JPH01132395A - デオキシリボ核酸の製造法 - Google Patents
デオキシリボ核酸の製造法Info
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- JPH01132395A JPH01132395A JP28949287A JP28949287A JPH01132395A JP H01132395 A JPH01132395 A JP H01132395A JP 28949287 A JP28949287 A JP 28949287A JP 28949287 A JP28949287 A JP 28949287A JP H01132395 A JPH01132395 A JP H01132395A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、発酵法によるデオキシリボ核酸（以下、ＤＮ
Ａという）の製造法に関するものであり、更に詳しくは
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、
ＤＮＡ生産能を有する微生物を培養し、菌体内に多量に
生成蓄積せしめたＤＮＡを、分離採取するＤＮＡの製造
法に関する。
Ａという）の製造法に関するものであり、更に詳しくは
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、
ＤＮＡ生産能を有する微生物を培養し、菌体内に多量に
生成蓄積せしめたＤＮＡを、分離採取するＤＮＡの製造
法に関する。
［従来の技術］
本発明で得られるＤＮＡは、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤な
どの医薬品の重要な合成原料として有用な物質である。
どの医薬品の重要な合成原料として有用な物質である。
従来、このＤＮＡを製造する方法としては、魚類白子を
原料として抽出精製する方法が一般的である。また、発
酵法によるＤＮＡの製造法も知られており、例えば、ア
ースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、シュ
ードモナス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコツカス（Ｍｉ ｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属
またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に
属スる微生物を、該微生物の資化しうる炭素源含有培地
を用いて好気的に培養して、培地中にＤＮＡを生成させ
る方法（特公昭５５−３５１０８号公報）、シュードモ
ナス属に属する細菌をｎ−パラフィンを炭素源とする培
地で培養し、菌体外にＤＮＡを蓄積させる方法〔アグリ
力ルチアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）第３６巻、第１３３頁（１９７２年）および第
３８巻、第２９３頁（１９７４年）〕、シュードモナス
属に属する微生物を酢酸および／または酢酸塩を主たる
炭素源とする培地にキレート剤を添加し、培養方法とし
て培養初期は好気的条件下で培養し、対数期に静置培養
条件下に移す方法を採用することにより、ＤＮＡを菌体
外に蓄積させる方法（特開昭５５−４８３９９号公報）
、アシネトバクタ−（Ａｃｉ ｎｃｔｏｂａｃｔｅｒ）
属に属する微生物を培養して、培養物からＤＮＡを採取
する方法（特開昭６１−１１５４９７号公報）が知られ
ている。
原料として抽出精製する方法が一般的である。また、発
酵法によるＤＮＡの製造法も知られており、例えば、ア
ースロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、シュ
ードモナス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコツカス（Ｍｉ ｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属
またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に
属スる微生物を、該微生物の資化しうる炭素源含有培地
を用いて好気的に培養して、培地中にＤＮＡを生成させ
る方法（特公昭５５−３５１０８号公報）、シュードモ
ナス属に属する細菌をｎ−パラフィンを炭素源とする培
地で培養し、菌体外にＤＮＡを蓄積させる方法〔アグリ
力ルチアル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）第３６巻、第１３３頁（１９７２年）および第
３８巻、第２９３頁（１９７４年）〕、シュードモナス
属に属する微生物を酢酸および／または酢酸塩を主たる
炭素源とする培地にキレート剤を添加し、培養方法とし
て培養初期は好気的条件下で培養し、対数期に静置培養
条件下に移す方法を採用することにより、ＤＮＡを菌体
外に蓄積させる方法（特開昭５５−４８３９９号公報）
、アシネトバクタ−（Ａｃｉ ｎｃｔｏｂａｃｔｅｒ）
属に属する微生物を培養して、培養物からＤＮＡを採取
する方法（特開昭６１−１１５４９７号公報）が知られ
ている。
［発明が解決しようとする問題点］
しかしながら、ＤＮＡの製造法として、魚類白子より抽
出精製する方法は、抽出操作のさいのＤＮＡの損失、夾
雑物との分離・精製操作の煩雑さ、原料である魚類の白
子の入手が季節により制約される等の問題点を有する。
出精製する方法は、抽出操作のさいのＤＮＡの損失、夾
雑物との分離・精製操作の煩雑さ、原料である魚類の白
子の入手が季節により制約される等の問題点を有する。
また、発酵法による製造法は、一般に得られるＤＮＡ溶
液が希薄であるため濃縮コストが大きくなるという問題
点があり、且つ炭素源としてｎ−パラフィンを用いる方
法では、ｎ−パラフィンが不溶性のため、高回転の機械
的攪拌又は、界面活性剤の添加により油滴を分散させて
培養を行う必要が生じ、基質供給速度が制限され、高い
生産性が確保できないなどの問題点を有している。
液が希薄であるため濃縮コストが大きくなるという問題
点があり、且つ炭素源としてｎ−パラフィンを用いる方
法では、ｎ−パラフィンが不溶性のため、高回転の機械
的攪拌又は、界面活性剤の添加により油滴を分散させて
培養を行う必要が生じ、基質供給速度が制限され、高い
生産性が確保できないなどの問題点を有している。
［問題点を解決するための手段］
本発明者らは、かかる問題点を解決し、より効率の良い
発酵法によるＤＮＡの製造方法を完全にさせるため検討
を重ねた結果、 従来のようにＤＮＡを菌体外、即ち培地中に蓄積させる
のではなく、シュードモナス属に属し、ＤＮＡを生産能
を有する微生物を適切な条件で培養することにより菌体
形成と同時に菌体内にＤＮＡを蓄積できることを見出し
、本発明を完成した。
発酵法によるＤＮＡの製造方法を完全にさせるため検討
を重ねた結果、 従来のようにＤＮＡを菌体外、即ち培地中に蓄積させる
のではなく、シュードモナス属に属し、ＤＮＡを生産能
を有する微生物を適切な条件で培養することにより菌体
形成と同時に菌体内にＤＮＡを蓄積できることを見出し
、本発明を完成した。
すなわち本発明はシュードモナス属に属し、デオキシリ
ボ核酸を生産する能力を有する微生物を培養して、菌体
内に多量のデオキシリボ核酸を生成蓄積せしめたのち、
集菌した菌体よりデオキシリボ核酸を採取することを特
徴とするデオキシリボ核酸の製造法を提供するものであ
る。
ボ核酸を生産する能力を有する微生物を培養して、菌体
内に多量のデオキシリボ核酸を生成蓄積せしめたのち、
集菌した菌体よりデオキシリボ核酸を採取することを特
徴とするデオキシリボ核酸の製造法を提供するものであ
る。
本発明に於て、特に重要なのは菌体内にＤＮＡを蓄積せ
しめる点であり、これを行うための培地及び培養条件で
ある。
しめる点であり、これを行うための培地及び培養条件で
ある。
すなわち、本発明にあっては、シュードモナス属に属す
る微生物を、炭素源に酵素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜等
の天然炭素源を炭素重量として２〜５％、窒素源に酵母
エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、大豆かす
等の天然有機窒素源を窒素重量として０．１％以上、マ
グネシウムを０．００４％以上含む培地を用い、酸素充
足条件下に培養することにより、培養の初期（対数増殖
期後期から定常初期までをいう）において、菌体形成と
同時に菌体内に多量のＤＮＡを生成蓄積せしめる点が特
に重要である。
る微生物を、炭素源に酵素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜等
の天然炭素源を炭素重量として２〜５％、窒素源に酵母
エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、大豆かす
等の天然有機窒素源を窒素重量として０．１％以上、マ
グネシウムを０．００４％以上含む培地を用い、酸素充
足条件下に培養することにより、培養の初期（対数増殖
期後期から定常初期までをいう）において、菌体形成と
同時に菌体内に多量のＤＮＡを生成蓄積せしめる点が特
に重要である。
この菌体内のＤＮＡは、培養液から集菌した菌体を熱ア
ルカリ等で処理することで、容易に高濃度溶液として得
られるもので回分培養のみならず連続培養も可能とする
ものである。
ルカリ等で処理することで、容易に高濃度溶液として得
られるもので回分培養のみならず連続培養も可能とする
ものである。
次に、本発明で用いる微生物について具体的に説明する
。
。
（Ａ）生産菌
本発明で使用される菌は、シュードモナス属に属し、菌
体内にＤＮＡを高濃度に蓄積するものであればよく、そ
の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）は問わない。具体的にはシュー
ドモナス・エルギノーザ（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）ＫＹＵ −１（微工研菌奇第９７０１号）、 シュー
ドモナス・エルギノーザＩＦＯ３３４５、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
） Ｉ Ｆ ０３０８１、シュードモナス。
体内にＤＮＡを高濃度に蓄積するものであればよく、そ
の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）は問わない。具体的にはシュー
ドモナス・エルギノーザ（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）ＫＹＵ −１（微工研菌奇第９７０１号）、 シュー
ドモナス・エルギノーザＩＦＯ３３４５、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（Ｐ、 ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
） Ｉ Ｆ ０３０８１、シュードモナス。
メラノグナム（Ｐ、 ｍｅｌａｎｏｇｅｎｕｍ）■ＦＯ
１２０２０、シュードモナス会オーレオファシェンス（
Ｐ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ） Ｉ Ｆ ０３５２
１、シュードモナス・ポリカラー（Ｐ、 ｐｏｌｙｃｏ
ｌｏｒ）等が示される。特に、シュードモナス・エルギ
ノーザＫＹＵ−１は、菌体内に多量のＤＮＡを生成蓄積
する。
１２０２０、シュードモナス会オーレオファシェンス（
Ｐ、 ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ） Ｉ Ｆ ０３５２
１、シュードモナス・ポリカラー（Ｐ、 ｐｏｌｙｃｏ
ｌｏｒ）等が示される。特に、シュードモナス・エルギ
ノーザＫＹＵ−１は、菌体内に多量のＤＮＡを生成蓄積
する。
シュードモナス・エルギノーザＫＹＵ−１は本発明者ら
によって、福岡市大字箱崎地内の空気中より分離された
もので、以下に示す菌学的性質を有する。
によって、福岡市大字箱崎地内の空気中より分離された
もので、以下に示す菌学的性質を有する。
（ａ）形 態
■ 細胞の形および大きさ：
０．５〜０．６Ｘ １．５〜１．６μの短桿菌■ 細胞
の多形性：なし ■ 運動性、鞭毛の着生状態：運動性あり、単極上 ■ 胞 子：なし ■ ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：なし くｂ）生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養：生育良好、白色光沢あり、水溶
性蛍光色素（ビオシアニン）産生 ■ 肉汁寒天斜面培養：生育良好、白色光沢あり、 ■ 肉汁液体培養：表面発育なし、濁度Ａ６６ｏ＝３〜
５ ■ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチン液化■ リドマス
・ミルク：アルカリ反応 （ｅ） 生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：培養３時間後に試薬を添加すると桃
赤色を呈し、６時間後には赤褐色を呈するとともに赤褐
色の沈澱（亜硝酸塩）を生成。さらに２０時間後にはガ
スを発生し、呈色反応は認められない。
の多形性：なし ■ 運動性、鞭毛の着生状態：運動性あり、単極上 ■ 胞 子：なし ■ ダラム染色性：陰性 ■抗酸性：なし くｂ）生育状態 ■ 肉汁寒天平板培養：生育良好、白色光沢あり、水溶
性蛍光色素（ビオシアニン）産生 ■ 肉汁寒天斜面培養：生育良好、白色光沢あり、 ■ 肉汁液体培養：表面発育なし、濁度Ａ６６ｏ＝３〜
５ ■ 肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチン液化■ リドマス
・ミルク：アルカリ反応 （ｅ） 生理学的性質 ■ 硝酸塩の還元：培養３時間後に試薬を添加すると桃
赤色を呈し、６時間後には赤褐色を呈するとともに赤褐
色の沈澱（亜硝酸塩）を生成。さらに２０時間後にはガ
スを発生し、呈色反応は認められない。
■ 脱窒反応：あり
■ インドールの生成：あり
■ 硫化水素の生成：あり
■ クエン酸の利用：クエン酸資化
■ 無機窒素源の利用：亜硝酸資化、アンモニウム塩資
化 ■ 色素の生成：水溶性蛍光色素（ビオシアニン）産生 ■ オキシダーゼ：陽 性 ■ カタラーゼ：陽 性 ［相］ 生育の範囲：５°Ｃにおける生育なし、４２°
Ｃにおける生育あり、至適温度３７℃１１ 酸素に対
する態度：好気性 １２０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ法による
）：糖を酸化的に分解する １３ 糖類から酸およびガスの生成の有無ニゲルコー
スから酸化的にグルコン酸、２−ケトグルコン酸を生成 １４ Ｔｗｅｅｎ ８０の加水分解：陽 性以上の菌
学的性状から本菌株はシュードモナス・エルギノーザと
同定された。なお、本菌株はシュードモナス・エルギノ
ーザＫＹＵ−１と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（微工研菌奇第９７０１号）。
化 ■ 色素の生成：水溶性蛍光色素（ビオシアニン）産生 ■ オキシダーゼ：陽 性 ■ カタラーゼ：陽 性 ［相］ 生育の範囲：５°Ｃにおける生育なし、４２°
Ｃにおける生育あり、至適温度３７℃１１ 酸素に対
する態度：好気性 １２０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ法による
）：糖を酸化的に分解する １３ 糖類から酸およびガスの生成の有無ニゲルコー
スから酸化的にグルコン酸、２−ケトグルコン酸を生成 １４ Ｔｗｅｅｎ ８０の加水分解：陽 性以上の菌
学的性状から本菌株はシュードモナス・エルギノーザと
同定された。なお、本菌株はシュードモナス・エルギノ
ーザＫＹＵ−１と命名し、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（微工研菌奇第９７０１号）。
（Ｂ）培地
本発明で用いられる培地は、該微生物が良好に生育する
とともに、菌体内にＤＮＡを生成蓄積するために必要な
炭素源、窒素源、無機質およびその他の栄養素等を含む
ものであり、炭素源、窒素源ともに資化されたものであ
れば特に限定されない。具体的には、炭素源としては酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜等の天然炭素源が特に良好
であり、炭素重量として２〜５％含むことが望ましい。
とともに、菌体内にＤＮＡを生成蓄積するために必要な
炭素源、窒素源、無機質およびその他の栄養素等を含む
ものであり、炭素源、窒素源ともに資化されたものであ
れば特に限定されない。具体的には、炭素源としては酵
素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜等の天然炭素源が特に良好
であり、炭素重量として２〜５％含むことが望ましい。
窒素源としては酵母エキス、ペプトン、コーンスティー
プリカー、大豆かす等の天然有機窒素源が特に良好であ
り、窒素重量として０．１％以上含むことが望ましい。
プリカー、大豆かす等の天然有機窒素源が特に良好であ
り、窒素重量として０．１％以上含むことが望ましい。
また無機質の主なものを元素としてあげるとリン、マグ
ネシウム、マンガン、鉄、カリウム、亜鉛、コバルト、
ニッケル等が例示されるが、特にマグネシウムは必須で
あり、０．００４％以上含むことが望ましい。
ネシウム、マンガン、鉄、カリウム、亜鉛、コバルト、
ニッケル等が例示されるが、特にマグネシウムは必須で
あり、０．００４％以上含むことが望ましい。
（Ｃ） 培養条件
ＤＮＡを効率よく生成するとともに、生成したＤＮＡを
菌体内に蓄積するためには、通気攪拌を行う深部培養で
なければならず、また、培養中は溶存酸素濃度がその臨
界酸素分圧以上を保つよう−１ｎ − に、酸素充足条件となるような高攪拌、高通気を行う。
菌体内に蓄積するためには、通気攪拌を行う深部培養で
なければならず、また、培養中は溶存酸素濃度がその臨
界酸素分圧以上を保つよう−１ｎ − に、酸素充足条件となるような高攪拌、高通気を行う。
ｐＨは７付近に制御し、温度を２０〜４０℃に保つこと
により培養の初期に菌体内でのＤＮＡの生成蓄積が進行
する。
により培養の初期に菌体内でのＤＮＡの生成蓄積が進行
する。
培養は回分培養でもよいが、連続培養がより適しており
、容易に連続化することが可能である。
、容易に連続化することが可能である。
当然生産性の点でも連続培養の方がすぐれている。
（Ｄ）ＤＮＡの分離採取
りＮＡの分離採取は、まず遠心分離等の手段により培地
から菌体を単離し、この菌体を少量の水に懸濁する。次
にこの懸濁水のｐＨを約１２に調整したのち、加熱して
溶菌させＤＮＡの高濃度溶液を得る。この溶菌操作は通
常は約９０℃で１時間程度を要するが、これに限定され
ない。また、このさいリゾチームや界面活性剤等を使用
することも可能である。次いで、ＤＮＡ高濃度溶液を濾
過して固形不純物を除いたのち、溶液に対して２倍容の
エタノールを加えることによりＤＮＡを不溶化し、遠心
分離等の手段により粗ＤＮＡを単離する。このようにし
て得られた粗ＤＮＡは常法により精製するか、そのまま
デオキシリボヌクレオシド類の原料として使用すること
もできる。
から菌体を単離し、この菌体を少量の水に懸濁する。次
にこの懸濁水のｐＨを約１２に調整したのち、加熱して
溶菌させＤＮＡの高濃度溶液を得る。この溶菌操作は通
常は約９０℃で１時間程度を要するが、これに限定され
ない。また、このさいリゾチームや界面活性剤等を使用
することも可能である。次いで、ＤＮＡ高濃度溶液を濾
過して固形不純物を除いたのち、溶液に対して２倍容の
エタノールを加えることによりＤＮＡを不溶化し、遠心
分離等の手段により粗ＤＮＡを単離する。このようにし
て得られた粗ＤＮＡは常法により精製するか、そのまま
デオキシリボヌクレオシド類の原料として使用すること
もできる。
［実 施 例］
以下実施例で本発明を具体的に説明する。
実施例 １
シュードモナス・エルギノーザＫＹＵ−１を肉エキス１
．０％、ペプトン１．０％、食塩０．５％、寒天１．５
％、ｐＨ７，０の組成を有する斜面培地において、３０
℃で２４時間培養後、酵母エキス１．０％、ペプトン１
．０％、食塩０．５％、ブドウ糖０．５％、ｐＨ７，０
の組成を有する培地５ｍｌを入れた試験管に植菌して、
３０℃で１５時間振とう培養し、シードとした。このシ
ード培養液をブドウ糖５．０％、尿素０．４％、コーン
スティープリカー粉末１．５％、Ｈ３Ｐ０４０．３％、
ＫＣ，Ｑｏ、０５％、ＭｇＳＯ４Φ７Ｈ２００，０４％
、ｐＨ７、０の組成を有する培地５０ｍ１を入れた坂ロ
フラスコへ２．５ｍｌ植菌し、３０’Ｃにてｐｉｔｃｈ
５０ｍｍ、 １４０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎの往復振
とう培養を行ったところ、４８時間後に乾燥菌体重量が
１６ｍｇ／ｍｌに達し、この時点で、菌体内に１．１４
ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが生産されていた。この培養液５
０ｍ１を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体
を分離し、これを０．３ Ｎ Ｎａ ＯＨ水溶液５ｍ
ｌに懸濁し、９０℃で１時間加熱して溶菌した。この溶
液をｐＨ５，０に調整後、エタノール１０ｍ１を加えて
ＤＮＡを不溶化し、１０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分
離して、粗ＤＮＡ５７ｍｇ（純度的７０％）を単離した
。収率は培地に使用したブドウ糖に対し１．６％であっ
た。
．０％、ペプトン１．０％、食塩０．５％、寒天１．５
％、ｐＨ７，０の組成を有する斜面培地において、３０
℃で２４時間培養後、酵母エキス１．０％、ペプトン１
．０％、食塩０．５％、ブドウ糖０．５％、ｐＨ７，０
の組成を有する培地５ｍｌを入れた試験管に植菌して、
３０℃で１５時間振とう培養し、シードとした。このシ
ード培養液をブドウ糖５．０％、尿素０．４％、コーン
スティープリカー粉末１．５％、Ｈ３Ｐ０４０．３％、
ＫＣ，Ｑｏ、０５％、ＭｇＳＯ４Φ７Ｈ２００，０４％
、ｐＨ７、０の組成を有する培地５０ｍ１を入れた坂ロ
フラスコへ２．５ｍｌ植菌し、３０’Ｃにてｐｉｔｃｈ
５０ｍｍ、 １４０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎの往復振
とう培養を行ったところ、４８時間後に乾燥菌体重量が
１６ｍｇ／ｍｌに達し、この時点で、菌体内に１．１４
ｍｇ／ｍｌのＤＮＡが生産されていた。この培養液５
０ｍ１を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体
を分離し、これを０．３ Ｎ Ｎａ ＯＨ水溶液５ｍ
ｌに懸濁し、９０℃で１時間加熱して溶菌した。この溶
液をｐＨ５，０に調整後、エタノール１０ｍ１を加えて
ＤＮＡを不溶化し、１０．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分
離して、粗ＤＮＡ５７ｍｇ（純度的７０％）を単離した
。収率は培地に使用したブドウ糖に対し１．６％であっ
た。
実施例 ２
シュードモナス舎エルギノーサＫＹＵ−１を用い、実施
例１と同様にしてシード培養液を調製し、下記の組成を
有する培地３００ ｍｌ張込みのミニジャーファーメン
タ−へ、１５ｍ１植菌した。
例１と同様にしてシード培養液を調製し、下記の組成を
有する培地３００ ｍｌ張込みのミニジャーファーメン
タ−へ、１５ｍ１植菌した。
Ａ培地 ブドウ糖 ５．０％尿素
０．４％ コーンスティープリカー粉末 １．５％Ｈ３ＰＯ４０，
３％ ＫＣＩｆｌｌ Ｏ，０５％Ｍ
ｇ５０ ・７Ｈ２００，０４％ Ｂ培地 ブドウ糖 １０．０％尿素
０．８％ コーンスティープリカー粉末 ３．０％Ｈ３ＰＯ４０，
６％ ＫＣρ ０．１％Ｍｇ５Ｏ・７
Ｈ２００，０４％ 培養温度は３０℃、ｐＨはアンモニアガス吹込みで７．
０に制御、攪拌は１．５００ｒｐｍｓ通気は常圧化１／
２ ＶＶＭで培養した。その結果ＤＯ２は、常時連続発
酵の定常状態の間、Ａ培地、Ｂ培地共に臨界溶存酸素濃
度以上に保たれ、酸素供給が生育およびＤＮＡ生成を律
速することはなかった。最初に希釈率０．ｌｈｒ”でＡ
培地を用いて連続培養を行ったところ、９０時間後に定
常状態に達したが、そのとき流出液は、乾燥菌体重量１
５ｍｇ／ｍｌ、菌体内Ｄ Ｎ Ａ １．０５ｍｇ／ ｍ
ｌであった。そこで希釈率を０．０８ｈｒ’、培地をＢ
培地に変えて、更に同様のｐＨおよび通気攪拌条件で培
養を続けたところ、培地を変えてから７０時間後に定常
状態に達し、流出液の乾燥菌体重量２８ｍｇ／ｍｌ、菌
体内Ｄ Ｎ Ａ １．９６ｍｇ／ｍ１となった。次に１
０時間分の連続培養抜出し液（３００ｍｌ）を７．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を分離し、これを
０．３Ｎ Ｎａ ＯＨ水溶液３０ｍ１に懸濁し、９０
℃で１時間加熱して溶菌した。この溶液をｐＨ５，０に
調整後、エタノール６０ｍ１を加えてＤＮＡを不溶化し
、７ 、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して粗ＤＮＡ
８７０ ｍｇ （純度７０％）を単離した。この連続培
養のＤＮＡ生産性を培養液量、単位時間当たりに換算す
ると０．１５６ｇ／ρ・ｈｒとなる。収率は培地にフィ
ードしたブドウ糖に対して１．６％であった。
０．４％ コーンスティープリカー粉末 １．５％Ｈ３ＰＯ４０，
３％ ＫＣＩｆｌｌ Ｏ，０５％Ｍ
ｇ５０ ・７Ｈ２００，０４％ Ｂ培地 ブドウ糖 １０．０％尿素
０．８％ コーンスティープリカー粉末 ３．０％Ｈ３ＰＯ４０，
６％ ＫＣρ ０．１％Ｍｇ５Ｏ・７
Ｈ２００，０４％ 培養温度は３０℃、ｐＨはアンモニアガス吹込みで７．
０に制御、攪拌は１．５００ｒｐｍｓ通気は常圧化１／
２ ＶＶＭで培養した。その結果ＤＯ２は、常時連続発
酵の定常状態の間、Ａ培地、Ｂ培地共に臨界溶存酸素濃
度以上に保たれ、酸素供給が生育およびＤＮＡ生成を律
速することはなかった。最初に希釈率０．ｌｈｒ”でＡ
培地を用いて連続培養を行ったところ、９０時間後に定
常状態に達したが、そのとき流出液は、乾燥菌体重量１
５ｍｇ／ｍｌ、菌体内Ｄ Ｎ Ａ １．０５ｍｇ／ ｍ
ｌであった。そこで希釈率を０．０８ｈｒ’、培地をＢ
培地に変えて、更に同様のｐＨおよび通気攪拌条件で培
養を続けたところ、培地を変えてから７０時間後に定常
状態に達し、流出液の乾燥菌体重量２８ｍｇ／ｍｌ、菌
体内Ｄ Ｎ Ａ １．９６ｍｇ／ｍ１となった。次に１
０時間分の連続培養抜出し液（３００ｍｌ）を７．００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を分離し、これを
０．３Ｎ Ｎａ ＯＨ水溶液３０ｍ１に懸濁し、９０
℃で１時間加熱して溶菌した。この溶液をｐＨ５，０に
調整後、エタノール６０ｍ１を加えてＤＮＡを不溶化し
、７ 、０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して粗ＤＮＡ
８７０ ｍｇ （純度７０％）を単離した。この連続培
養のＤＮＡ生産性を培養液量、単位時間当たりに換算す
ると０．１５６ｇ／ρ・ｈｒとなる。収率は培地にフィ
ードしたブドウ糖に対して１．６％であった。
［発明の効果］
本発明は、シュードモナス属に属し、ＤＮＡ生産能を有
する微生物を培養することにより、菌体形成と菌体内Ｄ
ＮＡ生成蓄積を同時に進行せしめることにより従来の菌
体外へＤＮＡを蓄積させる方法に於て定常期後期まで培
養を続ける必要があったのに対し、対数増殖期後期〜定
常期初期という短時間で培養を終了とすることが可能と
なりた。すなわち本発明の特長は菌体形成と菌体内ＤＮ
Ａ生成が同時におこるｇｒｏｖｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ型をとることにより、従来困難であった連続培養を
可能にするものであり、工業的にきわめてすぐれた発酵
法によるＤＮＡ製造法を具現化したものである。
する微生物を培養することにより、菌体形成と菌体内Ｄ
ＮＡ生成蓄積を同時に進行せしめることにより従来の菌
体外へＤＮＡを蓄積させる方法に於て定常期後期まで培
養を続ける必要があったのに対し、対数増殖期後期〜定
常期初期という短時間で培養を終了とすることが可能と
なりた。すなわち本発明の特長は菌体形成と菌体内ＤＮ
Ａ生成が同時におこるｇｒｏｖｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔ
ｅｄ型をとることにより、従来困難であった連続培養を
可能にするものであり、工業的にきわめてすぐれた発酵
法によるＤＮＡ製造法を具現化したものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス属に属し、デオキシリボ核酸を生産
する能力を有する微生物を培養して、菌体内に多量のデ
オキシリボ核酸を生成蓄積せしめたのち、集菌した菌体
よりデオキシリボ核酸を採取することを特徴とするデオ
キシリボ核酸の製造法。 ２、培養を、炭素源に酵素糖化液、酸糖化液、廃糖蜜等
の天然炭素源を炭素重量として２〜５％、窒素源に酵母
エキス、ペプトン、コーンス ティープリカー、大豆かす等の天然有機窒素源を窒素重
量として０．１％以上、マグネシウムを０．００４％以
上含む培地を用い、酸素充足条件下に行うことからなる
特許請求の範囲第１項記載のデオキシリボ核酸の製造法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62289492A JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62289492A JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01132395A true JPH01132395A (ja) | 1989-05-24 |
| JP2800005B2 JP2800005B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=17743976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62289492A Expired - Lifetime JP2800005B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | デオキシリボ核酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2800005B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8296154B2 (en) | 1999-10-26 | 2012-10-23 | Hearworks Pty Limited | Emphasis of short-duration transient speech features |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933226A (ja) * | 1982-08-19 | 1984-02-23 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗腫瘍活性物質ｐｄ−０１とその製法およびその製剤 |
-
1987
- 1987-11-18 JP JP62289492A patent/JP2800005B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5933226A (ja) * | 1982-08-19 | 1984-02-23 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 抗腫瘍活性物質ｐｄ−０１とその製法およびその製剤 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8296154B2 (en) | 1999-10-26 | 2012-10-23 | Hearworks Pty Limited | Emphasis of short-duration transient speech features |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2800005B2 (ja) | 1998-09-21 |
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Legal Events
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Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070710 Year of fee payment: 9 |
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