JPH01100199A - 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法 - Google Patents
顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法Info
- Publication number
- JPH01100199A JPH01100199A JP62256012A JP25601287A JPH01100199A JP H01100199 A JPH01100199 A JP H01100199A JP 62256012 A JP62256012 A JP 62256012A JP 25601287 A JP25601287 A JP 25601287A JP H01100199 A JPH01100199 A JP H01100199A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- granulocyte
- macrophage colony
- stimulating factor
- colony stimulating
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産 上のｉ
本発明は顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（以
下、ＣＭ−Ｃ３Ｆと略称する）の濃縮方法に関するもの
である。更に詳細にはＧＭ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ
配列により形質転換された大腸菌の産生ずる不活性型Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆを可溶化、還元、酸化することにより活性化
した活性型顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子を
濃縮し、さらに精製を進める過程において、イオン交換
高速液体クロマトグラフィーを用いることにより夾雑物
である非イオン性界面活性剤、酸化剤、還元剤およびキ
レート剤を除去すると同時に顆粒球・マクロファージコ
ロニー刺激因子を濃縮する方法に関するものである。
下、ＣＭ−Ｃ３Ｆと略称する）の濃縮方法に関するもの
である。更に詳細にはＧＭ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ
配列により形質転換された大腸菌の産生ずる不活性型Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆを可溶化、還元、酸化することにより活性化
した活性型顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子を
濃縮し、さらに精製を進める過程において、イオン交換
高速液体クロマトグラフィーを用いることにより夾雑物
である非イオン性界面活性剤、酸化剤、還元剤およびキ
レート剤を除去すると同時に顆粒球・マクロファージコ
ロニー刺激因子を濃縮する方法に関するものである。
来 ′および。 占
ＧＭ−Ｃ３Ｆは骨髄を刺激して、感染防御・免 ・疫な
どに重要な役割を果たす顆粒球・マクロファージなど白
血球の分化・増殖を促進するサイト力インの一種である
（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ ＨｅｍａｔｏｌｏｇＶ＋ ＩＬ
３２９−４８（１９８４） ； Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｗ、、 ２５２．１９９８−２００３（１９７７）
；５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２８．８１０−１５（１９８
５）） 。
どに重要な役割を果たす顆粒球・マクロファージなど白
血球の分化・増殖を促進するサイト力インの一種である
（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ ＨｅｍａｔｏｌｏｇＶ＋ ＩＬ
３２９−４８（１９８４） ； Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｗ、、 ２５２．１９９８−２００３（１９７７）
；５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２８．８１０−１５（１９８
５）） 。
ＧＭ−Ｃ３Ｆは白血球減少症や感染症の予防薬あるいは
治療薬として、また、骨Ｕ□移植後の白血球回復促進剤
などとして用い得るが、生体内には極めて微量にしか存
在しないため、遺伝子の組換え技術を用いて大腸菌によ
り、大量に生産できる技術が確立された。この場合、産
生タンパク質は不活性な不溶性の凝集体として得られる
ため、精製にあたりこの凝集体に還元剤および可溶化剤
を添加して可溶化し、次いで適切な条件の下で還元剤お
よび可溶化剤を希釈あるいは除去したのち酸化すること
によりＧＭ−Ｃ３Ｆを活性体にする操作が加えられる。
治療薬として、また、骨Ｕ□移植後の白血球回復促進剤
などとして用い得るが、生体内には極めて微量にしか存
在しないため、遺伝子の組換え技術を用いて大腸菌によ
り、大量に生産できる技術が確立された。この場合、産
生タンパク質は不活性な不溶性の凝集体として得られる
ため、精製にあたりこの凝集体に還元剤および可溶化剤
を添加して可溶化し、次いで適切な条件の下で還元剤お
よび可溶化剤を希釈あるいは除去したのち酸化すること
によりＧＭ−Ｃ３Ｆを活性体にする操作が加えられる。
活性化後、次の精製に進むため、ＣＭ−Ｃ３Ｆの濃縮が
必要となる。この濃縮操作には通常、限外ろ過性が行わ
れてきたが、この方法は時間がかかる上に回収率が低く
、吸着が考えられること、また１、混在するタンパク質
や界面活性剤等の除去も困難である等多くの問題を有し
ていた。
必要となる。この濃縮操作には通常、限外ろ過性が行わ
れてきたが、この方法は時間がかかる上に回収率が低く
、吸着が考えられること、また１、混在するタンパク質
や界面活性剤等の除去も困難である等多くの問題を有し
ていた。
一方、本発明者らは逆相高速液体クロマトグラフィーを
用いることにより、活性化したＣＭ−Ｃ５Ｆを濃縮、精
製できることを見出したが、非イオン性界面活性剤、酸
化剤、還元剤およびキレート剤等の夾雑物が含まれる場
合、逆相クロマトグラフィーでは上記夾、９１！物を除
去できないという問題があった。
用いることにより、活性化したＣＭ−Ｃ５Ｆを濃縮、精
製できることを見出したが、非イオン性界面活性剤、酸
化剤、還元剤およびキレート剤等の夾雑物が含まれる場
合、逆相クロマトグラフィーでは上記夾、９１！物を除
去できないという問題があった。
間 解゛の手段
上記の事情に鑑み、鋭意研究を進めた結果、イオン交換
高速液体クロマトグラフィーを用いることにより濃縮が
短時間で回収率も高く、大量かつ簡便に処理が可能であ
り、同時に活性化したＧＭ−Ｃ３Ｆ溶液に含まれる非イ
オン性界面活性剤、酸化剤、還元剤およびキレート剤等
の夾雑物の除去が可能であることを見出し、本発明を完
成した。
高速液体クロマトグラフィーを用いることにより濃縮が
短時間で回収率も高く、大量かつ簡便に処理が可能であ
り、同時に活性化したＧＭ−Ｃ３Ｆ溶液に含まれる非イ
オン性界面活性剤、酸化剤、還元剤およびキレート剤等
の夾雑物の除去が可能であることを見出し、本発明を完
成した。
本発明によれば、例えば組換え大腸菌によって生産され
るＧ Ｍ −ＣＳ Ｆ （Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ
） ２８１ 。
るＧ Ｍ −ＣＳ Ｆ （Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ
） ２８１ 。
５４４（１９７９） 、Ｇｅｎｅ ３９．２４７（１９
８５））の公知の方法により取得されるＧＭ−Ｃ３Ｆを
効率よく濃縮できる。不溶性の凝集体として宿主内に蓄
積されたＧＭ−Ｃ３Ｆを適当な手段を用いて菌体を破砕
して、遠心分離゛によって不溶性の凝集体をとり出す。
８５））の公知の方法により取得されるＧＭ−Ｃ３Ｆを
効率よく濃縮できる。不溶性の凝集体として宿主内に蓄
積されたＧＭ−Ｃ３Ｆを適当な手段を用いて菌体を破砕
して、遠心分離゛によって不溶性の凝集体をとり出す。
この凝集体を適当な可溶化剤（例えば高濃度のグアニジ
ン塩酸または尿素）および、分子内および分子間に存在
すると思われるジスルフィド結合を切断するための還元
剤（例えばジチオスレイトール）を用いて、ＧＭ−Ｃ３
Ｆを還元体として可溶化したのち、ゲルろ過クロマトグ
ラフィーなどの手段によって一次精製を行う、これらの
操作において、凝集体をとり出す段階でＣ，Ｍ−Ｃ３Ｆ
に夾雑している宿主由来のタンパク質や抜酸、また、細
、脂膜成分などのうち可溶性成分を除き、更に、ゲルろ
過クロマトグラフィー等によって、ＧＭ−ＣＳＦと分子
量の異なる夾雑成分を除く。このようにして得られたＧ
Ｍ −ＣＳ Ｆの還元体は適当な酸化還元系（例えば
、グルタチオンまたはシスティンの酸化剤および還元型
の混合物）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン
ドデシルエーテルまたはポリエチレングリコール６００
０）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）を
有する溶液中で２組のジスルフィド結合を形成させ、Ｃ
Ｍ−Ｃ３Ｆを活性化する。得られた活性型ＧＭ−Ｃ３Ｆ
溶液には一次精製によって除き得なかった宿主由来物質
の他、上記の酸化還元剤、界面活性剤、キレート剤等の
夾雑物が存在する。そこで、本発明により、イオン交換
高速液体クロマトグラフィーを用いて該夾雑物を除去す
ると同時にＧＭ−Ｃ３Ｆを濃縮する。
ン塩酸または尿素）および、分子内および分子間に存在
すると思われるジスルフィド結合を切断するための還元
剤（例えばジチオスレイトール）を用いて、ＧＭ−Ｃ３
Ｆを還元体として可溶化したのち、ゲルろ過クロマトグ
ラフィーなどの手段によって一次精製を行う、これらの
操作において、凝集体をとり出す段階でＣ，Ｍ−Ｃ３Ｆ
に夾雑している宿主由来のタンパク質や抜酸、また、細
、脂膜成分などのうち可溶性成分を除き、更に、ゲルろ
過クロマトグラフィー等によって、ＧＭ−ＣＳＦと分子
量の異なる夾雑成分を除く。このようにして得られたＧ
Ｍ −ＣＳ Ｆの還元体は適当な酸化還元系（例えば
、グルタチオンまたはシスティンの酸化剤および還元型
の混合物）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン
ドデシルエーテルまたはポリエチレングリコール６００
０）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸）を
有する溶液中で２組のジスルフィド結合を形成させ、Ｃ
Ｍ−Ｃ３Ｆを活性化する。得られた活性型ＧＭ−Ｃ３Ｆ
溶液には一次精製によって除き得なかった宿主由来物質
の他、上記の酸化還元剤、界面活性剤、キレート剤等の
夾雑物が存在する。そこで、本発明により、イオン交換
高速液体クロマトグラフィーを用いて該夾雑物を除去す
ると同時にＧＭ−Ｃ３Ｆを濃縮する。
本発明の方法において、充填剤としては通常のイオン交
換ＨＰ Ｌ Ｃ用の化学結合型充填剤が用いられ、例え
ば平均粒子径５μｍまたは１０μｍのポリアクリレート
などのポーラスポリマー樹脂またはシリカゲルにジエチ
ルアミノエチル基、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピ
ル）アミノエチル基、カルボキシメチル基、スルホプロ
ピル基などのイオン交換基又はオクタデシル基、オクチ
ル基などのアルキル基を化学的に結合させたイオン交換
用充填剤が使用される。
換ＨＰ Ｌ Ｃ用の化学結合型充填剤が用いられ、例え
ば平均粒子径５μｍまたは１０μｍのポリアクリレート
などのポーラスポリマー樹脂またはシリカゲルにジエチ
ルアミノエチル基、ジエチル−（２−ヒドロキシプロピ
ル）アミノエチル基、カルボキシメチル基、スルホプロ
ピル基などのイオン交換基又はオクタデシル基、オクチ
ル基などのアルキル基を化学的に結合させたイオン交換
用充填剤が使用される。
このような充填剤としては例えばＴＳＫ−ｇｅｌ ＤＥ
ＡＥ−５ＷＰ （東洋曹達製） 、ＴＳＫ−ｇｅｌ ５
Ｐ−５ＰＷ （東洋曹達製）などが挙げられる。
ＡＥ−５ＷＰ （東洋曹達製） 、ＴＳＫ−ｇｅｌ ５
Ｐ−５ＰＷ （東洋曹達製）などが挙げられる。
本発明の方法において用いるカラムのサイズは通常内径
４．６〜５０ｍ５．長さ１５０〜３００ｍａ＋程度のも
のが用いられ、試料の負荷量、得るべき純度などの目的
によって充填剤との適当な組合せが選ばれる。
４．６〜５０ｍ５．長さ１５０〜３００ｍａ＋程度のも
のが用いられ、試料の負荷量、得るべき純度などの目的
によって充填剤との適当な組合せが選ばれる。
本発明の方法において溶出はグラジェント溶出法により
行われる。例えば、緩衝液に低濃度の塩添加し、ＧＭ−
Ｃ３Ｆが溶離しないようなｐＨ条件でカラムを平衡化し
ておき、ＧＭ−Ｃ３Ｆの希薄な水溶液試料をＨＰＬＣ用
ポンプまたはその他のポンプを用いてカラム人口に注入
し、ＣＭ−Ｃ５Ｆを吸着した後、塩の初期濃度から連続
的あるいは段階的に塩濃度を高めていくグラジェント溶
出法によって溶出を行う。本発明の方法において、移動
相に用いる緩衝液は例えばｐＨ６〜Ｂ 、０．０１〜０
．２モル濃度のトリス−塩酸またはリン酸塩緩衝液が好
ましい。ま′た、カラムの初期平衡化およびグラジェン
ト溶出法は塩濃度を変化させることによって行うが、用
いる塩としては例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、塩化ナトリウムなどが好ましく、それらの濃度は０
〜２Ｍの範囲が望ましい。
行われる。例えば、緩衝液に低濃度の塩添加し、ＧＭ−
Ｃ３Ｆが溶離しないようなｐＨ条件でカラムを平衡化し
ておき、ＧＭ−Ｃ３Ｆの希薄な水溶液試料をＨＰＬＣ用
ポンプまたはその他のポンプを用いてカラム人口に注入
し、ＣＭ−Ｃ５Ｆを吸着した後、塩の初期濃度から連続
的あるいは段階的に塩濃度を高めていくグラジェント溶
出法によって溶出を行う。本発明の方法において、移動
相に用いる緩衝液は例えばｐＨ６〜Ｂ 、０．０１〜０
．２モル濃度のトリス−塩酸またはリン酸塩緩衝液が好
ましい。ま′た、カラムの初期平衡化およびグラジェン
ト溶出法は塩濃度を変化させることによって行うが、用
いる塩としては例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、塩化ナトリウムなどが好ましく、それらの濃度は０
〜２Ｍの範囲が望ましい。
本発明の方法における移動相の流速は用いるカラムのサ
イズによつても異なるが、毎分１〜５０ａｄ程度、カラ
ム温度は室温（２５°Ｃ）付近の一定温度およびカラム
によって分離され、溶出してきたＧＭ−Ｃ３Ｆを検出す
るための紫外線検出器の波長は２１０〜２３０ｎＩ１１
または２８Ｏｎｍ付近の一定波長が好ましい。また、−
回に処理できる試料量は用いるカラムのサイズによって
も異なるが、ＧＭ−Ｃ３Ｆの量として１〜１０００ｍｇ
、溶液量として１０〜２０００戚の範囲のものが望まし
い。
イズによつても異なるが、毎分１〜５０ａｄ程度、カラ
ム温度は室温（２５°Ｃ）付近の一定温度およびカラム
によって分離され、溶出してきたＧＭ−Ｃ３Ｆを検出す
るための紫外線検出器の波長は２１０〜２３０ｎＩ１１
または２８Ｏｎｍ付近の一定波長が好ましい。また、−
回に処理できる試料量は用いるカラムのサイズによって
も異なるが、ＧＭ−Ｃ３Ｆの量として１〜１０００ｍｇ
、溶液量として１０〜２０００戚の範囲のものが望まし
い。
以下、実施例によって本発明の具体的内容を説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１」虻１＝
ヒト白血病細胞Ｕ９３７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）
由来のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有するプラスミドｐ２１
０”およびｐｃ１８５７によって形質転換された大腸菌
に一１２株由来の５Ｇ９３６株により発現されたＧＭ−
ＣＳＦ凝集体を超音波破砕、遠心分離、可溶化、ゲルろ
過クロマトグラフィーおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの再生の各操
作を行うて得られた濃度０．００４６５χ（Ｗ／Ｗ）、
純度４１．４％（Ｗ／Ｉｎ） 、ＧＭ−Ｃ３Ｆとして１
７．８ｍｇを含む再生溶液３８３ ＩＲｌについて、ポ
リアクリレートのポーラスポリマー樹脂にジエチルアミ
ノエチル基を導入したイオン交換カラムを用い、以下に
示した条件で濃縮を行った。
由来のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有するプラスミドｐ２１
０”およびｐｃ１８５７によって形質転換された大腸菌
に一１２株由来の５Ｇ９３６株により発現されたＧＭ−
ＣＳＦ凝集体を超音波破砕、遠心分離、可溶化、ゲルろ
過クロマトグラフィーおよびＧＭ−Ｃ３Ｆの再生の各操
作を行うて得られた濃度０．００４６５χ（Ｗ／Ｗ）、
純度４１．４％（Ｗ／Ｉｎ） 、ＧＭ−Ｃ３Ｆとして１
７．８ｍｇを含む再生溶液３８３ ＩＲｌについて、ポ
リアクリレートのポーラスポリマー樹脂にジエチルアミ
ノエチル基を導入したイオン交換カラムを用い、以下に
示した条件で濃縮を行った。
本方法により回収率９２．６％で濃度０．０２９４χ（
−八）、純度７５．０％（−ハ）の水溶液５６Ｈ１に濃
縮することができた。
−八）、純度７５．０％（−ハ）の水溶液５６Ｈ１に濃
縮することができた。
濃縮条件（１）を以下に示す。
カラム：ポリアクリレート型ポーラスポリマー樹脂にジ
エチルアミノエチル基を導入 したＨＰＬＣ用イオン交換樹脂（東洋 曹達製ＴＳＫ−ｇｅｔ ＤＥＡＥ−５ＰＷ、粒子径１０
μｍ、孔径１１００ｎ ）を内径２１．５＋＋ｓ＋、長
さ１５０ｍｍのステンレス管に充填したもの移動相：Ａ
液 ２０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）Ｂ液
２０ｎ＋Ｍ ）リス−塩酸緩衝液に０．５Ｍの塩化ナ
トリウムを加えた液（ｐＨＬ３）グラジェント条件二Ｂ
液を５％で１０分間流した後、Ｂ液を４５％まで６０分
間 で直線的に増加させる。
エチルアミノエチル基を導入 したＨＰＬＣ用イオン交換樹脂（東洋 曹達製ＴＳＫ−ｇｅｔ ＤＥＡＥ−５ＰＷ、粒子径１０
μｍ、孔径１１００ｎ ）を内径２１．５＋＋ｓ＋、長
さ１５０ｍｍのステンレス管に充填したもの移動相：Ａ
液 ２０ｍＭ ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）Ｂ液
２０ｎ＋Ｍ ）リス−塩酸緩衝液に０．５Ｍの塩化ナ
トリウムを加えた液（ｐＨＬ３）グラジェント条件二Ｂ
液を５％で１０分間流した後、Ｂ液を４５％まで６０分
間 で直線的に増加させる。
流 量 ：８．０ｒＩ１１／ｗｉｎ
カラム温度：室温
検出器：紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ ）試料添
加：送液ポンプにより、８．０ｍ７’ｓｉｎでカラムに
添加した。
加：送液ポンプにより、８．０ｍ７’ｓｉｎでカラムに
添加した。
ＧＭ−Ｃ３Ｆ再生液のクロマトグラムおよび濃縮後のク
ロマトグラムを第１図および第２図に示す。
ロマトグラムを第１図および第２図に示す。
なお、溶液中のＧＭ−ＣＳＦ！ｌｔは以下に示すＨＰＬ
Ｃ条件でＧＭ−Ｃ５Ｆを基準品とした絶対検量法で定量
した。ＧＭ−Ｃ３Ｆの分析条件を以下に示す。
Ｃ条件でＧＭ−Ｃ５Ｆを基準品とした絶対検量法で定量
した。ＧＭ−Ｃ３Ｆの分析条件を以下に示す。
カラム：オクタデシル化したＨＰＬＣ用シリカゲル（Ｃ
ｏｓｍｏｓＨ５Ｃ＋ｓ半井牛丼製、球状、粒子径５μｍ
１孔径１２ｎｗ ）を内径４．６ｍ＋ｍ 、長さ２５０
ｍｍのステンレス管に充填したもの。
ｏｓｍｏｓＨ５Ｃ＋ｓ半井牛丼製、球状、粒子径５μｍ
１孔径１２ｎｗ ）を内径４．６ｍ＋ｍ 、長さ２５０
ｍｍのステンレス管に充填したもの。
移動相：Ｂ液 ２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に５
ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを加えた液（ｐ
Ｈ７，０） グラジェント条件＝Ｂ液を６０％から７６％まで１６分
間で直線的に増加させた あと、さらにＢ液を８６％ま で５０分間で直線的に増加さ せる。
ｍＭのテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを加えた液（ｐ
Ｈ７，０） グラジェント条件＝Ｂ液を６０％から７６％まで１６分
間で直線的に増加させた あと、さらにＢ液を８６％ま で５０分間で直線的に増加さ せる。
流 １ ： １．Ｏｄ／＋ｗｉｎカラム温度：室
温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２３０ｎｍ ）上笠且 実施例１と同様にして得られた濃度０．０ＩＸ（Ｗ／Ｗ
）、純度４６．１％（賀／Ｗ） 、ＧＭ−Ｃ３Ｆとして
１９．０ｍｇを含む再生水溶液１９０ｄについて以下に
示した条件で限外ろ過により濃縮を行った。
温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２３０ｎｍ ）上笠且 実施例１と同様にして得られた濃度０．０ＩＸ（Ｗ／Ｗ
）、純度４６．１％（賀／Ｗ） 、ＧＭ−Ｃ３Ｆとして
１９．０ｍｇを含む再生水溶液１９０ｄについて以下に
示した条件で限外ろ過により濃縮を行った。
本方法により回収率７８．７％で濃度０．０６５χ（Ｗ
／Ｗ）、純度５４．４％（Ｗ／Ｗ）の水溶液２３ｍに濃
縮された。
／Ｗ）、純度５４．４％（Ｗ／Ｗ）の水溶液２３ｍに濃
縮された。
濃縮条件（３）を以下に示す。
限外ろ過器：撹拌式セルでセル容量１８０ｄ、有効ろ過
面積２８．７ｄのもの（アミコ ン株式会社製、８２００型）。
面積２８．７ｄのもの（アミコ ン株式会社製、８２００型）。
限外ろ過膜：ポリサッカライド材質で分画分子量１０，
０００のもの（アミコン株式会社製、ＹＭＩｏ、 ６２
ｍｍ） ろ 過 圧：窒素、３ ｋｇ ／ ｃｒＭろ過温度 ２
４°Ｃ
０００のもの（アミコン株式会社製、ＹＭＩｏ、 ６２
ｍｍ） ろ 過 圧：窒素、３ ｋｇ ／ ｃｒＭろ過温度 ２
４°Ｃ
第１図は実施例１のｉ４縮前の再生液の高速液体クロマ
トグラムを示す。 第２図は実施例１の濃縮後の高速液体クロマトグラムを
示す。 第１図 保持時間（分） 第２１１ 保持時間（分） 手 続 補 正 書 （自 発）昭和６２
年１１月１３日 昭和６２年特許願第２５６０１２号 ２、発明の名称 顆粒球・マクロファージコロニー刺激 因子の濃縮方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 代表者 森 英 雄 連絡先 Ｔ Ｅ Ｌ （０６） ２２０−３４０４５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１） 明細書第４頁第５行目の「短時間で」の後に
ｒ済み、」を挿入する。 （２） 同第５頁第１１行目に「酸化剤」とあるを「
酸化型」と訂正する。 （３） 同第６頁第１０〜１１行目に「又はオクタデ
シル基、オクチル基などのアルキル基」とあるを削除す
る。 （４） 同第７頁第２行目の「塩」の後に「を」を挿
入する。 （５） 同第７頁第７行目に「吸着した」とあるを「
吸着させた」と訂正する。 （６） 同第７頁最下行から第８頁第１行目に「−定
温度およびカラムによって分離され、」とあるを「一定
温度、またカラムによって分離され」と訂正する。 （７） 同第８真下より第２行目、第９頁第５行目、
第１１頁第１０行目および第１１真第１４行目に「純度
」とあるをそれぞれ「蛋白純度」と訂正する。 以 上 −〇４
トグラムを示す。 第２図は実施例１の濃縮後の高速液体クロマトグラムを
示す。 第１図 保持時間（分） 第２１１ 保持時間（分） 手 続 補 正 書 （自 発）昭和６２
年１１月１３日 昭和６２年特許願第２５６０１２号 ２、発明の名称 顆粒球・マクロファージコロニー刺激 因子の濃縮方法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市東区北浜５丁目１５番地 （２０９）住友化学工業株式会社 代表者 森 英 雄 連絡先 Ｔ Ｅ Ｌ （０６） ２２０−３４０４５、
補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１） 明細書第４頁第５行目の「短時間で」の後に
ｒ済み、」を挿入する。 （２） 同第５頁第１１行目に「酸化剤」とあるを「
酸化型」と訂正する。 （３） 同第６頁第１０〜１１行目に「又はオクタデ
シル基、オクチル基などのアルキル基」とあるを削除す
る。 （４） 同第７頁第２行目の「塩」の後に「を」を挿
入する。 （５） 同第７頁第７行目に「吸着した」とあるを「
吸着させた」と訂正する。 （６） 同第７頁最下行から第８頁第１行目に「−定
温度およびカラムによって分離され、」とあるを「一定
温度、またカラムによって分離され」と訂正する。 （７） 同第８真下より第２行目、第９頁第５行目、
第１１頁第１０行目および第１１真第１４行目に「純度
」とあるをそれぞれ「蛋白純度」と訂正する。 以 上 −〇４
Claims (1)
- 組換え大腸菌由来の不活性型顆粒球・マクロファージコ
ロニー刺激因子を還元・可溶化し、さらに酸化すること
により活性化した活性型顆粒球・マクロファージコロニ
ー刺激因子を濃縮し、精製を行う方法において、イオン
交換高速液体クロマトグラフィーを用いて夾雑物である
非イオン性界面活性剤、酸化剤、還元剤およびキレート
剤を除去し、同時に顆粒球・マクロファージコロニー刺
激因子を濃縮する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62256012A JPH01100199A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62256012A JPH01100199A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01100199A true JPH01100199A (ja) | 1989-04-18 |
Family
ID=17286683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62256012A Pending JPH01100199A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01100199A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112526028A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-19 | 南京明捷生物医药检测有限公司 | 一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法 |
-
1987
- 1987-10-09 JP JP62256012A patent/JPH01100199A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112526028A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-19 | 南京明捷生物医药检测有限公司 | 一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法 |
| CN112526028B (zh) * | 2020-12-11 | 2022-05-10 | 上海明捷医药科技有限公司 | 一种测定蛋白溶液中二硫苏糖醇含量的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1571208B1 (en) | Novel factor IX purification methods | |
| EP1329461B1 (en) | Method of eliminating human serum albumin polymers | |
| EP0646594B1 (en) | Protein purification method | |
| EA035448B1 (ru) | СПОСОБ ОЧИСТКИ рчГ-КСФ | |
| JPS63503352A (ja) | タンパク質の精製 | |
| JP2005525304A (ja) | 生物学的に活性な顆粒球コロニー刺激因子の精製および／または単離方法 | |
| US4617378A (en) | Purification of biologically active human immune interferon | |
| JP2005336193A (ja) | 精製方法 | |
| JPH02234692A (ja) | ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する蛋白質の精製法 | |
| US6310186B1 (en) | Purification of biological preparations | |
| JPH01100199A (ja) | 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の濃縮方法 | |
| CN115894663A (zh) | 一种重组人白细胞介素-2纯化方法 | |
| JP2020517657A (ja) | アルブミン融合タンパク質の精製方法 | |
| JPWO1992014832A1 (ja) | ヒトｂｃｄｆの精製法 | |
| JPH11335395A (ja) | 精製ヒトアクチビン及びその製造方法 | |
| JPH022390A (ja) | 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 | |
| JP2012112930A (ja) | 高分子量物質の精製方法 | |
| JP2001139600A (ja) | Ｉｌ−６ｒ・ｉｌ−６融合蛋白質の精製方法 | |
| JPS59225195A (ja) | インタ−ロイキン２の精製法 | |
| JPH01100198A (ja) | 顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子の精製法 | |
| JPH0471488A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の精製法 | |
| Paulsen et al. | Membrane and adsorption processes in the purification of the human pancreatic secretory trypsin inhibitor (hPSTI) | |
| JPH0471487A (ja) | ウロキナーゼ前駆体の精製方法 | |
| JP2008520220A (ja) | 組換え型ヒトｘｉｉｉ因子の精製 | |
| HK1055596A (en) | Method of eliminating human serum albumin polymers |