JPH01191684A - ウレアーゼの製造法 - Google Patents
ウレアーゼの製造法Info
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- JPH01191684A JPH01191684A JP63014705A JP1470588A JPH01191684A JP H01191684 A JPH01191684 A JP H01191684A JP 63014705 A JP63014705 A JP 63014705A JP 1470588 A JP1470588 A JP 1470588A JP H01191684 A JPH01191684 A JP H01191684A
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- JP
- Japan
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- urease
- urea
- culture
- ethanol
- sake
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（発明の目的）
本発明は、酒類又は酒類のもろみ中に含まれ、酒質の劣
化の原因となる尿素を分解するためのウレアーゼの製造
法に関するものである。
化の原因となる尿素を分解するためのウレアーゼの製造
法に関するものである。
（従来の技術及び問題点）
酒類及び発酵食品は、発酵に関与する酵母及び糸状菌の
代謝生産物として尿素が含まれている。
代謝生産物として尿素が含まれている。
例えば、清酒中には数ｐｐｍから５０ｐｐｍ程度の尿素
が含まれている。尿素が多くなるような発酵条件で製造
した清酒は苦味や（４）味が多く、貯蔵熟成中に着色し
やすく、老香（ひねか）も発生しやすい。
が含まれている。尿素が多くなるような発酵条件で製造
した清酒は苦味や（４）味が多く、貯蔵熟成中に着色し
やすく、老香（ひねか）も発生しやすい。
また、酒類中から発がン性物質とされているカルバミン
酸エチルが検出されている（Ｊ、Ａｇｒｉｃ。
酸エチルが検出されている（Ｊ、Ａｇｒｉｃ。
Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ、、２４．３２３（１９７６））
。カルバミン酸エチルの生ｒ＆系路の一つとして、酒類
中の尿素とエタノールから非酵素的に生成する系が考え
られている。
。カルバミン酸エチルの生ｒ＆系路の一つとして、酒類
中の尿素とエタノールから非酵素的に生成する系が考え
られている。
酒質の安定化のため、尿素を酒類から除去する手段とし
て発明者らの一人はウレアーゼ活性を有する酵素剤を酒
類に添加する方法を発明した（特許公告 昭５６−２０
８３０ ）。通常、ウレアーゼの多くは中性〜微アルカ
リ性に反応至適ｐＨをもち、酒類やもろみのような酸性
かつアルコール存在下ではほとんど活性を示さず、しか
も不安定であることが知られている（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、 ７３゜１８５（１９７７）、Ｔｈｅ
Ｅｎｚｙｍｅｓ ３ｒｃｌ ｅｄ、４．１（１９７１）
）。
て発明者らの一人はウレアーゼ活性を有する酵素剤を酒
類に添加する方法を発明した（特許公告 昭５６−２０
８３０ ）。通常、ウレアーゼの多くは中性〜微アルカ
リ性に反応至適ｐＨをもち、酒類やもろみのような酸性
かつアルコール存在下ではほとんど活性を示さず、しか
も不安定であることが知られている（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、、 ７３゜１８５（１９７７）、Ｔｈｅ
Ｅｎｚｙｍｅｓ ３ｒｃｌ ｅｄ、４．１（１９７１）
）。
酸性領域に反応至適ｐＨをもつウレアーゼとしてラクト
バチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の生成するウレアーゼが知られ
ている（八ｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、、３７，３７９（１９７９））。
バチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の生成するウレアーゼが知られ
ている（八ｐｐ１．Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、、３７，３７９（１９７９））。
しかし、本菌は嫌気性菌であり、培養効率は著しく悪く
、また、耐熱性であるため、清酒の火入れ後もその活性
が残存することが問題である。
、また、耐熱性であるため、清酒の火入れ後もその活性
が残存することが問題である。
（問題点を解決するための手段）
そこで、本発明者らは、酒類に使用するに適するウレア
ーゼの特性として、下記の条件を設定し、それに適する
ウレアーゼを生産する微生物を広く自然界より検索した
。
ーゼの特性として、下記の条件を設定し、それに適する
ウレアーゼを生産する微生物を広く自然界より検索した
。
本発明の目的とする微生物の条件
■ 酸性領域のｐｉｔで活性を示すウレアーゼを生産す
る。
る。
■・ 高濃度アルコール存在下で活性を示すウレアーゼ
を生産する。
を生産する。
■ 培養効率のよい好気性菌である。
■ 微生物の生産したウレアーゼは反応終了後速やかに
失活する性質を有する。
失活する性質を有する。
なお、前記■の条件は、尿路に感染した細菌のウレアー
ゼの作用で生じたアンモニアが尿道結石の原因の一つで
ある（家放楡研究Ｎｏ、 ４ 、３ （１９８５））と
いわれていることから、酒類に添加したウレアーゼ活性
は目的の反応が終了後、火入れ等により容易に失活する
ことが実用上望ましい。
ゼの作用で生じたアンモニアが尿道結石の原因の一つで
ある（家放楡研究Ｎｏ、 ４ 、３ （１９８５））と
いわれていることから、酒類に添加したウレアーゼ活性
は目的の反応が終了後、火入れ等により容易に失活する
ことが実用上望ましい。
以上の条件を満たす菌株として、シュードモナス属に属
する一菌株（Ｕ２８３８）が岡山類の土壌から分離され
た。本菌株を液体培養又は固体培養し、生産されたウレ
アーゼを必要に応じ精製して酒類中の尿素を分解除去す
るための醇素剤として利用することができる。本菌株は
徽工研菌寄第９７９３号（ＦＥＲＭ Ｐ−９７９３）
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
する一菌株（Ｕ２８３８）が岡山類の土壌から分離され
た。本菌株を液体培養又は固体培養し、生産されたウレ
アーゼを必要に応じ精製して酒類中の尿素を分解除去す
るための醇素剤として利用することができる。本菌株は
徽工研菌寄第９７９３号（ＦＥＲＭ Ｐ−９７９３）
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
本発明の菌株の菌学的性質の検討には微生物の分類と同
定下巻（長谷用武治編著、学会出版センター）、医学細
菌同定の手びき（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ ５ｔｅｅｌ著、
坂崎利−訳、近代出版）及び新細菌培地学講座・上（坂
崎利−著、近代出版）に記載されている方法及び培地組
成を用いた。
定下巻（長谷用武治編著、学会出版センター）、医学細
菌同定の手びき（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ ５ｔｅｅｌ著、
坂崎利−訳、近代出版）及び新細菌培地学講座・上（坂
崎利−著、近代出版）に記載されている方法及び培地組
成を用いた。
Ａ、形 態
（１）細胞の形：桿菌
（２）細胞の大きさ ＝０．５〜０．８ ミクロン×１
．５〜４．０ ミクロン （３）細胞の多形性の有無：なし く４）運動性：あり （５）鞭毛の着生状態：極鞭毛 （６）胞子の有無二なし く７）ダラム染色性：陰性 （８）抗酸性：なし Ｂ、各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養： コロニーの生育状況は適度
、形状は円形、隆起は突円状、周縁は金縁、色状は淡褐
色。
．５〜４．０ ミクロン （３）細胞の多形性の有無：なし く４）運動性：あり （５）鞭毛の着生状態：極鞭毛 （６）胞子の有無二なし く７）ダラム染色性：陰性 （８）抗酸性：なし Ｂ、各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養： コロニーの生育状況は適度
、形状は円形、隆起は突円状、周縁は金縁、色状は淡褐
色。
（２）肉汁寒天斜面培養： 生育状態は適度、表面の状
態は円滑、色状は淡褐色、光沢は半透明、形状は糸状。
態は円滑、色状は淡褐色、光沢は半透明、形状は糸状。
（３）肉汁液体培養： 混濁の程度は適度、液面の生育
は票状、沈殿を生じる。
は票状、沈殿を生じる。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 液化せず（５） リ
ドマス・ミルク ： リドマスを還元する。
ドマス・ミルク ： リドマスを還元する。
Ｃ０生理学的性質
（１）硝酸塩の還元ニー
（２）脱窒反応ニー
（３）ＭＲテスト ニー
（４）〜“Ｐテスト ニー
（５） インドールの生成ニー
（６）硫化水素の生成ニー
（７）デンプンの加水分解ニー
（８） クエン酸の利用Ｋｏｓｅｒの培地：十（９）
ｔｔ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培
地：＋（１０）硝酸塩の利用：＋ （１１）アンモニウム塩の利用：＋ （１２）色素の生成：水溶性蛍光色素生成あり（シュー
ドモナス Ｐ 寒天培地） （１３）ウレアーゼ：＋ （１４）オキシダーゼ：十 （１５）カタラーゼ：＋ （１６）生育できるｐＨ範囲＝５〜９ （１７）生育限界最高温度：３３℃ （１８） ４℃における生育：＋ （１９）酸素に対する態度：好気性 （２０）Ｏ−Ｆテスト 二才キシデイテイブ（２１）糖
から酸及びガスの生成 糖 類 酸 〃ス■Ｌ−７ラ
ビノース 十 − ■Ｄ−キシロース ＋ − ■Ｄ−グルコース ＋ − ■Ｄ−マンノース 十 − ■Ｄ−７ラクトース 十 − ■Ｄ−ｆ７ラクトース 十 −■麦芽糖
十 − ■シヨ糖 十 − ■乳糖 十 − ［相］ トレハロース 十 −■Ｄ−ソル
ビット − − ＠Ｄ−マンニット 十 − ■イノシフト −− ■グリセリン 十 − ■デンプン −− （２２）カゼインの分解ニー 以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株 Ｕ２８３８株
の分類学的地位をパージエイズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイテブバクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版に基づいて検索した結
果、この菌株は■グラム陰性桿菌、■極鞭毛を有し、運
動性がある、■好気性、■カタラーゼ及びオキシダーゼ
陽性、■グルコースを酸化的に分解することから、シュ
ードモナス （Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）属に含まれ
る細菌であると考えられる。
ｔｔ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培
地：＋（１０）硝酸塩の利用：＋ （１１）アンモニウム塩の利用：＋ （１２）色素の生成：水溶性蛍光色素生成あり（シュー
ドモナス Ｐ 寒天培地） （１３）ウレアーゼ：＋ （１４）オキシダーゼ：十 （１５）カタラーゼ：＋ （１６）生育できるｐＨ範囲＝５〜９ （１７）生育限界最高温度：３３℃ （１８） ４℃における生育：＋ （１９）酸素に対する態度：好気性 （２０）Ｏ−Ｆテスト 二才キシデイテイブ（２１）糖
から酸及びガスの生成 糖 類 酸 〃ス■Ｌ−７ラ
ビノース 十 − ■Ｄ−キシロース ＋ − ■Ｄ−グルコース ＋ − ■Ｄ−マンノース 十 − ■Ｄ−７ラクトース 十 − ■Ｄ−ｆ７ラクトース 十 −■麦芽糖
十 − ■シヨ糖 十 − ■乳糖 十 − ［相］ トレハロース 十 −■Ｄ−ソル
ビット − − ＠Ｄ−マンニット 十 − ■イノシフト −− ■グリセリン 十 − ■デンプン −− （２２）カゼインの分解ニー 以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株 Ｕ２８３８株
の分類学的地位をパージエイズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイテブバクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版に基づいて検索した結
果、この菌株は■グラム陰性桿菌、■極鞭毛を有し、運
動性がある、■好気性、■カタラーゼ及びオキシダーゼ
陽性、■グルコースを酸化的に分解することから、シュ
ードモナス （Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）属に含まれ
る細菌であると考えられる。
本菌株の培養は通常行われている通気攪拌培養、振どう
培養、静置培養などの液体培養法もしくは固体培養法を
用いて行うことができる。
培養、静置培養などの液体培養法もしくは固体培養法を
用いて行うことができる。
培地組成としては、炭素源としてグルコース、シュクロ
ース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵母エキ
ス、尿素、硫安など、無機塩としＦｅ”、Ｃｏ２＋、Ｍ
ｎ２＋、Ｍｏ６＋などの微量金属やパントテン酸、ビオ
チン、チアミン、ビタミン８１２などのビタミン、メチ
オニン、シスチン、トリプト７７ン、アルギニン、ヒス
チジンなどのアミノ酸、ＥＤＴＡなとのキレート剤を適
宜加えたものを用いるが、通常の培養にはブイヨンなど
の天然培地が簡便である。培地のｐＨは、５．５〜７．
８の開でウレアーゼの生産にほとんど影響しないが、や
や酸性側の方が望ましい。培養温度は生育できる範囲な
らとくに限定されないが、３０℃付近か３０℃よりもや
や低めの温度が望ましい。培養はいずれの培養法におい
ても５〜７２時間行う。
ース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵母エキ
ス、尿素、硫安など、無機塩としＦｅ”、Ｃｏ２＋、Ｍ
ｎ２＋、Ｍｏ６＋などの微量金属やパントテン酸、ビオ
チン、チアミン、ビタミン８１２などのビタミン、メチ
オニン、シスチン、トリプト７７ン、アルギニン、ヒス
チジンなどのアミノ酸、ＥＤＴＡなとのキレート剤を適
宜加えたものを用いるが、通常の培養にはブイヨンなど
の天然培地が簡便である。培地のｐＨは、５．５〜７．
８の開でウレアーゼの生産にほとんど影響しないが、や
や酸性側の方が望ましい。培養温度は生育できる範囲な
らとくに限定されないが、３０℃付近か３０℃よりもや
や低めの温度が望ましい。培養はいずれの培養法におい
ても５〜７２時間行う。
このような方法で得られた培養物からウレアーゼを採取
するには、はじめに遠心分離法や口過法により培養物を
遠沈上澄と菌体に分画する。得られた菌体をガラスピー
ズ法、フレンチプレス法、堰音波処理法、浸透圧ショッ
ク法、リゾチーム処理、有機溶媒処理、自己溶解法など
を単独あるいは組合せて菌対破砕を行い、菌体残渣を除
去することにより粗酵素標品を得ることができる。
するには、はじめに遠心分離法や口過法により培養物を
遠沈上澄と菌体に分画する。得られた菌体をガラスピー
ズ法、フレンチプレス法、堰音波処理法、浸透圧ショッ
ク法、リゾチーム処理、有機溶媒処理、自己溶解法など
を単独あるいは組合せて菌対破砕を行い、菌体残渣を除
去することにより粗酵素標品を得ることができる。
更に、必要に応じた濃縮標品や精製標品を得るためには
、限外口過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル口過クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、等電点沈殿など周知の精製方法を単独
あるいは組合せて達成することができる。このようにし
て精製された本菌株のウレアーゼの酵素学的性質は以下
のとおりである。
、限外口過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル口過クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、等電点沈殿など周知の精製方法を単独
あるいは組合せて達成することができる。このようにし
て精製された本菌株のウレアーゼの酵素学的性質は以下
のとおりである。
■ 熱安定性
０ 、 Ｉ Ｍ コハク酸緩衝液（ｐＨ４，５）及び２
０％ｌ／Ｖ）エタノール含有０ 、１ Ｍ コハク酸
緩衝液（ｐＨ４，５）中で３０°Ｃ〜７０’Ｃ１１５分
間処理し、各温度における残存活性を測定した。エタノ
ール無添加では４０°Ｃまで安定であったが、エタノー
ル含有条件では温度が上昇するに従って急速に失活し、
４５℃では完全に失活した。（図１）・■ 至適温度 ０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ４，３）及び２０％（Ｖ
／Ｖ ）エタノール含有０．１Ｍ コノ、り酸緩衝液（
ｐＨ４，３）中における至適温度はエタノール無添加で
は４０℃付近、エタノール含有条件では２５°Ｃ付近に
ある。（図２） ■ ｐＨ安定性 ０．１Ｍコハク酸援衝液（ｐＨ３〜７ ）及び２０％（
Ｖ／Ｖ）エタノール含有０ 、１ Ｍ コハク酸緩衝液
（ｐＨ３〜７ ）中で８°Ｃ１２４時間処理後の残存活
性はエタノール無添加ではｐＨｓ付近、エタノール含有
条件ではｐＨ６、５付近が最も安定である。
０％ｌ／Ｖ）エタノール含有０ 、１ Ｍ コハク酸
緩衝液（ｐＨ４，５）中で３０°Ｃ〜７０’Ｃ１１５分
間処理し、各温度における残存活性を測定した。エタノ
ール無添加では４０°Ｃまで安定であったが、エタノー
ル含有条件では温度が上昇するに従って急速に失活し、
４５℃では完全に失活した。（図１）・■ 至適温度 ０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ４，３）及び２０％（Ｖ
／Ｖ ）エタノール含有０．１Ｍ コノ、り酸緩衝液（
ｐＨ４，３）中における至適温度はエタノール無添加で
は４０℃付近、エタノール含有条件では２５°Ｃ付近に
ある。（図２） ■ ｐＨ安定性 ０．１Ｍコハク酸援衝液（ｐＨ３〜７ ）及び２０％（
Ｖ／Ｖ）エタノール含有０ 、１ Ｍ コハク酸緩衝液
（ｐＨ３〜７ ）中で８°Ｃ１２４時間処理後の残存活
性はエタノール無添加ではｐＨｓ付近、エタノール含有
条件ではｐＨ６、５付近が最も安定である。
（図３）
■ 至適度ｐｉ
Ｏ１ＩＭコハク酸緩衝液における至適ｐｕは、エタ７−
ル無添２０％エタノール含有の両条件下、ｐｕｓ付近で
ある。（図４） ■ エタノール耐性 ０〜３０％（Ｖ／ｌのエタノールを含有した０、１Ｍ
コハク酸緩衝液（ｐｔ１４，３）中での酵素活性は１０
％付近まで安定であり、２０％エタノール含有条件でも
エタノール無添加の場合の８０％以上の活性を示す。
ル無添２０％エタノール含有の両条件下、ｐｕｓ付近で
ある。（図４） ■ エタノール耐性 ０〜３０％（Ｖ／ｌのエタノールを含有した０、１Ｍ
コハク酸緩衝液（ｐｔ１４，３）中での酵素活性は１０
％付近まで安定であり、２０％エタノール含有条件でも
エタノール無添加の場合の８０％以上の活性を示す。
■ 尿素に対するＫｍ値
２０％エタノール含有０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐｌ＋
４．３） ３０℃におけるＫｍ値は約１３ｍＭである。
４．３） ３０℃におけるＫｍ値は約１３ｍＭである。
■ 分子量
ゲル口過担体としてＴ Ｓ Ｋｇｅｌ Ｇ３０００Ｓ
Ｗ Ｘ Ｌ（Ｍ Ｗ ＜ ５Ｘ １０５）φ７．８ｍＸ
３０ｃｍカラムを用い、０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５、６）−１０％グリセロール−１ｍＭＥＤ
ＴＡ−０，０５％ＮａＮ３の組成の緩衝液を０ 、２
ｍｌ／ｍｉｎの流速で流す高速液体クロマトグラフィー
を行い、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から
分子量を算出した結果、本酵素の分子量は約３７０，０
００であった。
Ｗ Ｘ Ｌ（Ｍ Ｗ ＜ ５Ｘ １０５）φ７．８ｍＸ
３０ｃｍカラムを用い、０．０５ Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５、６）−１０％グリセロール−１ｍＭＥＤ
ＴＡ−０，０５％ＮａＮ３の組成の緩衝液を０ 、２
ｍｌ／ｍｉｎの流速で流す高速液体クロマトグラフィー
を行い、各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から
分子量を算出した結果、本酵素の分子量は約３７０，０
００であった。
■ 基質特異性
２０％エタノール含有ｏ、ｉＭ コハク酸援衝液（ｐＨ
４，３）における基質特異性を調べた結果、３０°Ｃ１
１０分間の反応でアンモニアを生成した基質は尿素のみ
であった。（第１表） 表１ 基質特異性 尿 素 １．２０
ウ し タ ン
０．００ヒドロキシウレア ０．００ Ｌ−グルタミン ０．００ Ｌ−アスパラギン ０，００ また、尿素を基質とした場合、２ｍＭ のアセトヒドロ
キサム酸の存在によりウレアーゼ活性は８８％阻害され
た。この阻害の程度はナタ豆より得られているウレアー
ゼＳ（ベーリンガー・マンハイム 山之内）の阻害度（
８７，９％）とほぼ同程度であった。
４，３）における基質特異性を調べた結果、３０°Ｃ１
１０分間の反応でアンモニアを生成した基質は尿素のみ
であった。（第１表） 表１ 基質特異性 尿 素 １．２０
ウ し タ ン
０．００ヒドロキシウレア ０．００ Ｌ−グルタミン ０．００ Ｌ−アスパラギン ０，００ また、尿素を基質とした場合、２ｍＭ のアセトヒドロ
キサム酸の存在によりウレアーゼ活性は８８％阻害され
た。この阻害の程度はナタ豆より得られているウレアー
ゼＳ（ベーリンガー・マンハイム 山之内）の阻害度（
８７，９％）とほぼ同程度であった。
以上の酵素活性は特に断わらない限り、０．２５１１１
１の４０％エタ／−ル含有フハク酸援衝液（ｐＨ４，３
）、０．１５ｍ１の２％尿素液を混合した反応液に０．
１０ｍ１の酵素液を加え、３０°Ｃで１０分間インキュ
ベーションを行った後に、メソッズ・オブ・バイオケミ
カル・アナリシス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ八ｎａｌｙｓｉｓ ）へ１７巻３１３頁（
１９６９年）に記載のベルトロー （Ｂｅｒｔｈｌｏｔ
）反応により生じた青色を６・２５ｎｍの波長の吸光
度を測定し、同時に塩化アンモニウムを標準物質として
作成した検量線から酵素活性を算出した。酵素の活性単
位（ユニット ）は尿素分解量μｍｏｌ／分 として定
義した。
１の４０％エタ／−ル含有フハク酸援衝液（ｐＨ４，３
）、０．１５ｍ１の２％尿素液を混合した反応液に０．
１０ｍ１の酵素液を加え、３０°Ｃで１０分間インキュ
ベーションを行った後に、メソッズ・オブ・バイオケミ
カル・アナリシス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ八ｎａｌｙｓｉｓ ）へ１７巻３１３頁（
１９６９年）に記載のベルトロー （Ｂｅｒｔｈｌｏｔ
）反応により生じた青色を６・２５ｎｍの波長の吸光
度を測定し、同時に塩化アンモニウムを標準物質として
作成した検量線から酵素活性を算出した。酵素の活性単
位（ユニット ）は尿素分解量μｍｏｌ／分 として定
義した。
（発明の効果）
本発明の生菌体及びウレアーゼ標品を用いることにより
、清酒など醸造酒中の尿素がほとんど完全に分解される
ことが認められた。また、清酒などの醸造酒あるいはウ
ィスキーなどの蒸留酒用もろみ等に本ウレアーゼ標品を
添加しても同様な効果が認められた。
、清酒など醸造酒中の尿素がほとんど完全に分解される
ことが認められた。また、清酒などの醸造酒あるいはウ
ィスキーなどの蒸留酒用もろみ等に本ウレアーゼ標品を
添加しても同様な効果が認められた。
なお、生菌体及びウレアーゼ標品を常法により固定化し
たものを用いて清酒等を処理しても尿素の除去が可能で
ある。
たものを用いて清酒等を処理しても尿素の除去が可能で
ある。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例１
本菌株を常法により殺菌したブイヨンに接種し、３０℃
で２４時間振とう培養した培養物から遠心分離して得た
菌体を蒸留水で３回洗浄したものに培養液に対し１０倍
濃縮になるように懸濁した。
で２４時間振とう培養した培養物から遠心分離して得た
菌体を蒸留水で３回洗浄したものに培養液に対し１０倍
濃縮になるように懸濁した。
この懸濁液０，１ｍｌ を清酒（アルコール分１８．９
％、日本酒度＋８、酸度２．１、アミノ酸度１．４）１
０＋Ｉｌｌに添加した。このときのウレアーゼ活性は０
．２２ Ｕ／ｍｌと算出された。１５°Ｃで保存し、
経常的に清酒中の尿素濃度を尿素定量試薬キット（東洋
醸造社製）を用いて測定した結果、１２日後尿素は不検
出となった。（図６） 実施例２ ５釦１のブイヨンをＬ字管に入れ、１２０ ’Ｃにて１
０分間オートクレーブ殺菌したものに、本菌株を１白金
耳ずつ接種し、３０℃で１５時間振どう培養したものを
、１００ｍ１のブイヨンを５００ｍ１容坂口７ラスフに
入れ、１２０ ’Ｃにて１０分間オートクレーブ殺菌し
たもの５本に１ｍｌずつ接種し、３０ ’Ｃで１６時間
振どう培養した。培養物を８ｖＯ０Ｏｒｐｍｌ ０分間
遠心して菌体を集め、３００ｍ１の蒸留水で洗浄後、遠
心により菌体を集め、４０ｍ１の５０ｍＭ リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐｆ１７．０ ）−０，１ｍＭジチ
オスレイトール（Ｄ Ｔ Ｔ ）−１ｍＭＥＤＴＡ
に懸濁した菌体を７レンチ・プレスを用い２０，０００
ｐｓｉの条件で破砕した。菌体破砕物を遠心し、その上
澄液を５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，
０） −１０％グリセロール−１ｍＭＥＤＴＡ（緩衝液
Ａ）に対して透析した。
％、日本酒度＋８、酸度２．１、アミノ酸度１．４）１
０＋Ｉｌｌに添加した。このときのウレアーゼ活性は０
．２２ Ｕ／ｍｌと算出された。１５°Ｃで保存し、
経常的に清酒中の尿素濃度を尿素定量試薬キット（東洋
醸造社製）を用いて測定した結果、１２日後尿素は不検
出となった。（図６） 実施例２ ５釦１のブイヨンをＬ字管に入れ、１２０ ’Ｃにて１
０分間オートクレーブ殺菌したものに、本菌株を１白金
耳ずつ接種し、３０℃で１５時間振どう培養したものを
、１００ｍ１のブイヨンを５００ｍ１容坂口７ラスフに
入れ、１２０ ’Ｃにて１０分間オートクレーブ殺菌し
たもの５本に１ｍｌずつ接種し、３０ ’Ｃで１６時間
振どう培養した。培養物を８ｖＯ０Ｏｒｐｍｌ ０分間
遠心して菌体を集め、３００ｍ１の蒸留水で洗浄後、遠
心により菌体を集め、４０ｍ１の５０ｍＭ リン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐｆ１７．０ ）−０，１ｍＭジチ
オスレイトール（Ｄ Ｔ Ｔ ）−１ｍＭＥＤＴＡ
に懸濁した菌体を７レンチ・プレスを用い２０，０００
ｐｓｉの条件で破砕した。菌体破砕物を遠心し、その上
澄液を５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，
０） −１０％グリセロール−１ｍＭＥＤＴＡ（緩衝液
Ａ）に対して透析した。
透析後の粗酵素溶液２０ｍ１を陽イオン文換カラム（Ｔ
Ｓ Ｋｇｅｌ Ｓ Ｐ ５ ＰＷ、φ２１＋ｎｍＸ １
５ｃｍ ）に吸着させ、３ｍｌ／ｌｌ１ｉｎの流速で高
速液体クロマトグラフィーを行った。粗酵素溶液を吸着
後緩衝液Ａを３０分間流し、その後、緩衝液Ａに ０．
５ＭになるようにＮａＣ１に関して直線勾配をつけて９
０分間溶出を行い、９ｍｌずつ分取した。ウレアーゼ活
性は７ラクシヨンＮｏ、２７を中心に溶出した。部分精
製されたウレアーゼ活性は培養液の約６．８倍（３，９
Ｕ／ＩＩ＋ｌ ）に上昇し、回収は４６％であった。
Ｓ Ｋｇｅｌ Ｓ Ｐ ５ ＰＷ、φ２１＋ｎｍＸ １
５ｃｍ ）に吸着させ、３ｍｌ／ｌｌ１ｉｎの流速で高
速液体クロマトグラフィーを行った。粗酵素溶液を吸着
後緩衝液Ａを３０分間流し、その後、緩衝液Ａに ０．
５ＭになるようにＮａＣ１に関して直線勾配をつけて９
０分間溶出を行い、９ｍｌずつ分取した。ウレアーゼ活
性は７ラクシヨンＮｏ、２７を中心に溶出した。部分精
製されたウレアーゼ活性は培養液の約６．８倍（３，９
Ｕ／ＩＩ＋ｌ ）に上昇し、回収は４６％であった。
実施例３
実施例２で得た部分精製ウレアーゼを ０．０５（Ｊ
／ ｍ Ｉになるように実施例１で用いた清酒に添加し
、１５℃で保存し、清酒中の尿素濃度を経時的に測定し
た。また、ウレアーゼ添加清酒を６０ ’Ｃで２０分間
火入れしたものについても尿素の濃度を測定した。約１
２日の保存により清酒中の尿素はつにアーゼによりほと
んど分解されたが、ウレアーゼ添加した清酒を火入れす
るとウレアーゼ活性は完全に失活した。（図７）
／ ｍ Ｉになるように実施例１で用いた清酒に添加し
、１５℃で保存し、清酒中の尿素濃度を経時的に測定し
た。また、ウレアーゼ添加清酒を６０ ’Ｃで２０分間
火入れしたものについても尿素の濃度を測定した。約１
２日の保存により清酒中の尿素はつにアーゼによりほと
んど分解されたが、ウレアーゼ添加した清酒を火入れす
るとウレアーゼ活性は完全に失活した。（図７）
図１は部分精製ウレアーゼの熱安定性、図２は至適温度
、図３はｐＨ安定性、図４は至適ｐｉ、図５はエタ／−
ル耐性を示したグラフである。図６は生菌体を清酒に添
加した場合の尿素の分解を経時的に測定したグラフ、図
７は清酒に部分精製したウレアーゼを添加したときの清
酒中の尿素濃度の変化を示すグラフである。
、図３はｐＨ安定性、図４は至適ｐｉ、図５はエタ／−
ル耐性を示したグラフである。図６は生菌体を清酒に添
加した場合の尿素の分解を経時的に測定したグラフ、図
７は清酒に部分精製したウレアーゼを添加したときの清
酒中の尿素濃度の変化を示すグラフである。
Claims (1)
- シュードモナス属に属し、酸性領域に反応至適ｐＨをも
つウレアーゼ生産能を有する菌株を培養して、菌体内及
び／又は培養液中にウレアーゼを生産せしめ、これを採
取することを特徴とするウレアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63014705A JPH01191684A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | ウレアーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63014705A JPH01191684A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | ウレアーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01191684A true JPH01191684A (ja) | 1989-08-01 |
| JPH0251596B2 JPH0251596B2 (ja) | 1990-11-07 |
Family
ID=11868589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63014705A Granted JPH01191684A (ja) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | ウレアーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01191684A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020080861A (ja) * | 2018-11-21 | 2020-06-04 | 葡萄王生技股▲ふん▼有限公司 | ラクトバチルスファーメンタムｇｋｆ３、それを含む組成物及び精神失調を改善する適用 |
-
1988
- 1988-01-27 JP JP63014705A patent/JPH01191684A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020080861A (ja) * | 2018-11-21 | 2020-06-04 | 葡萄王生技股▲ふん▼有限公司 | ラクトバチルスファーメンタムｇｋｆ３、それを含む組成物及び精神失調を改善する適用 |
| US11253556B2 (en) | 2018-11-21 | 2022-02-22 | Grape King Bio Ltd | Lactobacillus fermentum GKF3, composition comprising the strain and method for improving psychataxia using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0251596B2 (ja) | 1990-11-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |