JPH01174505A - 複合化分離剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、複合化分離剤の製造方法に関するものであり
詳しくは、蛋白質、酵素、杭先物質等の生体関連の比較
的高分子量の物質を分離、精製するに好適な複合化分離
剤の製造方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、生体関連物質を分離、精製する分離剤としては、
デキストランやアガロース等の多糖類を素材とする分離
剤が知られている。これらの分離剤は、親水性に富んで
いる為、特に蛋白質との非特異的吸着が少ないという特
徴がある。

又水中における膨潤度が１０−４４０ゴ／ｆ−ｄｒｙで
あり、且つ巨大網目構造を持ち、優れた分離能を有して
いる。特にゲルテ過クロマトグラフィー用として好適な
分離剤と言うことができる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし、これらの分離剤は、優れた分離能を有する反面
、軟質であるため、機械的強度が弱く、高層高、高流速
処理が必要な工業的スケールでは、圧密化の為に通液が
不可能になる場合が多いという問題を有している。

本発明は、巨大網目構造を有する多糖類系分離剤の優れ
た分離能を維持しつつ、上記の分離剤の問題点である機
械的強度を改善した、新規な複合化分離剤の製造方法を
提供することを目的とする。

そこで、上記分離剤の機械的強度を改善するため複合化
分離剤に関して検討した結果、架橋度カ≠〜１０モルチ
で、マクロポアー−造を有するポリビニルアルコール基
体中に包含することにより、本目的に合致する複合化分
離剤が得られることを見出し本発明を完成した。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち、本発明は巨大網目構造を有する親水性ポリマ
ーからなる分離剤を膨潤させた状態で、ポリビニルアル
コール及び塩類の水溶液と共に有機溶媒からなる分散浴
中に分散造球させ、前記分離剤および塩水溶液を包含し
たポリビニルアルコール粒子を得、次いで該ポリビニル
アルコ−２粒子を自然ゲル化させたのち架橋剤と反応さ
せることを特徴とする複合化分離剤の製造方法を要旨と
するものである。

本発明の複合化分離剤は、粒径が２Ｑ〜７０００μで、
マクロポア−を有する架橋ポリビニルアルコール粒子中
に、粒径５−ｚｏｏμの多糖類系分離剤を≠０−１０％
（容積比）包含したものである。

複合化分離剤は、多糖類系分離剤を膨潤させた状態でポ
リビニルアルコール水溶液と共に分散浴中に分散、造球
することにより、多糖類系分離剤を包含し、そののち、
ポリビニルアルコール水溶液の自然ゲル化現象を利用し
て造球、不溶化したのち架橋反応を行なうことにより製
造できる。

架橋ポリビニルアルコール基体のマクロポアは、包含し
た多糖類系分離剤の巨大網目構造のポアーよりも大きく
蛋白質、酵素等の生体高分子が自由に出入できるような
ものが好ましい。

このマクロポアはポリビニルアルコール水溶液の自然ゲ
ル化現象を利用することにより形成することが可能であ
る。

ここで言う自然ゲル化現象とは、ポリビニルアルコール
水溶液が、架橋剤を用いることなく、不溶化することで
ある。

ポリビニルアルコール水溶液は放置すると、経時的に粘
度が上昇し、ついにはゲル化することが古くから知られ
ている。

この現象は、ポリビニルアルコール分子間の水素結合に
より生起すると考えられており、ポリビニルアルコール
水溶液の濃度が高い程又放置温度が低い程、早くゲル化
がおこる。自然ゲル化現象を利用し製造することにより
マクロポアを有する原因は明らかではないが、おそらく
、自然ゲル化現象に伴ない、ポリビニルアルコールが反
応媒体中から析出し、相分離することにより、不均一構
造をとり、多孔質化されるものと考えられる。

本発明は、架橋度がよ〜１０モルチで、マクロポア構造
を有するポリビニルアルコール基体中に、多糖類系分離
剤を包含させた複合化分離剤の製造方法に関するもので
あり、複合化分離剤の製造方法は、多糖類系分離剤を膨
潤させた状態でポリビニルアルコール及び塩類の水溶液
と共に有機溶媒からなる分散浴中に分散、造球させて、
前記分離剤および塩水溶液を包含したポリビニルアルコ
ール粒子を得、次いて該ポリビニルアルコール粒子を自
然ゲル化させたのち架橋剤と反応させることを特徴とす
るものである。包含する分離剤としては、巨大網目構造
を有する架橋デキストラン、アガロース、架橋アガロー
ス等の多糖類系、アクリルアミドとＮ、Ｎメチレンビス
アクリルアミドを共重合させたポリアクリルアミド系等
が用いられる。

前記の分離剤は、乾燥粉末状であることから、水にて膨
潤させた状態でポリビニルアルコール及び塩類の水溶液
に添加する。

又、塩類を添加したポリビニルアルコール水溶液中に添
加し膨潤することもできる。

前記分離剤を水にて膨潤させるためには、各分離剤の膨
潤度で異なるが、室温で３〜７２時間、沸騰水浴で／−
７時間必要である。

多糖類系分離剤のポリビニルアルコール基体中への包含
は、分離剤を膨潤した状態で塩類を添加したポリビニル
アルコール水溶液と共に、有機溶媒からなる分散浴中に
分散、造球させることにより包含させることができる。

ポリビニルアルコールとしては重合度数十〜数十、好ま
しくは２００−２０００で、ケン化度りＱモルチ以上、
好ましくはり！そルチ以上のものが用いられる。ポリビ
ニルアルコールは２〜３０％、好ましくは！〜ｌｊ％と
なるように水に溶解して自然ゲル化を行なう。しかしポ
リビニルアルコール水溶液だけでは自然ゲル化に長時間
を要することから自然ゲル化を促進するためにポリビニ
ルアルコール水溶液に塩を添加する。塩としては塩化ナ
トリウム、硫酸ナトリウム等のポリビニルアルコールを
沈殿凝析する効果があるものを用いればよい。

その使用量は塩の種類等により異なるが、通常、３％以
上、ポリビニルアルコールが析出しない範囲内の濃度で
添加される。

特に塩化ナトリウムの添加量に関しては、ポリビニルア
ルコールの重合度、ケン化度、及び濃度により異なるが
、たとえば、重合度２００１ケン化度りｔ％以上のポリ
ビニルアルコール７０％水溶液を用いる場合には、／−
／コチ（好ましくは３〜１０％）、７％ポリビニルアル
コール水溶液を用いる場合には、／−７７％（好ましく
はよ一／３％）の量で添加される。

さらに、塩を添加したポリビニルアルコール水溶液に水
酸化ナトリウム等のアルカリを添加することにより、自
然ゲル化をより促進することもできる。

自然ゲル化は塩を添加したポリビニルアルコー−ル水溶
液および膨潤させた多糖類系分離剤と共に有機溶媒中に
て分散造球後行なう。

有機溶剤としては、通常、トルエン、ベンゼン、クロル
ベンゼン、ジクロルベンゼン等の芳香族炭化水素および
そのハロゲン誘導体、ｎ　−へブタン、ｎ−ヘキサン、
流動パラフィン、シクロヘキサン、ジクロルメタン、ジ
クロルエタン等の脂肪族炭化水素、脂肪族炭化水素およ
びそのハロゲン誘導体などが用いられる。これらの有機
溶剤は通常は単独で用いられるが、２種以上を混合して
用いても差支えない。

有機溶剤の使用量はポリビニルアルコール水溶液の２（
容量）倍以上、好ましくは２〜６（容量）倍である。ま
た有機溶剤中には分散安定剤トシテ、エチルセルロース
、セルロースアセテートブチレート、エチルヒドロキシ
エチルセルロース等の油溶性セルロース、アラビアゴム
、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタンモノオレエ
ート、ソルビタンモノステアレート等の油溶性分散安定
剤を添加するのが好ましい。

その量は有機溶剤に対して通常０．０ｒ−１０％、好ま
しくは０．／　−１％である。

自然ゲル化は分散造粒後、０−１０℃、好ましくは３〜
３０℃で、２〜２００時間、好ましくは５−ｉｏｏ時間
行なう。

自然ゲル化後、架橋反応を行なう。

架橋剤としては、グリオキザール、グルタルアルデヒド
、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物；　／
、２，３．≠−ジェポキシブタン等のジェポキシ化合物
；エチレングリコールジグリシジルエーテル、／、弘−
ブタンジオールジグリシシルエーテル等のグリシジルエ
ーテル化合物；エピクロルヒドリン、エビブロモヒドリ
ン等のエピハロヒドリン化合物などポリビニルアルコー
ル間に２個以上の炭素原子を有する架橋部分を形成し得
るものが用いられる。好適には、アセタール化架橋が形
成されるジアルデヒド化合物が用いられる。架橋剤は、
ポリビニルアルコールの全水酸基に対し通常１モルチ以
上用いる。

架橋反応は自然ゲル化後、上記の架橋剤を添加して行な
う。又、架橋反応は自然ゲル化後の球状の粒子を濾過し
て有機溶剤を分離し、アセトン、メタノール洗浄したの
ち水中にて行なうこともできる。

架橋反応は、自然ゲル化後、０℃ないし１００℃、好ま
しくは３０℃ないしｔＯ℃で１時間ないし２０時間、好
ましくは２時間ないしｔ時間。

行なう。架橋反応の際、架橋剤に応じて、触媒として塩
酸、硫酸等の酸、又は、水酸化す）　ＩＪウム、水酸化
カリウム等のアルカリを用いる。

架橋剤として、ジアルデヒド化合物を用いる場合は、触
媒として酸を用いる。酸の使用量は水層中の濃度が／Ｎ
以下になる様に添加するのが好ましい。架橋剤として、
二Ｉノ・ロヒドリン化合物を用いる場合は触媒としてア
ルカリを用いる。アルカリの使用量は水層中の濃度が２
Ｎ以上になる様に添加する。　　　　− 上記のごとく架橋反応を水中にて行なう場合も含め、架
橋反応の際、硫酸ナトリウム、塩化す）　ＩＪウム等の
塩又は塩水溶液を添加することが好ましい。

塩の添加量は種類等により異なるが、通常６チ以上、ポ
リビニルアルコール水溶液が沈殿凝析を起こす濃度以上
で添加される。例えば塩化ナトリウムでは２０％以上、
硫酸ナトリウムでは４％以上添加される。

このようにして得られた架橋ポリビニルアルコール粒子
は、濾過分離する。次いでアセトン、メタノール等の水
混合性の有機溶剤で洗浄したのち充分水洗する。

有機溶媒を完全に除去するためには、分離した架橋ポリ
ビニルアルコール粒子を水中で加熱し共沸により有機溶
媒を留去することが好ましい。

〔実施例〕

以下に実施例により本発明を更に具体的に説明するが、
本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例Ｉ 攪拌機と還流冷却管を取りつけたＯｌＳ　ｔの三ツロフ
ラスコに、ジクロルエタンｘｊＯｍｌｔ入れ、セルロー
スアセテート？°チレート（イーストマンコダック社製
、商品名ＣＡＢ　３１１−２０）０．２１を溶解し分散
浴とした。

別に、攪拌機と還流冷却管を取りつけた２００−の三ツ
ロフラスコに、塩化ナトリウムよｔ１水ｊＯｔｄを入れ
、攪拌しながら溶解後、これに粉末のポリビニルアルコ
ール（日本合成化学工業株式会社製、商標ゴーセノール
ＮＬ−０１）２、ｊ？を加えて分散させ？ｒ℃で１時間
加熱して溶解したのち、さらにｊＮ水酸化ナトリウムを
６−加えて攪拌した。

架橋デキストラン系分離剤（ファルマシア社製、商品名
セファデックスＧ　ｊ　Ｏ（Ｍｅｄｉｕｍ　）　）は、
攪拌機と還流冷却管を取りつけた２００ｄの三ツロフラ
スコ中の塩化カリウム水溶液（塩化ナトリウムよ？、水
ｊ　０１１Ｌｌ　）中にｓｔ加えて分散させ２℃℃で７
時間加熱して膨潤させたのち、室温まで冷却した上記の
ポリビニルアルコール溶液中に加えて攪拌した。その後
、上記の有機溶媒からなる分散浴に分散した。室温でｌ
り時間攪拌しながら放置し自然ゲル化を行なった。

自然ゲル化後、さらにλｊ％食塩水ｉｏｏ、ｚを加え、
３時間攪拌しながら放置したのち、濾過し、アセトン、
メタノール洗浄後、水洗し再び攪拌機付き！００ｔｇｌ
の三ツロフラスコに移し、塩化ナトリウム４ｃＯｔ、水
２００．１を入れ攪拌しながら、２ｊ％グルタルアルデ
ヒド水溶液ｌ≠ｙｔｔｌを加えたのち！Ｎ塩酸４ｃａｌ
を加え、攪拌しなから６ｊ’Ｃで２時間加熱して架橋反
応を行なった。室温まで冷却したのち、濾過し、十分水
洗した。平均粒径２２０μの架橋デキストラン系分離剤
を約７６個を包含した平均粒径７００μの乳白潤色の球
状架橋ポリビニルアルコール粒子が得られた。

実施例コ 使用した架橋デキストラン系分離剤（ファルマシア社製
、商標セファデックスＧ１００（Ｍｅｄｉｕｍ　）　）
の種類、添加量を第１表の如く変えた以外は実施例１と
同様の操作を行なった。

平均粒径２１０μの架橋デキストラン系分離剤を約／ｒ
個を包含した平均粒径７００μの乳白潤色の球状架橋ポ
リビニルアルコール粒子が得られた。

実施例３ 攪拌機と還流冷却管を取りつけた２００ｄの三ツロフラ
スコに、塩化ナトリウムｌＯｆ、水１００ｄを入れ、攪
拌しながら溶解後、これに粉末のポリビニルアルコール
（ゴーセノールＮＨ−／　ｒ　）　３．！　？、架橋デ
キストラン系分離剤（セファデックスＧｔｓｏ（ＳＦ）
）　２．３９を加えて分散させりｔ℃で３時間加熱して
ポリビニルアルコールは溶解し、架橋デキストラン系分
離剤は膨潤させたのち、さらにｔＮ水酸化ナトリウム参
ｄ加えて攪拌した。

室温まで冷却したのち、セルロースアセテートブチレー
トの添加量を７，２２ｒ　ｔに変えた以外は実施例１と
同様な有機溶媒中に分散し室温でｌり時間攪拌しながら
放置し、自然ゲル化を行なった。

自然ゲル化後、さらに２０％塩化ナトリウム水溶液１０
０−を加え、３時間攪拌しながら放置したのち、濾過し
１．アセトン、メタノール洗浄後、水洗し再び攪拌機付
き３００ｒｄの三ツロフラスコに移し、水ｔｏ、ｇを入
れ攪拌しながら、冷却下、粒状の水酸化す）　ＩＪウム
７２ｆを溶解したのち、エピクロルヒドリン３ｒｄを加
え攪拌しながら６０℃で６時間加熱して架橋反応を行な
った。室温まで冷却したのち、濾過し、十分水洗したの
ちもう一度架橋反応を同一条件で行なった。平均粒径６
？μの架橋デキストラン系分離剤を約７０個包含した平
均粒径ＪｊＯμの薄い黄色の球状架橋ポリビニルアルコ
ール粒子が得られた。

実施例≠ 使用したポリビニルアルコールの種類、添加量及び！Ｎ
水酸化ナトリウムの、添加量を第１表の如く変えた以外
は実施例３と同様の操作を行なった。平均粒径６ｒμの
架橋デキストラン系分離剤を約７０個包含した平均粒径
３！Ｏμの薄い黄色の球状架橋ポリビニルアルコール粒
子が得られた。

〔圧力損失測定試験〕

内径Ｌ２１１１１φのガラスカラム（ジャケット付）に
粒径を／≠り〜λり７μに整粒した実施例Ｖで得られた
分離剤を充填した。分離剤の層高は、ｊＱｃＩＩＬであ
った。カラムを循環水で２ｊ℃に保ち、カラム上部から
、蒸留水を一定流速で流した。充填層が安定し、カラム
の上部にとりつけた圧力計の指針が一定になったところ
で圧力計の目盛りを読みと９、その値から分離剤を充填
していない、いわゆる空力ラムの状態で前述した操作と
全く同様の操作をした場合の圧力計の読みとり値をさし
引いて圧力損失（Δｐ・単位Ａｆ／ｃｉｌ／　−ｔ　Ｏ
ａｎ　−ｂｅｄ　）を求めた。

流速（ＬＶ　：線流速、単位ｍ／Ｈｒ）を種々変えて圧
力損失（Δｐ）を測定したところ第１図に示した結果と
なった。測定した流速範囲内では（ＬＶとして３ｍ／Ｈ
ｒ以下）、本発明分離剤を用いた場合のΔｐとＬＶの間
には直線関係が成立し、ＬＶ＝ｓｍ／Ｈｒ　という高流
速で通液しても、担体粒子の変形、破砕は全く認められ
なかった。

なお、比較のために、実施例≠で得られた分離剤を用い
る代わりに、包含した多糖類系分離剤セファデックスｃ
　ｔ、ｚ　ｏ　（Ｍ）　（ファルマシア社製）を用いる
、以外は上記と同様の操作を行い、ΔｐとＬＶの関係を
求めた。その結果を第１図に示した。

多糖類系分離剤を用いた場合は、流速がＬＶ＝　０．３
　ｍ／Ｈｒをこえたあたりから、Δｐが急激に立ちはじ
め、ＬＶ　＝　０．４　ｍ　／Ｈｒ以上では、通液が困
難となった。

応用例／ 実施例／及びλで得られた複合化分離剤１０簡φ×ｊＯ
ＯＩＩＩ！ＩＨのガラスカラムに充填し十分水洗した後
較正曲線を作成するために以下の操作を行ない、ゲルテ
過りロマトグラフィ用担体としての性能評価を行なった
。

分子量既知のデキストランの水溶液（濃度ｊＷ／Ｖ９６
）をｉｏｏμｔ、ポリエチレングリコールの水溶液（濃
度ＪＷ／Ｖ％）を３００μＬ、上記のカラムにチャージ
し、次いで流速Ｏ０≠ｍｌ／頭で蒸留水を流し、デキス
トラン、ポリエチレングリコールを溶出した。

流出液中のデキストラン、ポリエチレングリコールを示
差屈折計を用いて検出し、その溶出位置（ピークのトッ
プ位置）を求めた。

第２図にその結果を示した。

応用例コ 実施例３及びψで得られた複合化分離剤を内径Ｌ２Ｍ１
１φＸｊ００ｔｍＨのガラスカラムに充填し、ｔ　ｊ　
ＯｍＭ　ＮａＣ！含有ｓ　ｏ　ｍＭリン酸バッファー（
ｐＨ７，≠Ｏ）で十分平衡化した後、蛋白質の較正曲線
を作成するために以下の操作を行ない、ゲルテ過りロマ
トグラフィー用担体としての性能評価を行なった。

下記に示した分子量の異なる蛋白質を０．１％の濃度に
なる様に、／　ｊ　ＯｍＭ　ＮａＣＬ含有１０ｍＭリン
酸バッファー（ｐＨ７，ψＯ）に溶解し、／Ｊ−０μｔ
１上記のカラムにチャージした。チャージ後、流速ｏ、
２ｙｔｌ／ｒＨＲで／　ｊ　ＯｍＭ　ＮａＣｔ含有ｊ　
ＯｍＭリン酸バッファーを流し蛋白質を溶出した。

蛋白質の検出はＵＶ計を用いて行なった。

（Ｊ　ｒ　Ｏｎｍ　） なお、比較のため、包含した多糖系分離剤セファデック
スＧｌ！０（Ｍ）を用いて上記と同様の操作を行ない、
蛋白質の較正曲線を求めた。

蛋白質の溶出位置から下式によりＫａｖ、を求め、この
値を分子量に対してプロットし、較正曲線として第３図
に示した。

（尚、Ｖｏは分子量約２００万のブルーデキストランを
用いて求めた値） 第２図より本発明の分離剤を用いて得られた較正曲線は
良好な直線性を示し、ゲル口過クロマトグラフィー用担
体として好適であることがわかる。

図中屋　蛋白質　分子量（×１Ｏ３）等電点／：チログ
ロプリン　　　　　６６７　　　　　≠、ｊ２：フェリ
チン　　　　　　　弘１７０　　　　　　４′〜ｊ３：
牛血清ｒ−グロブリン　　　ｌ！タ　　　　１，２〜７
．３Ｖ：牛血清フルブミ／　　　　　　６４．Ｊ　　　
　４（ｊ　〜４（、ｒｊ＝卵白アルブミン　　　　　　
≠ｊ　　　　　　　４Ｃ０４６：ミオグロビン　　　　
　　　ｉ７．ｔ　　　　ｔ、ｔ〜ｔ、λ″７ 〔効果〕 本発明方法により得られる複合化分離剤はクロマトグラ
フィー、特に水系ゲルパーミエイシ田ンクロマトグラフ
ィー用の充填剤として有用である。

本発明方法より得られる複合化分離地は、粒径が２０〜
１０００μで、マクロボアーを有する架橋ポリビニルア
ルコール粒子中に、粒径ｊ〜２００μの多糖類系分離剤
を参〇−１０％（容積比）包含されたものである、又本
複合化分離剤は、親水性に富んでいる為、特に蛋白質と
の非特異的吸着が少ないという特徴を有する。従って、
例えば、ｒ−’グロブリン、アルブミン、ミオグロビン
等の各種蛋白質の分離剤として有用である。

加えて、本発明の斯る複合化分離剤はポリビニルアルコ
ール基体の架橋構造により優れた機械的強度を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例≠で得られた複合化分離剤及
び比較例として多糖類系分離剤を用いて圧力損失と流速
との関係を測定した結果を示すグラフである。図中、横
軸は通液流速（−／ｈｒ、　）、縦軸は圧力損失（ｋｆ
／ｃｒ／ｌ　−ｊ　Ｏｃｍ　ｂｅｄ　）を表わす。 第２図は、本発明の実施例１及びコで得られ複合化分離
剤についてのデキストジン、ポリエチレングリコールの
較正曲線、第３図は実施例３及び≠で得られた複合化分
離剤及び比較例として多糖類系分離剤を用いた場合の蛋
白質の較正曲線である。第２図及び第３図において横軸
は下記式で表わされる保持容量、Ｋａｖ、値、縦軸は分
子量を表わす。 （尚、Ｖｏは分子量約−２００万のブルーデキストラン
を用いて求めた値） 出　願　人　　三菱化成工業株式会社 代　理　人　　弁理士　要否用　　　−（ほか１名） 第１図 ム、Ｖ、　（ｍ／Ａｒ） 第２図 護持ｅ−（ 亮３図 にａｖ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）巨大網目構造を有する親水性ポリマーからなる分
   離剤を膨潤させた状態で、ポリビニルアルコール及び塩
   類の水溶液と共に有機溶媒からなる分散浴中に分散造球
   させ、前記分離剤および塩水溶液を包含したポリビニル
   アルコール粒子を得、次いで該ポリビニルアルコール粒
   子を自然ゲル化させたのち架橋剤と反応させることを特
   徴とする複合化分離剤の製造方法。
2. （２）架橋剤がジアルデヒド化合物であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
3. （３）架橋反応が酸触媒の存在下に行なわれることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造方
   法。
4. （４）分散浴がハロゲン化炭化水素であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の製
   造方法。