JPS6152292A - クロン化プレアルブミンｄｎａ - Google Patents
クロン化プレアルブミンｄｎａInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はクロン化プレアルブミンＤＮＡに関するもので
あり、更に詳しくは肝において生産されるプレアルブミ
ンをコードする遺伝子に由来するクロン化ＤＮＡ、との
クロン化ＤＮＡの挿入された。くみかえＤＮＡプラスミ
ド及びこのプラスミドを有する微生物並びにその製造法
に関するものである。
あり、更に詳しくは肝において生産されるプレアルブミ
ンをコードする遺伝子に由来するクロン化ＤＮＡ、との
クロン化ＤＮＡの挿入された。くみかえＤＮＡプラスミ
ド及びこのプラスミドを有する微生物並びにその製造法
に関するものである。
ヒトプレアルブミンは肝で生産される血清タンパク質で
あシ２分子量約１４，０００ダルトンを持つ単一のサブ
ユニット４個から成っている。その機能は必ずしも明確
ではないが、ビタミンＡの輸送タンパクであるｒｅｔｉ
ｎｏｌ結合タンパクと複合体を形成すること、また甲状
腺（ｔｈｙｒｏｉｄ ） から放出されるホルモンで
あるチロキシンの約１５％と結合していることが知られ
ている。
あシ２分子量約１４，０００ダルトンを持つ単一のサブ
ユニット４個から成っている。その機能は必ずしも明確
ではないが、ビタミンＡの輸送タンパクであるｒｅｔｉ
ｎｏｌ結合タンパクと複合体を形成すること、また甲状
腺（ｔｈｙｒｏｉｄ ） から放出されるホルモンで
あるチロキシンの約１５％と結合していることが知られ
ている。
１９７８年に遺伝性の家族性アミロイド−シスポリニュ
ーロバチ−（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉ
ｓ ｐｏｌｙ −ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ （ＦＡＰ）
） （厚生省難病指定〕の患者において、末梢神経部
に沈着したアミロイドせんい中に異常なプレアルブミン
が見い出された。りンパク構造の解析より、この疾患の
患者は一部のアミノ酸の置換したプレアルブミン分子を
持つことが示され２日本、スウェーデンタイプでは３０
番目のＶａｌがＭｅｔに、イスラエルタイプでは４９番
目のＧＩｙがＴｈｒに置換していることが示された。こ
の疾患は常染色体上の優性遺伝であることが知られてお
シ、４０歳前後に発病し、現在有効な治療法はなく１０
年程度のうちに死亡するが。
ーロバチ−（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉ
ｓ ｐｏｌｙ −ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ （ＦＡＰ）
） （厚生省難病指定〕の患者において、末梢神経部
に沈着したアミロイドせんい中に異常なプレアルブミン
が見い出された。りンパク構造の解析より、この疾患の
患者は一部のアミノ酸の置換したプレアルブミン分子を
持つことが示され２日本、スウェーデンタイプでは３０
番目のＶａｌがＭｅｔに、イスラエルタイプでは４９番
目のＧＩｙがＴｈｒに置換していることが示された。こ
の疾患は常染色体上の優性遺伝であることが知られてお
シ、４０歳前後に発病し、現在有効な治療法はなく１０
年程度のうちに死亡するが。
上記の研究よシ、患者の持つ異常なプレアルブミン遺伝
子よシ生産される異常なプレアルブミンが。
子よシ生産される異常なプレアルブミンが。
他の血中タンパクを伴って末梢神経に沈着するととが主
要因と判断された。
要因と判断された。
従って本発明にかかわるプレアルブミン遺伝子の分離・
同定は、以下のような面に有用である。
同定は、以下のような面に有用である。
即ち■ＦＡＰ患者家族、家系のＤＮＡ診断を可能にする
。即ち血中又は羊水中よシ抽出したＤＮＡを用いて、プ
レアルブミン遺伝子中の異常を、この分離したｃＤＮＡ
をプローブとして容易に検出できる。このことによりＦ
ＡＰの予知が可能となシ。
。即ち血中又は羊水中よシ抽出したＤＮＡを用いて、プ
レアルブミン遺伝子中の異常を、この分離したｃＤＮＡ
をプローブとして容易に検出できる。このことによりＦ
ＡＰの予知が可能となシ。
臨床面での早期の対応が可能となる。■分離したプレア
ルブミン遺伝子（ｃＤＮＡ）を用いて正常なプレアルブ
ミンを大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞々どで大量に生
産させ、ＦＡＰ患者に薬剤として投与することにより、
異常プレアルブミンの沈着を抑制させることが期待でき
る。一方、プレアルブミン投与により、ビタミンＡ、チ
ロキシンの機能制御も可能と々る。また免疫能力の落ち
た動物に対して、免疫能力の増強剤としても使用できる
。
ルブミン遺伝子（ｃＤＮＡ）を用いて正常なプレアルブ
ミンを大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞々どで大量に生
産させ、ＦＡＰ患者に薬剤として投与することにより、
異常プレアルブミンの沈着を抑制させることが期待でき
る。一方、プレアルブミン投与により、ビタミンＡ、チ
ロキシンの機能制御も可能と々る。また免疫能力の落ち
た動物に対して、免疫能力の増強剤としても使用できる
。
医薬２診断薬として有用なプレアルブミンを効率よく製
造することは重要々課題である。本発明者らは生体由来
のプレアルブミンを遺伝子操作の手法により製造するべ
く、プレアルブミンまたはその前駆体である蛋白質の鋳
型となるクロン化されたＤＮＡを含むプラスミドを調製
することを企だて、それに成功し本発明を完成した。即
ち遺伝のの遺伝子クローニングには最近、ｐＢＲ３２２
とＳＶ４０のバイブリドＤＮＡブライマーにｍＲＮＡを
アニールした型でｃＤＮＡを合成し、つづいてリンカ−
ＤＮＡを用いて閉環させたのち閉環プラスミド上で二本
鎖目の合成を行なうことで、長いｃＤＮＡを効率良く得
たことが報告されている（Ｏｋａｙａｍａ。
造することは重要々課題である。本発明者らは生体由来
のプレアルブミンを遺伝子操作の手法により製造するべ
く、プレアルブミンまたはその前駆体である蛋白質の鋳
型となるクロン化されたＤＮＡを含むプラスミドを調製
することを企だて、それに成功し本発明を完成した。即
ち遺伝のの遺伝子クローニングには最近、ｐＢＲ３２２
とＳＶ４０のバイブリドＤＮＡブライマーにｍＲＮＡを
アニールした型でｃＤＮＡを合成し、つづいてリンカ−
ＤＮＡを用いて閉環させたのち閉環プラスミド上で二本
鎖目の合成を行なうことで、長いｃＤＮＡを効率良く得
たことが報告されている（Ｏｋａｙａｍａ。
Ｈ０＆ Ｂｅｒｇ、 Ｐ、、 Ｍｏｌ、 Ｃｅ１１．Ｂ
ｉｏｌ、、ｊ （２）、 ｌ ５１（１９８２））。
ｉｏｌ、、ｊ （２）、 ｌ ５１（１９８２））。
そこで本発明者らはこの方法を適用しプレアルブミンに
対するｍ ＲＮ Ａを、これを極微量含む肝とグアニジ
ン塩酸とのホモジネートから、温和な条件下でその他の
全ＲＮＡとともに抽出し、得られた抽出液からボＩＪ
Ａ含有ｍ ＲＮ Ａ分画として分離した分画を用いるこ
とによシ本発明に到達した。
対するｍ ＲＮ Ａを、これを極微量含む肝とグアニジ
ン塩酸とのホモジネートから、温和な条件下でその他の
全ＲＮＡとともに抽出し、得られた抽出液からボＩＪ
Ａ含有ｍ ＲＮ Ａ分画として分離した分画を用いるこ
とによシ本発明に到達した。
本発明は肝において生産されるプレアルブミンをコード
する遺伝子に由来し、塩基配列−Ｘ−ＡＣＡＧＡ、ＡＧ
ＴＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴ
ＴＣＴＭ ｅ ｔ Ａ １ ａ Ｓ ｅ
ｒＣＡＴＣＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＨｉ ｓ
ＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧ
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ｌＳｅｒＧｌｕＡ、１ａＧＩｙＣＣＴＡＣＧＧＧＣＡＣ
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Ｔ ＣＣＡ Ａ、Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ ＣＣＴ ＣＴ Ｇ
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Ｔ ＣＣＧ Ａ、Ｇ Ｇ ＣＡ Ｇ Ｔ ＣＣＴ
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ＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＡｓｐＡｓｐＴｈｒＴｒ
ｐＧｌｕＰｒ。
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１ ａＧＡＧＧＴＧＧＴＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＧｌ
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ＧＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＬｅｕＬｅｕ Ｓ ｅ
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ＣＡ ＣＣＡ ＣＧ Ｇ ＣＴ Ｇ Ｔ
ＣＴｙｒＳｅｒＴｈｒＴｈｒＡ、１ａＶａｌＧ Ｔ
ＣＡ ＣＣＡ Ａ Ｔ ＣＣＣＡ−Ａ Ｇ
Ｇ Ａ、ＡＶａｌＴｈｒＡｓｎＰｒｏＬｙｓＧ１
ｕＧＡ−Ｙ− 米米米 （配列中ＸはオリゴｄＧを、Ｙはノンコーディングシー
ケンスを表わす）で表わされるクロン化ＤＮＡを提供す
るものである。
Ｓ ｅｒＧｌｙＬｙｓＴｈｒＡ、Ｇ Ｔ Ｇ Ａ Ｇ
Ｔ ＣＴ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ｇ ＣＴ Ｇ
ＳｅｒＧｌｕＳｅｒＧｌｙＧｌｕＬｅｕＣＡ、Ｔ Ｇ
Ｇ Ｇ ＣＴ ＣＡ ＣＡ Ａ ＣＴ Ｇ Ａ ＧＨ
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ケンスを表わす）で表わされるクロン化ＤＮＡを提供す
るものである。
上記塩基配列の下に記載した略号は塩基配列に相当する
アミノ酸配列を示したものであシ、塩基配列の上の数字
は塩基の位置を説明するために付けた番号である。米米
米はナンセンスコドンヲ示すＯ 上記塩基配列中節８７ないし８９位のＧＧＣ（Ｇｌｙ）
から第４６５ないし４６７位のＧＡＡ（Ｇｌｕ）までが
プレアルブミンのアミノ酸配列をコードしたＤＮＡシー
ケンスであり、その前のアミノ酸配列はプレアルブミン
前駆体に存在するシグナルペプチドである。本発明のク
ロン化ＤＮＡでは更に第４６５ないし第４６７位のＧＡ
Ａシーケンスはターミネーションコドン（ＴＡＡ）を介
してノンコーディングシーケンスＹに続く。ノンコーデ
ィングシーケンスＹは本発明のクロン化ＤＮＡシーケン
スの３“末端を構成し、ポリｄＡで終る。ノンコーディ
ングシーケンスＹとしては。
アミノ酸配列を示したものであシ、塩基配列の上の数字
は塩基の位置を説明するために付けた番号である。米米
米はナンセンスコドンヲ示すＯ 上記塩基配列中節８７ないし８９位のＧＧＣ（Ｇｌｙ）
から第４６５ないし４６７位のＧＡＡ（Ｇｌｕ）までが
プレアルブミンのアミノ酸配列をコードしたＤＮＡシー
ケンスであり、その前のアミノ酸配列はプレアルブミン
前駆体に存在するシグナルペプチドである。本発明のク
ロン化ＤＮＡでは更に第４６５ないし第４６７位のＧＡ
Ａシーケンスはターミネーションコドン（ＴＡＡ）を介
してノンコーディングシーケンスＹに続く。ノンコーデ
ィングシーケンスＹは本発明のクロン化ＤＮＡシーケン
スの３“末端を構成し、ポリｄＡで終る。ノンコーディ
ングシーケンスＹとしては。
ＧＧＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡ
ＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｔ
Ｔ ＣＡ、 Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ａ ＣＣＡＡ、 Ｇ Ａ
Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ ＣＣＡ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ
Ａ ＣＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＡＣＴＣＡＴＡ
ＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＣ
ＡＡＴＡＡＡＡＣＡ Ｔ Ｔ ＣＣＴ Ｇ
Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ、Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ
ＡＡ を例示することができる。このシーケンスの塩基配列は
変ることがあり得る。
ＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｔ
Ｔ ＣＡ、 Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ａ ＣＣＡＡ、 Ｇ Ａ
Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｔ ＣＣＡ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ
Ａ ＣＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＡＣＴＣＡＴＡ
ＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧＧＡＧＡＧＡＣ
ＡＡＴＡＡＡＡＣＡ Ｔ Ｔ ＣＣＴ Ｇ
Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ、Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ
ＡＡ を例示することができる。このシーケンスの塩基配列は
変ることがあり得る。
本発明のクロン化ＤＮＡシーケンスの５′末端はＸ、即
ち士数個のオリゴｄＧ鎖で始まり、第１位のＡよシ第２
６位のＧまでの２６−塩基Ｌｆ５”配列を経てＡＴＧか
ら始まるアミノ酸配列に相当するＤＮＡシーケンスへと
続く。
ち士数個のオリゴｄＧ鎖で始まり、第１位のＡよシ第２
６位のＧまでの２６−塩基Ｌｆ５”配列を経てＡＴＧか
ら始まるアミノ酸配列に相当するＤＮＡシーケンスへと
続く。
本発明は更に肝において生産されるプレアルブミンをコ
ードする遺伝子に由来し、前述の塩基配列で表わされる
Ｄ’ＮＡをｐＢＲ３２２−８Ｖ４０−ρ因子ＤＮＡ連結
ベクターのＰｓｔｉ−ＰｖｕＪ部位間において挿入して
なるくみかえＤＮＡプラスミドを提供するものである。
ードする遺伝子に由来し、前述の塩基配列で表わされる
Ｄ’ＮＡをｐＢＲ３２２−８Ｖ４０−ρ因子ＤＮＡ連結
ベクターのＰｓｔｉ−ＰｖｕＪ部位間において挿入して
なるくみかえＤＮＡプラスミドを提供するものである。
第１図および第２図は本発明のプラスミドＤＮＡの制限
酵素開裂部位を表わす図である。本発明のクロン化プレ
アルブミンＤＮＡはその５１末端において本発明のくみ
かえＤＮＡプラスミドのＰｓｔｌ開裂部位に、また３゛
末端において同じ（Ｐｖｕ Ｉ開裂部位にくみ込まれて
いる。
酵素開裂部位を表わす図である。本発明のクロン化プレ
アルブミンＤＮＡはその５１末端において本発明のくみ
かえＤＮＡプラスミドのＰｓｔｌ開裂部位に、また３゛
末端において同じ（Ｐｖｕ Ｉ開裂部位にくみ込まれて
いる。
本発明は、更にまたエシエリンヤ属に属し、このくみか
えプラスミドを有し、かつこれを複製することのできる
微生物及びその製造法を提供するものである。
えプラスミドを有し、かつこれを複製することのできる
微生物及びその製造法を提供するものである。
本発明の微生物は以下の様にして調製することができる
。
。
まず肝をグアニジン塩酸とともにホモジナイズし、塩化
セシウム密度勾配遠心によって全ＲＮＡを得る。これを
常法に従ってオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラ
フィで精製してポリＡ含有ｍＲＮＡ分画を含む分画を調
製し、 これをｍＲＮＡ原料とする。
セシウム密度勾配遠心によって全ＲＮＡを得る。これを
常法に従ってオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラ
フィで精製してポリＡ含有ｍＲＮＡ分画を含む分画を調
製し、 これをｍＲＮＡ原料とする。
一方ｐＢＲ３２２とρ因子ＤＮＡのハイブリドプラスミ
ドからプラスミドプライマーを調製し、またｐＢＲ３２
２とＳＶ４０とのハイブリドプラスミドからリンカ−Ｄ
ＮＡを調製する。これらの調製は岡山らの方法（Ｍｏｌ
、 Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、、 ２（２）、 １６１゜
（１９８２））に従って行うことができる。
ドからプラスミドプライマーを調製し、またｐＢＲ３２
２とＳＶ４０とのハイブリドプラスミドからリンカ−Ｄ
ＮＡを調製する。これらの調製は岡山らの方法（Ｍｏｌ
、 Ｃｅ１ｌ、 Ｂｉｏｌ、、 ２（２）、 １６１゜
（１９８２））に従って行うことができる。
ｐＢＲ３２２とρ因子ＤＮＡとのハイブリドプラスミド
を制限酵素Ｋｐｎｌで消化し、常法でＤＮＡを回収する
。これにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼによりＫｐｎＩの開裂部位にオリゴｄＴテール
を付加させる。こうして得たオリゴｄＴテールＤＮＡを
制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＩエンドヌクレアーゼで切断し
たのち、長い方のＤＮＡ断片を分離精製し、プラスミド
プライマーを調製する。
を制限酵素Ｋｐｎｌで消化し、常法でＤＮＡを回収する
。これにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
エラーゼによりＫｐｎＩの開裂部位にオリゴｄＴテール
を付加させる。こうして得たオリゴｄＴテールＤＮＡを
制限酵素Ｂ ａ ｍ ＨＩエンドヌクレアーゼで切断し
たのち、長い方のＤＮＡ断片を分離精製し、プラスミド
プライマーを調製する。
また別にｐＢＲ３２２とＳＶ４０とのハイブリドプラス
ミドを制限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼで切断し、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
によりオリゴｄＧテールを付加させる。これを更に制限
酵素Ｈｉ ｎ ｄ 、ｌ［エンドヌクレアーゼで消化し
、短い方のＤＮＡ断片を分離精製し、オリゴｄＧテール
リンカ−Ｄ Ｎ Ａを得る。
ミドを制限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼで切断し、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
によりオリゴｄＧテールを付加させる。これを更に制限
酵素Ｈｉ ｎ ｄ 、ｌ［エンドヌクレアーゼで消化し
、短い方のＤＮＡ断片を分離精製し、オリゴｄＧテール
リンカ−Ｄ Ｎ Ａを得る。
こうして得たｍ ＲＮ Ａ原料、プラスミドプライマー
を逆転写酵素の存在下でｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、
ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰと反応させ、プラスミド−ｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡ複合体を調製する。得られたグラスミド−
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体をターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼの存在下でｄＣＴＰと反応
させてオリゴｄＣテールを付加させる。オリゴｄＣテー
ルを付加したプラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を
制限酵素Ｈｉ ｎ ｄ ■で消化したのち、先に調製し
たオリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡとＤＮＡリガーゼの
存在下で反応させて環化させる。こうして得た環状ｃＤ
ＮＡ：ｍＲＮＡ複合体プラスミドを４種のデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸塩、即ちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＣＴＰと、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びリボヌクレアーゼＨの存在下で反応させてＲ
ＮＡ鎖をＤＮＡ鎖で置換し、ｃＤＮＡセグメント含有プ
ラスミドを調製する。
を逆転写酵素の存在下でｄＡＴＰ 、 ｄＴＴＰ 、
ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰと反応させ、プラスミド−ｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡ複合体を調製する。得られたグラスミド−
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体をターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフエラーゼの存在下でｄＣＴＰと反応
させてオリゴｄＣテールを付加させる。オリゴｄＣテー
ルを付加したプラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を
制限酵素Ｈｉ ｎ ｄ ■で消化したのち、先に調製し
たオリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡとＤＮＡリガーゼの
存在下で反応させて環化させる。こうして得た環状ｃＤ
ＮＡ：ｍＲＮＡ複合体プラスミドを４種のデオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸塩、即ちｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＣＴＰと、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼ及びリボヌクレアーゼＨの存在下で反応させてＲ
ＮＡ鎖をＤＮＡ鎖で置換し、ｃＤＮＡセグメント含有プ
ラスミドを調製する。
こうして得たプラスミドを用い２例えば（：ｏｈｅｎら
の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、
６９ 、９８９（１９７２））に準じてエシエリシヤ
属微生物、特にエシエリシヤ・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
を形質転換し、アンピシリン耐性株をとる。
の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、
６９ 、９８９（１９７２））に準じてエシエリシヤ
属微生物、特にエシエリシヤ・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）
を形質転換し、アンピシリン耐性株をとる。
こうして形質転換した微生物のうちプレアルブミン配列
を含む遺伝子をもったものをスクリーニングするため、
プレアルブミンのアミノ酸配列に対応する標識された合
成オリゴヌクレオチドをグローブとして、そのコロニー
のうちこのプローブと相補性のある配列を含んだプラス
ミドを持つコロニーヲピノクアップする。
を含む遺伝子をもったものをスクリーニングするため、
プレアルブミンのアミノ酸配列に対応する標識された合
成オリゴヌクレオチドをグローブとして、そのコロニー
のうちこのプローブと相補性のある配列を含んだプラス
ミドを持つコロニーヲピノクアップする。
こうして得られるエシエリシヤ属の菌株は本発明のクロ
ン化されたプレアルブミンＤＮＡを含むプラスミドを持
っている。そしてその増殖によりとのプラスミドを複製
することができる。との菌株はまたこのプラスミドに由
来する性質９例えばとのプラスミドがｐＢＲ３２２起源
であることに基くアンピシリン耐性などを示すが、その
他の性質は親株と共通である。
ン化されたプレアルブミンＤＮＡを含むプラスミドを持
っている。そしてその増殖によりとのプラスミドを複製
することができる。との菌株はまたこのプラスミドに由
来する性質９例えばとのプラスミドがｐＢＲ３２２起源
であることに基くアンピシリン耐性などを示すが、その
他の性質は親株と共通である。
本発明のくみかえＤＮＡプラスミドはこうして得られる
エシエリシヤ属の菌株から慣用の方法により容易に取得
することができる。またこのプラスミドを慣用の方法で
、制限酵素ｐｓｔＪによる完全分解と同ＰｖｕＩによる
分解を組合せることにより本発明のクロン化プレアルブ
ミンＤＮＡを容易に得ることができる。
エシエリシヤ属の菌株から慣用の方法により容易に取得
することができる。またこのプラスミドを慣用の方法で
、制限酵素ｐｓｔＪによる完全分解と同ＰｖｕＩによる
分解を組合せることにより本発明のクロン化プレアルブ
ミンＤＮＡを容易に得ることができる。
本発明のクロン化プレアルブミンＤＮＡはその発現のた
めに、前述したＤＮＡ導入ベクターの発現し得るオペロ
ン中の部位に挿入することができる０ なお本発明のクローン化プレアルブミンＤＮＡの塩基配
列解析によシ、プレアルブミンはより大き々前駆体蛋白
質よりプロセスされて生じてくるものであることが明ら
かとなった。
めに、前述したＤＮＡ導入ベクターの発現し得るオペロ
ン中の部位に挿入することができる０ なお本発明のクローン化プレアルブミンＤＮＡの塩基配
列解析によシ、プレアルブミンはより大き々前駆体蛋白
質よりプロセスされて生じてくるものであることが明ら
かとなった。
インターフェロン、インシュリンなどの場合にみられる
様に１合成りＮＡを用いて遺伝子を人工的に構築し、大
腸菌から目的とするペプチドを得る方法があるが、一般
に短鎖ペプチドは菌体内ですみやかに分解されることが
多いため、高分子量の融合蛋白質として合成する方法が
とられている。
様に１合成りＮＡを用いて遺伝子を人工的に構築し、大
腸菌から目的とするペプチドを得る方法があるが、一般
に短鎖ペプチドは菌体内ですみやかに分解されることが
多いため、高分子量の融合蛋白質として合成する方法が
とられている。
前述した前駆体蛋白質に対する遺伝子の場合には。
その上流に適当なプロモーターとそれに続く蛋白合成開
始シグナルを接続するだけでこの目的が達成できる。
始シグナルを接続するだけでこの目的が達成できる。
この前駆体遺伝子の発現される臓器においては。
非特異的に分解されることなく適尚な酵素の働きによっ
て“正しく１プロセスされる様にこの前駆体蛋白質自体
が特有の折りたたまれ方をしていると推測されることか
ら、動物臓器由来の特異的プロテアーゼを用いることに
よって穏やかに目的とするプロダクトを切り出すことが
できることも期待できる。
て“正しく１プロセスされる様にこの前駆体蛋白質自体
が特有の折りたたまれ方をしていると推測されることか
ら、動物臓器由来の特異的プロテアーゼを用いることに
よって穏やかに目的とするプロダクトを切り出すことが
できることも期待できる。
以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが９本
発明法これらに限定されない。
発明法これらに限定されない。
実施例１
〔ヒト肝からのｍＲＮＡ原料の調製〕
ヒト肝（Ｊｏｇ）にグアニジン塩酸（８Ｍ）、酢酸ナト
リウム（２０ｍＭ）水溶液１００ｍ１を添加し。
リウム（２０ｍＭ）水溶液１００ｍ１を添加し。
ホモジナイズした。こうして得たホモジネートを１１０
０００Ｘ、１０分遠心分離し、上清を得た。
０００Ｘ、１０分遠心分離し、上清を得た。
この上清に半量のエタノールを加え、−２０°Ｃで２０
分間放置後、１ｌ１０００Ｘ、 １０分間遠心するこ
とにより、ＲＮＡを沈殿として回収した。これを６Ｍグ
アニジン塩酸溶液にとかし、それを塩化セシウム水溶液
（５，９Ｍ）上に重層し、 ３００００ Ｘｇ、２０時
間の遠心操作によりｍ ＲＮ Ａを含む分画をペレット
状で得た。この分画をＴｒｉｓ−ＨＣＩ及びＥＤＴＡを
それぞれ］ＯｍＭ及び］、ｍＭの濃度で含−ｊｒｐＨ７
，４の水溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７
，４） 。
分間放置後、１ｌ１０００Ｘ、 １０分間遠心するこ
とにより、ＲＮＡを沈殿として回収した。これを６Ｍグ
アニジン塩酸溶液にとかし、それを塩化セシウム水溶液
（５，９Ｍ）上に重層し、 ３００００ Ｘｇ、２０時
間の遠心操作によりｍ ＲＮ Ａを含む分画をペレット
状で得た。この分画をＴｒｉｓ−ＨＣＩ及びＥＤＴＡを
それぞれ］ＯｍＭ及び］、ｍＭの濃度で含−ｊｒｐＨ７
，４の水溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７
，４） 。
］ｍＭＥＤＴＡと略記する。以下同様に表示）５ｍｌに
溶解し、これにＫＣＩ溶液を０．５Ｍとなる様に加えた
のち、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィで
精製（溶出液： ］ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｉ（ＣＩ （
ｐＨ７，４）、１ｍＭＥＤＴＡ）ｌ、てポリｄＡ＋ＲＮ
Ａ分画を得た。
溶解し、これにＫＣＩ溶液を０．５Ｍとなる様に加えた
のち、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィで
精製（溶出液： ］ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｉ（ＣＩ （
ｐＨ７，４）、１ｍＭＥＤＴＡ）ｌ、てポリｄＡ＋ＲＮ
Ａ分画を得た。
岡山らの方法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２（２
）、１６］（１９８２））に従ってプラスミドプライマ
ーを調製した。ｐＢＲ３２２とρ因子ＤＮＡとのノ・イ
ブリドプラスミド４００１１ｇを６ ｍＭ Ｔｒ ｉ
５−ＨＣＩ （ｐＴ（７，５） 。
）、１６］（１９８２））に従ってプラスミドプライマ
ーを調製した。ｐＢＲ３２２とρ因子ＤＮＡとのノ・イ
ブリドプラスミド４００１１ｇを６ ｍＭ Ｔｒ ｉ
５−ＨＣＩ （ｐＴ（７，５） 。
６ｍＭ ＭｇＣ１２、６ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭ ２−
メルカプトエタノール及び１ｍｌ当り０．１ｍｇの ウ
・ン血清アルブミンを含む水溶液１．５ｍｌに溶解し、
制限酵素Ｋｐｎｌエンドヌクレアーゼ１．．２ＣＩＯ
ｕを加え、３７°Ｃで４時間反応させたのちドデシル硫
酸す） ＩＪウム水溶液（１０％）を加えて反応を停止
させ、得られた消化液から常法に従いエタノール沈殿に
よってＤＮＡを回収した。これを１４０ｍＭカコジル酸
ナト リ ウ ム −３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ６，８） 、 、１ ｍＭＣｏＣｌ□
、 ０．１ ｍＭジチオスレイトール及び０．２５ｍＭ
のｄＴＴＰを含む水溶液Ｑ、３ｍｌに溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ４００ｕ
を添加して３７°Ｃで３０分間反応させＫｐｎｌ開裂部
位に約６０個のｄＴデテール付加させた。
メルカプトエタノール及び１ｍｌ当り０．１ｍｇの ウ
・ン血清アルブミンを含む水溶液１．５ｍｌに溶解し、
制限酵素Ｋｐｎｌエンドヌクレアーゼ１．．２ＣＩＯ
ｕを加え、３７°Ｃで４時間反応させたのちドデシル硫
酸す） ＩＪウム水溶液（１０％）を加えて反応を停止
させ、得られた消化液から常法に従いエタノール沈殿に
よってＤＮＡを回収した。これを１４０ｍＭカコジル酸
ナト リ ウ ム −３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ６，８） 、 、１ ｍＭＣｏＣｌ□
、 ０．１ ｍＭジチオスレイトール及び０．２５ｍＭ
のｄＴＴＰを含む水溶液Ｑ、３ｍｌに溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ４００ｕ
を添加して３７°Ｃで３０分間反応させＫｐｎｌ開裂部
位に約６０個のｄＴデテール付加させた。
ドデシル硫酸す） ＩＪウム水溶液（１０％）の添加に
よって反応を終結させたのち再びエタノール沈殿を行な
いＤＮＡを回収した。
よって反応を終結させたのち再びエタノール沈殿を行な
いＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，
４）。
４）。
１０ｍＭＭｇＣｈ、２０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭジチオスレ
イトール及びｌ、ｍ１当りｏ、ｉｍｇの ウシ血清アル
ブミンを含む水溶液に溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩエン
ドヌクレアーゼ１００１１を加えて３７°Ｃで５時間反
応させてＤＮＡを切断した。
イトール及びｌ、ｍ１当りｏ、ｉｍｇの ウシ血清アル
ブミンを含む水溶液に溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩエン
ドヌクレアーゼ１００１１を加えて３７°Ｃで５時間反
応させてＤＮＡを切断した。
反応液をアガロース（１％）ゲル電気泳動に付し、大き
い方のＤＮＡにイ゛０当するノ（ンドを切り出し、透析
チューブ中で電気泳動して、ＤＮＡをゲルより抽出１７
１常法通りエタノール沈殿法により回収した。このＤＮ
Ａを更に〕ＱｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ（ＩｌｌＨ７，３
）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び］ＭＮａＣ＋を含む水溶液１
ｍｌに溶解して０°Ｃでオリコ゛ｄＡクロマトグラフィ
に付し、水で溶出させたのちエタノールで沈殿させ、オ
リゴｄＴテールを有するプラスミドプライマー約８０μ
ｇを得た。
い方のＤＮＡにイ゛０当するノ（ンドを切り出し、透析
チューブ中で電気泳動して、ＤＮＡをゲルより抽出１７
１常法通りエタノール沈殿法により回収した。このＤＮ
Ａを更に〕ＱｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ（ＩｌｌＨ７，３
）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び］ＭＮａＣ＋を含む水溶液１
ｍｌに溶解して０°Ｃでオリコ゛ｄＡクロマトグラフィ
に付し、水で溶出させたのちエタノールで沈殿させ、オ
リゴｄＴテールを有するプラスミドプライマー約８０μ
ｇを得た。
〔オリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡの調製〕岡山らの方
法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２（２）、１６１
（１，９８２）） に従ってオリゴｄＧテールリンカ
−ＤＮＡを調製した。ｐＢＲ３２２と５Ｖ４０（マツフ
。
法（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、２（２）、１６１
（１，９８２）） に従ってオリゴｄＧテールリンカ
−ＤＮＡを調製した。ｐＢＲ３２２と５Ｖ４０（マツフ
。
ユニット０．１９〜０３２）とのノ・イブリドプラスミ
ド１００μｇを６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，
４） 、 ６ｍＭＭｇＣ１２，６ｍＭ２−メルカプト
エタノール、５０ｍＭＮａＣ１及び１ｍｌ当り０．１ｍ
ｇのウシ血清アルフ゛ミンを含む水溶液０．２ｍｌに溶
解し、制限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼ１２０ｕを
加えて３７°Ｃで１時間半反応させた。反応後反応液を
フェノールで抽出し、水イ’ｌ’Ｊからエタノール沈殿
によってＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを前述のプ
ラスミドブライマー調製のｄＴデテール加に用いた水溶
液（但し０．２５ｍＭ６ｆ）ｄＴＴＰに代えて０．１
ｍ ＭのｄＧＴＰを含む）５０μｍに溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ６ｏｕを
用いて３７０Ｃで２００分間反応せ、これに約１０個の
ｄＧ残基を取シ込ませた。反応液を水飽和フェノール−
クロロホルム混合溶媒（ｊ： １ ）で抽出し、水相か
らエタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。
ド１００μｇを６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，
４） 、 ６ｍＭＭｇＣ１２，６ｍＭ２−メルカプト
エタノール、５０ｍＭＮａＣ１及び１ｍｌ当り０．１ｍ
ｇのウシ血清アルフ゛ミンを含む水溶液０．２ｍｌに溶
解し、制限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼ１２０ｕを
加えて３７°Ｃで１時間半反応させた。反応後反応液を
フェノールで抽出し、水イ’ｌ’Ｊからエタノール沈殿
によってＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを前述のプ
ラスミドブライマー調製のｄＴデテール加に用いた水溶
液（但し０．２５ｍＭ６ｆ）ｄＴＴＰに代えて０．１
ｍ ＭのｄＧＴＰを含む）５０μｍに溶解し、ターミナ
ルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ６ｏｕを
用いて３７０Ｃで２００分間反応せ、これに約１０個の
ｄＧ残基を取シ込ませた。反応液を水飽和フェノール−
クロロホルム混合溶媒（ｊ： １ ）で抽出し、水相か
らエタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。
回収したＤＮＡを２０ｒｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐ
Ｈ７，４） 。
Ｈ７，４） 。
７ ｒｎＭ ＭｇＣ１２、６０ｒｎＭ ＮａＣ１及び１
ｍｌ当りＯ，１ｍｇのウシ血清アルブミンを含む水溶液
５０μｌＫ溶解し、これに制限酵素Ｊ（ｉｎｄｌ エン
ドヌクレアーゼ５０ｕを加え、３７°Ｃで１時間反応さ
せ２反応液をアガロース（１８％）ゲル電気泳動に付し
、制限酵素Ｂ ｉ ｎ ｄ ｌエンドヌクレアーゼ消化
によって生成した小さいオリゴｄＱテールリンカ−ＤＮ
Ａを。
ｍｌ当りＯ，１ｍｇのウシ血清アルブミンを含む水溶液
５０μｌＫ溶解し、これに制限酵素Ｊ（ｉｎｄｌ エン
ドヌクレアーゼ５０ｕを加え、３７°Ｃで１時間反応さ
せ２反応液をアガロース（１８％）ゲル電気泳動に付し
、制限酵素Ｂ ｉ ｎ ｄ ｌエンドヌクレアーゼ消化
によって生成した小さいオリゴｄＱテールリンカ−ＤＮ
Ａを。
前述したプラスミドプライマーの回収の場合と同様にし
て回収した。
て回収した。
［ｃＤＮＡバンクの作製とクローニンク〕岡山らのグロ
ビンに対するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡバンクの調製
とクロー二／グ（Ｍｏ １．ｃｅ ｌ Ｉ。
ビンに対するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡバンクの調製
とクロー二／グ（Ｍｏ １．ｃｅ ｌ Ｉ。
Ｂｉｏｌ、、 ２（２）、 １６］（１９８２））に準
じて、肝プレアルブミンに対するｍＲＮＡに対応するｃ
ＤＮＡ の調製及びクローニングを行なった。
じて、肝プレアルブミンに対するｍＲＮＡに対応するｃ
ＤＮＡ の調製及びクローニングを行なった。
５０ｍＭのＴｒｒｓ−ＨＣＩ （ｐＩ（８，３）、８ｒ
ｎＭのＭｇＣｌ２゜３０ｍＭのＫＣｌ 、０．３ｍＭの
ジチオスレイトール並びに各２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びＰ３２−ｄＣＴＰ（１６００ｃｐｍ／
ｐｍｏｌ）を含む１ｏ１１の水溶液に前述した〔ヒト肝
からのｍＲＮＡ原料の調製〕で得られたポリＡ＋ＲＮＡ
分画０．２１＋ｇ＋及び同じく〔プラスミドプライマー
の調製〕で得たプラスミドプライマー１４〃ｇを加え、
トリ骨髄性白血病ビールス（ＡＭＶ）の逆転写酵素５ｕ
の存在下３７°Ｃで２００分間反応せ、プラスミド−ｃ
ＤＮＡ ： ｍＲＮＡ複合体を合成した。反応液には
ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（１０％）を加えて反応
を停止させ。
ｎＭのＭｇＣｌ２゜３０ｍＭのＫＣｌ 、０．３ｍＭの
ジチオスレイトール並びに各２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びＰ３２−ｄＣＴＰ（１６００ｃｐｍ／
ｐｍｏｌ）を含む１ｏ１１の水溶液に前述した〔ヒト肝
からのｍＲＮＡ原料の調製〕で得られたポリＡ＋ＲＮＡ
分画０．２１＋ｇ＋及び同じく〔プラスミドプライマー
の調製〕で得たプラスミドプライマー１４〃ｇを加え、
トリ骨髄性白血病ビールス（ＡＭＶ）の逆転写酵素５ｕ
の存在下３７°Ｃで２００分間反応せ、プラスミド−ｃ
ＤＮＡ ： ｍＲＮＡ複合体を合成した。反応液には
ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（１０％）を加えて反応
を停止させ。
エタノール沈殿によってグラスミド−ｃ ＤＮＡ ：
ｍＲＮＡ複合体をベレット状で回収した。
ｍＲＮＡ複合体をベレット状で回収した。
プラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を含んだベレッ
トをＩｍＭのＣｏＣｈ 、 ０．１ ｍＭのジチオスレ
イト−ｋ 、 ０，２ ｔｔ ｇのポリＡ 、 ６６μ
ＭノＰ”２− ｄＣＴＰ（１，，２００ｃｐｍ／ ｐ
ｍｏｌ ）及びターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ１８０を含む１３０ｍＭカコジル酸ナト
リウム−３０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ］緩衝液（ｐＨ
６，８） １５＃ ］に溶解した。末端当りｄＣ’ＭＰ
の１０ないし１５残基を付加するため３７°Ｃで５分間
反応させ、ドデシル硫酸す） ＩＪウム水溶液を添加し
て反応を停止させた。水飽和フェノール−クロロホルム
混合溶媒で抽出後水相にエタノールを加えてオリゴｄｃ
テールプラスミド−ｃ ＤＮＡ ： ｒｎＲＮＡ複合体
を沈殿させ、得られたベレットをエタノールで洗浄後回
収した。
トをＩｍＭのＣｏＣｈ 、 ０．１ ｍＭのジチオスレ
イト−ｋ 、 ０，２ ｔｔ ｇのポリＡ 、 ６６μ
ＭノＰ”２− ｄＣＴＰ（１，，２００ｃｐｍ／ ｐ
ｍｏｌ ）及びターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフエラーゼ１８０を含む１３０ｍＭカコジル酸ナト
リウム−３０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣ］緩衝液（ｐＨ
６，８） １５＃ ］に溶解した。末端当りｄＣ’ＭＰ
の１０ないし１５残基を付加するため３７°Ｃで５分間
反応させ、ドデシル硫酸す） ＩＪウム水溶液を添加し
て反応を停止させた。水飽和フェノール−クロロホルム
混合溶媒で抽出後水相にエタノールを加えてオリゴｄｃ
テールプラスミド−ｃ ＤＮＡ ： ｒｎＲＮＡ複合体
を沈殿させ、得られたベレットをエタノールで洗浄後回
収した。
得られたベレットを２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −Ｔ（Ｃ
Ｉ （ＪＩＩＨ７，４，） 、 ７ ｍＭ ＭｇＣＩ。
Ｉ （ＪＩＩＨ７，４，） 、 ７ ｍＭ ＭｇＣＩ。
、 ６０ｒｎＭ Ｎａｃｌ及び１ｍｌ当り０．１ｍｇの
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ
ｉ ｎ ｄ Ｉエンドヌクレアーゼ２．５Ｕで３７°０
１時間消化し、エタノールで沈殿させて回収した。これ
をＩ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ （ｐＨ７，３）及
び１ｍＭＥＤＴＡを含む水溶液１０μｍに溶解し。
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液に溶解し、制限酵素Ｈ
ｉ ｎ ｄ Ｉエンドヌクレアーゼ２．５Ｕで３７°０
１時間消化し、エタノールで沈殿させて回収した。これ
をＩ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ （ｐＨ７，３）及
び１ｍＭＥＤＴＡを含む水溶液１０μｍに溶解し。
更に３／！Ｊのエタノールを加え、オリゴｄＣテールｃ
ＤＮＡ：ｍＲＮＡ ’プラスミド溶液を得た。
ＤＮＡ：ｍＲＮＡ ’プラスミド溶液を得た。
この溶液１μ工を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）。
，５）。
ＩｍＭ ＥＤＴＡ、 Ｑ、ＩＭ ＮａＣ］及び前述した
〔オリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡの調製〕で得たリン
カ−ＤＮＡ ０．０４ｐ ｍｏｌを含む水溶液ＩＱμｌ
に溶解し、６５°Ｃで２分間インキュベートシたのち４
２°Ｃで３０分間アニーリングを行なった。これをｏｏ
ｃに冷却したのち、 Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ０６
μｇを加えて一夜間インキユベートシタ。
〔オリゴｄＧテールリンカ−ＤＮＡの調製〕で得たリン
カ−ＤＮＡ ０．０４ｐ ｍｏｌを含む水溶液ＩＱμｌ
に溶解し、６５°Ｃで２分間インキュベートシたのち４
２°Ｃで３０分間アニーリングを行なった。これをｏｏ
ｃに冷却したのち、 Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ０６
μｇを加えて一夜間インキユベートシタ。
この溶液に各４．０ ＃ ＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＣＴＰ 、０．１５ｍＭのβ−ＮＡＤ、０
．４ａｇのＥ。
ＧＴＰ及びｄＣＴＰ 、０．１５ｍＭのβ−ＮＡＤ、０
．４ａｇのＥ。
ｒ２ ｏ ｌ ｉ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ、３０ｐｇのＥ
、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ並びに１． ／ｌ
ｇのＥ、ｃｏｌｉリボヌクレ゛アーゼＨを加え、全量
を１００／１１としたのち最初】２０Ｃで１次いで室温
で各１時間インキュベートシ゛た。反応液に氷冷した１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）（ＣＩ（ｐＨ７，３）０．９ｍ
ｌを加えて反応を停止させてプラスミド溶液を調製した
。
、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ並びに１． ／ｌ
ｇのＥ、ｃｏｌｉリボヌクレ゛アーゼＨを加え、全量
を１００／１１としたのち最初】２０Ｃで１次いで室温
で各１時間インキュベートシ゛た。反応液に氷冷した１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）（ＣＩ（ｐＨ７，３）０．９ｍ
ｌを加えて反応を停止させてプラスミド溶液を調製した
。
次にこのプラスミド溶液を用い、 Ｃｏｈｅｎらの方法
（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ Ｓｃｉ、、 ６９．
９８９ （１９７２））に多少変更を加えてＥ、 ｃｏ
ｌｉ ＤＨＩ株を形質転換させた。
（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ Ｓｃｉ、、 ６９．
９８９ （１９７２））に多少変更を加えてＥ、 ｃｏ
ｌｉ ＤＨＩ株を形質転換させた。
Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＨＩ株をＬ−グロス液２０−ｍ１中
、３７°Ｃで吸光度ＡｇｏｏＯ値が０．２となるまで培
養し、菌体を冷却付遠心分離機で集め、 ５０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７
，３）緩衝液１０ｍ１に分散し、０°Ｃで再度遠心沈降
させた。集めた菌体を同じ緩衝液２ｍｌに分散し、０°
Ｃで ５分間静置した。この分散液０．２ｍｌにプラス
ミド溶液０．１ｍｌを添加混合し、 ｏｏｃで１５分間
静置し、更に４２０Ｃで２分間保持したのち、前の培養
で用いたのと同一の組成のＬ−ブロス液０．５ｍｌを加
えて１時間振とり培養を行なった。この培養液の一部を
とり、前述の成分の他に５０μｇ／ｍｌのａｍｐｉｃｉ
ｌｌｉｎを含んだＬ−グロスの寒天平板に拡げ３７°Ｃ
で約１２時間培養した。
、３７°Ｃで吸光度ＡｇｏｏＯ値が０．２となるまで培
養し、菌体を冷却付遠心分離機で集め、 ５０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７
，３）緩衝液１０ｍ１に分散し、０°Ｃで再度遠心沈降
させた。集めた菌体を同じ緩衝液２ｍｌに分散し、０°
Ｃで ５分間静置した。この分散液０．２ｍｌにプラス
ミド溶液０．１ｍｌを添加混合し、 ｏｏｃで１５分間
静置し、更に４２０Ｃで２分間保持したのち、前の培養
で用いたのと同一の組成のＬ−ブロス液０．５ｍｌを加
えて１時間振とり培養を行なった。この培養液の一部を
とり、前述の成分の他に５０μｇ／ｍｌのａｍｐｉｃｉ
ｌｌｉｎを含んだＬ−グロスの寒天平板に拡げ３７°Ｃ
で約１２時間培養した。
プレアルブミン配列に相当する遺伝子を含むプラスミド
を持つ菌株をスクリーニングするため。
を持つ菌株をスクリーニングするため。
プレアルブミンのアミノ酸配列に対応する。３２Ｐで標
識された合成オリゴヌクレオチド（コドンの縮退があシ
得るので、 ３’ＧＧ（ＧｏｒＡ、） ＡＡ（ＧｏｒＡ
） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＴ（ＣｏｒＴ） ＧＴ（Ｇｏ
ｒＡ） ＣＧ５’及び３ ’ ＣＧ、（Ｔ ｏｒＣ）
ＡＡ（ＧｏｒＡ） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＴ（ＣｏｒＴ
） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＧ５１の６４種類の 合成オ
リゴヌクレオチド使用）の混合水溶液を用い、 Ｈａｎ
ａｈａｎ 、 Ｄ ＆ Ｍｅｓｅｌｓｏｎ 。
識された合成オリゴヌクレオチド（コドンの縮退があシ
得るので、 ３’ＧＧ（ＧｏｒＡ、） ＡＡ（ＧｏｒＡ
） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＴ（ＣｏｒＴ） ＧＴ（Ｇｏ
ｒＡ） ＣＧ５’及び３ ’ ＣＧ、（Ｔ ｏｒＣ）
ＡＡ（ＧｏｒＡ） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＴ（ＣｏｒＴ
） ＧＴ（ＧｏｒＡ） ＣＧ５１の６４種類の 合成オ
リゴヌクレオチド使用）の混合水溶液を用い、 Ｈａｎ
ａｈａｎ 、 Ｄ ＆ Ｍｅｓｅｌｓｏｎ 。
Ｍ、 （Ｇｅｎｅ 、上０，６３（１９８０））の方法
に従い、これらの標識された合成ヌクレオチドをプロー
ブとしてスクリーニングし、このプローブと相補性のあ
る配列を含んだプラスミドをもった菌株をピンクアンフ
シタ。約３×１０４コｏ ＝ −中５ Ｑ −ｒ ＋：
＋ ＝ −が陽性であった。
に従い、これらの標識された合成ヌクレオチドをプロー
ブとしてスクリーニングし、このプローブと相補性のあ
る配列を含んだプラスミドをもった菌株をピンクアンフ
シタ。約３×１０４コｏ ＝ −中５ Ｑ −ｒ ＋：
＋ ＝ −が陽性であった。
更にこれらの陽性コロニーに対してプレアルブミンのア
ミノ酸配列に対応する３２ｐで標識された別の合成オリ
ゴヌクレオチド（コドンの縮退かあるので、 ３’ＡＣ
ＣＣＴ（ＴｏｒＣ） ＧＧ（ＴｏｒＣｏｒＧｏｒＡ）
ＡＡ（Ｇｏｒ Ａ） ＣＧ５ ’の１６種・の合成ヌク
レオチド′を利用）を用いてスクリーニングを行い、８
個の陽性コロニーを得た。
ミノ酸配列に対応する３２ｐで標識された別の合成オリ
ゴヌクレオチド（コドンの縮退かあるので、 ３’ＡＣ
ＣＣＴ（ＴｏｒＣ） ＧＧ（ＴｏｒＣｏｒＧｏｒＡ）
ＡＡ（Ｇｏｒ Ａ） ＣＧ５ ’の１６種・の合成ヌク
レオチド′を利用）を用いてスクリーニングを行い、８
個の陽性コロニーを得た。
こうして得た菌株を前述のＬ−グロス液で培養して菌体
を得た。
を得た。
との菌体をＢｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ
、 Ｊ、の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 ７ 、１５１３〜（］ ９７９））に従って処理
し、プラスミドＤＮＡを得た。収量は培養液１１当シ３
００μｇであった。こうして得たプラスミドＤＮＡを制
限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼで完全分解し、同Ｐ
ｖｕｌエンドヌクレアーゼで分解、精製分離してクロン
化プレアルブミンＤＮＡを得た。
、 Ｊ、の方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 ７ 、１５１３〜（］ ９７９））に従って処理
し、プラスミドＤＮＡを得た。収量は培養液１１当シ３
００μｇであった。こうして得たプラスミドＤＮＡを制
限酵素Ｐｓｔｌエンドヌクレアーゼで完全分解し、同Ｐ
ｖｕｌエンドヌクレアーゼで分解、精製分離してクロン
化プレアルブミンＤＮＡを得た。
このようにして得られたプレアルブミンＤＮＡプラスミ
ドの制限酵素切断部位を第１図に示す。
ドの制限酵素切断部位を第１図に示す。
ＤＮＡの塩基配−列の決定法のうち最も汎用されている
ｄｉｄｅｏｘｙ法を用いて決定した。先づ上記で得られ
たＰｓｔｌ−Ｐｖｕｌ［切断プレアルブミンＤＮＡｌａ
ｇを同じ（Ｐｓｔ Ｉ−ｐＶｕｌ［で切断したｐＵＣ９
プラスミドＤＮＡ（’ＰＬファルマシア社製）の１μｇ
と混合し、常法に従って、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ０．１
１１を加え両方のＤＮＡを結合させた。これを前記のＨ
ａｎａｈａｎの方法に従って、 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ
８３株に形質転換し、形質転換株を得た。これをＬ−グ
ロス液で培養して菌体を得た。この菌体より前記のＢｊ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊの方
法によってプラスミドＤＮＡを得た。このＤＮＡ １μ
ｇを０．２Ｎ苛性ソーダで変性後、エタノール沈殿法に
より変性プラスミドＤＮＡを回収した。これを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、 ５０ｍＭ
ＮａＣ］溶液に溶解し、ユニバーサルプライマーあるい
は逆ユニバーサルプライマー（ＰＬ・ファルマシア社製
）加ｔ。
ｄｉｄｅｏｘｙ法を用いて決定した。先づ上記で得られ
たＰｓｔｌ−Ｐｖｕｌ［切断プレアルブミンＤＮＡｌａ
ｇを同じ（Ｐｓｔ Ｉ−ｐＶｕｌ［で切断したｐＵＣ９
プラスミドＤＮＡ（’ＰＬファルマシア社製）の１μｇ
と混合し、常法に従って、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ０．１
１１を加え両方のＤＮＡを結合させた。これを前記のＨ
ａｎａｈａｎの方法に従って、 Ｅ、 ｃｏｌｉ ＪＭ
８３株に形質転換し、形質転換株を得た。これをＬ−グ
ロス液で培養して菌体を得た。この菌体より前記のＢｊ
ｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｄｏｌｙ、 Ｊの方
法によってプラスミドＤＮＡを得た。このＤＮＡ １μ
ｇを０．２Ｎ苛性ソーダで変性後、エタノール沈殿法に
より変性プラスミドＤＮＡを回収した。これを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
２．１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、 ５０ｍＭ
ＮａＣ］溶液に溶解し、ユニバーサルプライマーあるい
は逆ユニバーサルプライマー（ＰＬ・ファルマシア社製
）加ｔ。
６５°Ｃで５分間加温後、 Ｋｌｅｎｏｗ酵素・４１１
．２０１１ＣＩ ノα−８２ｐ −ｄ ＣＴＰ 、適当
なｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合液を加えて、 Ｓａｎｇｅ
ｒらの方法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ。
．２０１１ＣＩ ノα−８２ｐ −ｄ ＣＴＰ 、適当
なｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合液を加えて、 Ｓａｎｇｅ
ｒらの方法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、 Ｎ１ｃｋｌｅｎ。
Ｓ ａｎｄ Ｃｏｕｌｓｏｎ、 Ａ、 Ｒ，、Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７４．５４６３〜（’１９７７））に従って反
応を行った。これを８％ポリアクリルアミド、 ８Ｍｕ
ｒｅａゲル及び２０％ポリアクリルアミド、 ７Ｍｕｒ
ｅａゲルで電気泳動させた。泳動終了後ゲルをオートラ
ジオグラフィにかけ塩基配列を決定した。決定された塩
基配列は以下の通りであった。
応を行った。これを８％ポリアクリルアミド、 ８Ｍｕ
ｒｅａゲル及び２０％ポリアクリルアミド、 ７Ｍｕｒ
ｅａゲルで電気泳動させた。泳動終了後ゲルをオートラ
ジオグラフィにかけ塩基配列を決定した。決定された塩
基配列は以下の通りであった。
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣ；ＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＴＣ
ＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣ
ＴＣＡＴＭ ｅ ｔ Ａ ］ ａ Ｓ
ｅ ｒ Ｈｉ ５ＣＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴ
ＣＴＧＣＡ ｒ ｇ Ｌ ｅ ｕ Ｌ ｅ ｕ Ｌ ｅ
Ｉ］ Ｌ ｅ ｕ Ｃｙ ５ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＴ
ＧＧＴＡＴＴＴＬｅｕＡｌ ａＧ］ｙＬｅｕＶａ ］Ｐ
ｈｅＧＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＶａｌＳｅ
ｒＧｌｕＡ］ａＧ］ｙＰｒ。
ＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣ
ＴＣＡＴＭ ｅ ｔ Ａ ］ ａ Ｓ
ｅ ｒ Ｈｉ ５ＣＧＴＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴ
ＣＴＧＣＡ ｒ ｇ Ｌ ｅ ｕ Ｌ ｅ ｕ Ｌ ｅ
Ｉ］ Ｌ ｅ ｕ Ｃｙ ５ＣＴＴＧＣＴＧＧＡＣＴ
ＧＧＴＡＴＴＴＬｅｕＡｌ ａＧ］ｙＬｅｕＶａ ］Ｐ
ｈｅＧＴＧＴＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＶａｌＳｅ
ｒＧｌｕＡ］ａＧ］ｙＰｒ。
ＡＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＣＴｈｒＱｌｙＴ
ｈｒＧｌｙＧｌｕＳｅｒＡＡＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＴ
ＧＧＴＣＬ ｙ ｓ Ｃｙ ｓ Ｐ ｒ ｏ Ｌ ｅ
ｕ Ｍ ｅ ｔ Ｖ ａ ］ＡＡＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴ
ＧＣＴＧＴＣＬｙｓＶａｌＬｅｕＡｓｐＡ１ａＶａｌＣ
ＧＡＧＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＡｒｇＧｌｙＳｅ
ｒＰｒｏＡｌａＩ ＩｅＡＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＧＣＡ
ＴＧＴＧＡ ｓ ｎ Ｖ ａ ］ Ａ １ ａ Ｖ ａ
Ｉ Ｈｉ ｓ Ｖ ａ ］ＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＣＴ
ＧＣＴＧＡＴＰｈｅＡｒｇＬｙｓＡ］ ａＡｌ ａＡｓ
ｐＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＡｓｐＴｈ
ｒＴｒｐＧ１ｕＰｒｏＰｈｅＴｙｒＬｙｓＶａｌＧ］ｕ
ｌｌｅＡｓｐＡｓｐ Ｓ ｅｒＧ１ｙＰｒｏＡｒｇＡ
ｒｇＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴｈｒＡｓ
ｎＰｒｏＬｙｓＧＩｕ半米米ＧＧＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴ
ＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴ
ＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＴ
ＣＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡ
ＡＣＴＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧ
ＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ これらの配列からプレアルブミン前駆体−は第２７位の
Ａから始ｔｂ、第４６７位のＡで終了する。そのうちプ
レアルブミンは第８７位のＧから始マシ。
ｈｒＧｌｙＧｌｕＳｅｒＡＡＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＴ
ＧＧＴＣＬ ｙ ｓ Ｃｙ ｓ Ｐ ｒ ｏ Ｌ ｅ
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ＧＣＴＧＡＴＰｈｅＡｒｇＬｙｓＡ］ ａＡｌ ａＡｓ
ｐＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＴＡｓｐＴｈ
ｒＴｒｐＧ１ｕＰｒｏＰｈｅＴｙｒＬｙｓＶａｌＧ］ｕ
ｌｌｅＡｓｐＡｓｐ Ｓ ｅｒＧ１ｙＰｒｏＡｒｇＡ
ｒｇＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＧＡＴｈｒＡｓ
ｎＰｒｏＬｙｓＧＩｕ半米米ＧＧＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴ
ＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＡＴ
ＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＴ
ＣＣＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡ
ＡＣＴＣＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＡＧＴＣＡＧ
ＧＡＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＣＡＴＴＣＣＴＧＴＣＡ
ＡＡＡＡＡＡＡＡ これらの配列からプレアルブミン前駆体−は第２７位の
Ａから始ｔｂ、第４６７位のＡで終了する。そのうちプ
レアルブミンは第８７位のＧから始マシ。
第４６７位のＡで終了する。
なお本塩基配列決定のために用いたプレアルブミンＤＮ
Ａ−ｐＵＣ９連結プラスミドの構造、制限酵素切断部位
、ユニーバサルプライマーおよび逆プライマーの位置と
方向を第２図に示す。
Ａ−ｐＵＣ９連結プラスミドの構造、制限酵素切断部位
、ユニーバサルプライマーおよび逆プライマーの位置と
方向を第２図に示す。
第１図および第２図は本発明のクロン化プレアルブミン
ＤＮＡおよびこれを含むプラスミドの各種制限酵素のサ
イトを説明する図である。 ％許出廉人 三井ｆ！薬工裟株尤会註 榊 佳 え ”Ｊ、 ｉ Ｉｎ Ｈ＝、ｉｔ □二 へ゛タグ−ＤＮＡ 二二コ： り口ｙ化ＤＮＡ １２川 １−１ａｃ”ＩＬ −：へ゛ククー Ｄ汀へ ：：クロシイとｐ灯へ → ；ユニハ゛′−１ルアフイτ− → 二ａ７°ライン一
ＤＮＡおよびこれを含むプラスミドの各種制限酵素のサ
イトを説明する図である。 ％許出廉人 三井ｆ！薬工裟株尤会註 榊 佳 え ”Ｊ、 ｉ Ｉｎ Ｈ＝、ｉｔ □二 へ゛タグ−ＤＮＡ 二二コ： り口ｙ化ＤＮＡ １２川 １−１ａｃ”ＩＬ −：へ゛ククー Ｄ汀へ ：：クロシイとｐ灯へ → ；ユニハ゛′−１ルアフイτ− → 二ａ７°ライン一
Claims (6)
- （１）肝において生産されるプレアルブミンをコードす
る遺伝子に由来し、塩基配列 【塩基配列があります】 （配列中ＸはオリゴｄＧを、Ｙはノンコーディングシー
ケンスを表わす）で表わされるクロン化ＤＮＡ - （２）肝において生産されるプレアルブミンをコードす
る遺伝子に由来し、塩基配列 【塩基配列があります】 （配列中ＸはオリゴｄＧを、Ｙはノンコーディングシー
ケンスを表わす）で表わされるクロン化ＤＮＡをｐＢＲ
３２２−ＳＶ４０−ρ因子ＤＮＡ連結ベクターのＰｓｔ
I −Ｐｖｕ I 部位間において挿入してなる、くみかえ
ＤＮＡプラスミド。 - （３）肝において生産されるプレアルブミンをコードす
る遺伝子に由来し、塩基配列 【塩基配列があります】 （配列中ＸはオリゴｄＧを、Ｙはノンコーディングシー
ケンスを表わす）で表わされるクロン化ＤＮＡを含有す
るくみかえＤＮＡプラスミドを有し、これを複製させる
能力がある、エシエリシヤ属に属する微生物。 - （４）ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０−ρ因子ＤＮＡ連結ベク
ターのＰｓｔ I −Ｐｖｕ I 部位間にクロン化ＤＮＡの
挿入されたくみかえＤＮＡプラスミドを有するエシエリ
シヤ・コリＤＨ１の形質転換株である特許請求の範囲第
３項記載の微生物。 - （５）ヒト肝をグアニジン塩酸で抽出してｍＲＮＡを含
む分画を分離し、別にｐＢＲ３２２とρ因子ＤＮＡとの
ハイブリドプラスミドを制限酵素Ｋｐｎ I で消化して
ＤＮＡを分離し、これにターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼによりＫｐｎ I の開裂部位に
オリゴｄＴテールを付加させ、生成したオリゴｄＴテー
ルＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ I エンドヌクレアーゼで
切断して長い方のＤＮＡ断片を分離してプラスミドプラ
イマーを調製し、更にまた別にｐＢＲ３２２とＳＶ４０
とのハイブリドプラスミドを制限酵素Ｐｓｔ I エンド
ヌクレアーゼで切断し、ターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼによりオリゴｄＧテールを付加
し、制限酵素ＨｉｎｄIIIエンドヌクレアーゼで消化し
て短い方のＤＮＡ断片を分離してリンカーＤＮＡを調製
し、さきに調製したｍＲＮＡを含む分画及びプラスミド
プライマーを逆転写酵素の存在下でｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ
、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰと反応させてプラスミド−ｃＤ
ＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を調製し、これにターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼによってオリゴ
ｄＣテールを付加させ、オリゴｄＣテールを付加したプ
ラスミド−ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体を制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIIで消化し、更にこれをＤＮＡリガーゼの存在下で
さきに調製したリンカーＤＮＡと反応させて環化させ、
生成した環状ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ複合体プラスミドをＤ
ＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びリボヌクレアー
ゼＨの存在下でｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣ
ＴＰと反応させ、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖で置換してｃＤＮ
Ａセグメント含有プラスミドを調製し、調製したプラス
ミドでエシエリシヤ属に属する微生物を形質転換し、形
質転換された微生物のコロニーを肝プレアルブミンのア
ミノ酸配列に対応する標識されたオリゴヌクレオチドを
プローブとしてスクリーニングすることを特徴とする形
質転換された微生物の製造方法。 - （６）形質転換された微生物が塩基配列 【塩基配列があります】 （配列中ＸはポリｄＧを表わし、Ｙはノンコーディング
シーケンスを表わす）で表わされるＤＮＡを含有するプ
ラスミドを有するエシエリシヤ・コリである特許請求の
範囲第６項記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17340484A JPS6152292A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | クロン化プレアルブミンｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17340484A JPS6152292A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | クロン化プレアルブミンｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6152292A true JPS6152292A (ja) | 1986-03-14 |
Family
ID=15959791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17340484A Pending JPS6152292A (ja) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | クロン化プレアルブミンｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6152292A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01117790A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-05-10 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法 |
-
1984
- 1984-08-22 JP JP17340484A patent/JPS6152292A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01117790A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-05-10 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法 |
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