JPH01227964A - 免疫学的分析要素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［Ｑ明の分野］ 本発明は抗原／抗体反応を利用する免疫学的分析にイ１
用な分析要素の製造方法に関する。

［従来技術］ 乾式分析要素を用いて体液などに含右されている生化学
物質を定量する分析方法が知ｔ、れている。

乾式分析要素では−・般に、被検成分と分析要素内に含
まれる試薬との反応の反応生成物または未反応成分の量
を、光学的に、例えば発色、変色、蛍光、発光等の分光
測光により測定し、被検成分を定量する。乾式分析要素
を用いると、簡便、迅速に、しかも高い精度で液体中の
特定成分、例えば生化学的活性物質の分析ができる。

乾式分析要素を利用した免疫学的分析も、例えば特開昭
４９−５３８８８号、特開昭５９−１０２３８８号、米
国特許４，４５９，３５８号等の記載により知られてい
る。

免疫学における抗原抗体反応は互いに対応する抗原また
は抗体のみに特異的に反応し結かする反応であり、自己
免疫疾患のＪ）断、生体内微量物質の検出などに広く利
用されている。しかし操作に熟練を要するため、臨床検
査のためには簡便な操作で精度良く測定できる方法が望
まれている。

多層分析要素を利用した簡便な抗原量測定法の一つの典
型は特開昭５９−７７３５６号に開示されたものである
。この方法で用いている分析要素は、蛍光標識抗原を含
む展開層と、多孔性媒体から成る分配層と、固定化抗体
を禽む反応層を頂層したもので、被検液中の抗原と標工
抗原との間での競争的な抗原抗体反応を利用し、抗原の
量が蛍光強度の減少として測定される。

また検出感度の比較的高い免疫分析法として、酵素免疫
分析（ＥＩＡ）が考えられている。典型的な方法は特公
昭５３−２７７６３号によって知られ、酵素を抗原また
はその類縁体に結合させて、酵素標識抗原をつくり、酵
素活性に対する抗原の効果の、１１１１定により、被検
液中の抗原を分析する方法である。この方法では、抗原
と結合しまた酵素標識抗原（Ｂで示される）と未結合の
酵素標識抗原（Ｆて示される）とを分ｍする（いわゆる
Ｂ／Ｆ分に）か、１３と１・゛とで活性が変化する酵素
系が必要とされた。

このような系を成立させるためには、抗体と酵素Ｉつ品
抗原、：ｉたは抗体標二１物と抗原類縁体との、いずれ
かの二成分が必須である。検体との接触前にはこれらの
二成分が互いに反応しないようにしておかないと、検出
１５度〈信月／背景比）が著しく低下する。これまで知
られた乾式分析要素の多くは、この要因のために満足す
べき分析感度を得ることができなかった。

［発明の［１的］ 本発明の［１的は、高い分析感度と定量分析精度を有す
る、乾式免疫７的分析要素の製造方法の提供にある。

［発明の構成］ 本発明の上記目的は、少なくとも一−一）の水浸透性の
多孔性層を有し、抗原／抗体反応に関与する成分として
抗原類縁体と標識抗体とを前記多孔性層に含む酵素活性
測定用乾式分析要素を製造するに際し、多孔性層に、前
記抗原類縁体を含む組成物と前記標識抗体を含む組成物
とを個別に塗布または含浸することにより、達成された
。前記２つの組成物は、極性の異なる溶媒（例えば水と
エチルアルコール）からそれぞれ成ることが好ましい。

特に抗原類縁体、前記標識抗体のいずれか一方を含む第
１の組成物を塗布または含浸した後、他の一方を含み親
水性高分子を膨潤させない溶媒から成る第２の組成物を
多孔性層に塗布または含浸する方法は、有用な方法の一
つである。親水性高分子を膨潤させない溶媒としては、
例えば低級アルコール類（例えばメチルアルコール、エ
チルアルコール）、エーテル類、ケトン類（例えばアセ
トン）のような有機溶媒が有用である。第１の組成物に
用いる溶媒としては、水が好ましいが、前記のような有
機溶媒を用いてもよい。

抗原類縁体とは、抗原に対する抗体に、抗原と同様に結
合することのできる物質を言う。例えば、抗原と蛋白質
との化字的結合物、抗原とラテックスとの物理的結合物
、抗原と固体担体との結合物である。

抗原類縁体を含む組成物と、前記標識抗体を含む組成物
と（いずれか一方は水溶液、いずれが−方は親水性高分
子を膨潤させない溶媒から成る）をそれぞれ予め含浸ま
たは塗布した多孔性展開層を、他の水浸透性層、例えば
試薬層の土に、特開昭５５−１６４３５６号のような方
法で接着させるのも有用な方法である。

また抗原類縁体を含む組成物と標識抗体を含む組成物と
をそれぞれ予め含浸、塗布等により含有した多孔性層を
、他の多孔性層（ＰＡえば試薬層）の上に、例えば特開
昭６１−４９５９号等のような方法で接着させる方法も
有用である。

別の方法として、抗原類縁体を含む第１の組成物（例え
ば水溶液）を予め含浸または塗布した多孔性層（例えば
展開層）を、他の水浸透性層（例えば試薬層）の上に前
記のような方法で接着させた後、標識抗体を含む第２の
組成物を多孔性層に塗布してもよい。

反対に、標識抗体を含む組成物を多孔性層に含浸させ、
池の層に接着後、抗原類縁体を含む組成物を塗布しても
よい。

多孔性層への含浸または塗布には公知の方法を利用でき
る。塗布には例えばデイツプ塗布、ドクター塗布、ホッ
パー塗布、カーテン塗布等を適宜選択して用いる。

本発明における多孔性層は、分析要素の最上層であって
もよいし、最上層と試薬層の間にある層でもよい、供給
される液体の量にほぼ比例した面積に液体を展開する、
いわゆる計量作用を有する液体展開層（以下、展開層と
いうことがある）であってもよいし、それ以外でもよい
、繊維質であってもよいし、非繊維質でもよい、天然繊
維から成る布、合成または半合成ｍ維から成る布、不織
布、紙、酢酸セルロース等から成るメンブランフィルタ
−１無機物または有機物粒子の結合体等のいずれでもよ
い０例えば特開昭５５−１６４３５６号、同６０−２２
２７６９号等に記載された繊維質層のほか、特開昭４９
−５３８８８号、特開昭５８−７０１６３号、同６１−
４９５９号、特願昭６０−２５６４０８号、同６０−２
７９８５９号、同６０−２７９８６０号、同６０−２７
９８６１号等に記載されたような多孔性層も好適である
。

抗体を蛍光標識するためには種々の蛍光物質を用いるこ
とができる。それらは官能成分により分類することがで
きるが、例えばアミン基を有する蛍光物質として １−アミノナフタレン ２−アミノナフタレン ｐ、ｐ’−ジアミノスヂルベン ２−アミノアクリジン ｐ、ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン類ビス−３−
アミノピリジニウム塩 インドール類 フェノール性蛍光物質として ７−ヒドロキシクマリン類 ３．６−ジヒドロキシキサンテン類 テトラサイクリン サリチル酸エステル類 等が挙げられる０代表的なものはフルオレセインである
。

抗体は発光物質、例えば化学発光物質で標識されてもよ
い０例えば、ルミノールで代表される２）３−ジヒドロ
−１，４−フタラジンジオン、あるいは２．４．５−　
）リフェニルイミダゾール類を用いることができる。

抗体を酵素標識する場合、種々の酵素を用いることがで
きる。充分高い酵素活性が得られること、酵素の安定性
、酵素活性への結合の影響等を考慮して、酵素が選択さ
れる。特表昭５６−５００９０１号明細書の第１表およ
び第２表に記載されたものから選ぶことができる０代表
的なものはグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ　）、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−アミラーゼ
、ルシフェラーゼ等である。

抗体に標識を結合させる方法および本発明に用いること
ができる標識抗体については、石川栄治ら二「酵素免疫
測定法（第２版）Ｊ（１９８２年）河合忠Ｉｉ：「臨床
検査技術金言４免疫血清検査」（医学書院、１９７７年
発行）、９７−１０２頁、Ｂ　１ｏｃｌ＋ｅｍ、　Ｉ３
１ｏｐｌ＋ｙｓ　、　Ｒｅｓ　、　Ｃｏａｅｍｕｎ　、
　、７４．５３８（１９７７）、Ｃｌ１ｎｉｃａ　Ｃｈ
ｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　、８３，１６１（１９７８）等
の記載が参照できる。

標識抗体の具体例としてフルオレセインイソチオシアネ
ー）（ＦｒＴＣ）結合チロキシン（Ｔ、）抗体、ＧＯＤ
結合抗ヒト免疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ）、ＡＬＰ結合抗
Ｉ　ｇＧ、ＰＯＤ標識抗α−フェトプロティン等がある
。

酵素標識抗体を用いる場合、抗原／抗体反応の結果を測
定するために、酵素活性の測定を必要とし、酵素の基質
、酵素反応生成物の検出系が必要とされる。基質は標識
抗体と同一の層中に存在してもよいが、異なる層の中に
含まれるのが好ましい。基質または酵素標識抗体の少な
くとも一方を、酵素標識抗体の酵素反応が実質的に起こ
らない溶媒を用いて塗布または含浸することが好ましい
。

基質と酵素反応生成物の検出系とは、同一層中に存在し
てもよく、また異なる層の中に含まれてもよい、基質が
自己顕色性基質である場合には、酵素反応生成物の検出
系は特に必要としない。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。要素は多孔性層、試薬層のほか、支持体、展ｒＭ
Ｊ１！！、検出層、光遮蔽層、接着層、ろ過層、吸水層
、下塗り層その他の層を含む多重層の構成を有してもよ
い、かような分析要素として、米国特許第３，９９２，
１５８号、同４，０４２，３３５号および特開昭５５−
１６４３５６号各明細書に開示されたものがある。

光透過性水不透過性支持体を用いる場合、本発明の乾式
分析要素の実用的に採りうる構成は〈１）支持体上に試
薬層、その上に展ｒＭ層を有するもの。

（２）支持体上に検出層、試薬層、展開層をこの順に有
するもの。

（３）支持体上に試薬層、光反射層、展開層をこの順に
有するもの。

（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、展開層を
この順に有するもの。

（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、展開層を
この原に有するもの。

（６）支持体上に第二試薬層、光反射層、第一試薬層、
展開層をこの順に有するもの。

（７）支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、第一
試薬層、展開層をこの順に有するもの。

検出層は一般に被検成分の存在下で生成した色素等が拡
散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層
で、親水性ポリマーにより構成することができる０色素
に対する媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオ
ン性ポリマーを、含んでもよい。

吸水層は一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実
質的に拡散しないような層を言い、膨潤しやすい親水性
ポリマーにより構成することができる。

抗原類縁体および標識抗体が含まれる層は、展開層ある
いは試薬層であってもよい。

酵素標識抗体を用いる場合に酵素反応生成物を検出する
ための試薬組成物は、抗原類縁体および標識抗体を含む
層に含まれてもよいが、別の無孔性層または多孔性層に
含有させてもよい。例えば酵素反応生成物との反応によ
り中間体を生成する組成物を第１の試薬層に、中間体と
反応して染料等を生成し得る組成物（指示薬）を試薬層
と支持体との間にある第２の試薬層に含んでもよい、ま
た前記の中間体を生成する組成物を試薬層より支持体か
ら遠い層、例えば展ｆｍ層等に含み、指示薬を試薬層に
含んでもよい。

上記（１）ないしく５）において試薬層はそれぞれ異な
る複数の層から成ってもよい。支持体と試薬層または検
出層との間には吸水層を設けてもよい、上記（１）ない
しく３）と（６）において試薬層と検出層または展開層
の間にろ過層を設けてもよい、上記（３）ないしく７）
において光反射層と検出層、試薬層または展開層との間
、試薬層と検出層との間または試薬層と展開層との間に
、さらにろ過層を設けてもよい、試薬層が複数層から成
る場合に、試薬層と試薬層の間にさらにろ過層を設けて
もよい。

光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいものは
ポリエチレンテレフタレートである。親水性層を強固に
接着させるため通常、下塗り層を設けるか、親水化処理
を施す。

本発明の乾式分析要素の試薬層としては、親水性ポリマ
ーを結合剤とする実質的に均一の層のほか、例えば特開
昭５８−７０１６３号、特開昭６１−４９５９号、特願
昭６０−２５６４０８号、同６０−２７９８５９号、同
６０−２７９８６０号、同６０−２７９８６１号等に記
載されたような多孔性層も好適である。ＦＡ水性ポリマ
ーとして例えば、ゼラチンおよびこれらの誘導体く例え
ばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例えばヒド
ロキシメチルセルロース）、アガロース、アクリルアミ
ド重合体、メタアクリルアミド重合体、アクリルアミド
またはメタアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの
共重合体等が利用できる。

試薬層には必要に応じ酵素に対する基質、酸化剤、カプ
ラー、緩衝剤等を含有させることができる。標識抗体と
して酵素標識抗体を含む場合には、当該酵素に対する基
質が必須である。

本発明の分析要素の試薬層に含有させることができる緩
衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸塩やＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌　第５巻　第２号、４６７ページ
より４７７ページ（１９６６年）に記載されているグツ
ド（Ｇｏｏｄ　）の緩衝剤などを挙げることができる。

これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法１（堀尾
武−ほか著、南江堂、１９８１年）、前記Ｂｉｏｃｌ＋
ｅｍｉｓｔｒｙ誌第５巻等の文献を参考にして選択する
ことができる。

多孔性層を展開層として利用する場合、液体計量作用を
有する層であることが好ましい、液体計量作用とは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含有して
いる成分を実質的に偏在させることなく、面の方向に単
位面積当りほぼ一定量の割合で広げる作用である。

展ｔ７Ｆ１層その他の多孔性層を構成する材料としては
、Ｐ紙、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生
地（例えば、トリコット編）、ガラス繊維２紙等を用い
ることができる。展開層としては、これらのうち織物、
編物等が好ましい、織物等は特開昭５７−６６３５９号
に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい、展開
層には、展開面精、展開速度等を調節するため、特開昭
６０−２２２７７０号、特願昭６１−１２２８７５号、
６１−１２２８７６号、６１−１４３７５４号に記載し
たような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有しても
よい。

多孔性層を接着し頂層するための接着層を、試薬層、光
道へい層、濾過層、吸水層、検出層等の層の上に設けて
もよい、接着層は水で膨潤したときに多孔性層を接着す
ることができるような親水性ポリマー、例えばゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、澱粉等からな
ることが好ましい。

光遮蔽層は、検出層、試薬層等に生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反
射測光する際に、展開層に点着供給された被検液の色、
特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮
蔽するとともに光反射層または背景層として機能する。

光遮蔽層は、皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性
微粒子が分散された水浸透性の層であることが好ましい
、バインダーとしてはゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリ
アクリルアミド等が好ましい０分析要素には、光遮蔽層
を設ける代わりに、またはそれと同時に、展開層、試薬
層、検出層等に酸化チタン等の光反射粒子を含有させて
もよい。

［実施例］ （１）Ｔ、−ＢＳＡの合成 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１５ｍｇを３ｍｌのりん酸
ＭＨＩｔ液（ｐＨ８，０，０，１Ｍ）に溶解し、これに
Ｔ、溶液（チロキシン１０ｍｇを３ｍｌのジメチルスル
フオキシドに溶解したもの）を靜かに添加した０次にこ
の液に１％ゲルタールアルデヒド溶液０．２ｍｌをゆっ
くりと添加し、４℃で３時間反応させた。反応液を２日
間透析し、凍結乾燥してＴ４−ＢＳＡを得た。

（２）抗原固定化膜の作製 ニトロセルロースメンブランフィルタ−（ミリボア社製
）に下記の液（λ）を含浸し、１夜放置した後、水でよ
く洗浄した。

（Ａ）　　　７４　　ＢＳＡ（上記）　　　１５μｇ炭
酸緩衝液（ｐＨ９）　　　１０社 次にこのメンブランフィルタ−に、ＢＳ　Ａ　３００ｍ
ｇを水Ｌｏａｆに溶解した液を含浸し、１夜放置した後
、水でよく洗浄して、室温で乾燥したものを抗原固定化
膜とした。

（３）Ｔ４測定要素の作製 前記抗原固定化膜に下記組成（Ｃ）の液を含浸した後、
速やかに乾燥した（ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオ
シアネートを意味する）。

（Ｃ）ＦＩＴＣ標識抗標識抗体溶液　１ｍ１（抗体乾燥
粉末４０μｇ含有） エタノール　　　　　　　　　９醜！ 次にこれを厚さ１８０μ−のＰＥＴ支持体に特開昭６２
−１３８７５６実施例３に記載された方法により点状部
分接着した。１５ｍｍ角に裁断し、上下に直径１０ｇ＋
−の窓を設けたポリスチレンフレームにはさみ込み、Ｔ
、測定要素［１］とした。

一方、抗原固定化膜に含浸する液の組成（Ｃ）を下記（
Ｄ）に変更した他は上記Ｔ、測定要素と同様にして、比
較用Ｔ４測定要素［２］を作製した。

（Ｄ）ＦＩＴＣ標識抗標識抗体４抗 （抗体乾燥粉末４０μｇ含有） 蒸留水　　　　　　　　　　　９鍮！ （４）チロキシンの測定 チロキシン（Ｔ，）を含まない血清に既知量のＴ。

を添加したＴ，含有血清５μｌに、０．３ＭグリシンＭ
衝液（ｐＨ９．０、０．０５ＭＦデシルナフタレンスル
フォン酸ナトリウム含有）５μｌを加えたものを、各分
析要素に点着（滴下）した、３７℃で１５分間放置後、
　各分析要素に０．３ＭグリシンＭ衝液（上記に同じ）
１５μｌを滴下して拭き取る操作を２回繰り返し、遊離
のＦＩＴＣ標識抗体を洗い流した。

その後、蛍光光度計（日立製作所モデル６５０−１０（
Ｓ））を用い、励起波長４９５ｎｓ、蛍光波長５２５ｎ
ｍで、ＰＥＴ支持体側より蛍光を測定した．得られた結
果を第１図に示す。

第１図から明らかなように、本発明の分析要素［１］は
比較用分析要素［２］に比し、優れた免疫分析特性を示
した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴ４測定用分析要素の免疫分析特性を示すグラ
フである。 出願人：　富士写真フィルム株式会社

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも一つの水浸透性の多孔性層を有し、抗
   原／抗体反応に関与する成分として、抗原類縁体と標識
   抗体とを前記多孔性層に含む乾式免疫分析要素の製造方
   法であって、 多孔性層に、前記抗原類縁体を含む組成物と前記標識抗
   体を含む組成物とを、個別に塗布または含浸することを
   特徴とする乾式分析要素の製造方法。
2. （２）特許請求の範囲（１）において、多孔性層に前記
   抗原類縁体を含む組成物を塗布または含浸した後、前記
   標識抗体を含み親水性高分子を膨潤させない溶媒から成
   る組成物を該多孔性層に塗布または含浸することを特徴
   とする方法。
3. （３）特許請求の範囲（１）において、前記標識抗体を
   含む組成物を塗布または含浸した後、前記抗原類縁体を
   含み親水性高分子を膨潤させない溶媒から成る組成物を
   該多孔性層に塗布または含浸することを特徴とする方法
   。