JPH01206997A - 血管収縮ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１し跣のオ団Ｌｒ野− 本発明は血管平滑筋収縮作用を有するペプチドに関する
。

更に詳しくは、本発明は分子量２，５００±３００で血
管収縮作用を有する新規なポリペプチドに関し、このも
のは好ましくは、哺乳動物もしくは鳥類の血管内皮細胞
から得られるものであり、また本発明はこのポリペプチ
ドを製造および使用する方法に関し、またこのようなポ
リペプチドを用いた薬剤組成物に関するものである。

従来の技術 内皮依存性の血管拡張反応とならんで１種々の刺激に対
する内皮依存性の血管拡張反応が報告されている。血管
の伸張や内圧の亢進といった機械的負荷による収縮、さ
らにはニューロペプチドＹ（竹本、プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｌｌ、Ｓ。

Ａ、）、副、　５４８５　（１９８２）　；シー、ミン
ス等、同、８ｉ。

４５７７　（１９８４）　）によるノルアドレナリン収
縮の増強などがその例である。アメリカン・ジャーナル
・オブ・フィジオロジ−（Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、）。

２４８、　Ｃ５５０（１９８５）（ｚ−、’）　ＩＪ　
スチン等）オヨヒジャーナル・オブ・セルラー・フィジ
オロジ−（Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、　１３２．２６３　（
１９８７）　（アールエフオブライエン等）には内皮細
胞由来の冠血管収縮因子（分子量はそれぞれ８，５００
および：ｌ、０００）が記載されているが構造は不明で
ある。また、ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・ア
ンド・エクスペリメンタル・セラビューティクス（Ｊ、
　Ｐｈａｒｍａｃｌ、　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｒ、）、　２
３６．３３９　（１９８５）　　（Ｚムエヌ　ギレスピ
ー等）にも内皮細胞由来のペプチド様物質が記載されて
いるが、これも構造は不明である。

一方、血管収縮作用を有するペプチドとしてバソプレッ
シン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ　）やブラジキニン（Ｒ
ｒａｄｙｋｉｎｉｎ　）などのペプチドが知られていて
、それらのアミノ酸配列も明確にされているが、これら
のペプチドが哺乳類または鳥類の血管内皮細胞をオリジ
ンとして得られたという報告はない。また、血管収縮作
用を有するアンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ
　）がウシ大動脈の内皮細胞から得られるという報告（
アイ　カイフォーおよびヴイ　ジエ　ドザブ、サーキュ
レーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ）、　６０．４２２　（１９８７））があ
るが。

アンジオテンシンは分子量ｔ、ｏｏｏのペプチドである
。

明が　゛しようとする１１題、々 本発明者らは、ブタ大動脈の内皮細胞が産生ずる強い血
管平滑筋収縮因子を見出し、この活性因子が新規なペプ
チドであることをつきとめ、さらに検討を加えて本発明
を完成した。

、　点を解決するための手段 本発明は哺乳類または鳥類の血管内皮細胞から得られる
、人間を含めた動物に対し、血管平滑筋収縮作用を有す
る分子量２，５００±３００のペプチドを提供するもの
であり１本発明者等は、これをエンドセリンと命名した
。

哺乳類としては、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ
、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムス
ターなどがあげられる。鳥類としては、ニワトリ、カモ
、ガチョウ、シチメンチョウなどがあげられる。扱いや
すい動物であることと内皮細胞を取り出しやすいことか
ら、ヒト、ウシ、ブタ、ウサギが好適である。これら哺
乳類や鳥類の血管内皮細胞は、常法によって容易に得ら
れるが、例えば血管の内壁を解剖用メスなどで擦過する
か、あるいはトリプシンなどの酵素で常法通りに処理す
ることにより容易に得られる。血管は太いほうが扱いや
すいので大動脈や調帯静脈を用いるのがよい。得られた
内皮細胞は参考例に記載するアッセイ系において観測さ
れ１強い血管平滑筋収縮活性を有している。また１強心
作用（心臓に対する変時作用および変力作用）も認めら
れる。

本発明の血管収縮因子を多量得ようとする場合は、上記
のようにして得られた内皮細胞を培養するとよい。培養
は血清培養でも無血清培養でもよいが、本発明の血管平
滑筋収縮因子を嘔離する目的には無血清培養が適してい
る。培養方法は特に限定されないが、通常は、単層継代
培養する。培養に用いる培地としては高等動物細胞培養
に通常用いられる培地（たとえばハム（Ｈａｍ）　Ｆ−
１０培地など）がよく、内皮細胞１０’個に対して培地
は０．０５〜５　ｍ　Ｑ、好ましくは０．１〜０．２ｍ
　（ｌ使用する。無血清培養の培養期間は０．５ないし
８日間が適当であるが、５ないし６日間が最もよい。培
養温度は通常３７℃±１℃である。血管平滑筋収縮作用
と強心作用は培養上清中に観測される。

本発明の血管平滑筋収縮因子は単離・精製の結果、ペプ
チドであることが確認された。本発明の血管平滑筋収縮
ペプチドの単離・精製は、抽出、イオン交換またはゲル
ろ過のカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー、電気泳動、再結晶のようなペプチドの通常の
ｌｉｔ　ｆｉ−精製法が用いられる。本発明の目的には
イオン交換または逆相のカラムクロマトグラフィーや高
速液体クロマトグラフィーが特に適している。

本発明によるペプチドたるエンドセリンは２１個のアミ
ノ酸残基を有し、その中には上記アミノ酸配列のＮ末端
から数えて第１番目、第３番目、第１１番目、第１５番
目に位置する４個のシスティン基が含まれ、それらは２
組のジスルフィド結合を形成している。このジスルフィ
ド結合の組合せとしては、１−１５．３−１１の組合せ
、およびｌ　−１１゜３−１５の組合せがあるが、前者
の組合せのものの方が活性が高い。

単離・精製された本発明のエンドセリンのうちの一つは
、アミノ酸分析にンヒドリン法）２分子量間室およびそ
の他のデータから、次のアミノ酸２１個からなるペプチ
ド（以後、エンドセリンＡと表す）であることが分かっ
ている。エンドセリンＡのアミノ酸配列は Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
Ｌｅｕ　　ＭｅｔＡｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＣｙｓ　　Ｈｉｓ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ｔｒｐで
あり、ＣｙｓとＣｙｓの間でＳ−８結合が２組存在する
。分子量は２，４９２である。

作」−二汰來 エンドセリンＡを含む本発明の血管収縮ペプチドは低血
圧治療剤や局所血管収縮剤としても利用することができ
るのみならず、生体の血管収縮反応のメカニズムの解析
や血管収縮因子のアンタゴニストの解明の手掛かりを与
えるものである。

例えば、本発明の血管収縮ペプチドは血管収縮剤として
種々の出血、例えば胃や食道の出血を防止するような効
果を有する。またこのものは種々のショック症状を回復
させる効果をも有する。このペプチドは経ロ的１局所的
、静注もしくは非経口的に投与することができるが９局
所もしくは静注投与が好ましい。・投与量は０．００１
μｇ−１００μｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１μｇ−１
０μｇ／ｋｇであり、体重に応じた投与量を１〜１０ｍ
　ｍの生理的食塩水中に溶解して用いる。

本発明のペプチドは該ペプチドおよび副成分を含む乳剤
、水和剤、錠剤、水溶剤、粉剤１粒剤。

カプセル剤、丸刑などの種々の形態に製剤化したものと
して使用できる。副成分としては、薬理的に許容され得
る賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、分散剤、可塑剤、
充填剤、担体などが用いられる。

これらの副成分の例としては、賦形剤としては乳糖、ぶ
どう糖、白糖などが、崩壊剤としては澱粉、アルギン酸
ナトリウム、寒天末、カルボキシメチルセルローズカル
シウムなどが、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウ
ム、タルク、流動パラフィンなどが、結合剤としては単
シロップ、ゼラチン溶液、エタノール、ポリビニルアル
コールなどが１分散剤としてはメチルセルロース、エチ
ルセルロース、セラックなどが、可塑剤としてはグリセ
リン、澱粉などが挙げられる。

参考例 （１）血管平滑筋収縮作用のアッセイ法内皮を綿棒によ
る擦過にて除去したブタ右冠状動脈スパイラル標本（２
Ｘ２０＋ｍ）を炭酸ガスと酸素の混合ガス（５：９５、
Ｖ／Ｖ）で飽和した３７℃のクレブス−リンゲル液（３
ｍＡ）中に懸垂する。

刺激前張力（ｂａｓａｌ　ｔｅｎｓｉｏｎ）を１ｇに設
定したのち、張カドランスデューサーで等尺性張力を測
定する。

（２）強心作用のアッセイ法 前記（１）のアッセイ法で用いたブタ右冠状動脈スパイ
ラル標本のかわりにモルモットの右心房の懸垂標法を使
用し、（１）と同じ操作を行って張力および毎分の心臓
数を測定する。

（３）ＥＤ５゜ 平均効果投与琥のことで、５０％の被験体に有効な投与
量をいう。

実施例１ （１）培養 １０〜２０継代のブタ大動脈内皮細胞（３，６Ｘ　１０
’個）をのべ培養面積３６，０００ｄのプラスチックデ
イツシュ上で、１０％ウマ血清を含むダルベツコ変法イ
ーグル最小培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉ
ｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔ
ｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）　９．６ｆｌにて３７℃、５％
炭酸ガスを含む大気中で飽和（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細
胞密度に至るまで単層培養した。１０日間を要した。こ
のときの細胞密度は１０’／ｌｎで、すなわち総細胞数
は４，８Ｘ１０’個であった。次に培地を、血清を含ま
ないダルベツコ変法イーグル最小培地（９，６Ｑ　）に
交換し、３７℃、５日間培養を継続した。培養後の培地
をｔｏ、０ＯＯＧ、　２０分間遠心分離して浮遊物を除
去し、上清（９，６Ｑ　）を得た。

（２）エンドセリンＡの単離・精製 （ｉ）逆相カラムによる濃縮と脱塩 （１）で得た培養上清を０．１％トリフルオロ酢酸水溶
液（ｐｌ＋　２．０）にて平衡化したＣｈｅｍｃｏｓｏ
ｒｂ　５Ｐ−ｃ−ｏｏｓ逆相カラム（ケムコ社製、直径
３　ａｎ　Ｘ長さＩ８■）にかけ、吸着物を０．１％ト
リフルオロ酢酸／７０％アセトニトリル水溶液（ｐＨ２
，０、：ｌＯｍ　Ｑ　）にて溶出した。溶出液をジエチ
ルエーテル（３００ｎ＋　Ｑ　）で抽出したのち有機層
を捨て、水層（２０ｍ　Ｑ　）に１Ｍトリス塩基（Ｔｒ
ｉｓ　（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅ
ｔｈａｎｅ）水溶液を加えてｐ　Ｈを７．０とした。

（ｉｔ　）陰イオン交換クロマトグラフィーによる粗分
画 （ｉ）で得られた分画（２０ｍ　Ｑ　）を高速液体クロ
マトグラフィーに接続し、２０［１１Ｍトリス塩酸（ρ
１１７゜０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌｐａｋ　
Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−６５０Ｍ（東洋昔達製、直径２．２
１Ｘ長さ２０口）にかけ、２０ＩＩＩＭトリス塩酸（ｐ
ｌ＋　７．０）中、０．３Ｍから０．８Ｍの食塩濃度勾
配（３０分間、カラム流速４　ｒａ　Ｑ　／ｍ１ｎ）で
溶出し、各分画の血管収縮活性を検定し１食塩濃度０．
５Ｍで溶出される分画４０ｎ＋　Ｑを活性分画として用
いた。

（ｉｉｉ）逆相高速液体クロマトグラフィーによる最終
精製　　　　　　　・ （…）で得られた活性分画４’Ｏｉｎ　Ｑを、０．１％
トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したＵｎｉｃｉｌ　Ｑ
Ｃ１８カラム（ガスクロ工業、直経７．５１ｍ×長さ３
０■）にかけ、吸着物を０１１％トリフルオロ酢酸中、
１５％から５０％のアセトニトリル濃度勾配（７０分間
、カラム流速３　ｍ　Ｑ　／ｗｉｎ）で溶出し、各分画
の活性を検定し、３５％アセトニトリルで溶出される活
性分画１２１Ｑを得た。これを０．１％トリフルオロ酢
酸で３倍に希釈し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化
したＣｈｅｎ＋５ｏｒｂ　５−ＯＤＳ−）１カラム（ケ
ムコ社製、直径４．６ｍｍＸ長さ２５１）にかけ、０．
１％トリフルオロ酢酸２０％から５０％のアセトニトリ
ル濃度勾配（１２０分間、カラム流速１　ｍ　Ｑ　／ｍ
１ｎ）で溶出した。溶出液の２８０ｎｒａｌ外吸光をモ
ニターし、吸光のピークごとに分画し、活性のある分画
（ピーク）を精製エンドセリンＡとした。エンドセリン
Ａの収量は７．３μｇ（２゜！ＪｎＩ＋１ｏｌｅ）。

（３）アッセイ 上記２（市）で得られたエンドセリンＡの活性が参考例
（１）および（２）の方法で測定された。

アッセイ法（１）（ブタ冠状動脈によるアッセイ）によ
るＥＤ、。は４〜５Ｘ１０−１０モル／Ｑであった・ アッセイ法（２）（モルモット左心房による強心作用）
によるＥＤ、０は１×１０−９モル／Ｑであった。

（４）注射剤の製造 （２）で得られたエンドセリンＡ　１２μｇを生理的食
塩水に溶解し、ミリポアフィルタ−でろ過、次いで凍結
乾燥した。使用時に静注剤を製造するに当り、上記凍結
乾燥物を生理的食塩水に溶解し。

全量を５１１Ｑとして注射剤とした。

実施例２　エンドセリンＡの合成 市販の保護トリプトファン樹脂（ＢｏＣ−Ｔｒｐ（Ｃｌ
ｌ（））−ＰＡＭ樹脂、アプライド・バイオシステムズ
社製）　０．７ｇ　（０，５ｍ　ｍｏｌｅ）を用い、ペ
プチド合成機（アプライド・バイオシステムズ社製・モ
デル４３０Ａ）を使用し、通常の方法により合成した。

縮合方法は、樹脂上のＢｏＣ基を塩化メチレン中５０％
トリフルオロ酢酸で処理し、末端アミノ基を遊離させ、
この遊離のアミノ基にＢｏＣ−１１ｅ。

Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（○Ｂ　ｚ　ｌ　）　、　Ｂ　ｏ　ｃ
　−Ｌ　ｅ　ｕ　。

Ｂｏｃ−ＴＩｉｓ　　（Ｔｏｓ）、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ　　
（ＡＣｍ）、Ｂｏａ−Ｔｙｒ　（Ｂｒ−ｚ）、ＢｏＣ−
Ｖａ　１．Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＢｏＣ−Ｇｌ　ｕ　　（Ｏ
Ｂｚ　１）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　　（ＣＱ−Ｚ）、Ｂｏｃ
−Ｍｅｔ、Ｂｏｃ−８ｅｒ　（Ｂｚ　ｌ）をＣ末端側よ
りエンドセリンのアミノ酸配列通りに、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下に縮合させる反応
をくり返した。

この様にして得られた保護エンドセリン樹脂１゜８ｇの
うち８００■をアニソール１　ｍ　Ｑ、１，２−エタン
ジオチール１　ｍ　ｎで膨潤させ、０℃でフッ化水素１
０ｍ　Ｑと６０分間処理した後、過剰のフッ化水素を減
圧留去した。残査を酢酸エチル５　ｍ　Ｑで洗った後、
５０％−酢酸水に抽出し、デキストランゲル（セファデ
ックスＬＨ−２０）カラム（２Ｘ９０■）に付し、同溶
媒で溶出した主分画を集め凍結乾燥し、　１２０１Ｔ１
ｇの白色粉末を得た。これの２０１１Ｉｇを８０％−酢
酸ノト２０ｍＱに溶解し、トリフルオロ酢酸第二水銀１
５■を加え、室温で６０分間撹拌したのち、同溶媒３０
ｍ１２で希釈し、硫化水素ガスを通じ、析出物をろ去し
、凍結乾燥した。これを希酢酸４００ｍＱに溶解し、重
炭酸アンモニウムでＰＨ８に調節したのち６時間空気酸
化に付し、酢酸を加えｐＨ；３としたのち、凍結乾燥し
た。これを３０％−酢酸で充填したセファデックスＬＨ
−２０のカラム（２Ｘ９０Ｃ１１）に付し、主要分画を
集め、さらにＨＰＬＣ（カラム：　ＹＭＣ，溶媒：０．
１　％−トリフルオロ酢酸水と０．１％−トリフルオロ
酢酸含有アセトニトリルの直線型濃度勾配溶出）で分取
し目的物のエンドセリンＡを２．７■得た。

以上のように合成されたエンドセリンＡは、Ｉ（ＰＬＣ
で実施例１の天然抽出物と一致する位置に溶出された。

測定条件■ カラム；ケムコ社製ヌクレオシル５０ＤＳ−Ｈ（４，６
１ｎｎφｘ２５０ｍｍ） 溶離液：Ａ液（０，１％−トリフルオロ酢酸水）Ｂ液（
０，１％−トリフルオロ酢酸含有−５０％含水アセトニ
トリル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（２０分） 流　速：　１．Ｏｍ　Ｑ　／分 測定条件■ カラム：東洋ソーダ製　ＤＥＡＥ−２８Ｗ（４，６１＋
ｒｔＲφｘ２５０＋ｍ＋）溶離液：Ａ液（１０ｍＭ　　
トリス・塩酸ｐ　Ｈ７，５）Ｂ液（ＩＭＮａＣＱ含有Ａ
液） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配 溶出（４０分） 流　速：　１．Ｏｍ　Ｑ　／分 溶出位置　２１．５分（測定条件■） ２１．３分（測定条件■）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）血管平滑筋収縮作用を有する分子量２，５００±
   ３００のペプチド。
2. （２）血管内皮細胞から得られる請求項１記載の血管収
   縮ペプチド。
3. （３）２１個のアミノ酸からなり、その内の４つのシス
   テインが２組のＳ−Ｓ結合を有する、請求項１または２
   記載の血管収縮ペプチド。
4. （４）次のアミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有する請求項１、２または３記載の血管収縮ペプチド
   。
5. （５）均質な請求項１、２、３または４記載の血管収縮
   ペプチド。
6. （６）請求項１記載のペプチド産生細胞の培養を行い培
   養物から該ペプチドを回収することを包含する該ペプチ
   ドの製造法。
7. （７）請求項１記載のペプチド産生細胞が血管内皮細胞
   から得られるものである請求項６記載の方法。
8. （８）培養が無血清培地で行われる請求項６または７記
   載の方法。
9. （９）回収が高速液体クロマトグラフィーを含む方法に
   よって行われる請求項６記載の方法。
10. （１０）請求項１、２、３、４または５記載の血管収縮
    ペプチドの有効量および薬剤的に許容し得る添加剤を有
    する薬剤組成物。
11. （１１）有効量が０．００１μｇ〜１００μｇ／ｋｇで
    ある請求項１０記載の薬剤組成物。
12. （１２）薬剤的に許容し得る添加剤が担体、崩壊剤、潤
    滑剤、結合剤、分散剤、充填剤を包含する請求項１０ま
    たは１１記載の薬剤組成物。