JPS5933226A - 抗腫瘍活性物質ｐｄ−０１とその製法およびその製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシー−トモナス属に属する細菌から得られる抗
腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−０１
に関する。

ブドウ糖非発酵性のダラム陰性桿菌であるシュードモナ
ス属に属する＋Ｊｉｌｔｌ菌から得られる宿主介在性の
抗腫瘍活性物質については他のダラム陰性直類と同様に
菌体の外膜に存在するリボ多糖体（内毒素）が知られて
いる。

しかし、シュードモナス′属の細菌を含めたダラム陰性
桿菌が産生ずるリボ多糖体は、宿主介在性の抗腫瘍活性
以外に、それ自体が生体に対して同時に発熱原性を示す
ばかりでなく、重篤な致死毒性あるいはショックを誘発
することが知られてお９、医薬としては安全性の面で問
題が多い。このリポ多糖体から化学的処理によって毒性
作用を切り離して得られる無毒化リピドＡについての研
究の動きもみられるが無毒化リビドＡ単独の抗腫瘍活性
は十分な水準とは言い難い（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ　。

Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ　、　　ヱ、　　４３，１．９７
９）　　。

丑だ、近年シ・−トモナス属に属する緑膿菌の感染防御
抗原の解析研究を通じて得られた緑１１１ｊｉ！閑の感
染防御共通抗原であるＯ　Ｅ　Ｐ　　（Ｏｒｉｇｉｎａ
ｌ　ｅｎｄｏ　−ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）に宿
主介在性の抗腫瘍活性がみられることが指摘されている
が（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

８３　、　７１１．　１９７８．、ＧＡＮＮ、６３，５
０３．＋９７２．。

ＧＡＮＮ、　６４．５２３．１９７３）　、　　ＯＥＰ
は約８０％の蛋白質と約２０％のリボ多糖体との複合体
であることから抗原性を含めた副作用などに問題があり
実用に供する壕でに至っていない。

本発明者らは先に結核菌から得られる抗腫瘍活性物質に
ついて広範な検討を加えた結果、結核菌の無細胞抽出液
から得られる、加熱変性デオキシリボ核酸が宿主介在性
の強力な抗）厘瘍活性を有し、かつ毒性および抗原性が
極めて低いことを初めて見い出し、特許（特願昭５６−
２３６６９）を出願した。

さらに、本発明者らは、シュードモナス属に属する細菌
の菌体抽出物についても新規な抗腫瘍活性物質を見い出
すべく、結核菌の経験に基づいて活性物質の検索を鋭意
進めた結果、シュードモナス属に属する細菌から結核菌
の場合に用いたのと同様の方法で調製した加熱変性デオ
キシリボ核酸も高い抗腫瘍活性を示し、かつ毒性が極め
て低く、発熱性や抗原性がほとんどないことを明らかに
し、本発明′吻買を加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−０
１と命名し本発明を完成するに至った。

以［、本発明物質を単（て加、熱変性デオキシリボ核酸
、変性デオキシリボ核酸、デオキシリボ核酸あるいは本
物質と称することが多い。

本発明によって得られるデオキシリボ核酸は結核菌由来
の該物質と同様に宿主介在性の強い抗腫ＪＨ活性を有し
、その作用はこ、？シマでに知られている動物細１胞由
来のデオキシリボ核酸等の腫瘍細胞）の直接障害作用に
基づくｉ元肺腐作用（Ｓｃｉｅｎｃｅ１４９、９９７．
．１９６５．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　２
７．　２３４２゜１９６７、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏ
ｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　６１．２０７．１９６８）　　に
比べはるかに強力である。

本発明物質とその製造法およびその宿主介在性の強力な
抗腫瘍活性は本発明者らによって初めて明らかにされた
ものである。

すなわち本発明は、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せ
しめてなる加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−０１及びそ
の塩に関し、更に詳細には、シ−ドモナス属細菌より得
られる抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリポ核酸Ｐ
Ｄ−旧に関し、そして、その製法及び抗ｊ厘瘍剤に関す
るものである。

さらに本発明はシー−トモナス属細菌破砕物を遠心分離
して得られる核酸画分を加熱することを特徴とする抗腫
瘍活性を有する加熱変性チオキシリボ核酸ＰＤ−７（目
の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核酸凝集剤を加え、得られる沈澱の可溶画分から分離す
ることを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキ
シリポ核酸ＰＤ−旧の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核酸凝集剤を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に
対し２て透析した後加熱し、その上清から分離すること
を特徴とする抗腫瘍活性を有す′る加熱変性デオキシリ
ボ核酸ＰＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は、デオキシリボ核酸含有物を約８０〜１
２０℃に加熱して、抗腫瘍性を有せしめることを特徴と
する抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ
−１，）］の製造法である。

さらに本発明は、加熱変性によって抗）厘瘍活性を有せ
しめてなる加熱変性デオキシリポ核［ＰＤ−０１を有効
成分とする抗腫瘍剤である。

本発明に用いられる微生物は、シー−トモナス属に属す
る細菌であるが、好適なものとしては、シ−−モナスブ
テイダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）Ｉ
Ｆｏ　１２９９６株やシュードモナスアエルギν−サ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）　
ＡＴＣ’Ｃ−１０１４５株などが挙げられる。

微生物の培養方法や一体の破砕方法は、通常の方法に従
ってよい。たとえばシ−−モナスプテイダ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ　ｉｄａ　）の場合ペプトン酵母
エキス培地あるいは普通ブイヨン培地を用いて３０〜３
７℃程度の温度で２４時間通気あるいは静置培養するこ
とにより良好な培養物が得られ；これを遠心分離または
濾過して菌体を得ることが出来る。得られた菌体を水、
好ましくは適当な緩衝液と充分混合し、氷冷しながらダ
イノミル（Ｄｙｎ。

−Ｍｉｌｌ）　あるいはフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ　）プ
レスなどにより菌体を破砕して破砕菌体懸濁液を得る。

この懸濁液を遠心して無細胞抽出液を得るが、このとき
の遠心分離の条件は、未破砕菌体、部分的に破砕された
菌体、細胞壁画分等を沈渣として除去出来る通常の遠心
力で良く、たとえば５，０００　ｘｇ　。

１０分間以上遠心してその上清を取得する。

本発明における無細胞抽出液とは、破砕菌体懸濁液から
遠心分離により、未破砕菌体、部分的に破砕された菌体
、細胞壁画分等を出来るだけ除いた両分のことである。

無細胞抽出液から核酸画分を得るには、無細胞抽出液を
直接有機溶剤処理して核酸画分を得る方法（例えばマー
マー（Ｍａｒｍｕｒ　）法やフェノール法等、以下直接
有機溶剤法と称する）と無細胞抽出液に核酸凝集剤を加
えて核酸画分を含む沈澱を得る方法が適用可能である。

直接有機溶剤法は小量規模（通常１７以下）の本発明物
質を得るのに適した方法であり、得られる核酸画分（以
下ＰＤ核酸画分と称する）は、通常抗原性を有する多糖
や蛋白等の不純物を含有するので密度勾配遠心法等によ
り不純物を出来るだけ除去した後書られる精製デオキシ
リボ核酸画分を加熱処理して本発明物質を得るか、ある
いはＰＤ核酸画分をまず加熱処理した後遠心法や沈澱法
等によって不純物を除去して本発明物質を得る。

ＰＤ核酸画分や精製デオキシリボ核酸画分の加熱処理条
件は、後述の調製法と共通するので、後に詳しく述べる
。

本発明における加熱の目的は本発明物質の分子量分布を
調節し、２本鎖構造を１本鎖構造にかえるとともに不純
物の除去効率を高め、製剤化を容易にし、片時の溶解性
を高め、抗腫瘍活性が高く、かつ、毒性、副作用の低い
本発明物質を得ることでりる。

無細胞抽出液に核酸凝集剤を加えて核酸画分を沈澱させ
る方法は、核酸画分を濃縮出来るので大量規模の本発明
物質を得るのに適した方法である。

この方法において用いられる核酸凝集剤は通常の核酸凝
集剤のいずれも使用可能であるが、後の工程で用いたべ
東剤を簡便に除去出来るという意味で、低分子凝集剤が
好ましい。その好適な例としては、塩化カルシウム、塩
化マンガン、塩化マグネシウム、硫酸アルミニウム等の
多価金属陽イオンあるいはストレプトマイシン、カナマ
イシン等の水溶性塩基性抗生物質またはその塩等が挙げ
られる。核酸凝集剤の使用量はその種類により適宜選択
出来るが、たとえば多価金属陽イオンでは０．１〜１０
％、好ましくは０．１〜３％、抗生物質では０．０１〜
１０％、好ましくは０１〜１％を抽出液に対して使用す
るのが適当である。

操作としては無細胞抽出液に核酸凝集剤を加え、生成し
た沈澱を遠心あるいはｐ過等の方法により分離して核酸
画分を含む懸濁液を得る。この懸濁液より核酸凝集剤を
除くには透析が適当である。

その際に使用する水性溶媒は、核酸凝集剤の除去効率を
高めるために適当なイオン溶度を有する、ｐＨが中性附
近の緩衝液が好ましい。たとえば好適なものとしては０
．１〜１ＭＮａｃｆｉ含有リン酸緩衝液、　　０．１〜
Ｉ　Ｍ　ＫＣｆｉクエン酸緩衝液、０．１〜ＩＭＮａＣ
ρ含有炭酸ナトリウム緩衝液、０１〜１ＭＮａＣＱ含有
トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。

核酸画分を含む懸濁液を含塩緩衝液に対して透析した後
便すればさらに水に対して透析して塩類を除く。透析済
みの核酸画分を含む懸濁液を以下ＰＮ−１画分と称する
。ＰＮ−１画分を得る操作は、全て冷却下で行ない、核
酸画分の不易゛要な分解、変性を防＋ｈする。冷却温度
は０ないし１０℃が好ましい。

ＰＮ−１画分から本発明物質を得るには２つσ）方法が
可能である。１つの方法は、ＰＮ−１画分から核酸画分
を分離した後、得られた核酸画分を加熱して本発明物質
を得る方法であり、もう一つの方法はＰＮ−１画分を加
熱処理した後本発明物質を分離する方法である。

前者の方法においては、まず、ＰＮ−１画分の含有物濃
度と水性溶媒のｐＨや塩濃度等を調節した後、体心分離
祉たは、ｐ過弄の方法によりＰＮ−１画分からデオキシ
リボ核酸を含む可溶画分を分離する。

この可溶画分から沈澱法あるいはカラムクロマト法める
いは電気泳動法さらに、要すればリボヌクレアーゼ処理
法等の方法によりデオキシリボ核酸画分を分離して、加
熱処理すれば本発明物質が得られる。ＰＮ−１画分から
可溶画分を分離する際の好適なＰＮ−１画分の濃度は１
〜１５　ｍｆ／ｍｆｌである。水性溶媒のｐＨは中性附
近が好ましく、通常酸あるいは塩基であるいは緩衝液で
ｐＨ５から８の範囲に調節する。水性溶媒のイオン強度
は、遠心分離等の除の沈澱の除去効率に影響を与え、通
常０．１以上が好ましく、要すれば食塩あるいは塩化カ
リウム等を加えてイオン強度を調節しても良い。

このように調節したＰＮ−１画分を通常２０，０００ｘ
ｔで５分間以上遠心分離すると、核酸画分を含む清澄な
可溶画分がその上清として得られる。この上清からスト
レプトマイシンあるいは塩化マンガンあるいはセチルト
リメチルアンモニウムプロミド等を用いる沈澱法あるい
はセファローズ等を用いるカラムクロマト法あるいは塩
化ビニル−酢酸ビニル共重合体等を用いる電気泳動法等
によりデオキシリボ核酸画分を分離することが出来る。

以−１−の操作は全て０〜１０℃で行うのが好ましい。

このようにして得られたデオキシリボ核酸画分をさらに
、リボヌクレアーゼ処理後加熱処理するかあるいは加熱
処理後リボヌクレアーゼ処理すれば精製された本発明物
質が得られるが、加熱条件は後者の方法と共通するので
後に詳述する。

後者の方法では、まずＰＮ−１画分を加熱するが、この
加熱操作は核酸画分の適切な変性を行なうことおよび不
、連物を変性させ以後の本発明物質の分離操作を容易に
することを目的とする。加熱条件は後に示すように本発
明物質の抗腫瘍活性にも密接に関連しており、適切な条
件範囲が存在する。

加熱の要因としては、加熱時の溶質の濃度、水性溶媒の
４’！Ｊｉ類とｐＨ、イオン強度、加熱温度、加熱時間
が挙げら扛、適切な条件範囲は次のとおりである。

浴質の濃度は１〜１５　ｍ？／ｍρが適切である。

水性溶媒が水あるいは食塩等の含塩水（イオン強度が０
．１〜０．５）の場合は８０”Ｃないし１．２０℃で５
分間ないし１２０分間、　水性溶媒が緩衝液の場合は緩
衝液のｐＴ（によって大きく影響され、中性附近のｐＨ
では加熱温度は高く、加熱時間も長くし、酸性あるいは
アルカリ性では、加熱温度は低く、加熱時間も短くする
のが好捷しい。

例えば水性溶媒が強酸性あるいは強アルカリ性の場合は
、加熱温度を８０〜１２０℃に限定するものではなく、
室温付近でも充分である。また、水性溶媒がアルカリ性
の場合はｐＨ，加熱温度および時間を適宜選択すれば本
発明物質からリボ核酸を除去しうる点で有利な場合もあ
る。

以上のごとく、適切な加熱条件を選ぶことにより後に示
すように本発明の目的とする抗１厘瘍活性が高く、かつ
抗原性の低い加熱変性デオキシリボ核酸を含む懸濁液を
得ることが出来る。

ここに示した加熱条件は本発明物質調製法の重要な要因
であり、本明細書で示したいずれの調製法にも適用可能
である。

このようにしてＰＮ−１画分を加熱した後冷却し、遠心
または濾過等の方法により沈渣を除けば、本発明物質を
含む／Ａ−澄な溶液を得る。この溶液から本発明物質を
分離するのは容易であり、通常の方法によって可能であ
る。その適切な例としては、核酸凝集剤による沈澱法、
有機溶媒による分向法。

カラムクロマト法あるいは電気泳動法等とりボヌクレア
ーゼ処理法七の組み合わせが挙げられる。

これらの方法によってイｉＩられた本発明物質は、その
まま製剤の原体として使用するか、あるいは凍結乾燥し
て乾燥粉末にすることも可能である。

本発明物質中のデオキシリボ核酸の分子量は；う万から
１．　（１０万０間に分布し、グアニン、シトシン（Ｇ
Ｃ）含量は約６１％である。本発明物質の転移温度Ｔｍ
は、明確な値゛を示さずさらに、　ヒドロキシアパタイ
トのカラムクロマトグラフィーにより分析すると本発明
物質が変性された１本鎖のデオキシリボ核酸であること
を意味する。

本明細書に示した方法によって得られる物質のなかには
、加熱変性デオキシリポ核敵以外に、リボ核酸、蛋白、
糖等を含むものもあるが、いずれも混入物と言える程度
であり、要すればこれらはさらに精製して除くことが出
来る。

次に実柿例１において精製して得られたＰＤ−ＡＩにつ
いて理化学的性質を調べ、その結果を示す。なお、実施
レリ２で得られたＰＤ−Ａ２の鞘製品についても同様の
理化学的性質を示している。

本物質、加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−Ａｌの理化学
的性質（Ｎａ塩による） （１）元素分析％：　Ｃ：　２７．３１〜３１．４４　
　Ｈ：４．１３〜５．７９　　Ｎ　：　Ｉ　１．０３〜
Ｉ　：３．５５Ｐ　：　６．８１〜８．２２　　Ｎａ　
：　３．８０〜４．８１ （２）分子量：１３万〜１（）ｏ万 分子量分布図は第１図に示す通り。

（３）融　点：明確な融点を示さない。

（４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。

（５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。

（６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。

メタノール、エーテル、アセトンに不溶。

（７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応：ＳＴＳ法により分画したＲＮＡ
画分に対してご〜性。

Ｂ）ジフェニルアミン反応：　ＳＴＳ法（どこより分画
したＤＮＡ両分に対して陽性。

Ｃ）ニンヒドリン反ＬＧ　：本物’Ｍ　１　ｉｆ　μＪ
　／ｍＱの濃度で陰性。

Ｄ）アンスロン反応二本物質１０　ｔｒｙ／ｍ、Ｑ、の
濃度で陰性。

（８）塩基性、酸性、中性の区別二本物質の水溶液のｐ
Ｈは６．５〜７．５である。

（９）物質の色：白色粉末 ００）特　性：加熱処理によって可溶性を付与するとと
もに、高い抗肺何活性を有せしめ、かつ毒性および抗原
性が極めて低くなっている。

０１）　　塩基組成％ニゲアニン：３０．０　　アデニ
ン：　１９．９シトシン：３０．７　　チミ　ン：１９
．４（方法は化学分析による） ０→　酵素処理二本物質をデオキシリボヌクレアーセ［
（ＤＮａｓｅ　ｔ　）　　で処理すると抗肺痒性がなく
なるが、リボヌクレアーゼＴ、　（ＲＮａｓｅ　Ｔ、　
）　　の処理では抗腫編性は変化しない。

（１３）　　ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグ
ラフィーにより分析すると１本鎖構造である。

（＋４）　　転移温度（Ｔｍ）　　：　測定された融解
曲線からは明確な転移温度Ｔｎ１は求められない。

本発明物質が示す抗腫瘍活性の本体が、゛加熱変性デオ
キシリボ核酸であることは、本発明物質をデオキシリボ
核酸分解酵素（・ＤＮａｓｅ　ｌ’　）で処理すると抗
腫瘍活性がなくなること、本発明物質をリボ核酸分解酵
素（ＲＮａｓｅ”Ｌ　）で処理しても抗腫瘍活性が変化
しないことから明らかである。

本発明物質を抗腫瘍剤として用いる場合は、注射剤の型
で用いるのが好ましい。本発明物質は、単独であるいは
通常用いられる添加剤、賦型剤を加えて液剤、あるいは
同時溶解型の凍結乾燥製剤として適用可能である。

また本発明物質は水中油滴型あるいは油中水滴型のエマ
ルジョンとしても適用可能である。

本発明物質の使用量、投与経路は適宜選択されるが使用
量は体重ｋｇあた。り　０．０１ないし１００ｍＷが好
ましく、投与経路は皮肉、皮下、静脈内、腹腔内投与や
嘘瘍内投与が行なわれる。さらに、本物質は経口投与も
げ能である。

本発明物質はモルモットやマウスの揮々のｊ厘侃系に対
して高い抗腫瘍作用を示す。例えばマウスの同系１匣瘍
であるＩＭＣ力ルチノーマに対して本発明物質は生理食
塩液に溶フリイした型で腫瘍細胞と接触させた後、動物
体内に移植することによる肺刺の生着抑制（丈プレッシ
ョン活性）あるいは動物体内に生着した腫瘍組織内に投
与することによる抗腫瘍活性（リダレノション活性）に
おいて原料である菌体と同等か、あるいはそれよりも篩
い抗腫瘍活性を示しだ。また、モルモットの同系１匣瘍
であるライン】０に対しては、油中水滴型の本発明物質
の腫瘍内投与により、本発明物質は、原発１匣瘍の増殖
抑制だけでなく、所属リンパ節への腫瘍の転移も抑制し
た。

さらに本発明物質は、生理食塩液に溶解して１匣瘍組織
とは異る場所に投与することによっても１１ＶＩＣ力ル
チノーマに対して抗＋ｌＪ４４Ｍ作用を示した。

本発明物質の急性４性はマウスに対する静脈内投与によ
る体！Ｉｔ、ｋｇあたりの５０％致死量Ｔ−Ｄ　ｓｏ値
が５００ｍｆ以」二であることから、極、めて低い。

また本発明物質の抗原性についても、モルモットを用い
たアナフィラキシ−試験、遅延型アレルギー試験によっ
て、本発明物質が極めて安全であることが判明した。

その他事発明物質の発熱性、疼痛性、起炎性。

肉芽形成性等も原料菌体に比較し、極めて低く、通常の
医薬としての適用には問題にならない程度であることが
、種々の試験によシ判明した。

各種の原画細胞に対する本発明物質の細胞増殖抑制作用
を調べたところ、本発明物質は、はとんど細胞増殖抑制
作用を示さなかった。このことがら本発明物質は宿主の
免疫反応を介して抗腫瘍作用を示すと考えられるので本
発明物質の免疫学的活性を種々検討した。その結果、本
発明物質はマウスのキラーＴ細胞増強効果、およびマク
ロファージ活性化作用の他にナチーラルキラー細胞活性
増強作用を示した。

以上の種々の知見から本発明物４質は抗腫瘍剤として惟
めで有用なものと考えられる。

以下に本発明物質の製造法を実姉例により、また、本発
明＋Ｖ！Ａ質の抗＋＋ｔｈ瘍剤としての有用性を試験例
により示す。

実施例１　ストレプトマイシンを用いて得られる懸濁液
の可溶画分から本発明物質の製造ペプトン　　　　１０
フ イーストエキス　　　１０７ ＮａＣ氾　　　　　　　　　５７ 水を加えて１Ｃにし、ｐＨ６，８〜７０に調節する。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、　　ＩＦＯ１
２９９６株を−Ｆ記組成の培地で３０℃、２４時間振盪
培養し、培養液を遠心分離処理して得た湿菌体４０２を
４０　ｍＱの］　ＯｍＭ　リン酸緩衝液（１）Ｈ７，０
）　　に懸濁した後、水冷下ダイノミルで破砕し、２０
，０００ｘｆで２０分間遠心分離して上清の無細胞抽出
液を得た。この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩を終
濃度が０．３％になるように添加し、充分攪拌した後、
４℃で一晩装置し、生成した沈澱を遠心分離により巣め
、０．５　Ｍ　Ｎａ（４含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）にｈ″−冑蜀した。この懸濁液をセロ・・ン
チューブに詰めて同じ緩衝液に対して透析し、続いて蒸
留水に対して透析して核酸画分を含む懸濁液８５ｍυ（
以下この懸濁液をＰＮ−１と称する）を得た。この懸濁
液の固形物濃度は５．３　ｍｆ／ｍ　Ｑであり、湿菌体
あたり１．１％の収率であった。

次にＰＮ−１全薩にＮａＣｆ１を終濃度が０９％になる
ように加えて攪拌し、加熱変性処理（１００℃、６０分
）した後、２０，０００　ｘｆ、２０分間遠心分内「し
て上清を得た。この上清にＮａＣ４を最終濃度が０．４
Ｍになるように加えて溶解した後、セチルトリメチルア
ンモニウムプロミド（以下このものをＣＴＡＢと称す。

東京化成金社製）を最終濃度が０．２％（Ｗ／Ｖ）にな
るように加えて充分攪拌し、室温に３０分間静置した。

生成した沈澱を遠心分離によｐ集め、ＩＭＮａＣρ液１
５ｍＱ液溶５した彼、等−ｍのクロロホルム−インアミ
ルアルコール（２４：１）の混液を加えて振盪、遠心分
離して水層部分を得た。この操作をさらに２回くり返し
た後、得られた水層に３倍量の９９．５％エタノールを
加えて攪拌し、４℃で一晩静１献した。生成した沈澱を
遠心分離により果め、蒸留水１５ｒｒＪに溶解した後、
蒸留水に対して透析し、精疎核酸溶液を青た。この溶液
をｌＮＮａＯＨで中和後、凍結乾燥して乾燥標品６３ｍ
７を得た。氷晶全量を０．０５Ｍ酢ｊ唆緩衝液（ｐＨ４
，５）　　１．０　＋ｘＱに溶解した後、同緩衝液２ｍ
ρに溶解したりボヌクレアーゼＴ２　　（三共会社ｆｆ
）２００Ｕを添加し、３７℃で２２時間反応させた。反
応液に等量のクロロホルム−インアミルアルコール（２
４：１）の混液を加えて振盪後、遠心分離して水層部分
を得た。この操作をさらにくり返した後、水層の全量を
、あらかじめ０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム液で洗浄し
た径２．５ｃｍ、長さ９０ｃｍのセファデックスＧ−１
００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ社製）カラムに負荷し、同液で溶出した後、最初に
溶出する両分としてデオキシリボ核酸を含む両分を得た
。この両分を水に対して透析した後、Ｎａ０Ｔ（で中和
後、凍結乾燥して本発明物質４４．５１ｎｙを得た。以
下このものをＰＤ−ＡＩと称す。

ＰＤ−ＡＩのデオキシリボ核酸の含量（純度）は５″Ｘ
過塩素酸で加水分解した後、ジフェニルアミン法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　６２．３１５．
　［１５６）により定量した時９８．５％であった。

実施例２　マーマー法による本発明物質の製造：Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎｓ　ｐｕｔｉｄａ　Ｉ　Ｆｏ　１２９９６
株を実施例１の培地で同様の培養条件によって得た湿菌
体２５０２を７倍量の１０　ｍＭ　’）ン酸緩衝液に懸
濁した後水冷下ダイノミルで破砕し、２０，０００ｘｆ
　ｆ　２０　分間遠心して無細胞抽出液を得た。この抽
出液から？　−マー（Ｍａｒｍｕｒ、　　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ３、２
０８．１９６］）法によシ粗デオキシリボ核酸自分を得
た。この両分を０．９％食塩液に対して透析した後、１
００℃、６０分加熱した。冷却後蒸留水に対して透析、
中和後凍結乾燥して得た標品５６ｍＰＫ対し、実施例１
と同様のスケールでリボヌクレアーゼＴ２処理を行ない
、精製し、本発明物質４１ｍｆｆ：得た。以下このもの
をＣＤ−Ａ２と称す。ＣＤ−Ａ２のデオキシリボ核酸含
量は実施例１と同様の方法で分析すると９８６１％であ
った。

実施例 ＰＤ−Ａｌ　　１．Ｏｍｆを１．Ｏｍｆ！のＰＢＳマイ
ナス液（栄研化学社製）に溶解し、ニークリボアーＮ。

２　＋＋　（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　ｊ、ｌｌｉＭ）　を
用いて無菌濾過した。得られたＰ液を１．５ｍ、Ｃずつ
バイアル瓶に無菌的に分注して本発明物質の液剤を得た
。

実ノＩ亀例４　凍結乾燥制剤 ＰＤ−Ａ１．１０ｍ７をｌｏｍＱの注射用蒸留水に溶ブ
Ｉｊ！ｌ！シ、次に５００ｍＳ７のマニト−ルを加えて
溶解した後、ニークリボアーＮｏ２０を用いて無菌濾過
しだ。得られたＰ液を１．５ｍｆｉずつ無菌的にバイア
ル瓶に分注した後、凍結乾燥して本発明物質の凍結乾燥
製剤を得た。

実施例５　エマルジョン剤 ＰＤ−Ａｌ　　４ｍｆを０．５１η氾の生理食塩液に溶
解し、次にドラケオール６−　ＶＲ（Ｄｒａｌｃｅｏｌ
　６−ＶＲ。

Ｐｅｎ５ｉｌｖａｎｉａ　Ｒｅｔｉｎｉｎｇ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ製）とアラシールＡ（ＡｒｌａｃｅｌＡ、　Ａｔ
１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）
の８．５　：　１．５の混液０．５ｍ、Ｃを加えて連結
注射針を用いて油中水型のエマルジョンを得た。

試験例１　マウスＩＭＣ力ルチノーマに対する抗腫＋Ｈ
作用 本発明物質のマウスＴＭＣカルチノーマに対する抗腫瘍
性を調べた。

試験系は次のとおりである。

ＣＤＦ雌性マウスの皮肉に５Ｘ］０５個のＩＭＣ力ルチ
ノーマＭ（ＩＩ　Ｊｌｆ！２を移植し、移植後１日目か
ら隔日に計６回、実則例３の方法で調製した製剤を１回
あたりＯ，１ｍｆｌずつ、腫瘍内に投与した。移植後３
５′Ｂ目にｊ厘瘍を摘出し、その電歇を測定した結果は
第１表のとおりであった。

第１表　マウスＩＭＣカルチノーマに対する抗腫瘍作用 ＊：Ｐ（０，０１ 後述の検定を含めて平均腫瘍１Ｆ量および治癒例、蚊の
出現類度の有意差検定にはスチ・、−プントの検定法と
フィッシャーの検定法をそれぞれ用いた。

Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍重数に対する投与群の平均腫
瘍重数のパーセント比である。ＢＣＧはＢＣＧワクチン
（日本ピーシ−ジー会社製）を用いた。対照としては生
理食塩液を用いた。

試験例２　　ストレイン２モルモットのライン１０ヘパ
トーマに対する抗腫瘍作用 本発明物質のスｒレイン２モルモットのライン１０ヘパ
トーマに対する抗腫瘍作用を調べた。

ｌＸｌ０６個のライン（ｌｉｎｅ）　　１０　ヘノ（ト
ーマ１１ｊｉｉ　Ｊ虞、賀ｌ胞をストレイン（５ｔｒａ
ｉｎ　）　２モルモットの皮肉に移植し、移植後７日目
に実施例３に示した方法で調製した製剤０．１．　ｍＱ
をｌｌ！＠瘍内に投与した。

移植後７００日目生存例数、治癒例数、所属リンパ節へ
の転移の有無を調べた。対照としては生理食塩液を用い
て同様に調製したものを用いた。

結果は第２表に示した。

第２表　ストレイン２モルモットのライン１０ヘパトー
マに対する抗腫瘍作用 試験例３　核酸分解酵素処理物の抗腫瘍作用本発明物質
を核酸分解酵素で処理することにより本発明物質の抗腫
瘍活性の本体を調べた。

試験法は次のとかりである。

ＰＤ−ＡＩをデオキシリポ核酸分解酵素ＤＮａｓｅ　Ｊ
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）で処理した後得
られた分解物をクロロホルム処理して１）Ｎａｓｅ　（
を除き、次にセファデックスＧ　１０　　（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ製）カラム
により脱塩、凍結乾燥して、本発明物質の核酸分解酵素
処理物を得だ。得られた処理物の抗腫瘍活性を試験例１
と同様に試験し、第３表に示す結果を得た。

第３表　マウスＩ　ｒｖＩＣ力ルチノーマに対する核酸
分解酵素処理物の抗腫瘍作用 Ｔ／Ｃは対照群の平均肺ｊｆ１重量に対する投与群の平
均腫瘍重量のパーセント比である。

対照としては生理食塩液を用い、ＢＣＧはＢＣＧワクチ
ンを用いた。

試験例４　ナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ　）　　細胞の活
性増強作用： 本発明物質のＮ　Ｋ細胞に対する活性増強作用を調べた
。

試験法は次のとおりである。

生理食塩液、ＰＤ−ＡＩ又はＰＤ−Ａ２の生理良塩液溶
解液（１ｍｆ／／ｒｙＪ　）を８週令のｃ　５７　Ｂ　
ｔ−／　６糸雌性マウスに一匹あたり０．３ｍυ腹腔腹
腔再投与その４８時間後に１復腔浸出細胞を採取した。

採取液中の細胞数を１０％牛脂児面清添加ＲＰＭ１１６
４０培地で２　Ｘ　１０６個／ｍＱに調整した後プラス
チックシャーレに移して３７℃、５％炭酸ガス大気下で
９０分間インキコーペートし、シャーレに付着性細胞、
非付着性の、Ｉ＋Ｉｌ＋胞を得た。各々の細胞５×１０
５個ど５１Ｃｒで標識したマウス白廂病細胞ＹＡＣ−１
、■×１０個を３７℃、５％炭酸ガス大気下で１０％牛
脂児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地を用いて４時間培養
した。その培養上清に遊離された”Ｃｒの放射能をオー
トガンマ−カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ製）で測定し、
腹腔浸出細胞のＹＡ（、−１細胞に対する細胞障害作用
を調べた。

第４表　Ｎ　Ｋ細胞の活性増強作用 試験例５　　；ｔ、＋＋１胞増殖直接１５ｆｌ害作用本
発明物質のＹＡＣ−１マウス白血病卸１胞とＦ　Ｍ３　
’Ａマウス乳癌細ｊ１後の細胞増殖に対する直接阻害作
用を調べた。

試験系は次のとおりである。

８．４　Ｘ　］　０’個のＹＡＣ−１刷ＩＩ　！Ｉｉダ
と１！５．７１ＸｌＯ’個のＦ　Ｍ　３　Ａ　ａｕａを
それぞれ１０％牛脂児血清添加ＲＰＭＩ　］　６１Ｉ　
（ｌ培地に浮遊せしめ、３７℃、５％炭酸ガス大気下で
２４時間培養後ＦＤ−ＡＩを１１ｎ７／＋ｎＲの最終濃
度に加え、同じ条件下でさらに培養を継続した。培養開
始後２４時間目毎にトリバンプルー染色により生＋￥ｌ
ｔｌ　Ｉｌ数を測定した。結果は／ 試験例６　急性毒性 １群１０匹の５週令ｄｄＹ系雄性マウス（平均体重２５
２）にＰＤ−Ａｌを生理食塩液に溶解して体重１　ｋｇ
あたり５００ｍ５’を静脈内投与した。本発明物質は投
与後１週間の観察期間中、体重増加の抑制を示さず、死
亡例もなかった。この結果から本発明物質の静脈内投与
における５０％致死用量ＬＤ５ｏは５００　ｍｆ　／ｋ
ｇ　以上（！：　考エラレル。

試験例７　抗原性 生理食塩液に溶解したＰＤ−ＡＩを１群（３匹のハ雌 一トレー系Ｗ性モルモット　（平均体重３５０グ）に１
匹あたり１ｍグずつ、週３回合割６回皮肉投与して感作
した。最終感作日から２週間経過後ＰＤ−ＡＩを生理食
塩液に溶解して体重ｋｇあたり１０ｍ２あるいは２＋ｉ
グを静脈内投与した。チャレンジ前後のモルモットの行
動観察により本発明物質の抗原性を調べたところ本発明
物質は前記投与量では全くアナフィラキシ−ショックを
誘発しなかった。

試験例８　発熱性： 生物学的ツツ削基準の一般試１啄法に準じて、滅菌生理
食塩液に溶解したＰＤ−Ａｔを１群３頭の在来押雄性白
色ウサギ（平均体重２．４６　ｋｇ）に５００μＶ／ｍ
Ｑ、／ｋｇ　　の投与量で耳静脈内に投与し、投与後３
時間にわたって直腸体温を測定した。

その結果、」々４前の対照体温に対する投与後の測定体
温との差体温の八を発熱反応とすると３頭の発熱反応の
和は０．７２℃で生物学的製剤基準の判定基準に従い発
熱反応が陰性と判定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物質のセファローズＣＬ　−、６Ｂカラ
ムクロマトによる溶出図を、第２図は同物質の紫外線吸
収スペクトルを、第：３図は同物質の赤外線吸収スペク
トルを示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 Ｉ２１Ｉ　　　　面 第　１　凹 （プ 喜に°、狭７１（本）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなり、下
   記の理化学的性’］（Ｎａ塩による）を示す加熱変性デ
   オキシリボ核酸ＰＤ−０１及びその塩。 （１）元素分析犯）　：　Ｃ：　２７．３１〜３１．４
   ４　　Ｈ：　４．１３〜５，７９ｉｒ：１１．０３〜１
   ３．５５　　Ｐ：６．８１〜８．２２Ｎａ　：　３．８
   ０〜４．８１ （２）分子量：３万〜１００万 分子−畦分布図は第１図に示す通り。 （３）融　点：明確な融点を示さない。 （４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。 （５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。 （６）溶剤に対する溶肩性：水に可溶、エタノール、メ
   タノール、エーテル、アセトンに不溶。 （７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応Ｓ　ＳＴＳ法により分画したＲＮ
   Ａ画分に対して陰性。 Ｂ）ジフェニルアミン反応：ＳＴＳ法により分画したＤ
   ＮＡ画分に対して陽性。 Ｃ）ニンヒドリン反応二本物質１０μ？　／ｍτの濃度
   で陰訃。 Ｄ）アンスロン反応：本物質１（ｌｔｔｆ／ｍ℃の濃度
   で陰性。 （８）塩基性、酸性、中性の区別：本物質の水溶液のｐ
   Ｈは６．５〜７．５である。 （９）物質の色：白色粉末 ００特性：加熱処理によって可溶性を付与するとともに
   、高い抗腫瘍活性を有せしめ、かつ毒性および抗原性が
   極めて低くなっている。 α１）塩基組成（％）ニゲアニン：３０．Ｏアデニン：
   １９．９シトシン：３０．７　　　チミン：１９．４（
   方法は化学分析による） ０４酵素処理二本物質をデオキンリボヌクレアーゼＩ　
   （ＤＮａｓｅＩ）で処理すると抗腫瘍性がなくなるが、
   リボヌクレアーゼＴ、　　（ＲＮａｓｅＴ、　）の処理
   では抗腫瘍性は変化しない。 （１徹　ヒドロキノアパタイトのカラムクロマトグラ丁
   ノイーにより分析すると１本鎖構造である。 （１４）転移温度（Ｔｍ）　　：測定された融解曲線か
   らは明確な転移温度Ｔｍは求められない。 ２、ンユードモナス属菌より得られたものである特許請
   求の範囲第１項記載の加熱変性デオキリボ核ｒＬ捉ＰＤ
   −（月。 ３、シュードモナス属、ｉ４１菌破砕物を遠心分離して
   得られる無細胞抽出液から得られる核酸画分を加熱変性
   することを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオ
   キシリボ核酸ＰＩ）−０１の製造法。 ４、核酸画分の分離法どして無細胞抽出液を有機溶剤処
   理して分離することを特徴とする特許請求の１１１旧用
   第３項記載の製造法。 ５、核酸画分の分離法として無細胞抽出液に核酸凝集剤
   を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に対して透析
   した後、その可溶画分から分離することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の製造法。 ６、シュードモナス属細菌破砕物を遠心分離して得られ
   る無４４ｔｌ　、を他抽出液に核酸凝集剤を加え、得ら
   れる沈澱を水または塩類溶液に対して透・折した後加熱
   変性してその上清から分離することを特徴とする抗ｌＩ
   ！４ｆ瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−
   ０１の製ノ告？−（几 ７、デオキシリボ核酸含有物を約８０°−１２０℃に加
   熱して抗腫瘍性を有せしめることを特徴とする抗腫瘍活
   性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＰＤ−０１の製造
   法。 ８、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなる加熱
   変性デオキシリボ核酸Ｔ’Ｄ−０１を有効成分とする抗
   腫瘍剤。 ９、加熱変性チオキシリボ核酸ＰＤ−０１がシー−トモ
   ナス属菌よシ得られたものである特許請求の範囲第８項
   記載の抗腫瘍剤。