JPH01148198A - サルコシンの定量法 - Google Patents
サルコシンの定量法Info
- Publication number
- JPH01148198A JPH01148198A JP30720287A JP30720287A JPH01148198A JP H01148198 A JPH01148198 A JP H01148198A JP 30720287 A JP30720287 A JP 30720287A JP 30720287 A JP30720287 A JP 30720287A JP H01148198 A JPH01148198 A JP H01148198A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sarcosine
- ado8
- formula
- hydroxy
- quantifying
- Prior art date
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- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はサルコシンの定量法、更に詳細には、少ない酵
素量で短時間に精度よくサルコシンを定量する方法に関
する。
素量で短時間に精度よくサルコシンを定量する方法に関
する。
体液中のクレアチニンおよびクレアチンの定量は腎疾患
、筋肉疾患、甲状腺機能先進症等の診断のために重要で
ある。
、筋肉疾患、甲状腺機能先進症等の診断のために重要で
ある。
従来よく用いられていたクレアチニンおよびクレアチン
の定量法はアルカリ性ピクリン酸を用いるヤツ７工法で
あるが、この方法はアセトン、ピルビン酸、葉酸等の他
の物質の影響を受けるため、正確なりレアチニンおよび
クレアチン量を求めることができないという欠点があっ
た。
の定量法はアルカリ性ピクリン酸を用いるヤツ７工法で
あるが、この方法はアセトン、ピルビン酸、葉酸等の他
の物質の影響を受けるため、正確なりレアチニンおよび
クレアチン量を求めることができないという欠点があっ
た。
斯かる従来法の欠点を解決するために、クレアチニナー
ゼおよびクレアチナーゼを作用させてサルコシンを生成
させ、これにサルコシンオキシダーゼを作用させ、生成
する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下４−アミノ
アンチピリンとフェノール系又はアニリン系誘導体と反
応させて発色させてその吸光度を測定する酵素法が提案
された。
ゼおよびクレアチナーゼを作用させてサルコシンを生成
させ、これにサルコシンオキシダーゼを作用させ、生成
する過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下４−アミノ
アンチピリンとフェノール系又はアニリン系誘導体と反
応させて発色させてその吸光度を測定する酵素法が提案
された。
しかしながら、この酵素法も、従来の色素系を用いた場
合には、サルコシンから発色体を得るまでの反応が遅く
、そのため多量の酵素を必要とすると共に、血清中の妨
害因子の影響を受は易いという欠点があった。
合には、サルコシンから発色体を得るまでの反応が遅く
、そのため多量の酵素を必要とすると共に、血清中の妨
害因子の影響を受は易いという欠点があった。
従って、サルコシンを少ない酵素量で短時間に定量する
方法の提供が望まれていた。
方法の提供が望まれていた。
斯かる実状において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、色原体として４−アミノアンチピリンと後記一般式（
Ｉ）で表わされるＮ−２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピルアニリン誘導体（以下、ＡＯ３と称する）ｆｔ使用
すると、ＡＯ８がサルコシンオキシダーゼのサルコシン
に対するミカエリス定数（Ｋｍ値）を著しく増大し、少
ない酵素量で短時間にサルコシンを定量できることを見
出し、本発明を完成したＯ すなわち、本発明は、サルコシン含有試料にサルコシン
オキシメーゼ、ペルオΦシダ−ゼ、４−アミノアンチピ
リンおよび一般式（４）（式中、Ｒは水素原子又はメト
キシ基を、Ｍはアルカリ金属を示す） テ表ワサれるＮ−２−ヒドロキシ−３−スル、ホプロピ
ルアニリン誘導体を作用させ、生ずる発色体を測定する
ことを特徴とするサルコシンの定量法を提供するもので
ある。
、色原体として４−アミノアンチピリンと後記一般式（
Ｉ）で表わされるＮ−２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピルアニリン誘導体（以下、ＡＯ３と称する）ｆｔ使用
すると、ＡＯ８がサルコシンオキシダーゼのサルコシン
に対するミカエリス定数（Ｋｍ値）を著しく増大し、少
ない酵素量で短時間にサルコシンを定量できることを見
出し、本発明を完成したＯ すなわち、本発明は、サルコシン含有試料にサルコシン
オキシメーゼ、ペルオΦシダ−ゼ、４−アミノアンチピ
リンおよび一般式（４）（式中、Ｒは水素原子又はメト
キシ基を、Ｍはアルカリ金属を示す） テ表ワサれるＮ−２−ヒドロキシ−３−スル、ホプロピ
ルアニリン誘導体を作用させ、生ずる発色体を測定する
ことを特徴とするサルコシンの定量法を提供するもので
ある。
本発明の定量法はサルコシンを含有する全ての試料に適
用することができ、サルコシン含有液またはサルコシン
を遊離する反応系から生ずるサルコシン含有液、例えば
クレアチニンまたはクレアチ／を含有する体液にクレア
チニナーゼおよびクレアチナーゼを作用させて得られる
試料等が挙げられる。
用することができ、サルコシン含有液またはサルコシン
を遊離する反応系から生ずるサルコシン含有液、例えば
クレアチニンまたはクレアチ／を含有する体液にクレア
チニナーゼおよびクレアチナーゼを作用させて得られる
試料等が挙げられる。
本発明に使用するサルコシンオキシダーゼはいかなる起
源のものでもよいが、例えばコリネバクテリウム属、フ
ラボバクテリウム属、バチルス属等に属する微生物が産
生ずるものが挙げられ、その使用量は５〜３０ Ｕ ／
ｔｅｓｔ 。
源のものでもよいが、例えばコリネバクテリウム属、フ
ラボバクテリウム属、バチルス属等に属する微生物が産
生ずるものが挙げられ、その使用量は５〜３０ Ｕ ／
ｔｅｓｔ 。
特に１０〜２０ Ｕ ／ ｔｅｓｔが好ましい。また、
ペルオキシダーゼも１動植物、微生物等のいかなる起源
のものでもよいが、特に西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼが好ましく、その使用量は０５〜５ Ｕ ／ ｔｅ
ｓｔ 、特に１〜２Ｕ／ｌ＠ｍｔが好ましい。
ペルオキシダーゼも１動植物、微生物等のいかなる起源
のものでもよいが、特に西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼが好ましく、その使用量は０５〜５ Ｕ ／ ｔｅ
ｓｔ 、特に１〜２Ｕ／ｌ＠ｍｔが好ましい。
本発明の色原体の１つであるＡＯ８の好ましいものとし
ては、例えばソゾウムーＮ−エチに−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホゾロピル）メタアニシジン（＾ＤＯ８
と称する）、ンゾウムーＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホゾロぎル）アニＩＪ ン（ＡｌＯ２と
称する）等が挙げられる。これらのＡＯ８は試料に対し
００１〜１ ｖ ／ ｖ％の範囲になるように使用する
のが好ましい。
ては、例えばソゾウムーＮ−エチに−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホゾロピル）メタアニシジン（＾ＤＯ８
と称する）、ンゾウムーＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホゾロぎル）アニＩＪ ン（ＡｌＯ２と
称する）等が挙げられる。これらのＡＯ８は試料に対し
００１〜１ ｖ ／ ｖ％の範囲になるように使用する
のが好ましい。
本発明の定量法は、色原体の１つとしてＡＯ８ｆｔ使用
する以外は公知の方法によって行うことができる。測定
系のｐＨは発色体の呈色の安定範囲内であればよく、例
えばＡＤＯ８の場合にはｐＨａ５〜Ｑ５、ＡｌＯ２の場
合にはｐ）Ｉ ｅ、 ５〜７５が好ましい。緩衝液はこ
のｐＨ範囲のものであれば何れのものでもよく、例えば
リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が使用される。
する以外は公知の方法によって行うことができる。測定
系のｐＨは発色体の呈色の安定範囲内であればよく、例
えばＡＤＯ８の場合にはｐＨａ５〜Ｑ５、ＡｌＯ２の場
合にはｐ）Ｉ ｅ、 ５〜７５が好ましい。緩衝液はこ
のｐＨ範囲のものであれば何れのものでもよく、例えば
リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が使用される。
このようＫすると、 ＡＯ８と４−アミノアンチピリン
は過酸化水素の存在で酸化縮合して発色体を生成するの
で、例えば、 ＡＤＯ８の場合には５４２ ｎｍで、人
ＬＯ８の場合には５６５ｎｍにて吸光度を測定すればサ
ルコシン量を定量することができる。
は過酸化水素の存在で酸化縮合して発色体を生成するの
で、例えば、 ＡＤＯ８の場合には５４２ ｎｍで、人
ＬＯ８の場合には５６５ｎｍにて吸光度を測定すればサ
ルコシン量を定量することができる。
斜上の如く、本発明によれば、色原体のＡＯ８がサルコ
シンからの過酸化水素生成反応を促進するので、少ない
酵素量で短時間にサルコシンの定量を行うことができる
。而して、体液中のクレアチニンおよびクレアチンの定
量においては、サルコシンからの過酸化水素生成反応が
律速反応であるから、この反応を短時間で行うことので
きる本発明は臨床検査の診断分野において極めて有意義
である。
シンからの過酸化水素生成反応を促進するので、少ない
酵素量で短時間にサルコシンの定量を行うことができる
。而して、体液中のクレアチニンおよびクレアチンの定
量においては、サルコシンからの過酸化水素生成反応が
律速反応であるから、この反応を短時間で行うことので
きる本発明は臨床検査の診断分野において極めて有意義
である。
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１
サルコシンの定量・・・・・・各種色原体の比較：反応
液組成 リン酸緩衝液 ４０ ｍＭ 、 ｐ
ＨＥＬ ０４−アミノアンチピリン（４−＾Ａ）
０．０２％ペルオキシダーゼ ２．５
Ｕ色原体 ００２％サルコシン
Ｑ ｌ ｐｍｏ ｌ ｅ上記反応
液０．５ ｄに各量のサルコシンオキシダーゼを添加し
、３７℃にて５分間反応させた後、０５％ＳＤＳ溶液１
ｄ ｔｌ″加えて反応を停止し、各色原体の吸収波長
にて吸光度を測定した。測定結果を第１図に示す。
液組成 リン酸緩衝液 ４０ ｍＭ 、 ｐ
ＨＥＬ ０４−アミノアンチピリン（４−＾Ａ）
０．０２％ペルオキシダーゼ ２．５
Ｕ色原体 ００２％サルコシン
Ｑ ｌ ｐｍｏ ｌ ｅ上記反応
液０．５ ｄに各量のサルコシンオキシダーゼを添加し
、３７℃にて５分間反応させた後、０５％ＳＤＳ溶液１
ｄ ｔｌ″加えて反応を停止し、各色原体の吸収波長
にて吸光度を測定した。測定結果を第１図に示す。
これよシ明らかな如く、ＡＤＯ８、ＡｌＯ２の２種のみ
が他の色原体と比較して少ない酵素量で短時間に反応が
終了しておシ、良好な結果を示した。
が他の色原体と比較して少ない酵素量で短時間に反応が
終了しておシ、良好な結果を示した。
尚色原体としては次のものを使用した。
ＡＤＯ８：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル） メタアニシジン ＡｌＯ２：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホゾロビル） アニリン ＴＯＯ８：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル） メタトルイゾン ＡＬＰＳ ；ソゾウムーＮ−エチルーＮ−スルホプロピ
ル−アニリン ＡＤＰＳ ：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−スルホゾロビ
ルーメタアニシゾン ＤＡＯ８：ソシウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホゾロビル） −３，５−ジメトキシアニリン ＨＤＡＰＳ ：ソゾウムーＮ−スルホゾロビルー３．５
−ジメトキシアニリン ＰＮ：フェノール ＤＥ人＝ゾメチルアニリン 実施例２ ＡＤＯ８’ｉ用いた発色系におけるサルコシンオキシダ
ーゼのＫｍ値： 反応液組成 リン酸緩衝液 ４０ｍＭ 、 ｐＨａ。
シ−３−スルホプロピル） メタアニシジン ＡｌＯ２：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホゾロビル） アニリン ＴＯＯ８：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホプロピル） メタトルイゾン ＡＬＰＳ ；ソゾウムーＮ−エチルーＮ−スルホプロピ
ル−アニリン ＡＤＰＳ ：ソゾウムーＮ−エチルーＮ−スルホゾロビ
ルーメタアニシゾン ＤＡＯ８：ソシウムーＮ−エチルーＮ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルホゾロビル） −３，５−ジメトキシアニリン ＨＤＡＰＳ ：ソゾウムーＮ−スルホゾロビルー３．５
−ジメトキシアニリン ＰＮ：フェノール ＤＥ人＝ゾメチルアニリン 実施例２ ＡＤＯ８’ｉ用いた発色系におけるサルコシンオキシダ
ーゼのＫｍ値： 反応液組成 リン酸緩衝液 ４０ｍＭ 、 ｐＨａ。
４−ムＡ ００２％色原体
０．０２％ペルオキシダーゼ
２．５Ｕサルコシンオキシダーゼ １２．５ｍ
Ｕ上記反応液０５ｍに各濃度のサルコシンを添加し、３
７℃にて５分間反応させた後、０５％ＳＯ８溶液１−を
加えて反応を停止し、各々の吸光度を測定した。結果を
第２図に示す。第２図よりＬｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕ
ｒｋプロットによシ求めたＫｍ値は、対照の４−ＡＡ
−フェノールの発色系におけるサルコシンオキシダーゼ
のＫｍ値が６７：ＯｍＭであるのに対し、 ４−ＡＡ−
ＡＤＯ８の発色系におけるサルコシンオキシダーゼのＫ
ｍ値は１３１ ｍＭであった。すなわチ、サルコシンオ
キシダーゼのサルコシンに対するＫｍ値は、４−ＡＡ−
ＡＤＯ８の発色系を用いた場合、４−ＡＡ−フェノール
の発色系と比較して約５分の１に低下していた。
０．０２％ペルオキシダーゼ
２．５Ｕサルコシンオキシダーゼ １２．５ｍ
Ｕ上記反応液０５ｍに各濃度のサルコシンを添加し、３
７℃にて５分間反応させた後、０５％ＳＯ８溶液１−を
加えて反応を停止し、各々の吸光度を測定した。結果を
第２図に示す。第２図よりＬｉｎｅｖｅａｖｅｒ−Ｂｕ
ｒｋプロットによシ求めたＫｍ値は、対照の４−ＡＡ
−フェノールの発色系におけるサルコシンオキシダーゼ
のＫｍ値が６７：ＯｍＭであるのに対し、 ４−ＡＡ−
ＡＤＯ８の発色系におけるサルコシンオキシダーゼのＫ
ｍ値は１３１ ｍＭであった。すなわチ、サルコシンオ
キシダーゼのサルコシンに対するＫｍ値は、４−ＡＡ−
ＡＤＯ８の発色系を用いた場合、４−ＡＡ−フェノール
の発色系と比較して約５分の１に低下していた。
実施例３
ＡＤＯ８を用いたクレアチニンの定量・・・用時間経過
： 反応液組成 リン酸緩衝液 ４０ｍＭ 、 ｐＨ
ａ。
： 反応液組成 リン酸緩衝液 ４０ｍＭ 、 ｐＨ
ａ。
４−ＡＡ ＱＯ２％ＡＤＯ
８００２％ ペルオキシダーゼ ２５Ｕクレアチニナー
ゼ ＩＯＵクレアチナーゼ
２０Ｕサルコシンオキシダーゼ ２０Ｕ上
記反応液０．５ ｗｌにクレアチニンをｌＯｎｍｏ １
＠添加し、３７℃にて５４２ ａｍの吸光度変化を測
定した。結果を第３図に示す。これよ多明らかな如く、
反応は５分で完全に終了してお〕、良好な結果を得た。
８００２％ ペルオキシダーゼ ２５Ｕクレアチニナー
ゼ ＩＯＵクレアチナーゼ
２０Ｕサルコシンオキシダーゼ ２０Ｕ上
記反応液０．５ ｗｌにクレアチニンをｌＯｎｍｏ １
＠添加し、３７℃にて５４２ ａｍの吸光度変化を測
定した。結果を第３図に示す。これよ多明らかな如く、
反応は５分で完全に終了してお〕、良好な結果を得た。
実施例４
ＡＤＯ８を用いたクレアチニンの定量・・・・・・検量
線： 実施例２における反応液０５ｍ１に各量のクレアチニン
を加え、３７℃にて５分間反応させた後、５４２ｎｍの
吸光度を測定した。結果は第４図に示すとおシであシ、
極めて良好な直線性を示した。
線： 実施例２における反応液０５ｍ１に各量のクレアチニン
を加え、３７℃にて５分間反応させた後、５４２ｎｍの
吸光度を測定した。結果は第４図に示すとおシであシ、
極めて良好な直線性を示した。
第１図は各種色原体を用いたときの吸光度とサルコシン
オキシダーゼ量との関係を示す図、第２図はＡＤＯ８を
用いた発色系及びフエ／−ルｆ用いた発色系におけるサ
ルコシンオキシダーゼの基質飽和曲線を示す図、第３図
はクレアチニンの定量において、色原体としてＡＤＯ８
を用いたときの吸光度の経時変化を示す図、第４図は色
原体としてＡＤＯ８を用いてクレアチニンを定量すると
きの検量線を示す図である。 以上 一ノ
オキシダーゼ量との関係を示す図、第２図はＡＤＯ８を
用いた発色系及びフエ／−ルｆ用いた発色系におけるサ
ルコシンオキシダーゼの基質飽和曲線を示す図、第３図
はクレアチニンの定量において、色原体としてＡＤＯ８
を用いたときの吸光度の経時変化を示す図、第４図は色
原体としてＡＤＯ８を用いてクレアチニンを定量すると
きの検量線を示す図である。 以上 一ノ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、サルコシン含有試料にサルコシンオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよび一般式
（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは水素原子又はメトキシ基を、Ｍはアルカリ
金属を示す） で表わされるＮ−２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
アニリン誘導体を作用させ、生ずる発色体を測定するこ
とを特徴とするサルコシンの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30720287A JPH01148198A (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | サルコシンの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30720287A JPH01148198A (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | サルコシンの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148198A true JPH01148198A (ja) | 1989-06-09 |
Family
ID=17966269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30720287A Pending JPH01148198A (ja) | 1987-12-04 | 1987-12-04 | サルコシンの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01148198A (ja) |
-
1987
- 1987-12-04 JP JP30720287A patent/JPH01148198A/ja active Pending
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