JPS6219081A - 耐熱性α−アミラ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、好熱嫌気性細菌を用いて新規なα−アミラー
ゼを製造する方法に係り、特に、好熱嫌気性細菌を培養
する際の培養基質の炭素源に関するものである。

〔発明の背景〕

耐熱性酵素は常温用酵素に比べ、加熱やｐ　Ｔ（の変化
にも安定性が高く、酵素利用工業には極めて有用である
。従来のα−アミラーゼは好気性細菌を起源とするもの
に限られている（嶋村等：特公昭４６−１２９４６号公
報）。上記の好気性細菌の中でチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　　及びバチルス
・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ
ｆｏｒｍｌｓ　）を起源とするα−アミラーゼは、すで
に工業生産され、殿粉加工や繊維ののり抜きに使用され
ている。これら公知のα−アミラーゼは、いずれも酵素
本体のたん白質だけでは耐熱性を発揮できず、カルシウ
ムイオンの存在下ではじめて耐熱性を示す。通常数ｍＭ
〜２０ｍＭ（版部：特開昭５１−４４６５２号公報、特
開昭５１−４４６９０号公報）、少なくとも１ｍＭ（斉
藤：特開昭４８−３５０８３号公報）のカルシウム濃度
を必要とする。

本発明者等は、耐熱性にすぐれ、かつカルシウム要求性
の低いα−アミラーゼを得ることを目的に酵素及び酵素
生産用微生物の探索を行った。その結果、クロスツリジ
ウム属に属する偏性嫌気性細菌（クロスツリジウム属細
菌ＲＳ　−０００１゜ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ　
ＲＳ　−０００１，微工研菌寄第７９１８号）が、酵素
の特性、特にカルシウム要求性ならびに作用ｐＨ域が従
来のα−アミラーゼと全く異なる新規な耐熱性α−アミ
ラーゼを生成することを見い出した。

α−アミラー・ゼの製造は、（ｉ）殿粉、デキストリン
等を炭素源として用いて細菌を培養し、培養液中にα−
アミラーゼを分泌させる。（ｉｉ　）培養液中からα−
アミラーゼを回収・精製する。といった工程に従って行
われる。このため、α−アミラーゼを効率的に生産する
には、培養液中に効率よくα−アミラーゼを分泌せしめ
ることが必要である。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、好熱嫌気性細菌の産生ずる、耐熱性に
優れ、かつカルシウム要求性の低い新規なα−アミラー
ゼを培養液中に多量に分泌させることができる、好熱性
嫌気性細菌のための培養用炭素源を提供することにある
。

〔発明の概要〕

本発明者らは、耐熱性にすぐれ、かつカルシウム要求性
の低い新しいタイプのα−アミラーゼを得ることを目指
し、酵素生産用微生物の探索を行った。その結果、クロ
スッリジウム属に属する好熱性嫌気性細菌（クロスッリ
ジウム属細菌Ｒ８−０００１、Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕＩ
Ｉｌｓｐ、　ＲＳ　−０００１、微工研菌寄第７９１８
号）が上記の要件を満たす新規な耐熱性α一アミラーゼ
を生成することを見い出した。そして、本菌を用いてα
−アミラーゼの効率的な生産方法につき鋭意研究した結
果、本発明に至った。

本発明の特徴は、クロスツリジウム属に属する細菌を培
養する際に用いる培養基中に、炭素源としてマルトース
を用いることにある。マルトースを炭素源として用いる
ことにより、殿粉やデキストリンを用いた場合に比べ、
培養液中に分泌されるα−アミラーゼ量は約２倍にも達
する。また、マルトースは、炭素源として単独で用いる
場合のみならず、殿粉もしくは可溶性殿粉とマルトース
とを混合して用いた場合にも、α−アミラーゼの分泌を
促進する。すなわち、殿粉もしくは、可溶性殿粉もしく
はデキストリンを単一で炭素源として用いた場合に比べ
、多量のα−アミラーゼを培養液中に分泌させる。

なお、マルトースと同様に、グルコース２分子の縮合物
であるイソマルトースの場合には、上記のような、α−
アミラーゼ産生促進効果は認められない。

培養液中に分泌されたα−アミラーゼは、殿粉粒子等へ
の吸着法、硫酸アンモニウム塩による塩析法、分子ふる
い膜による濾過法、分子ふるいクロマト、イオン交換液
体クロマト法等、従来よりα−アミラーゼ精製法として
公知の手法により分離、精製したのち、製品化される。

本発明に用いるα−アミラーゼを産生ずるクロスツリジ
ウム属を属する細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐＲ
Ｓ−０００１）は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託している（受託番号；微工研菌寄第７９１８号（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７９１８））である。まず、本菌の菌学的性
質の詳細を説明する。

Ａ、形態的性質 （１）栄養細胞の形態 下記の殿粉・ペプトン培地の寒天平板上、嫌気性雰囲気
中、６０℃で２日間培養した場合、栄養細胞は０．４〜
０．８Ｘ２〜５μｍの大きさの直状の桿菌である。３日
間以上の培養では、上記の形状の栄養細胞が単独に存在
する他、連鎖するものも生ずる。液体培養でも同様とな
る。

殿粉・ペプトン培地の組成 可溶性殿粉　　　　　　　　　１．５％ペプトン　　　
　　　　　　０・５％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．５％ＫＨ，ＰＯ４０
，７％ Ｎａ２ＨＰ０．　　　　　　　　０．３５％Ｍ　ｇ　Ｓ
　Ｏ−・７　Ｈ２００−００１％寒天　　　　　　　　
　　　　２．０％チオグリコール酸ナトリウム　０．１
％水道水 ｐＨ６，４ （２）胞子の有無 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養及び液体培養で胞子
の形成が認められる。

Ｂ、培養的特性 （１）コロニーの形態 殿粉・ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニーは、中
心部がやや隆起した扁平な円形となり、周縁部は金縁で
ある。色素生成は見られす、表面に光択を有し乳白色不
透明である。また、粘着性を有する。

（２）肉汁培地の寒天平板培養及び穿刺給養生育して殿
粉・ペプトン培地と同様のコロニーを生ずる。

肉汁寒天培地組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　　
０．２％チオグリコール酸ナトリウム　０．１％寒天　
　　　　　　　　　　　１．５％蒸留水 ｐＨ６，０ （３）肉汁培地の穿刺培養 水素と炭酸ガスを含むガスの発生を伴って生育し、この
ため寒天培地が２〜３個所で分断される。

（４）肉汁液体培養 嫌気的雰囲気下でのみ生育し、培養液が自濁する。

肉汁培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　　
０．２％チオグリコール酸ナトリウム　０．１％蒸留水 ｐ　Ｈ６、０ （５）肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。

肉汁・ゼラチン培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　　
０．２％ゼラチン　　　　　　　　　１５　　％チオグ
リコール酸ナトリウム　０．１％蒸留水 ｐＨ６，０ （６）リドマスミルク培養 ガス発生を伴い、固く凝固し、酸の生成により赤変する
。

Ｃ０生理的性質 （１）生育の温度範囲 ４０〜６３℃で生育する。３０℃では生育認められず、
６０℃付近で良好。

（２）生育のＰＨ範囲 ｐＨ５〜７゜５．６付近が良好。

（３）酸素に対する態度 偏性嫌気性 （４）〇−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌａｊ、ｆｓｏｎ変法
）空気雰囲気中では生育みられず陰性。流動パラフィン
重層による嫌気性条件下では菌が生育し、酸を生成して
培養液が黄色となる。

培地組成 ペプトン　　　　　　　　　　０．２％グルコース　　
　　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　
　０．５％に２ＨＰＯ４０，０３％ チオグリコール酸ナトリウム　０．１％ブロムクレゾー
ルパープル　　０．００２％寒天　　　　　　　　　　
　　０．３％蒸留水 ｐ　Ｈ６、０ （５）硝酸塩の還元 陰性。

（６）ＶＰテスト 陰性。

（７）ＭＲテスト 陽性、赤変化する。

（８）インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（９）硫化水素の生成 陰性（Ｋｌｉｇｒｅｒの培地使用において）。

（１０）殿粉の加水分解 陽性。可溶性殿粉だけでなく、馬鈴薯殿粉なと粒状殿粉
も分解する。

（１１）クエン酸の利用 陰性（Ｓｉｍｎ＋ｏｎｓ培地使用において）。

（１２）アンモニウム塩の利用 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（１３）色素の菌体外生成 陰性。

（１４）ウレアーゼ 陰性。

（１５）オキシダーゼ活性 陰性。

（１６）カタラーゼ活性 陰性。

（１７）糖の資化性 糖の資化性及びダラーム管を用いたガス発生有無のｍｅ
結果を下表に示す。

第　　　１　　　表 （Ｉ８）無機塩培地への生育 生育認められず。

（１９）有機酸の生成 各種培地から生成する有機酸組成を第２表に示す。

第　　　２　　　表 供試液体培地の組成 炭素源　　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　　　　　　　　
０．２％チオグリコール酸ナトリウム　０．１ 蒸留水 ｐＨ６，４ これらの結果よりホルトマン（Ｈｏｌｄｅｍａｎ　）の
嫌気性細菌分類マニュアルに基づき、クロスツリジウム
属に属する細菌と同定した。

尚、α−アミラーゼ活性の測定方法は次のように行った
。

ブルーバリュー法（Ｂｌｕｅ　ｖａｌｕｅ法）（日本化
学会編：実験化学講座２４巻、生物化学■、ｐ２７９、
丸善書店、１９６９）による糊精化力を測定した。本法
は、殿粉の分子が加水分解されるのに伴い、殿粉−より
素複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）　　に基づく青色の発色量
が、分子量の低下に比例して減少する原理を応用したも
のである。まず、２　ｍｇ／ｍ　Ｑの殿粉溶液２ｍＡ及
び０．１Ｍ＜えん酸緩衝液（ｐＨ４，０）　１ｍΩを試
験管に取り、６０℃水浴中で５分間振盪した。次いで、
粗酸素液として培養炉液１ｍρを加え、３０分間反応さ
せた。反応後、反応液０．４ｍＱを採取し、直ちに０．
５Ｍ酢酸溶液２　ｍ　Ｑと混合して酵素反応を停止させ
た。次のその１ｍｆｌを１０ｍ（ｌの１　／３００ＯＮ
よう素溶液中に加え、６８０ｎｍでの吸光度を分光光度
計を用いて測定した。

一方、酵素液を加えた直後の反応液（以下０１反応液と
略称する）を採取して同様に発色させ、吸光度を測定し
た。なお、殿粉としては重合度約２０００のアミロース
を用いた。

α−アミラーゼ活性は次式により算出した。

α−アミラーゼ活性（単位）＝ Ｏｔ反応液の吸光度 〔発明の実施例〕 以下、本発明の実施例を示し、詳しく説明する。

実施例１ 酵素エキス０．５％、ポリペプトン０．５％、リン酸第
１カリウム０．７％、リン酸第２ナトリウム０．２％、
硫酸マグネシウム・７水和塩ｏ、ｏｏｔ％、チオグリコ
ール酸ナトリウム０．１％、炭素源としてマルトース２
％、及び水道水を含む液体培地（ｐ　Ｈ６，０）　２．
７　ｋｇを、内容積５Ｑの培養槽に入れ、１２０℃で１
０分殺菌した。これに、同上培地にて嫌気的に培養した
クロスツリジウム属細菌の菌体懸濁液０．３　ｋｇを添
加した。次いで、ガス出口に水封トラップを付し、培養
槽内気相部をアルゴンで十分置換後、嫌気条件下で培養
した。培養液のＰＨは６．０に自動調整し、温度も６０
℃に自動調整した。培養中、一定時間毎に槽内の培養液
の一部を採取し、３５００　ｐ　ｐ　ｍで遠心分離し、
０．２μｍのフィルタで濾過して除菌したのち、液中の
α−アミラーゼ活性を測定した。その結果、第１図中の
曲線１で示すように、培養開始後１６時間で最大６１単
位／　ｍ　Ｑのα−アミラーゼを産生じた。

比較例１ 実施例１において、炭素源として馬鈴薯殿粉２％を用い
、実施例１と同じ要領で培養試験を実施した。α−アミ
ラーゼの産生量を測定した結果、曲線２に示すように、
培養開始後４４時間後に２８単位／　ｍ　Ｑであった。

比較例２ 実施例１において、炭素源として可溶性殿粉２％を用い
、実施例１と同じ要領で培養試験を実施した。α−アミ
ラーゼの産生量を測定した結果、曲線３に示すように培
養開始後４０時間で３０単位／ｍＱであった。

比較例３ 実施例１において、炭素源としてデキストリン２％を用
い、実施例１の要領で培養試験を実施した。α−アミラ
ーゼの産生量を測定したところ、曲線４に示すように、
培養開始３８時間で３０単位／　ｍ　Ｑであった。

比較例４ 実施例１において、炭素源としてグルコースを用い、実
施例１の要領で培養試験を実施した。α−アミラーゼの
産生量を測定した結果、曲線５に示すように、培養開始
６０時間後に６単位／　ｍ　Ｑであった。

比較例５ 実施例１において、炭素源としてイソマルトースを用い
、実施例１の要領で培養試験を実施した。

α−アミラーゼ産生量を測定した結果、曲線６に示すよ
うに、培養開始６０時間後に１５単位／ｍＱであった。

実施例１と比較例１〜５を比較することにより、マルト
ースを基質として用いることにより、短時間の培養で高
濃度のα−アミラーゼを生産せしめ得ることが解る。

実施例２ 実施例１において、炭素源として、殿粉１．５％及びマ
ルトース０．５％を加えて培養試験を実施した。α−ア
ミラーゼ産生量は、第２図の曲線１１に示すように培養
開始４６時間後に５２単位／ｍＤまで達した。

実施例３ 実施例１において、炭素源として、可溶性殿粉１．５％
及びマルトース０．５％を加えて培養試験を実施した、
α−アミラーゼ産生量は曲線１２に示すように、培養開
始４５時間後に５６単位／　ｍ　Ｑまで達した。

実施例４ 実施例］において、炭素源としてデキストリン１．５％
及びマルトース０．５％を加えて培養試験を実施した。

α−アミラーゼ産生量は曲線１３に示すように、培養開
始４１時間後に５８単位／　ｍ　Ｑまで達した。

実施例２と比較例２とを比較し、実施例３と比較例３と
を比較し、実施例４と比較例４とを比較すると、マルト
ースを単独で炭素源として用いる場合のみならず、馬鈴
薯殿粉、可溶性殿粉、デキストリンのそれぞれと混合し
て用いることにより、これらそれぞれを単独で用いた場
合に比べ、α−アミラーゼ産生量が増加することがわか
る。

実施例５ 馬鈴薯殿粉２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０
．５％、リン酸第１カリウム０．７％、リン酸第２ナト
リウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．００
１％、チオグリコール酸ナトリウム０．１％及び水道水
を含む液体培地（ｐ　Ｈ６，０）　２．７　ｋｇに９０
℃、５分間の熱処理を施したのち、６０℃まで冷却した
。次いで、これにβ−アミラーゼ１０００単位を加え、
６０℃ｗｐＨ６，０で１時間反応させた。１時間後、反
応液中には０．５４％のマルトースが含まれていた。次
いで、これを内容積５Ｑの培養槽に入れ、１２０℃で１
０分間、高圧蒸気殺菌を行った。以下、実施例１と同じ
要領により培養試験を行ったところ、培養開始後３８時
間で５６単位／ｍＱのα−アミラーゼを産生じた。

培養終了後、４℃まで冷却したのち、７０００ｒｐｍの
遠心分離により菌体を除去した。次いで、ポアサイズ０
．４５μｍのフィルタで培養液の清澄化を行い、培養済
液２．８　ｋｇを得た。次に、４℃に冷却下、とうもろ
こし殿粉１５０ｇを添加し、１０分間攪拌下で接触させ
たのち、遠心が過を行い、とうもろこし殿粉を回収した
。回収した殿粉に４℃に冷却した純水ＩＱを加え、殿粉
の洗浄を行った。次いで、６５℃に加熱した純水０．８
Ｑに上記のどうもろこし殿粉を入れてα−アミラーゼの
脱着を行った。ついで直ちに遠心濾過器を用いて、殿粉
粒子を除去し、α−アミラーゼ液０．７５　Ｑを得た。

α−アミラーゼ液は分子ふるい膜（分画分子量２万）を
用いて濃縮したのち凍結乾燥し、α−アミラーゼ標品１
５　ｍ　ｇを得た。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、クロスッリジウム属の好熱性嫌気
性細菌を用いて耐熱性α−アミラーゼを生産する場合、
本発明を適用して、培養基中に、炭素源としてグルコー
ス残基が２個以上のグルコース多量体を混合して用いる
ことにより、耐熱性に優れ、かつカルシウム要求量の低
いα−アミラーゼを培養液中に多量に分泌せしめること
ができるという優れた実用的効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、それぞれ、本発明方法の実施例に
おける効果を説明するための図表である。 １．１１，１２，１３・・・本発明の実施例におけるα
−アミラーゼ活性の時間に伴う変化を示すカーブ、２，
３，４．５．６・・・比較例１コむけろα−アミラーゼ
活性の時間に伴う変化を示すカーブ。 代理人　弁理Ｉ：　秋本１［：実 来１図 １さｉ！ｕ〒間（ｈ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クロスツリジウム属に属する好熱性嫌気性細菌を用
   いて耐熱性α−アミラーゼを生産する場合、前記の好熱
   嫌気性細菌を培養する培養基質中に、炭素源としてグル
   コース残基が２個以上のグルコース多量体を混合して用
   いることを特徴とする耐熱性α−アミラーゼの製造方法
   。 ２、前記のグルコース多量体は、２種以上のグルコース
   多量体を混合して用いるものであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の耐熱性α−アミラーゼの製
   造方法。 ３、前記のグルコース多量体はグルコース２量体のマル
   トースであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の耐熱性α−アミラーゼの製造方法。 ４、前記のグルコース多量体はマルトースであり、かつ
   、これを殿粉と混合して用いるものであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の耐熱性α−アミラー
   ゼの製造方法。 ５、前記の炭素源は、殿粉を主たる炭素源とするととも
   に、従たる炭素源としてマルトースを混合したものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の耐熱
   性α−アミラーゼの製造方法。