JPH01117793A - ユビキノン９の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 屡」Ｌ辷曵オｌ九舅− 本発明は、補酵素の一種であるユビキノン９を微生物を
利用して製造する方法に関する。

盗米立亘東 補酵素Ｑとして知られているユビキノンは下記式（１） （但し、式中ｎは１〜１２の整数である。）で示され、
側鎖のイソプレノイド単位数ｎによりＣｏ　Ｑｉｔ　Ｃ
ｏ　Ｑ＊、　”””Ｃｏ　Ｑｘｉとされている。

このうちｎが９のＣｏ　Ｑ　ｓはユビキノン９といわれ
、脳血管障害、心不全、高血圧、糖尿病の治療薬、抗が
ん剤アドリアマイシンの副作用防止等として有用である
ことが知られている。

従来、このユビキノン９を製造する方法としては、下記
■、■、■に示すような微生物の培養物や■、■に示す
ような植物の培養細胞の培養物からユビキノン９を得る
方法などが知られている。

■キャンディダ属、ショートモナス属に属す７＋Ｗ（特
公昭４４−１０７５２号公報）。

■アクロモバクター属に属する菌（特公昭４４−２６９
０８号公報）、 ■イネ科植物の培養細胞（特開昭５３−７２８９５号公
報）、 ■紅花の培養細胞（特開昭５４−８０４９１号公報）、 ■グラフィオラ属に属する菌（特開昭５６−１４８２９
２号公報）。

日が　　しよ　とする− しかしながら、上記■〜■の方法は菌体又は培養細胞か
らのユビキノン９の生成量が低く、また■の方法は乾燥
菌体からのユビキノン９の生成量は多いが、培養時の菌
体濃度が低いという欠点を有し、いずれの方法も工業的
に不利であった。

このため、従来よりユビキノン９を効率良く生産し得る
工業的に有利な製造方法の開発が望まれていた。

問題点を解決するための手段及び作用 本発明者ら゛は、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果
、モルティエレラ属に属する菌を栄養培地を用いて培養
し、培養物の脂質成分中からユビキノン９を分離するこ
とにより、ユビキノン９を効率良く製造できることを知
見した。

従来より、モルティエレラ属に属する菌を炭素源の存在
下で培養するとその培養物からγ−リルン酸を含む脂質
を採取することができることが知られており（特開昭５
７−１４４９８６号公報、特開昭６０−１６８３９１号
公報）、また、先に本出願人はかかる炭素源として脂肪
酸又はそのエステルを用いるとγ−リルン酸を含む脂質
をより効率良くかつ安価に製造し得ることを提案した（
特願昭６１−２７９１４７号）。

本出願人らは更に研究を進め、上記モルティエレラ属に
属する菌を栄養培地を用いて培養すると。

意外にもかかる菌が栄養培地中で炭素源を補酵素の一つ
であるユビキノン９に変換してユビキノン９を多量に産
生じながら増殖し、しかもこのユビキノン９が培養物の
脂質成分中に混在すること、従って増殖した菌体から脂
質成分を抽出し、特に脂質成分中の不けん化物成分を高
速液体クロマトグラフィー等で分離することにより、ユ
ビキノン９を採取し得ることを見い出し、本発明をなす
に至った。

従って、本発明はモルティエレラ属に属する菌を栄養培
地を用いて培養し、該培養物の脂質成分中からユビキノ
ン９を分離することを特徴とするユビキノン９の製造方
法を提供する。

以下、本発明につき更に詳しく説明する。

本発明において泪いるモルティエレラ属の菌の種類に特
に制限はなく、この属に属するものであればいずれのも
のでも使用し得るが、特にモルティエレラ・イサベリナ
ＩＦ０７８７３等を好適に使用し得る。

また、栄養培地中の配合成分の種類にも制限はなく、種
々のものを使用し得るが、特に培養に際して適切な炭素
源、窒素源、無機塩、更には必要に応じて増殖因子、界
面活性剤、その他の栄養源などを配合することが好まし
い。ここで、栄養培地の成分を具体的に例示すると、炭
素源としてはグルコース等の炭水化物（培地濃度３００
〜Ｌｏｇ／１００１００Ｏ、ｎ−アルカン等の炭化水素
（５０〜Ｌｏｇ／１００ｄ）　、カプリン酸、カプリル
酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステア
リン酸、オレイン酸、リノール酸等の炭素数８〜２２の
脂肪酸又はそのアルキルエステルや主にパルミチン酸及
びオレイン酸より構成されるパーム油、主にオレイン酸
及びリノール酸より構成される大豆油、コーン油、落花
生油、米糠油、主にオレイン酸、リノール酸及びエルシ
ン酸より構成されるナタネ油、主にオレイン酸及びリシ
ルイン酸より構成されるヒマシ油等の前記脂肪酸のエス
テル（１００〜１０　ｇ／　１０００ｍ１１）など、窒
素源としては尿素、ペプトン、大豆蛋白。

コーン・スチープ・リカー等の有機窒素源や（ＮＨ４）
２Ｓｏ４．ＮＨ，Ｎｏ、等の無機窒素源など、無機塩と
してはＫ　Ｈｚ　Ｐ　Ｏ４ｅ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ
，Ｏ。

ＦｅＳＯ４・７Ｈ，Ｏ，Ｚｎ５Ｏ，・７Ｈ，○。

ＣａＣＱ、・２Ｈ，Ｏ，Ｃｕ５Ｏ，・５Ｈ，Ｏなど、増
殖因子としては酵母エキス、麦芽エキスなど、界面活性
剤としてはポリオキシエチレン（６０）ソルビタン脂肪
酸エステルなどを挙げることができる。

本発明において、上記菌体の培養方法に限定はないが、
液体培地で振盪培養、通気攪拌培養にょり培養を行うか
、或いは液体培地をスポンジ等に含浸して固体培養によ
り培養を行うことが好ましい。また、培地のＰＨは３．
５〜５．５、培養温度は１５〜３５℃、培養時間は９０
〜１５０時間程度とすることが好適である。

更に、培養終了後、培養物から脂質成分を採取する方法
としては公知の手段を採用し得、例えば培養物より菌を
集菌した後、破砕助剤を用いてホモジナイザーで菌体の
破砕を行うと共に、抽出溶媒により脂質を抽出する方法
などを好適に採用し得る。ここで、抽出溶媒としては、
非極性溶媒と極性溶媒との混合溶媒を使用することが好
ましく。

具体的にはｎ−ヘキサンとエタノールとの混合溶媒、ク
ロロホルムとメタノールとの混合溶媒等が例示され、中
でもｎ−ヘキサンとエタノールとの混合溶媒が好適に使
用し得る。なお、上記混合溶媒における非極性溶媒と極
性溶媒との混合比は３：１（容量／容量、以下同様）〜
１：３、特に２：１とすることが好ましい。

本発明において、培養物の脂質成分中からユビキノン９
を分離する方法も限定はないが、ユビキノン９が脂質成
分中の不けん化物成分に存在するので、脂質成分を上記
混合溶媒で抽出し食塩水等で塩析した後に非極性溶媒層
を分取し、この非極性溶媒層より得られた脂質をメタノ
ール性アルカリでけん化した後、不けん化物を非極性溶
媒で抽出し、この中からユビキノン９を分離する方法を
採用し得る。また、脂質をけん化した後、ｎ−ヘキサン
等の非極性溶媒で抽出し、脂肪酸と不けん化物とを得、
不けん化物からユビキノン９を分離する方法も採用し得
る。

なお、上記脂質成分中にはユビキノン９と共にγ−リル
ン酸などが含有されているが、これらはけん化物成分中
にあるのでユビキノン９とは効率よく分離することがで
きる。

更に、不けん化物成分からユビキノン９を採取する方法
としては例えば非極性溶媒に溶かして薄層クロマトグラ
フ、カラムクロマトグラフを行なう等の方法が挙げられ
るが、中でもＯＤＳを充填剤としたカラムクロマトグラ
フを行うことにより、ユビキノン９を収率良く採取する
ことができる。

見匪立羞果 以上説明したように、本発明のユビキノン９の製造方法
によれば、モルティエレラ属の菌体がユビキノン９を多
量に産生じながら高濃度に増殖するので、ユビキノン９
を効率良く得ることができ、工業的に有利である。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明は下記実施例に制限されるものではない。

〔実施例１〕 ｉ生叫鹿亙 グルコース８０ｇ、（Ｎ　Ｈ＊）ｔ　Ｓ　Ｏ４３ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４５ｇ、Ｍｇ５Ｏ＊７ＨｚＯ２，５ｇ。

ＫＣＱ　　０．５ｇ、Ｆｅ５０．・７Ｈ，０５０，、酵
母エキス５ｇ、大豆蛋白５　ｇ、　Ｃａ　ＣＱ、・２Ｈ
，０１，２■、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，２ｆｆ１ｇ、
ｚｎＳｏ４・７　Ｈｚ　ＯＬ　−Ｏｍｇを蒸留水ＩＱに
溶解し、ｐＨ４，５に調整した。この培地１．８Ｑを３
Ｑ容ジャーファーメンタ−に仕込んだ。これにモルテイ
エレラ・イサベリナＩＦ０７８７３菌株を植菌した後、
温度３０℃、通気量０．５ＶＶＭ、攪拌速度５００ｒｐ
ｍで９６時間培養した。培養後、ガラス繊維２紙で集菌
した（菌体収量：乾燥菌体重量で３７　ｇ　／　Ｑ　−
ｂｒｏｔｈ）。

血ｉ座皿監 上記菌体をｎ−ヘキサン／エタノール＝２／１（容量／
容量）を抽出溶媒、ガラスピーズを破砕助剤としてホモ
ジナイザーでホモジナイズし、菌体の破砕及び脂質の抽
出を行った。この抽出液を回収して食塩水で塩析、洗浄
し、ｎ−ヘキサン層を集めて無水芒硝で脱水した後、ｎ
−ヘキサンを留去して脂質を得た。脂質は、乾燥菌体１
ｇ当たり０．３３ｇ得られた。

ユビキノン９の　　、 上記方法で得られた脂質１ｇを１０ｍＱの水に懸濁し、
メタノール８０ｄｌ、ＮａＯＨ８ｇ、ピロガロール１ｇ
を加えて１時間加熱還流した。冷却後、ｎ−ヘキサン１
００−と水５０ａｌｌを加えて２回抽出を行った。更に
、このｎ−ヘキサン層を水で３回洗浄し、無水芒硝を加
えて脱水後、ｎ−へキサンを留去して乾燥物を得た。

得られた乾燥物をｎ−ヘキサン１０ｍ１に溶解し、高速
液体クロマトグラフィーでユビキノン９を分離した（カ
ラム：ｏＤＳ、４．５ｍ＄Ｘ３Ｑａｍ、展開溶媒：エタ
ノール／水＝９９．５１０．５（容量／容量）、流量：
　０　、８　ｍＱ／ｍｉｎ、検出器：紫外吸収２７５ｎ
ｍ）。

純品のユビキノン９（シグマ社製）を用いてＲ，Ｔ、と
絶対検量法で定量を行い、薄層クロマトグラフ法、紫外
吸収スペクトルで定性を行ったところ、上記脂質中には
ユビキノン９が１０００ｐｐ璽存在していた。

（実施例２〕 菫生立夏亙 粗パーム油５０ｇ、大豆蛋白２５ｇ、酵母エキスｌＯｇ
、ＫＨｚＰＯ＊　１５ｇ、Ｍｇ５Ｏ，−７ＨｚＯＬ、５
ｇ、Ｆｅ３Ｏ３・７Ｈ，０５０■、ＣａＣＱ、・２Ｈ，
０１，２ｍｇ、ＣｕＳＯ４”５Ｈ，００，２ａｇ。

Ｚｎ５Ｏ，−７Ｈ，０１，ＯＩ＋ｇ、シヨ糖脂肪酸エス
テル２．５ｇ、脂肪酸モノグリセライド２．５ｇを蒸留
水ＩＱに溶解し、ｐＨ４，５に調整した。

この培地１．８Ｑを３Ｑ容ジャーファーメンタ−に仕込
んだ、これにモルティエレラ・イサベリナＩＦ０７８７
３菌株を植菌し、実施例１と同条件で１５０時間培養し
て集菌したところ、菌体収量は乾燥菌体重量で４６　ｇ
／　Ｑ　−ｂｒｏｔｈであった。

胤叉免皿仇 実施例１と同様に抽出処理したところ、乾燥菌体１ｇ当
たり０．２５ｇの脂質が得られた。

ユビキノン９の　　、　量 実施例１と同様の方法で脂質からユビキノン９を分離、
定量したところ、脂質中にユビキノン９が２９００ｐｐ
ｍ存在していた。

〔実施例３〕 実施例２と同様な方法で得られた脂質４０ＨにＫＯＨｌ
ｏｇ、メタノール８００ｍＱを加え、水浴上で１時間還
流した後、メタノールを留去した。

これを水に溶解し、過剰の硫酸を加え、水浴上で１時間
酸分解した。冷却後ｎ−ヘキサンで抽出し、ｎ−へキサ
ンを留去すると、脂肪酸とその他年けん化物が得られた
。これを５０ｄのメタノールに溶解し、ＯＤＳを充填剤
としたカラムクロマトグラフにかけた（カラム：５０φ
Ｘ　５０　（！＠　ｗ展開溶媒ニアセトニトリル、流速
４０ｍ１／ｌ１ｉｎ、検出器ＲＩ）、脂肪酸を溶解させ
た後に展開溶媒をエタノールに変え、カラムに吸着して
いる不けん化物を溶離させた。これを集めてエタノール
を留去し、濃縮した後にカラムクロマトグラフでユビキ
ノン９を分離した（カラム＝５０φ×５０ａ１１．充填
剤ＯＤＳ、展開溶媒：エタノール／水＝９９．５１０、
５　（Ｖ／Ｖ）　、流速４０　ｄ／ｍ１ｎｅ検出器：紫
外吸収２７５ｎｍ）、ユビキノン９のフラクションを集
めて溶媒を留去したところ、ユビキノン９の粗結晶１１
０■が得られた。

出願人　　ラ　イ　オ　ン　株式会社 代理人　　弁理士　小　島　隆　司

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モルティエレラ属に属する菌を栄養培地を用いて培
   養し、該培養物の脂質成分中からユビキノン９を分離す
   ることを特徴とするユビキノン９の製造方法。 ２、培養物の脂質成分をけん化した後、不けん化物を非
   極性有機溶媒で抽出してユビキノン９を採取する特許請
   求の範囲第１項記載の製造方法。