JPH01187085A - 新規リパーゼ、該リパーゼの製造法及び微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規リパーゼ、該リパーゼの製造法及び新規
微生物に関する。

来の技術及びその課題 リパーゼは、消化剤や石鹸製造時の油脂の分解用、洗剤
添加用酵素等として、使用されている。

しかしながら、従来公知のリパーゼには、ヒマシ油の加
水分解率が非常に低いという欠点があった。即ち、ヒマ
シ油は、その構成脂肪酸としては水ａ！基を持つリシノ
ール酸が大部分を占めており、この水酸基のために各種
リパーゼによる加水分解率が他の油脂に比べて低いこと
が知られている。

従って、リシノール酸の生理活性物質や化成品等への利
用ひいてはとマシ油の有効な利用が制限されているのが
現状である。

課題を解決するための手段 本発明者は、Ｅ２現状に鑑み、ヒマシ油の加水分解率が
轟くリシノール酸を容易に製造でき、ひいてはとマシ油
のより有効な利用を可能にすることを目的として、ヒマ
シ油を唯一の炭素源とする培地を用いて土壌を対象とし
てスクリーニングを行なった。その結果、アルカリゲネ
ス属に属する新菌株であるｆ−８−２４株がヒマシ油を
効率良く分解する新規リパーゼを生産することを見い出
し、これに基づき更に研鷹し本発明を完成するに至った
。

即ち本発明は、分子量が約３００００　（ゲル濾過法に
よる）であり、至適ｐＨがｐＨ７，０付近であり、且つ
オリーブ油を基質とした際の活性を１００％としたとき
の、ヒマシ油を基質とした相対活性が１０７％であるこ
とを特徴とする新規リパーゼ、 該リパーゼを生産するアルカリゲネス属に属する微生物
を培地に培養し、培養液中に該リパーゼを蓄積させ、こ
れを採取することを特徴とする該リパーゼの製造法、並
びに、 アルカリゲネス属に属し、該リパーゼ産生能を有するこ
とを特徴とする微生物に係る。

本明細書において、リパーゼの力価は、山田らのポリビ
ニルアルコール乳化法（日本農芸化学会誌、第３６巻、
第８６０頁、１９６２年）により測定したちのである。

即ち、ポリビニルアルコールの２％水溶液７５容量に局
方オリーブ油２５容のを加え３分間ホモジナイズして１
９たオリーブ油エマルジョン５１、ｐＨ７；０の０．１
Ｍリン酸緩衝液４−１及び酵素液（被験液）１１を混合
して反応液とする。この反応液を、３７℃で２０分間反
応させ、反応終了後直ちにアセトン−エタノール（１：
１．容量比）混液２０１を加えて反応を停止して、生成
した脂肪酸をフェノールフタレインを指示薬として０．
０５Ｎ　　ＮａＯＨで滴定する。

１単位（以下、Ｕとする）のリパーゼ活性の力価は、１
分間に１マイクロモル量の脂肪酸を遊離せしめる酵素量
を示す。また、１−１当り、２８０ｎａ＋の吸光度当り
の単位数（ＬＪ／１ｆ１０Ｄ　　　）を、比活性とする
。

本発明に係る新規リパーゼの特性は、次の通りである。

（１）作用：種々の油脂のエステル結合に作用し、脂肪
酸とグリセリンを生成する。

（２）基質特異性：諸種の動植物油脂それぞれ１ｇを基
質として、ｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液９−：存
在下、酵素溶液０．５＋ｅｌ（１４０Ｕ）を添加して、
３７℃で７２時間毎分１２０往復の１ｔｌｌｉｉ下に反
応を行なったときの諸基質に対する酵素活性を加水分解
率により測定し、オリーブ油を基質とした際の活性を１
００％とした相対活性で示すと、第１表の通りである。

第　　１　　表 上記第１表より、本リパーゼは、諸種の動植物油脂に対
して良（作用し、特に従来分解が困難であったヒマシ油
に対しても良く作用していることが明らかである。

また、加水分解率（絶対値）は、油脂のケン化価と酸価
とから求めると、ヒマシ油８２％、オリーブ油７７％、
ヤシ油７３％である。

比較のため、市販のリゾープス・ニベナス（Ｒ，ｎ１ｖ
ｅｎｕｓ　）由来のリパーゼ（ナガセ生化学工業■製、
Ｌｏｔ、６２７０１１３　）の基質特異性を同様にして
調べたところ、オリーブ油を基質とした際の活性を１０
０％としたときのヒマシ油を基質とした相対活性は、５
２％であった。

（３）至適ｐＨ：ｐＨ７，０付近である。

オリーブ油を基質としたときのリパーゼ活性とｐＨとの
関係を第１図に示す。第１図において、ｐＨ３〜６の活
性はクエン酸緩衝液を、ｐＨ６〜８の活性はリン酸緩衝
液を、ｐＨ８，５〜９の活性はグリシン緩衝液をそれぞ
れ用いて測定した。

（４）ｐＨ安定性：４℃で２２時間放賀した場合、ｐＨ
９，０〜１０．０の範囲で残存活性は１００％であり、
安定である。

４℃で２２時間放置後、オリーブ油を基質としたときの
リパーゼ残存活性と放置時のｐＨとの関係を第２図に示
す。第２図において、ｐＨ４〜５の処理はクエン酸緩衝
液を、ｐＨ６〜８の処理はリン酸緩衝液を、ｐＨ９〜１
１の処理はグリシン緩衝液をそれぞれ用いて行った。

（５）至適温度二６０℃付近である。

オリーブ油を基質としたときのｐＨ７，０でのリパーゼ
活性と温度との関係を第３図に示す。

（６）温度安定性：ｐＨ７，０において、３５℃で３０
分間のインキュベートでは１００％活性が残存し、４０
℃で３０分間のインキュベートでは７６％活性が残存し
、４５℃で３０分間のインキュベートでは完全に失活す
る。

オリーブ油を基質としたときのＤＨ７，０でのリパーゼ
残存活性と処理温度の関係を第４図に示す。

（１）阻害及び賦活化：本リパーゼは、Ｆ０３＋、２＋ ＨＱ　　、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＰＣ
ＭＢ　（パラクロロマーキュリツク安息香酸）等により
阻害を受ける。

各種無機塩類、ＥＤＴＡ又はＰＣＭＢを、ｐＨ６，９の
２０ｍＨトリスー塩酸緩衝液を用いて最終濃度がｉｍＨ
になるように調製し、３７℃で２０分間インキュベート
した後の残存活性の測定結果を、無添加のときを１００
％とする相対値として第２表に示す。

第　　２　　表 また、本リパーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシ
ルベンゼン硫酸ナトリウム等により著しい用言を受け、
またコール酸ナトリウム等の胆汁酸塩、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレアート等により賦活化を受ける
。

各種の界面活性剤を、ＤＨ６，９の２０−Ｈトリス−塩
１ｌＩＩＩＩｉ液を用いて最終濃麿が０．４用量％にな
るように調製し、３７℃で２０分間インキュベートした
後の残存活性の測定結果を、無添加のときを１００％と
する相対値として第３表に示す。

第　　３　　表 （８）分子ｆｆ１＝ゲルか適法により求めた分子量は、
約３００００であった。測定は、［セファデックスＧ−
７５Ｊ　　（ファルマシア社製）を用いて行なった。

（９）アミノ酸組成：本すバ〜ゼを、６Ｎ塩酸を用いて
１１０℃で２４時間加水分解を行なった後、自動アミノ
酸分析装置により各アミノ！ｌ１ｆｆｉを測定した。尚
、トリプトファンについては、紫外線吸収法により測定
した。

結果を、下記第４表に示す。尚、１分子中の残基数は、
分子１３００００であることから算出したものである。

第　　　４　　　表 本発明リパーゼと従来公知の微生物由来のリパーゼとの
特性の比較を下記第５表に示す。

第５表において、比較酵素随１及び２は特公昭５８−３
６９５３号に記載のアルカリゲネス・名糖ＰＬ−２６６
号由来のリパーゼエ及び■を、比較酵素ＮＱ３は特公昭
４９−３２０８０号に記載のアクロモバクタ−・名糖−
ＡＬ−８６５号由来のリパーゼを、比較酵素１１Ｑ４は
特公昭４４−１０７５４号に記載のシュードモナス・ス
テウラエリ由来のリパーゼを、比較酵素ＮＱ５は特開昭
４８−８８２７８号に記載のシュードモナス・フラッジ
由来のリパーゼを、比較酵素Ｎα６は特公昭５０−２５
５５３号に記載のシュードモナス・メフイテイカ・バリ
エタス・リボリテイ力由来のリパーゼを、それぞれ示す
。

第５表より明らかな通り、本発明リパーゼは、分子量の
点で他のリパーゼと異なり、明確に区別される。また、
分子９未記載の８Ｑ４及び５のリパーゼとは至適ｐＨの
点で異なり、明確に区別される。以上の点から、本発明
リパーゼは、従来公知のリパーゼとは異なり、新規なリ
パーゼと認められる。

本発明のリパーゼは、該リパーゼを生産するアルカリゲ
ネス属に属する微生物を培地に培養し、培養液中に該リ
パーゼを蓄積させ、これを採取することにより、好適に
収得することができる。本発明は、かかる新規リパーゼ
の製造法及び該微生物にも係るものである。

上記微生物の好ましいものとして、本発明者が土壌より
発見したアルカリゲネス属に属する新菌株であるｆ−８
−２４株を挙げることができる。

該ｆ−８−２４株は、工業技術院微生物工業技術研究所
へ寄託され、受託番号は、微工研菌寄第９７１５号であ
る。

該ｆ−８−２４株は、下記菌学的性質を有する。

（ａ）形態 肉汁寒天培地に生育させた菌の形状は、桿状であり、大
きさは０．７〜０．８Ｘ１．７〜２．０μｍである。運
動性がある。極鞭毛はない。胞子は形成しない。また、
ダラム染色性は陰性であり、抗酸性は陰性である。

（ｂ）生育状態 （１）肉汁寒天平板培養二手透明で乳白色のコロニーを
生成する。コロニーの表面は滑らかで、周縁は円形で、
断面は凸状をなし、色素の産生はない。

（２）肉汁寒天斜面環！ｉ：良く生育する。

（３）肉汁液体培養：良く生育する。培地は１時間静置
しても懸濁したままで、底には沈殿物はない。表面は泡
状である。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通である。

液化はロート状である。

（５）リドマスミルク：僅かにアルカリ性になる。

ペプトン化を起こし、液化する。

（Ｃ）生理学的性質 この項において、＋は陽性又は利用することを、−は陰
性又は利用しないことを、それぞれ示す。

（１）硝酸塩の還元：＋ （２）脱窒反応ニー （３）ＭＲテストニー （４）ＶＰテストニー （５）インドールの生成ニー （６）硫化水素の生成ニー （７）デンプンの加水分解：＋ （８）クエン酸の利用 コーザーの培地：・← クリステンセンの培地：＋ （９）無機窒素源の利用 硝酸塩：＋ アンモニウム塩：＋ （１０）ウレアーゼのテスト：＋ （１１）オキシダ・−ゼのテスト二十 （１２）ゼラチンの加水分解：＋ （１３）カタラーゼのテスト：＋ （１４）生育の範囲 ｐＨ４，４〜８．８の範囲で生育する。また、４１℃ま
で、生育する。

（１５）塩化ナトリウム耐性 Ｎａ（’１　２重間％含有培地で生育する（１６）０−
　Ｆテスト：ｉｏ化的 （１１）糖の利用 Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース
、Ｄ−ソルビット、マルトース、サッカロース、ラクト
ース、トレハロース、マンニトール、グリセロール、サ
リシン、デキストリン、セルロース、ラフィノース、イ
ノシン、セロビオース、デンプン及びα−メチルグルコ
シドを、いずれも利用し、いずれも酸の生成が認められ
た。この際、いずれもガスの生成は、認められなかつた
。

以上の諸知見に基づき、バーシーズの同定基準や飯塚ら
の報告（ジャーナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプ
ライド・マイクロバイオロジー、第９巻、第７３及び８
３頁、１９６３年）によって分類すると、アルカリゲネ
ス属に属することが認められる。

本菌株と同様にリパーゼを産生ずる菌株としては、前記
した通り、特公昭５８−３６９５３号に記載のアルカリ
ゲネス・８糖ＰＬ−２６６号（比較菌株間１）、特公昭
４９−３２０８０号に記載のアクロモバクタ−・名糖−
ＡＬ−８６５号（比較菌株Ｎα２）、特公昭４４−１０
７５４号に記載のシュードモナス・ステウラエリ（比較
菌株間３）、特開昭４８−８８２７８号に記載のシュー
ドモナス・フラッジ（比較菌株Ｎｎ４）、特公昭５０−
２５５５３号に記載のシュードモナス・メフイテイカ・
バリエタス・リボリテイ力（比較菌株ＮＱ５）をそれぞ
れ挙げることができるが、下記第６表に示す各菌株の生
理学的性質の相違から明らかな通り、本菌株はこれらの
菌株と明確に区別される。

以上の通り、アルカリゲネス属に属するｆ−８−２４株
は、明らかに公知の菌株と区別され、アルカリゲネス属
の新菌株と認められる。本発明において用いる菌株とし
ては、アルカリゲネス属に属するｆ−８−２４株自体の
みでなく、例えば該株の自然的及び人工的変異株のいず
れも包含されることは勿論である。

次に、本発明リパーゼ産生菌の培養及びリパーゼの回収
について述べる。

培地の組成については、通常の微生物により用いられる
もので本国により利用可能なものをいずれも使用できる
。炭素源としては、例えばブドウ糖、麦芽糖、デンプン
、デキストリン等が挙げられ、又窒素源としては、例え
ば大豆粉、脱脂大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンステイープリカー等が挙げられる。また、通
常、無機塩類、例えばリン酸カリウム、リン酸マグネシ
ウム、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等を培地に添加する。そして、更に必要に応じて
、菌の生育あるいはＭ素生産に必要な各種の有機物、無
機物、消泡剤等を培地に添加することができ・る。特に
、リパーゼの生産を：Ａ導する見地から、オリーブ油、
ナタネ油、大豆油、ヤシ油、トウモロコシ油、魚油等の
各種油脂を添加するのが好ましい。好ましい基本培地と
して、例えばペプトン、酵母エキス、リン酸１カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウムを含む培地に種々
の油脂を添加したものを挙げることができる。

培養は、上記成分を含む培地を通常の方法で滅菌し、本
閑を接種して行なわれる。培養は好気的条件下で行なう
のが良く、培養温度は通常２０〜４０℃程度が適当で、
特に２８〜３０℃程度が好ましい。培養時間は通常１〜
５日程度とするのが適当で、リパーゼ活性は通常４０〜
６０時間程度で最高に達する。

培養液中に分泌、番積されたリパーゼを回収する際の分
離、精製は、常法に従って実施できる。

例えば、培養終了後、遠心分離等により菌体を除去した
後上澄液を硫酸アンモニウム等の塩類で塩析し、これに
セライトを加える。沈澱濾過物を冷アセトンにて脱脂後
、緩衝液により抽出し、透析により脱塩して粗製酵素が
得られる。更にこの粗製酵素は、当分野公知の分離、精
製手段、例えばイオン交換体、ゲル濾過剤、吸着剤等を
適宜に用いてＮ製することができる。このようにして本
発明リパーゼを精製することができるが、本酵素の製造
については後記の実施例で更に具体的に説明する。

発明の効果 本発明によれば、とマシ油を効率良く分解する新規リパ
ーゼ、該リパーゼ産生微生物を培養して容易にリパーゼ
を製造できる方法、及び該微生物が提供されるという顕
著な効果が得られる。また、これにより、リシノール酸
を容易に製造することができ、ひいてはヒマシ油の幅広
い有効利用が可能となる。

実施例 以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する
。

実施例１ オリーブ油２重量％、ペプトン４重量％、Ｆｓ母母字キ
ス００５ｆｌｉｆｆ１％、リン酸１カリウム０．１重量
％、硫酸マグネシウム０．０２重量％及び塩化ナトリウ
ム０．１ｆｆｉ量％を含む液体培地１００−１を５００
１容の坂ロフラスコに入れ、１１０℃で２０分間滅菌し
た後、予め１６時間３０℃で前培養しておいたアルカリ
ゲネス属ｆ−８−２４株（微工研菌寄第９７１５号）の
菌体を５−１接種し、３０℃で、毎分１２０回、振幅７
０−の往復娠盪培養機で培養した。リパーゼ活性がピー
クに達する４８時間で培養を止めた。この培養液のリパ
ーゼ活性は、１０５Ｕ／ａｌであった。また、その比活
性は、６Ｕ／１ｆ１００２３０であった。

培養終了後、培養液を１２０００ｒｐｍで２０分間遠心
分離して菌体を除き上澄液を得た。この上澄液を０．６
硫酸アンモニウム飽和とし、これにセライトを入れ沈澱
濾過物を冷アセトンで脱脂後、２０１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ６，９）にて抽出した。この粗製酵素液のリ
パーゼ活性は、４５５ＬＩ／ｍｌであった。また、その
比活性は、１１４　Ｕ／ｍ１１０Ｄ２８（、であった。

この粗製酸素液を透析後、ＤＥＡＥ−セルロース（ブラ
ウン社製）にて処理し非吸着部分に含まれる酵素を得た
ところ、リパーゼ活性は、１９８Ｕ／ｍｌであった。ま
た、その比活性は、２２１ＬＪ／■１１０Ｄ２８ｏであ
った。更に、２０１Ｎトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３
）に透析し、ＤＥＡ［−トヨバール６５０Ｍ（東ソー■
製）に吸着させ、ＮａＣｌグラジェント（０→０．２Ｍ
）で溶出させると、塩Ｓ度５０―Ｈのところにシングル
ピークが現れ、活性が認められた。リパーゼ活性は、２
９３Ｕ／−１であった。

また、その比活性は、２４３７　Ｕ／ｍ１１００２Ｂ。

であった。

得られたリパーゼは、ポリアクリルアミドゲル及び５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルを用いたディスク電気泳動
において、何れも単一バンドを示した。

実施例２ 実施例１の培地のオリーブ油２重量％に代え、ナタネ油
１重量％を用いて実施例１と同様に培養を行なった。リ
パーゼ活性のピークは５６時間になった。５６時間培養
後のリパーゼ活性は、１０４Ｕ／ｉ＋ｌであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明リパーゼの活性とｐＨの関係を示すグ
ラフである。第２図は、本発明リパーゼのｐＨ安定性を
示すグラフである。第′３図は、本発明リパーゼの活性
と温度の関係を示すグラフである。第４図は、本発明リ
パーゼの温度安定性を示すグラフである。各図において
、口はクエン酸！１１！ｉ液を、Ｏはリン酸緩衝液を、
・はグリシン緩衝液をそれぞれ用いて測定したことを示
す。 （以　上） 代理人　弁理士　三　枝　英　−り り・ 一一 第１図 リパーセ゛活性とｐＨ−１ｆ１保 ｐＨ 第２図 リパーゼｃｒ＞ｐＨ９定性 ｐＨ 第３図 リパーセ゛Ｓｇａ１逼痕。閲イ釆 温　１陀　（°Ｃ） 第４図 リパーセ゛のミｌ、度テ足姓 ＳＬ　　Ｒ（”Ｃ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量が約３００００（ゲル濾過法による）であ
   り、至適ｐＨがｐＨ７．０付近であり、且つオリーブ油
   を基質とした際の活性を１００％としたときの、ヒマシ
   油を基質とした相対活性が１０７％であることを特徴と
   する新規リパーゼ。
2. （２）請求項１記載のリパーゼを生産するアルカリゲネ
   ス属に属する微生物を培地に培養し、培養液中に該リパ
   ーゼを蓄積させ、これを採取することを特徴とする該リ
   パーゼの製造法。
3. （３）微生物がアルカリゲネス属ｆ−Ｂ−２４（微工研
   菌寄第９７１５号）である請求項２記載の製造法。
4. （４）アルカリゲネス属に属し、請求項１記載のリパー
   ゼ産生能を有することを特徴とする微生物。
5. （５）アルカリゲネス属ｆ−Ｂ−２４（微工研菌寄第９
   ７１５号）である請求項４記載の微生物。