JPH0672885B2 - 分析素子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素子に係
り、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析する
ための分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてき
た。その分析方法は、主として免疫反応をその原理とす
るものである。上記原理を用いる測定法として、種々の
ものが開発されてきたが、最も精度の高いものとして、
免疫測定法が知られている。

免疫測定法は、1958年、ベルソン（Berson）とイアロウ
（Yallow）が、放射性ヨードで標識した、ウシインシユ
リンと糖尿病患者血清中の抗インシユリン抗体を用い
て、血清中のインシユリンを測定することに成功して以
来、放射免疫測定法が広く用いられている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発がなされてきた。他の標識化合物としては例
えば、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテ
リオフアージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、
有機補欠分子族、化学発光性反応体、及び蛍光性分子等
が挙げられる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かつた物質（以下、Ｆと略記する）の分離（以下B/F分
離と略記する）がある。

従来、免疫測定法における問題点を解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭53−38619
号、同53−79024号、同55−90859号、同57−67860号、
同57−200862号、同58−18167号、同59−77356号及び同
59−170768号各公報参照〕。

しかし、これらの方法は、B/F分離が不完全である、ノ
イズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物質
が低分子物質に限られる等の欠点があつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、ウエツト・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されている（例えば特
開昭58−209994号及び同59−202064号各公報参照）。し
かし、それらの測定法では、両固定相を区別することな
く全体の酵素活性を測定しているため、バツクグラウン
ドやノイズの問題から、感度、精度及び再現性について
満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、第２抗体を用い
る免疫測定法が開発されている（特開昭57−82766号及
び同57−82767号各公報参照）。しかし、これらは、操
作が煩雑であること、再現性の良い展開を行う技術が必
要であること等、改良の余地がある。更に、特開昭59−
34155号公報記載の発明では、未結合物収納シートを用
いる方法が開示されている。しかし、この方法でも、反
応用シートと未結合物収納シートとを密着させたままで
測定を行おうとすると前述した問題が生じ、また測定時
に両シートを分離するのは煩雑であり、特に測定を自動
化する際、障害となる。

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は、単一層の中でB/F分離を
行うことにより、測定対象として比較的高い分子量（２
万〜500万）の物質が適用可能であり、簡便な操作で感
度、精度及び再現性に優れた、流体試料中の特定成分を
定量することができる分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あつて、流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａと特
異的に結合し得る物質Ｂと、該物質Ｂとは異なる特定成
分Ａと特異的に結合し得る物質Ｃと標識とが結合した標
識物Ｄとを用いて測定するための分析素子において、
（ａ）該物質Ｂを固定化した担体と、（ｂ）該物質Ｂに
結合した特定成分Ａに結合していない該標識物Ｄの標識
部位に特異的に結合して、該標識に起因する信号を変調
させる物質Ｅ（以下吸収物質Ｅと略記する）を固定化し
た担体とを含有する混合物を用いて形成した多孔質反応
層を有することを特徴とする。

本発明に使用しうる流体試料としてはあらゆる形態の溶
液、コロイド溶液を挙げることができるが、好ましくは
生物由来の流体試料すなわち血液、血漿、血清、脳背髄
液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられ、特に
好ましいのは血液及び血清である。

本発明が測定しうる流体試料中の特定成分Ａとはその存
在又はその流体試料中での量が測定され、その成分の分
子の異なる部位に特異的に結合する物質が２種類以上得
うる物質又は物質の群であり、下記表１に挙げる物質又
は物質の群を例に挙げることができる。

本発明に使用しうる流体試料中の特定成分Ａと特異的に
結合し得る物質Ｂとしては、測定対象により抗体、抗
原、レクチン、プロテインＡ、特定酵素の阻害物質など
が挙げられるが、該特定成分と該結合物質の結合反応が
抗原−抗体反応である場合が特に好ましい。本発明で使
用する抗体は、その由来を特に限定されるものではな
く、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血
清、腹水液をそのままか、あるいは従来公知の方法であ
る（右田俊介編「免疫化学」中山書店第74〜88頁参
照）、硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿
法、セフアデツクスゲルによるゲル過法、イオン交換
セルロールクロマトグラフイー法、電気泳動法等で精製
して用いることができる。

あるいは抗原で原作した哺乳動物等（例えばマウス）脾
蔵細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を得てモノクローナル抗体を用いるのが
特に好ましい。

また、これらの抗体はIgG、IgM、IgA、IgD、IgE各分画
を用いることができ、あるいはこれらの抗体を酵素処理
してFab又はFab′といつた活性抗体フラグメントにして
使用してもよい。更にこれらの抗体は単一で使用して
も、複数の抗体を組合せ使用してもかまわない。

流体試料中の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂと
して抗体又は抗原を用いた場合、本発明分析素子の測定
原理は免疫測定法に属する。本発明の分析素子は免疫測
定法において特に好ましく使用できるが、本発明は免疫
測定法に限定されるものではなく、種々の応用が可能で
あることは以上に述べてきた内容からも明らかである。

本発明に適用しうる標識としては、例えば、酵素、酵素
基質、酵素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質（酵
素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活性化
する物質など）、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質など
が挙げられ、その代表的な例としては下記表２に示した
物質を挙げることができる。更に好ましくは表２に開示
された酵素及び蛍光物質が用いられる。（これらの標識
に起因する信号については後述する。） 2. 基質 p-ニトロフエニル‐β‐D-ガラクトシド o-ニトロフエニル‐βD-ガラクトシド 4-メチルウンベリフエロン‐β‐D-ガラクトシド p-ニトロフエニルホスフエート コルチゾール‐21-ヘミスクシネート ウンベリフエロ
ン コンジユゲート ルミノール イソルミノール N-（4-アミノブチル）‐N-エチル イソルミノール ヘ
ミスクシンアミド N-（6-アミノヘキシル）‐N-エチル イソルミノール N-（4-アミノブチル）‐N-エチル イソルミノール ルシゲニン アクリジニウム フエニル カルボキシレート ロフイン ピロガロール 没食子酸 シロキシン ビス（2,4,6-トリクロロフエニル）オキサレート及びそ
の誘導体 3. 酵素阻害物質 フイソスチグミン メチオニン スルホキシミン ワイルドフアイア（wildfire）毒素 ブルーデキストラン o-ジアニシジン‐セルロース o-ジアニシジン‐デキストラン 2-プロピニルアミン 2-クロロアリルアミン フエニルグリシン p-ニトロフエニルグリシン アミノアセトニトリル 2-アミノ‐3-ヒドロキシプロピル‐1,3′‐カルボキシ
‐３′‐アミノ‐１′‐プロペニル‐１エーテル L-2-アミノ‐4-メトキシ‐トランス‐3-ブテン酸 エタノールアミン o-サルフエート アルビジイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン △³-7-アミノセフアロスポリン酸 ミモシン 2-アミノ‐4-ペンチン酸 2-アミノ‐4-クロロ‐4-ペンテン酸 3,3-ジクロロアラニン 3,3,3-トリクロロアラニン D-シクロセリン 2-ヒドロキシル‐3-ブチン酸 N,N-トリメチル‐2-プロピニルアミン β‐アミノプロピオニトリル 2-プロモエチルアミン 3-デシノイル‐N-アセチルシステアミン 2,3-デカジエノイル‐N-アセチルシステアミン β‐クロロ‐L-アラニン L-セリン‐o-サルフエート β‐フルオロアラニン L-ビニルグリシン D-ビニルグリシン プロパルギルグリシン ガバクリン 5-ニトロ‐L-ノルバリン N-ベンジル‐N-メチル‐2-プロピニルアミン 3-ジメチルアミノ‐1-プロピン グリセロール ジイソプロピルホスホロフルオロライド フエニルメタンスルホニルフルオライド クラブラン酸 アロプリノール 4. 補酵素・補欠分子族 FAD（フラビン・アデニン・ジヌクレオチド） FMN（フラビン・モノヌクレオチド） ヘム S-アデノシルメチオニン THF（テトラヒドロ葉酸） TPP（チアミン二リン酸） CoA（補酵素Ａ） UDP-Glc（ウリジン二リン酸グルコース） PLP（ピリドキサールリン酸） ATP（アデノシン三リン酸） ビオチン CoI（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド） CoII（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸） アデノシルコバラミン メチルコバラミン CoM（2,2′‐ジチオジエタンスルホン酸） CoQ（ユビキノン） 5. アポ酵素 アポグルタチオン還元酵素 アポチトクローム還元酵素 アポNADFHデヒドロゲナーゼ アポグルコース・オキシダーゼ アポリポアミド・デハイドロゲナーゼ アポピリドキシン・ホスフエート・オキシダーゼ アポペルオキシダーゼ アポチトクロームＣ アポキサンチンオキシダーゼ アポ酵母乳酸デヒドロゲナーゼ アポサルコシンオキシダーゼ アポp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ アポアシル‐CoAデヒドロゲナーゼ アポジヒドロリポ酸デヒドロゲナーゼ アポコハク酸デヒドロゲナーゼ アポホモシステインメチルトランスフエラーゼ アポグルタミン酸ホルミルトランスフエラーゼ アポトランスケトラーゼ アポコリンアセチルトランスフエラーゼ アポグリコーゲンシンターゼ アポアラニンアミノトランスフエラーゼ アポヘキソキナーゼ 6. 酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペプチダーゼ ストレプトキナーゼ プロテインキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ 7. 酵素前駆体 トリブシノーゲン キモトリプシノーゲン プロコリパーゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロカルボキシペプチダーゼＡ プロカルボキシペプチダーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシノーゲン プロインシユリン プロパラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーゲン（可溶性） 凝集因子 XI、XII、XIII プロコラゲナーゼ プロココーナーゼ プレカリクレイン ペプシノーゲン プラスミノーゲン フイプリノーゲン プロトロンピン プラスミノーゲンプロアクチベータ プロアクロジン 8. 蛍光物質 フルオレセイン イソチオシアナート（FITC） テトラメチルローダミン イソチオシアナート（TRIT
C） ローダミンＢ イソチオシアナート（RBITC） リサミンローダミン‐B200スルホリル クロライド（RB
200SC） ウンペリフエロン 4-メチルウンペリフエロン（4MU） フルオレセインチオフルバミル（FTC） フルオレセインチオカルバミル‐ジフエニルグリシン
（FTC-DPG） テトラメチルローダミン（TMR） 5-〔（4,6-ジクロロトリアジン‐2-イル）‐アミノ〕フ
ルオレセイン ジメチルアミノナフタレン‐5-スルホニルクロライド
（DNS-Cl） フルオラム 2-メトキシ‐2,4-ジフエニル‐３（2H）‐フラノン（MD
PF） 7-クロロ‐4-ニトロベンゾ‐2-オキサ‐1,3-ジアゾール
（MBD-Cl） 1-アニリノ‐8-ナフタレンスルホン酸（ANS） N-（3-ピレン）‐マレイミド（NPM） N-（7-ジメチルアミノ‐4-メチル‐2-オキシ‐3-クロロ
メチル）‐マレイミド（DACM） N-（p-2-ペンズイミダゾイル‐フエニル）‐マレイミド
（BIPM） アントラセンイソチオシアナート フルオロアンチルマレイミド（FAM） 希土類元素を含む各種キレート及びこれらの誘導体 本発明において標識物Ｄとは、前述の特定成分Ａと特異
的に結合し得る物質Ｃに前述の標識をその信号を発する
能力を保持したまま化学的手段等で直接又は間接的に結
合した物質の総称である。種々の公知の方法で前述の標
識を化学結合させることができ、更にくわしく言えば石
川栄治、河合 忠、宮井 潔編「酵素免疫測定法（第２
版）」（医学書院、1978年刊）や日本臨床病理学会編
「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床検査のためのイ
ムノアツセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、1983
年刊）に記載された方法を参考にすることができる。こ
れらの方法のうちでもグルタルアルデヒド法、過ヨーソ
酸法（ナカネ法）、マレイミド法は特に好ましく用いる
ことができる。

また、「標識物Ｄ」に用いる「特定成分Ａと特異的に結
合し得る物質Ｃ」は、担体に固定化した「特定成分Ａと
特異的に結合し得る物質Ｂ」とは異なる種類のもので、
両者は該特定成分の一分子の異なる部位に同時に結合し
得る必要がある。

本発明に使用する吸収物質Ｅ、すなわち、前述の標識物
Ｄの標識部位に特異的に結合して、該標識に起因する信
号を消滅するか減じる物質Ｅは、使用する標識に対応し
て選ばれるべきものであり、下記のような物質を例に挙
げることができる。

1. 標識が「酵素」である場合 標識に起因する信号 該酵素活性による基質の減少・生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化 好ましい吸収物質Ｅ 該酵素に対する阻害剤（表２に挙げた阻害物質から該酵
素に対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの 2. 標識が「酵素基質」である場合 標識に起因する信号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化 好ましい吸収物質Ｅ 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素 該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの 3. 標識が「補酵素」又は「補欠分子族」である場合 標識に起因する信号 分析素子中に添加された該標識を必要とする酵素の反応
による基質の減少、生成物の増加、及びそれらに起因す
る変化 好ましい吸収物質Ｅ 該標識に対する抗体で、該標識に結合してその活性に影
響を与えるもの 該標識を吸収又は消費するが、その活性により本来検出
しようとしている信号を発しないもの。

4. 標識が「アポ酵素」である場合 標識に起因する信号 該標識はそのままでは信号を発しない。

後述の吸収物質と結合して酵素活性を再現し、その活性
による基質の減少・生成物の増加及びそれらに起因する
変化を測定できる。

好ましい吸収物質Ｅ 該標識の酵素活性を発現させる補欠分子族。（表２に例
示した補欠分子族から該標識に対応するものを選んで使
用できる） 5. 標識が「酵素前駆体を活性化させる物質」である場
合 標識に起因する信号 該標識が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活性化
し、その活性による基質の減少、生成物の増加、及びそ
れらに起因する変化 好ましい吸収物質Ｅ 該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの 該物質が酵素である場合、その阻害剤 6. 標識が「酵素前駆体」である場合 標識に起因する信号 該標識はそのままでは信号を発しない。

後術の吸収物質にいつたん結合後分子の一部が切断され
た酵素活性を発現し、その活性による基質の減少・生成
物の増加及びそれらに起因する変化を測定できる。

好ましい吸収物質Ｅ 該標識の酵素活性を発現させる物質 7. 標識が「蛍光物質」である場合 標識に起因する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光 好ましい吸収物質Ｅ 該標識に対する抗体及びその誘導体で、該標識の蛍光波
長・強度を変化させるもの。

上記の各種吸収物質の具体例はいずれも当業者によく知
られており、あらためて開示するまでもないが本発明の
理解を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組合せとしては、ビ
チオン酵素（ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチルCo
-Aカルボキシラーゼ、プロピオニル‐CoAカルボキシラ
ーゼ、メチルマロニル‐CaAカルボキシラーゼなど）と
アビジン、ペルオキシダーゼとo-ジアニジン‐デキスト
ラン、乳酸オキシダーゼと2-ヒドロキシル‐3-ブチン
酸、モノアミンオキシダーゼとN,N-トリメチル‐2-プロ
ピニルアミン又はβ‐アミノプロピオニトリルなどが挙
げられ、更にジヤーナル オブ ジ アメリカン ケミ
カル ソサイアテイ（J.Am.Chem.Soc）第80巻、第456頁
（1958年）；同第82巻、第596頁（1960年）；アカウン
ツ オブ ケミカル リサーチ（Acc.Chem.Res）第９巻
313頁（1976年）；サイエンス（Science）第185巻320頁
（1974年）；化学工業1985第21頁（1985年）などに記載
された、若しくは引用された酵素阻害剤の組合せも好ま
しく用いることができる。

本発明の主要部分をなす多孔質反応層は前記（ａ）及び
（ｂ）で表される担体を含有する混合物を用いて形成
（例えば塗布及び／又は製膜することによる）したもの
であり、担体としては例えば粒子、繊維が挙げられる。

ここで用いられる粒子は粒径１〜1000μｍが好ましく材
質としては、デキストラン、アガロース、ポリアミド、
ポリスチレン、ポリカーボネート、あるいは特開昭55−
90859号公報に開示された材質などの有機ポリマー粒
子、あるいはガラス、二酸化ケイ素、ケイ砂などの無機
粒子を好ましく用いることができるが、特開昭57−1017
60号及び同57−101761号公報に開示された自己結合性粒
子を用いることが特に好ましい。代表的な材質としては
次の表３のようなものが例示できる。

表 ３ 例示化合物 （１） ポリ（スチレン‐コ‐グリシジルメタクリレート）〔90
/10〕 （２） ポリ（スチレン‐コ‐メチルアクリレート‐コ‐グリシ
ジルメタクリレート）〔80/15/5〕 （３） ポリ（スチレン‐コ‐n-ブチルメタクリレート‐コ‐グ
リシジルメタクリレート）〔75/15/10〕。

（４） ポリ（スチレン‐コ‐ビニルベンジルクロライド‐コ‐
グリシジルメタクリレート）〔80/10/10〕。

（５） ポリ（スチレン‐コ‐ジビニルベンゼン‐コ‐グリシジ
ルアクリレート）〔90/2/8〕。

（６） ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐グリシジルメタクリレー
ト）〔90/10〕。

（７） ポリ（メタクリレート‐コ‐グリシジルメタクリレート
〔80/20〕。

（８） ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルメタク
リレート）〔95/5〕。

（９） ポリ（スチレン‐コ‐アジリジルエチルメタクリレー
ト）〔95/5〕。

（10） ポリ（スチレン‐コ‐メチルアクリレート‐コ‐アクロ
レイン）〔90/5/5〕。

（11） ポリ（スチレン‐コ‐アクリルアミド）〔95/5〕 （12） ポリ（スチレン‐コ‐ビニルチオール）〔95/5〕。

（13） ポリ（スチレン‐コ‐メチロール化アクリルアミド）
〔95/5〕。

（14） ポリ（スチレン‐コ‐t-ブチルアクリレート‐グリシジ
ルメタクリレート）〔95/5/5〕。

（15） ポリ（スチレン‐コ‐ビニルイソシアネート）〔95/
5〕。

（16） ポリ（メチルアクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐N-メチ
ロールアクリルアミド）〔50/35/15〕。

（17） ポリ（スチレン‐コ‐グリシジルメタクリレート‐コ‐
N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレート）〔90/5/
5〕。

（18） ポリ（スチレン‐コ‐メタクリル酸‐コ‐アクリルアミ
ド）〔95/2/3〕。

（19） ポリ（スチレン‐コ‐N-メチロールアクリルアミド‐コ
‐アクリル酸メトキシエチル）〔95/5/5〕。

（20） ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐N-メチロールアクリルア
ミド‐コ‐アクリル酸）〔90/8/2〕。

（21） ポリ（メチルメタクリレート‐コ‐グリシジルメタクリ
レート‐コ‐t-ブチルアクリレート）〔80/10/10〕。

（22） ポリ（スチレン‐コ‐p-ビニルペンジルクロライド‐コ
‐アクリル酸‐コ‐アクリル酸ウレイドエチル）〔75/1
0/5/10〕。

（23） ポリ（スチレン‐コ‐メタクロレイン‐コ‐α‐ヒドロ
キシエチルメタクリレート）〔90/5/5〕。

（24） ポリ（スチレン‐コ‐アクロレイン‐コ‐アセトアセト
キシエチルメタクリレート）〔85/5/10〕。

（25） ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルアクリ
レート‐コ‐ビニルスルホニルエチルメタクリレート）
〔90/5/5〕。

（26） ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐アミノスチレン‐コ‐ビ
ニルスルホニルエチルメタクリレート）〔85/10/5〕。

（27） ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルメタク
リレート）〔90/10〕。

（28） ポリ（スチレン‐コ‐アクリル酸）〔97/3〕。

（29） ポリ（スチレン‐コ‐アクリルアミド）〔97/3〕 （30） ポリ（p-ビニルトルエン‐コ‐t-ブチルアクリレート）
〔95/5〕 （31） ポリ（メチルアクリレート‐コ‐メタクリルアミド）
〔95/5〕 （32） ポリ（スチレン‐コ‐N-メチロールアクリルアミド）
〔95/5〕 （33） ポリ（p-ビニルベンジルクロライド‐コ‐N-メチロール
アクリルアミド）〔96/4〕 （34） ポリ（スチレン‐コ‐イタコン酸）〔98/2〕 （35） ポリ（スチレン‐コ‐t-ブチルアクリレート）〔92/8〕 （36） ポリ（メチルアクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐アクロ
レイン）〔30/65/5〕 （37） ポリ（メチルメタクリレート‐コ‐スチレン‐コ‐2-ヒ
ドロキシエチルメタクリレート）〔25/70/5〕 （38） ポリ（スチレン‐コ‐ビニルスルホニルエチルアクリレ
ート）〔80/20〕 （39） ポリ（スチレン‐コ‐N,N-ジメチルアミノエチルアクリ
レート）〔90/10〕 （40） ポリ（スチレン‐メチルアクリレート‐コ‐アセトアセ
トキシエチルアクリレート）〔90/5/5〕 （41） ポリ（スチレン‐コ‐メタクリル酸）〔95/5〕 各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、バ
ルブ、綿、麻、絹、羊毛、セルロースエステル、ビスコ
ースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、ポリアミド（6-
ナイロン、6,6-ナイロン、6,10-ナイロンなど）、ポリ
エステル（ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリオ
レフイン（ポリプロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊
維、石綿など。植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成
・再生繊維を用いることができ、あるいはこれらを混合
して用いても良い。

該特定成分と特異的に結合する物質の固定化は、種々の
公知の方法により、該物質を前述の粒子又は繊維の表面
に物理的に吸着させるか、化学反応により直接あるいは
間接的に結合させることにより達成される。この際該物
質の該特定成分に対する特異的結合性が失われないよう
に留意する必要があり、例えば石川栄治、河合忠、宮井
潔編「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、1978
年刊）、千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実験と応用
アフイニテイクロマトグラフイー」（講談社 1976年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。

また、該特定成分Ａと特異的に結合する物質Ｅを固定化
した後必要に応じて免疫反応における非特異的反応を排
除する目的で、測定すべき免疫反応に関与しないタンパ
ク質を担持することが可能である。

これらの代表的な例としては哺乳動物の正常血清タン白
質、アルブミン、ゼラチン及びその分解物等が挙げられ
る。

以上述べてきた方法で前記（ａ）及び（ｂ）を作成す
る。この際（ａ）と（ｂ）は必ずしも同じ材質である必
要はなく、異なる材質の粒子、異なる材質の繊維、ある
いは粒子と繊維を組合せて使用しても良い。ただし、
（ａ）と（ｂ）を均一に混合するためには、平均粒径が
著しく異なる粒子を組合せるのは好ましくない。

粒子又は繊維（ａ）、（ｂ）の混合比は各々に固定化さ
れた各特異的結合物質の量と結合定数に応じ定められ、
必要に応じては更に、特異的結合物質を固定化していな
い粒子又は繊維を調整のために加えても良い。

これらの混合物を塗布及び／又は製膜することにより、
流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多
孔性構造が存在する多孔質反応層を形成する。自己結合
性を有しない粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点
接着する形で製膜することができ、例えば特開昭55−90
859号の方法を適用することができる。自己結合性を有
する有機ポリマー粒子は特開昭57−101760号又は同57−
101761号各公報に記載の方法により同様に製膜できる。
繊維又は繊維及び粒子混合物については特開昭57−1258
47号、同57−197466号公報に記載された繊維分散液を塗
布することにより多孔質反応層を形成でき、また特願昭
59−28571号明細書で行われている方法のようにゼラチ
ンやポリビニルピロリドンのような水溶性バインダーを
使用した繊維分散液を塗布することも可能である。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるものであれば
よく、特に制限されるものではないが、製造上及び操作
・測定上、フイルム状あるいはシート状であることが好
ましい。

本発明の分析素子の理解を助けるために、一例を挙げて
原理を説明する。

第１図は本発明による分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応層１のみで分析
素子が構成されている。

第２図は第１図の拡大図である。第２図において符号２
は前記（ａ）の粒子、３は前記（ｂ）の粒子そして４は
調整のため添加された粒子である。

第２図は粒子２、３及び４が均一に混合され、点接着す
ることにより多孔質反応層が構成されていることを示し
ている。

第３図は標識物Ｄの模式図であり、符号８は流体試料中
の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｃ、９は標識、
10は標識物Ｄを意味する。

第４図は本発明を説明する模式図であり、符号５は流体
試料中の特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂ（物質
Ｃとは異なる）、６は吸収物質Ｅ、７は流体試料中の特
定成分Ａを意味する。

第１図〜第４図により本発明の機構を説明する。

流体試料の一定量をはかりとり、第１図の分析素子に滴
下する。すると流体試料中の特定成分Ａは粒子又は繊維
の表面に固定化された「流体試料中の特定成分Ａに特異
的に結合する物質Ｂ」に吸着される。

次に標識物Ｄを含む溶液を滴下すると、該標識物Ｄは、
（ａ）の粒子表面に吸着された特定成分Ａ及び（ｂ）の
粒子表面に固定化された吸収物質Ｅの間で分配される
（第４図）。

一定の反応時間の後の標識物は イ 「流体試料中の特定成分Ａに特異的に結合する物質
Ｂ」を固定化した粒子表面に該物質Ｂを介して吸着され
る。

ロ 吸収物質Ｅを固定化した固定表面に該物質Ｅを介し
て吸着される。

ハ 流体試料中に残存する の３通りの状態にある。このうちハの割合はなるべく少
なくなるように反応条件と多孔質反応層の構成を設定す
るのが好ましい。流体試料中の特定成分Ａの濃度にイの
割合は支配され、該特定成分Ａの濃度が高いほどイの割
合は高くなり、ロの割合が低くなる。ロの状態の標識物
Ｄはその標識部位と吸収物質Ｅとの結合により該標識に
起因する信号が変調されるので、流体試料中の特定成分
Ａの濃度と、標識物Ｄ全体の信号強度の間には関数関係
が成立する。そこであらかじめ特定成分Ａの濃度がわか
つている流体試料（標準試料）を数種類用いて検量線を
作成しておけば、道の流体試料中の特定成分Ａの濃度を
知ることができるようになる。

信号の測定方法は標識の種類により異なる。

例えば、標識が蛍光物質であれば、分析素子に励起光を
当て、蛍光強度を測定すれば良い。標識が酵素であれば
適当な基質、必要ならば酵素や発色系を含む溶液を添加
し一定時間インキユベートした後に、該発色系に適合し
た波長の光の反射濃度（基質の種類によつては蛍光強
度、発光強度）を測定することにより信号強度を測定で
きる。このような目的で用いられる基質・発色系は標識
酵素の種類に従つて公知の方法から適当なものを選択で
きる。

一例を挙げれば、標識がペルオキシダーゼである場合
は、過酸化水素を0.001〜10.0％含む緩衝液（pH4.0〜9.
0）に表４に例示した化合物のうちの１種若しくは数種
を選んで溶解したものを用いることができる。

表 ４ （１） o-ジアニン （２） o-トリジン又はその酸塩 （３） o-フエニレンジアミン又はその酸塩 （４） グアヤク （５） アドレナリン （６） フエノールフタレイン （７） フエロシアン化物 （８） 4-アミノアンチピリン、及びその誘導体又はそ
れらの酸塩とフエノール又はナフトール又はそれらの誘
導体との組合わせ （９） アニリン及びその誘導体 （10） o-トルイジン、p-トルイジン等のモノアミン類 （11） o-フエニレンジアミン、N,N′‐ジメチル‐p-
フエニレンジアミン、N,N′‐ジエチルフエニレンジア
ミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 （12） フエノール、チモール、o-,m-及びp-クレゾー
ル、α‐ナフトール、β‐ナフトール等のフエノール類 （13） カテコール、グアヤコール、オルシノール、ピ
ロガロール、p,p-ジヒドロキシジフエニル、フロログル
シノールのようなポリフエノール類 （14） サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のよう
な芳香族の酸 （15） ロイコマラカイトグリーン、ロイコフエノール
フタレインのようなロイコ染料 （16） 2,6-ジクロロフエノールインドフエノールのよ
うな着色染料 （17） エピネフリン、フラボン類、チロシン、ジヒド
ロキシフエニルアラニン、トリブトフアンのような種々
の生化学物質 （18） 2,2′‐アジノジ（3-エチル‐6-スルホベンゾ
チアゾリン）又はその塩、及び3,3′‐ジアミノベンジ
ジンのような特殊染料 （19） その他、グアヤゴム、グアヤコン酸、ヨウ化カ
リウム、ヨウ化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並
びにビリルビンのような物質 標識が酵素基質、補酵素、アポ酵素、酵素前駆体を活性
化させる物質、酵素前駆体の場合も同様であり、要は信
号測定に必要とされる物質の溶液を添加、インキユベー
トし、反射濃度、蛍光強度、発光強度などを測定すれば
良い。

本発明で用いられる前記（ａ）と（ｂ）で示される担体
の粒子又は繊維はミクロ的に見るとわずかな接着部分を
除いて、その表面は離れた状態で反応層を構成してお
り、このことが流体試料を収容する空間を確保すると同
時に、（ａ）の粒子又は繊維の表面に固定化された物質
Ｂに吸着された標識物Ｄの標識部位が（ｂ）の粒子又は
繊維の表面に固定化された物質の影響を受けてその信号
が変調されることを防止しているのである。この結果、
本発明の特徴である単一層内のB/F分離が可能となつ
た。

更に、本発明の別な効果として、（ａ）、（ｂ）の粒子
又は繊維及び、必要に応じて調整のために添加する粒子
又は繊維を混合する際、その比率は自由に設定できるの
で、（ａ）及び（ｂ）に固定化した物質の量や標識物Ｄ
への結合能力が製造ロツトごとに多少変動しても、その
混合比を調整することにより常に一定の性能を持つ分析
素子を供給することが可能である。従来の粒子又は繊維
集合体による多孔層を利用した分析素子及びその類似品
は粒子又は繊維の集合体を流体試料を収納する容器とし
て扱つており、このような集合体を構成する粒子、繊維
に異なる機能を持たせたものを混合し製膜することで単
一層内でのB/F分離を行う試みは全く新しい試みであ
り、実際に上述した効果が得られたことは発明者にとつ
ても全く予想がつかない驚くべき結果であつた。

本発明の実施に当つてはさまざまな態様が可能である。
例えば、第１図の態様の分析素子を使用する場合、前述
の方法の他に、標識物の一定量と流体試料を事前に混合
してから滴したり、あるいは流体試料と標識物を含む溶
液を同時に滴下することも可能である。この方法は感度
において多少不利となるが、反面分析に当つての操作を
非常に簡略化できる。

本発明の分析素子は前述の多孔質反応層が最低必要構成
要素であるが、発明の効果をより一層発揮するために種
々の補助層を設けることができる。第５図〜第10図に本
発明の分析素子の１実施の態様を表す断面概略図を示
す。

第５図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体11の
上に多孔質反応層が積層されており、支持体の存在によ
り素子の取扱い性が向上している。

このような目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セル
ロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）のよう
な高分子化合物、あるいはガラスのような透明無機化合
物が挙げられる。該多孔性反応層はこのような支持体の
上で直接塗布及び／又は製膜するか、あるいはいつたん
多孔質反応層を別に形成した後に前述の支持体に貼りつ
けても良い。第５図に示した態様の場合、流体試料は反
応層側から滴下する必要があるが、信号の測定は両側か
ら行うことが可能である。

第６図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
12の上に反応層が設けられている。この態様では、試料
滴下、信号測定とも多孔性反応層側から行い、信号を反
射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容易にし
ている（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸光性支
持体を同じように用いることで同様な効果を得ることが
できる）。

このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミツクス、金属、あるいは
樹脂被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならばTiO₂、BaSO₄、マイカなどの白色顔
料等を塗布するか含有させることにより目的を果すこと
ができる。

第７図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体11の上に多孔質反応層１、光反射層13が順に積層され
ている。この態様では試料は光反射層側から滴下され、
信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反射層は
公知の分析素子及びその類似品に用いられていたものを
いずれも使用できるが、好ましくは多孔質反応層に用い
られるのと同様な粒子及び繊維に前述の白色顔料等を含
有させたものを塗布又は製膜するか貼りつけることがで
きる。更に好ましくは内部に白色顔料を含有する粒子の
表面に多孔質反応層に用いる時と同様に流体試料中の特
定成分に特異的に結合する物質Ｂや吸収物質Ｅを固定化
し、下層の多孔質反応層と同様の機能を持たせた光反射
層を設けることができる。このような特殊な光反射層を
用いると、光反射層内に多くの未反応標識物が残ること
を防止できる。

第８図の態様では多孔質反応層１の上に標識物含有層14
が設けられている。標識物含有層は多孔性媒体に面積濃
度が一定となるように標識物を含有させた層であり、流
体試料の一定量を滴下すると一定量の標識物が溶出さ
れ、多孔質反応層に試料と共に拡散するものである。素
材としては多孔質反応層と同様のものを塗布、製膜、貼
付しても良く、あるいは吸水性の洋紙、和紙、紙、ブ
ラツシユポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維
（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、バルブなど）、
動物性繊維（羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロ
ン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロ
ピレンなど）、再成繊維（レーヨン、セルロースエステ
ルなど）などを単独あるいは混合して製造した織物、不
織布、合成紙などで作成した標識物含有層を貼付しても
良い。また必要に応じてこの標識物含有層に前述の光反
射層の効果を合せ持たせることができる。第８図の態様
の場合標識が蛍光物質であれば、流体試料のみを滴下
し、インキユベートすれば直ちに測定が可能である。標
識が他の物質の時は、流体試料を滴下後一定時間インキ
ユベートした後、必要な基質・発色試薬等を含む溶液を
滴下することにより測定できる。

第９図も標識物含有層を有する別な態様である。この場
合は下から順に光透過性支持体11、標識物含有層14、タ
イミング層15、多孔質反応層１が積層されている。タイ
ミング層は写真化学の分野で広く知られている技術であ
り、例えば硬膜度を適当に調節したゼラチン層などが用
いられる。本態様においては流体試料滴下後、試料中の
特定成分が多孔質反応層中の対応する粒子の表面にある
程度吸着された後に標識物が多孔質反応層に放出され
る。このような方法はデイレードアデイシヨンとして広
く知られ、本発明においては特に有効である。

本態様のように標識物含有層が最上層以外の部分にある
場合、標識物含有層に用いる素材としては前述のものの
他にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロースな
ど）、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピ
ロリドン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、ビ
ニルアルコール、スルホニルスチレンなどをモノマーと
したホモポリマーあるいはコポリマーといつた連続バイ
ンダーを塗布して用いる方法がある。更に別な態様とし
てはこうした親水性高分子物質やポリマーの膜厚及び組
成を調節することにより標識物含有層からの標識物溶出
速度を制御し、タイミング層の機能をも兼ねさせること
が可能である。

第10図に示した態様は標識が蛍光物質以外の際（信号測
定に当り何らかの形で酵素反応を利用する標識の場合）
特に有用なものである。試薬層16は標識物含有層14と同
様の素材で、標識信号測定の際に必要な物質を面積濃度
一定に含有させたものである。この試薬層と標識物含有
層を設けることにより、蛍光物質以外の標識を用いる場
合でも、流体試料のみを滴下し、インキユペートするだ
けで測定が可能となる。

この場合、多孔質反応層における反応が充分に進行した
後に試薬層の内容物が溶出されるのが好ましく、そのた
めには前述のタイミング層を試薬層の上に設けるか、あ
るいは試薬層の組成を調整してタイミング層の効果を持
たせることが必要である。また、同様の理由から試薬層
は分析素子の最下層（支持体がある場合はその上）に設
けることが好ましい。

なお、酵素反応系にペルオキシダーゼを用いる場合は、
基質として過酸化水素と適当な還元物質が必要である。
このうち前者は揮発性であり、そのまま素子の中に含有
させるのは困難であるので、クメン・H₂O₂などの形で含
有させるが、流体試料が滴下された時点で過酸化水素を
発生させるのが好ましい。後者は、例えばグルコースオ
キシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼに
代表される酸化酵素（反応生成物として過酸化水素を生
じるタイプのもの）と、その酵素の基質を乾燥状態で試
薬層に含有させるか、あるいは該過酸化酵素及び基質の
うち片方を試薬層に片方をそれと異なる層に含有させる
ことにより達成できる。

第11図及び第12図は、本発明の好ましい態様の一例につ
いて断面図、斜視図を示したものである。分析素子の取
扱いが容易になるよう、全体がプラスチツク製のマウン
ト17で覆われており、マウント上部に試料注入孔、下部
に信号測定孔が開いている。

本発明の分析素子は更に、流体試料を素子に適用した際
にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全血）
の際に必要となることがある血球分離層、必要に応じて
設ける接着層、保護層といつた補助層を設けることがで
きる。これらの補助層及び前述の発色試薬層、標識物含
有層、タイミング層は独立して設けても良く、あるいは
複数の機能を併わせもつた層として設けても良い。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が容易に
決定できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によつて更に具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。

実施例１ （１） ウサギ抗FITC抗体の作製 牛血清アルブミン（BSA）50mgを5mlの0.1モル炭酸ナト
リウム溶液（pH 9.0）に溶解し、2mgのフルオレセイン
ソチオシアナート（米国リサーチオルガニツクス社製）
を500μｌのジメチルホルムアミドに溶解して加え、遮
光室温下３時間かくはんし、セフアデックスG-25（フア
ルマシア社製）カラムで精製、凍結乾燥した。

これをフロイントの完全アジユバント（初回のみ）及び
不完全アジユバントと混合し、ウサギに免疫した。

得られた抗血清より硫酸アンモニウム法でグロブリン分
画を分離し、アフイニテイークロマトグラフイーでBSA
に吸着する抗体を除いた後に透析、凍結乾燥した。

（２） 多孔質反応層の作製 （ア） ヤギ抗ヒトIgG（米国カツペル社製）を0.05M
pH 9.6 炭酸・重炭酸緩衝液に10μg/mlの濃度で溶解
し、平均粒径21μｍのポリ（スチレン‐コ‐n-ブチルメ
タクリレート‐コ‐グリシジルアクリレート）〔75/15/
10〕の高分子重合体粒子単位を加えて４℃で一晩放置し
た。粒子を生理食塩水で洗浄後BSAを200μg/ml含む同様
の緩衝液に入れて３日間４℃で放置し、生理食塩水で洗
浄した。

（イ） 抗ヒトIgGの代りに（１）で作製した抗FITC抗
体を用いて、（ア）と同様の操作を行つた。

（ウ） （ア）に準じた方法でBSAのみを物理吸着させ
た粒子を作成した。

以上（ア）〜（ウ）で作成した粒子を7:1:3の割合で均
一に混合し、５重量％のトライトンX-100（ノニオン界
面活性剤、ロームエンドハース社製）と共に乾燥膜厚約
350μｍになるようにポリエチレンテレフタレート支持
体上に塗布し、42℃、30分間乾燥を行い、成膜後、支持
体からはく離した。

（３） 標識物含有層の作成 下引済ポリエチレンテレフタレートフイルム上に次の組
成の試薬層を塗布乾燥により作成した。

（４） 分析素子の作成 （３）で作成した標識物含有層の上に（２）で作成した
多孔質反応層を接着し、２×2cmの大きさに切断し分析
素子とした。

（５） ヒトIgGの測定 ヒトIgG（米国カツペル社製）を640μg/mlから０μg/ml
の各種濃度で含有する0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（p
H 7.6）を作成する。

各濃度のヒトIgG液10μｌを（４）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、37℃で20分保温した後に試料滴下
側から蛍光測定（励起波長 490nm、蛍光波長 520nm）
したところ表５のような結果を得た。

実施例２ （１） 試薬層の作成 下引済ポリエチレンテレフタレートのフイルム上に、下
記のような組成の発色試薬層を塗布、乾燥により作成し
た。

（２） 標識物含有層の作成 （１）で作成した試薬層の上に次の標識物含有層を塗
布、乾燥により作成した。

（３） セルロース繊維への反応性基の導入 粉末紙Ｄ（東洋紙社製）55gを1000mlの2.5Mリン酸
カリウム緩衝液（pH 12.1）に浸漬し、５〜10℃におい
てスターラーでかくはんしながら500mlのプロモシアン
溶液（0.05g/ml）を徐々に加えた。20分間反応させた後
に過し、氷冷した蒸留水、0.1M炭酸水素ナトリウムで
順に洗浄した。

（４） 多孔性反応層の作成 （ア） ヤギ抗ヒトIgG（米国カツペル社製） IgG留分1.0mg（抗体タン白量換算）を40mlの0.1M NaHC
O₃-0.5M NaCl溶液に溶解し、（３）で作成した活性化
紙の一部を入れ、室温で３時間振とうした。過後、
1Mトリス‐塩酸緩衝液（pH8.0）と室温で２時間振とう
する。

水、0.5M酢酸緩衝液（pH 4.0）、0.5M NaHCO₃、50mM
リン酸緩衝化生理食塩水（pH 7.2）で順次洗浄す
る。これを２％BSA含有50mM トリス・塩酸緩衝液（pH
8.0）に１晩浸漬し、蒸留水で洗浄し、BSAとシヨ糖の
水溶液を少量含有させてから凍結乾燥した。

（イ） （３）で作成した活性化紙の一部とo-ジアニ
シジンをpH ９、暗所室温で１晩反応させた。過後1M
1-アミノ‐2-プロパノールで処理し、水洗後（ア）と
同様BSA処理し、乾燥した。

（ウ） グルコースオキシターゼと（３）で作成した活
性化紙の一部を用いて（ア）と同様の操作を行つた。

以上、３種類の処理済繊維を用いて次のような組成の繊
維分散液を調整し、（２）で作成した標識物含有層の上
に塗布乾燥した。

乾燥後、２×2cmの大きさに切断し分析素子とした。

（５） ヒトIgGの測定 ヒトIgG（米国カツペル社製）を640μg/mlから０μg/ml
の各種濃度で含有する0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（p
H 7.6）を作成する。

各濃度のヒトIgG液10μｌを（４）で作成した分析素子
各１枚の上に滴下し、37℃で20分保温した後に支持体側
から492nmの反射濃度を測定した。その結果を表６に示
す。

〔発明の効果〕 以上説明したように、本発明の分析素子によれば、単一
層内でB/F分離を行い、簡便な操作により感度、精度及
び再現性良く、流体試料中の比較的高い分子量の特定成
分を定量分析することができるという顕著な効果を奏す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第５図〜第10図は本発明の分析素子の１実施
の態様を示す断面概略図、第２図は第１図の拡大図、第
３図は標識物の模式図、第４図は本発明を説明する模式
図、第11図は本発明の好ましい態様の１例の断面図そし
て第12図は第11図の斜視図である。 1:多孔質反応層、2:担体（ａ）、3:担体（ｂ）、 4:調整のために添加された粒子、5:物質Ｂ、6:吸収物質
Ｅ、7:流体試料中の特定成分Ａ、8:物質Ｃ、9:標識、1
0:標識物Ｄ、11:光透過性支持体、12:光反射性支持体、
13:光反射層、14:標識物含有層、15:タイミング層、16:
試薬層、17:マウント

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石川 匡代 東京都日野市さくら町１番地 小西六写真 工業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭58−17365（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−103055（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−18167（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａ
   と特異的に結合し得る物質Ｂと、該物質Ｂとは異なる特
   定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｃと標識とが結合し
   た標識物Ｄとを用いて測定するための分析素子におい
   て、（ａ）該物質Ｂを固定化した担体と、（ｂ）該物質
   Ｂに結合した特定成分Ａに結合していない該標識物Ｄの
   標識部位に特異的に結合して、該標識に起因する信号を
   変調させる物質Ｅを固定化した担体とを含有する混合物
   を用いて形成した多孔質反応層を有することを特徴とす
   る分析素子。