JPH01105159A - 組織標本の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は例えば顕微鏡検査などの診断評価で使用される
組織標本を製造する方法に関する。本発明による組織標
本の製造においては、組織標本の急速固定、脱水、包埋
、組織標本から取ったプラスチック切片のガラス・スラ
イドへの接着及び染色が行われる。この組織標本の急速
固定は加熱装置の存在下で組織標本をマイクロ波にさら
すことによって行われる。組織標本の脱水は加熱装置の
存在下でくり返しマイクロ波にさらすことにより行われ
るが、さらに大きな組織標本、特に骨の標本については
凍結乾燥することにより行われる。

組織標本の包埋は従来のパラフィンあるいはプラスチッ
ク包埋方法によって行われてもよい。プラスチックはマ
イクロ波を使って急速に浸透させる。

プラスチック切片をガラス・スライドに急速接着させる
工程は組織構造の染料を様々な組織成分に急速に最もよ
く浸透させる工程と同様にマイクロ波を使用することに
よって容易に行われる。

（従来の技術） 診断評価用の組織標本を第一固定、脱水、包埋によって
製造することは当該技術分野では周知のことである。組
織標本を固定あるいは脱水する従来の方法は時間がかか
るし悪臭のある蒸気を放出する又はその恐れがある毒物
を利用する可能性もある。

従来の固定方法ではホルマリンあるいはホルマリン誘導
体を使用する。ホルマリンはメチルアルコールを含有し
てもよいホルムアルデヒドの水溶液である。この従来の
固定方法では固定を完了するまで８時間から２４時間か
かる。

従来の脱水方法ではエタノール、トルエン、あるいは可
燃性、揮発性でもしかすると毒性もある有機溶媒を使用
する。従来の脱水方法では８時間から４日間かかる。

これまでＭＬ、ｔａ標本の固定を促進するなめに加熱に
よる固定改良方法が試みられた。しかし、従来の加熱固
定方法では組織標本を加熱したり燃焼したりして損失を
与えてきた。

従来の包埋方法では過酸化ベンゾイル及び加熱によって
重合するパラフィンあるいはプラスチック・モノマーを
使用する。パラフィンに包埋された組織標本の切片はプ
ラスチック包埋標本に比べて品質が劣る。しかし、大抵
のプラスチック包埋方法は時間がかかり、例えば、最良
の包埋をするためには３６時間から５８時間必要とする
。

プラスチック切片をガラス・スライドに接着するための
従来の方法は、おだやかに加熱しながら圧力を加えるこ
とによって行われる。この場合に８時間から１８時間か
かる。

従来のプラスチック包埋方法では組織標本からプラスチ
ックを除去しない。組織切片にプラスチックが存在する
と組織構造染料が細胞になじみやすい。プラスチックを
溶解することはほとんど行われないが、溶解する場合に
は組織切片−組あたり１．４５時間はどかかる。

（発明が解決しようとする課題） 従来の組織構造切片の染色方法は特別な組織構造染色で
満たした容器の中にスライドを浸して行う。異なった様
々な染料に差別的にさらすことにより種々の組織成分を
選択的に染色し優先的に確認することができる。例えば
、トリクロム染料などのような従来の染色方法では、選
択的逐次的に染色を完了するまでに８０分もかかる。

本発明の目的はマイクロ波のタンパク質変性効果を利用
することにより加熱して組織に損害を及ぼさない新規の
急速固定方法を提供することにある。

本発明の別の目的は様々な組織を１０秒から２０分以内
に固定する新規な急速固定方法を提供することにある。

本発明のまた別の目的は本発明の急速固定方法と同時に
使用される場合に組織標本の脱水を１時間から３時間以
内に行う急速脱水方法を提供することにある。

本発明のさらに別の目的はマイクロ波のタンパク質変性
効果を利用することにより加熱して組織標本に損害を及
ぼさない急速脱水方法を提供することにある。

本発明のさらに別の目的はマイクロ波の非熱及び熱効果
を利用することによりプラスチックモノマーの組織標本
への浸透を促進するプラスチック包埋急速浸透方法を提
供することにある。

本発明のさらに別の目的はプラスチックを１５分から３
１５分以内で様々な組織に浸透させる急速浸透方法を提
供することにある。

本発明のさらに別の目的は約１０分間かかるマイクロ波
の熱効果を利用することによりプラスチック切片をガラ
ス・スライドにより速く接着する新規な方法を提供する
ことにある。

本発明のさらに別の目的は約６分間かかるマイクロ波の
熱効果を利用することによりプラスチック・ポリマーを
組織切片から除去する新規方法を提供することにある。

本発明のさらに別の方法はマイクロ波の熱効果及び非熱
効果を利用することにより組織成分を別々に急速染色す
る方法を提供することにある。

本発明のさらに別の目的は従来の組織製造方法に比べて
時間を短縮し毒性の全くないあるいは制限された物質を
利用し毒性の煙又は臭いを全く出さないあるいは微量で
ある診断評価に使用するための固定、脱水、組織標本の
包埋、切片のスライドへの急速接着及び最良の染色工程
から成る組織標本を製造する全工程を提供することにあ
る。

本発明の以上のような目的及びその他の目的は以下に述
べる本発明の詳細な説明及び好ましい実施態様の詳細な
説明から明らかである。

（課題を解決するための手段） 本発明による組織標本の製造方法は、顕微鏡検査のよう
な診断評価において使用されるが、急速固定、脱水、包
埋、プラスチック・スライドへの接着、プラスチックの
除去及び組織成分の急速染色の工程から成る。急速固定
方法は組織標本をマイクロ波源にさらすことから成る。

加熱装置は組織標本と共にあって、それによりマイクロ
波の非熱効果を上げ組織標本を固定させる。その後、組
織標本をアルコール溶液に浸してから繰り返し加熱装置
つきのマイクロ波にさらすか、あるいは組織標本を凍結
乾燥することにより脱水する。固定、脱水工程の後に組
織標本を従来のパラフィン包埋方法あるいはプラスチッ
クの急速浸透、切断後のプラスチック溶解、組織切片の
ゼラチン被覆ガラス・スライドへの接着のためにマイク
ロ波を利用する急速プラスチック包埋方法によって包埋
する。

次に、様々な組織成分を速く最善に選択的差別的染色す
るためにマイクロ波を利用して組織切片を染色する。

後で明らかにされるように、固定、脱水、包埋の一部と
しての浸透、ガラス・スライドへの接着、プラスチック
の除去及び染色方法は個別にあるいは組み合わせて使用
できる。また、後で明らかにされるように、本発明の方
法は筋肉、骨、皮膚、肝臓、腎臓、頭脳、内分泌腺器官
を含むあらゆるタイプの組織、ＧＩ管の標本、婦人病学
的標本、肺、耳鼻咽喉学標本などに利用できる。

本発明に記載されているように、診断標値において利用
する組織標本の製造方法は筋肉、骨、皮膚、肝臓、腎臓
、頭脳、内分泌腺器官などを含むあらゆるタイプの組織
、ＧＩ管の標本、婦人病学的標本、肺、耳鼻咽喉学標本
などに使用するのに適しているが、組織標本製造方法は
特に脱石灰していない骨の標本の製造に役立つ。これま
では、石化した骨の組織構造は冗長で複雑で時間がかか
ったので、少数の選ばれた研究所でしか行われなかった
。本発明は日常の診断検査に含まれる石化した骨の標本
を製造することもできる。石化した骨の標本の切片を製
造する場合に本発明においては、従来方法で１週間から
４週間かかるのに対して、１６時間から２０時間かかる
だけである。

診断評価で使用する組織標本の製造の第一工程は組織標
本の固定である。組織標本の急速制御固定を行うために
はマイクロ波によるタンパク質の変性効果を利用する。

加熱装置をマイクロ波放出源と共に使用すると、マイク
ロ波の非熱効果のみが組織標本に有効に働いて過熱によ
る損害を与えない。

特に本発明の好ましい固定方法では、例えばエタノール
、生理食塩水、又は１０％のホルマリン緩衝液などの液
体固定媒体として適した溶液を入れた充分な８及のある
、例えば、約４リツトルはどの容器の中に組織標本を置
くことから成る。さもなければ、上述の液体固定媒体の
うちの一種類をさらに少量だけ入れて一杯にした例えば
染色皿のような容量の小さい容器の中に繰り返し組織標
本を浸すか、あるいは０℃以下（−４０℃まで）の温度
で、１００％エタノールのような溶液を入れた染色皿の
中に一回だけ組織標本をくぐらせる。次に容器に入れた
組織標本をマイクロ波放出源にさらす。固定化工程にお
いて組織標本をマイクロ波にさらす時間は組織標本の大
きさと堅さによって異なる。（ａ）大量の溶液を使用す
る場合、（ｂ）２℃から１０℃までの温度で少量の溶液
で満たした複数個の新しい容器に組織標本を移動するた
びに繰り返しマイクロ波にさらす場合、又は（Ｃ）標本
を０℃以下（−４０℃）までの温度の溶液に浸して一回
だけマイクロ波にさらす場合に、加熱装置を使用するこ
とにより組織標本及びその周囲にある溶液の温度が上昇
することを避けることができる。加熱装置を使用すると
いうことは溶液の量と温度の低下との間には直接関係が
あることを示していて、標本を入れる溶液の量が少なけ
れば少ないほど熱の蓄積を避けるために温度を低くしな
ければならない。例えば、骨の標本の場合、診断評価用
に得られる平均釣管標本は０．５Ｘ２．５ｃｍである。

この寸法の骨の標本は−４０で１００％エタノール４０
０〜５００　ｍｌで満たした容器に入れマイクロ波にさ
れな後９０秒以内に固定されるか、あるいは、−１０℃
で１００％エタノール４リツトルで満たした容器にいれ
た場合は１０分以内に固定される。例えば生理食塩水及
びホルマリン緩衝液などの溶液の場合は加熱するために
さらにマイクロ波にさらす必要があるので、上記寸法の
骨械本は２℃で４リツトルの溶液に入れた場合（溶液は
冷蔵庫に貯蔵）、あるいは４リツトルの上記溶液で満た
した容器に入れてマイクロ波にさらした場合に１０分間
で固定することができる。骨標本の極く近くの温度は３
８℃を超えないようにするのが好ましい。固定が完了し
た後では温度の作用範囲は１０℃から４０℃の間が普通
である。固定する間組織を浸すための好ましい溶液は、
骨や肝臓にはエタノール、腎臓にはホルマリン、頭脳に
は生理食塩水である。軟かい組織標本を固定化する場合
には周縁部の細胞を傷つける恐れがあるので開始温度を
一５℃以下に低下させないように注意する。寸法がさら
に大きい組織標本を固定化する場合には一５℃の溶液４
リツトルに浸して各々７分間ずつ２回マイクロ波にさら
すなどの逐次的に行う方法を選択するのが好ましい。調
理用電子レンジの操作安全基準に合うものならどんなマ
イクロ波放出源でも利用できる。マイクロ波の電力は５
００〜６００ワツトにセットし、標本はマイクロ波に最
もよくさらされるように容器の中央に自由に吊り下げる
のがよい。

組織標本は固定した後、マイクロ波を使っであるいは凍
結乾燥して急速に脱水する。マイクロ波を使用する場合
には標本の全表面がマイクロ波に最もよくさらされるよ
うに溶液を満たした容器の中央に自由に吊り下げるのが
よい。１００％エタノールが好ましいが、類似のアルコ
ール溶液でもよい。再び加熱装置を使用する必要がある
が、標本を１８００ｍｌのエタノール中に繰り返し浸し
マイクロ波に繰り返しさらす場合には最善である。なお
、一定数の組織標本を脱水する場合はマイクロ波にさら
す度にエタノールは新しくするべきである。

マイクロ波にさらす作業範囲は室温で開始して、２４−
３６ワツト、２０分、４−６回である。軟がい組織でよ
り小型の骨標本にとって加熱装置と共にマイクロ波を使
用するのが有効である。大型の骨標本で特に密度の高い
骨からなる表面が大きな割合を有する標本の場合は凍結
乾燥方法で脱水するのが好ましい。特に、組織標本を６
００　ｍｌの凍結乾燥フラスコに入れた一５℃から一１
０℃の温度の１００％エタノール約３００　ｍｌに浸し
て脱水するのが好ましい。次に組織標本は実際の大きさ
や密度の高い骨から成る表面の割合にもよるが、１時間
から１゜５時間凍結乾燥する。極端な場合エタノールを
取り換えた後に繰り返しマイクロ波にさらすことが必要
かもしれない。無水の液体を使用せずに人骨標本を脱水
することは可能である。この方法は脱水の最適時間を見
つけることがむずかしいので安全ではない。マイクロ波
にさらすことが充分でないと切片の品質が劣るし、マイ
クロ波にさらし過ぎると加工品が多様になる。組織標本
を凍結乾燥するなめにＤｉｒｅｃｔｏｒｒ真空ポンプを
備えたｔａｂｃｏｎＣＯ凍結乾燥機ＭＯｄｅｌ　８など
を使用できる。凍結乾燥機の内圧は一５０℃の開始温度
で１０００−４００　トールの範囲である。

組織標本は固定、脱水の後、従来のパラフィン包埋方法
又はプラスチック包埋方法により包埋する。

本発明は急速プラスチック包埋用にマイクロ波を利用す
る。マイクロ波を使用することによりプラスチックモノ
マーを様々な軟かい組織又は骨に急速に浸透させること
ができる。標本をプラスチック・モノマーの液体に入れ
る前に移動工程が必要である。例えば、エタノールと純
粋なメチル・メタクリレート・モノマーを１：１の割合
で混合したもの５００　ｍｌで満たした染色器などの適
当な容器に組織標本を入れる。この容器を磁気撹拌器上
に置き、３０〜４５分間かきまぜる。その後で組織標本
を４５０〜５００ｍｌの純粋なメチル・メタクリレート
で満たした別の容器に移し、５分間マイクロ波（２４ワ
ツト）にさらす。このようにマイクロ波にさらすことを
２回繰り返した後、それぞれ室温で開始した同量のメチ
ル・メタクリレートの新しい溶液に標本を移す。合計１
５分間このようにマイクロ波にさらすことにより診断を
目的とした普通寸法の組織標本中にプラスチック・モノ
マーが最もよく浸透する。さらに大きな標本、特に骨標
本は繰り返しマイクロ波にさらすか、後で冷蔵庫の中に
入れた重合溶液中に２〜８時間貯蔵する必要がある。そ
の後、プラスチックの硬化は組織標本を約６２５　ｍｌ
の重合溶液の入った適当なガラスのジャーに移すことに
よって開始される。重合溶液は５００　ｍｌのメチル・
メタクリレート、１２５　ｍｌのプラストイド・Ｎ（Ｐ
ｌａｓｔｏｉｄ　Ｎ）及び１５　（ＩＩＩｓの無水過酸
化ベンゾイルから成るか、あるいは包埋に必要とされる
プラスチックの全量によって左右されるがこれらの成分
の倍数又は分数から成る。プラストイドＮはノニルフェ
ノール、ポリエチレン・グリコール及びエチルアセテー
トの混合物である。

プラストイドＮを添加してプラスチックの重合を行うこ
とは石灰質を取り除いてない骨の標本を製造する場合に
特に有利である。というのは組織標本を包埋するプラス
チックが骨の標本と同じ又はほぼ同じ硬さまで硬化する
からである。このモノマーの重合は過酸化ベンゾイル開
始剤の添加によって引き起こされるが、最終的硬さはプ
ラストイドＮの成分であるポリエチレン・グリコールと
ノニルフェノールを使用することによって調整される。

骨標本にこの重合溶液を充分に浸透させ易くするために
、その標本を冷蔵庫の中に２〜８時間入れておく。この
工程は軟かい組織標本の場合には必要ない。その後、標
本は１０〜１２ｍｌの重合溶液で満たしたガラスの小び
んに移される。組織標本人りのガラスの小びんは硬化が
完了するまで（４〜８時間）４８〜５０℃の温水浴に保
存する。メチル・メタクリレートが硬化した後、ガラス
の小びんを割って取り除く。金属のカップなど他の容器
を使用してもよく、また再使用してもよい。この点で組
織標本は永久にプラスチック材料に包埋され、この組織
標本を切断することができるので診断評価のために使用
することができる。Ｄ型のナイフを備えたユング・ミク
ロトームなどのがん丈なミクロトームでプラスチックに
包埋した組織標本を切断する。プラスチックに包埋した
軟かい組織を切断するために、又は小さい骨の標本のた
めにガラスのナイフや安いミクロトームも使用する。

プラスチック包埋組織、特に石灰質を取り除いてない骨
の場合は組織切片をしわが寄らないよう最上の状態でス
ライドに接着するために特別のガラス・スライドを用意
する必要がある。本発明ではまたプラスチック切片をゼ
ラチン被覆スライドに急速接着するためにマイクロ波の
熱効果を利用する。組織切片をスライドに移し広げてポ
リエチレン・プラスチック紙でおおってからスコッチ・
テープでスライドに固定する。次に、このスライドをマ
イクロ波のところに移し、４８０→ツトで放出されるマ
イクロ波に合計３分間さらす。次に１０分間スライドを
冷却し、スコッチ・テープとポリエチレン・プラスチッ
ク紙とをはがしてから、組織切片に付着させて染色する
。プラスチック切片をゼラチン被覆ガラス・スライドに
接着する方法としては、時間を問題にせず、さらに大き
な標本の骨の切片をプラスチックに包埋切断する場合に
はまな別の方法がある。この方法でもポリエチレン・プ
ラスチック紙を利用し、１〜２滴の拡張液（ブトキシェ
タノール、又は７０％のエタノール）をたらして広げた
切片の上をおおう。再びスコッチ・テープでプラスチッ
ク紙をガラス・スライド上に固定する。なお、ポリエチ
レン紙をガラス・スライド上に注意深く広げ、組織標本
とポリエチレン紙、あるいは、ガラス・スライドとポリ
エチレン紙の間に空気の泡が入ってないか確認すること
。次に、このスライドを６０℃の細菌培養器に移し、最
低３０分は入れておく。小さい万力又は金属製締め具を
使って２〜６枚のガラス・スライドを−まとめにして圧
力をかけ、組織標本を最適に広げプラスチック切片をガ
ラス・スライドに接着する。

ポリエチレン紙を除去し、プラスチックを取り除き、様
々な組織成分を充分に染色する。プラスチック切片のは
り付いたスライドを例えば２−メトキシ−エチル−アセ
テート、又はメチルグリコールアセテートなどの有機溶
媒の中に入れてメチルーメタクリレートを溶解する。こ
れまではプラスチック切片の付着したガラス・スライド
を上記溶液に４５分から６０分浸してプラスチックを溶
解してきた。マイクロ波の熱効果を利用することにより
この時間を劇的に短宿できる。約１０枚はどのスライド
を６５ｍｌの２−メトキシ−エチル・アセテートで満た
した染色ジャーに移すことができる。この染色ジャーを
マイクロ波室に入れ、６００ワツトで放出されるマイク
ロ波に１５秒間さらす。この工程は２度繰り返されるが
、その度に２−メトキシ−エチル−アセテートの新しい
溶液で満たしたジャーにスライドを移し入れる。次に、
上記スライドを同じ溶液で満たした別の皿に移し、合計
２〜５分間冷却する。スライドについたメトキシ−エチ
ル−アセテートを取り除いてきれいにするために、１０
０％エタノールで満たした３つの皿にそれぞれ３〜５分
間ずつ浸す。プラスチックを除去する前述の工程にかか
不時間は２１分以上にならないが、従来の方法に比べて
さらに時間の節約ができることを示していることは明ら
かである。

次に、骨を含む様々なＭｉ織の切片はその組繊成分を正
しく確認するために染色する必要がある。

組織構造染色では様々な組織成分が特定の染料にだけ染
まることを利用している。従来の染色技術では組織構造
染色に必要な時間が様々に異っていた。故に、マイクロ
波及びその急速熱効果を使用すると染色を速め、特定の
組織成分が確認のなめ　゛に使われる染料に示す親和性
を増大することになる。スライドを染色皿に浸し、次に
６００ワツトのマイクロ波オーブンに入れる。スライド
を染料に浸す時間について最もひんばんに使われる骨の
染料の場合マイクロ波にさらさなかった場合とさらした
場合を以下に比べてみた。

ワイゲルト核染料・・・１０分対１０秒ポンソー・レッ
ド・・・２０分対２０秒アニリン・ブルー・・・２分封
６・〜８秒ソロクローム・シアニン・・・４５分対４５
秒本発明方法による組織標本は優れた品質であり、他の
方法による標本に少なくとも匹敵する品質を有する。し
かし、本発明は組織標本の製造の総処理時間を劇的に短
縮する。

以上述べたように、特定の組織標本の寸法堅さによって
固定、脱水、浸透、プラスチック包埋と溶解、ガラス・
スライドへの接着、染色方法など量、時間、温度、材料
を様々に変化させて利用できる。例えば、組織標本を加
熱装置の存在下で固定のためにマイクロ波にさらす時間
は１０秒から２０分の範囲である。固定した組織標本の
脱水時間は全部で約０．２５から３時間である。固定工
程の液担体の温度は一４０℃から室温までである。さら
に、組織標本の脱水の利用する無水液体の温度範囲は一
４０℃から室温までである。固定脱水工程で利用される
液担体の量も様々に変えられる。固定脱水工程で使用さ
れる液体材料の必要量を測定する基準は組織をどうして
も傷つけてしまう熱の蓄積が避けられるように決められ
る。以上述べたように、開始温度が高く、マイクロ波に
さらす時間が増加し、マイクロ波エネルギーが高くなる
と熱の蓄積を４０℃以上に上昇させないために液体材料
の量をさらに増す必要がある。すでに述べたように、従
来のプラスチックあるいはパラフィン方法は固定脱水工
程の後で利用してもよい。本発明をさらに詳細に説明す
るなめに以下に実施例を挙げる。

（実施例） 実施例：脱石灰してない骨の切片の製造方法工、固定 約０．５　ｘ３．０　（ｍの寸法の骨の組織標本を一１
０℃の１００％エタノール４０００ｍｌで満たした容器
に入れる。骨の標本は液体の中で自由に吊り下げる、つ
まり表面下できるだけ深く浸すが、底から１ｃｍ以上離
れるようにすべきである。次にこの容器を６００ワツト
のマイクロ波オーブンに入れる。マイクロ波は１０分間
放出される。マイクロ波にさらし終わると、骨採本は燃
焼することも有害な影響を与えることもなく固定された
。もし骨の標本が上記寸法を越える場合は工程を繰り返
す。

■、脱水 固定した骨の標本を室温（２０℃）の１００％エタノー
ル１８００ｍｌ入りの容器に入れる。マイクロ波放出源
は２４ワツトにセットし２０分間作動させる。その後、
骨の標本を同じ開始温度（２０℃）の１００％エタノー
ルを同量（１８００ｔｎｌ　）入れた別の容器に移す。

この工程は合計６回それぞれ２０分ずつ逐次的に行われ
る。マイクロ波にさらす時間は全部で６Ｘ２０分又は２
時間である。１８００ｍｌの１００％エタノールは標準
寸法の骨標本２５個に対して使用される量である。脱水
工程は逐次的であるので、溶液は１回以上使用される。

溶液の数は次に来る工程に対応する。従って、溶液＃６
は溶液＃５となり、溶液＃５は溶液＃４となり、溶液＃
４は＃３となり、溶液＃３は＃２となり、溶液＃２は＃
１となり、容器＃６には新しい１００％エタノールが充
填される。標本は容器の中に自由に吊り下げられるとい
うことが重要である。すなわち、標本は表面下に完全に
浸されるべきであるが、容器の底から１ｃｍ以上以上へ
きである。

大きな骨標本については、凍結乾燥を利用する脱水が代
わりに行われる。固定した骨の標本を一５℃の１００％
エタノール３００　ｍｌを入れた６００　ｍｌ容積の凍
結乾燥フラスコに入れる。次にこの骨標本を１〜１，５
時間凍結乾燥する。凍結乾燥器の開始温度は一５０℃で
内圧は１ｏｏｏから４００トールである。

■、プラスチック包埋 固定脱水した骨の標本を１００％エタノールとメチル−
メタクリレートを同じ割合で混合した溶液を室温で５０
０　ｍｌ入れた容器の中に入れた。この容器を磁性撹拌
機上に置き、４５分間撹拌した。次に、この骨標本を５
００　ｍｌの純粋なメチル−メタクリレート・モノマー
で満たした室温の別の容器に移す。

この容器をマイクロ波オーブンの移し、２４ワツトで５
分間マイクロ波を放出した。次にこの工程を２回繰り返
すが、１回毎に５００　ｍｌの純粋メチル−メタクリレ
ートを室温で満たした別々の容器に移す。５分間マイク
ロ波にさらした後の骨標本の直ぐ近くのメチル−メタク
リレートの温度は３６℃を越えない。次に骨標本を６２
６　ｍｌの重合溶液で満たした別の容器に移す。この重
合溶液は５００　ｍｌのメチル−メタクリレート・モノ
マー、１５　ｇｍｓの無水過酸化ベンゾイル、１２５　
ｍｌのプラストイドＮから成る。標本を冷蔵庫に入れて
おいたこの溶液の中に８時間保存しておく。この間に重
合溶液が充分に浸透する。この工程は骨標本の大部分が
外層の骨であるか密度の高い骨である場合は特に必要で
ある。次に骨標本を１０〜１５ｍｌの重合溶液で満たし
たガラスの小びんを入れる。ガラスの小びんを４８〜５
０℃の水浴中に移す。重合工程は上記温度で促進される
。水浴によって泡の発生を防ぐ。重合完了までの時間は
４〜８時間である。

硬化工程が完了したら、ガラスの小びんを冷蔵庫へ５分
間入れておく。次にガラスの小びんを割って、プラスチ
ックのかたまりを切断のために取り出す。このプラスチ
ックのかたまりには診断評価に役立つ固定脱水した石灰
質を取り除いてない骨の標本が入っている。

ＩＶ、スライドへの接着 カーバイドの刃のナイフ又はＤ型ナイフを備えたユング
のがん丈なミクロトーム（さもなければ小さな骨標本用
にガラスのナイフと安価なミクロトーム〉を使って切片
を切断した後、プラスチック切片をゼラチン被覆したス
ライドに移す。拡張液（７０％エタノール、又はブトキ
シェタノール）を１滴か数滴たらしてプラスチック切片
の拡張を助ける。次に一枚のポリエチレン紙（４Ｘ２．
５ａｍ）をプラスチック切片入りのスライド上にかけて
、スコッチテープでガラス・スライドに止め付ける。

２〜６枚のガラス・スライドを重ねて、小さな金属の万
力に入れる。ガラス・スライドを割らない程度にできる
だけ万力を締めつけてプラスチック紙とガラス・スライ
ドの間に残っているかもし、れない小さな気泡を抜いて
やる。万力に締めつけられたスライドの重ねたものを３
０〜６０分間細菌培養器中に入れておく。次に万力に締
めつけられたままのスライドを培養器から取り出し、２
分間冷却した。次に万力をはずす。ガラス標本とポリエ
チレン紙の間に液が残っているようだったら、スライド
をマイクロ波オーブンに移し、４８０ワツトのマイクロ
波に３分間さらす。時間が重要なら、培養器へ入れない
でマイクロ波乾燥をしてもよい。

しかし、この場合は金属の万力の代わりにプラスチック
又はガラスの万力を使う必要がある。骨は培養器でゆっ
くり乾燥するのが好ましいが、軟かい組織はマイクロ波
のみで乾燥できる。

■、プラスチックの除去 ポリエチレン・カバー紙をスライドから取り除き、各種
組織成分を最上に染色するためプラスチックを溶かす。

プラスチックを除去した後、スライドを２−メトキシ−
エチル−アセテートで満たした染色ジャーに移す。この
ジャーを電子オーブンに入れてスライドを６００ワツト
で放出するマイクロ波に１５秒間さらすことによりプラ
スチックの溶解を促進する。この工程を３回繰り返すが
、毎回新しい２−メトキシ−エチル−アセテートで満た
した新しいジャーにスライドを移し入れる。次に室温の
２−メトキシ−エチル−アセテートで満たした別の染色
ジャーにスライドを移し入れ、さらに２分間この溶液中
で冷却させる。

Ｖｌ、染色 組織標本のスライドを染色するための準備として、室温
の新しい１００％エタノールで満たした３個の染色ジャ
ーにスライドを移し入れる。各ジャーに２〜３分入れて
おく。次にスライドを染色する。好ましい染料はマラソ
ン−ゴールドナートリフロム染料で、これは石灰化した
骨と石灰化してない骨とを区別することができ、細胞の
細部をみごとに染め出してくれる。様々な染料の中にス
ライドを浸しておくのに必要な従来の時間はマラソン・
ゴールトナ一方法の一部であるが、染色液とスライドの
入った染色ジャギーをマイクロ波にさらすことにより劇
的に短縮される。６００ワツトで放出されるマイクロ波
にさらす回数が下記に挙げられている。さらに、使用す
る染色用ジャーは室温で様々の異なった染料を満たすべ
きである。

−ワイゲルトのヘマトキシリン　１０秒；−１ｏｏ％エ
タノールに漫す； 一蒸溜水ですすぐ； 一１％ＩＩｃＬ水で区別する； 一水道水ですすぐ（４回）； 一室温の水道水中のスライドを電子オーブンへ移す； 一６００ワットで２０秒間マイクロ波にさらす；−蒸溜
水ですすぐ； 一１％氷酢酸に浸す； 一ボンソ・デ・キシリジン（室温）に移す；−６００ワ
ツトで放出されるマイクロ波に２０秒さらす； 一蒸溜水ですすぐニ −１％氷酢酸に浸す； 一ポンソ・レッドが柱骨から除去されるまで５％モリブ
ドリン酸中で区別する（２〜５分）ニー蒸溜水ですすぐ
ニ −１％氷酢酸に浸す； 一室温でアニリン・ブルーで電子オーブンに移すニー　
６００ワツトで放出されるマイクロ波に６〜８秒さらす
； 一氷酢酸中でアニリン・ブルーのスライドを洗浄し、１
００％エタノール中で脱水（各々１分間、３回）、洗浄
しくキシレン中で、各々１分間、３回〉、取り付ける； −得られた骨標本は診断評価に使用できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組織標本を約１０℃以下の液体担体中に置き、前記
   担体中の標本をマイクロ波放出源にさらし、前記液体担
   体の量は加熱装置を提供するに足るほど充分であること
   から成ることを特徴とする組織標本の固定方法。 ２、液体担体がエタノールであり、温度が約０℃〜−４
   ０℃の範囲であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 ３、組織標本を液体担体に置き、前記液体担体中の標本
   をマイクロ波放出源にさらし、前記液体担体の量は加熱
   装置を提供するに充分であることから成ることを特徴と
   する組織標本の脱水方法。 ４、（１）組織標本をプラスチック・モノマーとアルコ
   ールの溶液中に置き； （２）次に前記組織標本をプラスチック・モノマーの溶
   液中に置きこの標本をマイクロ波放出源にさらし、 （３）前記工程（１）及び（２）を２回くり返すことか
   ら成ることを特徴とする組織標本の包埋方法。 ５、組織標本をスライド上に置き、前記組織標本をプラ
   スチック紙でおおいスライドに固定し、組織標本を有す
   るスライドをマイクロ波放出源にさらすことから成るこ
   とを特徴とする診断評価に使用するスライドに組織標本
   を接着する方法。 ６、（１）組織標本を有するスライドを有機溶剤で満た
   した容器にいれ； （２）有機溶剤に入れたままのスライドをマイクロ波放
   出源にさらし； （３）前記工程（１）と（２）を繰り返すが、毎回新し
   い有機溶剤溶液で満たした容器にスライドを移し； （４）前記スライドを新しい有機溶剤溶液に移し冷却す
   ること から成ることを特徴とするスライドに接着した組織標本
   からプラスチックを除去する方法。 ７、前記工程（１）と（２）を２回繰り返し、有機溶剤
   は２−メトキシ−エチル−アセテート及びメチル・グリ
   コール・アセテートから成る部類中から選ばれることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、組織標本を染料中に置きマイクロ波放出源にさらす
   ことから成る組織標本を染色する方法。 ９、（１）組織標本を約１０℃以下の液体担体中に置き
   マイクロ波放出源にさらし； （２）固定した組織標本を脱水し； （３）固定し脱水した組織標本を包埋するが、前記液体
   担体の量は加熱装置を提供するに足るほど充分であるこ
   とから成る ことを特徴とする診断評価に使用するための組織標本を
   製造する方法。 １０、液体担体がエタノールであり、温度が０℃から−
   ４０℃の範囲内であることを特徴とする特許請求の範囲
   第９項に記載の方法。 １１、組織標本の脱水は組織標本を液体担体中に置き担
   体に入れた標本をマイクロ波放出源にさらすことから成
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法
   。 １２、組織標本の脱水は組織標本を−５℃のエタノール
   に包埋した後に０．２５時間から１時間凍結乾燥するこ
   とから成ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記
   載の方法。 １３、組織標本をプラスチックに包埋することを特徴と
   する特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １４、組織標本をパラフィンに包埋することを特徴とす
   る特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １５、（１）組織標本をエタノールとメチル−メタクリ
   レート・モノマーを１：１に混合したもので満たした容
   器中に置き３０〜４５分間連続して撹拌し； （２）組織標本を新しいメチル−メタクリレート・モノ
   マーで満たした別の容器に移し約５分間マイクロ波にさ
   らし： （３）工程（１）と（２）を２回繰り返し； （４）プラスチックを重合により硬化させることから成
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の組織
   標本の包埋方法。 １６、重合方法が （１）組織標本を重合溶液中に置き冷蔵庫に２〜８時間
   保存し； （２）組織標本を約１０〜１２ｍｌの重合溶液で満たし
   た容器に移し、前記容器は硬化完了まで約４８℃から５
   ０℃の温水浴中に保存することから成ることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１５項に記載の方法。 １７、重合溶液が５００ｍｌのメチル−メタクリレート
   、１５ｇの無水過酸化ベンゾイル、１２５ｍｌのノニル
   フェノールとポリエチレングリコールとエチルアセテー
   トの混合物から成る、あるいは、包埋に必要なプラスチ
   ックの合計量によって前記重合溶液の倍量又は分数から
   成ることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の
   方法。