JPH01109261A - 過酸化水素視覚測定用試験組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １哩二立！ 本発明は、概して、過酸化水素の視覚測定用試験組成物
、及び、特に、過酸化水素の異なる濃度において異なる
色相を生成しつる試験組成物並びに試験具に関する。

五里皿 比色試験は、適当なカラーチャートと単純に比較するこ
とによって比較的熟練していない人間が定型的に結果を
得ることができる視覚試験として好都合に用いられてい
る。視覚試験は、装置を必要としないので低コストで便
利なものである６現在、視覚試験は、尿試料を、多数の
診断的に重要な分析対象物に関して定型的にスクリーニ
ングするために用いられている０例えば、かかる試験は
、尿及び血液グルコースを自宅で試験するためのものと
して糖尿病患者に用いられており、視覚試験は、また、
鉄含有量に関する水の試験をはじめとする他の分野にお
いても用いられている。かかる試験の多くは、ペルオキ
シダーゼ及び酸化指示薬の存在下での過酸化水素の検出
に基づくものである。

現在利用されている試験は、通常、分析対象物の濃度に
対する特定の色強度に関連するものである１例えば、試
験具が、グルコースの濃度が増加するにつれて、無色か
ら淡青色、更に暗色がかった青色へ変化する。単一色の
異なる色合又は強度よりも、色域の変化が与えられれば
、より大きな視覚的識別、したがってより高い正確性が
可能となる。したがって、異なる分析対象物濃度におい
て異なる色（色相）を示す試験組成物が、用いるのがよ
り容易であり、これによってより正確な視覚結果が与え
られるであろう。

本発明組成物は、有用な酸化指示薬系を提供し、特に、
対象とする分析対象物を加えてグルコース及びコレステ
ロールのような臨床的に重要な分析対象物を視覚測定す
るために有用である。

ｉ丘ｘ１ 過酸化水素生成機構を用いることによって測定すること
のできる、過酸化水素又は分析対象物の比色測定用の多
くの系が考案されている。グルコース測定の重要性ゆえ
に、多くの検出系において呈色応答を与えるためのグル
コースオキシダーゼとペルオキシダーゼ／酸化指示薬と
の系が開示されている。過酸化水素測定に基づく比色試
験の分野における文献及び特許の範囲及び内容から、公
衆に対して良好な視覚試験を提供するために多くの時間
、努力及び専門的知識が費やされてきたことが示される
。

マエカワらに与えられた米国特許筒４゜１３２．５２７
号は、多成分酸化指示薬の使用を開示した特許の代表例
である。しかしながら、それぞれの指示薬が、異なる視
認される色を有する形態へ酸化される。使用者に観察さ
れる色は酸化指示薬の色が合わさったものである。した
がって、反応した組成物又は試験片のみかけの色は、分
析対象物の濃度が増加するにつれていっそう暗色系のも
のとなる。

Ｆａｕｌｋｎｅｔに与えられた米国特許筒４．２３４゜
３１３号においては、存在する尿酸の量が増加するにつ
れて消色する指示薬組成物を用いた、尿酸測定用試験組
成物が開示されている。好ましい指示薬系は、青色を有
し、尿酸の量が増加するにつれて消色するコンプレック
スヨウ素源；澱粉−Ｉ、である、　ｐＢＨｌｋｎｅｔは
、「ある種の呈色化合物が、酸化によって色の非可逆変
化又は消色を受け、無色生成物を生成する」と主張し、
他の化合物を用いることができると主張しているが、酸
化によって無色になる指示薬に関する実施例は開示され
ていない。

更に、第２の成分を酸化（呈色）形態の指示薬と反応さ
せ、酸化指示薬を還元して無色形態に戻す、呈色指示薬
の生成に基づくいくつかの系が開示されている。　Ｈｏ
ｃｈｓｔｒａｓｓｅｒに与えられた米国特許筒４，０４
２，３２９号においては、指示薬が無色形態から呈色形
態へ酸化されるが、滴定液によって無色形態に再還元さ
れ得ないような系が開示されている１分析対象物の濃度
が滴定液の濃度よりも大きくなった場合にのみ色が観察
される。

Ｈａｖｉｌｌに与えられた米国特許筒３．００８゜８７
９号においては、グルコースオキシダーゼ及びペルオキ
シダーゼからなる酵素系、過酸化水素及びペルオキシダ
ーゼの存在下でその呈色形態に酸化される第１の指示薬
物質、並びに、選択的に酸化された第１の指示薬によっ
て酸化され、それ自身の特定の色形態をとって配合色を
生成する第２の指示薬を有するグルコース測定用の系が
開示されている。かくして、選択的に酸化された第１の
指示薬物質が、部分的又は完全に、その還元又は無色形
態に戻される。

西独国特許ＤＥ　　３２　４７　８９４号においては、
ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ，又は、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの生成もし
くは消失の下で反応する基質もしくは酵素の測定範囲が
拡大せしめられた、還元ニコチンアデニンジヌクレオチ
ド測定用還元試験系及び試験方法が開示されている。鎖
糸は、異なる電気化学的ポテンシャルを有し、それぞれ
が独立してＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの電子受容体として機能す
る複数の物質を同時に含むことを特徴とする。鎖糸は、
還元系における未反応形態である酸化形態においては青
色を呈し、還元系における反応形態である還元形態にお
いては無色であるジクロロインドフェノールを用いるこ
とを含むと開示されている。酸化指示薬系を与える言及
又は実施例は記載されていない。

どの先行文献においても、それぞれが、ペルオキシダー
ゼの存在下で過酸化水素に対して直接に反応性を有し、
そのうちの少なくとも−が酸化によってその色相を消失
する複合酸化指示薬を用いるは開示又は示唆されていな
い。

穴！し１１畳 本発明は、異なる濃度の過酸化水素に接触した際に異な
る色調を生成しうる、液体試料中の過酸化水素を視覚測
定するための試験組成物、試験具及び試験方法に関する
０反応を受けて過酸化水素を生成する分析対象物を過酸
化水素生成系に加えて測定することもできる。試験組成
物は、液体試料に接触する前（即ち未反応状態）の第１
のみかけの色相、及び、液体試料に接触した後の最終的
なみかけの色相を有する。最終的なみかけの色相は第１
のみかけの色相と視覚的に異なるものである。該組成物
は、過酸化活性な物質及び多成分酸化指示薬系を包含す
る。多成分酸化指示薬系は、少なくとも、第１及び第２
の指示薬成分から成る。第１の指示薬成分は、第１の形
態におけるみかけの色相を有するが、第２の形態に酸化
されると、この色相を消失する。第２の指示薬成分は、
第１の指示薬成分のいずれの形態におけるものとも視覚
的に異なる色相を有する形態に酸化されうるものである
。指示薬成分は、単一の化合物であっでも、指示薬対の
結合体であってもよい、第３の酸化指示薬を加えると有
利である場合がある。

好ましい系においては、指示薬成分が逐次酸化されて一
連の異なる色相［すなわち虹状のもの（以下、虹彩と称
する）］が生成する１分析対象物の存在下で過酸化水素
を生成しつる、分析対象物に特定のオキシダーゼを加え
ることによって、グルコースのような特定の診断対象の
分析対象物を測定することができる。該組成物をキャリ
ア中に包含せしめて乾燥状態の試薬片を製造することが
できる。異なる層に指示薬を画定して、過酸化水素の異
なる濃度において観察される色相間の相違を向上せしめ
ることができる。

ましい　　、気　の 視認による色合わせは簡便な方法であり、高価な装置を
用いることなく、許容しつる正確な分析対象物の濃度測
定を提供しつるものである０通常、反応した試験溶液又
は試験片の１色」を、視認によって、色チャート上に印
刷された色のブロックと色合わせする０色合わせは多く
のファクター、即ち、色に対するある人間と他の人間と
の視覚認識の相違、照明、及び、ラベル片上に印刷され
た乾燥した色の色合いと反応した（即ち濡れ状態にある
）紙又はフィルム試験片において観察される色の色合い
との相違などによって複雑化する。しかしながら、主要
な複雑性は、色ブロックが単一の「色」の明度又は強度
の相違を示したものであることが多いことに帰因する。

１色」は通常用いられている用語であるが、色の概念は
、彩度、明度及び色相のような要素に分けられる。青、
赤又は黄色に「見える」ものといったように、通常、色
相が１色」とみなされている６本明細書においては、「
色相」という用語は論点を明確にするように用いられる
べきである０本発明は色相の変化を意図するものであり
、単に単一の色相の明度又は彩度の変化を意図するもの
ではない。

概して、−の色相が単一の指示薬の−の形態に関連する
。したがって、色相域を生成するためには多数の異なる
指示薬成分又は単一の指示薬成分の複数の形態が必要と
なる。しかしながら、ある色相を除去するための何らか
の方法が行なわれなければ、より多い数の色相が生成す
るにつれて、実際の試験組成物又は器具の最終的な色相
は次第に暗色系になり黒っぽくなってしまう、酸化によ
ってその色相が消失する少なくとも−の指示薬成分を用
いることによって、視覚的に異なる色相の生成が大きく
改良されることが見出された０色相の消失とは、指示薬
の酸化形態が有色状態にあるが未酸化指示薬に対して異
なる色相のものである場合と、酸化形態が無色である場
合の両方を包含する。ここで、「無色」という用語は、
視認される色相を有さないことを意味すると定義される
ものであり、「はぼ無色」という表現は、指示薬の色相
が試験組成物のみかけの色相に対して有効に色添加され
るものではないような微弱な色相を有するものを意味す
ると定義される。

ここで開示されている試験組成物は過酸化水素の測定に
有用なものである。該組成物は多波長能を有する装置と
共に用いることができる。しかしながら、これらは、視
覚試験に特に有用なものであり、このために特に設計さ
れたものである。該試験組成物は、過酸化活性な物質及
び多成分酸化指示薬系から成る。

多成分酸化指示薬系は、少なくとも２種の酸化指示薬成
分から成る。酸化指示薬は、過酸化水素及び過酸化活性
な物質の存在下で酸化されうるものであると定義される
。該試験組成物は、過酸化活性な物質並びに第１及び第
２の指示薬成分からなり、それぞれの指示薬成分は還元
形態にあり、酸化されて測定可能な応答を生成しうるも
のである。第１の指示薬成分（還元体）は、ある色相を
有し、異なる色相（例えば無色）の形態に酸化されうる
ものである。第２の指示薬成分（還元体）は、第１の指
示薬の酸化又は未酸化形態のみかけの色相と視覚的に異
なる色相を有する形態に酸化されうるものである１例え
ば、第１の指示薬成分（還元体）が、青色であり、第２
の指示薬成分（還元体）が無色である場合、未反応試験
組成物のみかけの色相は青色である。試験組成物と試料
との接触後、過酸化水素が存在していると両方の指示薬
が酸化され、過酸化水素（又は分析対象物）の濃度、指
示薬の反応の進行度合及び過酸化水素の濃度に関連する
指示薬成分の濃度に依存して青色と異なる色相が生成す
る。

反応が進行し、過酸化水素の濃度が全ての指示薬分子を
酸化するのに十分なもめであり、第２の指示薬成分Ｃｔ
（還元体）が酸化される前に、第１の指示薬成分Ｃ＋（
還元体）が完全に又は実質的に完全に酸化されると、劇
的な色変化が得られる０例えば、Ｃ，（青色）がＣｏｌ
（無色）に酸化され、ｃｍ（無色）がＣ′３（赤）に酸
化される場合、試験組成物のみかけの色相は青色であり
、反応後のみかけの色相は赤である。これによって青色
から赤への色相の明確な変化が得られ、これによって、
青色の色合いの変化によるよりも極めて容易に使用者が
測定することができる。過酸化水素の濃度が低いと、反
応した試験組成物のみかけの色相は無色である。それぞ
れの指示薬の反応度合がある程度型なると、即ち、第２
の指示薬成分の酸化が開始するまえに、第１の指示薬の
全部が酸化されない場合、過酸化水素のある濃度におい
て、酸化及び還元形態の指示薬成分の混合物が紫又は他
の色相を生成せしめる。それぞれが、過酸化水素の存在
下で酸化されて、反応した試験組成物のみかけの色相中
において測定可能な変化を生成せしめうる更なる指示薬
成分を用いることによって更なる色相を生成させること
ができる。

それぞれの指示薬成分は単一の化合物でありでも結合指
示薬対を形成する化合物の対であってもよい、第１の酸
化指示薬の選択は特に重要である。酸化は、通常、指示
薬の複雑性を増し、その増加は、通常、色の存在に関連
するものであるので、酸化によって消色する指示薬の数
は、還元によって無色になる指示薬の数よりも大きく制
限される。しかしながら、利用することのできる染料の
数は非常に大きく、定常的に増加している。かかる指示
薬を用いて得ることのできる特に有利な結果の知識、及
びここで示す指針によって、更に多くのかかる指示薬を
見出すことができる。

アシッドブラック　［Ａｃ１ｄ　Ｂｌａｃｋ）　　１、
即ち、次式： を有する４−アミノ−５−ヒドロキシ−３−（ｐ−ニト
ロフェニルアゾ’）−６−（フェニルアゾ）−２，７−
ナフタレンジスルホン酸のジナトリウム塩は特に好まし
い第１の酸化指示薬成分である。

この化合物は還元形態において青色であり、酸化形態に
おいて無色である。アシッドブラックｌの代わりに、酸
化によって、酸化形態の色相の寄与が、単独で酸化され
ると極めて微弱な色相として観察されるが、反応した試
験組成物の色相に対して影響を与えないようなほぼ無色
状態となる複数の他の指示薬が見出されている。これら
の中で、ニトロレッド、アシッドオレンジ８、アシッド
レッドｌ及びアシッドレッド４が挙げられる。

これらの還元及び酸化形態の色相を表１に示す。

これら指示薬の構造は、全て、実施例中の注釈欄におい
て示す。

紅 酸化によって無色になる好適な化合物の構造は、連鎖、
次式： ［式中、Ｍは、ＨｌＯＨ，ＮＨ，又はＮＨアセチルであ
り： Ｐは、ＮＨＮ又はＯＨであり； Ｚｌ及びＺ８は、独立して、Ｈ又は−５Ｏ８Ｈあるいは
その塩から選択されるものであり：Ｙは、Ｈ又は置換フ
ェニルアゾ環であり；Ｘは、Ｈ又は置換基（ＯＣＨｓ及
びＮＯ□が好ましく−ＮＯ□が特に好ましい）である］
によって示されるように、フェノール又はアミン基に対
してオルト位のジアゾ基を有するナフタレン環を含むも
のである。

アシッドブラック１の場合、ＭはＯＨであり、ＰはＮＨ
！であり、ＸはＮｏｔであり、Ｚ、及びＺ２はＮ　ａ　
Ｓ　Ｏｓ−であり、Ｙはフェニルアゾ環である。

アシッドイエロー３４のような、酸化によってほぼ無色
になる他の指示薬を用いることもできる。

指示薬成分の色相はｐＨに依存する。したがって、ある
場合においては、緩衝物質を加えることによって試験組
成物のｐＨを制御することが望ましい。

第２の、及び場合によっては第３又は第４の指示薬成分
として用いることのできる化合物は極めて多い、酸化に
よって色相の変化を示す指示薬としては、単一及び結合
指示薬が挙げられる。これらとしては、酸化指示薬の大
部分を構成する、無色から異なる色相を有する形態に酸
化される指示薬、並びに、ある色相から他の色相へ酸化
される指示薬（色変化指示薬）を挙げることができる。

単一タイプの指示薬の例としては、３．３°。

５．５°−テトラメチルベンジジン、０−トルイジン及
びグアギクゴム（ｇｕｍ　ｇｕａｉｃ）が挙げられ、有
用な結合指示薬としては、４−アミノアンチ上０リンと
、２−メチルインドール、４．５−ジクロロ−２−ヒド
ロキシベンゼンスルホネート（ＤＣＨＢＳ）又はＣＮ５
Ｐとの系が挙げられる。

第２の指示薬成分に関しては、６無色の還元形態から、
黄色、赤又は青のような濃い原色を有する酸化形態へ色
相が変化することが好ましい、試験組成物が、青色から
無色に酸化されうる第１の指示薬、及び、無色から黄色
、及び無色から赤に酸化されうる第２及び第３の指示薬
を含んでいることが最も好ましい、未反応の場合に青色
であり、過酸化水素の予め定められた濃度において、緑
、黄色、橙色及び赤のみかけの色相を有する試験組成物
によって酸化虹彩が生成する。

試験組成物中の過酸化活性な物質は、好ましくは、西洋
ワサビ及びジャガイモのような天然源から得られるペル
オキシダーゼである。ヨウ化カリウム及びモリブデン酸
ナトリウムの混合物、並びに、ナトリウム及びアンモニ
ウムのヨウ化物のような他のヨウ化物とカリウム及びア
ンモニウムモリブデン酸塩のような他のモリブデン酸塩
との混合物のような、ペルオキシダーゼ活性を有する無
機化合物をはじめとする過酸化活性を有する他の物質を
用いることもできる。更に、ウロヘミン及び過酸化活性
を有する多数の他のポルフィリン物質を用いることがで
きる。２−アミノベンゾチアゾール、ピリジン、ビピリ
ジル、ビピリジルピリジン、ニコチン酸などのような、
メタロポルフィリンを活性化するがそれ自体作用性を有
さない種々のコンプレックス形成化合物をこれらと共に
用いることができる。酵素ではないが過酸化活性を有す
る他の物質としては、鉄スルホシアネート、タンニン酸
鉄、第１鉄フエロシアニド、カリウム第２クロムスルフ
エートなどのような化合物が挙げられる。

また、緩衝剤、界面活性剤及び安定化剤のような更なる
成分を組成物に加えることもできる。

ｐＨを調節する、つまり緩衝物質を加えることによって
指示薬成分の特定形態の色相を決定することができる０
例えば、アシッドオレンジ８は、ｐＨ７，５においては
橙色から薄淡黄色に酸化されるが、ｐＨ９，５において
は（淡）黄色に酸化される。ニトロレッドは、ｐＨ７，
５においては紫から薄褐色に酸化されるが、ｐＨ９，５
においては薄青褐色に酸化される。所望の色相域を得る
ためには、あるｐＨ条件が他の条件よりもより好ましい
場合がある。多くの緩衝物質が当業者に公知であり、ペ
ルオキシダーゼ及び過酸化水素が指示薬成分を酸化する
作用に障害を与えなければこれらを用いることができる
。

分析対象物に特定のものであり、分析対象物の存在下で
過酸化水素を生成しうるオキシダーゼを加えることによ
って、本試験組成物を用いて診断対象の多くの分析対象
物を測定することもできる。特定の対象となる分析対象
物及びこれらに対応するオキシダーゼを下表２に示す。

表２ 分析対象物　　　　　　　　　　　　　オキシダーゼ反
　　応 グルコース　　　　　　　　　　　グルコースオキシダ
ーゼＧ。

グルコース十Ｈａ　Ｏ＋Ｏ＊　　−グルコン酸＋Ｈ８０
２アルコール　　　　　　　　　　　アルコールオキシ
ダーゼＯＤ Ｃｚ　Ｈｓ　ＯＨ＋　Ｏ□　　　　→　　ＣＨｓＣＨＯ
＋Ｈ＊Ｏヨコレスチロール　　　　　　　　　コレステ
ロールオキシダーゼコレステロールオキシターぜ コレステロール＋Ｏ２→　コレスト−４−エン−３−オ
ン十Ｈ＊Ｏ＊他の成分を試験組成物の更なる成分として
必要とする場合がある。しかしながら、これらの反応及
び試験組成物及び乾燥形態の試験具におけるこれらの使
用は当該技術において公知なものである。試験組成物の
好ましいｐＨは、オキシダーゼ酵素に必要なｐＨによっ
て決定されることが多い、この点から、色相における所
望の変化を得るために適当な酸化指示薬成分を選択しな
ければならない。

組成物を溶解して試験溶液を調製することも、担体マト
リクス中に包含せしめて試験具構成品を製造することも
できる。どちらの形態を用いても、体液中の過酸化水素
の存在を検出するか、又は、成分を試験組成物に加えて
分析対象物から過酸化水素を生成させて対象とする他の
いくつかの分析対象物の存在を検出することができる。

試験溶液を製造する簡便な方法を実施例に示す、それぞ
れの成分をそれぞれの試薬成分の別々の溶液中に溶解す
るか、結合対のそれぞれの成分を調製する。ペルオキシ
ダーゼ及び好適なオキシダーゼを含む酵素溶液を調製す
る０次に、それぞれの指示薬及び酵素溶液のアリコート
を混合して試験溶液を調製する。

指示薬成分の濃度比は、測定す″べき分析対象物の濃度
範囲及び予め決定された最も有効な濃度点に依存する０
例えば、極めて低い濃度の分析対象物（青）に対して、
「通常」の臨床範囲においては緑、高い又は危険な濃度
においては赤又は橙色の色相が生成することが好ましい
、これは、ここで開示されている定常的な実験及び本実
施例において与えられている指針によって行なうことが
できる。訓練されていない素人が容易に特定の試験の結
果を測定できるようになることに加えて、医師が色相の
変化を基にして素人に簡単に指示を与えることができる
ようになる。

試験組成物を、溶液又は混合すべき溶液の組から成る試
験キットとして提供することができる。

しかしながら、乾燥形態の試験片がよく知られたもので
あり、有用な形態を提供するものである。

乾燥試験片を製造するために用いる担体マトリクスは、
該マトリックスが組成物を包含せしめうるものであり、
色生成に必要な反応に障害を与えないものであれば工業
界において周知のいかなるものであってもよい、これら
としては、紙：天然ポリマー、ラテックス、ポリウレタ
ン、シリコーン又はこれらの配合物から製造されるもの
のようなフルム：及び、ポリウレタンから凝固法によっ
て製造さｈるもめのような微孔性膜などの膜が挙げられ
る。

紙のような予め成形されている担体に、噴霧、印刷又は
浸漬によって試験組成物を包含せしめることができる。

浸漬が好ましい方法であり、通常は含浸法と呼ばれてい
る。また、これらの技術によって膿に１種又は複数の試
験組成物を包含させることもできる。これらの膜は、膜
を製造する際に、膜内に均一に分布させながら１以上の
成分を加えることができるという更なる有利性を有する
０通常、膜の製造中に１以上の指示薬を加えた後、酵素
及び１ａ衝剤のような他の成分を包含せしめることによ
って、最も好ましくは含浸せしめることによって加える
ことが好ましい。

紙又は膜担体を、両面接着剤によって剛性の基材又は支
持部材上に載置することができる。また、膿又はフィル
ムを支持体上で直接成形することもできる。かかる支持
体は、通常、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレ
ン、ポリエステルなどのような水不透過性剛性ポリマー
フィルムである。かかる試験に必要な試薬領域が非常に
小さいので、支持体によりて使用者のための簡単な柄部
が形成される。基材は不透明であっても透明であっても
よいが、視覚読取り試験のためには不透明な白色の基材
が好ましい、試験具に更なる層を加えて、読取り前に表
面から赤血球の拭き取り又は除去を行なわせしめてもよ
い、これは、赤血球を炉取してそれを拭き取ることが出
来るか、又はその層自体を除去することの出来るポリマ
ー被覆又は更なる層によって行なうことができる。

指示薬成分を多層試験具中の分離層において単離するこ
とができる。かかる層は、公知の技術によって紙製膜上
にも、あるいはフィルムとしても製造することができる
。これによって、更なる色相違を与え、最終的な器具に
おける色相の呈色度合を制御する簡便な方法を与えるこ
とができる。

多層ゼラチンフィルムマトリックスがこの目的で特に好
ましいことが見出された。

この記載によって、過酸化水素の異なる濃度において視
覚的に異なる色相を生成する、過酸化水素又は診断分析
対象物の測定用試験組成物又は試験具を製造するための
十分な情報が与えられる。

過酸化水素を、オキシダーゼ系によって、臨床的に重要
な多くの分析対象物から生成せしめることができる０本
発明は、少なくとも二つの指示薬成分を用いることを必
要とする。第１の指示薬成分は、その色相を、酸化によ
って、無色の形態か、又は、少なくとも異なる色相のも
のに消失するものでなければならない、第２の指示薬成
分も、その色相を、例えば、無色の還元形態から、異な
る、比較的濃い色相のものに変化するものでなければな
らない、生成される色相は、用いることのできる酸化指
示薬成分の数と同じたけ変化する。

組成物の最終的なみかけの色相もまた。指示薬成分の相
対的な濃度による。この事実を用いて、用いることので
きる色相の範囲、及び分析対象物の濃度をシフトさせ１
色相におけるシフトを明確にすることができる。

本発明を実施例によって示す、しかしながら、特許請求
の範囲によって定義された発明の範囲をこの実施例によ
って制限するものではない、当業者であれば、開示され
た多くの変化を行なうことができるであろう。

衷鳳困 置皿 ＨＥＰＥＳ　　　　　　緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−Ｎｏ−２−エ タンスルホン酸 ＴＡＰＳＯ緩衝剤、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミ ノ）−２−ヒドロキシプロパン スルホン酸 ＴＲｌ５　　　　　　　Ｉｆｒｒ剤、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン （ｔｒｉｓｌ　ｘｓｏ、　　　　硫酸によって、与えら
れたｐＨに調節されたＴＲｌ５緩衝剤 Ｔｒｉｔｏｎ■Ｘ−１００界面活性剤、　Ｓｉｇｍａ　
ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、から入手したポリオキシエ チレンエーテル Ｕ　　　　　　国際単位、酵素活性の尺度（ＩＵは、特
定の濃度及びｐＨ 条件下における、１分あたり の、基質１マイクロモルの転化 に触媒効果を与えるのに必要な 酵素活性） Ｍｅ　　　　　　　　メチル ＰＯＤ　　　　　　　ペルオキシダーゼＧＯグルコース
オキシダーゼ ＡＯＤ　　　　　　　アルコールオキシダーゼＰＥＴ　
　　　　　　　ポリエチレンテレフタレートｄ１　　　
　　　　　デシリットル −ミリリットル μ　　　　　　　マイクロリットル ｇ　　　　　　　グラム μ　　　　　　　ミクロン ＲＴ　　　　　　　　室温、通常２５℃ＭＷ　　　　　
　　　分子量 表土 φ　　　　　　　色相が視覚的に異なる＝　　　　　　
　色相が視覚的に識別できない負１す組紐 ＯＲ橙色 Ｒ赤色 Ｐｋ　　　　　　　　桃色 Ｂｌ　　　　　　　　青色 Ｂｒ　　　　　　　　褐色 Ｇｎ　　　　　　　　緑色 Ｇｒ　　　　　　　　灰色 Ｍａｕ　　　　　　　紅紫色 Ｙ　　　　　　　黄色 Ｌ　　　　　　　明色 化豆曳辺亙１ ４ＡＰ　　　　　　　４−アミノアンチピリンＤＣＨＢ
Ｓ　　　　　　３．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベン
ゼンスルホネート 直ヱ週 ニトロレッド（化合物４） アシッドオレンジ（化合物６） ｏ３Ｎａ アシッドレッド１ アシッドレッド４ Ｍｅ アシッドイエロー３４ ＣＮＳＰ（ＲＮＧ−３６０８１：　３−カルボキシ−４
−［４”−（２”　−Ｎ−４−（２”’、４”’−ビス
ーｔｅｒｔ−アミルーフェノキシ）ブチルカルバモイル
）１”−ヒドロキシナフチルオキシフェニルアゾ）−ｉ
−スルホフェニル−５−ピラゾロン １−（４−フェノキシ−３−スルホフェノキシ’）　−
３−（オクタデカミド）−５−ピラゾロンＮ、Ｎ−ジフ
ェニル−ｐ−フェニレンジアミン（化合物１） １−ヒドロキシ−４−（２°−Ｎ’−トリル−Ｎ−スル
ファモイルアミン）フェニルアゾ−２−Ｎ−（２”−Ｎ
”−メチル−Ｎ”−オクタデシル）フェニルナフトアミ
ド（化合物２）Ｎ−［２°−才クタデシルオキシ−５−
（Ｎ−メチルスルファそイル）］］フェニルー２−４−
メトキシ）ベンゾイルアセトアニリド（化合物３）鴫 異なる多成分酸化指示薬系を有する、過酸化水素の濃度
の増加に応答して異なる色相を生成しつる二種の試験組
成物を調製した。試験組成物を、過酸化水素を添加した
溶液として試験した。比色を容易にするために、反応溶
液のアリコート（３０１）を平らな白色紙上に施した。

終了点に約２〜４分で達した。

Ａ、　有色状態から無色状態に変化する第１の指示薬成
分としてニトロレッド、第２の指示薬成分として２−ア
ミノ−３−ヒドロキシ−５−ブロモピリジンを用いて多
成分酸化指示薬系を調製した。ニトロレッドは、過酸化
水素及びペルオキシに酸化される。第１の指示薬成分自
身が酸化されると酸化形態が認められるが、生成する色
は非常に弱いので、多成分指示薬系の視認される色への
寄与度は、あったにしてもほとんどないようなものであ
る。第２の指示薬成分は無色から強い黄色に酸化される
。

これら二種の成分の溶液を過酸化水素試験用に調製した
１表３）、試験溶液には、緩衝剤・（ｔｒｉｓｌｚｓｏ
、、　　０．　１　Ｍ、　ｐＨ８，５及びペルオキシダ
ーゼ（２０Ｕ／ｍｌ’）も含有させた。過酸化水素を試
験溶液のアリコートに加え、終了点に約２〜４分で到達
した後に、それぞれの反応済溶液３０μを吸収）戸紙の
平らな片に施し、生成した色相を比較した。

これらの溶液によって、過酸化水素の濃度の増加に対応
した色相域、即ち、低濃度においては青、中濃度におい
ては緑、高濃度においては黄色が観察された。

Ｂ、　第１の指示薬成分としてアシッドオレンジ８（化
合物６）、並びに、第２の指示薬成分を形成する化合物
１及び７の結合指示薬対を用いて第２の多成分酸化指示
薬系を調製した。アシッドオレンジ８（化合物６）は、
過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在下で強い橙色か
ら極めて弱い黄色又は淡黄色に酸化される。酸化形態の
色相は、単独に酸化されて白色の背景付近に配置された
場合は視覚的に識別することができるが、色相は非常に
弱いので、他の呈色指示薬と組み合わせている場合は視
覚識別に対する寄与はあったとしてもほとんど無いよう
なものである。化合物７は、化合物１、過酸化水素及び
ペルオキシダーゼの存在下で無色形態から赤紫色に酸化
される。Ａに示したのと同様に試験溶液を調製し試験し
た。

結果を下表４に示す。最終的な色相は異なるが同様の相
違が得られた。

実五ｌｌｚ 過酸化水素生成系としてグルコースオキシダーゼを用い
て、グルコースの異なる濃度において異なる色相を与え
うるグルコース測定用試験具を調製した。

試験溶液は、グルコースオキシダーゼ（５０Ｕ／ｄ）　
、ペルオキシダーゼ（５０Ｕ／ｍｌ’）ＴＡＰＳＯ（ｐ
　Ｈ８、５，２０ｍＭ）及びポリビニルアルコール（８
８％加水分解、ＭＷ　　１０，０００．１．５ｗ／ｗ％
）、並びに指示薬成分として化合物ｌ、２及び３を含ん
でいた。化合物２（赤−桃色）は、過酸化水素及びペル
オキシダーゼの作用によって化合物ｌと酸化的に結合す
ると藍色の色相を生成する。同様に、化合物３（無色）
は化合物ｌと酸化的に結合すると黄色を生成する。用い
る指示薬成分の比を表５に示す。

Ｗｈａｔｍａｎ　３１ＥＴ？Ｐ紙を上記溶液中に浸漬し
て乾燥した。　ｔＰ紙を片に切断し、（ｔｒｉｓ）　１
ｓＯ４，０，１Ｍ、ｐＨ８，５によって緩衝されたグル
コース溶液によって試験した。

終了点の色相は約１０分間で得られ、これも表中に示し
た。

得られる色相は、化合物２及び３の比を変えることによ
って変化させることができた０例えば、ＩＩｊＭのレベ
ルにおいては、０Ｒ−ＰＫ　、　ＯＲ，０Ｒ−ＢＲ又は
Ｇｎ−Ｍａｕの色相を生成させることができた。更なる
指示薬を加えることによって、禮色、黄褐色及び褐色が
加えられた０表３に示した最後の実験は比較例である。

実験によって、試験試料中のグルコースの濃度の増加に
相関させることのできる異なる色相を生成させることが
できることが示された。これらの色相は、同一の色相の
強度又は階調の変化よりも、より容易に識別することが
できる。みがけの色相が視覚的に識別できなくなるほど
暗色系にはならないので、高濃度をより容易に測定する
ことができる。

アシッドブラックｌは、還元形態では青色であり、過酸
化水素及びペルオキシダーゼの存在下で酸化されると無
色であるので、好ましい第１の指示薬成分である。この
化合物によって、グルコースの濃度に対応した虹彩の色
相を生成しつる多重指示薬系に関する出発点が与えられ
た。青から緑へ、更に赤へという異なる色相の生成によ
って、糖尿病患者のための最も良好な視覚識別法が提供
されるので、この結果は特に好ましいものである。

Ａ、　試験組成物を、第１の指示薬成分、アシッドブラ
ック１、第２の指示薬成分、３．５−ジクロロ−２−ヒ
ドロキシベンゼンスルホネート（ＤＣＨＢＳ）−及び４
−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）、並びに、第３の指
示薬成分、２−メチルインドール及び４−アミノアンチ
ピリンと配合した。酸化によってこれらの指示薬から得
られる色相の変化を以下に示す。

試験組成物を次のようにして調製した。

【含惣ニ アシッドブラック１　　　　　　　　　　６０ｍｇ４−
ＡＰ　　　　　　　　　　　　　　　３６５ｍｇＤＣＨ
Ｂ３　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇＨ２Ｏで全
量を１００−とじた。

区立璽ｌ グルコースオキシダーゼｆ１２２１　Ｕ／ｍｔ’）　　
２０　ｄペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　Ｉｇ
藍豆惣ユ 配合物１　　　　　　　　　　　　　　２−配合物２　
　　　　　　　　　　　　　２−４−ＡＰ　（１０−”
Ｍ）　　　　　　　　　　ｌＷｄ！２−メチルインドー
ル（１０−”Ｍ）　　　　　１ｍＺ玉刊 配合物３１００ｇｆｆを、異なる濃度のグルコースを含
有する水溶液１００μと混合した。２分後、それぞれの
溶液のアリコートを濾紙片上に配置することによって試
験溶液の色相を測定した。

グルコースの濃度が増加すると異なる色相が生成した。

Ｂ、　上記配合物１及び２、並びに異なる第３の指示薬
成分、ＣＮ５Ｐをベースとして溶液の第２の組を調製し
た。この指示薬は、還元形態の黄色から酸化形態の赤に
変化した。したがって、グルコースが存在していなかっ
た場合の組成物の色相は緑であり、酸化によって生成し
た色相は実施例３Ａにおいて観察されるものとは異なっ
ていた。しかしながら、この組成物によっても視覚的に
異なる色相が得られた。

胆倉膣Ａ 配合物１　　　　　　　　　２− 配合物２　　　　　　　　　２− ４−ＡＰ　（１０−”Ｍ）　　　　　２１ｎｌＣＮＳＰ
　（１０”Ｍ）　　　　　２１ｄｌ１厘 配合物４１００−を、異なる濃度のグルコースを含有す
る水溶液１００７ｄと混合した。１〜２分後、Ａと同様
に溶液の色相を測定した。

ここでも、容易に識別しうる色相がグルコースの広範囲
の濃度にわたって生成した。

明らかに、上記に示した本発明の多くの修正及び変更を
、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行なうこ
とができ、したがって、添付の特許請求の範囲によって
示されたような制限のみが課せられるべき゛である。

手続補正書 昭和６３年１０月１４日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第２２４８８４号 ２、発明の名称 名　称　マイルス・インコーホレーテッド４、代理人 ６、補正の対象　　明＊＊の特許請求の範囲の欄７、補
正の内容　　別紙のとおり 特許請求の範囲 １、　液体試料と接触する前の第１のみかけの色相、及
び液体試料と接触した後の最終的なみかけの色相とを有
し、最終的なみかけの色相が第１のみかけの色相と視覚
的に異なるものである組成物を含む、液体試料中の過酸
化水素を視覚測定するための試験組成物であって、 （ａ）　　過酸化活性な物質、及び （ｂｌ　　多成分酸化指示薬系とを含み：多成分指示薬
系が、それぞれが過酸化水素及び過酸化活性な物質の存
在下で酸化されうる少なくとも第１及び第２の酸化指示
薬成分からなり：第１の指示薬成分が、あるみかけの色
相を有する形態から異なる色相を有する第２の形態へ酸
化されうるものであり、第２の指示薬成分が、第１の指
示薬の第２の形態と視覚的に異なる色相を有する形態へ
酸化されうるものであり； それにより、反応した組成物の最終的なみかけの色相に
よって過酸化水素の異なる濃度において異なるみかけの
色相が与λられることを特徴とする組成物。

２、　多成分酸化指示薬系が、更に、過酸化水素及び過
酸化活性成分の存在下で酸化されて呈色応答を与えうる
第３の酸化指示薬を含んでなる請求項１記載の試験組成
物。

３、　第１の指示薬成分が、ある色相から無色又はほぼ
無色状態に酸化されうるものであり、次式： （式中、ＭはＨｌＯＨ，ＮＨ，又はＮＨアセチルであり
； ＰはＮＨ，又はＯＨであり； Ｚ、及びＺ、は、独立して、Ｈ又は−３Ｏ，Ｈあるいは
その塩から選択されるものであり；ＹはＨ又は置換フェ
ニルアゾ環であり：Ｘは−ＮＯオである） の構造を有する請求項１記載の試験組成物。

４、　液体試料と接触する前の第１のみかけの色相、及
び、液体試料と接触した後の最終的なみかけの色相を有
し、最終的なみかけの色相が第１のみかけの色相と視覚
的に異なるものである組成物を含む、液体試料中の過酸
化水素を視覚測定するための試験組成物であって、 （ａｌ　　ペルオキシダーゼ、及び、 （ｂ）　　アシッドブラック１と、少なくとも、過酸化
水素及びペルオキシダーゼの存在下で酸化されて呈色応
答を生成せしめうる第２の酸化指示薬成分とからなる多
成分酸化指示薬系を含み：第２の指示薬成分が、未反応
組成物の第２のみかけの色相と視覚的に異なる色相を有
する形態へ酸化されうるものであり； それにより、反応した組成物の最終的なみかけの色相に
よって過酸化水素の異なる濃度において異なるみかけの
色相が与えられることを特徴とする組成物。

５、　　　（ａ）　　対象とする分析対象物から過酸化
水素を生成せしめうる酵素系： （ｂｌ　　ペルオキシダーゼ：及び、 （Ｃ）　　アシッドブラック１、及び、二種の結合酸化
指示薬成分、４−アミノアンチピリン／２−メチルイン
ドール及び４−アミノアンチピリン／３．５−ジクロロ
−２−ヒドロキシベンゼンスルホネートからなる多成分
指示薬系を含む、液体試料中の分析対象物を視覚測定す
るための試験組成物。

６、　過酸化水素測定用試験具であって、（ａ）　　担
体マトリクス；及び、 （ｂ）　　担体マトリクスに包含せしめられた、ペルオ
キシダーゼ、及び、それぞれが過酸化水素及びペルオキ
シダーゼの存在下で酸化されうる、少なくとも第１及び
第２の酸化指示薬成分から成る多成分酸化指示薬系から
成る試験組成物を含み： 第１の指示薬成分が、あるみかけの色相を有する形態か
ら異なる色相を有する第２の形態へ酸化されうるもので
あり、第２の指示薬成分が、第１の指示薬の第２の形態
と視覚的に異なる色相を有する形態へ酸化されうるもの
であり： それにより、反応した組成物の最終的なみ力）けの色相
によって過酸化水素の異なる濃度にお５Ｎで異なるみか
けの色相が与えられることを特徴とする試験具。

７、　少な（とも−の指示薬成分が積層によって画定さ
れている請求項６記載の試験具。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料と接触する前の第１のみかけ の色相、及び液体試料と接触した後の最終的なみかけの
   色相とを有し、最終的なみかけの色相が第１のみかけの
   色相と視覚的に異なるものである組成物を含む、液体試
   料中の過酸化水素を視覚測定するための試験組成物であ
   って、 （ａ）過酸化活性な物質、及び （ｂ）多成分酸化指示薬系とを含み； 多成分指示薬系が、それぞれが過酸化水素及び過酸化活
   性な物質の存在下で酸化されうる少なくとも第１及び第
   ２の酸化指示薬成分からなり；第１の指示薬成分が、あ
   るみかけの色相を有する形態から異なる色相を有する第
   ２の形態へ酸化されうるものであり、第２の指示薬成分
   が、第１の指示薬の第２の形態と視覚的に異なる色相を
   有する形態へ酸化されうるものであり； それにより、反応した組成物の最終的なみかけの色相に
   よって過酸化水素の異なる濃度において異なるみかけの
   色相が与えられることを特徴とする組成物。 ２、多成分酸化指示薬系が、更に、過酸化 水素及び過酸化活性成分の存在下で酸化されて呈色応答
   を与えうる第３の酸化指示薬を含んでなる請求項１記載
   の試験組成物。 ３、更に緩衝物質を含む請求項１記載の試 験組成物。 ４、過酸化活性な物質がペルオキシダーゼ である請求項１記載の試験組成物。 ５、更に、液体試料中の分析対象物から過 酸化水素を生成せしめうる酵素系を含む請求項１記載の
   試験組成物。 ６、酵素系がオキシダーゼを包含する請求 項５記載の試験組成物。 ７、第１の指示薬がアシッドブラック （ａｃｉｄ　ｂｌａｃｋ）１である請求項１記載の試験
   組成物。 ８、第１の指示薬成分が、ある色相から無 色又はほぼ無色状態に酸化されうるものであり、次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＭはＨ、ＯＨ、ＮＨ＿２又はＮＨアセチルであ
   り； ＰはＮＨ＿２又はＯＨであり； Ｚ、及びＺ＿２は、独立して、Ｈ又は−ＳＯ＿３Ｈある
   いはその塩から選択されるものであり；ＹはＨ又は置換
   フェニルアゾ環であり； Ｘは−ＮＯ＿２である） の構造を有する請求項１記載の試験組成物。 ９、液体試料と接触する前の第１のみかけ の色相、及び、液体試料と接触した後の最終的なみかけ
   の色相を有し、最終的なみかけの色相が第１のみかけの
   色相と視覚的に異なるものである組成物を含む、液体試
   料中の過酸化水素を視覚測定するための試験組成物であ
   って、 （ａ）ペルオキシダーゼ、及び、 （ｂ）アシッドブラック１と、少なくとも、過酸化水素
   及びペルオキシダーゼの存在下で酸化されて呈色応答を
   生成せしめうる第２の酸化指示薬成分とからなる多成分
   酸化指示薬系を含み；第２の指示薬成分が、未反応組成
   物の第２のみかけの色相と視覚的に異なる色相を有する
   形態へ酸化されうるものであり； それにより、反応した組成物の最終的なみかけの色相に
   よって過酸化水素の異なる濃度において異なるみかけの
   色相が与えられることを特徴とする組成物。 １０、更に、液体試料中の分析対象物から過酸化水素を
   生成せしめうる酵素系を含む請求項９記載の試験組成物
   。 １１、（ａ）対象とする分析対象物から過酸化水素を生
   成せしめうる酵素系； （ｂ）ペルオキシダーゼ；及び、 （ｃ）アシッドブラック１、及び、二種の結合酸化指示
   薬成分、４−アミノアンチピリン／２−メチルインドー
   ル及び４−アミノアンチピリン／３，５−ジクロロ−２
   −ヒドロキシベンゼンスルホネートからなる多成分指示
   薬系を含む、液体試料中の分析対象物を視覚測定するた
   めの試験組成物。 １２、過酸化水素測定用試験具であって、 （ａ）担体マトリクス；及び、 （ｂ）担体マトリクスに包含せしめられた、ペルオキシ
   ダーゼ、及び、それぞれが過酸化水素及びペルオキシダ
   ーゼの存在下で酸化されうる、少なくとも第１及び第２
   の酸化指示薬成分から成る多成分酸化指示薬系から成る
   試験組成物を含み； 第１の指示薬成分が、あるみかけの色相を有する形態か
   ら異なる色相を有する第２の形態へ酸化されうるもので
   あり、第２の指示薬成分が、第１の指示薬の第２の形態
   と視覚的に異なる色相を有する形態へ酸化されうるもの
   であり； それにより、反応した組成物の最終的なみかけの色相に
   よって過酸化水素の異なる濃度において異なるみかけの
   色相が与えられることを特徴とする試験具。 １３、少なくとも一の指示薬成分が積層に よって画定されている請求項１２記載の試験具。 １４、第１の指示薬成分がアシッドブラック１である請
   求項１２記載の試験具。