献３）。
Utxの膀胱がん発症における関与を示した論文としては、Utx変異を有するヒト膀胱がん細胞株を用いた免疫不全マウスへの移植実験モデルが報告されているが（非特許文献４）、これは培養細胞を用いて異種移植を行った結果であり、生体内でのUtx機能欠失を反映したモデルとは言い難い。これまで、膀胱がんに着目して遺伝子改変の手法を用いて膀胱特異的Utx欠損（UtxΔ/Δ）マウスを作製し解析を行った研究は報告されていない。
IL-6は、はB 細胞刺激因子2 (BSF2)あるいはインターフェロンβ2とも呼称されたサイトカインである。IL-6は、B リンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（非特許文献５）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（非特許文献６）。IL-6は、T リンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（非特許文献７）。
CCL2は、自然免疫及びTh2エフェクター応答及びCD4+T細胞分化等に関するケモカインであり、CC-ケモカインリガンド2、単球走化性タンパク質1、MCP-1とも称される（非特許文献８）。CCL2の受容体としてCCR2が知られている。
これまで、マウスの膀胱がんMB49細胞を浮遊培養した後、得られたsphere形成細胞(sMB49) についてin vitroでIL-6をブロックすることにより、sphere形成MB49細胞の浸潤能力が低減したことが報告されている（非特許文献９）。
また、抗IL-6抗体及び抗CCL2抗体を浸潤性の乳がんのマウスに投与した結果、がんの浸潤が抑制され、生存期間が延びたことが報告されている(非特許文献１０)。
しかし、IL-6阻害剤及びCCR2阻害剤の併用による膀胱がんの治療効果は報告されていない。
van Haaften et al. Nature Genetics, volume 41, number 5, 2009 Van der Meulen et al. Epigenetics, volume 9, Issue 5, 2014 Lu Wang, et al., UTX mutation in Human Cancer. Cancer Cell, 2019 Ler et al, Science Translational Medicine, 9, eaai8321 (2017) Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76 Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. （1988）167, 1253-1258 Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) p.801-840 Annals of Surgical Oncology, Nov. 2018, vol.25, Issue 12, pp3518-3526 Nature, Vol.515, 6, 2014, 130-133
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものである。本発明は、新規な泌尿器がんの治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんに対して、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２活性とＩＬ－６活性を共に抑制することにより腫瘍増大を有意に抑制できることを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下を含む。
〔１〕IL-6阻害剤を含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔２〕CCR2阻害剤を含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔３〕IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤。
〔４〕前記IL-6阻害剤が抗IL-6抗体又は抗IL-6受容体抗体である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔５〕前記抗IL-6抗体及び抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔４〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔６〕前記CCR2阻害剤がCCL2阻害剤である、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔７〕前記CCR2阻害剤が抗CCL2抗体又はプロパゲルマニウムである、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔８〕前記抗CCL2抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔７〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔９〕前記がんが膀胱がん、前立腺がん、又は腎臓がんである、〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１０〕前記がんが膀胱がんである、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１１〕前記がんが、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下したがんである、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１２〕前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１３〕前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、〔１２〕に記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１４〕前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１５〕前記がんが、p53遺伝子に変異を有するがんである、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１６〕KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
〔１７〕p53の発現の低下、機能の低下、及び/又はp53遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１〕～〔１０〕および〔１６〕のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
本発明はさらに、以下の態様も含む。
〔１８〕CCR2阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、IL-6阻害剤。
〔１９〕IL-6阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、CCR2阻害剤。
〔２０〕泌尿器がんの治療及び／または予防において用いるための、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせ。
〔２１〕個体に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんの治療及び／または予防方法。
〔２２〕個体に有効量のIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんの治療及び／または予防方法。
〔２３〕CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、IL-6阻害剤の使用。
〔２４〕IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、CCR2阻害剤の使用。
〔２５〕泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤の製造における、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせの使用。
〔２６〕前記IL-6阻害剤が抗IL-6抗体又は抗IL-6受容体抗体である、〔１８〕～〔２５〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２７〕前記抗IL-6抗体及び抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔２６〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２８〕前記CCR2阻害剤がCCL2阻害剤である、〔１８〕～〔２７〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔２９〕前記CCR2阻害剤が抗CCL2抗体又はプロパゲルマニウムである、〔１８〕～〔２７〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３０〕前記抗CCL2抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、〔２９〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３１〕前記がんが膀胱がん、前立腺がん、腎臓がんである、〔１８〕～〔３０〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３２〕前記がんが膀胱がんである、〔１８〕～〔３１〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３３〕前記がんが、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下したがんである、〔１８〕～〔３２〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３４〕前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、〔１８〕～〔３３〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３５〕前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、〔３４〕に記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３６〕前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、〔１８〕～〔３５〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３７〕前記がんが、p53に遺伝子変異を有するがんである、〔１８〕～〔３６〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３８〕KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１８〕～〔３２〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
〔３９〕p53の発現の低下、機能の低下、及び/又はp53遺伝子の変異を有すると判定された個体に投与するための、〔１８〕～〔３２〕及び〔３８〕のいずれかに記載の阻害剤、組み合わせ、治療方法、予防方法又は使用。
本発明により、新規の泌尿器がんの治療剤が提供された。
図1Aは、N-butyl-N-(4-hydro-oxybutyl) nitorosamine（BBN）の投与から10週間後のコントロールマウス（Utx+/+, p53+/-マウス）およびUtxΔ/Δ, p53+/-マウスの膀胱における、正常組織（Normal）、異形成～上皮内がん（Dysplasia～CIS）、および筋層への浸潤がん（Muscle invasive cancer）の比率を示す図である。図1Bは、BBNを投与されたUtxΔ/Δ, p53+/-マウスの膀胱より採取された組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色した結果を示す写真である。図中の矢印は、筋層への浸潤がんを示している。 図2は、BBN投与4週の時点でのコントロールのUtx+/+マウスおよびUtxΔ/Δマウスの尿路上皮から抽出されたRNAを用いたトランスクリプトーム解析およびKEGGによるパスウェイ解析の結果を示す図である。図2Aは、コントロールマウスとUtxΔ/Δマウスのパスウェイ比較結果の図であり、コントロールマウスと比べてUtxΔ/Δマウスで発現亢進している経路を示している。図2Bは、コントロールマウスとUtxΔ/Δマウスの”Cytokine-cytokine receptor interaction”経路の142遺伝子の発現比較結果を示している。 図3Aは、マウス膀胱がん細胞株MBT2に由来するUtx発現株（EV clones）およびUtx欠損株（KO clones）におけるUTX蛋白質の発現を、抗UTX抗体または抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図3Bは、腫瘍移植マウスにおけるプロパゲルマニウム（Propagermanium）および/またはMR16-1の投与スケジュールを示す図である。図3CおよびDは、C3HマウスにUtx発現株（C）またはUtx欠損株（D）を移植した結果として生じた腫瘍の腫瘍体積（Estimated tumor volume）および腫瘍重量（Tumor weight）を示す図である。
本発明の非限定的な一局面として、IL-6活性及びCCR2/CCL2活性を共に抑制することを特徴とする、泌尿器がんの治療剤または予防剤（泌尿器がんの治療または予防用の医薬組成物とも表現される）および併用療法が提供される。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、膀胱がん、前立腺がん、腎臓がん、又は陰茎がんである。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現が低下したがん、又はKDM6Aの機能が低下したがんであり、任意で、KDM6A遺伝子に変異（例えば、機能欠失型変異）を有するがんである。当該局面の一態様において、泌尿器がんは、p53に変異を有する泌尿器がんである。当該局面の一態様において、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤を併用することによって、IL-6阻害剤又はCCR2阻害剤単独による処置と比べて、泌尿器がんの治療または予防において相乗的な効果を得られる。
前記局面の一態様において、IL-6阻害剤を有効成分として含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様において、IL-6阻害剤を含有する泌尿器がんの治療剤または予防剤は、CCR2阻害剤と同時に、別々に、または、順次に投与される。これらの阻害剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。当該態様は、CCR2阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療または予防において用いるための、IL-6阻害剤；IL-6阻害剤を投与する工程およびCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又はCCR2阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、IL-6阻害剤の使用と表現することできる。
前記局面の別の態様において、CCR2阻害剤を有効成分として含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様において、CCR2阻害剤を含有する泌尿器がんの治療剤または予防剤は、IL-6阻害剤と同時に、別々に、または、順次に投与される。これらの阻害剤の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。当該態様は、IL-6阻害剤と組み合わせて泌尿器がんの治療または予防において用いるための、CCR2阻害剤；個体に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又はIL-6阻害剤と組み合わせて投与するための泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、CCR2阻害剤の使用と表現することできる。
前記局面の他の態様において、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを有効成分として含有する、泌尿器がんの治療剤または予防剤が提供される。当該態様は、泌尿器がんの治療または予防において用いるための、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせ；個体に有効量のIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法；又は泌尿器がんの治療剤または予防剤の製造における、IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせの使用と表現することもできる。
本発明における「ＩＬ－６阻害剤」とは、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断し、ＩＬ－６の生物学的活性を阻害する物質である。ＩＬ－６阻害剤は、好ましくはＩＬ－６、ＩＬ－６受容体及びgp130のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
本発明のＩＬ－６阻害剤としては、例えば抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗gp130抗体、ＩＬ－６改変体、可溶性ＩＬ－６受容体改変体あるいはＩＬ－６又はＩＬ－６受容体の部分ペプチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＩＬ－６阻害剤としては、好ましくはＩＬ－６受容体を認識する抗体を挙げることが出来る。
ＩＬ－６は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、ＩＬ－６が結合する分子量約８０ｋＤのリガンド結合性蛋白質のＩＬ－６受容体である（非特許文献４、５）。ＩＬ－６受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性ＩＬ－６受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約１３０ｋＤの膜蛋白質ｇｐ１３０である。ＩＬ－６とＩＬ－６受容体はＩＬ－６／ＩＬ－６受容体複合体を形成し、次いでｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ－６の生物学的活性が細胞内に伝達される（Ｔａｇａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８９）５８，５７３－５８１）。
本発明における「ＣＣＲ２阻害剤」とは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７又はＣＣＬ８によるシグナル伝達を遮断し、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７及び／又はＣＣＬ８の生物学的活性を阻害する物質であり、ＣＣＬ２阻害剤、ＣＣＬ７阻害剤およびＣＣＬ８阻害剤を含む。本発明における「ＣＣＬ２阻害剤」とは、ＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断し、ＣＣＬ２の生物活性を遮断する物質である。
本発明のＣＣＬ２阻害剤としては、例えば抗ＣＣＬ２抗体、ＣＣＬ２の受容体であるＣＣＲ２に対する抗体（抗ＣＣＲ２抗体）、ＣＣＲ２に結合しＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断する低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＣＣＬ２阻害剤としては、好ましくは抗ＣＣＬ２抗体、ＣＣＲ２に結合しＣＣＬ２によるシグナル伝達を遮断する低分子物質（例えばプロパゲルマニウム）を挙げることが出来る。
ＣＣＬ２は、自然免疫及びＴｈ２エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化等に関するケモカインであり、ＣＣ－ケモカインリガンド２、単球走化性タンパク質１、ＭＣＰ－１とも称される(Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) p.801-840)。ＣＣＬ２は、ケモカイン受容体ＣＣＲ２を介して結合しシグナル伝達することが知られている。ＣＣＲ２は、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び好塩基球を含む数多くの細胞に発現する、７回膜貫通領域Ｇタンパク質共役受容体である。
本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
本発明で使用される抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、抗ＣＣＬ２抗体および抗ＣＣＲ２抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６受容体抗体、抗ｇｐ１３０抗体、抗ＣＣＬ２抗体および抗ＣＣＲ２抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。このような抗ＩＬ－６抗体はＩＬ－６と結合することにより、ＩＬ－６のＩＬ－６受容体への結合を阻害してＩＬ－６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗ＩＬ－６抗体としては、MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18,951-956)やSK2抗体（Sato, K. et al., 第21回 日本免疫学会総会、学術記録(1991)21, 1 66）等が挙げられる。以下に、本発明で使用される各種抗体の例として抗ＩＬ－６抗体の作製方法等を記載するが、他の抗体も基本的には同様の手法及び公知技術を使用して（抗CCL2抗体については、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号の記載を参照することによっても）作製することができる。
抗ＩＬ－６抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＩＬ－６を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＩＬ－６抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＩＬ－６は、Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550 、J. Immunol.(1988)140, 1534-1541 、あるいはAgr. Biol. Chem.(1990)54, 2685-2688に開示されたＩＬ－６遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
ＩＬ－６の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＩＬ－６蛋白質を公知の方法で精製し、この精製ＩＬ－６蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、ＩＬ－６蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗IL-6受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。この抗体はIL-6受容体と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928)、PM-1抗体 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906）、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体あるいはAUK146-15抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒトIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはPM-1抗体が例示され、またマウスIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはMR16-1抗体が挙げられる。
抗IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL-6受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトIL-6受容体は、欧州特許出願公開番号EP 325474に、マウスIL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平3-155795に開示されたIL-6受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性IL-6受容体）（Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676）との二種類がある。可溶性IL-6受容体は細胞膜に結合しているIL-6受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型IL-6受容体と異なっている。IL-6受容体蛋白質は、本発明で用いられる抗IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのIL-6受容体を使用してもよい。
IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のIL-6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、この精製IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6受容体を発現している細胞やIL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗gp130抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗gp130抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマによって産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主によって産生されるものがある。この抗体はgp130と結合することにより、ＩＬ－６／ＩＬ－６受容体複合体のgp130への結合を阻害してＩＬ－６の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、AM64抗体（特開平3-219894）、4B11抗体および2H4抗体（US5571513）B-S12抗体およびB-P8抗体（特開平8-291199）などが挙げられる。
抗gp130モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、gp130を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるgp130は、欧州特許出願公開番号EP 411946に開示されたgp130遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
gp130の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のgp130蛋白質を公知の方法で精製し、この精製gp130蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、gp130を発現している細胞やgp130蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4～21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415 ）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 ）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1～10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000～6000程度のPEG溶液を通常、30～60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平3-139293に開示された方法により行うことができる。PM-1抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からPM-1抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ウシ胎児血清、5％BM-Condimed H1（Boehringer Mannheim製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM培地（GIBCO-BRL製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清からPM-1抗体を精製する方法で行うことができる。
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全RNA を調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシ法により確認する。
目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγが挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用される抗IL-6受容体抗体のヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化PM-1抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388を参考にすることができる。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40)等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114) 、また、HEF1αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322 ）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546；Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 ）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994)24, 131-138）。
上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515 、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663 、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又はH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又はL鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG)等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μｇ/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG(TAG製）100μｌを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製)100μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用されるＩＬ－６改変体は、ＩＬ－６受容体との結合活性を有し、且つＩＬ－６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ－６改変体はＩＬ－６受容体に対しＩＬ－６と競合的に結合するが、ＩＬ－６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ－６改変体は、ＩＬ－６のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。ＩＬ－６改変体のもととなるＩＬ－６はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトＩＬ－６である。
具体的には、ＩＬ－６のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、WHATIF（Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 ）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトＩＬ－６遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるPCR法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、ＩＬ－６改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてＩＬ－６改変体を得ることができる。
ＩＬ－６改変体の具体例としては、Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269,86-93 、及びSavino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367 、WO 96-18648 、WO96-17869に開示されている。
本発明で使用されるＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、各々ＩＬ－６受容体あるいはＩＬ－６との結合活性を有し、且つＩＬ－６の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドはＩＬ－６受容体又はＩＬ－６に結合し、これらを捕捉することによりＩＬ－６のＩＬ－６受容体への結合を特異的に阻害する。その結果、ＩＬ－６の生物学的活性を伝達しないため、ＩＬ－６によるシグナル伝達を遮断する。
ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体のアミノ酸配列においてＩＬ－６とＩＬ－６受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０～８０、好ましくは２０～５０、より好ましくは２０～４０個のアミノ酸残基からなる。
ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドは、ＩＬ－６又はＩＬ－６受容体のアミノ酸配列において、ＩＬ－６とＩＬ－６受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
ＩＬ－６部分ペプチド又はＩＬ－６受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、「続医薬品の開発 第１４巻 ペプチド合成（監修：矢島治明、廣川書店、1991年）」に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのC末端に対応するアミノ酸を結合させ、α-アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をC末端からN末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα-アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりBoc法とFmoc法に大別される。
このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Boc法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Fmoc法ではTFAを通常用いることができる。Boc法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Fmoc法では、例えばTFA中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
得られた粗ペプチドは、HPLCに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
ＩＬ－６部分ペプチド及びＩＬ－６受容体部分ペプチドの具体例は、特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及び米国特許公報US5210075に開示されている。
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
また、本発明における「抗体」には、翻訳後修飾を受けたものが含まれる。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
本発明における「抗IL-6受容体抗体」の好ましい例としては、ヒト化抗IL-6レセプターＩｇＧ１抗体であるトシリズマブ、トシリズマブの可変領域及び定常領域の改変を行ったヒト化抗IL-6レセプター抗体、及びトシリズマブと同じエピトープに結合する抗体があげられる。
具体的には配列番号：１の重鎖可変領域（トシリズマブの重鎖可変領域）および配列番号：２の軽鎖可変領域（トシリズマブの軽鎖可変領域）を含む抗体、ならびに配列番号：５の重鎖可変領域（ＳＡ２３７の重鎖可変領域）及び配列番号：６の軽鎖可変領域（ＳＡ２３７の軽鎖可変領域）を含む抗体があげられる。
更に具体的には、配列番号：３の重鎖（トシリズマブの重鎖）及び配列番号：４の軽鎖（トシリズマブの軽鎖）を含む抗体、ならびに配列番号：７の重鎖（ＳＡ２３７の重鎖）及び配列番号：８の軽鎖（ＳＡ２３７の軽鎖）を含む抗体が挙げられる。
このような抗体は、例えばＷＯ２０１０／０３５７６９、ＷＯ２０１０／１０７１０８、ＷＯ２０１０／１０６８１２などに記載の方法に従って取得することができる。具体的には、上記抗IL-6受容体抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて抗体を作製することが可能である（例えば、Borrebaeck CAK and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させて得ることができる。
このような抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を５０％以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を５０％以上阻止する。具体的には、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上阻止する抗体のことをいう。
別の局面において、IL-6受容体への結合に関してトシリズマブと競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体は、トシリズマブによって結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする、詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイにおいて、固定化されたIL-6受容体は、IL-6受容体に結合する第1の標識された抗体（例えば、トシリズマブ）およびIL-6受容体への結合に関して第1の抗体と競合する能力に関して試験される第2の未標識の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。対照として、固定化されたIL-6受容体が、第1の標識された抗体を含むが第2の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。第1の抗体のIL-6受容体に対する結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、余分な未結合の抗体が除去され、固定化されたIL-6受容体に結合した標識の量が測定される。固定化されたIL-6受容体に結合した標識の量が対照サンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に減少している場合、それは第2の抗体がIL-6受容体への結合に関して第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) を参照のこと。
本発明における「抗CCL2抗体」の例としては、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号に記載の抗体が挙げられるが、それらに限定されない。より具体的な例としては、ABN912及びCNTO888(carlumab)があげられる。これらの抗体は、日本国特許第９０６７３９９号、日本国特許公開平０５２７６９８６号、ＷＯ０３０４８０８３号、ＵＳ２００４００４７８６０号、ＵＳ２００６００３９９１３号、ＷＯ２００６／１２５２０２号に記載の方法に従って、任意に公知技術を使用することにより作製することができる。
CCR2阻害剤が低分子物質の場合、当該物質の例としては、プロパゲルマニウム（３－オキシゲルミルプロピオン酸ポリマー）、ＩＮＣＢ３３４４、ＲＳ－５０４３９３、又はＷＯ２００６／１８７３９３に記載のものがあげられるが、これらに限定されない。
本発明の治療剤または予防剤は、必要に応じて、適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して調製し、凍結乾燥製剤又は溶液製剤とすることができる。適当な薬学的に許容される担体、媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤(アスコルビン酸等)、緩衝剤（リン酸、クエン酸、ヒスチジン、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（PEG、Tween等）、キレート剤（EDTA等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポロキサマー188、HCO-50）等と併用してもよい。また、製剤中にヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）を混合することによって、より大きな液量を皮下投与することも可能である（Expert Opin Drug Deliv. 2007 Jul;4(4):427-40.）。また、本発明の医薬組成物は予め注射筒に入れられていてもよい。尚、溶液製剤はWO2011/090088に記載の方法に従って作製することができる。
また、必要に応じ本発明の治療剤または予防剤をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の治療剤または予防剤に適用し得る（Langer et al., J.Biomed. Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP第133,988号）。
本発明の治療剤または予防剤は、有効成分として低分子物質を含む場合、適当な薬学的に許容される担体等と混和して調製し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤とすることもできる。
薬学的に許容される担体等の例としては、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖類；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンなどのデンプン類；セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、メチルセルロースなどの誘導体；トラガカントガム粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸やステアリン酸マグネシウムなどの固形潤滑剤；硫酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、植物油、カカオ油などの植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどの多価アルコール；アルギン酸；TWEENのような乳化剤；レシチンのような湿潤剤；着色剤；香料；錠剤化剤(tableting agent)；安定剤；坑酸化剤；防腐剤；パイロジェンフリー水；等張塩水溶液；及びリン酸緩衝液などがあげられるが、これらに限定されない。
本発明の治療剤または予防剤の投与は、任意の適切な経路を介して患者に投与することができる。例えば、ボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注入による静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、皮内、関節内、舌下、滑液内、経口、吸入、局所または外用による経路により患者に投与される。
投与量としては、例えば、1回につき体重1 kgあたり活性成分が0.0001 mg～100 mgの範囲で選ぶことが可能である。または、例えば、ヒト患者に投与する場合、患者あたり活性成分が0.001～1000 mg/kg・body・weightの範囲を選ぶことができる。抗体を有効成分とするIL-6阻害剤又はCCR2阻害剤であれば、1回当たり投与量としては、例えば0.01～50mg/kg・body・weight程度の量が含まれることが好ましい。
併用療法及び医薬組成物
本発明における非限定の一態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の有効量を投与することを含む、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤またはCCR2阻害剤の単独療法と比較して、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する効果が高い。別の実施態様において、本発明の併用療法は、細胞増殖を抑制する、腫瘍重量を抑制する、腫瘍体積を抑制する、がんを治療する、またはがんを予防する相乗効果または相加効果を有する。
いくつかの実施態様において、本発明における「有効量」は、個体における疾患（本発明においては特に泌尿器がん）を治療または予防するために有効なIL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤の用量を意味する。例えば、IL-6阻害剤が抗体の場合、一回の投与につき体重1 kgあたり例えば0.0001 mgから1000 mg、好ましくは0.001mgから100mg、更に好ましくは0.01～50mgの範囲の用量で、例えば１～１０週間毎に、好ましくは1～８週間毎に、更に好ましくは１～４週間毎に１回投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。また、CCR2阻害剤が抗CCL2抗体の場合、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mg、好ましくは0.001mg～100mg、更に好ましくは0.01～50mgの範囲の用量で、例えば1～１０週間毎に、好ましくは１～８週間毎に、更に好ましくは１～４週間毎に１回投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。また、CCR2阻害剤がCCR2に結合しCCL2のシグナルを遮断する低分子物質の場合、一回の投与につき、例えば1日あたり体重1kgあたり0.01mgから40mgの範囲で、好ましくは１日あたり体重1kgあたり0.25mgから10mgの範囲で毎日投与することがあげられる。CCR2阻害剤がプロパゲルマニウムの場合、例えば1日あたり20-40mgの範囲で、好ましくは1日あたり30mgで、例えば2-4回に分けて、好ましくは3回に分けて投与することがあげられるが、これらに制限されるものではない。
本発明における前記泌尿器がんは特に限定されないが、好ましくは膀胱がんである。
いくつかの実施態様において、本発明における「治療」は、本発明の併用療法によって、個体の泌尿器における腫瘍増大が抑制されること、がん細胞数が減少すること、がん細胞の増殖が抑制されること、腫瘍体積が減少すること、腫瘍重量が減少すること、がん細胞の転移を抑制すること、またはがんに起因する様々な症状が改善されることを意味する。また、いくつかの実施態様において、本発明における「予防」は、減少したがん細胞が再度増殖することによるがん細胞数の増加を防止すること、増殖が抑制されたがん細胞の再増殖を防止すること、減少した腫瘍のサイズが再度増大することを防止すること、または局所治療により肉眼的に消失した（または治癒した）がんが再度肉眼的に出現することを予防すること、を意味する。
いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤を使用することにより、CCR2阻害剤によるがんの治療または予防に際して、当該CCR2阻害剤の治療または予防効果を増強する方法を提供する。別の実施態様において、本発明の併用療法は、CCR2阻害剤を使用することにより、IL-6阻害剤によるがんの治療または予防に際して、当該IL-6阻害剤の治療または予防効果を増強する方法を提供する。ここで、治療または予防効果の増強とは、例えば、治療の奏功率が上昇すること、治療のために投与されるIL-6阻害剤またはCCR2阻害剤の量が低減すること、および／または、IL-6阻害剤またはCCR2阻害剤による治療期間が短くなることをいうが、これらに限定されない。別の実施態様においては、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の有効量を投与することを含む、個体において無増悪生存期間を増加させる方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明の併用療法は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の投与を含む。IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤は、当技術分野で公知の任意の適切な方法で投与することができる。例えば、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を、並行して（すなわち同時に）または連続して（すなわち異なる時点で）投与することができる。いくつかの実施態様において、該IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を連続して（すなわち異なる時点で）投与する場合、該IL-6阻害剤とCCR2阻害剤の投与間隔は特に限定されず、投与経路や剤型等の要因が考慮されて設定され得る。例えば、０時間～１６８時間であり、好ましくは０時間～７２時間であり、また好ましくは０～２４時間であり、さらに好ましくは０時間～１２時間であるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤は同時投与される。いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤は間欠的に（すなわち断続的に）投与される。いくつかの実施態様では、IL-6阻害剤は、CCR2阻害剤の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、IL-6阻害剤は、CCR2阻害剤の投与後に投与される。
いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は間欠的に（すなわち断続的に）投与される。いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は、IL-6阻害剤の投与前に投与される。いくつかの実施態様では、CCR2阻害剤は、IL-6阻害剤の投与後に投与される。
いくつかの実施態様において、公知または本明細書に記載のIL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が、本発明の併用療法に使用され得る。
いくつかの実施態様においては、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤の併用療法に加えて、さらに追加療法を行うことができる。いくつかの実施態様において、本発明の併用療法に追加する療法には、追加のIL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤の投与を含んでもよい。
本発明の非限定の一態様として、本発明は、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含有する、細胞増殖抑制剤（細胞増殖阻害剤）、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量の抑制剤、がん治療剤またはがん予防剤（以下、本発明の医薬組成物と総称する）を提供する。いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、本発明の併用療法に用いられ得る。いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が併用されることにより、これらの単独療法と比較して、細胞増殖を抑制する、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量を抑制する、またはがんを治療もしくは予防する効果が高い。別の実施態様において、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が併用されることにより、細胞増殖を抑制する、がん細胞もしくはがん細胞を含む腫瘍組織の体積または重量を抑制する、またはがんを治療もしくは予防する相乗効果または相加効果を有する。
いくつかの実施態様において、本発明におけるIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含有する」医薬組成物とは、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤を、疾患（本発明においては特に泌尿器がん）の治療または予防において同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせた医薬組成物を意味する。例えば、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤およびCCR2阻害剤が共に含有される配合剤の形で提供することができる。また、例えば、本発明の医薬組成物は、IL-6阻害剤を含有する薬剤とCCR2阻害剤を含有する薬剤とが別々に提供され、これらの薬剤が、同時に、または順次に使用されてもよい。前記泌尿器がんは特に限定されないが、好ましくは膀胱がんである。
いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤を有効成分として含む、CCR2阻害剤と併用するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、CCR2阻害剤を有効成分として含む、IL-6阻害剤と併用するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤をCCR2阻害剤と組み合わせることにより、CCR2阻害剤によるがんの治療に際して、当該CCR2阻害剤の治療効果を増強するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、CCR2阻害剤をIL-6阻害剤と組み合わせることにより、がんの治療に際して、当該IL-6阻害剤の治療効果を増強するための医薬組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、IL-6阻害剤および／またはCCR2阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を製造するためのIL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤の使用を提供する。
なお、本発明において、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤を有効成分として含むとは、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤を主要な活性成分として含むという意味であって、IL-6阻害剤および／またはそのCCR2阻害剤の含有率を制限するものではない。
KDM6Aは、ヒストン修飾蛋白質であり、その遺伝子はX染色体上に位置する。KDM6AはJmjCドメインを介してトリ・ジメチル化されたヒストンH3の27番目のリジン残基（H3K27）の脱メチル化を促進すると共に、TPR (tetratricopeptide repeat)と呼ばれる蛋白質相互作用ドメインを介してヒストンメチル化酵素であるMLL3 (mixed lineage leukemia 3, KMT2C) またはMLL4 (mixed lineage leukemia 4, KMT2D)と結合し、蛋白質複合体であるCOMPASS (complex of proteins associated with Set1)-like complexの構成要素としてヒストンH3の4番目のリジン残基（H3K4）のメチル化に関与することが知られている。H3K27メチル化は転写抑制のヒストンマーク、H3K4メチル化は転写促進のヒストンマークであり、KDM6Aは上記の機能を介して標的遺伝子の転写活性化を促進すると考えられる。
前記局面の一態様において、本発明は、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、泌尿器がんの治療用または予防用の医薬組成物（泌尿器がんの治療剤又は予防剤）であって、個体（例えば、泌尿器がん患者）から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価し、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記医薬組成物による治療または予防に対する応答者として選択し、当該選択された個体に投与するための、前記医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、泌尿器がんの治療または予防における使用のためのIL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせであって、個体（例えば、泌尿器がん患者）から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価し、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択し、当該選択された個体に投与するための、IL-6阻害剤、CCR2阻害剤、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを提供する。
他の態様において、本発明は、個体（例えば、泌尿器がん患者）に有効量のIL-6阻害剤を投与する工程および個体に有効量のCCR2阻害剤を投与する工程を含むか、またはIL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを投与する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法であって、個体から得られた生物試料におけるKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）の有無を評価する工程、およびKDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、及び/又はKDM6A遺伝子の変異（好ましくは機能欠失型変異）を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択する工程を含む、泌尿器がんを治療または予防する方法を提供する。前記評価する工程および選択する工程は、好ましくは前記投与する工程の前に実施される。
これらの態様において、個体におけるp53の発現の低下、p53の機能の低下、及び/又はp53の変異の有無を評価し、p53の発現の低下、p53の機能の低下、及び/又はp53の変異を有する個体を前記治療または予防に対する応答者として選択してもよい。p53の変異の有無を評価する方法は当技術分野において公知である。
本発明において、KDM6Aの機能の低下、KDM6Aの発現の低下、KDM6A遺伝子の変異、及びKDM6A遺伝子の機能欠失型変異は、例えば、泌尿器がんの患者から採取した試料をKDM6Aに対する抗体を使用して免疫染色することにより、又は患者から採取した試料についてウエスタンブロット法又はエクソンシークエンス法を実施することにより、確認することができる。
例えば、KDM6Aに対する抗体を使用した免疫染色の結果、KDM6A陽性コントロール（例えばKDM6Aの機能が低下していない、KDM6Aの発現が低下していない、KDM6A遺伝子の変異を有さない、KDM6A遺伝子の機能欠失型変異を有さない患者から採取した生物試料）と比較して、KDM6A蛋白質の発現が顕著に低下している場合、KDM6Aの機能が低下している、KDM6Aの発現が低下している、KDM6A遺伝子が変異を有する、又はKDM6A遺伝子が機能欠失型変異を有すると判定することができる。
本発明において、KDM6Aの機能の低下には、KDM6A機能の欠失、KDM6Aの不活化が含まれる。
本発明において、KDM6Aの発現の低下には、KDM6A蛋白質の発現が顕著に低下すること、KDM6A蛋白質が発現しないことが含まれる。
本発明において、KDM6A遺伝子の変異には、KDM6A遺伝子の機能欠失型変異が含まれる。具体的な変異としては、ナンセンス変異、フレームシフト変異、スプライス変異、欠失などが挙げられる。

p53遺伝子は、DNA修復や細胞周期の制御、アポトーシスなどの誘導などの機能を有するがん抑制遺伝子の一つで、p53遺伝子変異は多様ながんにおいて認められている。変異型p53 蛋白は半減期が長く，細胞内に蓄積するため，血清中にp53 抗体が出現する（Lowe SW, Bodis S, McClatchey A et al：p 53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo. Science 266：807―810, 1994）．このため血清中p53 抗体をELIZA法で測定することは，p53 遺伝子変異を伴ったがんの発見に有用と考えられており（Shimada H, Ochiai T, Nomura F et al：Titration of serum p 53 antibodies in 1085 patients with
various types of malignant tumors. Cancer 97：682―689, 2003），2007 年11 月から食道がん，大腸がんおよび乳がんにおける腫瘍マーカー検査として保険適応が認められている。
本発明において、p53の機能の低下には、p53の機能の欠失、p53の不活化が含まれる。
本発明において、p53の発現の低下には、p53蛋白質の発現が顕著に低下すること、p53蛋白質の発現が検出されないことが含まれる。
本発明において、p53遺伝子の変異の具体的な変異としては、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、欠失などがあげられる。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
膀胱がんにおけるUTX(KDM6A)欠失の関与を検討する目的で、膀胱上皮特異的にUTXを欠失したマウス（UtxΔ/Δ）を作製し、解析を行った。UtxΔ/Δマウスの膀胱上皮ではUtxの欠失が確認されたが、長期間の観察で膀胱に腫瘍発症は認めず、UTXの単独欠損は膀胱がん発症には十分ではないと考えられた。
膀胱がんで最も高頻度に変異を認める遺伝子はp53であり、Utx欠失とp53変異は高率に合併することが知られている（The Cancer Genome Atlas Research Network, Nature 2014, vol. 507, p.315-322）。そこで、UtxΔ/Δマウスをp53ヘテロマウスと交配し、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスを作製した。興味あることに、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスは長期間の観察の結果上皮内がん（carcinoma in situ, CIS）の発症が認められ、Utx欠失はp53変異と協調して膀胱がん発症に関与していることが示された。
さらに、膀胱がん発症には喫煙等の変異源への暴露が発症に重要と考えられているため、マウスに実験的膀胱がん誘発物質であるN-butyl-N-(4-hydro-oxybutyl) nitorosamine（BBN）の投与を行なった。その結果、投与から10週でコントロールのUtx+/+, p53+/-マウスは約60%に異形成～上皮内がん（Dysplasia～CIS）を認めたのに対し、UtxΔ/Δ, p53+/-マウスは100%異形成～上皮内がんを発症しており（図1A）、さらに一部は筋層への浸潤がん（Muscle invasive cancer）へと進行していた（図1B）。これらの結果は、Utx欠失とp53変異は膀胱がん感受性を亢進させ、変異源と協調して進行がんへと進展することを示している。我々のマウスは、ヒト膀胱腫瘍を遺伝子変異の蓄積および環境変異源の影響の見地から作製した、初めてのin vivoモデルと考えられる。
膀胱がん発症におけるUTX欠失の関与について解析する目的で、我々はBBN投与4週の時点でコントロールのUtx+/+マウスおよびUtxΔ/Δマウスの膀胱から尿路上皮を採取し、RNAを抽出してトランスクリプトーム解析およびKEGG によるパスウェイ解析を行った。その結果、UtxΔ/Δマウスの膀胱上皮で最も亢進している経路は”Cytokine-cytokine receptor interaction”であり（図2A；太枠）、その他”MAPK pathway”および”JAK-STAT pathway”の亢進が認められた。これらの結果は、UTX欠失により膀胱上皮においてサイトカイン経路が活性化し、その結果MAPKやJAK-STATなどの細胞内情報伝達系が活性化していることを示している。さらに、”Cytokine-cytokine receptor interaction”経路で発現亢進している遺伝子を調べたところ、最も発現が高いのはケモカインCCL2であり、次にサイトカインIL6であることが判明した（図2B；太字）。
そこでこれらのサイトカイン・ケモカインの機能を抑制することにより、膀胱がんの進展が抑制できるかどうかを検討する治療モデル実験を行なった。MBT2はC3Hというマウスラインから確立された膀胱がん腫瘍株である。そこで我々はMBT2にempty vector (EV)およびUtx knockout (KO) vectorを導入することにより、Utx発現株（EV clones）とUtx欠損株（KO clones）を作成した（図3A）。このクローンを同系のC3Hマウスに移植し、7日生着期間を設けて、その後にvehicleのみ、Propagermanium（CCL2の受容体CCR2の阻害剤、0.005%濃度となるよう餌に混ぜて連日投与）のみ、MR16-1（マウスIL6受容体に対する中和抗体、1匹あたり100μgを週3回腹腔内注射）のみ、およびPropagermanium とMR16-1の併用（Combination）による治療を行なった。
その結果、図3Cに示す様に、Utx発現株を移植した結果生じたEV tumorではいずれの治療法もvehicleのみに比較して有意な治療効果を認めなかったのに対し、図3Dに示す様にUtx欠損株を移植した結果生じたKO tumorに対しては、Propagermanium とMR16-1の併用（Combination）療法が有意に腫瘍重量を抑制することが明らかとなった。
これらの結果は、Utx欠損膀胱がんに対して、CCL2/CCR2活性とIL6活性を共に抑制することにより腫瘍増大を有意に抑制できることを示している。
Utxの膀胱がん発症における関与を示した論文としては、Utx変異を有するヒト膀胱がん細胞株を用いた免疫不全マウスへの移植実験モデルが報告されているが（Deer Lee et al. Sci Trans Med 2017）、これは培養細胞を用いて異種移植を行った結果であり、生体内でのUtx機能欠失を反映したモデルとは言い難い。これまで、膀胱がんに着目して遺伝子改変の手法を用いて膀胱特異的Utx欠損（UtxΔ/Δ）マウスを作製し解析を行った研究は報告されておらず、本発明に関する研究とその手法は独自のものと考えられる。
本発明は、泌尿器がん、特にlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の機能が低下した泌尿器がんに対する新たな治療剤を提供するものである。

Claims (8)

  1. IL-6阻害剤を含有する、CCR2阻害剤と組み合わせて投与するためのlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下した泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤であって、前記IL-6阻害剤が抗IL-6受容体抗体であり、前記CCR2阻害剤がプロパゲルマニウムである、治療剤及び／または予防剤。
  2. CCR2阻害剤を含有する、IL-6阻害剤と組み合わせて投与するためのlysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下した泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤であって、前記IL-6阻害剤が抗IL-6受容体抗体であり、前記CCR2阻害剤がプロパゲルマニウムである、治療剤及び／または予防剤。
  3. IL-6阻害剤とCCR2阻害剤との組み合わせを含む、lysine (K)-specific demethylase 6A (KDM6A)の発現または機能が低下した泌尿器がんの治療剤及び／または予防剤であって、前記IL-6阻害剤が抗IL-6受容体抗体であり、前記CCR2阻害剤がプロパゲルマニウムである、治療剤及び／または予防剤。
  4. 前記抗IL-6受容体抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  5. 前記がんが、KDM6A遺伝子に変異を有するがんである、請求項１～４のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  6. 前記KDM6A遺伝子の変異が機能欠失型変異である、請求項５に記載の治療剤及び／または予防剤。
  7. 前記がんが、p53の発現または機能が低下したがんである、請求項１～６のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
  8. 前記がんが、p53遺伝子に変異を有するがんである、請求項１～７のいずれかに記載の治療剤及び／または予防剤。
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