JPH01187067A - 経口摂食組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高血圧予防のための健康食品として用いて有
用な経口摂食組成物に関するものである。

〔従来の技術〕

今日、高血圧症は我が国において死亡率の上位を占める
疾病の一つであり、その治療あるいは予防は緊急かつ重
要な課題となっている。

高血圧症には二次性高血圧症と本悪性高血圧症とがある
が、前者のうち腎性高血圧症あるいは内分泌性高血圧症
等とさらに後者の本態性高血圧症の発疹、病態に、いず
れも血中活性ペプチド産生系、特にレニン・アンジオテ
ンシン系が深いかかわりを持っていることはよく知られ
ている。このレニン・アンジオテンシン系には、血圧調
節に関与するアンジオテンシンａｍ酵素（＾ｎｇｉｏｔ
ｅｎｓｉｎＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ、以下
ＡＣＥということがある）が存在しており、該酵素によ
って血管壁平滑筋収縮作用を有するペプチド（アンジオ
テンシン■）が産生されることにより、強い血圧上昇が
もたらされる。

従って、この酵素活性を阻害すれば、血圧上昇を抑圧す
ること（降圧）が可能となることが考えられ、現にかか
る観点から種々の天然物および合成物について阻害物質
の探索が進めら些、既に合成物についてはプロリン誘導
体化合物のある種のものがその有効性を認められて降圧
剤として実用に供されている。

一方、天然物からのＡＣＥ阻害物質として最近、牛由来
のカゼインのトリプシン分解物中に阻害ペプチドが存在
することが確認され、単離・精製されている（特開昭５
８−１０９４２５号公報参照）。

これら天然物由来のＡＣＥ阻害物質は、食品あるいは、
食品原料から得られるものであるので、低毒性で安全性
の高い降圧剤となることが期待できるが、なかでもカゼ
イン由来の阻害ペプチドは、安全性、有効性に加えて、
製造面に於いても比較的容易かつ低コストで量産化が可
能と見込まれるところから、その降圧剤としての実用化
が検討されている。

しかして、生理活性ペプチド類は、−船釣に親水性で比
較的高分子量である為、消化管からの吸収が悪く、また
場合によっては消化管液により分解を受けてその活性を
失うことがあるため、投与経路は多くの場合、注射によ
る静脈内投与に限定されており、上記のカゼイン由来の
ＡＣＥ阻害ペプチドにあってもその例にもれず、従来は
もっばら静脈内投与時の有効性が検討され、その際の血
圧降下作用が確認されているに過ぎない。

〔発明の解決課題〕 本発明者らは予てより、高血圧症、特に本態性高血圧症
の根本的治癒の困難性に鑑み、血圧の日常的、継続的な
調節（例えば血圧降下作用を有する健康食品の摂取等）
とそれに基づく高血圧症の発症予防、あるいは高血圧傾
向の緩和の重要性に着目し、かかる目的に適用可能な低
毒性でしかも経口投与（摂取）により有効性を発揮する
降圧物質について探索を進めて来たが、前述のカゼイン
由来のＡＣＥ阻害ペプチドのすぐれた特性、特にその低
毒性からしてこれを上記の目的に使用することの可能性
について検討を行ったところ、意外なことに該ペプチド
の経口投与で降圧作用が見られ、更にまた卵黄を併用し
、経口投与することにより更に降圧作用が増強される事
を見い出した。

この併用投与は、適度な降圧作用を示し、その低毒性、
高い安全性と相俟ってここに高血圧予防、高血圧傾向緩
和のための健康食品等として有用な経口摂食物の提供が
可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

〔発明の構成〕

即ち、本発明はカゼインを蛋白質分解酵素により分解し
て得られるアンジオテンシン転換酵素を阻害するペプチ
ドと卵黄を含存することを特徴とする経口摂食組成物で
ある。

本発明に云うカゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチドとして
は、例えば以下に示す如きアミノ酸配列からなるＣＥＩ
＋ｔ、ｃＥＩｓ、あるいはｃＥＩｓ等があり、それらは
単独で、もしくは混合物として用いられる。

Ｇ　Ｅ　Ｔ　＋ｘ　　：　Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ ｃＥＩｓｔ　　：　Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−ＡｒｇＣＥＩ　５　　　：　Ｐｈｅ−
Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒ。

これらＡＣＥ阻害ペプチドのうち、ＣＥＩ＋＊およびｃ
ＥＩｓ、は、牛由来カゼイン（特に後者はβ−カゼイン
）のトリプシン加水分解物から得られ、またＣＥｌ、は
、ＧＥＴ＋ｔのプロリン特異的エンドペプチダーゼ処理
によって得られる。

ＣＥＩ＋ｔの調製は、特開昭５８−１０９４２５号公報
等によって公知の方法に準じて例えば以下のようにして
行われる。

生由来カゼイン（α−カゼインまたはβ−カゼイン）を
、Ｐ　Ｈ５，０〜９．０の条件下トリプシンにより分解
し、分解物から加熱処理あるいは酸処理によりトリプシ
ンおよび未分解カゼインを沈降・除去せしめる０次に、
母液を、要すればアルカリで中和し、減圧下に２〜３倍
に濃縮した上、セファデックスＧ−２５等を充填したカ
ラムに添加し、蒸留水で溶出させてＡＣＥ阻害活性を示
す両分を集め、さらに必要に応じて同様の精製を繰返し
た後、活性画分から、例えば減圧濃縮あるいは有機溶媒
添加等の方法によりＣＥＩ＋ｔを取得する。

また、ｃＥＩｓ、は、その出発原料がβ−カゼインに限
定されることを除けば、上記のＣＥＩ＋ｚと全く同様に
してこれを調製することができる。

この場合、トリプシン分解物中にはｃＥＩｓ７とＣＥＩ
＋＊とが同時に生成してくることになるが、それらはセ
ファデックスカラムクロマトグラフィーにより容易に分
別が可能である。

ＣＥ　Ｉｓ　は、ＣＥＫＩ！を原料として例えばアグリ
カルチユラル　アンド　バイオロジカル　ケミス　ト　
リ　−　（＾ｇｒｌｃ、　　　　Ｂｉｏｌ、　　　　Ｃ
ｈｅｗ、）　　、−ゴ１９　　　（５）　　。

１４０５　（１９８５年）に記載の方法に従って調製す
ることができる。即ち、ＣＥＩ＋ｔを燐酸緩衝液（Ｐ　
Ｈ７，０）中でプロリン特異的エンドペプチダーゼによ
り加水分解し、該ペプチダーゼを除去した後、分解物を
例えばラブイアルーパツク（Ｒａｄｉａｌ−ＰＡＮ　）
　Ｃ−１８カラム（ウォーターズ社製）を用いた高速液
体クロマトグラフィー（溶出液：ｔ４酸緩衝液（ＰＨ３
，０）　／Ｃ１１ｓＣＮ　−６０／４０（ｖ／ｖ））に
付し、活性画分（２１０ｎｍに吸収をもつ両分）を分取
することにより、ＣＥ　Ｉｓが得られる。

又、より有利には有機化学的な合成手法を用いることが
できる。

以下にＣＥＩ＋ｔの合成法の一例を示す、ここでは、不
溶性担体としてポリスチレン樹脂を用いる固相対称酸無
水物法を利用し、ペプチド合成を行う、なお、ここでは
、アミノ酸はすべてＬ体を意味し、アミノ酸の保護基の
略号はそれぞれ次の残基を表す。

Ｂｏｃ　：　ｔａｒｔ、　Ｂｕｔｙｌｏｘｙ−ｃａｒｂ
ｏｎｙｌ基ＰＡＭ　　：　　ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙ　　　
ｐｈｅｎｙｌ　　　ａｃｅｔａｓｉｄｏｍａｔｈｌ　　
ｒｅｓｉｎＢ２１：ベンジル基 ２　　：ペンジルオキシカルボニル基 Ｔｏｓ：ｐ−）リルスルホニル基 ＡＡ”：ｎ番目のアミノ酸 ポリスチレン樹脂に架橋されたＡＡ’　（ＡＡ’−ＰＡ
Ｍ）をＴＦＡにより、脱保護基反応により、Ｈ−ＡＡ’
−ＰＡＭを合成し、それにＢｏｃ−Ａ　Ａ”−ＯＨをジ
クロルメタン中でＤＣＣを用いをジメチルホルムアミド
中で縮合させ、Ｂｏｃ−ＡＡ”−ＡＡ’−ＰＡＭを合成
し、未反応のＡＡ’−ＰＡＭを無水酢酸を用い、キャン
ピングする。

得られたＢｏ　ｃ−ＡＡ”−ＡＡ’−ＰＡＭを再びＴＦ
Ａを用い、脱保護基反応を行ない、同様にしてＢＯｅ−
ＡＡ３−ＯＨを縮合し、以下同様にしてＡ　Ａ　１　ｇ
まで縮合反応を行なう、なお、用いるアミノ酸側鎖の官
能基は以下の様に封鎖してお（。

Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ　（０−Ｂｚｌ）。

Ｃｙｓ（４−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）、Ｇ１　ｕ　
（０−Ｂｚ　１）　。

Ｌ　ｙ　ｓ　（２−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙ　
　ｃａｒｂｏｎｙｌ　）　。

Ｓｅｒ　　（Ｂｚ　１）、Ｔｈｒ　（Ｂ２１）、Ｔｒｙ
（２−Ｂｒｏｓｏｐｈｅｎｙｌｏｘｙ　　ｃａｒｂｏｎ
ｙｌ）＋　Ｈｉ　ｓ　（Ｔ　ｏ　ｓ　）縮合反応終了後
、ＨＦを用い脱保護基反応を行ない、Ｂｏｃ及びＰＡＭ
、側鎖の保護基を除き、Ｈ−ＡＡ”・・・・−・−・・
・・−・・−・−・・−・−・・・・ＡＡ’−ＯＨを得
る。

ここでＡＡ’−Ｌｙｓ、ＡＡ”−Ｇｌｙ、ＡＡ”ｗＰｈ
ｅ、ＡＡ’−Ｖａ　ｌ、ＡＡ’−Ｇｌ　ｕ。

ＡＡ’−Ｐｒｏ、ＡＡ’−Ｐｈｅ、ＡＡ”＝Ｐｒｏ。

ＡＡ’＝Ａ　Ｉ　ａ、ＡＡ’・−Ｖａ　１．ＡＡ”−Ｐ
ｈ　ｅ。

ＡＡ”ｗＰｈｅを示す。

また、これらを混合物として大量の試料を得る為には、
トリプシン分解後、その分解液をポアサイズＭＷ−８，
０００以下の透析膜により透析し、透析液をそのままあ
るいは、濃縮・凍結乾燥等の操作を行えばよい。

卵黄は、市販の鶏あるいはウズラ（ｎ）、だちょう等の
卵の黄身を用いればよい。

以上の如きカゼイン由来のＡＣＥ阻害ペプチド類は、通
常粉末の形で単離・取得した上、卵黄と共にこれを混合
したものをそのまま、もしくはより好適には適当な無毒
性の経口投与（摂取）用担体と共に適宜の形状、形態か
らなる組成物として経口摂食用に供する。

組成物の例としては、ＡＣＥ阻害ペプチドと卵黄を、薬
学的に許容される担体（賦形剤、滑沢剤、結合剤、着色
剤、矯味剤、賦香剤等）と共に、経口投与用の製薬製剤
の形態、例えば錠剤（糖衣錠、発泡錠、フィルムコート
錠、咀明錠等）、カプセル剤、トローチ剤、粉末側、細
粒剤、顆粒剤等としたものが挙げられる。

また、固形あるいは液状の食品ないしは嗜好品、例えば
菓子類、粉末茶、アイスクリーム、ヨーグルト、アルコ
ール飲料、スポーツ飲料等の形態としてもよい。

経口摂食物中に於けるＡＣＥ阻害ペプチドと卵黄との合
計の含有量は剤型により適宜選択が可能であるが一般に
は１〜１００重量％の範囲である。

又、上記ペプチドと卵黄との含有比率は一般的にはｌ：
１０〜３：１の範囲にある。

以上の如き構成からなる本発明の経口摂食物は、後に試
験例で示す通り、その有効成分たるカゼイン由来のＡＣ
Ｅ阻害ペプチドと卵黄が、経口投与によってもかなりの
降圧作用を示し、しかも著しく低毒性であることから、
それを高血圧傾向緩和あるいは血圧調節を目的として、
継続的に経口投与（摂取）することが可能であり、高血
圧予防のための健康食品等として用いてその有効性が期
待できる。

かかる目的に本発明の経口摂食物を用いる場合、その摂
取量は、活性成分のＡＣＥ阻害ペプチドがＣＥｌｌｔＣ
後に示す通り、そのＡＣＥ阻害活性（ＩＤｓ。）は７７
μＭである〕である時には、該ペプチドの重量に換算し
て成人男子１日当たり０．０５〜３０　ｍ　ｇ　／　Ｋ
　ｇ体重の範囲が適当であり、ＣＥ１＋富以外のペプチ
ドについては、上記のＣＥＩ＋ｘの摂取量を基準として
、各々の阻害活性（１０ｓ。）ないしは純度、あるいは
腸管吸収性等に応じて適宜の範囲が選択される。一方、
卵黄は０、０　Ｏ５ｇ〜２ｇ／Ｋｇ体重の範囲が好まし
い。

以下に本発明経口摂食物の活性成分たるカゼイン由来の
ＡＣＥ阻害ペプチドの製造例とそれらペプチド及び卵黄
との併用投与が有効であることを示す動物実験（血圧降
下試験および急性毒性試験）の結果を挙げる。

なお、ＡＣＥ阻害ペプチドの活性（ＩＤｓｏ）は、以下
の方法によって測定したものである。

（ＡＣＥ阻害ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定〕ｉ）ア
ンジオテンシン転換酵素液（ＡＣＥ液）の調製 ５ｇのラビットラング７セントパウダー（シグマ社製）
を５０ｍｊ！の０．１　Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，８）
に溶解し、４０．　０００　ｘ　ｇ、　　４０分の条件
下で遠心処理し、その上清液をさらに、上記緩衝液で、
１０倍に稀釈し、アンジオテンシン転換酵素液を得た。

ｉｉ）活性の測定 試料を試験管に０．０３　ｍ　ｌ入れ、これに基質とし
て、２５０μｍのヒプリルーし一ヒスチジルーし一ロイ
シン（シグマ社（Ｓｌｇｍａ、　　Ｃｏ、）製、最終濃
度５　ｍＭ、　ＮａＣ１３００ｍＭを含む、〕を添加し
、３７℃で１０分間保温後、上記酵素液を０、１　ｍ　
ｊ添加し、３７℃で３０分間反応させた。

その後、ＩＮ塩酸０．２５　ｍ　ｊを添加して反応を停
止させた後、ｉ、　ｓ　ｍ　ｓの酢酸エチルを加え、１
５秒間激しく攪拌した。その後、３．５０Ｏｒｐｍで１
５分間遠心して、酢酸エチル層１ｍＡを採取した。その
酢酸エチル層を１２０ｔで３０分間加熱し、溶媒を除去
した。溶媒除去後、蒸留水１ｍｊを添加し、抽出された
ヒプリル酸の吸収（２２８ｎｍの吸光度）を測定し、こ
れを酵素活性とした。

阻害率は、次式より算出した。

阻害率−Ａ−Ｂ／ＡｘｌＯＯ％ Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸光度 Ｂ；阻害剤添加の場合の２２８ｎｍの吸光度　・そして
、阻害率５０％の時の阻害濃度をＩｎ５ｏとする。

製造例１ ５０リフトルジャーファメンタ−（ミツワ製）に牛由来
カゼイン（和光純薬製、生化学用）２．５Ｋｇを３５リ
ツトルのＨｌＯに懸濁し、アンモニア水（和光製、２５
％ＮＨ，ＯＨ）によってＰＨを７．６に調整する。３７
℃に保温しトリプシン（シグマ製トリプシンＥＣ３，４
，２１，４牛膵臓由来Ｔｙｐｅｌ１１）　６．２５　ｇ
を加え、攪拌しながら１８時間消化を行った。

消化液にｃｏｎｃＨＣ１を加え、Ｐ　Ｈ１，０とし、未
反応Ｃａ５ｅｉｎ等を沈澱させた。これを１０．００Ｏ
ｒｐｍ、４℃で連続遠心分離を行い、沈澱物を除いた後
、上澄液を透析チューブ（スペクトラ、ボア６　分画分
子量１．０００）を用いて流水下にて室温で透析を行っ
た。チューブのシールは、スペクトラ製のクローサーで
行った。透析の終点は、透析チューブ内液の伝導度が４
　ｍ　ｓ　／　ｃ　ｍ以下に低下した時とした。（通常
３〜４ｈｒ必要）透析液を１０．００Ｏｒｐｍ、ｆｏｒ
　　１５ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、不溶物を除いた後
、凍結乾燥を行いペプチド９４０ｇを得た。

透析前後におけるＡＣＥ阻害活性成分の回収率は９５％
と良好であり、また脱塩も９０％以上達成できた０本ペ
プチドはＣＥＩ＋ｔとＣＥＩβ、を主体とするＡＣＥ阻
害ペプチドであり、ＩＤ５ｓ−２、５ｍ　ｇ　／　ｍ　
ｊである。

次に製造例１で得たペプチドの降圧作用について試験し
た。

試験例１ 製造例１で得たペプチドと卵黄を併用経口投与させ、４
週間飼育した時の降圧作用 ＋１）試験方法 １２週齢の自然発症高血圧ラット（日本チャールズ・リ
バー社）２０匹を温度２３±２℃、湿度５５±５％の動
物室に収容し、水および飼料（オリエンタル酵母社製、
ＭＦ）を自由に摂食させた。

ラットは、週に一度血圧を測定しながら２週間にわたっ
て馴化飼育したのち、高血圧を発症したところで実験に
供した。

即ち、製造例−１で得られたペプチドの投与量が２．４
　ｇ−／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙになるように被験
試料を生理食塩水に溶解したちの約６　ｍ　ｌを胃ゾン
デにて毎日強制経口投与した（ペプチド溶液群）同様に
、製造例−１で得られたペプチドの投与量が２．４　ｇ
　／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙ　、鶏卵黄の投与量が
７．２　ｇ　／　Ｋ　ｇ体重／　ｄ　ａ　ｙになるよう
にペプチドを３０％卵黄液（卵黄を生理食塩水中に畦濁
させたもの）に溶解したちの約６ｍｌを胃ゾンテにて毎
日強制経口投与した（ペプチド溶液・卵黄群）。

また、鶏卵黄の投与量が７．２　ｇ　／　Ｋ　ｇ体重／
ｄａｙになるように３０％卵黄液（卵黄を生理食塩水中
に懸濁させたもの）約６ｍｊｌを胃ゾンテにて毎日強制
経口投与した（卵黄液群）。

その他は馴化飼育と同じ条件で４週間飼育した。

血圧測定は、１週間に一度行った。

血圧測定は、それぞれ無加温・非観血的ラット血圧形（
トーイデン製、ＤＳＲ８０１Ａ＞を用い、ｔａｉｌ−ｃ
ｕｆｆ法で各ラットの最高血圧値を連続１０回測定し、
その平均値を求めることにより行った。

結果は１群５匹の平均値で示した。

（２）試験結果 第１図に血圧測定結果を示す。

第１図から明らかな通り、本発明方法のＡＣＥＩ阻害ペ
プチドは、卵黄とともに併用投与することによって単独
で投与するよりも降圧効果が優れていることがわかる。

又、体重変化や臓器重量の変化は、コントロールと同等
であり安全面でも良好である事を確認した。

試験例２　急性毒性試験 （１１試料 各ＡＣＥ阻害ペプチドの１０％水溶液を試料とした。（
卵黄は安全性が確認されているので記載を省略する。） ［２）実験動物 動物：ＩＣＲ系マウス（日本タレア） 供試数：雌雄各２０匹 試験開始時の体重：雄２４〜２６ｇ 雌２２〜２４ｇ 期間中の飼育条件：温度２２±２℃ 湿度５０±５％ 固型試料 （ＣＥ　−２、日本タレア） 水道水を自由摂取 （３）試験方法 動物は１週間予備飼育した後に、１群１０匹として実験
に供した。投与前１６時時間量させ実験群には試料３ｇ
／Ｋｇ胃ゾンデを使って強制的に経口投与した。

投与後７日間、動物の生死と一般症状について毎日観察
を行った。

（４）試験結果 試験結果を第３表に示す、第３表に示した通り、動物の
死亡は全く無かった。一般症状として衰弱、るいそう、
虚脱、うずくまり、腹這い、横臥、体色変化、皮膚温変
化、発汗、立毛、脱毛、毛の汚染、呼吸数増減、不整呼
吸、喘鳴等についても観察したが、まった（変化は無か
った。

第　　３　　表 あることからして、本発明のＡＣＥ阻害ペプチドが掻め
て安全性の高いものであることが明らかである。

（発明の効果） 本発明により安全性が高く、有効性の高い降圧用の経口
摂食組成物の提供が可能となった。

以下実施例を示す。

なお実施例中の部とは、すべて重量部を意味する。

実施例１　アイスクリーム 脱脂粉乳　　　　　　　　　　８．０％植物脂肪　　　
　　　　　　１０．０ 砂１ｉ　　　　　　　　　　　　１３．０安定剤　　　
　　　　　　　　０．３ 乳化剤　　　　　　　　　　　０．３ バニラフレーバー　　　　　　０．１ 製造例１のペプチド　　　　　５．０ 卵黄　　　　　　　　　　　　７．５ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５．８
通常の製造法にて作成した。（１０，０ｇ／カップ）実
施例２　ヨーグルト 牛乳　　　　　　　　　　　６４．０ 全乳　　　　　　　　　　　　４・Ｏ 脱脂粉乳　　　　　　　　　　５．０ グラニュー＄１７．０ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０
通常の製造法にて作成した。　　（１０，０ｇ　／　ｃ
　ｕ　ｐ　）週 第１図 手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 経口摂食組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号名称　（０９
５）鐘紡株式会社 〒５３４　　大阪市部島区友淵町１丁目５番９０号鐘紡
株式会社特許部 ４、補正命令の日付 平成　１年　３月　７日（発送臼） ５、補正により増加する発明の数　　　な　し６、補正
の対象 明細書「図面の簡単な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書第２０頁実施例２の記載後に、次の「４、
図面の簡単な説明」の項を追加挿入する。

【図面の簡単な説明】

第１図は試験例１の血圧測定結果を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）カゼインを蛋白質分解酵素により分解して得られ
   るアンジオテンシン転換酵素を阻害するペプチドと卵黄
   を含有することを特徴とする経口摂食組成物