JPH01102093A - 高濃度のリボースドナーを用いるリバビリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリバビリン及び関連化合物の製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

リバビリンの分類名は１−β−Ｄ−リボフラノシルー１
．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミドである。

この種の化合物は公知の抗ウィルス剤である。この点に
ついてはジッセフ・Ｔ・ウィトコラスキ４　（Ｊｏｓｅ
ｐｈ　Ｔ、Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ）らの米国特許筒３．７
９８．２０９号（１９７４年３月１９日に登録）を参照
されたい０本明細書中では、リバビリンと称することに
するが、トリアゾールに結合したリボース基を有する関
連化合物も含まれているものと理解されたい。

リバビリンの製造方法には幾つかの方法がある。

化学的な方法（酵素を用いない化学的な方法）は費用が
かかる。高価な出発原料及び低収率により特徴づけられ
るプロセス工程が普通である。

その結果、生物変換法が広範囲にわたって研究されてき
た。これらの方法に於て、リボースをトリアゾールに結
合するのに一種以上の酵素が使用される。幾つかの場合
に於て、酵素がまず単離されついで触媒として使用され
る。この点についてはライトコウスキイらの米国特許筒
３．９７６．５４５号（１９７６年８月２４日に登録）
を参照されたい。この特許には、リボースドナーがリボ
ース−１−ホスフェートである方法が開示されている。

トリアゾールアクセプターである１、２．４−トリアゾ
ール−３−カルボキサミドとドナーとをＯ℃〜５０℃の
温度でヌクレオシドホスホリラーゼの存在下で反応させ
る。酵素源は広範に開示されている。

また、発酵を伴う方法も公知である。これらの方法に於
ては、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ−巾
）属からの微生物の如き増殖微生物を含む培地にり、２
．４−）リアゾール−３−カルボキサミドを添加する。

この場合に於て、必要なリボースドナーは、微生物が成
長するのに伴って、発酵培地から生じる。微生物が成長
するので、温度は比較的に低い。典型的な温度は２０℃
〜４０℃である。

反応時間は極めて長く、典型的には何日もかかる。

ヤマナカ（Ｙａｍａｎａｋａ）らの米国特許筒４．４５
８．０１６号（１９８４年７月３日に登録）には、温度
が５５℃〜６５℃であること以外は上記の米国特許筒３
．９７６、５４５号の方法に極めて類似する方法が記載
されている。

単離された酵素ではなく、むしろ必要な活性を含む全細
胞を使用し得る。特別な物質が使用されるこの特許明細
書の比較結果によれば、生成されるリバビリンの量が７
０℃では極めて少なく７５℃〜８０℃ではと（わずかで
ある（第７欄の第３表を参照のこと）。この試験に使用
された微生物は肝炎杆菌（Ｘｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｎ
ｅｕｍｉｎｉａｅ）であり、リボースドナーはリボース
−１−ホスフェートまたはウリジンであった。

フジシマ（Ｆｕｊ　１ｓｈｉｓ＋ａ）　らの米国特許筒
４，６１４，７１９号（１９８６年９月３０日に登録）
には、上記の米国特許筒４．４５８．０１６号に類似す
る方法が開示されている。米国特許筒４．６１４，７１
９号に於て、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔ　−■μ徂）微生
物が非増殖性条件下に使用される。この開示によれば多
種のリボースドナーが使用でき、温度は４０℃〜８０℃
であってもよい。しかしながら、実施例に於てイノシン
がドナーとして主として使用され温度は通常６０℃であ
る。実施例２に於て、種々のドナーが６０℃でブレビバ
クテリウム・アセチリカムを用いて試験され、実施例４
に於て７０℃までの種々の温度がその微生物及びドナー
としてのイノシンを用いて試験されている。リバビリン
の収率は６５℃〜７０℃の間で劇的に減少する。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許筒４，４５８．０１６号及び同第４．６１４．
７１９号の生物変換法は、従来の化学的な方法、及び酵
素を使用前に単離しなければならなかった方法よりも多
くの利点をもたらす、しかしながら、更に改良すること
が要望されていた０例えば、これらの方法によるリバビ
リンの生成速度は所望の速度よりも遅い、米国特許筒４
．６１４．７１９号の実施例に於て、典型的な反応時間
は２０時間または２４時間であり、リバビリンの生成量
は比較的少ない。

（記載されたデータに基づけば、せいぜい約１０ｇ／ｌ
であると計算される）、か（して、収率（％）〔実際に
は下記の転化率（％）〕はこれらの方法に於て許容し得
るかもしれないが、これらの方法の生産性は所望される
生産性よりも劣る。

更に、リバビリンは希薄溶液中にのみ生成されるので、
その回収は所望される費用よりも費用がかかる。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に従って、ブレビバクテリウム・アセチリカム（
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕ
ｓ）から誘導された酵素調製物の存在下に、リボースド
ナーとトリアゾール化合物とを反応させる工程を含む１
゜２．４−）リアゾールヌクレオシドの改良された製造
方法が提供される。本発明はリボースドナーがグアノシ
ンまたはグアノシン誘導体であり、ドナーの濃度が約１
００ミリモル以上であり、酵素調型物を反応混合物のゲ
ル化前に添加することを特徴とする。

典型的な方法に於て、酵素調製物は反応混合物から分離
され廃棄される。本発明者は、有意な量の所望の生成物
が酵素調製物と混在することを知見した。本発明の好ま
しい態様に於て、酵素調製物は反応混合物から分離され
、ついで追加の生成物を回収するために洗浄される。

上記の方法の更に別の改良によれば、リボースドナーと
トリアゾールとを反応の進行中に添加する追加の工程が
ある。この方法は極めて高濃度のりバビリン及び関連化
合物を製造し得る。

〔作　用〕

反応混合物中のリバビリンの最終濃度は本性を実施する
全費用の重要な構成要素である。濃厚溶液からの回収は
希薄溶液からの回収よりも安価であるので、高濃度は一
層良好な経済性をもたらす。

本発明方法を用いて、好ましい態様に於て１００ｇ／ｌ
程度の極めて高濃度のりバビリンを容易に得ることがで
きる。

本発明の好ましい態様に従って、方法の少なくとも一部
中で温度は６５℃以上であるべきである。

この限度よりも高い温度を使用し得るが、実際問題とし
て温度が高くなるにつれて生成速度は高いままであると
しても転化率は減少する。それ故、約７０℃の温度が好
ましい。

リボースドナーはグアノシンである。これは市販されて
おり、ＲＮＡ例えば酵母ＲＮＡの加水分解産物中に見ら
れる。また、グアニル酸の如きグアノシンの誘導体も使
用し得る。

触媒活性源として使用される微生物はブレビバクテリウ
ム・アセチリカムである。この種のいずれの菌株も使用
し得る。ザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手できるＡＴＣ
Ｃ３９３１１として同定されており、上記の米国特許第
４．６１４．７１９号に記載されている菌株が好ましい
。

微生物は、本明細書の実施例の直前の調製例１に記載さ
れた方法の如き通常の発酵方決により調製し得る。微生
物の試料を好適な栄養物質と共に発酵槽中に接種し定常
期まで成長させる。得られる培養液を触媒物質として直
接使用し得る。また、細胞をろ過または遠心分離により
培養液から除去して細胞ペーストとして使用し得る。細
胞を、それらの透過性を増すように処理してもよい。こ
の目的には、凍結融解の如き処理や米国特許第４．６１
４，７１９号に記載されているその他の処理が有効であ
る。

本発明に従えば、ブレビバクテリウム・アセチリカムか
ら誘導されるいずれの酵素調製物も有用である。これは
上記の調製物を含み、またこの微生物のヌクレオシドホ
スホリラーゼ活性に応答性であるブレビバクテリウム・
アセチリカムから単離された一種以上の遺伝子を形質発
現する微生物からのいずれの調製物も含む。

また開始ｐＨは広く変化してもよ（、約６．０〜約９．
２の範囲であってもよい０反応中にｐＨを制御すること
は重要ではないが、ｐＨ制御は望ましい、リバビリン製
造の最適ｐＨは約７．２である。

本発明に従って、出発原料の濃度は類似の方法に通常見
られる濃度よりも高い０例えば、グアノシンは１００ミ
リモル〜２００ミリモルの量で存在し、一方トリアゾー
ルは１００ミリモル〜２００ミリモルの量で存在する。

これに対して、上記の米国特許第４．６１４．７１９号
のドナーの最高濃度は約５０ミリモルである。

本発明者は、ドナーのグアノシンを用いる反応混合物が
比較的高い温度でグアノシンの高濃度でゲル化する傾向
にあることを見出した。従って、触媒はゲル化が起こる
前に添加される。かくして、触媒（酵素調製物）をまず
試薬の一つと混合し、その他の試薬をその混合物に添加
してもよい。その他の試薬を添加すると反応が直ちに始
まり、これによりゲル生成が防止される。別法として、
反応体を低温で混合し、温度が上昇しそしてゲル化が起
こる前に触媒を添加してもよい。これらの操作は上記の
文献には示唆されていない、米国特許第４．６１４．７
１９号に於ては、例えば試薬混合物がまず形成されつい
で触媒をその混合物に添加する。

特に好ましい態様に於て、リボースドナー及びトリアゾ
ールが反応を進行中に添加する。これらの試薬を連続的
に添加してもよく、あるいはバッチ中で成る時間にわた
って（例えば８時間毎に）添加してもよい。添加速度は
約４０ミリモル／時間が好ましいが、それよりも速い速
度及び遅い速度を用いてもよい。前記の如く、反応の進
行にわたって１００ｇ／ｌに近いリバビリンの濃度を得
ることができる。所望の終了濃度に依存して、反応時間
は広く変化してもよく、例えば約６時間〜３０時間の間
で変化してもよい。

リボースドナー及びトリアゾールの他に、反応混合物は
ホスフェートイオンを含有することが好ましい（これは
酵素により必要とされることがあるからである）。ホス
フェートイオンの有用な源はモノリン酸カリウムであり
、その濃度は典型的には約２５ミリモル〜約１００ミリ
モルである。ｐＨを反応中に制御する場合には、−層低
濃度のホスフェートが有効である。

この型の通常の方法に於ては、触媒として使用する細胞
を反応混合物から除去しそして廃棄する。

本発明者はこれらの細胞が有意な量の所望の生成物を含
有することを見出した。かくして、好ましい方法に於て
、酵素調製物を例えば遠心分離により回収しそして洗浄
する。ついで追加の生成物を洗浄液から回収する。洗浄
液は水であることが好ましい。

下記の実施例に於て、転化率（％）が示されている。転
化率（％）は、制限反応体のモル量を基準として出発原
料の最初の量で割った（除算した）モル基準のリバビリ
ンの量である。これは先行技術文献に於て収率と称され
るものと考えられる。

更に正確には、収率は、反応する出発原料の量で割った
生成物の量を云う。収率を計算するためには、出発原料
の最終量を知る必要がある。本明細書の実施例に於て、
反応終了時の出発原料の残存量を計る努力はしなかった
。出発原料が所望の生成物だけになる場合には、転化率
（％）と収率（％）とは同じである。

以下の調製例及び実施例によって本発明を更に詳細に説
明する。

ｐ）１７．２の水性培地１０１を調製し、滅菌し、発酵
槽中で組み合わせた。培地の組成を第１表を示す。培地
５００−を含むフェルンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フ
ラスコ中でブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅＬｙｌｉｃｕ＋＋＋）
＾ＴＣＣ３９３１１を３０℃で２０時間培養することに
より植菌物（または接種物）を調製した。フェルンバッ
ハ培地は、硫酸マグネシウムを欠いていること以外は、
発酵槽中で使用したものと同じであった。植菌物を移し
た後に、発酵槽を３０℃で２０時間培養した。　ｐＨを
水酸化カリウムで７．２に制御した。培養液２０ｇ／ｌ
量の追加のグル１コースを発酵中に１２時間経過後に添
゛加した。

発酵の終了時に、培養液を遠心分離して培養液１１当た
り湿潤細胞５０ｇを生成した。細胞を１０ミリモルのホ
スフェート緩衝液中に再懸濁することにより細胞を洗浄
した。ついで遠心骨急により細胞を集め凍結ペーストと
して貯蔵した。

第１表 １、栄養物質培養液　　　　　　　２０２、　　ＫＪＰ
Ｏｎ　　　　　　　　　　　　１４３、　　ＫＨｚＰＯ
ｅ　　　　　　　　　　　　　ｓ、ｓ４、　クエン酸ナ
トリウム　　　　　　０．０２５５、　　ＭｎＣｌ　！
　”　４１１ｚ０　　　　　　　　　０．０１５６、　
　ＺｎＣＪｚ　　　　　　　　　　　　　　ｏ、ｏｉ７
、　　ＦｅＣ１ｓ　’　６ＨｚＯＯ，０１８、ＭｇＣＩ
ｌ、・６Ｈ２００，２５ ９、ＣｕＣｊ！　ｚ　”　２ＨｔＯＯ，００１１０、Ｃ
ａＣ１ｔ　・２Ｔｏ０　　　　　　　　　０．００３７
５１１、　ＣｏＣｌ１ｔ　”　２Ｈｔ０　　　　　　　
　　０．００１１２、　ＮａＭｏ０ｔ　Ｈ２Ｌ０　　　
　　　　　　０．０００５１３、ポリグリコールＰ　−
２０００７２１４、グルコース　　　　　　　　　　５
０１５、　Ｍｇ５Ｏ，・７８！０　　　　　　　　　０
．７５１６、チアミン・ＨＣｌ１Ｏ，０００２第１表（
続き） １７．ｐ−アミノ安息香酸　　　　　　０．０００２１
８、　ヒ’）　Ｆ　−１−シフ　・ＩＩ（Ｊ　　　　　
　　Ｏ，０００２１９、ニコチン酸　　　　　　　　　
　０．０００２２０、　　リボフラビン　　　　　　　
　　０．０００２２１、ｄ−パントテン酸カルシウム　
　０．０００２２２、葉酸　　　　　　０．０００００
２※　米国ミシガン州ミツドランドのダウ・ケミカル（
Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から入手し得る。

〔実施例〕

一＋１：”ル　　−　び、　Ｓ、・。

Ａ）比較試験 種々の量のグアノシンと１．２．４−）リアゾール−３
−カルボキサミドとを組合わせることにより生物変換培
地を１１裏した。その量は２０ミリモル、４０ミリモル
または１００ミリモルであった。

二つの反応体を１：ｌのモル比セ使用した。また反応混
合物はＫｌＩ□Ｐ０４２０ミリモル及び水２００　ｍｆ
を含んでいた。ブレビバクテリウム・アセチリカム細胞
ペース）４０ｇを添加して生物変換を開始した。各々の
フラスコの初期ｐＨを水酸化カリウムでｐＨ１，２に調
節した。

二つの反応体１００ミリモルを含むフラスコを７０℃に
加熱すると、細胞ペーストを添加する前にゲル化した。

また二つの反応体４０ミリモルを含むフラスコはゲル化
したが、数分長い時間を要した。撹拌棒による撹拌は両
者の場合ゲル化を逆行するには有効ではなかった。

Ｂ）グアノシン及び１．２．４−）リアゾールの濃度を
１００ミリモルから２００ミリモルに変えたこと以外は
上記のようにして生物変換培地を調製した。二つの反応
体を１：ｌのモル比で使用した。

各々のフラスコの初期ｐＨを水酸化カリウムでｐＨ７，
２に調節した。生物変換を７０℃で行った。温度が７０
℃に達した時に細胞を直ちに添加して生物変換混合物の
ゲル化を避けた。

最終転化率を２４時間経過後に測定した。各々の生物変
換培養液を遠心分離し、最終の細胞を含まないリバビリ
ン濃度を測定するため試料を上澄液から採取した。

各々の生物変換からの細胞ペースト（約４０ｇ）を水２
０〇−中に再懸濁した。これらの溶液を２２℃で１時間
撹拌して細胞からりバビリンを抽出した。ついで溶液を
遠心分離して、抽出されたリノくビリンの測定のため試
料を上澄液から採取した。

新しい水と第一抽出からの細胞ペーストとを用いて抽出
工程を二回繰り返した。

生物変換の最初の時間に計算された初期反応速度、反応
の７時間後の細胞を含まないリバビリン濃度及び転化率
並びに最終の細胞を含まないリノくビリン濃度及び転化
率を、細胞を含まない溶液中の初期のグアノシン濃度の
関数として第２表に示す。細胞からリバビリンを抽出す
ることにより得られた最終転化率の増加を第３表に示す
。

第２表 １００　　　　　　　　３．９　　　　　１４．８　１
［ｉ、８　　　６１　　　７０１２５　　　　　　　　
４．５　　　　　１Ｂ、８　２０．９　　　６２　　７
０１５Ｇ　　　　　　　　　５．４　　　　　２２．７
　２５．１　　　６２　　７０１？５　　　　　　　　
５．４　　　　　２５．７　２８．９　　　　（ｉｏ　
　　６８２００　　　　　　　　５．５　　　　　２８
．３　３２．８　　　５８　　６８第３表 １５Ｇ　　　　７０　　７９　　８０ 〜乍＋２　：’＋）　　ｏ　’ｔ−Ｐ　　を　いるリバ
ビリングアノシン及び１．２．４−トリアゾール−３−
カルボキサミドの初期の量が４０ミリモルであったこと
以外は実施例１のようにして生物変換培地を調製した。

各々のフラスコの初期のｐＨを水酸化カリウムでｐＨ７
，２に調節した。生物変換を実施例１のようにして開始
した。温度が７０℃に達した時に細胞を直ちに添加して
生物変換混合物のゲル化を避けた。グアノシン及び１．
２．４−トリアゾール−３−カルボキサミドの両者の４
０ミリモルを６時間目及び１２時間目に生物変換中に添
加した。かくして、二回目の添加後に、二つの反応体の
合計１２０ミリモルが添加された。水酸化カリウムを６
時間経過後に添加してｐＨを６．７から７．２に調節し
た。

細胞を含まないリバビリン濃度、グアノシンを基準とし
た転化率、並びに６時間目、１，２時間目及び２４時間
目の総反応速度を第４表に示す。

第４表 ｏ　　　ｏ　　　　ｏ　　　。

６　　２５．８　　４．３　　５３ １２　　５６．７　　４．７　５Ｂ ２４　　９４．９　　４．Ｏ６５ ５００ａｆのフラスコ中でグアノシン９０ミ９モル及び
１．２．４−トリアゾール−３−カルボキサミド１０ミ
リモルを水１００−中のＫＨｚＰＯａ　１０ミリモルと
７０℃で組合わせることにより生物変換培地を調製した
。ついで細胞ペース）４０ｇを添加し、次にグアノシン
９０ミリモル及び１．２．４−トリアゾール−３−カル
ボキサミド９０ミリモルを添加し、最後に室温で水１０
０−中のＫＨ，ＰＯ。

１０ミリモルを添加した。この調製中、反応混合物を頂
部駆動式実験室撹拌機で激しく撹拌した。

得られる反応混合物はペースト状の粘稠であったがゲル
化しなかった。リバビリンの生成は実施例２と同様であ
った。

〔発明の効果〕

本発明の方法は反応混合物中の所望の生成物の一層高い
濃度を得ることができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リボースドナーがグアノシンまたはグアノシン誘導
   体であり、ドナーの濃度が約１００ミリモル以上であり
   、ブレビバクテリウム・アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｙｌｉｃｕｍ）から誘導され
   た酵素調製物を反応混合物のゲル化前に添加することを
   特徴とする、上記の酵素調製物の存在下にリボースドナ
   ーとトリアゾール化合物とを反応させる工程を含む１，
   ２，４−トリアゾールヌクレオシドの製造方法。 ２、反応混合物から酵素調製物を分離し、その酵素調製
   物を洗浄し、そしてその洗浄流体からヌクレオシドを回
   収する追加の工程を含む請求項１記載の方法。 ３、反応の進行中にリボースドナー及びトリアゾール化
   合物を添加する追加の工程を含む請求項１記載の方法。