JPH01123152A - 牛白血病ウイルス由来の診断薬を用いた診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、牛白血病を引き起すレトロウィルス弁接に関
する。

［従来の技術］ 牛白血病ウィルス（ｎｔ、■）は、牛白血病を引き起す
レトロウィルスの一種として知られており、蔓延しつつ
ある牛白血病の予防対策として、ＢＬＶワクチンやＢＬ
Ｖに対する抗血清あるいは抗ウィルス剤の実用化が強く
要請されている。

ＢＬＶワクチン等の開発のために必要なりＬＶ抗原につ
いては、ヒツジ、ヤギ、ウシなど、およびこれら動物由
来細胞において研究されてきている。

ＢＬＶ自体の取得方法については、例えば農林水産省家
畜衛生試験場から分譲を受けることのできるＢＬＶが持
続感染しているＦｅｔａｌ　ｌａｍｂ　ｋｉｄｎｅｙ細
胞（以下ＦＬＫ−ＢＬＶと略記する）などの株化細胞を
培養し、培養細胞あるいは培養上清がらＩＩＬＶを分離
する方法が特開昭６１−２００４７１号公報に開示され
ている。

［発明が解決しようとする問題点］ 蔓延しつつある牛白血病に罹患している牛あるいはＢＬ
Ｖ感染牛の所在を明らかとするための感度の良い診断薬
への要請が高まっている。

また、上述のように［ｌＬＶワクチンに対する要請が高
まるなかで、開発したＢＬＶワクチンの効果を確認する
ための精度良い検定方法についての、要請も高まりつつ
ある。

すなわち、ＩＩＬＶ不活性化抗原による各種動物モデル
への免疫試験が行なわれ、その中で種々の検定方法が開
発されてきたが、本来の宿主である牛での研究は少ない
。

また、ＢＬＶ感染牛の診断のため及び旧、■ワクチンの
検定用の抗原成分として必要な不活性化ＢＬＶどのＢＬ
Ｖ感染細胞の培養細胞あるいは培養上清から分離できる
方法は未だ確立されていなかった。

例えば、前述の特開昭６１−２００４７１号公報に開示
された方法では、ＢＬＶの分離に蔗糖などを用いた超遠
心密度勾配法による分画を行なっているが、これはコス
トがかかり大変煩雑な方法であり、またＢＬＶＩＡ−離
の過程でＢＬＶが損傷を受はエンベロープを構成する環
タンパク質が多量に失なわれ易く、実用的ではない。

また、ＢＬＶの宿主細胞が生細胞であれば良いが、ｐ＋
、ｇ−ＢＬｖなどの羊細胞の場合には、羊細胞の激しい
破壊を行なうと、羊細胞抗原がＢＬＶ抗原及び牛胎児血
清とまじりあってワクチン化され、牛に免疫された際、
丸種抗原か全面に出てアレルギー反応をより強く惹起す
る危険性がある。そこで、界面活性剤などで処理する工
程を含まない操作法を考案する必要があった。

また、硫安塩析などの濃縮方法はＢＬＶタンパク質を変
性・失活させる可能性もある。

本発明は旧、■感染中の新たな診断法およびＢＬＶワク
チンの実用化に必要な技術的課題解決するために成され
たものであり、その目的は、現在市販されている寒天ゲ
ル内沈降反応よりもより感度の良いＢＬＶ感染牛の診断
方法およびＢＬＶワクチンの精度良い検定方法を提供す
ることにある。

［問題点を解決するための手段］ 上記目的を達成する本発明の検定方法は、牛白血病ウィ
ルス由来のタンパク質を抗原として付着させたプレート
を用いた酵素抗体免疫測定法により免疫した牛の抗体価
を測定することを特徴とする。

すなわち、本発明の方法は、酵素抗体免疫測定法（Ｅｌ
ｉｓａ法）における抗体価測定用プレートに予め牛白血
病ウィルス由来の不活性タンパク質を抗原として付着さ
せておき、酵素抗体免疫測定法を行なって抗体価を検定
するものである。

プレートに吸着させる牛白血病ウィルス由来の不活性タ
ンパク質は以下のようにして調製されたものを用いる。

牛白血病ウィルスを感染させた宿主細胞の培養細胞また
はその培養液等から牛白血病ウィルスを含む粗タンパク
質を調製し、該粗タンパク質の牛白血病ウィルスを不活
性化した後、該不活性化牛白血病ウィルスを含む粗タン
パク質を含む溶液をＰｅ１ｌｉｃｏｎ　Ｌａｂ−ｃａｓ
ｓｅｔｔｅ　Ｐｏｒｅ　５ｉｚｅ　１０．（１００（ミ
リポア社製）などを用いて限外濾過で処理し濃縮画分を
得る。この濃縮画分中のタンパク質をプレートに吸着さ
せて用いる。

該方法において用いることのできる宿主細胞としては、
ＦＬＫなどのヒツジ細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、コラモ
リ細胞などを挙げることができ、一般に汎用されている
という点でＦＬにが好ましい。

これらの宿主細胞の培養に用いる培地は、培養しようと
する宿主細胞に応じて適宜選択すれば良い。

例えば、ＦＬＫの場合には、５〜２０ｔの葬儀化した牛
胎児血清（以下ＦＣ５と略記する）を含むＲＰＭ１１６
４０　にラスイ社製）　、　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　
ＭＥＭ　　にラスイ社製）などが利用でる。

一般に、宿主細胞へのＢＬＶの感染及びＢＬＶ感染宿主
細胞の培養は常法に従って行なえば良い。

例えばＦＬに−ＢＬＶの培養の場合には、５〜２０５に
葬儀化ＦＣ５を含むＲＰＭＩ　１６４０中、炭酸ガス雰
囲気下、３７℃の条件で２〜４日間培養する。細胞濃度
は例えば１０５ＮＩＯ’　／ｍｌとする。

培養終了後、例えば２０００ｒｐｍ程度の条件での低速
遠心分離により培養液から細胞除き、培養上清を得る。

次に、培養上清に含まれる［ｌＬＶの不活性化処理を行
なう。

この不活性化処理には、ホルマリン、グルタルアルデヒ
ド、バラホルムアルデヒド等の不活性化剤を用いた処理
が利用できる。

ホルマリンを用いる場合には、上記のようにして得た培
養上清に、最終濃度が０．０５〜０．５を好ましくは０
．１亀となるようにネルマリン溶液（和光純薬社製）を
加え、これを４℃で２４〜７２時間軽く振盪して処理す
る。

なお、Ｔｗｅｅｎ　１００．８０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００などの界面活性化剤などで、ＦＬＫ−ＢＬＶなと
の細胞成分を強く破壊する工程を含まないところにこの
方法の特徴がある。

不活性化処理が終了したところで、他の工程を経ないで
直ちに処理後の溶液を限外濾過にかける。

この限外濾過における操作条件は、不活性化ＢＬＶを含
む溶液から、少なくとも分子量が１万以下の細胞由来成
分や上記の不活性化処理で用いた薬剤などの成分が除去
でき、かつＢＬＶワクチンの抗原成分として直接利用で
きる不活性化ＢＬＶを含む濃縮画分を得るのに必要な条
件に設定する。

ここで用いる濾Ａ膜としては、例えばＰｅｔｌｉｃｏｎ
Ｌａｂ−ｃａｓｓｅｔｔｅ、Ｐｏｒｅ　５ｉｚｅ　ｔｏ
、０００　ＮＭＷＬ（ミリボア社製、ＰＴ　ｆｉｌｔｅ
ｒ）、アミコンＹＭ　ｔｏ　　（アミコン社製）等を挙
げることができる。

限外濾過を行なうに際しては、例えば１党の処理溶液あ
たり５〜！θ時間かけて、５０〜９０倍に濃縮して、Ｂ
Ｓ＾およびホルマリン等を完全に除去した濃縮画分を得
ることができる。更に、蔗糖濃度勾配遠心法によりＢＬ
Ｖタンパク質を精製することができる。

この濃縮画分を凍結乾燥して、ＢＬＶタンパク質を含む
粉末標品を得ることができ、この粉末標品の適当な濃度
の溶液を調製し、Ｅｌｉｓａ法に用いるプレートと接触
させる。

以上の例は、ＢＬＶ感染細胞培養上清を用いた例である
が、これに限定されず、培養上清の代りに北里研究所か
ら人手できる粗ＢＬＶ抗原などのＢＬＶを含む抗原溶液
を適宜用いることができる。

得られた粉末標品（ＢＬＶタンパク質）の検定は、ホル
マリン処理後の濃縮画分の標準溶液（タンパク貿濃度と
して１　ｍｇ／ｍ　ｌ　）を調製し、それを抗−牛白血
病ウイルスエンベロープ・グライコベプタイド抗原モノ
クロナール抗体（ＧＰＡ−１１，セロチック社製）を用
いた酵素抗体免疫測定法（Ｅｌｉｓａ法）で検定し、Ｏ
，Ｄ、（４１０ｎｍ）が０．３以上の場合を陽性と判定
した際に、どの程度の血清希釈まで陽性を示すかを判定
することによって行なうことができ、１：１６以上の血
清希釈まで陽性を示す標品が望ましい。

更に、牛白血病ウィルスを感染させた宿主細胞またはそ
の培養液から牛白血病ウィルスを含む粗タンパク質を調
製し、該粗タンパク質を界面活性剤と接触させてタンパ
ク質を分解して得られた分解混合物からイオン交換法に
より分画して得られる牛白血病ウィルスのコアタンパク
質および牛白血病ウィルスのエンベロープタンパク質を
上記ブレート吸着用のタンパク質として用いることがで
きる。

すなわち、この方法により、牛白血病ウィルスのエンベ
ロープタンパク質（ｇｐ５１）とコアタンパク質（ｐ２
４）とを分離して得ることができ、これらを用いて、Ｅ
ｌｉｓａ法によるＢＬＶワクチンの抗体価の精度良い検
定が可能となる。

以下、ｇｐ５１およびｐ２４の積装分離法について詳述
しする。

まず、先の濃縮画分を得る場合と同様に、培養上清等の
ＢＬＶを含む溶液を、界面活性剤で処理して、該溶液に
含まれるＢＬＶをエンベロープタンパク質とコアタンパ
ク質に分解する。

この分解処理には、例えばノニデットＰ−４０、トライ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ−１００などの界面活性剤の
１種以上を用いることができる。

界面活性剤の使用量あるいは処理条件は適宜選択でき、
例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を用いた場合には、最
終濃度を１％程度とし、４℃で３時間程度の処理によっ
て行なうことができる。

なお、この界面活性剤による処理の前後に、透析、限外
濾過、′ＩＩｔ濃度勾配法等によるＢ１、■を含む溶液
の濃縮工程や予備分離精製工程を組み入れても良い。

例えば、ＢＬＶを含む溶液を、０．１！にのＴｗｅｅｎ
　８０を含む１０ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ）ｌ　７
．２に対して透析して、しかる後蔗糖を用いた１１ｍ度
勾配法により濃縮することができる。

また、界面活性剤による処理の後に、例えばラボカセッ
ト（ミリボア社製）、ベリコン（ミリボア社製）等の分
子量１０万〜１００万のフィルターで限外濾過して、濃
縮画分をｇｐ５１調製用に、また濾液画分を９２４の調
製用に用いても良い。

界面活性剤処理によって得られたタンパク質混合物は、
次に陰イオン交換体を用いたイオン交換法により処理す
る。

ここで用いる陰イオン交換体としては、ＤＥ八へ−５ｅ
ｐｈａｃｅｌ　（ファルマシア社製）、　ＤＥ八へ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ　（トーソー社製）等を用いることが
でき、必要に応じて複数回処理しても良い。

界面活性剤処理によって得られたタンパク質混合物を陰
イオン交換体と接触させ、イオン交換体に吸着しない両
分を得ることができる。この非吸着画分を各種精製工程
にかけて、コアタンパク質ｐ２４を含む標品を得ること
ができる。

この非吸着画分の精製には、分子量１万以下を除くアミ
コンＹＭＩＯなどを用いた限外濾過による濃縮工程、５
ｕｐｅｒｏｓｅ　６または１２（ファルマシア社製）等
を用いたゲル濾過によるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の除
去処理、抗ｐ２４モノクローナル抗体結合−５ｕｐｅｒ
ｏｓｅによるアフィニティークロマト等の１以上を組み
入れることができる。

一方、界面活性剤処理によって得られたタンパク質混合
物を陰イオン交換体と接触させ、陰イオン交換体に吸着
した成分からｇｐ５１含む両分を溶出し、更に精製する
ことによってｇｐ５１含む標品を得ることができる。

陰イオン交換体からｇｐ５を含む両分の溶出には、塩濃
度勾配法を用いることができる。

例えば、０．１Ｍと０．５ＭのＮａ（：Ｉ溶液の組み合
せによる段階的な塩濃度勾配を用い、０．５Ｍ　Ｎａ１
１画分中にｇｐ５１を得ることができ、またＯ　−＋０
．５Ｍ　ＮａＣ１の直線的な塩濃度勾配を用い、０．２
Ｍ〜０．３Ｍ画分中にｇｐ５１を得ることができる。

ｇｐ５１を含む溶出画分から、ｇｐ５１を含む標品の精
製には、アミコンＹＭＩＯなとのフィルターを用いた限
外濾過、５ｕｐｅｒｏｓｅ　６（ファルマシア社製）、
ＴＳＫ　：ｌ０００ＳＷ　（トーソー社製）などを用い
たゲル濾過、Ｃｏｎ　八−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　（フ
ァルマシア社製）を用い、溶離剤としてα−メチル−マ
ンノシドを用いるよるアフィニティークロマト、抗ｇｐ
５１モノクロ一ナル抗体結合−５ｅｐｈａｒｏｓｅによ
るアフィニティークロマト等の１以上を組いれることが
できる。

本発明のｇｐ５１およびｐ２４の分離特製方法における
一例の操作の代表例を第１図〜第３図に示す。

以上のようにして得られたｇｐ５１およびｐ２４をプレ
ートに吸着する。

以下本発明の方法に一例について詳細に説明する。

まず、上記のようにして得た不活性ＢＬＶ・タンパク質
、ｇｐ５１およびｐ２４の１つを、適当な濃度の溶液そ
の５０μｌを、Ｅｌｉｓａ法用９６ウヱルマイクロプレ
ートに接触させる。

これらのタンパク質の溶液あるいは希釈液を得には、例
えば５０ｍＭ炭酸バッファー、ｐＨ９，６等を用いるこ
とができる。

吸着すべきタンパク質の溶液のタンパク濃度としては、
ｌｎｇ／ｍｌ−１００μｇ／ｍｌ程度から適宜選択する
。

これらタンパク質とプレートとを例えば、４〜３７℃、
１〜２４時間程度接触させることにより、吸着を充分に
行なうことができる。

Ｅｌｉｓａ法用９６ウエルマイクロプレートとしては、
Ｅｌｉｓａ法に利用できるものであればどのようなもの
でも使用でき、例えばフロー社製、ヌンク社製、グライ
ナー社製のものが利用できる。

吸着操作が終了したところで、ダルベツコＰＢＳ（−）
　（０，０５！Ｉｉ　Ｔｗｅｅｎ　８０２０含有、以下
ＰＴと略する）で各ウェルを洗浄する。

次に、オボアルブミン（ＯＶＡ　）　、カゼイン、ゼラ
チンを含有するＰＴの１００μｌを各ウェルに加え、室
温で６時間放置し、更にＰＴで各ウェルを洗浄する。

このときのＯＶＡ等の濃度は、１％程度とすれば良い。

ワクチンで免疫した牛より得た抗血清を、０．１！ｋＯ
ｖ＾を含有するＰＴで例えば１：ｌＯＯなとの適当な濃
度に希釈し、分析用サンプルとする。

この分析用サンプルの５０μｍを上述のようにして調製
したプレートのウェルに加えた後、それを４〜３７℃、
１〜２４時間程度放置し、ＰＴで洗浄する。

次に、０．１！ｋ　　ＯＶＡを含有するＰＴで適当な濃
度に希釈したウサギ抗−ウシＩｇＧ（ＩＩ＋Ｌ）−パー
オキシダーゼの５０μｌをウェルに加え更に室温で２時
間放置し、ＰＴで洗浄する。

このときのウサギ抗−ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−パーオキ
シダーゼの濃度は免疫した牛の抗体価の程度に応じて適
宜選択する。また、酵素としてパーオキシダーゼがβ−
ガラクトシダーゼ等に、ウサギ抗−ウシ抗体が羊抗ウシ
抗体等に、ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）がＩｇＧ（Ｆｃ）に置き代
ったものを用いても良い。

ＰＴでの洗浄後、ウェルに、０．０２鵠の２．２′−ア
ジノービス（３−エチルベンズチアゾリンスルフオン酸
ジアンモニウム塩及びＯ，＋５％過酸化水素水を含有す
る５　０ｍＭクエン酸バファー、ｐＨ４，０の１００μ
ｍを各ウェルに加え、室温で１５分間反応させた、直ち
に４１４ｎｍの吸光度をイムノリーダーＮＪ−２０００
（日本インターのメッド社製）で測定した。

［実施例］ 以下、実験例および実施例により本発明を更に詳細に説
明する。

実験例！ ＦＫＬ−ＢＬＶ　　（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍａａｔｅｎ博
士樹立）を、培養細胞濃度１０’個／ｍｌでＴ−７５ｆ
ａｌｃｏｎ　ｐｌａｓｔｉｃ　ｆｌａｓｋ（５０ＩＩ１
１）中の１０’４　Ｆｅ２を含むＲＰＭＩ　１６４０培
養液にラスイ社製）で、３７℃、炭酸ガス雰囲気下、２
〜４日培養した。

得られた培養液を２００Ｏｒｐｍの遠心分離処理し、Ｆ
ＫＬ−ＢＬＶ培養細胞を沈殿させ、その上清を集めた。

次に、培養上清（ｉｎ）に最終濃度が０．１！にとなる
ようにホルマリン溶液（和光純薬社製）を加え、４℃で
４８時間軽く振盪した。

このホルマリン処理を経た培養上清を次に、Ｐｃ１ｌｉ
ｃｏｎ　Ｌａｂ−ｃａｓｓｅｔｔｅ　Ｐｏｒｅ　５ｉｚ
ｅ　１０，０００　ＮＭＷＬ（ミリボア社製、ＰＴフィ
ルター）を用いた限外濾過にかけた。

濾過は１２のホルマリン処理培養上清あたり５〜ＩＯ時
間かけ、５０〜９０倍に濃縮した。また、濾過操作の途
中で、蒸留水を２００１０１はど濃縮液に加えて、数回
限外濾過を縁り返した。

２０ｍ１程度まで濃縮された溶液を凍結乾燥処理し、粉
末標品（ＢＬＶタンパク質）を得た。

実験例２ 実験例１で得られた粉末標品を蒸留水に溶解し、タンパ
ク質濃度が１　ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、この溶液を
抗−牛白血病つイルスエンヘローブ・グライコベブタイ
ド抗原モノクロナール抗体（ＧＰＡ−１１、セロチック
社製）を用いた酵素抗体免疫測定法（Ｅｌｉｓａ法）で
検定し、Ｏ，Ｄ、（４１０？＋１１１）が０，３以上を
抗原活性ありと判定したところ、１：２５６の血清希釈
まで陽性を示した。

次に、粉末標品を、蒸留水に溶解し、タンパク質濃度が
３００ｍｇ／ｆｆ１ｌの溶液を調製し、これに同容量の
フロイント完全アジュバント（デイフコ、社製）を加え
旧、■ワクチンを得た。

実験例３ 実験例１で得られた粉末標品の溶液（タンパク質濃度、
３００ｍｇ／ｍｌ）と同容量の水酸化アルミニウムゲル
液（３００ｍｇ水酸化アルミニウム含有）ＢＬＶワクチ
ンを得た。

実施例１ 実験例２で得たＢＬＶワクチンを、他から隔離されて飼
育され、ＢＬＶに感染していないことが証明されている
２頭の牛（ホルスタイン、２１箇月令）に注射し、ＢＬ
Ｖに対する抗体価を経時的に検定し、ワクチン効果を検
討した。その結果を第４図及び第５図に示す。

なお、抗体価の検定には、後述の実施例２〜４に示すＥ
ｌｉｓａ法などを用いた。また、第４図は抗体価の検定
に、実験例１の濃縮画分から得たＢＬＶタンパク質標品
を吸着させたマイクロプレートを用いた後述の実施例２
で示すＥｌｉｓａ法を用いた場合の結果であり、第５図
は、ｇｐ５１を吸着させたマイクロプレートを用いた後
述の実施例３で示すＥＩｉＳａ法を用いた場合の結果で
ある。

また、Ｅｌｉｓａ法と併用して、免疫した牛の血清を用
いたウェスタンブロッティング、ＢＬＶのフェリチン抗
体法（ｉｍｍｕｎｏｆｅｒｒｉ　ｔｉｎ）により、ＢＬ
Ｖの感染抗原である後述のｇｐ５１およびｐ２４に特異
的な抗体の産生を検査した。

第４図および第５図に示した結果から明らかなように初
回免疫時■、上記標品のタンパク質濃度で量で６０Ｑａ
＋ｇを免疫すると、免疫後２週間で、抗体価が上昇し、
３週間後にその３００ｍｇをアジュバントなしに追加免
疫するａｌｌ乙、その２週間後に、抗体価は更に上昇し
た。抗体価はその後も持続し、１５週目釘再びアジュバ
ントなしに追加免疫したところまた抗体価は明瞭に上昇
した。

一方、放牧されている牛より採血し、得られた血清を後
述の実施例２〜４で示すＥｌｉｓａ法で測定したところ
、抗体陽性牛を発見した。なお、実施例２の方法におい
ては、０．Ｄ、が０．３以上を陽性とした。

スバッファー、ｐＨ７，２（０，１９６Ｔｗｅ、ｅｎ　
８０含有）に対して４℃で１〜２昼夜の条件で透析した
。

透析終了後、透析内液を取り出し、それに最終濃度が１
％となるようにＴｒｉｔｏｎ　Ｘを加え溶解し、４℃、
１５分間放置した。

次に、０．４５ｇｍメンブレン（ミリボア社製）で濾過
し、濾液を上記透析バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｓ（トーソー社製）カラム
（Ｉ　Ｘ　ＩＯｃｍ）に供した。なお、ここで得られた
流出画分（通過画分）は実験例５のｐ２４の分離特製方
法に用いた。

更に、カラムを上記透析バッファーで充分に洗浄した後
、塩化ナトリウム濃度が０から０．５Ｍまでのリニアグ
ラジェントによりカラムに吸着したタンパク質を溶出し
た。

この溶出操作は、０．６ｍｌ／分で行ない、２ｍｌずつ
の両分を集めた。

各両分の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、更に後述
の参考例１に示すＥｌｉｓａ法により抗原の溶出パター
ンを分析した。

その結果、０．２　Ｍ　−０，３Ｍ　ＮａＣ１画分中に
目的とするｇｐ５１が含まれていることが確認された。

ｇｐ５１を含む両分を集め、それをアミコン　ＹＭＩＯ
メンプラン（分子量カットオフ、１万、アミコン社製）
を用いた限外濾過にかけ濃縮した。

容量が、１ｍｌ程度になった溶液を、０．１Ｍリン酸バ
ッファー、ｐＨ７，４（０，３Ｍ塩化ナトリウム含有）
に対して１昼夜透析した。

透析終了後透析内液を、同様のバファーで予め平衡化し
ておいた５ｕｐｅｒｏｓｅ　６カラム（Ｉ　Ｘ　３０ｃ
ｍ。

ファルマシア社製）に供した。

更に、同様のバッファーでカラムを処理し、溶出液を得
た。その際の溶出速度は０．１ｍｌ／分とし、０．５ｍ
ｌずつの分画を集めた。

得られた各分画を後述の参考例１に示すＥｌｉｓａ法に
より分析したところ、ボイドボリュームのところにｇｐ
５１活性が認められた。そこで、ｇｐ５１活性が認めら
れた画分を集め、ｇｌ）り　１を含む画分とした。

実験例５ 実験例４で得たＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０
５からの流出画分を、アミコンＹＭＩＯ（分子量１万カ
ツトオフ、アミコン社製）を用いた限外濾過により濃縮
した。

容量が、１ｍｌ程度になった溶液を、０．１Ｍリン酸バ
ッファー、ｐＨ７，４（０，３Ｍ塩化ナトリウム含有）
に対して透析した。

次に、透析終了後透析内液を、同様のバッファーで予め
平衡化してあいた５ｕｐｅｒｏｓｅ　Ｂカラム（１ｘ３
０ｃｍ、ファルマシア社製）に供した。

同様のバファーでカラムを処理し、溶出液を得た。その
際の溶出速度は０．１ｍｌ／分とし、０．５ｏ＋１ずつ
の分画を集めた。

その結果、トータルボリューム付近に溶出されるＴｒｉ
ｔｏｎ　Ｘ　１００が除去された。

また、得られた各分画を後述の参考例１に示すＥｌｉｓ
ａ法により分析し、ｐ２４活性が認められた両分を集め
、これをｐ２４を含む両分とした。

実験例６ 実験例４で得たｇｐ５１を含む両分のｌ　Ｏｍｇと水酸
化アルミニウムｌ　Ｏｍｇとを混合し、ｇｐ５１ワクチ
ンを得た。

実験例７ 実験例５で得たｐ２４を含む両分の１ｍｇと水酸化アル
ミニウムＩＢとを混合し、ｐ２４ワクチンを得た。

実験例８ 実験例４で得たｇｌ）り　１のｌＯｎ＋ｇ／ｍｌと、血
清胸腺因子（ＦＴＳ）　　１　ｍｇ／　ｌｌ１１をそれ
ぞれｌ　ｉｐｏｓｏｍｅ中に加え混合し、ｇｌ）！ｉ　
ｌワクチンを得た。

実施例２ ＢＬＶタンパク買をプレートに付着させて行なうＥｌｉ
ｓａ法による免疫抗体価の測定は以下のようにして実施
した。

まず、実験例１で得たＢＬＶタンパク質を２０から６０
％までの蔗糖濃度勾配法により８０．０００Ｘｇで遠心
し、密度１．１６ｇ／ｍｌのところのＢＬＶタンパク質
を集めた。このＢＬＶタンパク質を９６穴のＮｕｎｋ社
製マイクロプレートに４００〜８００ｎｇ／ｗｅｌ　ｌ
になるようにコートし、その後３％グルタルアルデヒド
溶液をウェルに加え、４℃で１５分間処理し、ＢＬＶタ
ンパク質を固定した。

次に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０溶液で数回洗浄した。

抗体価を測定すべき血清を加える前に、１％ＢＳ八でプ
レートを洗浄し、その後希釈された牛組清実施例３ ｇｐ５１をプレートに付着させて行なうＥｌｉｓａ法に
よる免疫抗体価の測定は以下のようにして実施した。

実験例ヰで得られたｇｐ５１を含む両分を５０ｍＭ炭酸
バッファー、ｐＨ９，６で希釈して、タンパク質濃度で
１μｇ／＋ｍｌの溶液とした。

この希釈液の５０μｍをＥｌｉｓａ法用９６ウエルマイ
クロプレート（フロー社製）の各ウェルに加え、４℃、
１８時間放置した後、ダルベツコＰＢＳ　（−）（０，
０５！ｋ　Ｔｗｅｅｎ　８０２０含有、以下ＰＴと略す
る）で各ウェルを洗浄した。

次に、オボアルブミン（Ｏｖ＾、シグマ社製）の１％を
含有するＰＴの１００μｍを各ウェルに加え、室温で６
時間放置し、更にＰＴで各ウェルを洗浄した。

ワクチンで免疫した牛より得た抗血清を、０．戊ＯＶＡ
を含有するＰＴで１：１００に希釈し、分析用サンプル
とした。

この分析用サンプルの５０μｍを上述のようにして調製
したプレートのウェルに加えた後、それを４℃で１８時
間放置し、ＰＴで洗浄した。

次に、０．１４ｋ　　ＯＶ八を含有するＰＴテ１　：　
１０００に希釈したウサギ抗−ウシＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ、
）−パーオキシダーゼの５０μｌをウェルに加え更に室
温で２時間放置し、ＰＴで洗浄した。

ＰＴでの洗浄後、ウェルに、０．０２５９６の２．２′
−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリンスルフオ
ン酸ジアンモニウム塩及びＯ，１５％過酸化水素水を含
有する５　０ｍＭクエン酸バファー、ｐｌ＋　４．０＋
７）ｔｏ。

μｍを各ウェルに加え、室温で１５分間反応させた、直
ちに４１４ｎｍの吸光度をイムノリーダー　ＮＪ−２０
００（日本インターメッド社製）で測定し、抗体価を求
めた。

実施例４ 実験例５で得たｐ２４を含む両分を５０　ｍＭ炭酸バ同
様にして抗体価の検出を行なった。

参考例１ 上記実験例中の各分画操作でのＥｌｉｓａ法によるＢＬ
Ｖタンパク質、ＢＬＶのコアタンパク質及びエンベロー
プ蛋白質の検出は以下のようにして行なった。

各分画段階で得られた両分の５μｌをＥｌｉｓａ法用９
６ウエルマイクロプレート（フロー社製）の各ウェルに
加え、４℃、１８時間放置した後、ダルベツコＰＢＳ（
−）　（０，０５！ｅｉ　Ｔｗｅｅｎ　８０２０含有、
以下ＰＴと略する）で各ウェルを洗浄した。

次に、ＯＶへの１％を含有するＰＴの１００μｌを各ウ
ェルに加え、室温で６時間放置し、更にＰＴで各ウェル
を洗浄した。

ここで、中杭ＢＬＶポリクローン抗体（北里研究所製）
またはマウス抗ＢＬＶ　ｇｐ６９モノクローナル抗体（
セロチック社製）の５０μｌを上述のようにして調製し
たプレートのウェルに加えた後、それを４℃で１８時間
放置し、ＰＴで洗浄した。

次に、０．１９６０ＶＡを含有すルＰＴテ１　：　１ｏ
００ニ希釈したウサギ抗−ウシＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）−パ
ーオキシダーゼまたは抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）−パーオ
キシダーゼの５０μｌをウェルに加え更に室温で２時間
放置し、ＰＴで洗浄した。

ＰＴでの洗浄後、ウェルに、０．０２５％の２．２′−
アジノービス（３−エチルベンズチアゾリンスルフオン
酸ジアンモニウム塩及びＯ，１，５９６過酸化水素水を
含有する５　０ｍＭクエン酸バファー、ｐＨ４，０の１
００μｍを各ウェルに加え、室温で１５分間反応させた
、直ちに４１４ｎｍの吸光度をイムノリーダー　ＮＪ−
２０００（日本インターメツド社製）で測定した。

［発明の効果］ 本発明によりＢＬＶ感染牛の診断に有用であり、また、
牛白血病の予防に有用なワクチンの精度良い検定法が提
供された。

なかでも、本発明の方法に用いるＥｌｉｓａ法用のプレ
ートに吸着させるタンパク質は、特に煩雑な手法を用い
ることなく分離精製でき、高活性を維持しており、本発
明によりＢＬＶ感染牛の診断に有用であり、また牛白血
病の予防に有用なワクチンの簡便な検定法が提供された
。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、ｇｌ）！］　１およびＰ２４の分離
精製方法の代表例の概略を示す図であり、第４図および
第５図は実施例１における２頭の牛の抗体価の変化を示
すグラフである。 特許出願人：三井東圧化学株式会社 三井製薬工業株式会社 代理　人：若　　林　　　忠 ｇｌ）！］　Ｉ及びＰ２４精製法 第１図 第２図　　　　　ウィルス培養液 ↓ ５ｕｃｒｏ＊ｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ ↓ ウィルス濃縮液 ↓ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００処理 ↓ ＤＥＡＥ処理 第３図　　　ウィルス培養液（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０
１）処理後）ｆ液（ｐ２４）　　　　　　　　　　　　
濃縮液（ｇｐ５１）ＤＥＡＥカラム　　　　　　　　　
　　　ＤＥＡＥカラム通過画分（ｐ２４）　　　　　　
　　　　　ｇｐ５１両分ゲルｆ過（除Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００）　　　　　ゲルー過ｐ２４　　　　　　　　
　　　　　　　ｇｐ５１画分第４図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）牛白血病ウィルス（ＢＬＶ）由来のタンパク質を抗
   原として付着させたプレートを用いた酵素抗体免疫測定
   法により、免疫した牛またはＢＬＶ感染牛の抗体価を測
   定することを特徴とする牛白血病の診断方法。 ２）前記タンパク質が、牛白血病ウィルスが感染した宿
   主細胞またはその培養液から調製した牛白血病ウィルス
   を含む粗タンパク質中の牛白血病ウィルスを不活性化し
   た後、該不活性化牛白血病ウィルスを含む粗タンパク質
   の溶液を限外濾過して得た濃縮画分中に含まれるもので
   ある特許請求の範囲第１項に記載の診断方法。 ３）前記タンパク質が、牛白血病ウィルスが感染した宿
   主細胞またはその培養液から調製した牛白血病ウィルス
   を含む粗タンパク質を界面活性剤と接触させてタンパク
   質を解離し、得られた解離物温合物からイオン交換法に
   より選択的に分離した牛白血病ウィルスのコアタンパク
   質である特許請求の範囲第１項に記載の診断方法。 ４）前記タンパク質が、牛白血病ウィルスが感染した宿
   主細胞またはその培養液から調製した牛白血病ウィルス
   を含む粗タンパク質を界面活性剤と接触させてタンパク
   質を解離し、得られた解離物温合物からイオン交換法に
   より選択的に分離した牛白血病ウィルスのエンベロープ
   タンパク質である特許請求の範囲第１項に記載の診断方
   法。