JPH0728729B2 - 動物細胞の培養方法 - Google Patents
動物細胞の培養方法Info
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- JPH0728729B2 JPH0728729B2 JP61022125A JP2212586A JPH0728729B2 JP H0728729 B2 JPH0728729 B2 JP H0728729B2 JP 61022125 A JP61022125 A JP 61022125A JP 2212586 A JP2212586 A JP 2212586A JP H0728729 B2 JPH0728729 B2 JP H0728729B2
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- Japan
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- culture
- culturing
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- animal cells
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Description
【発明の詳細な説明】 （ａ） 産業上の利用分野 本発明は動物細胞の培養方法に関するものである。更に
詳しくは、有用物質を産生する動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。
詳しくは、有用物質を産生する動物細胞を、高密度で培
養する方法に関するものである。
（ｂ） 従来技術 大規模による細胞大量培養は、例えばウイルス，ワクチ
ン，インターフェロンなどの抗ウイルス剤、あるいはホ
ルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に近年特
定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生
産は、抗体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマ
大量培養によるものであり、その技術の解決は工業的に
重要なテーマである。
ン，インターフェロンなどの抗ウイルス剤、あるいはホ
ルモンなどの生物薬品の製造に必須である。殊に近年特
定タンパク質などを標的とするモノクローナル抗体の生
産は、抗体産生細胞とミエローマによるハイブリドーマ
大量培養によるものであり、その技術の解決は工業的に
重要なテーマである。
従来、細胞の大量培養法及びそのための装置としていく
つかの提案がなされている。しかし、これらの方法で
は、特に無血清培地での培養において工業的に十分なほ
ど高密度には増殖していない。
つかの提案がなされている。しかし、これらの方法で
は、特に無血清培地での培養において工業的に十分なほ
ど高密度には増殖していない。
（ｃ） 発明の目的 そこで、本発明者らは従来、サスペンジョン培養におい
て106〜５×106 cells/ml程度にしか増殖できなかった
方法を、更に大量且つ高密度で増殖させることを目的と
して研究を進めた結果、本発明に到達した。
て106〜５×106 cells/ml程度にしか増殖できなかった
方法を、更に大量且つ高密度で増殖させることを目的と
して研究を進めた結果、本発明に到達した。
（ｄ） 発明の構成及び効果 すなわち、本発明は、動物細胞を培養槽中にて、サスペ
ンジョン状態で且つ、新しい培養液を該培養槽中へ供給
すると共に、古い培養液を該培養槽外へ排出して、高密
度で培養する方法において、該培養を無血清培地を用
い、且つサスペンジョン培養液中にポリビニルピロリド
ンを存在せしめて行うことを特徴とする動物細胞の培養
方法である。
ンジョン状態で且つ、新しい培養液を該培養槽中へ供給
すると共に、古い培養液を該培養槽外へ排出して、高密
度で培養する方法において、該培養を無血清培地を用
い、且つサスペンジョン培養液中にポリビニルピロリド
ンを存在せしめて行うことを特徴とする動物細胞の培養
方法である。
かかる本発明により、動物細胞を効果的に増殖させるこ
とができ、また高密度で生育することが可能となる。
とができ、また高密度で生育することが可能となる。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の細胞培養方法は無血清培地を用い、且つサスペ
ンジョン状態で培養する方法に適用されるが、サスペン
ジョン状態とは、水性媒体中で細胞それ自他が浮遊しな
がら、或いは細胞を微小担体（マイクロキャリアー）に
担持して浮遊しながらまたマイクロカプセル中で細胞が
生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊に本発明
は、細胞自体を浮遊させながら培養する方式に有利に用
いられる。
ンジョン状態で培養する方法に適用されるが、サスペン
ジョン状態とは、水性媒体中で細胞それ自他が浮遊しな
がら、或いは細胞を微小担体（マイクロキャリアー）に
担持して浮遊しながらまたマイクロカプセル中で細胞が
生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊に本発明
は、細胞自体を浮遊させながら培養する方式に有利に用
いられる。
本発明の培養方法において、培養する動物細胞として
は、サスペンジョン状態にて増殖可能なものであればよ
く、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝子操
作により変性された細胞例えばハイブリドーマであって
もよい。
は、サスペンジョン状態にて増殖可能なものであればよ
く、天然の動物細胞のみならず、人為的或いは遺伝子操
作により変性された細胞例えばハイブリドーマであって
もよい。
また細胞としてIL−２−の如きリンホカインを産生する
リンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロン
（IFN）の如き有用な生理活性物質を産生する２倍体細
胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗体を
産生する細胞であってもよく、本発明はかかるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの培養に対してモ
ノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のために特に適
している。
リンパ球由来の細胞であってもよく、インターフェロン
（IFN）の如き有用な生理活性物質を産生する２倍体細
胞であってもよい。さらに種々のモノクローナル抗体を
産生する細胞であってもよく、本発明はかかるモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマの培養に対してモ
ノクローナル抗体を高い濃度で得る目的のために特に適
している。
本発明における細胞培養は、パーヒュージョン方式で行
われる。ここで、パーヒュージョン方式とは、一般に新
しい培養液を培養槽中へ供給しつつ、生育阻害物質を含
んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式
である。この方式を用いて培養するに当って重要なこと
の１つは、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養
液とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出
し、培養槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持する
ことである。また、ここでサスペンジョン液中から分離
され、培養層外へ取り出された古い培養液は、膜による
分離法、或いは吸着による分離法などにより、その中に
含まれる生育阻害物質を除去し、更に必要により産生さ
れた有用物質を分画された後、培養に必要な添加成分を
新たに加えることにより、新しい培養液として再使用す
ることができる。
われる。ここで、パーヒュージョン方式とは、一般に新
しい培養液を培養槽中へ供給しつつ、生育阻害物質を含
んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式
である。この方式を用いて培養するに当って重要なこと
の１つは、サスペンジョン液中の生細胞と前記古い培養
液とを効率よく分離し、古い培養液を培養槽外へ取り出
し、培養槽内の細胞の生育環境を最適条件下に維持する
ことである。また、ここでサスペンジョン液中から分離
され、培養層外へ取り出された古い培養液は、膜による
分離法、或いは吸着による分離法などにより、その中に
含まれる生育阻害物質を除去し、更に必要により産生さ
れた有用物質を分画された後、培養に必要な添加成分を
新たに加えることにより、新しい培養液として再使用す
ることができる。
本発明におけるサスペンジョン状態の細胞培養において
培養槽中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は所謂無血清培地
であり、実質的に水よりなる水性媒体に、種々の無機
塩，ビタミン類，捕酵素，ブドウ等，アミノ酸，抗生物
質などの通常細胞培養に使用される添加成分、無血清培
地に一般に用いられる増殖因子、及びポリビニルピロリ
ドンが加えられている。また、培養液には血清アルブモ
ンやポリグリコールなどの添加物もポリビニルピロリド
ンと共に加えることができる。
培養槽中においては、培養しようとする細胞が培養液中
に浮遊した状態で培養される。培養液は所謂無血清培地
であり、実質的に水よりなる水性媒体に、種々の無機
塩，ビタミン類，捕酵素，ブドウ等，アミノ酸，抗生物
質などの通常細胞培養に使用される添加成分、無血清培
地に一般に用いられる増殖因子、及びポリビニルピロリ
ドンが加えられている。また、培養液には血清アルブモ
ンやポリグリコールなどの添加物もポリビニルピロリド
ンと共に加えることができる。
ここで、ポリビニルピロリドンとは、下記式（Ｉ） の繰り返し単位より成る化合物であり、ポリビニルピロ
リドンは、これらの単位が100〜6,000個繰返されたもの
が使用される。本発明で用いられるポリビルピロリドン
は水に可溶であり、その分子量は、10,000〜700,000、
好ましくは40,000〜400,000である。サスペンジョン液
中への添加量は、0.1〜10g/、好ましくは0.5〜5g/
加えるのが有利である。
リドンは、これらの単位が100〜6,000個繰返されたもの
が使用される。本発明で用いられるポリビルピロリドン
は水に可溶であり、その分子量は、10,000〜700,000、
好ましくは40,000〜400,000である。サスペンジョン液
中への添加量は、0.1〜10g/、好ましくは0.5〜5g/
加えるのが有利である。
本発明の培養方法において、サスペンジョン液中の酸素
濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法とし
ては、サスペンジョン液中へ酸素または酸素含有ガスを
直接供給してもよい。また他の供給手段によってもよい
が、本発明においては特に、サスペンジョン液中への酸
素または酸素含有ガスの直接供給に有効である。他の供
給手段としては、例えば酸素キャリアーを用いる方法が
ある。
濃度を一定に維持するために、酸素を供給する方法とし
ては、サスペンジョン液中へ酸素または酸素含有ガスを
直接供給してもよい。また他の供給手段によってもよい
が、本発明においては特に、サスペンジョン液中への酸
素または酸素含有ガスの直接供給に有効である。他の供
給手段としては、例えば酸素キャリアーを用いる方法が
ある。
酸素キャリアーとしては、水と実質的に混合しないで酸
素を溶解し得る液状の化合物が使用され、その例として
は、人工血液の素材として使用されるような種々のフル
オロカーボンが挙げられる。かようなフルオロカーボン
を酸素供給手段として使用する場合には、酸素を溶解さ
せたフルオロカーボンをサスペンジョン液中の上部から
液滴状または薄膜状で添加すればよい。
素を溶解し得る液状の化合物が使用され、その例として
は、人工血液の素材として使用されるような種々のフル
オロカーボンが挙げられる。かようなフルオロカーボン
を酸素供給手段として使用する場合には、酸素を溶解さ
せたフルオロカーボンをサスペンジョン液中の上部から
液滴状または薄膜状で添加すればよい。
かくして、本発明方法によれば、パーヒュージョン方式
におけるサスペンジョン培養において、生細胞率が上が
り、106 cells/ml以上、好適条件下では５×106 cells/
ml以上の高密度で培養することが可能となる。
におけるサスペンジョン培養において、生細胞率が上が
り、106 cells/ml以上、好適条件下では５×106 cells/
ml以上の高密度で培養することが可能となる。
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。
実施例 （１） 培養装置 添付第１図に示す培養システムを使用した。培養槽は図
のように外壁に内側に隔壁によって仕切られたセトリン
グゾーンがもうけられ、その上部には培養液の排出口を
有しており、正味培養容積は約120mlである。
のように外壁に内側に隔壁によって仕切られたセトリン
グゾーンがもうけられ、その上部には培養液の排出口を
有しており、正味培養容積は約120mlである。
（２） 培養液 基礎培地として、RPMI1640培地，ハム−F12培地及びダ
ルベッコ変報イーグル培地を2:1:1で混合したものにア
ミノ酸，グルコース等をさらに増強したもの（以下、ｅ
−RDFと称する）を用い、増殖因子としてインスリン，
トランスフェリン，エタノールアミン，亜セレン酸（IT
ES）を加えた。インスリンの添加量は９μg/ml,トラン
スフェリンは10μg/ml,エタノールアミンは10μM,亜セ
レン酸は20nMであった。
ルベッコ変報イーグル培地を2:1:1で混合したものにア
ミノ酸，グルコース等をさらに増強したもの（以下、ｅ
−RDFと称する）を用い、増殖因子としてインスリン，
トランスフェリン，エタノールアミン，亜セレン酸（IT
ES）を加えた。インスリンの添加量は９μg/ml,トラン
スフェリンは10μg/ml,エタノールアミンは10μM,亜セ
レン酸は20nMであった。
（３） 培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ減菌した前記培養槽に正味培
養容積が約120mlになるような培養液ａを送入し、これ
にマウスミエローマ細胞P3U1株を親株とするマウス×ヒ
トハイブリドーマ41−２−１株を4.8×105個/mlとなる
ように播種した。この細胞はIgG産生株である。培養槽
には酸素ガス（溶存酸素が3ppmとなるように）吹込みノ
ズルＢを通して自動的にコントロールされて送入され
た。培養槽中の培養液は37℃に保持された。培養槽中に
はマリン型攪拌翼が取付けられており、攪拌速度は60rp
mであった。
養容積が約120mlになるような培養液ａを送入し、これ
にマウスミエローマ細胞P3U1株を親株とするマウス×ヒ
トハイブリドーマ41−２−１株を4.8×105個/mlとなる
ように播種した。この細胞はIgG産生株である。培養槽
には酸素ガス（溶存酸素が3ppmとなるように）吹込みノ
ズルＢを通して自動的にコントロールされて送入され
た。培養槽中の培養液は37℃に保持された。培養槽中に
はマリン型攪拌翼が取付けられており、攪拌速度は60rp
mであった。
播種後１日間は回分培養を行ない、この後パーヒュージ
ョンを開始した。パーヒュージョンの尺度は正味培養容
積の１日当りの置換率として表わし、実験結果に併記す
る。
ョンを開始した。パーヒュージョンの尺度は正味培養容
積の１日当りの置換率として表わし、実験結果に併記す
る。
以上の培養操作を13日間継続した。その結果を第１表に
示す。
示す。
比較例 培養装置は実施例と同じものを用いた。培養液はポリビ
ニルピロリドンを含まなかった以外は実施例と同様に行
った。培養は17日間継続した。その結果を第２表に示
す。
ニルピロリドンを含まなかった以外は実施例と同様に行
った。培養は17日間継続した。その結果を第２表に示
す。
添付図面は、本発明の培養方法を実施する工程の概略図
の１例を示したものである。
の１例を示したものである。
Claims (1)
- 【請求項１】動物細胞を培養槽中にて、サスペンジョン
状態で、且つ新しい培養液を該培養槽中へ供給すると共
に、古い培養液を該培養槽外へ排出して高密度で培養す
る方法において、該培養を無血清培地を用い、且つサス
ペンジョン培養液中にポリビニルピロリドンを存在せし
めて行うことを特徴とする動物細胞の培養方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61022125A JPH0728729B2 (ja) | 1986-02-05 | 1986-02-05 | 動物細胞の培養方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61022125A JPH0728729B2 (ja) | 1986-02-05 | 1986-02-05 | 動物細胞の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62181780A JPS62181780A (ja) | 1987-08-10 |
| JPH0728729B2 true JPH0728729B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=12074159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61022125A Expired - Fee Related JPH0728729B2 (ja) | 1986-02-05 | 1986-02-05 | 動物細胞の培養方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0728729B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384487A (ja) * | 1986-09-27 | 1988-04-15 | Agency Of Ind Science & Technol | リンパ系細胞増殖用組成物及び増殖方法 |
| JPH02211866A (ja) * | 1988-07-29 | 1990-08-23 | Biochem Technol Inc | 壊れやすい細胞および組織培養による生産物量を増す方法 |
-
1986
- 1986-02-05 JP JP61022125A patent/JPH0728729B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62181780A (ja) | 1987-08-10 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |