JPH0120879B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、醗酵法による３−オキソ−４−プレ
グネン−20−カルボン酸の製造方法に関するもの
である。 本発明方法は、キレート化剤の存在下、ステロ
ールまたはその誘導体を、３−オキソ−４−プレ
グネン−20−カルボン酸を生産しうるブレビバク
テリウム属に属する微生物を用いて醗酵し、培養
液から３−オキソ−４−プレグネン−20−カルボ
ン酸を採取することを特徴とするものである。本
発明方法により、３−オキソ−４−プレグネン−
20−カルボン酸を得ることができる。 ３−オキソ−４−プレグネン−20−カルボン酸
は、ステロイドホルモンおよびケノデオキシコー
ル酸等の胆石溶解剤の製造のために有用な中間体
である。該化合物は、Ｊ・Ｍ・ウイツトマーシ
ユ：バイオケミカル・ジヤーナル90 23、（1964）
（Biochemical Journal）に記載されている様に、
８−ヒドロキシキノリンの存在下、コレステロー
ルを、ノカルデイア属に属する微生物を用いて醗
酵することによつて製造することが知られてい
る。しかしながら、これらの従来方法において
は、３−オキソ−４−プレグネン−20−カルボン
酸のほかにアンドロスタ−４−エン−３，17−ジ
オン、アンドロスタ−１，４−ジエン−３，17−
ジオンおよび３−オキソ−１，４−プレグナジエ
ン−20−カルボン酸が同時に生成するので、生成
混合物から所望化合物を分離するのが繁雑であ
る。従来方法に比べ、本発明方法は、非常に平易
でかつ安価である。 本発明においては、ステロールまたはその誘導
体を３−オキソ−４−プレグネン−20−カルボン
酸に変換しうるブレビバクテリウム属に属するす
べての菌株を使用することができる。好ましい菌
株は、福岡県筑後市羽犬塚の土壌から分離したブ
レビバクテリウム・ステロイドシダーリス
（Brevibacterium steroidocidalis）NRM−91−
CH15Bならびにその突然変異株および変異株で
ある。該菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微工研菌寄第3663号」として寄託されてい
る。本発明方法において使用する変異株は、通常
の変異方法、例えば紫外線、Ｘ−線もしくはγ−
線の照射または適当な変異剤による処理によつて
得ることができる。 「微工研菌寄第3663号」として寄託されてい菌
株の菌学的性質は、以下の通りである： 形態： 菌株、「微工研菌奇第3663号」は、その成長
過程において桿状より、短い球形桿状の形態に
除々に変化する（多形態性）。桿の大きさは0.4
×0.8μ〜0.7×1.2μである。細胞分裂の型式は、
山田および駒形著「ジヤーナル・オブ・ジエネ
ラル・アプライド・マイクロバイオロジー16、
103（1970）、（Journal of General Applied
Microbiology）」によつて定義されている屈曲
型である。変色性顆粒の生成は認められない。
肉汁中および半固形栄養寒天培地中において、
運動性は認められない。グラム染色は、陽性で
あり、抗酸染色は、陰性である。胞子の形成は
認められない。 各種培地における生育状態： すべての試験において、培養は27℃で行なつ
た。(4)における肉汁ゼラチン穿刺培養において
は30日間、(5)におけるリトマス・ミルクにおい
ては14日間観察を行なつたほかは、生育状態の
観察を、培養後１〜７日間行なつた。 (1) 肉汁寒天平板培養 生育は、中心トツ状、全縁、平滑であつ
た。生育の色は、クリーム白色〜淡黄橙色で
あり、透明度は、半透明であつた。可溶性色
素の生成は認められなかつた。 (2) 肉汁寒天斜面培養 生育は、旺盛であり、光沢は、輝光であつ
た。生育の色は、クリーム白色〜淡黄橙色で
あつた。 (3) 肉汁液体培養 生育は、旺盛であり、菌膜の生育は、中程
度であつた。沈殿物の生成は、中程度であつ
た。可溶性色素の生成は認められなかつた。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 生育は、中程度であつた。液化は、認めら
れなかつた。 (5) リトマス・ミルク PHの変化は認められなかつた。液化および
ペプトン化もまた認められなかつた。 生理的性質： 試験結果を第１表に示す。 【表】 【表】 【表】 以上のことから、本菌株、「微工研菌寄第3663
号」は、いわゆるコリネフオルム群菌の１種であ
る。すなわち、本菌株は、好気性ないし通性嫌気
性であり、かつグラム陽性であり、やや多形態性
を示し、非運動性、無穿胞および非抗酸性であ
る。 コリネホルム菌群のなかからその属を同定する
ことは分類学上意味がないことが知られている
（参照：山田および駒形著ジヤーナル・オブ・ジ
エネラル・アプライド・マイクロバイオロジー
18、417、1972（Journal of General Applied
Microbiology）。しかしながら、あえて言うなら
ば、バージーズ・マニユアルに基き以下のように
分類することが可能である。 本菌株、「微工研菌寄第3663号」の上記諸特徴
からみて、該菌株は、コリネホルム群のクルチア
属、リステリア属、ミクロバクテリウム属および
セルロモナス属とは明らかに異なつている。しか
し、該菌株は、コリネホルム群の他の３つの属に
属するアルスロバクター・ウレアフアシエンス
種、コリネバクテリウム・ボービス種、コリネバ
クテリウム・ネフリデイイ種、コリネバクテリウ
ム・フミフエルム種、ブレビバクテリウム・テグ
メンテイコーラ種およびブレビバクテリウム・フ
ルブム種にやや類似している。しかしながら、
「微工研菌寄第3663号」は、ウレアーゼ活性、ゼ
ラチン液化能、硫化水素生成能および／ヌクレア
ーゼ活性の点においてアルスロバクター・ウレア
フアシエンスと異なり、形態的特徴および生育特
性の点においてコリネフオルム・ボービスと異な
り、形態、リトマス・ミルクにおける生育および
ウレアーゼ活性の点においてコリネホルム・ネフ
リデイイと異なり、多形性、クエン酸および他の
炭素利用能の点においてコリネホルム・フミフエ
ルムと異なり、また形態、炭素源からの酸産生能
の点においてブレビバクテリウム・テグメンテイ
コーラと異なる。 上記コリネホルム種のうち、ブレビバクテリウ
ム・フルブムは、「微工研菌寄第3663号」によく
類似している。しかし、ブレビバクテリウム・フ
ルブムAJ−1485（山田および駒形の第３群中の
IFM Ａ−34）との平行実験の結果、インドール
生成能、ウレアーゼ活性、10％NaCl中における
生育およびクエン酸利用能の点において「微工研
菌寄第3663号」と明瞭に異なることを示した。以
上の点から「微工研菌寄第3663号」は、ブレビバ
クテリウム・フルブムによく類似しているが、本
菌株を、ブレビバクテリウム・フルブムと同一で
あるとみなすことができない。従つて、我々はこ
のタクソンをブレビバクテリウム・ステロイドシ
ダーリスNRM−91−CH15Bと命名した。 本発明の方法は、キレート化剤の存在下、ステ
ロールまたはその誘導体を含有する培地に微生物
を接種することによつて行なうことができる。 培地は、炭素源、窒素源、無機塩および微生物
の生育に適当な栄養物質を含有することができ
る。炭素源としては、例えばグルコース、シユク
ロース、デキストリン、マンノース、デンプン、
ラクトースおよびグリセン等である。窒素源とし
ては、例えば肉エキス、酵母エキス、ペプトンお
よびコーンスチープリカー等の窒素含有有機化合
物または例えば硝酸塩およびアンモニウム塩等の
窒素含有無機化合物である。無機塩の例として
は、リン酸塩またはナトリウム塩、カリウム塩、
マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩および銅塩で
ある。培地のPHは、５〜８に調整するのが好まし
い。培地の特に好ましい組成は、グルコース、肉
エキス、ペプトンおよび塩化ナトリウムを含有す
るものである。 本発明方法で使用するステロール類は、天然に
広く分布し、容易に入手することができる。それ
らは17−位に８〜10個の炭素原子を含有する炭化
水素側鎖を有する。 本発明方法で使用するステロール類およびそれ
らの誘導体の例としては、コレステロール、コレ
ステリルアセテート、β−コレスタノール、β−
シトステロール、４−コレステン−３−オン、
6β−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン、
5α−コレスタン−３−オンおよび６−ケトコレ
スタノール等である。 このようなステロールまたはその誘導体は、基
質として微粉末状、例えばメタノール、ジメチル
ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の水
と混和する有機溶媒中における溶液状または例え
ばトウイーン、スパン（アトラス社商品名）等の
ような界面活性剤中における乳濁液状で培地に加
えることができる。基質の濃度は、通常、２〜15
ｇ／、好ましくは2.5〜５ｇ／である。 基質は、培養中、微生物の培地にまたは滅菌も
しくは植菌前に培地に加えることができる。 副生物の生成を阻止するために、キレート化剤
が培地に加えられる。好ましいキレート化剤は、
α，α′−ジピリジル、クペロンおよびｏ−フエナ
ンスロリン等である。キレート化剤の濃度は、通
常、10〜1000mg／、好ましくは50〜200mg／
である。培養を30〜60時間、好ましくは40〜50時
間行なつた後、キレート化剤を培地に加えるのが
好ましい。 培養は、液体培地中、好気的条件下、好ましく
は深部撹拌培養法または振盪培養法によつて行な
うことができる。 培養時の温度は、一般に10〜35℃の範囲、好ま
しくは25〜30℃の範囲で行なう。培養時間は、使
用する菌株、培地の組成、使用する基質およびそ
の濃度に応じて種々決めることができる。通常、
95〜130時間の培養時間で充分である。事実上、
培養は、高速液体クロマトグラフイーによつて培
養液中の目的生成物である３−オキソ−４−プレ
グネン−20−カルボン酸を定量することによつ
て、適宜終了させることができる。 培養液中の３−オキソ−４−プレグネン−20−カ
ルボン酸の定量 培養液の少量（２ml）を採取し、クロロホルム
４mlで抽出する。抽出液から溶媒を除去した後、
残渣を、クロロホルム2.5mlに溶解する。溶液の
一部分（0.5ml）を減圧下、溶媒留去し、残渣を、
内部標準物質としてピクリン酸を50ppm含有する
メタノール１ml中に溶解する。溶液の一部分（通
常2μ）を、以下の条件下、高速液体クロマト
グラフイーによつて分析する。 カラム：μ−ボンダパツクC₁₈、１フイート×
0.25インチ（米国ウオーターズ社製） 溶媒：メタノール0.1M酢酸緩衝液、PH4.0（８：
２） 流速：3.0ml／分 検出：254nｍにおける紫外線吸収 上記条件下で、内部標準物質および３−オキソ
−４−プレグネン−20−カルボン酸の保持時間
は、それぞれ0.85分および2.60分である。ピーク
面積比より検量線を用いることによつて濃度を算
出することができる。 培養生成物は、それ自体公知の方法、例えばク
ロロホルム、塩化メチレンまたは酢酸エチル等の
水と混和しない有機溶媒で溶媒抽出し、シリカゲ
ルまたは酸化アルミニウムを使用するクロマトグ
ラフイーに付する方法で、培養混合物から単離す
ることができる。この様にして、３−オキソ−４
−プレグネン−20−カルボン酸を無色結晶として
得ることができる。 本発明を、以下の例によつて説明する： 例 １ コレステロール（0.5％）、グルコース（１％）、
肉エキス（0.3％）、ペプトン（１％）、塩化ナト
リウム（0.5％）および脱イオン水中のトウイー
ン80（１％）を含有する培地100mlが入つている５
個の500mlフラスコのそれぞれを滅菌し、ブレビ
バクテリウム・ステロイドシダーリスNRM−91
−CH15B「微工研菌寄第3663号」の斜面寒天を１
白金耳植菌した。 フラスコを、28℃で、毎分180回転で運転して
いる振盪撹拌機上で培養した。44時間後、２％
α，α′−ジピリジルのエタノール溶液0.5mlを、
それぞれのフラスコに加え、培養を120時間続け
た。この時、培養液に蓄積した３−オキソ−４−
プレグネン−20−カルボン酸の濃度を、前記高速
液体クロマトグラフイー法によつて測定したとこ
ろ、遊離酸として1.3〜1.4mg／mlであつた。 合した培養液を、５％硫酸でPH３に調整した
後、クロロホルム900mlづつで２回抽出した。抽
出液を合し、減圧下、溶媒留去した。油状残渣を
シリカゲルカラム（和光ゲルＣ−200、200ml）に
かけ、クロロホルム180mlで洗浄し、クロロホル
ム−メタノール（１：１、ｖ／ｖ）900mlで溶出
した。溶出液から溶媒を除去した後、残渣を再び
シリカゲル（E.メルク社製、キーゼルゲル60、
180ml）を使用したクロマトグラフイーに付した。
カラムをシクロヘキサン70mlで洗浄した後、シク
ロヘキサン−酢酸エチル（１：１）で展開し、分
画13ｇを集めた。分画46〜62を合し、減圧下、溶
媒留去することによつて結晶状の残渣を得た。ク
ロロホルム−ベンゼンで残渣を再結晶して、３−
オキソ−４−プレグネン−20−カルボン酸481mg
（収率21.8％）を無色結晶として得た：融点270〜
273℃（分解）；〔α〕²² _D＝＋60゜（Ｃ＝1.04、
CHCl₃）。 例 ２ グルコース（１％）、肉エキス（0.3％）、ペプ
トン（１％）および塩化ナトリウム（0.5％）を
含有する液体培地（90ml）を、500mlフラスコに
入れた。10％トウイーン80を含有する前記培地10
ml中で20分間粉末状の原料を超音波処理すること
によつて調製した以下の表に記載のステロイド基
質（500mg）を培地に加えた。混合物を減菌し、
ブレビバクテリウム・ステロイドシダーリス
NRM−91−CH15B「微工研菌寄第3663号」の斜
面寒天を１白金耳植菌し、例１において採用した
のと同一の条件下で培養した。42時間後、２％
α，α′−ジピリジルのエタノール溶液0.5mlをフ
ラスコに加え、120時間培養を行なつた。生成し
た３−オキソ−４−プレグネン−20−カルボン酸
の量は、前記高速液体クロマトグラフイー法によ
つて測定した。その結果を、以下の表に示した。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キレート化剤の存在下、ステロールまたはそ
   の誘導体を、３−オキソ−４−プレグネン−20−
   カルボン酸を生産しうるブレビバクテリウム属に
   属する微生物を用いて醗酵し、培養液から３−オ
   キソ−４−プレグネン−20−カルボン酸を採取す
   ることを特徴とする３−オキソ−４−プレグネン
   −20−カルボン酸の製造方法。 ２ 微生物が、ブレビバクテリウム・ステロイド
   シダーリス「微工研菌寄第3663号」であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造方
   法。 ３ ステロール類およびそれらの誘導体が、コレ
   ステロール、コレステリルアセテート、β−コレ
   スタノール、β−シトステロール、４−コレステ
   ン−３−オン、6β−ヒドロキシ−４−コレステ
   ン−３−オン、5α−コレスタン−３−オンおよ
   び６−ケトコレスタノールであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 ４ 基質としてのステロールまたはその誘導体の
   濃度が２〜15ｇ／、好ましくは2.5〜５ｇ／
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の製造方法。 ５ キレート化剤が、α，α′−ジピリジル、クペ
   ロン、ｏ−フエナンスロリンであることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 ６ キレート化剤の濃度が、10〜1000mg／、好
   ましくは50〜200mg／であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 ７ 醗酵を30〜60時間行なつた後、キレート化剤
   を培養液に加えることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の製造方法。 ８ 好気的条件下、液体培地中、醗酵を10〜35℃
   の範囲で行なうことを特徴とする特許請求の範囲
   １項に記載の製造方法。