JPH01157380A - ピコルナウイルス特にポリオウイルスのタンパクに特性エピトープが組み込まれたワクチン - Google Patents

ピコルナウイルス特にポリオウイルスのタンパクに特性エピトープが組み込まれたワクチン

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JPH01157380A
JPH01157380A JP63197810A JP19781088A JPH01157380A JP H01157380 A JPH01157380 A JP H01157380A JP 63197810 A JP63197810 A JP 63197810A JP 19781088 A JP19781088 A JP 19781088A JP H01157380 A JPH01157380 A JP H01157380A
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マルク・ジラール
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チエスロ・ビショスキ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 感染性ヒト疾患、ｐｏｌ　ｉｏｍｙｅｌ　ｉｔｅまたは
Ｈｅ１ｎｅ−Ｈａｄｉｎ病の病原体として知られるポリ
オウィルスは、ピコルナウィルス科のウィルスの原型と
して研究されてきた。数年以来の遺伝子工学の発達によ
って該ウィルスに関する知識が深まり、ｃＤＮＡ中での
ウィルスＲＮへの分子クローニング、及びそのゲノムの
ヌクレオチド配列の決定も可能になった（Ｋｉｔａｍｕ
ｒａ等、１９８１；Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ　ｅｔ　Ｂａ
ｌｔｉｍｏｒｅ。
１９８１、ｖａｎ　ｄｅｒ　ＩＡｅｒｆ等、１９８１）
。更に、ウィルスゲノムの完全コピーを保有するプラス
ミドを出発材料として霊長類細胞中で感染サイクルを誘
発することが可能になり、その結果、別のベクターを特
異的感染性を増強すべく処理することもできる（Ｓｅｍ
ｌｅｒ等、１９８４、Ｋｅａｎ等、１９８６）。その池
のピコルナウィルスについても速やかに研究が進んだ。
このクラスのウィルスとしては、エンテロウィルス属が
あり、そのサブクラスとしてポリオウィルス１．２及び
３型がある。ピコルナウィルスはまた、コクサラキーウ
ィルス及びエコーウィルス、ライノウィルス、カルジオ
ウィルス、アフトウィルス及び＾型ウィルス肝炎のウィ
ルスを包含する。ピコルナウィルスのゲノムは、一般に
約７５００ヌクレオチドのサイズをもつＲＮＡである。
１１ｏＩ？ｌｅ等（１９８５）の業績とＲｏｓｓｍａｎ
（１９８５）の業績とによって、ピコルナウィルスには
主要な３つの中和部位、即ちＶＰＩ（７）旧ｍＩトｖＰ
２及びＶＰＩ（７）ＮＩｍＩＩとＶＦ６及びＶＦ６のＮ
１ｍ１ｌｌとが存在することが判明した（ＮＩｎは［中
和抗原（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅ
ｎ）」の略号である）、ポリオウィルス１型においては
、逐次的（ｓｅｑｕｅｎ　ｔ　ｉ　ｅ　ｌ　）エピトー
プＣ３をもつＮＩ＋１部位（アミノ酸９３〜１０４、Ｗ
ｙｃｈｏｗｓｋ　ｉ等、１９８３）と、ピリオン表面で
高次部位（ｓｉｔｅ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｎｅｌ
）を決定するＮｒｎ１１部位及び旧ｍｌＩ［部位とが存
在することが知見された。
ポリオウィルスのその他の免疫原性エピトープの所在検
出及び同定に関しては、Ｅ、＾、Ｅｍｉｎｉ、Δ。
Ｊａｍｅｓｏｎ　、＾、Ｊ、Ｌｅｗｉｓ＋Ｇ、Ｒ，Ｌａ
ｒｓｅｎ＋Ｅ、Δ、Ｗｉｍｍｅｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　
４３．９９７（１９８２）：Ｒ，Ｃｒａｉｎｉｃ等、Ｉ
ｎｆｅｃｔ。
Ｉｍｍｕｎ、４１．１２１７（１９８３）　；Ｐ、Ｍｉ
ｎｏｒ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０１．６７
４（１９８３）　；Ｐ、Ｍｉｎｏｒ等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖ
ｉｒｏｌ、６５．１１５９（１９８５）　；Ｍ、Ｆｅｒ
ｇｕｓｓｏｎ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４３．５０５（
１９８５）；Ｄ、Ｃ，Ｄｉａｍｏｎｃｌ等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２２９．１０９０（１９８５）；Ｄ、Ｈ，Δ。
Ｅｖａｎｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　　ｖｏ
ｌ、３０４．４５９〜４６２を参照するとよい。
また、ライノウイルスが保有する中和エビトープの位置
決定及び同定に関しては、例えばＲｏｓｓ−１１１ａｎ
ｎ　Ｍ、Δ９等（１９８５）；５ｈｅｒｒｙ　８等、Ｊ
、Ｖｉｒｏｌ　５７．２４６〜２５７（１９８６）、Ｄ
　Ｕ　Ｅ　ＣＨＬ　Ｅ　Ｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ。
ＵＳ八、ｖｏｌ、８４、ｐｐ　、　２６０５〜２６０９
　（１９８７）を参照するとよい。
今日まで同定された免疫原性エピトープの大部分は該当
ウィルスのキャプシドによって該キャプシドの表面に担
持されているが、例えばラット及びウサギにおいては、
表面に存在しないが有意な中和反応を誘発し得るエピト
ープも存在することが判明した。一部分だけが露出しな
■Ｐ１のアミノ酸残基１１３〜１２１の配列に対応する
ペプチド（Ｂ、Δ。
Ｊａｍｅｓｏｎ等、ｒ　ｖａｃｃ　１ｎｅｓ　」、Ｒ，
Ｌｅｒｎｅｒ等編（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ−ｒｉｎｇ　１ｌａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｎ。
Ｙ、１９８５）ｐｐ、１９１〜１９８）、またはウィル
ス内部のペプチド、例えばポリオウィルスのアミノ酸残
基６１〜８０及び１８０〜２０１に対応するペプチドは
、重要な中和特性をもつ抗体を誘発した。
本発明は、宿主細胞を所定の病原体に対して免疫化した
い場合において、該宿主細胞中で複製し得るピコルナウ
ィルスを、該病原体に対する中和抗体の産生を宿主細胞
中で誘発し得るピコルナウィルスに対して外来の免疫原
性エピト−プを、ピコルナウィルスの中和免疫原性エピ
トープに置換してピコルナウィルスのタンパクに組み込
んで、該エピトープのキャリアベクターとして使用し得
るという知見に基づく。
ベクターとして使用され得る好ましいピコルナウィルス
はポリオウィルス、アフトウィルス及びライノウイルス
である。
従って言い替えると本発明は、ピコルナウィルスのタン
パクに対して外来の免疫タンパクの特性エピトープ（ｅ
ｐｉｔｏｐｅ　ｃａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｑｕｅ）をピ
コルナウィルス本来の免疫原性エピトープの１つに置換
して含むことを特徴とする生きたハイブリッドピコルナ
ウィルスを提供する。好ましくは、外来エピトープがピ
コルナウィルスのキャプシドの表面に露出している。特
にエピトープは、通常はピコルナウィルスの表面に露出
したピコルナウィルスの内在免疫原性エピトープに置換
している。
−ｍ的には、外来エピト−プは、ピコルナウィルスの内
在免疫原性エピトープを最初に含んでいたキャリアタン
パク中に構築によって組み込まれると考えでよい。好ま
しくは、外来エピトープはキャプシドの表面に露出して
いる。しかしながら、本発明はこの露出タイプに限定は
されない。本発明は、天然の内在免疫原性エピトープに
外来工と）・−プが置換しｉｎ　ｖｉｖｏで活性を発揮
し得るようなすべてのピコルナウィルスに係る。
本発明の好ましい実施態様において、ポリオウィルスキ
ャプシドによるベクターピコルナウィルスは、通常はポ
リオウィルスのキャプシドの表面に露出したエピトープ
Ｃ３に外来エピトープが置換したポリオウィルス１型で
ある。
本発明はまた、生きたハイブリッドピコルナウィルス構
築中に生成する中間生成物、特に、ピコルナウィルスの
ｃＤＮＡ全部、または少なくとも非形質転換ピコルナウ
ィルスの培養が可能なコンピテント細胞培Ｗ：物中での
生存ウィルスの産生に必要な前記ピコルナウィルスのｃ
ＤＮＡの部分と、別のエピト−プをコードする合成され
たものであってもよい外来ヌクレオチド配列とを含む組
換えハイブリッドｃＤＮＡに係る。前記外来ヌクレオチ
ド配列はｃＤＮＡ中で、免疫原性アミノ酸配列をコード
する天然内在ＤＮＡ配列に置換している。好ましくは、
外来配列は、非変性ピコルナウィルス中では周囲配列の
性質に基づいて該ピコルナウィルスのキャプシドの表面
に露出したアミノ酸配列をコードしていた内在配列に置
換している。
本発明はまた、面記ハイブリッドｃＤＮＡをプロモータ
と調節エレメントとのコントロール下の構築によって組
み込んだ組換えプラスミドに係る。前記調節エレメント
は、多址のピコルナウィルスの産生に使用できる原核生
物または真核生物中で対応する組換えピコルナウィルス
の自律複製を可能にする。
本発明のプラスミドは特に、前記条件下に外来免疫原性
エピトープをコードするポリヌクレオチドによって変性
されたポリオウィルス、アフトウィルスまたはライノウ
ィルスのｃＤＮＡに由来のキャリアプラスミド、持に原
核生物または真核生物の形質転換に使用でき対応する変
性ポリオウィルス、アフトウィルスまたはライノウィル
スの自律複製及び産生を行なうことが可能なプラスミド
である。
本発明はまた、タンパクＶＰＯ，ＶＦ６及びｖＰｌをコ
ードする配列を含む該当ピコルナウィルスのメツセンジ
ャーＲＮΔ全部を含み、該当ｃＤＮＡの置換に対応する
置換を含む組換えＲＮＡに係る。このメッセンジャーＲ
ＮＡは、対応するピコルナウィルスを含むベクターを出
発材料とし、プロモータ及び適当な調節エレメントのコ
ントロール下に匡ｖｉｔｒｏで得られてもよくまたは予
め形質転換した細胞培養物中で得られてもよい。
極めて注目すべきは、ウィルスタンパク中、特にピコル
ナウィルス特にポリオウィルスのキャプシドの表面に通
常は露出した免疫原作エピトープを普通なら含むウィル
スタンパク中に前記のごとき変性が導入されても、多く
の場合には生存率が損なわれないことである。その結果
として本発明は、合成によって産生されたオリゴヌクレ
オチドによってコードされる特性エピトープを出発材料
とし、「生ワクチン」または不活化ワクチンを製造する
ための活性成分を提供する。これらのワクチンは勿論、
通常はエピトープのアミノ酸配列を含むタンパクをコー
ドする天然ＤＮＡまたは天然ＤＮＡへ来のｃＤＮＡの開
裂によって得られた天然ヌクレオチド配列を出発材料と
して産生することもできる。
本発明はまた、前記ウィルス、特に従来方法によってビ
ルレンスが不活化された前記ウィルスから得られるワク
チンまたは弱毒生ワクチンに係る。
、　　ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｅに対するワクチンを製
造するために、ポリオウィルスの不活化方法を同様に応
用できる。例を挙げると、例えば５０°Ｃ〜６０°Ｃの
間の温度で熱処理する方法、不活化ワクチンの製造に使
用できるホルモールまたはその他のアルデヒドのごとき
（ヒ学薬晶で処理する方法等がある。
本発明ワクチンの重要な利点は、ピコルナウィルス特に
ポリオウィルスと、該ピコルナウィルスに対するワクチ
ン特にｐｏ　ｌ　ｉｏｍｙｅ　ｌ　ｉ　ｔｅに対するワ
クチンとの完全にコントロールされたかまたはコンＩ・
ロール可能な特性をその他のワクチンの製造のために利
用し得ることにある。更に、新規なワクチンの外来エピ
トープは、ポリオウィルスの天然免疫原の形態に類似の
三次元構造で被免疫宿主生物に与えられる。
！？＆に本発明は、前記ハイブリッドピコルナウィルス
の産生方法に係る。該方法の特徴は、ウィルスＲＮＡに
由来のｃＤＮＡを出発材料とし、該当ピコルナウィルス
の天然免疫原性エピトープの所在を予め検出した後、前
記ｃＤＮＡにおいて、置換されるべき天然免疫原性配列
の処々に特異的制限部位を導入しくこれらの特異的制限
部位がまだ存在しないときだけ）、これらの特異的制限
部位の処で対応する制限酵素によってｃＤＮＡを開裂し
、天然エピトープをコードする配列とそれまで結合して
いたウィルスの最終複製に必要なｃＤＮＡと、天然エピ
トープをコードする配列に置換すべき免疫原性エピトー
プをコードする配列との全部のエレメントから組換えハ
イブリッドｃＤＮＡを復元し、感受性細胞培養物に前記
組換えＤＭＡをトランスフェクトし、最後に対応する組
換えピコルナウィルスを回収することである。
置換される内在免疫原性エピトープをコードする配列を
包囲する特異的部位を認識するためには、核酸の所定場
所に特異的制限部位を導入すべく適当な任意の方法で処
理すればよい。好ましくは、例えば実施例で後述するご
とく突然変異誘発によって処理する。
処理すべきＤＮへの所望場所における特異的開裂を確保
し同時に該ＤＨへの別の領域における寄生開裂を阻止す
るために、その別の領域に存在し得る同様の制限部位を
消滅させるようにＤＮＡを予め変性するのが好ましい。
この処理は、制限部位を変性し得る適当な任意の方法で
行なうことができ例えば突然変異誘発を使用する。
前記の記載においては、対応するピコルナウィルスのｃ
ＤＮＡの限定された置換についてのみ説明した。実用上
の要件に応じて、より大きく形質転換したハイブリッド
ウィルスの産生も可能であることは当業者に理解されよ
う。前記方法によれば、ポリオウィルスのｃＤＮＡにお
いて、ポリオウィルスのタンパクｖＰＯ１ＶＰ３及びＶ
ＰＩをコードする対応配列に置換して、例えばライノウ
ィルスまたは＋１ＡＶのタンパクｖＰＯ１ＶＰ３及びｖ
Ｐｌを順次コードする完全配列の全部または一部な結合
する。
また、この場合には、ライノウィルスまたはＨＡＶのｃ
ＤＮＡの特異的切断部位を突然変異誘発によって変性し
、特異的プロテアーゼをコードする配列のコントロール
下にタンパク■ＰＯとＶＰ３との間及びタンパクＶＰ３
とｖＰｌとの間で最終ハイブリッドウィルスの産生に必
要な開裂を生じさせる必要がある。
特異的プロテアーゼは天然ポリオウィルスにおいては、
前記タンパクを分離するグルタミン−グリシン結合を切
断する。
この形質転換の結果として、ライノウイルスまたはＩＩ
ＡＶのキャプシドをもつポリオウィルス由来のピコルナ
ウィルスが得られる。
種々のピコルナウィルスのその池の結合（ａｓｓｏ−ｃ
ｉａｔｉｏｎ）を含む構築が設計者の意図に応じて同様
に可能であり、産生されたハイブリッドウィルスと免疫
すべき宿主生物との間に所望の最大適合性が得られるこ
とは当業者に明らかであろう。
本発明の付加的特徴は、第１ａ図から第５ｄ図に基づい
て説明するポリオウィルス１型に由来の本発明の組換え
ハイブリッドＯＮへの構築方法に関する以下の記載より
明らかであろう。これらの図は構築の順次段階及び種々
の使用プラスミドの構造を概略的に示す。
１、′　　ブクローニングベクターＢＲ３２７の　築ア
ンピシリン耐性（＾ｐ’）及びテトラサイクリン耐性（
Ｔｃ″）遺伝子とその複製オリジン（ｏｒｉ）とを保有
する大腸菌中で複製し得るプラスミドｐＢＲ３２７（Ｓ
ＯＢＥＲＯＮ等、１９８０）　（第１ａ図）を構築用ベ
クターとして選択する。このベクターをクローニング要
件に応じて以下のごとく変性する。
１、このプラスミドのＨｉｎｄｌＩ［部位（２９位）を
Ｘｈｏ　１部位によって置換する。
対応する制限酵素（ＢＯＥ）ＩＲＩＮＧＥＲ１使用条件
は製造業者の規定に準拠）によって）Ｉｉｎｄｌ１１部
位でベクターを開裂する。阿ＡＮＩΔＴｒＳ等（１９８
２）の１０トコＩしを用い、４つのヌクレオチド（ｄＮ
ＴＰ）　（各２００μＭ）の存在下に、生じた付着末端
（４０μｇ／ｘｌ＞をＤＮＡポリメラーゼＫＬＥＮＯＶ
　（１００ｔｌ／ＩＩＮ）で処理して充填する。直線化
したＤＮＡを、５０ｎ＋Ｈ）リス−１１ｃＮ　ｐＨ８，
ｏ、１０ｍＭ　ＨｇＣ（１２，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、
ＩＭＭ　ＺｎＣｌ２バッファ中の子ウシ腸アルカリホス
ファターゼ（ＯＮ八へｇ当たり２Ｘ０．０２単位）で３
７℃で３０分間ずつ２回処理して脱ポスホリル化した後
に（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲの酵素及びプロＩ、コル）、
ホスホリル化した合成アダプターくリンカ−）Ｘｈｏ　
Ｉ　（８ヌクレオチド、ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢＩ
ＯＬＡＢＳ４：　ヨリ市販）と結合させる。結合反応は
、６０ｍＭ　）リス−１１ＣａｐＨ７，５、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　　ｈｃ１２、１０ｍＭ　　ＤＴ
Ｔ、　　１ｍＭ　　ＡＴＰ溶液中で、ＤＮＡＩμｇ当た
り１単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＯＥ）ＩＲＴＮＧ
ＥＲ）ノ存在下に、モル比１００（リンカ−／プラント
末端をもつＤＮＡ）で＋４°Ｃで４８時間（または＋１
５°Ｃで１６時間）行なう。結合混合物を使用し、塩化
カルシウムで処理した大腸菌１１８ＩＯＩ（１３０ＹＥ
Ｒ１ＲＯＵＩ几ΔＮ０−ＤＵＳＳＯＩＳ、１９６９）を
形質転換する（ＭＡＮＩＡ−ＴＩＳ等のプロトコル）。
次に、アンピシリン（１００１ｉ。
／ｚｌ）を含むＬＢアガロースプレートに細菌を展開さ
せる。ＢＩＲＮＢＯＩＭ及ヒＤＯＬＹノ方法（１９７９
）　テア’　ラスミドを抽出し、スクリーニングし、Ｘ
ｈｏ　Ｉ制限部位を含むプラスミドを単離する。
１１ｉｎｄＩ［Ｉ部位に置換したＸｈｏ　ｒ制限部位を
もつプラスミドｐＡＨ１（第１ｂ図）を保存する。この
プラスミドはりゾチームードデシル硫酸ナトリウム（Ｇ
ＯＤＳＯＮ及び■ΔＰＮＥＫ、１９７３）で細菌を溶解
し塩化セシウム勾配で精製すると一５量に調製される。
勾配で採取されたプラスミドＤＮＡを、等容のブタノー
ル１（３回）、ＴＥ（１０ｍＭ　トリス−ＨＣ１ｐＨ７
，５，１ｍＭ　ＥＤＴΔ）中の飽和フェノールとクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２４：１）との１：１
混合物で処理する。倍容の９５％エタノールを添加して
抽出水相を沈殿させ、遠心し、残渣をＴＥバッファに入
れる。
２゜得られた変性プラスミド中のＥｃｏＲＶ部位（１８
５位）をＢｇｌ　■部位によって置換する。
同様にして、プラスミドｐＡＭ１をＥｃｏＲＶ部位で直
線化し、脱ホスホリル化し、ホスホリル化した「リンカ
−」ＢｇｌＵ　（８ヌクレオチド）と結合させる。細菌
ＨＢＩＯＩを結合混合物で形質転換後にアンピシリン耐
性クローンが得られる。前記の方法でプラスミドを調製
し、Ｂｇｌ　ＩＩ制限部位の存在を分析する。
Ｈｉｎｄｌｌ及びＥｃｏＲＶ部位の夫々に置換したＸｈ
ｏ　ｌ及びＢｇ（ｌ　［制限部位をもつプラスミドｐＡ
Ｍ２（第１ｃ図または第２ａ図）を塩化セシウム勾配で
精製する。
ポリオウィルス１型阿＾１１ＯＮＥＹ（７４４１ヌクレ
オチド）の相補的ＤＮ＾（ｃＤＮＡ）の最初の５６０１
のヌクレオチドを含むフラグメントのサブクローニング
は、突然変異誘発によって生起されこのフラグメントに
おいて構造中で非反復（ｕｎｉｑｕｅ）の制限部位を形
成する。従って新しい制限部位は、対応する制限酵素に
よる完全消化によってアクセスでき、これらの部位の間
に含まれたフラグメントを容易に欠失させて外来置換配
列で置換させ得る。
このサブクローニングに必要な「ポリオフラグメン１〜
」及びベクターは以下に記載のごとく得られる。
１、ポリオフラグメント ポリオｃＤＮＡ（５６３８塩基対）の最初の５６０１の
ヌクレオチドを含むＸｈｏ　Ｉ−ＢｇＩＩＩ制限フラ制
限フラグメントスミドｐＫＫ１７（Ｋ、ＫＥＡＮ等、１
９８６）　（第２ｂ図）に由来する。このプラスミドは
、ＳＶ４０に由来のフラグメンｌｌＴＡｇ）に含まれた
ＳＶ４０の後期プロモータＰＬの直後にクローニングさ
れたポリオウィルスのｃＤＮＡく斜線部分）全部と、サ
ル細胞中での自律複製に必要なエレメント（ＳＶ４０の
複製オリジンと、転写プロモーターと、転写エンハンサ
−配列と、機能Ｔ抗原と）を含む、また、細菌の複製オ
リジンとアンピシリン耐性をコードする遺伝子とを含む
９プラスミドｐＫＫ１７を制限酵素Ｘｈｏ　ｌ及びＢｇ
ｌ　ＩＩ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ）で完全消化する。該
プラスミド中の非反復部位が上記制限酵素に対応する。
５６３８塩基対（ｂｐ）のフラグメントを低融点アガロ
ースゲル（ＷＩＥ乳＾ＮＤＥＲ１１９７９）から単離し
、フェノールで２回抽出、フェノール／クロロホルム：
イソアミルアルコール（ＩΔΔ）混合物で１回抽出及び
クロロホルム：イソアミルアルコール（ＩΔ＾）混合物
で２回抽出することによって精製する。
２、ベクター 同時に、プラスミドｐＡＭ２を制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ及び
１３ｇ１　］１によって完全に消化する（非反復部位）
。細菌複製オリジンとアンピシリン耐性遺伝子とを含む
８ｇ１■−Ｘｈｏ　ｌフラグメント（３１０９ｂｐ）を
同様に低融点アガロースゲルから単離し精製する。
３、サブクローニング （インサート／ベクターのモル比２：１で）２つのフラ
グメントの結合反応を行なう。細菌ＨＢＩＯ１を結合混
合物で形質転換する。アンピシリン耐性クローンが得ら
れる。プラスミドＤＮ＾を抽出し、酵素Ｘｈｏ　■及び
ＢＧＮ　１１で消化後に得られたフラグメントをサイズ
に基づいて分析する。
ポリオのｃＤＮＡの最初の５６０１塩基対の配列をもつ
ｐＡＭ３（第２ｃ図または第３ａ図）を回収し、塩化セ
シウム勾配で精製する。
ｐＡＭ３の場合には、二重鎖プラスミドに使用される合
成オリゴヌクレオチド（ＮＯＲＩＮＡＣ八等、１９８４
）によって誘発される突然変異誘発法で新しい制限部位
を形成する。このために、ポリオウィルスの配列中の２
７５６位のＨｐａ　ｌまたはＥｃｏＲＶ部位と２７８６
位の旧ｎｄｌ［部位とを形成させる方法を選択した。こ
れらの２つの位置は、２つのβ層間に存在するポリオウ
ィルス１型の中和抗原決定部位に対応するキャプシドタ
ンパクＶＰＩのループ９３〜１０３を正確に包囲する。
このように形成された制限部位は、このループのアミノ
酸をコードするヌクレオチド配列を欠失させ、その抗原
決定機能に基づいて選択された外来配列で置換し、この
外来配列をピリオンの表面に露出させる。
新しい制限部位を形成するためには、ポリオウィルスの
ＯＮΔ中の１つのヌクレオチドを突然変異させれば十分
である。ここではく対応するき成オリゴヌクレオチド対
によって（第３図参照））ポリオウィルスの二重突然変
異を生じさせる方法と使用する。一方では２７５７〜２
７９１位において生じた局限的突然変異（ｍｕｔａｔｉ
ｏｎ　ｐｏｎｃｔｕｅｌｌｅ）によって１ｌｐａ（及び
ｔｌｉｎｄｌＩ［部位が形成され、他方では２７６０位
及び２７９１位において生じた突然変異によってＥｃｏ
ＲＶ及び旧ｎｄ１１部位が形成される。
これらの方法を実施するために、前記プラスミドに加え
て合成オリゴヌクレオチドを使用する。
合成オリゴヌクレオチドの各々は、前記「ポリオフラグ
メント」の一部のヌクレオチド配列に対する局限的突然
変異を含む、これらの長さは、突然変異ヌクレオチドを
包囲し且つポリオウィルス野性型閂＾ＨＯＮ　Ｅ　Ｙの
その他の配列と最小相同をもつように選択されている。
特に以下のごとく処理する。
１、プラスミドｐＡＭ３をＳａｌ　Ｉ　（ｐＢＲ３２７
の６５１位）で消化して直線状フラグメントを形成する
（第３ｂ図）。
２．１ラスミドルＡＭ３をポリオウィルスのｃＤＮＡの
フラグメントの２５４６．２８６１．３５８１．４８８
６位に存在するＸｈｏ１部位で消化する。従って、４つ
のフラグメントが得られる。１つのフラグメント（２５
４６〜２８６１）は低融点アガロースゲル分離後に除去
される。除去されたフラグメントはキャプシドタンパク
ＶＰＩの前記ループ９３〜１０３をコードする核酸配列
と本文中て以後「ポリオ野性配列」と指称する配列中で
前記核酸配列を包囲するヌクレオチドとを含む。
残りの３つのフラグメントは逆に抽出される。
これらは夫々、７２０ｂｐ　（フラグメントｌ１ａ）、
１３０５ｂｐ（フラグメントｎｂ）及び６４０５ｂｐ（
フラグメントＩｎｃ）のサイズをもつ。このため、５ａ
ｌｌで消化したフラグメントｐＡＨ３によって変性及び
ハイブリダイゼーション処理した後に、２５４６位と２
８６１位との間に単鎖領域が得られる。ここに突然変異
を導入する。
３、フェノール抽出及び９５％エタノール沈殿を順次行
なってフラグメントＩ、Ｕａ、ｌｌｂ、ｌｌｃを個々に
精製する。これらをＴＥバッファ＜１０ｍＭ　Ｉ−リス
−１１ＣＮ　ｐｌ＋７．５．１ｍＭ　ＥＤＴ＾）中に溶
解する。次に同じ溶液中でフラグメンｌ−１１ａ、ｎｂ
及びＴｉｃを結合さぜる。
４、オートマチックシンセサイザー内でオリゴヌクレオ
チドを合成し、高性能液相クロマトグラフィー　（ＨＰ
ＬＣ）で精製し、次に７Ｍウレアを含む２０％アクリル
アミドゲル電気泳動で精製した。最後に、１ｍＭのΔＴ
Ｐの存在下に５０ｍ１〜リス−１１Ｃｆ　ｐＨ９，ｏ、
１０ｍＨＨｇＣｂ、５＋＋＋Ｍ　ＤＴＴバッファ中のＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（２×１単位／μｇ　ＤＮ
Ａ）で３７°Ｃで１時間ずつ２回処理してホスホリル化
した。
これらのオリゴヌクレオチドは、後述の構造をもつ「ポ
リオ野性型配列」の部分に対応する。特に、以下のアミ
ノ酸を夫々コードするコドンのヌクレオチドの突然変異
を含む。
一オリコ′、ヌクレオチドへは９３ −オリゴヌクレオチドＢは１０４及び −オリゴヌクレオチドＣは９４゜ 上記の数字は後述の「ポリオ野性型配列」の対応するコ
ドンによってコードされるタンパクＶＰＩのアミノ酸番
号に対応する。
ＨｐａＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＨｉｎｄＩ［ＩｃｏＲＶ ＾１ａＶａｌ　　丁「ｐ 「野性型ポリオ配列」のコドン及び対応アミノ酸の列の
下方で合成オリゴヌクレオチドの相対位置を矢印で示す
、この合成オリゴヌクレオチドは夫々の構造中の（枠で
囲んだ）局限的突然変異によって得られたもので以下の
式で示される。これらの局限的突然変異は、この突然変
異で得られた置換ヌクレオチドを指示し且つ突然変異コ
ドンによってコードされるアミノ酸の種類の変化を認識
するために白抜き文字によって示される。
オリゴヌクレオ　ドＡ。
Ｈｐａｌ　　５’　　　ＧＡＣＣＧＴＧ　　　ＧＴｒＴ
ＡＡＣＣＣＡＧＣ３゜３’　　　ＣＴＧＧ　　ＣＡＣＣ
ｌ１ｉｌ＾　ｎＧ　　ＧＧＴ　　ＣＧ　　　５°　Ｏ１
ｉｇｏｎｕｃ！６ｏｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｔｉｑｕ
ｅ９１　　９３　　９５　　　　　　　　（１８−ｎ＋
ｅｒ）Ｔｈｒ　Ｖａｔ　ｌ（ｉ　Ａｓｎ　Ｐｒ。
１１ｐａｉ部位は、アスパラギン残基をコードするコド
ン（ｖｐｔの９３位）をバリンをコードするコドンで置
換することによって形成された（＾２７５７＞　Ｔ）　
。
１　ゴ　　　　し　　−　　′Ｂ １０２　１０４　　　　１０８　　　　（２２−ｍａｒ
）ＡＳｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　
ＴｒｐＨｉｎｄＩ［［部位は、ＶＰＩ　１０４位の残基
に対する（アミノ酸発現に関して）サイレントな突然変
異によって形成された（Δ２７９１＞Ｔ）。
リゴヌクレ　　ドＣ ＥＣ０ＲＶ　　５’　　ＣＣＧＴＧ　　ＧＡＴ　　Ａ？
ＣＣＣＡ　　ＧＣＴ　　ＴＣＣ３゜ＥｃｏＲＶ部位は、
（ＶＰＩの９４位の）アスパラギン残基をコードするコ
ドンをイソロイシンをコードするコドンで置換すること
によって形成された（＾２７６０＞　Ｔ）。
フラグメントＩ及び■（夫々０．０３ｐｍｏｌｅ）を１
０μ！の水中で、夫々的２０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレ
オチド＾及びＢまたはオリゴヌクレオチドＢ及びＣと混
合し、最終ハイブリッドプラスミド中に部位対Ｈｐａ　
Ｉ＋１１ｉｎｄｌＩ［またはＥｃｏＲＶ　＋　Ｈｉｎｄ
ｌ［［を形成する。この混合物に２μｌの１０倍濃縮ポ
リメラーゼ−リガーゼバッフｙ　（ＬＭ　ＮａＣ１，６
５ｍＭ　）リス−ＨＣ１’　ｐＨ７，５，８０ｍＭＭＦ
ｉＣＮ、、１０Ｈβ−メルカプトエタノール）を添加す
る。密封毛細管に入れた混合物のフラグメントを沸騰塩
水浴中で３分間インキュベーションすることによって変
性し、次に徐冷して分子を再結合する。形成された分子
集合中に、野性型マトリックスの１つの鎖とオリゴヌク
レオチド対＾−Ｂまたはオリゴヌクレオチド対Ｂ−Ｃと
のハイブリダイズによって生じた分子が検出される。
これらのハイブリダイゼーション産物、特に最初に言及
したハイブリダイゼーション産物を第４ａ図に示す。そ
の後は、第４ｂ図及び第４ｃ図に示されるマトリックス
の単鎖部分の充填を行なうだけでよい。第４ｂ図及び第
４ｃ図は、前記単鎖部分を含み尖った小突起で示される
挿入をもつフラグメントを示す。
このために、混合物をＤＮＡポリメラーゼＫＬＥＮＯＶ
（３単位）＋４　ｄＮＴＰ＋Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（３
単位）で１２．５°Ｃで１晩処理して、単鎖ＤＮＡを、
２つのオリゴヌクレオチドによって生じた突然変異を含
む環状二重鎖ＤＮＡに変換する。
細菌ＨＢ　１０１を混合物によって変換する。各構築物
毎に、得られた１０００以上のアンピシリン耐性形質転
換体に対してコロニーハイブリダイゼーションによって
６００の形質転換体をスクリーニングする（ＧＲＵＮＳ
ＴＥ　ＩＮ及びＨＯＧ　Ｎ　Ｅ　Ｓ　Ｓの方法、１９７
５）。次にポリヌクレオチドキナーゼによってｆｆ２ｐ
標識された合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼー
ションプローブとして使用し、突然変異したプラスミド
によって形質転換された細菌を同定する（４２℃でハイ
ブリダイゼーション、５３°Ｃで洗浄〉。約１０の陽性
クローンを保存し、これを使用して細菌１１８１０１を
再度形質転換し、同−形質転換体中に共存し得る突然変
異プラスミドと「野性型プラスミド」とを分離する。Ｂ
ＩＲＮＢＯＩＭ及びＤＬＯＹの方法で調製したプラスミ
ドについて、対応する制限部位即ちＨｐａ　ｌと１ｌｉ
ｎｄｌ［またはＥｃｏＲＶと旧ｎｄｌとの存在を検査す
る。
保存されたプラスミド（第４ｄ図）は、−ｐＡＭ４：Ｈ
ｐａ　Ｉ及びｌｌ１ｎｄＩ［［部位−ｐＡＭ５：Ｅｃｏ
ＲＶ及び旧ｎｄ１部位の存在を示す。
プラスミドを調製し、ＣｓＣＮ中で精製し、突然変異を
確認するために配列決定する。配列決定は、ＢＩＲＮＢ
ＯＩＭ及びＤＯＬＹの方法または塩化セシウム中で調製
されたプラスミドに対しＺへＧＵＲＳＫＹの方法を直接
用いて行なう。
■、ハイブト・ドブ２スζドの プラスミドｐＡＭ４の非反復制限部位Ｈｐａ　ｌ及びｔ
ｌｉｎｄｌｌｌ（またはプラスミドｐＡＭ５のＥｃｏＲ
Ｖ及びＨｉｎｄ■）は、ポリオウィルスの■Ｐ１のアミ
ノ酸９４〜１０２即ちエピトープＣ３に対応するヌクレ
オチド配列を欠失させ、外来抗原決定基本単位（ｍｏｔ
ｉｆ　ａｎｔｉｇｅ−ｎｉｑｕｅ）をコードする任意の
別の配列、例えばエンテロウィルス（ポリオウィルス２
型もしくはポリオウィルス３型またはΔ型肝炎ウィルス
）あるいはその他の任意の免疫原性外来エピ１ヘープの
配列で置換し得る。
匿ニ プラスミドｐＡＭ４　（第４ｂ図にも示す）を制限酵素
ｔ（ｐａＩ及びｔｌｉｎｄｌで消化する。ｌ１ｐａＩは
ブランｌ−末端を形成し、旧ｎｄｌ［は付着端を形成す
る。次にこのプラスミドを脱ホスホリル化する。Δ型肝
炎配列は、前記のごとく合成し精製しホスホリル１ヒし
た相補的な２つのオリゴヌクレオチドの形態で導入され
る。これらの２つのオリゴヌクレオチドの１つは八によ
って相補され１つは直前に配列へＧＣＴＴ（後記参照）
をもち、ベクターと付着端で結合し得るｌｌ１ｎｄＩＩ
［部位を復元する。下の図で枠で囲んだ２つのハイブリ
ッドオリゴヌクレオチドは、特に後述するごとく処理す
ることによってポリオウィルスのベクターの配列に組み
込まれる（配列Ｈ八Ｖに外明細書の浄′６（内容に変更
なし］ 来のヌクレオチド及びアミノ酸配列は白抜き文字で示す
）。
）１ｉｎｄＩ［［ モル比１／２０の欠失ベクターと２つのハイブリッドオ
リゴヌクレオチドとの結合反応は、Ｔ４　ＤＮ＾リガー
ゼの存在下に＋４℃で４８時間行なう、細菌）ＩＢｌｏ
ｌを混合物によって形質転換し、形質転換クローンを、
３２　Ｐ　Ｗ　ｉプローブとして使用されるＨＡＶの２
つのオリゴヌクレオチドの１つとのコロニーハイブリダ
イゼーションによって分析する。（３７℃でハイブリダ
イゼーション、４２°Ｃから６８゛Ｃの段附的温度で洗
浄）、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法で陽性ク
ローンからプラスミドを抽出し、対応する酵素で消化し
て旧ｎｄｌ［［部位の存在を試験する。プラスミドｐＡ
Ｍ４２（第５ｂ図）を保存する。挿入ゾーンの該プラス
ミドの配列を記載の方法を用いた配列決定によってコン
トロールする。
次に、外来配列を含むポリオウィルスの配列１〜５６０
１をプラスミドｐＫＫ１７（第５ｃ図に再度示す）に置
換し、ポリオウィルスの完全ｃＤＮＡを復元する。
このために、プラスミドｐＡＭ４２を制限酵素Ｘｈｏ　
Ｉ及びＢｇＮ　ｎで消化し、ポリオ−Ｉ（へ■配列を含
むＸｈｏ　Ｉ　−Ｄｇｆｌ　■フラグメント（５６４１
ｂｐ）を単離し、低融点アガロースゲルで精製する。同
時に、プラスミドｐＫＫ１７を同様にＸｈｏ　Ｉ及びＢ
ｇＩＩＩで消化し、ポリオの最終１８４０ｂｐと細菌及
び霊長類細胞中でのプラスミドの複製に必要な配列とを
含むＢｇｌ　Ｉｆ　−Ｘｈｏ　ｌフラグメント（１００
２８ｂｐ）を単離し同様にして精製する。
２つのフラグメント間の結合反応を行ない、細菌ＩＩ　
Ｂ　１０１を組換え体によって形質転換する。形質転換
クローンから抽出されたプラスミドを、制限酵素Ｘｂｏ
　■＋　Ｈｐａ　ｌ及び／またはＸｈｏ　Ｉ　＋　Ｈｉ
ｎｄＩＩ［を川明＃ｌＪｅの浄８（内容に変更なし）ζ
斗１〜将９）いた二重消化によって分析し、得られたフ
ラグメントをサイズに基づいてスクリーニングする。
プラスミドｐＡＭ４２０（第５ｄ図）を保存する。該プ
ラス、ミドは、霊長類細胞に対して感染性のプラスミド
中にＨへＶインサートをもつポリオウィルスのｃＤＮＡ
ＤＮＡ含む０次に後述する条件下にノｚ４ブリ・ンドボ
リオウイルスを産生させこれを以後Ｖ４２０と指体する
。
挿入配列を確認するために記載の方法でプラスミドを配
列決定する。
同様にして、ポリオウィルス１型Ｍａｈｏｎｅｙの抗原
決定部位Ｉを別の配列、例えば、合成オリゴヌクレオチ
ドによるポリオウィルス２型ＬａｎｓｉｎｇのＶＰＩの
配列９４〜１０２、　　　　　　　　　（１１間■で置
換するか、または、１１ΔＶのｖＰｌの配列９７〜１０
７Ｈｉｎｄｌｌ［ ｔｂＴｌ　　１１０　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　Ｐ
ｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　ｌｙｓ　Ｇ
ｌｕ　　Ｔｙｒ　　甲ＩＬ＋ｓｓ　　了９メｃで置換し
、ポリオウィルスのｃＤＮＡに組み込まれたＨＡＶのＶ
ＰＩ配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列を形成してもよ
い（上記の配列図でハイブリッドした合成オリゴヌクレ
オチドは枠で囲まれている）。
ブーラスミドｐＡＭ５中で行なわれた構築によれば、制
限部位ＥｃｏＲ’Ｊによる突然変異の発生は阻止される
。この理由は、突然変異が欠失した配列に含まれている
からである。逆にプラスミドｐＡＭ４においては、欠失
配列の直ぐ上流の）ｌｐａ　■部位による突然変異が残
存する（アスパラギンにバリンが置換する）、アミノ酸
９３の機能を研究するために２つの系の比較が重要であ
る。
例えば、ｐＡ１４５中では、　　　　　ＨｉｎｄＩ［？
ｔ’Ｕ　　ｆｆ１ｓｐ　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　＾−Ｈ１Ｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＡＳｐ　
Ｌ％ｎ５１！ｌ　　ｌｆｆ１＠　　△ｈＳＩｉ（ｉｌき
−ｑｃ　　　ｇδｑｕｅｎｃｅ　ＨＡＶ　　　　　　　
ｒｐ’８ｒＪ＠で示される外来インサートによって特性
決定されるポリオウィルス／Ｈ＾Ｖ７２〜８１ハイブリ
ッドプラスミド（ｖ５２０とも指体）を構築した。
■、・・　■　　・の　六 ＤＥＡＥデキストラン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　ａｎｄ　
Ｐａｇａｎｏ、１９６５）の存在下に、Ｓ　ｏ　ｍ　ｐ
　ａ’ｙ　ｒ　ａ　ｃ及びＤａｎｎａ（１９８１）の方
法で、ｐＡＭ４２０型ハイブリッドプラスミドをサルＣ
ＶＩまたはＶＥＲＯの腎！ａ細胞またはヒト細胞（Ｈｅ
Ｌａ、Ｈｅｐ２等）に１、ランスフエフｌ−した、　Ｄ
　Ｎ　ＡをＢｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙの方法または
塩化セシウム勾配で調製する。
１０’のＣＶＩまたはＶＥＲＯ細膓を６０ｍｍのベトリ
皿に展開し、５０ｍＭの１−リス−〇Ｃｊ！　ｐＨ７，
５と５００μｇ／ｘｉのＤＥＡＥデキストランとを含む
無血清ダルベツコ改質イーグル培地（ＤＭＥ）１）中で
、ＤＮ＾１．ｚｌ当たり０．２５μｇの割合の０．４ｚ
ｌの混合物とインキュベートする。インキュベーション
はＣＯ３保温器で３７°Ｃで２時間行なう。次に細胞を
無血清ＤＭＥＭで洗浄し、５％ウシ胎児血清を添加した
ＤＭＥＭ４こ入れて保存する。約１０日後、細胞変性効
果（ＣＰＥ）が完全になると、ドライアイスで凍結／解
凍サイクルを５回繰り返して細胞を破壊し、１５００ｒ
ｐｍで３０分間遠心して細胞破片を除去する。上清をウ
ィルスのミニストックとして使用する。
ウィルスミニスｌ−ツクを６ウエルのプレートに滴下す
る。ウェルに夫々４×１０５のＣＶＩまたはＶＥＩＩＯ
細胞を接種し、１０ｍＭのＭｇＣＮ２を添加した無血清
Ｄ　ＨＥ　Ｍ培地で階段希釈した０、２ｚｌのウィルス
懸濁液で感染させる。Ｃ０２保温器で３７°Ｃで３０分
間インキュベーションを行なう。ここでウィルス懸濁液
を除去し、２％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭを含む寒
天で細胞を覆う。感染２日後にプレートをクリスタルバ
イオレットで染色する。寒天を除去し、溶菌プラークが
生じた細胞層を、１０％のホルモールと２０％のエタノ
ールと２ｇ／ｌのクリスタルバイオレッ１〜とを含む水
溶液で染色する。溶菌プラークを適当に希釈して計数す
る。ウィルス懸濁液の力価をプラーク形成単位（ｐｆｕ
）７ｍｆｆ１で示す。
ミニストックを利用してウィルスのマキシストツクを調
製する。このために、５ｘｌＯ’のＣＶＩＩ胞または８
Ｘ１０６のＩＩ　Ｅ　ｐ　２ＭＡ胞（ヒト上皮癌細胞、
ポリオウィルスはこの細胞で最も盛んに増殖する）を１
００ｍｍのペトリ皿に展開し、細胞層たり１ｐｆｕの多
重度のウィルス懸濁液でＳ染させる。ＣＯ□医温器て３
７°Ｃで１時間のインキュベーションを行なう。次に細
胞を、２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭに入れて保存す
る。２２時間後、ＣＰＥか完全になると、細胞をミニス
トックの場合と同様に処理する。マキシスＩ・ツクの力
価を同様にして測定する。
このマキシストツクを構成するピリオンから抽出された
ウィルスＩ’ｌＮ＾配列は挿入のレベルでコントロール
できる。従ってこのマキシストツクを使用して種々の分
析が可能である。
一ウィルスの特性決定。ベクターポリオウィルス及び外
来エピトープを提供した抗原に対するポリクローナル及
び／またはモノクローナル抗体との反応。必要な場合に
は、使用ピコルナウィルス中で置換配列の特異的モノク
ローナル抗体が該ピコルナウィルスを中和させる能力、
例えばモノクロ−ナルＣ３抗体がポリオウィルス１型に
由来のハイブリッドまたはキメラポリオウィルスを中和
させる能力が、エピトープＣ３を外来エピト−プて置換
したために低下することを確認する。
−精製されたハイブリッドウィルスをウサギに注射し得
られた血清を分析する（ＥＬＩＳΔ、イムノプロット、
血清中和（ｓｅｒｏｎｅｕｔｒａｌ　１ｚａｔｉｏｎ）
）。
−ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ　（Ｌａｅｍｍ　ｌ　
ｉ、］、　９７０　）中でハイブリッドウィルスのキャ
プシドタンパク（特にＶｌ’ｌ）を分析するために感染
細胞の抽出１勿を標識及び調製する。
一必要な場合は、ポリオウィルスに挿入された配列に対
応する合成ペプチドをウサギに注射し、得られた抗体の
分析、ハイブリッドウィルスの認識及び中和試験を行な
う。
［重用されたピコルナウィルスに挿入可能な複数のエピ
トープが得られる度毎に、最良の耐熱性をもち且つ非変
性ピコルナウィルスに比較して最良の産生効率を示す工
とｌ−−プをまず選択する。
次に、保存したハイブリッドピコルナウィルスの免疫原
性を試験し、また、特に実験動物（マウス、モルモット
、ウサギ）に注射後にこのハイブリッドピコルナウィル
スに挿入された工とｌ・−プに対応する病原体を中和さ
せる能力を試験する。
動物においてポリオウィルス及びその池の標的〈例えば
ＨＡＶ、ＩＩＩＶ、ロタウィルス）のいずれに対してら
高力価の中和抗体を誘発し得、しかも培養中のポリオウ
ィルスの安定性と収率とが最良になるハイブリッドまた
はキメラウィルスを保存する。次に適当な動物系（サル
、チンパンジー等）において、該当ウィルスのテスト感
染に対するこれらのウィルスの防御能を試験する。
特に、＾型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）に由来の配列によっ
て変性されたポリオウィルスの場合、新しい免疫成分の
免疫原性を以下のごとく試験し得る。
約１０６ｐｌｕのウィルスス１〜ツク清澄液の各々を完
全フロインドアシュパン１−（ＣＦ八）と等容で混音し
、４羽１０ツｌ〜のウサギ（雌、白色ニューシーラント
種）の各々の背中に多点皮肉（ＴＤ）注射で投与する。
免疫化の３３！１間後に同じ条件（１０”ｐｆｕのウィ
ルスをＣＦへの存在下にＩＤ注射）で第１回のブースタ
ーを行なう。ブースターの２週間後に瀉血によって採取
した血清の血清中和を分析する。Ｉｆ八へ中和抗体及び
Ｐｖ】中和抗体の存在を検査する。
ハイブリッドまたはキメラポリオウィルスを産生するた
めの前記の方法では、感染性プラスミド１１ＫＫ１７（
ＩＩ−１の項て記載）中でクローニングしたハイブリッ
ドのｃＤＮＡを霊長類細胞に直接１ヘランスフエクシヨ
ンすることによ−）で対応ウィルスを産生させる。
また、ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を利用し、ｉｎ
　ｖｉｔｒ。
で得られた陽極性ＲＮＡによる糸Ｅ胞のトランスフェク
ション後に対応するウィルスと産生さぜることも可能で
ある。霊長類♂Ｗ胞で１〜ランスフエクシヨンを行なう
とき、これらのＲＮＡの感染性はｃＤＮＡクローンの感
染性を上回る。
この第２の方法では、ハイブリッドｃＤＮＡを例えばフ
ァージＴ７（Ｓ、ｖａｎ　ｄｅｒ讐ｅｒｆ笠によって記
載されたプラスミド、１９８６＞のプロモーターの段方
またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａのファージＳＦ’６（Ｇ、
Ｋａｐｌａｎ等によって記載されたプラスミド、１９８
５）のプロモーターの？変力にクローニングする。ｃＤ
ＮＡは丁、！＃製Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼまたはＳＦ
３のＲＮＡポリメラーゼを１吏用して細胞系に転写され
、陽極性の感染性ウィルスＲＮへのコピーを！ｎ　ｖｉ
ｔｒｏで産生し得る。Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼは本来
のプロモーターに対して極めて高い特異性をもち且つ長
いｃＤＮＡの完全転写物を産生ずる能力をもつので、こ
の系においては多量のＲＮＡが産生され得る。これらの
ＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞中で翻訳用マト
リックスの機能を果たす。
Ｓ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ（１９８６）によって記
載されたプラスミドｐＴ７ＰＶ１〜５は、その構築によ
って、５′の２つの余剰残基Ｇと３′のポリへの下流の
３つの余剰残基だけとを含むＲＮＡ（÷）を産生し得る
。初期構築物から産生じたＲＮＡの５′及び３°の長い
余剰配列を除去したのでＲＮＡの感染性を１０’ｐｆｕ
／μｇから１０５ｐｆｕ／μｇに増加させ得る（ピリオ
ンから抽出されたウィルスＲＮへの感染性の約５％）。
更に、これらの方法論は、ゲノムのより大きい部分にハ
イブリッドしたｃＤＮＡ−最にも応用できる。
突然変異誘発によって形成され得る制限部位で包囲され
た同じ「カセット」系によってポリオウィルスのゲノム
の部分Ｐ１全部を欠失させ、別のピコルナウィルスの領
域Ｐ１で置換し、ハイブリッドウィルスを産生ずること
が可能である（必要に応じて任意に、外来ポリオウィル
スのキャプシドを与える系を相補してもよい）。
ポリオウィルスのキャプシクンバクに前記のごとく組み
込まれ得る中和免疫原作ペプチドのいくつかの例を非限
定的に以下に説明する。
ｐＡＭ４またはｐＡＭ５のごとき適当なカセットベクタ
ーに挿入されたかまたは挿入可能な免疫原性配列のいく
つかの生存ハイブリッドポリオウィルスが実際に得られ
たとき、このポリオウィルスを指体するために、文字Ｖ
に番号を付け、中間ｃＤＮＡの構築に使用したプラスミ
ドの名称を併記する。対応するハイブリッド配列をポリ
オウィルスのエピトープＣ３に置換して挿入した。
１、中和免疫原性ペプチドをコードするへ型ウィルス肝
炎（１１＾Ｖ）のウィルスの特性配列（Ｊ、Ｃ０ＨＥＮ
等（１９８６）、Ｊ、ｖｉｒｏｌ、　６１．５０〜５９
）。これらの配列は特に以下の領域に対応する。
−ＶＰＩ　　ＩＩＡＶの’ｆ　　ｔ−１０２〜１１０　
　ｖ５４５・　八Ｍ５５°Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｉ’ｈｅ　Ｐｒｏ　３
’５’　　ＴＣ八　＾ΔＴ　　へ＾ＴＡへ＾　ＧＡＧ　
　ＴＡＣＡＣＡ　　ＴＴＴ　　ＣＣ＾　八　３’　（２
８ｍｅｒ）３°　＾ＧＴ　　ＴＴＡ　　ＴＴＡ　　ＴＴ
Ｔ　　ＣＴＣＡＴＧ　　ＴＧＴ　　ＡＡＡ　　ＧＧＴ　
　ＴＴＣＧΔ　５’　（３２ｍｅｒ　）−ＶＰ１１１八
■の　１−１０２〜１１５５°　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　
Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈｒ　　
Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　ＩｌｅＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　３′５’　　ＴＣ＾　＾へ丁　へへＴ　Δ＾八
　ＧＡＧ　　ＴＡＣＡＣＡ　ＴＴＴ　　ＣＣ八　＾ＴＴ
ＡＣＣＴＴＧ　　ＴＣＴ　　ＴＣＧ　　＾　３’　（４
３ｍｅｒ）３°　＾ＧＴ　　ＴＴＡ　丁ＴＡ　　ＴＴＴ
　　ＣＴＣＡＴＧ　　ＴＧＴ　　＾＾＾　ＧＧＴ　　Ｔ
ＡＴＴＧＧ　　＾＾ＣＡＣＡ　八ＧＣＴＴＣＧ八（４７
ｍｅｒ）−Ｖｌ’ｌ　ＩＩＡＶノ領域９９〜１０６ポリ
オウイルスのＶＰＩの＾ｓｐ残基（９３）−Ａｓｎ残基
（９４）とＬｙｓ残基（１０３）とによって囲まれた配
列Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　八ｓｎ　
　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ−ＶＦ６　　ＨＡＶの　
１ｊ、′６７〜７６（ｖ　５６４　；　ｐ　Ａ　Ｍ　５
　）ポリオウィルスのＶＰＩのへｓｐ残基（９３）とＬ
ｙｓ残基（１０３）とによって囲まれた配列 へｓｎ　　八ｌａ　　Ｓｅｒ　　八ｓｐ　　Ｓｅｒ　　
Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ２゛
、Ｂ型肝炎ウィルスの中相免疫原性ペプチドをコードす
るＢ型肝炎ウィルスの特性配列。これらのペプチドは以
下の領域に対応する。
−７をコード・るう１　　のＬ　１２０〜１４５（平均
３３〜３６ＫＤのタンパクのＮ末端領域）５°　Ｍｅｔ
　　Ｇｌｎ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ
　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　ｌ１ｉｓ　　Ｇ１ｎＴｈｒ　
　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　
Ｖａｔ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　ＴｙｒＬｅ
ｕ　Ｉ’ｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　３’１肛、　
Ａ、Ｒ，ＮＥＵＲＡＴＩＩ、Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、ＫＥＮＴ、
　Ｎ、ＳＴＩ’ｔｌＣＫ（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、
　２２４．３９２〜３９４゜−ｒｅ−３の領１，１２〜
３２ １２２゜ ５’　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　八ｓｎ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　八ｓｎ　　Ｐ
ｒ。
Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｐｂｅ　　Ｐｒｏ　　
Ａｓｐ　　ｌ１ｉｓ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　八ｓｐ　
　Ｐｒｏ　　３’！ｆｆｆ、　Ａ、Ｒ，ＮＥＵＲＡＴＩ
ｌ、Ｓ、Ｂ、Ｉｌ、ＫＥＮＴ、　Ｎ、ＳＴＲ［ＣＫ、　
Ｐ。
ＴＡＹＬＯＲ，Ｃ，Ｅ、５ＴＥＶＥＮＳ、Ｎａｔｕｒｅ
　３１５．１５４〜１５６（１９８５）。
−針叫ル或■壌二士ド ５’　　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｔ
ｈｒ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　３’
づρＬｑ、ｅ＋＋ΔＴＮＡＧΔＲ”Ｓ”（１９８２）、
　ＰＮＡＳ　　７９、４４００〜４４０４゜Ｔ１１ΔＮ
八ＶΔＬΔ等（１９８６）、　Ｊ正Ｘｐ、Ｍｅｄ、１６
４、２２７〜２３６゜３、単純ヘルペス１型ウイルスの
免疫原性ペプチドをコードする配列、特に以下の領域に
対応する配列。
一友九ｌム乙ハム眩１ｕ［ヱ旦（ＦｉＤｌの前記配列の
残基３３〜４８） ５’　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ’Ｍｅｔ　　Ａｌ
ａ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　八ｓｎ　　Ａｒｇ　Ｐｌ＋
ｅ八ｒｇ　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　
Ｐｒｏ　　３゜１＝＝ａ、　Ｃ０１１ＥＮ等（１９８４
）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４９．１０２．１０８゜−゛タン
パ　ＤのＩＩｊ！３４０〜３５ｉ（前記配列の残基３６
５〜３８１） ５’　　ｔｌｉｓ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　
八ｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　
Ａｒｇｒｌｅ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ｌ１
ｉｓ　　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　３’１肛、　Ｅｒ５ＥＮＩ
ＩＥＲＧ等（１９８５）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５３．６３
４〜６４４゜Ｒ，Ｊ、−ＡＴＳＯＮ、Ｊ、１１．−ＥＩ
Ｓ、Ｊ、Ｓ、ＳＡＬＳＴＲＯＭ、Ｌ、Ｗ、ＥＮＱＵＩＳ
Ｔ（１９８２）、５ｃｉｅｎｃｅ　２１８−１３８１〜
３８４゜４、マラリア病原体１」且凹Ｊ頂す−ｂユ且ｉ
１ち」−ノｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅの免疫支
配（ｉｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔｅ）表面抗原、特にタ
ンパクＣＳ（タンパクの中央部にテ）・ラペプチドの反
復配列４１個を含む４１２のアミノ酸から成るｃｉｒｃ
ｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅのタンパク）に存在する抗原
決定基本単位をコードする配列。使用可能な抗原決定基
本単位は、複数例えば４つのテ１〜ラベプチドーＰｒｏ
　Ａｓｎ＾Ｉａ　Ａｓｎ−反復配列から成る。
１肛、ｖ、ＥＮＥΔ等（１９８４）、５ｃｉｅｎｃｅ　
２２５．６２８〜６３０゜Ｊ、Ｂ、ＤＡＭＥ等（１９８
５）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８５、Ｃ（＋Ｉｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇｔｌａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（７〜１
１）。
タンパク！Ｉｌｌ！に　する剥ｒ、、　Ｊ、Ｉｌ、ＤＡ
ＨＥ等（１９８４）、５ｃｉｅｎｃｅ　　２２５．５９
３−５９９゜５、ヘマグルチニンの残基１３８〜１６４
を含むインフルエンザのウィルスエピト−プ １、−［１’ｆｆ、　　Ｍ、５ＨＡＰｒＲＡ、　Ｊ、Ｊ
ｉＢＳＯＮ、　　Ｇ、ＭＵＬＬＥＲ，Ｒ，八ＲＮＯＮ（
１９８４）、　ＰＮＡＳ　　８１、２＝１．６１〜２４
６５゜６．１ＩＩＶＩ及ヒ１ｌｒＶ２のエンベロープ糖
タンパクの特性エピＩ・−プ、例えばＩｌｏ　ｌ　ｏｇ
ｎｅｓ　ｉ及びＰｕｔｎｅｙのグループによって定義さ
れたエピトープ（タイプ特異性エピトープ）及びＩｌｏ
と共同研究者のグループによって定義されたエピトープ
（グループ特異性エピトープ）またはＭａＬｓｕｌ＋ｉ
ｔｏ等、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　、１９８８、蛙、２１０７〜
２１１４によって定義されたエピト−１のようなビｐ１
２０に局在する血清中和（ｓｅｒｏｎｅｕｔｒａ−中で
同定されたような広い特異性をもつ中和エピトープ、　
ｇｐ４１は更に、細胞膜とウィルスエンベロープとの融
合に必要な疎水性配列をもつ（Ｒｏｂｉｎ阿ｅｉｓｓ＞
。
特に、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ−Ｐｕｔｎｅｙのエピトープ
（Ｐｕｔｎｅｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６．２３４
−１１３９２〜１３９５）　（従来はＦｌ＋）１２０の
アミノ酸３０１〜３３６から構成されたループの形態で
記載されている） を使用するか、または、変異種Ｉ［［Ｂ型（ＬＡＶ−１
）に特異的な中和抗体を誘発するに十分な配列ＮＴＲＫ
ＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲ に対応するループの一部を使用するか、または変異種Ｒ
Ｆを中和する抗体を誘発し得る配列ＫＧＰＧＲＶＩ を使用し得る。
また、アフリカ、ヨーロッパ及びアメリカのすべての被
検変異種を（種々の割合で）中和する抗体を誘発するｇ
ｐ１２０の第２のエピト−プ（Ｈｏ等、１９８８．５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２３９．１０２１）のアミノ酸配列２５４
〜２７１）ＣＴＨＧ　ＩＲＰＶＶＳＴＱＬＬＬＮＧＳを
使用してもよく、またはこのエビＩ・−プの一部Ｇ　　
ＩＲＰＶＶＳ　　丁　ＱＬ を使用してもよい。これらの工と１・−ブは、広い中和
スペクトルを゛もつ抗体を誘発し得るのでワクチンに含
まれることが特に重要である。
使用可能な別のエピトープとしては、アミノ酸７３５〜
７５２、即ち ＧＩＥＥＥＧにＥＲＤＲＤＲＳＩＲＬＶＮＧに対応する
ｇｐ４１のエピトープ、またはレセプターＣＤ４　（ア
ミノ酸４０４〜４２５）、即ちＩＫＱＩＩＮＭｉＫＶＧ
ＫＡＭＹＡＰＩ’１ＳＧの認識に関与すると考えられる
エピトープ（ＬＡＳＫＹ等）がある。
７、ロタウィルスに対する防御作用をもつポリペプチド
穎ＶＩ’３及びＶＦ６のエピトープ。
例えばＭａｃｋｏｕ＋５Ｈａｒｒｙ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒ
ｇ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。
＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、１９８８、阻、６４５〜６４９）
によって最近同定されたエピトープ、特にＶＦ６によっ
て担持されたアミノ酸８７〜８９の配列、 ＬＬＡＰＴ八ＡＧＶへＶＥＧＴ １４８〜１５０の配列、 Ｄ　Ｖ　Ｖ　Ｋ　Ｔ　Ｔ　ＬルエＳ　Ｙ　Ｓ　Ｑ　Ｙ　
Ｇ　Ｐ及び３８８〜３９３の配列、 ＧＤＹＳＦ八ＬＰＶへＯＷＰ のエピトープがある。
上記の最後のエピトープは、該エピトープに対応する中
和抗体がロタウィルスの複数の血清型と大きい交差反応
性を示すので特に重要である。
Ｖｌ’７に存在するその他の中和エピトープ、特に、ア
ミノ酸８７〜１０１及び２０８〜２２１の領域（Ｔａｎ
ｉｇｕｃｈｉ、Ｃｈａｎｎｏｃｋ等、Ｖｉｒｏｌ、、１
９８８、蛙、１８７０〜１８７４）と一致するエピトー
プ、特に配列、 ＴＥＡＳＴＱＩＮＤＧＤＷＫＤＳＬＳＱ及び ＧＣＱＴＴＮＶＤＳＦＥＭＶＡＥＮ をもつエピトープの使用も可能である。
８、狂犬病ウィルスの糖タンパクのエピトープ９、コレ
ラの抗原のエピトープ（フランス特許第８３．１３８２
８号、第２５５１０８８号として公開）、等。
勿論、弱毒ピコルナウィルス（例えば５ＡＢＩＮ株）を
キャリアベクターとして使用してワクチン好ましくは生
ワクチン分産生するために、その池の任意のエピトープ
の使用が可能である。これらのワクチンは、選択エピト
ープ及び選択ベクターの１類に基づいてヒｌ−または動
物の免疫に使用される。
また、ベクターとして使用されるピコルナウィルスがビ
ルレン１へウィルスでもよくその場合には得られた組換
え体を利用して不活１ヒワクチンを製造できることも当
業者には容易に理解されよう。最後に、選択ワクチンの
投与量及び投与方法は対象哺乳動物に従って臨床医が決
定する。
本文中で引用した研究者の著作を参考文献目録として明
細書の末尾に添付する。
また最後に、本発明がエピＩ・−プＣ３（ＮＩＭＩ部位
）ニ限定すレナイコト、ＮＩＭ■（ＶＦ２）及び旧Ｈ１
［（ＶＦ６）部位でも同様の構築が可能であることも勿
論理解されよう。特に、ベクターピコルナウィルス（例
えばポリオウィルス１型）の２つまたは３つ、即ち最高
で３つの中和部位を別のピコルナウィルス（例えばＨへ
Ｖ）に由来の対応する２つまたは３つの中和部位で置換
することが可能である。
前記のごとき置換の場合、例えばポリオウィルスのキャ
プシドをライノウィルスのキャプシドで置換するかまた
はその逆の置換を行なう場合に、この置換キャプシド自
体が、該キャプシドに外来の外東工とＩ・−１によって
局部的に置換されていてもよく、この局部的な置換は、
出発ピコルナウィルス中で該キャプシドの表面に存在し
ていたキャプシドの天然エピト−プによって行なわれて
もよいことも勿論理解されよう。
最後に、本明■Ｄて使用した「エピトープ」なる用語は
、限定的に解釈されてはならない。特に「エピト−プＪ
なる用語は、該エピトープを提供した抗原に対する中和
抗体をｉｎ　ｖｉｖｏ産生する能力を与えるアミノ酸配
列だけに限定されない。エピＩ・−プなる用語は、該エ
ピトープを提供した抗原中で、（限定された意味の）エ
ピトープを通常は包囲している多少とも短いアミノ酸配
列を任意に包含すると理解されない。ピコルナウィルス
の場合には、これらの配列自体が、置換抗原を提供した
ピコルナウィルスのキャプシドタンパク全体を含むこと
も可能である。
また、野性株（Ｈａｈｏｎｅｙ）のｃＤＮ眞こおいて行
なわれた置換をＳａｂｉｎ株のｃＤＮＡに移すことも可
能である。従って、本発明は、経口投与できるキメラ生
ワクチンを製造し得る。これは、へ型肝炎及びロタウィ
ルス性下痢に対するワクチンの製造のために特に好まし
い。置換プラスミド、ＡＭ５のフラグメントをＳａｂｉ
ｎ　ｃＤＮＡ中で直接サブクローニングできるので′こ
の手当にも対応できる。
また、本文中で記載した処理はすべて■型Ｓａｂｉｎ株
に由来のｃＤＮＡに同様に応用でき、例えばこのｃＤＮ
Ａ中で、Ｍ　ａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ　ｙ株のタンパクＶＰ
ＩのエピトープＣ３に実質的に対応するペプチドをコー
ドする内在配列を、選択外来エピトープのコード配列を
含むオリゴヌクレオチドで置換するとよい。例えば、Ｈ
ｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　ｌ１ｉｓ八ｒ
ｇ　　Ｓｅｒ　　八ｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｓｅｒ　　ｌｉｅ　　Ｇｌｕ　　５ｅｒＰｈｅ　
　Ｐｌ＋ｅ　　八ｌａ　　Δｒｇ　　［：Ｉｙ　　八ｌ
ａ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｔ　　ΔＩａ　　１ｉｅ１１ｅ　
　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　
　ΔＩａ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　ＴｈｒＡｓｎｌ、ｙ
ｓ　　八ｓｐ　　Ｌｙｓ　　［、ｅｕ　　Ｎ１ｅ　　Ｔ
ｉｅｒである。
「参考文獣目録」 ＢＩｒｎｔ＋ｏ１ｍ、Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｊ、
　（１９７９）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７
．１５１３−１５：）２Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，Ｗ、　ａｎｄ
　Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｌｓ、Ｄ、　（１％９
）Ｊ、Ｍｏ１．ＢＩｏｌ、、　４１．４５９−４７２Ｅ
ｍｌｎｌ、Ｅ人、　Ｈｕ（ＬＩＥＳ、Ｊ、Ｖ、、ρｅｒ
ｌｏｗ、Ｄ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｂｏｇｅｒ、Ｊ、　（！９
８５）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　５５゜８３６−８’：Ｊ
９ Ｇｏ（ＩＳＯｎ、Ｇ、Ｎ、ａｎｄＶａｅｐｎｅｋＤ、（
１９７３）ＢＩｏｃｈｌｍ、ＢＩｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ
、　２９９，５１６−５２０Ｇｒｕｎｓｔｅｌｎ、Ｍ、
　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅ、Ｉｓ、Ｄ、Ｓ、　（１９７５）
ρｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃ１．ＵｓＡ、　７２
゜Ｈｏｇｌｅ、ＪＭ、Ｃｈｏｗ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｌｌ
ｍａｎ、ＤＪ、　（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２
９．１３５８−１３６５Ｋａｐｌａｎ、Ｇ、、　　　Ｌ
ｕｂｌｎｓｋｌ、Ｊ、、　　Ｄａｓｇｕｐｔａ、入　　
ａｎｄ　　Ｒａｃａｎｌｅｌｌｏ、Ｖ、Ｒ，（１９８５
）ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、　
８２．８４２４−８４２８Ｋｅａｎ、Ｋｊｌ、、　Ｗｙ
ｃｈｏｗｓｋｌ、Ｃ，、Ｋｏｐｅｃｋａ、Ｈ，、ａｎｄ
　Ｇｌｒａｒｄ、Ｍ、　（１９８６１Ｊ、ＶＩｒｏｌ、
、　５９゜Ｋｌｔａｍｕｒａ、Ｎ、、　Ｓｅｍ１ｅｒ、
Ｂ、Ｌ、、　Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、Ｐ、Ｇ、、　Ｌａｒｓ
ｅｎ、　Ｇ、Ｒ，、Ａｄｌｅｒ、ＣＪ、、　Ｄｏｒｎｅ
ｒ、入Ｊｌεｍ１ｎｌ、Ｅ人、　　Ｈａｎｅｃａｋ、Ｒ
，、Ｌｅｅ、Ｊ、Ｊ、　　ｖａｎ　　ｄｅｒ　　Ｗｅｒ
らＳ、　　、　　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃ，Ｗ、　　ａｎ
ｄＷｌｍｍｅｒ、Ｅ、　（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ、　
２９１．５４７−５５３Ｌａｅｍｍｌ　ｌ、Ｕ、Ｋ　（
１９７０）Ｎａｔｕｒｅ、　６８０−６８５Ｍａｎｌａ
ｔｌｓ、Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、　Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ、Ｊ、　（＋９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｌｎｇ　、　　＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙρｒｅｓｓ、　Ｎ、ＹＭｃＣｕｔ
ｃｈａｎ、　ＪＭ　ａｎｄ　Ｐａｇａｎｏ、Ｊ、Ｓ、（
１９６１３）Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、
、　４１．３５１−３５６Ｍｏｒｌｎａｇａ、Ｙ、、　
　Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｌ、Ｔ、、　　１ｎｏｕｙｅ
、Ｓ、　　ａｎｄ　　Ｉｎｏｕｙｅ、Ｍ、　　＋１９８
４＞Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６３６−６３９Ｒａ
ｃａｎｌｅｌｌｏ、Ｖ、ｌ１１．　ａｎｄ　　８ａｌｔ
１ｍｏｒｅ、Ｄ、　（＋９８１）ρｒｏｃ、Ｎａｔ１．
Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、　７８゜ＲＯ５Ｓｍａｎｎ
、Ｍ＾、　Ａｎｒｏｌｄ、Ｅ、、　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、
Ｊ、Ｗ、、　Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅ人、　Ｇ
ｒｌｔｈ、Ｊ、Ｐ、。
Ｈｅｃｈｔ、Ｈ，Ｊ、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ、Ｅ、、
にａｌＴｌｅｒ、　Ｇ、、　Ｌｕｏ、Ｍ、、　Ｍｏ５ｓ
ｅｒ、　Ａ、Ｇ、、　ＲｕｅＣｋｅｒｔ、ｆｌｌ、Ｒ，
。
５ｈｅｒｒｙ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｖｒｌｅｎｄ：Ｇ、　（
１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７，１４５−ｌ４５
−１５３Ｓｅ、Ｂ、Ｌ、、　　Ｄｏｒｎｅｒ、入Ｊ、、
　　ａｎｄ　　Ｗｌｍｍｅｒ、Ｅ、　　（１９８４）　
　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　１２゜Ｓｏ
ｂｅｒｏｎ、Ｘ、、　Ｃｏｖａｒｒｕｂｌａｓ、Ｌ、　
ａｎｄ　Ｂｏｌｌｖａｒ、Ｆバ１９８０）　Ｇｅｎｅ、
９，２８７−３０５Ｓｏｍｐａｙｒａｃ、ＬＭ　ａｎｄ
　Ｄａｎｎａ、Ｋ　（１９８１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｌ；ＵＳＡ、７８．７５７５−７５７８
ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、　Ｂｒｅ９Ｉ！％ｒ
ｅ、Ｆ、、　Ｋｏｐｅｃｋａ、Ｈ，、にＩｔａｍｕｒａ
、Ｎ、、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ、Ｐ、Ｇ、。
Ｋｏｕｒｌｌｓｋｙ、Ｐ、、　Ｗｌｍｍｅｒ、Ｅ、　ａ
ｎｄ　Ｇｌｒａｒｄ、Ｍ、　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、５ｃ１．Ｕｓ＾、７８゜ｖａｎ　
　ｄｅｒ　　Ｗｅｒｆ、Ｓ、、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｊ、Ｗ
ｌｍｍｅｒ、Ｅ、、５ｔｕｄｌｅｒ、Ｆ、Ｗ、、ａｎｄ
　　Ｄｕｎｎ、Ｊ、Ｊ、（１９８６）ρｒｏｃ、Ｎａｔ
１．Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ、　８３．２］３Ｏ−２
３３４Ｗｌｅｓｌａｎｄｅｒ、Ｌバ１９７９）　Ａｎａ
＋、８１ｏｃｈｅｍ、、　９８．３０５−３０９Ｗｙｃ
ｈｏｗｓｋｌ、Ｃ，、ｖａｎ　　ｃｌｅｒ　　Ｗｅｒｆ
、Ｓ、、　　５ｌｆｆｅｒｔ、Ｏ，、Ｃｒａｌｎｌｃ、
Ｒ，、Ｂｒｕｎｅａｕ、Ｐ、、　　ａｎｄＧｌｒａｒｄ
、Ｈ（１９８３）　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、　２．２０
１９−２０２４Ｚａｇｕｒｓｋｙ、ＲＡＪ、、　Ｂａｕ
ｍｅｌｓｔｅｒ、に、　Ｌｏｍａｘ、Ｎ、、　ａｎｄ　
Ｂｅｒｍａｎ、Ｍ、Ｌ、　（１９８５）　ＧｅｎｅＡｎ
ａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｌｑｕｅｓ、　２．８９−９
４（以下余白）
【図面の簡単な説明】 添付の図面はすべて本発明の組換えハイブリッド１）Ｈ
Ａの構築方法を説明する図である。 手彰Ｖネ市正７！）（方式） 昭和６３年１２月ｚＺ日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ２、発明の名称　ピコルナウィルス特にポリオウィルス
のタンパクに特性エピトープが組み込まれたワクチン３
、補正をする名 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　　アンステイテユ・バストウール４、代　
理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田
ビル５、補正指令の日付　昭和６３年１１月２日８、補
正の内容 （１）　　明細書中、第３２〜３４頁、第３９頁及び第
４１〜４３頁を、鮮明に浄占した別紙と差し換える。（
内容に変更なし）。 ■　明細書中、第６９頁「図面の簡単な説明」の欄に「
添付の図面はすべて・・・・・・説明する図である。」
とあるを、「添付の第１ａ図〜第１Ｃ図、第２ａ図〜第
２Ｃ図、第３ａ図〜第３Ｃ図、第４ａ図〜第４ｄ図及び
第５ａ図〜第５ｄ図は、本発明の組換えハイブリッドＤ
ＮＡの構築方法を説明する図である。」と補正する。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ピコルナウイルスのタンパクに対して外来の免疫
    タンパクまたはタンパク鎖の特性エピトープまたはタン
    パク鎖を、ピコルナウイルス本来の免疫原性エピトープ
    またはタンパク鎖の１つに置換して含むことを特徴とす
    る生きたハイブリッドピコルナウイルス。
  2. （２）外来エピトープがピコルナウイルスのキャプシド
    の表面に露出していることを特徴とする請求項１に記載
    のピコルナウイルス。
  3. （３）ヒトポリオウイルスから形成されていることを特
    徴とする請求項１または２に記載のピコルナウイルス。
  4. （４）ポリオウイルス１型から成り、通常は該ポリオウ
    イルスのキャプシドの表面に露出したエピトープＣ３に
    外来エピトープが置換していることを特徴とする請求項
    ３に記載のピコルナウイルス。
  5. （５）ライノウイルスまたはアフトウイルスから成るこ
    とを特徴とする請求項１または２に記載のピコルナウイ
    ルス。
  6. （６）外来エピトープが、結合アミノ酸残基またはペプ
    チドの非存在下で該外来エピトープを組み込んだウィル
    スタンパクに含まれるアミノ酸配列に直接隣接すること
    を特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のピコル
    ナウイルス。
  7. （７）１つ以上の外来エピトープで置換された１つ以上
    の免疫原性エピトープ以外の、対応する天然ピコルナウ
    イルスの通常は露出したエピトープ全部が、天然ピコル
    ナウイルスから産生されるかまたは該天然ピコルナウイ
    ルスに由来のタンパクによって産生され該エピトープの
    各々に対応する特異的抗体によって認識されることを特
    徴とする請求項１から６のいずれかに記載のピコルナウ
    イルス。
  8. （８）ゲノムのレプリコン（ｌａ　ｒ■ｐｌｉｑｕｅ）
    を構成するｃＤＮＡにおいて、外来免疫原性エピトープ
    をコードする配列と該配列を包囲する配列との間の接合
    が、ＤＮＡレプリコンが除去された制限部位の周囲で行
    なわれることを特徴とする請求項１から７のいずれかに
    記載のピコルナウイルス。
  9. （９）外来エピトープがＡ型肝炎ウィルスのタンパクの
    免疫原作エピトープであることを特徴とする請求項１か
    ら８のいずれかに記載のピコルナウイルス。
  10. （１０）外来エピトープがＨＩＶのエンベロープ糖タン
    パクまたはトランスメンブラン糖タンパクの免疫原作エ
    ピトープであることを特徴とする請求項１から８のいず
    れかに記載のピコルナウイルス。
  11. （１１）外来エピトープがロタウイルスタンパクの免疫
    原作エピトープであることを特徴とする請求項１から８
    のいずれかに記載のピコルナウイルス。
  12. （１２）別のピコルナウイルスに所属する外来タンパク
    鎖を置換タンパク鎖として含むことを特徴とする請求項
    １に記載のピコルナウイルス。
  13. （１３）外来タンパク鎖が別のピコルナウイルスのタン
    パクＶＰ０、ＶＰ３及びＶＰ１の配列を含むことを特徴
    とする請求項１２に記載のピコルナウイルス。
  14. （１４）ヒトポリオウイルスから成り、外来タンパクＶ
    Ｐ０、ＶＰ３及びＶＰ１の配列がライノウイルスまたは
    ヒトＨＡＶに由来することを特徴とする請求項１３に記
    載のピコルナウイルス。
  15. （１５）ヒトポリオウイルス１型Ｍａｈｏｎｅｙから成
    り、外来タンパクＶＰ０、ＶＰ３及びＶＰ１の配列がポ
    リオウイルス１型Ｓａｂｉｎに由来することを特徴とす
    る請求項１２に記載のピコルナウイルス。
  16. （１６）ピコルナウイルスのゲノムの全部、または少な
    くとも非形質転換ピコルナウイルスの培養が可能なコン
    ピテント細胞培養物中での生存ウィルスの産生に必要な
    前記ピコルナウイルスのゲノムの部分と、別のエピトー
    プをコードする任意に合成の外来ヌクレオチド配列とを
    含み、ｃＤＮＡ中で免疫原性アミノ酸配列をコードする
    天然内在ＤＮＡ配列に前記外来配列が置換していること
    を特徴とする組換えハイブリッドｃＤＮＡ。
  17. （１７）外来免疫原性配列が、非変性ピコルナウイルス
    中で該ピコルナウイルスのキャプシドの表面に露出する
    アミノ酸配列を周囲配列の性質に基づいてコードしてい
    た内在配列に置換していることを特徴とする請求項１６
    に記載のハイブリッドｃＤＮＡ。
  18. （１８）請求項１６または１７のハイブリッドｃＤＮＡ
    を含む組換えＤＮＡ、特にプラスミドであり、前記ｃＤ
    ＮＡハイブリッドがプロモータ及び調節エレメントのコ
    ントロール下に構築によって組み込まれ、前記調節エレ
    メントは、非変性ピコルナウイルスの産生に使用される
    真核生物中で前記組換えＤＮＡによる形質転換後に該当
    組換えピコルナウイルスの自律複製を生起するか、また
    はｃＤＮＡを感染性ハイブリッドＲＮＡに細胞転写させ
    得ることを特徴とする組換えＤＮＡ特にプラスミド。
  19. （１９）ポリオウイルス、ライノウイルスまたはアフト
    ウイルスに由来することを特徴とする請求項１８に記載
    の組換えＤＮＡ。
  20. （２０）ポリオウイルス１型に由来し配列Ｃ３に置換し
    た外来配列を含むことを特徴とする請求項１８に記載の
    組換えＤＮＡ。
  21. （２１）ピコルナウイルスのタンパクに対して外来の免
    疫タンパクの特性エピトープを該ピコルナウイルス本来
    の免疫原作エピトープの１つに置換して含む生きたハイ
    ブリッドピコルナウイルスから成る活性成分を含み、前
    記ピコルナウイルスが請求項１から１５のいずれかのピ
    コルナウイルスであり、前記免疫タンパクが所定病原体
    に由来の疾患を防御することを特徴とする所定病原体に
    対して有効なワクチン。
  22. （２２）ウィルスＲＮＡに由来のｃＤＮＡを出発材料と
    し、対応するピコルナウイルスの天然免疫原性エピトー
    プまたはタンパク鎖の所在を予め検出した後に、該ｃＤ
    ＮＡにおいて、置換されるべき天然免疫原性配列の処々
    に特異的制限部位（該特異的制限部位が存在しない場合
    に限って）を導入し、対応する制限酵素によってこれら
    の特異的制限部位の処でｃＤＮＡを開裂し、ウィルスＲ
    ＮＡ全部または天然エピトープをコードする配列とそれ
    まで結合していたウィルスの最終複製に必要なｃＤＮＡ
    と、天然エピトープまたは鎖をコードする配列に置換す
    べき免疫原性エピトープまたはタンパク鎖をコードする
    配列との全部のエレメントから組換えハイブリッドｃＤ
    ＮＡを復元し、前記組換えＤＮＡを感受性細胞培養物に
    トランスフェクトし、最後に対応する組換えピコルナウ
    イルスを回収することを特徴とする請求項１から１６の
    いずれかに記載のハイブリッドピコルナウイルスの製造
    方法。
  23. （２３）請求項１から１５のいずれかに記載のハイブリ
    ッドピコルナウイルスのＲＮＡ。
  24. （２４）請求項２３のＲＮＡの逆転写によって得られた
    ｃＤＮＡ。
  25. （２５）ポリオウイルス１型ＭａｈｏｎｅｙまたはＳａ
    ｂｉｎから形成されることを特徴とする請求項１または
    ２に記載のピコルナウイルス。
JP63197810A 1987-08-07 1988-08-08 ピコルナウイルス特にポリオウイルスのタンパクに特性エピトープが組み込まれたワクチン Pending JPH01157380A (ja)

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